RU2193199C1 - Test system for detecting opium narcomania - Google Patents
Test system for detecting opium narcomania Download PDFInfo
- Publication number
- RU2193199C1 RU2193199C1 RU2001121965A RU2001121965A RU2193199C1 RU 2193199 C1 RU2193199 C1 RU 2193199C1 RU 2001121965 A RU2001121965 A RU 2001121965A RU 2001121965 A RU2001121965 A RU 2001121965A RU 2193199 C1 RU2193199 C1 RU 2193199C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- opiate
- latex
- test system
- addiction
- opium
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к области медицины, а точнее к способу экспресс-диагностики опийной наркомании с использованием латексного диагностикума с иммобилизированным специфическим пептидным фрагментом. The present invention relates to medicine, and more specifically to a method for the rapid diagnosis of opium addiction using a latex diagnosticum with an immobilized specific peptide fragment.
Проблема наркомании является актуальной, и выявление наркозависимости экспресс-методом может значительно упростить диагностику и создать возможность для широкого скрининга населения. The problem of drug addiction is urgent, and the detection of drug addiction by the express method can greatly simplify the diagnosis and create the opportunity for a wide screening of the population.
Проявление злоупотребления наркотическими веществами часто не имеет специфических черт и может быть принято за проявление соматических или психических заболеваний, к тому же больные нередко скрывают употребление наркотиков (1). В настоящее время лабораторная диагностика наркомании основана на определении присутствия наркотического средства в организме: в волосах, крови и других биологических жидкостях. Наиболее используемыми тестами являются методы, основанные на иммунологическом и масс-спектроскопическом определении наркотиков в биологических тканях (2, 3). The manifestation of drug abuse often does not have specific features and can be mistaken for the manifestation of somatic or mental illnesses; moreover, patients often hide drug use (1). Currently, laboratory diagnosis of drug addiction is based on determining the presence of a drug in the body: in hair, blood and other body fluids. The most used tests are methods based on the immunological and mass spectroscopic determination of drugs in biological tissues (2, 3).
Однако токсикологическая экспертиза биологических жидкостей свидетельствует только об однократном применении наркотического вещества, а определение наркотиков в волосах, свидетельствующее о хронической интоксикации, требует дорогостоящего оборудования. However, the toxicological examination of biological fluids indicates only a single use of the narcotic substance, and the determination of drugs in the hair, indicating chronic intoxication, requires expensive equipment.
Разработан метод диагностики опийной наркомании реакцией пассивной гемагглютинации с выявлением в сыворотке крови антител к морфину, повышенный уровень которых определяется у 50% больных опийной наркоманией и сохраняется повышенным в течение 2 месяцев после отмены наркотика (4). A method for diagnosing opium addiction by a passive hemagglutination reaction with the detection of antibodies to morphine in the blood serum has been developed, an increased level of which is determined in 50% of patients with opium addiction and remains elevated for 2 months after drug withdrawal (4).
У данного метода существуют следующие недостатки: неспецифичность за счет перекрестно реагирующих антигенов, находящихся на поверхности биологического носителя, в качестве которого выступают эритроциты; нестабильность при хранении эритроцитарного диагностикума. This method has the following disadvantages: nonspecificity due to cross-reacting antigens located on the surface of a biological carrier, which is erythrocytes; instability during storage of red blood cell diagnosticum.
Известен способ диагностики опийной наркомании методом иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на определении в сыворотке крови пациентов уровня аутоантител к опиатному рецептору, выделенному из мозга человека (5, 6). Установлено, что в процессах развития зависимости и толерантности к морфину и героину участвуют мю- и дельта-опиатные рецепторы. Предполагается, что опийная зависимость связана с увеличением числа опиатных рецепторов, участвующих в процессах положительного подкрепления в мозге. Установлено, что при хроническом введении опиатов изменяется баланс мю- и дельта-опиатных рецепторов в стриатуме, ядрах гипоталамуса и миндалине. Избыточный синтез и разрушение нейрорецепторов приводят к образованию иммуногенных фрагментов, которые, попадая в кровоток, вызывают развитие аутоиммунного ответа по типу антиген-антитело. A known method for the diagnosis of opium addiction by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), based on the determination in the blood serum of patients of the level of autoantibodies to the opiate receptor isolated from the human brain (5, 6). It has been established that mu- and delta-opiate receptors are involved in the development of dependence and tolerance to morphine and heroin. Opium dependence is thought to be associated with an increase in the number of opiate receptors involved in positive reinforcement processes in the brain. It has been established that the chronic administration of opiates alters the balance of mu- and delta-opiate receptors in the striatum, nuclei of the hypothalamus and amygdala. Excessive synthesis and destruction of neuroreceptors leads to the formation of immunogenic fragments, which, getting into the bloodstream, cause the development of an autoimmune response of the antigen-antibody type.
При использовании ИФА существует ряд сложностей, снижающих его чувствительность и специфичность, которые обусловлены стабильностью субстрата, качеством отмывки, специфичностью конъюгата, негомогенностью и эффектами краевых лунок планшета. When using ELISA, there are a number of difficulties that reduce its sensitivity and specificity, which are due to the stability of the substrate, the quality of the wash, the specificity of the conjugate, the inhomogeneity and effects of the edge wells of the tablet.
Также этот метод требует приборного обеспечения и определенных навыков работы. Использование белкового фрагмента в качестве антигена в ИФА представляет определенные трудности, в частности: выделение и очистка опиатного рецептора из мозга человека, стандартизация метода. Also, this method requires instrumentation and certain skills. The use of a protein fragment as an antigen in ELISA presents certain difficulties, in particular: isolation and purification of the opiate receptor from the human brain, standardization of the method.
Наиболее близким к изобретению является способ определения опийной зависимости с помощью антигенов, где в качестве иммуногенных фрагментов нейрорецепторов мозга используются синтетические фрагменты мю- и дельта-опиатных рецепторов (7). ИФА аутоантител по этому способу основан на их связывании иммобилизированными синтетическими пептидными фрагментами опиатных рецепторов, нанесенными на ячейку полистиролового иммунологического планшета высокой сорбционной емкости "Biohit". Closest to the invention is a method for determining opium dependence using antigens, where synthetic fragments of mu and delta opiate receptors are used as immunogenic fragments of brain neuroreceptors (7). ELISA autoantibodies according to this method are based on their binding by immobilized synthetic peptide fragments of opiate receptors deposited on a cell of a polystyrene immunological tablet of high sorption capacity "Biohit".
Анализ по этому способу не может быть широко использован, так как требует наличия дорогостоящих реагентов и многоканального спектрофотометра "Dinatech", что делает невозможным применять его в обычных лабораториях и больницах. Analysis by this method cannot be widely used, since it requires the presence of expensive reagents and a multi-channel Dinatech spectrophotometer, which makes it impossible to use it in ordinary laboratories and hospitals.
Целью данного изобретения является создание тест-системы, позволяющей осуществлять диагностику опийной наркомании, обладающей специфичностью, стабильностью и удобством применения. The aim of this invention is the creation of a test system that allows the diagnosis of opium addiction, with specificity, stability and ease of use.
Задача решена с помощью использования реакции латекс-агглютинации. Частицы полистирола с карбоксильными группами (диаметр 0,99-1,05 мкм) сенсибилизировали синтетическими пептидными фрагментами опиатных рецепторов, что позволило создать тест-систему для выявления уровня специфических аутоантител с помощью реакции латекс агглютинации (РЛА), которая визуализирует связывание антиген-антитело в иммунологическом планшете. The problem is solved using the latex-agglutination reaction. Particles of polystyrene with carboxyl groups (diameter 0.99-1.05 μm) were sensitized with synthetic peptide fragments of opiate receptors, which allowed us to create a test system to detect the level of specific autoantibodies using the latex agglutination reaction (RLA), which visualizes antigen-antibody binding to immunological tablet.
Тест-система представляет собой иммуносорбент, где в качестве антигенной детерминанты была использована аминокислотная последовательность консервативного цитоплазматического участка, общего для мю- и дельта-опиатных рецепторов человека, длиной 23 аминокислоты, которая была рассчитана на основе индекса гидрофильности/гидрофобности, которая фиксирована ковалентной или ионной связью на иммуносорбенте, что обеспечивает сохранение иммуногенных свойств фрагмента (4). Наибольшая серологическая активность при использовании в качестве антигена синтетического фрагмента мю- и дельта-опиатных рецепторов наблюдалась при использовании полистирола с карбоксильными группами (диаметр 0,99-1,05 мкм). The test system is an immunosorbent, where the amino acid sequence of a conserved cytoplasmic region common to mu and delta opiate human receptors, 23 amino acids in length, which was calculated on the basis of the hydrophilicity / hydrophobicity index, which is fixed covalent or ionic, was used as an antigenic determinant a bond on the immunosorbent, which ensures the preservation of the immunogenic properties of the fragment (4). The highest serological activity when using a synthetic fragment of mu and delta opiate receptors as antigen was observed when using polystyrene with carboxyl groups (diameter 0.99-1.05 μm).
Заявляемая тест-система позволяет быстро и эффективно провести диагностику опийной наркомании. Кроме того, данный тест позволяет проводить профилактическое обследование населения с целью выявления лиц, употребляющих опиаты, что немаловажно для тестирования профессиональных групп (военных, операторов АЭС etc. ), работа которых связана с большой степенью ответственности. The inventive test system allows you to quickly and efficiently diagnose opium addiction. In addition, this test allows for a preventive examination of the population in order to identify people who use opiates, which is important for testing professional groups (military, NPP operators etc.), whose work is associated with a high degree of responsibility.
Предложенный к применению специфический пептид был иммобилизирован на полистироловом латексе, использование которого в РЛА дало результаты, сопоставимые по своей чувствительности и специфичности с техникой ИФА. Заявляемая тест-система для выявления опийной наркомании является новой и в литературе не описана. The specific peptide proposed for use was immobilized on polystyrene latex, the use of which in RLA yielded results comparable in its sensitivity and specificity to the ELISA technique. The inventive test system for detecting opium addiction is new and is not described in the literature.
Метод РЛА легко выполним, обладает хорошей воспроизводимостью, чувствительностью и специфичностью. The radar method is easy to perform, has good reproducibility, sensitivity and specificity.
Хотя в литературе агглютинационные латексные тест-системы с использованием в качестве действующего начала различных иммунореагентов известны, подбор латекса в каждом случае очень индивидуален. Белки, синтетические пептидные олигомеры, являющиеся антигенными детерминантами, благодаря своей структуре требуют определенных латексов, определенных условий проведения реакции, специфических рH, для того чтобы в качестве тест-системы обладать способностью адсорбировать антитела из биологических жидкостей. Изучая ряд латексов на основе полистирола, таких как сополимер полистирола с акролеином, полистирол с карбоксильными группами с диаметром около 0,84 мкм, а также латекс на основе сополимера полиметилметакрилата с карбоксильными группами с диаметром около 0,72 мкм, невозможно было получить специфическое связывание антител с синтетическим пептидным фрагментом мю- и дельта-опиатных рецепторов. В результате поиска латексов с различной сорбционной поверхностью с химическими группами для ковалентного привязывания антигена был найден латекс высокой сорбционной емкости и большого размера, подходящий для нанесения пептидного фрагмента. Ковалентное или ионное связывание пептида с функциональными группами приводило к увеличению специфичности анализа. Были изучены буферы боратный, фосфатный для получения латексных диагностикумов, и только фосфатный буфер рН 7,8 позволил получить эффективное связывание антигена, причем оптимальным количеством антигена для сенсибилизации является 0,1-10 мкг на 1 мл 1% латекса. В качестве основного критерия специфичности было использовано отношение выявленных титров аутоантител методом реакции латекс агглютинации между пулированными сыворотками здоровых доноров и лиц, страдающих опиатной наркоманией. Группа больных опийной наркоманией отличалась высокой частотой обнаружения повышенного уровня антител к опиатным рецепторам. Уровень антител в титре 1:16 и выше у больных опийной наркоманией регистрировался в 71,4%. Полученные данные свидетельствуют о специфичности выявленных нами изменений уровня антител к мю- и дельта-опиатным рецепторам у больных опийной наркоманией. Результаты титрования антител к мю- и дельта-опиатным рецепторам по РЛА у больных опийной наркоманией сравнивали с данными, полученными по методу ИФА. Although agglutination latex test systems using various immunoreagents as active ingredients are known in the literature, the selection of latex in each case is very individual. Proteins, synthetic peptide oligomers, which are antigenic determinants, due to their structure, require certain latexes, certain reaction conditions, specific pH, in order to be able to adsorb antibodies from biological fluids as a test system. By studying a number of polystyrene-based latexes, such as a polystyrene-acrolein copolymer, polystyrene with carboxyl groups with a diameter of about 0.84 μm, and also latex based on a polymethyl methacrylate copolymer with carboxyl groups with a diameter of about 0.72 μm, it was not possible to obtain specific antibody binding with a synthetic peptide fragment of mu and delta opiate receptors. As a result of the search for latexes with different sorption surfaces with chemical groups for covalent binding of antigen, a latex of high sorption capacity and large size was found suitable for applying a peptide fragment. Covalent or ionic binding of the peptide to functional groups increased the specificity of the assay. Borate, phosphate buffers for latex diagnosticums were studied, and only phosphate buffer pH 7.8 allowed to obtain effective antigen binding, and the optimal amount of antigen for sensitization is 0.1-10 μg per 1 ml of 1% latex. The ratio of the detected titers of autoantibodies by the latex agglutination reaction method between the pulled sera of healthy donors and people suffering from opiate addiction was used as the main criterion for specificity. The group of patients with opiate addiction was characterized by a high frequency of detection of an increased level of antibodies to opiate receptors. The antibody level in the titer of 1:16 and higher in patients with opiate addiction was recorded in 71.4%. The data obtained indicate the specificity of the revealed changes in the level of antibodies to mu- and delta-opiate receptors in patients with opium addiction. The results of titration of antibodies to mu- and delta-opiate receptors by RLA in patients with opium addiction were compared with data obtained by ELISA.
Пептидный фрагмент опиатсвязывающего мембранного белка, фиксированного на жестком иммуносорбенте, специфически выявляет в образцах крови больных опийной наркоманией и людей, входящих в группу риска по данному заболеванию, аутоантитела к опиатсвязывающему мембранному белку. Диагноз "опийная наркомания" ставится на основании 3-4-кратного превышения титра аутоантител в крови (>10,4 мкг/мл) по сравнению с контролем. Неспецифическая реакция тест-системы с образцами крови больных другими заболеваниями нервной системы не отмечена. The peptide fragment of the opiate binding membrane protein fixed on a hard immunosorbent specifically reveals in the blood samples of opiate addicts and people at risk for this disease, autoantibodies to the opiate binding membrane protein. The diagnosis of opium addiction is made on the basis of a 3-4-fold increase in the titer of autoantibodies in the blood (> 10.4 μg / ml) compared with the control. Nonspecific reaction of the test system with blood samples of patients with other diseases of the nervous system was not noted.
Заявляемая тест система была испытана на группе больных, страдающих опийной наркоманией, которая состояла из 21 человека. Контрольная группа состояла из 28 здоровых доноров, не употребляющих наркотических и седативных средств. Возраст обследованных составлял 16-35 лет. Пробы крови у больных опийной наркоманией отбирали в течение месяца после отмены наркотика. Сыворотки до анализа хранили при температуре -70oС. Наличие в крови аутоантител к иммуногенному фрагменту опиатсвязывающего мембранного белка проверяли с помощью заявленной тест-системы (синтетическими пептидными фрагментами, соответствующими аминокислотным последовательностям опиатных рецепторов фиксированного на иммуносорбенте полистироловом латексе с карбоксильными группами), используя стандартную методику реакции агглютинации (РЛА). Эксперименты показали, что в сыворотке крови опийной наркоманией связывание антител опиатсвязывающим мембранным белком было повышено в сравнении с контрольной группой. Применение заявляемой тест-системы для диагностики опийной наркомании основано на обнаружении уровня антител к фрагменту мю- и дельта-опиатных рецепторов.The inventive test system was tested on a group of patients suffering from opium addiction, which consisted of 21 people. The control group consisted of 28 healthy donors who did not use drugs and sedatives. The age of the examined was 16-35 years. Blood samples from patients with opium addiction were taken within a month after drug withdrawal. Serums were stored at -70 ° C until analysis . The presence of autoantibodies to the immunogenic fragment of the opiate binding membrane protein in the blood was checked using the claimed test system (synthetic peptide fragments corresponding to the amino acid sequences of the opiate receptors fixed on immunosorbent polystyrene latex with carboxyl groups) using standard agglutination reaction technique (RLA). Experiments have shown that in the blood serum of opiate addiction, antibody binding to the opiate-binding membrane protein was increased in comparison with the control group. The use of the inventive test system for the diagnosis of opium addiction is based on the detection of the level of antibodies to a fragment of mu - and delta-opiate receptors.
Таким образом, клинические исследования показали связь между уровнем аутоантител (УАА) к пептидному фрагменту опиатного и степенью выраженности опийной зависимости. Thus, clinical studies have shown a relationship between the level of autoantibodies (UAA) to the peptide fragment of the opiate and the severity of opium dependence.
Наибольшая серологическая активность при использовании в качестве антигена синтетического фрагмента мю- и дельта-опиатных рецепторов наблюдалась при ковалентном связывании с частицами полистирола с карбоксильными группами (диаметр 0,99-1,05 мкм). The highest serological activity when using a synthetic fragment of mu and delta opiate receptors as antigen was observed upon covalent binding to polystyrene particles with carboxyl groups (diameter 0.99-1.05 μm).
Величины антител к мю- и дельта-опиатным рецепторам в группах больных опийной наркоманией, эпилепсией и здоровых доноров, выявленные методом РЛА представлены в табл.1. Повышенными считали уровень антител в количестве 10,4 мкг/мл и более, который не наблюдался в сыворотках здоровых людей. Группа больных опийной наркоманией отличалась высокой частотой обнаружения повышенного уровня антител к опиатным рецепторам. Уровень антител в количестве 10,4 мкг/мл и выше у больных опийной наркоманией регистрировался в 71,4%. Среднее количество специфических аутоантител в группе больных опийной наркоманией составило 9,91±0,36 мкг/мл, что достоверно в 2,8 раз выше по сравнению с уровнем антител у здоровых доноров. Отмечено, что частота выявления специфических аутоантител в количестве 10,4 мкг/мл и выше была повышена у больных опийной наркоманией. Полученные данные свидетельствуют о специфичности выявленных нами изменений уровня антител к мю- и дельта-опиатным рецепторам у больных опийной наркоманией. The values of antibodies to mu- and delta-opiate receptors in groups of patients with opiate addiction, epilepsy and healthy donors identified by the X-ray method are presented in Table 1. Elevated levels of antibodies were considered in the amount of 10.4 μg / ml or more, which was not observed in the sera of healthy people. The group of patients with opiate addiction was characterized by a high frequency of detection of an increased level of antibodies to opiate receptors. The level of antibodies in the amount of 10.4 μg / ml and higher in patients with opiate addiction was recorded in 71.4%. The average number of specific autoantibodies in the group of patients with opium addiction was 9.91 ± 0.36 μg / ml, which is significantly 2.8 times higher than the level of antibodies in healthy donors. It was noted that the frequency of detection of specific autoantibodies in the amount of 10.4 μg / ml and higher was increased in patients with opium addiction. The data obtained indicate the specificity of the revealed changes in the level of antibodies to mu- and delta-opiate receptors in patients with opium addiction.
Уровень антител к мю- и дельта-опиатным рецепторам у больных опийной наркоманией также был определен методом ИФА. Сравнительные данные по методу ИФА и РЛА представлены в табл.2. Показано повышенное содержание антител у 71,4% больных. Установлена достоверно корреляция между уровнями антител у больных опийной наркоманией, измеренными с помощью РЛА и ИФА (r=0,77; р<0,05). У наркоманов с повышенным уровнем антител, выявленным РЛА, результаты не всегда подтверждались ИФА. Наблюдаемые различия могут быть связаны с тем, что в ИФА измерялось содержание иммуноглобулина G к исследуемым антигенам, а в РЛА определялись антитела и других основных изотипов М и А. Таким образом, в проведенном нами сравнительном исследовании методами ИФА и РЛА были установлены достоверные различия содержания антител у больных опийной наркоманией и здоровых доноров, что может свидетельствовать об индукции антител к опиатному рецептору при хронической опийной интоксикации. Антитела к опиатным рецепторам в крови людей, употребляющих наркотики, служат важным диагностическим признаком и позволяют осуществить быстрый анализ образцов крови у значительного (до 200 человек) количества больных одновременно. Это дает возможность быстро и эффективно проводить диагностику опийной наркомании. Применение заявляемой тест-системы позволит расширить методы текущего контроля за состоянием больного и, тем самым, оптимизировать процесс лечения. The level of antibodies to mu- and delta-opiate receptors in patients with opium addiction was also determined by ELISA. Comparative data by the method of ELISA and XRD are presented in table.2. An increased antibody content was shown in 71.4% of patients. A significant correlation was established between antibody levels in opiate addiction patients measured using RLA and ELISA (r = 0.77; p <0.05). In drug addicts with elevated levels of antibodies detected by RLA, the results were not always confirmed by ELISA. The observed differences may be due to the fact that the ELISA measured the content of immunoglobulin G to the studied antigens, and antibodies and other major isotypes M and A were determined in the X-ray spectroscopy. in patients with opiate addiction and healthy donors, which may indicate the induction of antibodies to the opiate receptor in chronic opium intoxication. Antibodies to opiate receptors in the blood of people who use drugs serve as an important diagnostic feature and allow rapid analysis of blood samples in a significant (up to 200 people) number of patients simultaneously. This makes it possible to quickly and efficiently diagnose opium addiction. The use of the inventive test system will expand the methods of monitoring the patient’s condition and, thereby, optimize the treatment process.
Заявляемую тест-систему получают по следующей методике/
Иммобилизацию синтетического пептидного фрагмента на частицы латекса осуществляют так. Перед сенсибилизацией частицы латекса отмывают два раза фосфатным буфером рН 8,0, доводят до концентрации 1% и смешивают с антигеном. Сенсибилизирующая доза антигена составляет 0,1-10 мкг на 1 мл латекса. Смесь инкубируют 1,5 ч при 37oС, частицы отмывают фосфатным буфером и инкубируют в глициновом буфере рН 7,8 еще в течение 1 ч для инактивации оставшихся свободными функциональных групп. Затем частицы латекса переводят в фосфатный буфер. Рабочая концентрация латекса для реакции в планшетах составляет 0,05%. Чувствительность латексного диагностикума оценивают в РЛА.The inventive test system is obtained by the following method /
The immobilization of a synthetic peptide fragment on latex particles is carried out as follows. Before sensitization, the latex particles are washed twice with phosphate buffer pH 8.0, adjusted to a concentration of 1% and mixed with antigen. A sensitizing dose of antigen is 0.1-10 μg per 1 ml of latex. The mixture was incubated for 1.5 hours at 37 ° C. , the particles were washed with phosphate buffer and incubated in a pH 7.8 glycine buffer for another 1 hour to inactivate the remaining free functional groups. The latex particles are then transferred to phosphate buffer. The working concentration of latex for the reaction in the tablets is 0.05%. The sensitivity of the latex diagnosticum is assessed in RLA.
При изучении чувствительности латексного диагностикума с различными антигенами выявляют конечный титр антител со стандартной сывороткой в зависимости от видов латекса. РЛА ставят микрометодом в полистироловых планшетах для иммунологических реакций с U-образным дном. Сыворотки добавляют в объеме 75 мкл в первую лунку каждого ряда, а затем раститровывают с двухкратным шагом разведении в 75 мкл изотонического раствора NaCl. В каждую лунку добавляют по 75 мкл латексного диагностикума. Реакцию учитывают визуально через 16-20 ч по 4-крестовой системе. За титр сыворотки принимают максимальное ее разведение, при котором наблюдается агглютинация латекса на "4+". При титровании сывороток с контрольным латексом наблюдают полное отсутствие агглютинации латекса. When studying the sensitivity of a latex diagnosticum with various antigens, the final antibody titer with standard serum is detected depending on the types of latex. Radar systems are placed by micromethod in polystyrene plates for immunological reactions with a U-shaped bottom. Serum is added in a volume of 75 μl to the first well of each row, and then triturated in two steps of dilution in 75 μl of isotonic NaCl solution. 75 μl latex diagnosticum is added to each well. The reaction is taken into account visually after 16-20 hours on a 4-cross system. Serum titer is taken to be its maximum dilution, at which latex agglutination is observed at "4+". When titrating serums with control latex, a complete absence of latex agglutination is observed.
Количественное определение связавшихся с латексом антител проводили при помощи построения соответствующей калибровки. Реакция латекс агглютинации (использованы частицы полистирола с активными карбоксильными группами диаметром 0,99-1,05 мкм) наблюдалась при минимальной концентрации специфических антител (IgA + IgG + IgM), равной 2,6 мкг/мл. Данная цифра была получена путем вычитания количества неспецифически связавшихся антител с несенсибилизированным пептидом латексом от общего количества связавшихся антител с сенсибилизированным латексом. Связавшиеся антитела смывают раствором 3М NaCl. Содержание белка в элюенте определяют по стандартному методу Лоури. Концентрацию белка определяют, используя калибровочную кривую, построенную для стандартного белка в диапазоне от 1 μg/ml до 1500 μg/ml. Оптическую плотность измеряют при длине волны 750 нм. Таким образом, полученная калибровка позволяет количественно оценивать результаты РЛА путем умножения приведенного коэффициента на максимальный титр разведения сыворотки, при котором наблюдается реакция латекс агглютинации. Quantification of latex-bound antibodies was performed by constructing an appropriate calibration. The agglutination latex reaction (polystyrene particles with active carboxyl groups with a diameter of 0.99-1.05 μm were used) was observed at a minimum concentration of specific antibodies (IgA + IgG + IgM) of 2.6 μg / ml. This figure was obtained by subtracting the number of non-specifically bound antibodies with non-sensitized latex peptide from the total number of bound antibodies with sensitized latex. Bound antibodies are washed with a solution of 3M NaCl. The protein content of the eluent is determined by the standard Lowry method. Protein concentration is determined using a calibration curve plotted for a standard protein in the range of 1 μg / ml to 1,500 μg / ml. The optical density is measured at a wavelength of 750 nm. Thus, the calibration obtained allows us to quantify the results of XRD by multiplying the reduced coefficient by the maximum titer of serum dilution, at which the latex agglutination reaction is observed.
Для оценки связи между показателями использовали коэффициент корреляции Пирсона, статистическую достоверность межгрупповых различий вычисляли по t-критерию Стьюдента. To assess the relationship between the indicators, the Pearson correlation coefficient was used, the statistical reliability of the intergroup differences was calculated by the Student t-test.
Пример выполнения экспресс-диагностики опийной наркозависимости. Для проведения опыта была приготовлена тест-система. Полистирол с активными карбоксильными группами диаметром 1,0 мкм отмывали 2 раза фосфатным буфером рН 8,0, после чего приготовили его 1% раствор и смешали с антигеном так, чтобы на 1 мл латекса приходилось 0,2 мкг антигена. После инкубации при 37oС в течение 1,5 ч частицы отмывали фосфатным буфером и снова инкубировали в течение 1 ч в глициновом буфере рН 7,8. Частицы латекса с антигеном перенесли в фосфатный буфер, их концентрация в нем составляет 1%. Для определения уровня антител в крови наркозависимых (опийная наркомания) были приготовлены сыворотки 10 больных. Анализ проводили в полистироловых планшетах для иммунологических реакций с U-образным дном. Сыворотки добавили в объеме 75 мкл в первую лунку каждого ряда, а затем раститровывали с двухкратным шагом разведений в 75 мкл изотонического раствора NaCl. В каждую лунку добавили по 75 мкл латексного диагностикума. Реакцию учитывали визуально через 16-20 ч по 4-крестовой системе. За титр сыворотки принимали максимальное ее разведение, при котором наблюдали агглютинацию латекса на "4+". При титровании сывороток с контрольным латексом наблюдали полное отсутствие агглютинации латекса. У всех 10 пациентов с опийной наркоманией отмечено наличие повышенного уровня антител. Величина титра антител к опиатным рецепторам составляет приблизительно 10,4 мкг/мл и выше.An example of the rapid diagnosis of opium addiction. For the experiment, a test system was prepared. Polystyrene with active carboxyl groups with a diameter of 1.0 μm was washed 2 times with phosphate buffer pH 8.0, after which it was prepared with a 1% solution and mixed with antigen so that 0.2 μg of antigen per 1 ml of latex. After incubation at 37 ° C. for 1.5 hours, the particles were washed with phosphate buffer and again incubated for 1 hour in a glycine buffer, pH 7.8. Particles of latex with antigen were transferred to a phosphate buffer, their concentration in it is 1%. To determine the level of antibodies in the blood of drug addicts (opium addiction), serums of 10 patients were prepared. The analysis was carried out in polystyrene plates for immunological reactions with a U-shaped bottom. Serum was added in a volume of 75 μl to the first well of each row, and then it was triturated with a double dilution step in 75 μl of an isotonic NaCl solution. 75 μl latex diagnosticum was added to each well. The reaction was taken into account visually after 16-20 hours using a 4-cross system. Serum titer was taken to be its maximum dilution, at which latex agglutination at “4+” was observed. When titration of serums with control latex was observed a complete absence of latex agglutination. All 10 patients with opiate addiction have an increased level of antibodies. The titer of antibodies to opiate receptors is approximately 10.4 μg / ml and above.
Проверка сыворотки крови 10 здоровых людей при постановке РЛА в таком же иммунологическом планшете выявило наличие антител в количестве, менее и равном 3,33 мкг/мл. A test of the blood serum of 10 healthy people when staging an RLA in the same immunological tablet revealed the presence of antibodies in an amount less than and equal to 3.33 μg / ml.
Заявляемая тест-система позволяет достоверно определять опийную наркоманию и выявлять группу риска. Она может быть широко использована в медицинской практике благодаря тому что не требует специального оборудования и результаты анализа определяются визуально. The inventive test system allows you to reliably determine opium addiction and identify a risk group. It can be widely used in medical practice due to the fact that it does not require special equipment and the results of the analysis are determined visually.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Пятницкая И.Н. (1994) Наркомании. М., 544 с.LIST OF REFERENCES
1. Pyatnitskaya I.N. (1994) Addiction. M., 544 p.
2. Pichini S., Pacifici R., Altieri I., Pellegrini M., Zuccaro P. (1999) J. Anal Toxicol., 23, 343-348. 2. Pichini S., Pacifici R., Altieri I., Pellegrini M., Zuccaro P. (1999) J. Anal Toxicol., 23, 343-348.
3. Eldefrawi M. E. , Azer N.L., Nath N., Anis N.A., Bangalore M.S.,; O'Connell K. P. , Schwartz R.P., Wright J. (2000) Appi Biochem Biotechnol, 87(1), 25-35. 3. Eldefrawi M. E., Azer N. L., Nath N., Anis N. A., Bangalore M. S.,; O'Connell K. P., Schwartz R. P., Wright J. (2000) Appi Biochem Biotechnol, 87 (1), 25-35.
4. Гамалея Н.Б. (1994) Вопросы наркологии, 2, 47-53. 4. Gamaleya NB (1994) Issues of Addiction Medicine, 2, 47-53.
5. Изыкенова Г. А., Сиренко В.В., Дамбинова С.А. (1995) Вопросы наркологии. 1, 45-49. 5. Izykenova G. A., Sirenko V. V., Dambinova S. A. (1995) Addiction issues. 1, 45-49.
6. Дамбинова С. А. , Изыкенова Г.А. (1997) Журнал высшей нервной деятельности, 42(2), 1551-1556. 6. Dambinova S. A., Izykenova G. A. (1997) Journal of Higher Nervous Activity, 42 (2), 1551-1556.
7. Izykenova G.A., Smith J.E. (2000) Identification of autoantibodies to peptide candidate for opiate receptors in peripheral fluids and brain. Abstr. of CPDD Meeting, Puerto-Rico, June 2000, S238C. 7. Izykenova G.A., Smith J.E. (2000) Identification of autoantibodies to peptide candidate for opiate receptors in peripheral fluids and brain. Abstr. of CPDD Meeting, Puerto-Rico, June 2000, S238C.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001121965A RU2193199C1 (en) | 2001-08-07 | 2001-08-07 | Test system for detecting opium narcomania |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001121965A RU2193199C1 (en) | 2001-08-07 | 2001-08-07 | Test system for detecting opium narcomania |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2193199C1 true RU2193199C1 (en) | 2002-11-20 |
Family
ID=20252386
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001121965A RU2193199C1 (en) | 2001-08-07 | 2001-08-07 | Test system for detecting opium narcomania |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2193199C1 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2222253C2 (en) * | 2002-01-22 | 2004-01-27 | ФГУ Омская государственная медицинская академия | Method for predicting opium narcomania |
| RU2250467C1 (en) * | 2003-12-25 | 2005-04-20 | Институт физиологически активных веществ Российской Академии Наук, Общество с ограниченной ответственностью "ДИАМЕДИКА" | Method for predicting the fact for the intake of narcotic substances |
| RU2297634C2 (en) * | 2005-03-02 | 2007-04-20 | Светлана Александровна Дамбинова | Drug addiction-revealing diagnostic reagent kit "narco-ifa-peptide test" |
| RU2299005C2 (en) * | 2005-05-11 | 2007-05-20 | ГОУ ВПО Омская Государственная Медицинская Академия | Method for quick-test diagnostics of opium addiction |
| RU2325644C2 (en) * | 2005-07-26 | 2008-05-27 | Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН | Method of clinical and biochemical analysis of biological body fluids |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5486204A (en) * | 1994-09-20 | 1996-01-23 | University Of Texas Health Science Center Houston | Method of treating a non-penetrating head wound with hypothermia |
| US5527810A (en) * | 1992-11-06 | 1996-06-18 | Eli Lilly And Company | Decahydroisoquinoline compounds as excitatory amino acid receptor antagonists |
| RU2122735C1 (en) * | 1996-10-29 | 1998-11-27 | Государственный научный центр наркологии МЗ МП РФ | Method of diagnosing opium drug addiction |
-
2001
- 2001-08-07 RU RU2001121965A patent/RU2193199C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5527810A (en) * | 1992-11-06 | 1996-06-18 | Eli Lilly And Company | Decahydroisoquinoline compounds as excitatory amino acid receptor antagonists |
| US5486204A (en) * | 1994-09-20 | 1996-01-23 | University Of Texas Health Science Center Houston | Method of treating a non-penetrating head wound with hypothermia |
| RU2122735C1 (en) * | 1996-10-29 | 1998-11-27 | Государственный научный центр наркологии МЗ МП РФ | Method of diagnosing opium drug addiction |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| IZYKENOVA G.A. et al. Identification of autoantiboodies to peptide candidate for opiate receptors in peripheral fluids and brain. Abstr. of CPDD Meeting, Puerto-Rico, June 2000, S 238 C. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2222253C2 (en) * | 2002-01-22 | 2004-01-27 | ФГУ Омская государственная медицинская академия | Method for predicting opium narcomania |
| RU2250467C1 (en) * | 2003-12-25 | 2005-04-20 | Институт физиологически активных веществ Российской Академии Наук, Общество с ограниченной ответственностью "ДИАМЕДИКА" | Method for predicting the fact for the intake of narcotic substances |
| RU2297634C2 (en) * | 2005-03-02 | 2007-04-20 | Светлана Александровна Дамбинова | Drug addiction-revealing diagnostic reagent kit "narco-ifa-peptide test" |
| RU2299005C2 (en) * | 2005-05-11 | 2007-05-20 | ГОУ ВПО Омская Государственная Медицинская Академия | Method for quick-test diagnostics of opium addiction |
| RU2325644C2 (en) * | 2005-07-26 | 2008-05-27 | Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН | Method of clinical and biochemical analysis of biological body fluids |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2905218B2 (en) | Immunoassay for detection of HIVI antigen | |
| JP2675676B2 (en) | Immunological assay method for determining antibodies in biological fluids and kits implementing the method | |
| EP1238284B1 (en) | Diagnostic assay for stroke | |
| US5340720A (en) | Methods of diagnosing and monitoring rheumatic diseases | |
| Menge et al. | Conformational epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein are targets of potentially pathogenic antibody responses in multiple sclerosis | |
| RU2193199C1 (en) | Test system for detecting opium narcomania | |
| CN113156143A (en) | Blood group irregular antibody specificity identification method and reagent thereof | |
| EP2064554A2 (en) | Improved immunoassay involving mutant antigens to reduce unspecific binding | |
| Tomazic-Jezic et al. | Protein and allergen assays for natural rubber latex products | |
| Karcher et al. | Anti-neurofilament antibodies in blood of patients with neurological diseases | |
| JPH07140144A (en) | Method for measuring allergen-specific IgE antibody and method for measuring antigen-antibody complex | |
| Delamarche et al. | An ELISA technique for the measurement of C1q in cerebrospinal fluid | |
| EP1141710A2 (en) | A METHOD OF DETECTING AND/OR QUANTIFYING A SPECIFIC IgE ANTIBODY IN A LIQUID SAMPLE | |
| Shimizu et al. | A solid-phase radioimmunoassay for detection of human antibodies. I. Measurement of IgG antibody to bee venom antigens | |
| RU2218569C1 (en) | Method for detecting risk groups in developing nervous-psychic diseases | |
| Eldefrawi et al. | A sensitive solid-phase fluoroimmunoassay for detection of opiates in urine | |
| US20110256641A1 (en) | Methods and Systems for Detecting Free IgE | |
| JP2020519895A (en) | Diagnostic biomarkers for detecting, subtyping and/or assessing progression of multiple sclerosis | |
| Ewins et al. | A clinical comparison of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and haemagglutination (TRC) in the routine detection of antithyroglobulin antibodies | |
| CN114835808A (en) | Blocking agent capable of directionally eliminating false positive and preparation method thereof | |
| RU2818115C1 (en) | Method for determining avidity index of autoantibodies in human blood serum on hydrogel biochips | |
| RU2258934C2 (en) | Method for predicting the flow of nervous-psychic diseases | |
| RU2259567C2 (en) | Method for determining nervous system pathology risk group by means of screening and health state monitoring of people suffering from neuropsychical diseases | |
| RU2415430C1 (en) | Method for detecting circulating immune complexes | |
| JP3779798B2 (en) | Measuring method of CA125 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050808 |