RU2191010C2 - Сложные эфиры 5-аминолевулиновой кислоты в качестве фотосенсибилизаторов в фотохимиотерапии - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается применения эфиров 5-аминолевулиновой кислоты для фотохимиотерапии и диагностики рака, псориаза, старческого кератоза, кожных ссадин или царапин, или бактериальных, вирусных или грибковых инфекций. Изобретение позволяет лучше проникать в опухоль или другие новообразования и является более эффективным фотосенсибилизатором. 6 с. и 5 з.п. ф-лы, 23 ил.

Description

Настоящее изобретение относится к производным 5-аминолевулиновой кислоты (ALA) и, в частности к сложным эфирам 5-аминолевулиновой кислоты, предназначенным для использования в качестве фотосенсибилизаторов в фотохимиотерапии или диагностике.

Фотохимиотерапия или известная также как фотодинамическая терапия (PDT) является прогрессивным методом лечения различных нарушений или поражений (аномалий) кожи, других эпителиальных органов или слизистой оболочки, особенно, рака или предрака, а также некоторых незлокачественных или доброкачественных поражений, например, таких болезней кожи, как псориаз. Фотохимиотерапия предполагает применение фотосенсибилизирующих агентов или фотосенсибилизаторов (фотохимиотерапевтических средств) к пораженному участку тела и последующее воздействие фотоактивирующим светом с целью активации фотосенсибилизаторов и превращения их в цитоксическую форму, позволяющую уничтожить пораженные клетки или снизить их пролиферативный потенциал.

Известен целый ряд фотосенсибилизаторов, включающих в частности псоралены, порфирины, хлорины и фталоцианины. Эти лекарственные средства становятся токсическими под воздействием света.

Фотосенсибилизирующие лекарственные средства могут оказывать свое действие с помощью различных механизмов прямо или косвенно. Так, например, одни фотосенсибилизаторы сами становятся токсическими, когда они активируются под воздействием света, в то время как другие действуют, генерируя токсические вещества, например, оксиданты, такие как атомарный кислород или другие свободные радикалы на основе кислорода, которые являются крайне разрушительными для клеточного вещества и биомолекул, таких как липиды, белки и нуклеиновые кислоты. Псоралены являются примером фотосенсибилизаторов прямого действия; под воздействием света они образуют аддукты и поперечные связи между двумя цепями молекул ДНК, ингибируя, таким образом, синтез ДНК. Такое лечение опасно тем, что могут возникнуть нежелательные побочные эффекты мутагенного и канцерогенного характера.

Этот недостаток модно устранить, выбирая фотосенсибилизаторы с альтернативным, опосредованным или косвенным механизмом действия. Например, порфирины, которые действуют опосредованно в результате образования токсических разновидностей кислорода, не вызывают мутационных побочных эффектов и являются более благоприятными кандидатами для фотохимиотерапии. Порфирины являются природными предшественниками синтеза гема. В частности, гем образуется при включении железа (Fe³⁺) в протопорфирин IX (Рр) под действием фермента феррохелатаза. Рр является крайне сильным фотосенсибилизатором, в то время как гем не обладает фотосенсибилизирущим действием.

Одно такое лекарственное средство на основе профирина, фотофрин, недавно признано эффективным фотосенсибилизатором для лечения некоторых видов раковых опухолей. Главным недостатком этого средства является то, что его необходимо вводить парентерально, обычно внутривенно, при этом оно вызывает фотосенсибилизацию кожи, которая может сохраняться в течение нескольких недель после внутривенной инъекции. Фотофрин состоит из больших олигомеров порфирина и не свободно проникает в кожу при местном применении. Аналогичные проблемы возникают и в случае использования других фотосенсибилизаторов на основе порфирина, таких как, называемое "производное гематопорфирина" (Hpd), которое также предложено для применения в фотохимиотерапии рака (см., например, S. Dougherty. J. Natl. Cancer Ins., 1974, 1333, 52; Kelly and Snell, J. Urol. 1976, 115, 150). Производное гематопорфирина является комплексной смесью, которую получают в результате обработки гематопорфирина уксусной и серной кислотами с последующим растворением ацетилированного продукта в щелочи.

Чтобы устранить эти недостатки, были проведены исследования с целью определения фотохимиотерапевтического потенциала предшественников Pp. В частности, были проведены исследования 5-аминолевулиновой кислоты (ALA), которая является предшественником Рр, с целью ее использования в качестве фотохимиотерапевтического средства для лечения некоторых видов рака кожи. ALA, образуемая из сукцинил - СоА и глицина на первой стадии синтеза гема, способна в ограниченной степени проникать в кожу и стимулировать локальное образование протопорфирана IX; поскольку действие феррохелатазы (металлирующего фермента) ограничивает скорость синтеза гема, избыток ALA способствует накоплению Рр, являющегося фотосенсибилизатором. Таким образом, нанесение ALA на опухоли кожи и последующее подвержение опухоли воздействию света через несколько часов, может оказывать благоприятное фотохимиотерапевтическое действие (см. , например, WО 91/01727). Поскольку 5-аминолевулиновая кислота более свободно проникает в кожу, пораженную базально-клеточной и плоскоклеточной карциномами, чем в здоровую кожу, и поскольку концентрация феррохелатазы в опухолях кожи является низкой, установлено, что местное применение ALA избирательно увеличивает продуцирование Рр в опухолях.

Однако хотя применение ALA является значительным достижением в этой области, фотохимиотерапия на основе ALA не всегда оказывается полностью удовлетворительной. ALA не способна достаточно эффективно проникать во все опухоли и другие ткани, чтобы сделать возможным лечение целого ряда опухолей или других заболеваний и ALA имеет также тенденцию быть нестабильной в фармацевтических препаратах. Поэтому существует потребность в более совершенных фотохимиотерапевтических средствах.

Настоящее изобретение направлено на решение этой проблемы и, в частности, на создание фотохимиотерапевтических средств, которые способны лучше проникать в опухоль или другие новообразования и оказывают более эффективное фотохимиотерапевтическое действие по сравнению с известными средствами.

Таким образом, одним аспектом настоящего изобретения является создание соединений, которые являются сложными эфирами 5-аминолевулиновой кислот или их фармацевтически приемлемыми солями, для применения в фотохимиотерапии или диагностике.

В сложных эфирах по данному изобретению 5-аминогруппа может быть замещена или не замещена, в последнем случае получаются сложные эфиры 5-аминолевулиновой кислоты.

Более конкретно, соединениями для использования по настоящему изобретению являются сложные эфиры 5-аминолевулиновых кислот с возможно или необязательно замещенными алкалонами, то есть сложные алкиловые эфиры или замещенные сложные алкиловые эфиры.

В базе данных Xfire, в источниках 3060978, 5347132, 5499790, 5620924, 5633390, 5991317 и 6517740 (Beilstein); Cosmo Sogo Kenkyusho KK, Patent Abstracts Японии, т. 16; N 156 (С-0930), 16.4.1992; ЕР-А-316179, С 07 D 495/10 (Tokuyama Soda KK); GB-A-2058077, С 07 С 103/52 (Hudson et al.) и заявке на патент Германии DE-А-2411382, С 07 D 221/26 (Boehrihgen Sohn Ingelheim) описываются производные сложных эфиров 5-аминолевуленовой кислоты, их производные и соли, а также способы их получения.

Поэтому альтернативно можно сказать, что объектом данного изобретения являются соединения формулы I
R₂ ²N-CH₂COCH₂-СН₂СО-OR¹ (I)
(в которой R¹ может обозначать алкил, возможно (т.е. необязательно) замещенный гидроксильной, алкоксильной, ацилокси, алкоксикарбонилокси, амин, арильной, оксо или фторогруппами, цепь которого необязательно прервана атомами кислорода, азота, серы или фосфора; и каждый R², которые могут иметь одинаковые или разные значения, каждый обозначает атом водорода или группу R¹) и их соли для использования в фотохимиотерапии или диагностике.

Замещенные алкильные группы R¹ могут быть моно- или полизамещены. Так, подходящие группы R¹ включают, например, незамещенный алкил, алкоксиалкил, гидроксиалкоксиалкил, полигидроксиалкил, гидроксиполиалкиленоксиалкил и тому подобные. Термин "ацил", используемый в этом описании изобретения, включает карбоксилатные и карбонатные группы; так, ацилоксизамещенные алкильные группы включают, например, алкилкарбонилоксиалкил. В таких группах любые алкиленовые части предпочтительно имеют столько атомов углерода, сколько указано ниже для алкильных групп. Предпочтительными арильными группами являются фенил и моноциклические 5-7-членные гетероароматические группы, особенно фенил, и такие группы сами по себе могут быть необязательно замещены.

Типичные замещенные алкильные группы R¹ включают алкоксиметильные, алкоксиэтильные и алкоксипропильные группы или ацилоксиметильные, ацилоксиэтильные и ацилоксипропильные группы, например, пивалоилоксиметил.

Предпочтительными соединениями для использования по данному изобретению являются такие соединения, в которых R¹ обозначает незамещенную алкильную группу и/или каждый R² обозначает атом водорода.

Термин "алкил" включает любую алифатическую насыщенную или ненасыщенную углеводородную группу с длинной или короткой, прямой или разветвленной цепью. Ненасыщенные алкильные группы могут быть моно- или полиненасыщенными и включают как алкенильные, так и алкинильные группы. Такие группы могут иметь до 40 атомов углерода. Однако предпочтение отдается алкильным группам, имеющим до 10 атомов углерода, например, 8, более предпочтительно до 6 атомов углерода, и наиболее предпочтительно до 4 атомов углерода.

Следует особо отметить метиловый эфир ALA, этиловый эфир ALA, пропиловый эфир ALA, гексиловый эфир ALA, гептиловый эфир ALA, октиловый эфир ALA и их соли, которые являются предпочтительными соединениями для использования по настоящему изобретению.

Соединения по настоящему изобретению можно получить при помощи стандартных методов и способов, хорошо известных в этой области для получения производных многофункциональных соединений, и особенно, путем сложной этерификации. Как известно, такая этерификация соединений может включать защиту и снятие защиты с соответствующих групп, в результате чего лишь необходимые группы остаются активными и принимают участие в реакции в условиях этерификации. Так, например, во время этерификации могут быть защищены заместители замещенных алканолов, используемых для получения сложных эфиров. Аналогичным образом, группа NR₂ ² в соединении, отдающем эту группу соединениям формулы I, может быть защищена во время реакции, после чего с нее снимают защиту. Такие методы защиты и снятия защиты хорошо известны в этой области для получения производных, и в частности, сложных эфиров хорошо известных аминокислот, см., например, Mcomie и работе "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum, 1973, и Т. W. Greene в работе "Protective Groups in Organic Chemistry", Wiley - Interscience, 1981.

Другим аспектом настоящего изобретения является создание способа получения соединений по данному изобретению, включающего образование сложного эфира карбоксигруппы 5-аминолевулиновой кислоты.

Таким образом, данным изобретением предусматривается способ получения соединений по данному изобретению, включающий взаимодействие 5-аминолевулиновой кислоты или ее этерифицируемого производного с алканолом или его производным, образующим сложный эфир.

Более конкретно, данный аспект изобретения предоставляет способ получения соединений формулы I, который включает, по крайней мере, одну из следующих стадий:
(а) взаимодействие соединения формулы II
R₂ ²N-СН₂СОСН₂-СН₂СО-X (II)
(в которой X обозначает отщепляемую группу, например, гидроксильную группу, атом галогена или алкоксигруппу, или СЩХ обозначает группу ангидрида кислоты и R² имеет указанные выше значения)
с соединением формулы III
R¹-ОН (III)
(в которой R¹ имеет указанные выше значения); и
(b) превращение соединения формулы I в его фармацевтически приемлемую соль.

Реакцию на стадии (а) можно удобно осуществлять в растворителе или в смеси растворителей, таких как вода, ацетон, диэтиловый эфир, метилформамид, тетрагидрофуран и т. д. , при температурах вплоть до температуры кипения смеси, предпочтительно при температуре окружающей среды.

Условия реакций этерификации зависят от используемого спирта, и указанные условия можно выбирать с учетом достижения максимального выхода сложного эфира. Поскольку реакции этерификации являются обратимыми равновесными реакциями, условия реакции можно выбирать так, чтобы получить максимальный выход сложного эфира. Такие условия можно создать, выбрав растворитель, который способен удалять воду, образующуюся во время обычной реакции этерификации, путем образования азеотропа с водой. Примерами таких растворителей могут служить ароматические углеводороды или другие, способные образовывать азеотропы с водой, например, некоторые хлорированные углеводороды, такие как хлороформ. Чтобы получить низшие сложные эфиры 5-аминолевулиновой кислоты, равновесную реакцию можно сместить в сторону сложного эфира благодаря использованию большого избытка спирта. В случае других сложных эфиров равновесное состояние может быть смещено в сторону эфирного продукта благодаря использованию большого избытка кислоты.

Реакции этерификации хорошо известны в этой области. Они, например, описаны Саулом Патаи (Saul Patai, "The chemistry of the carboxylic acids and esters", ch. 11, p. 505, Interscience 1969) и Губен Вейлем (Houban Weyl, Methoden der Organische Chemie, Band E5, "Carbonsauren und carbonsauren - derivate", p. 504, Georg Thieme Verlag, 1985). Получение производных аминокислот описано в выпуске XI/2 той же серии (Houben Weyl, Metoden der Organische Chemie, Band XI/2, "Stickstoffverbindungen", p. 269, Georg Thieme Verlag, 1958).

Реакцию можно удобно осуществлять в присутствии катализатора, например, неорганической или органической кислоты, или агента, связывающего кислоту, такого как основание.

Соединения, используемые в качестве исходных веществ, известны из литературы и во многих случаях выпускаются промышленностью или могут быть получены при помощи известных методов. ALA, например, производится фирмами Sigma или Protocure, Осло, Норвегия.

Как указывалось выше, соединения по настоящему изобретению могут принимать форму фармацевтически приемлемых солей. Такие соли предпочтительно являются кислотно-аддитивными солями с физиологически приемлемыми органическими или неорганическими кислотами. Подходящими кислотами являются, например, хлороводородная, бромоводородная, серная, фосфорная, уксусная, молочная, лимонная, винная, янтарная, малеиновая, фумаровая и аскорбиновая кислоты. Способы получения указанных солей являются обычными в этой области.

Как указывалось выше, соединения по настоящему изобретению и их соли обладают ценными фармакологическими свойствами, а именно, они являются фотосенсибилизаторами, что делает их полезными в качестве фотохимиотерапевтических средств.

Подобно ALA эти соединения проявляют свое действие путем усиления образования Рр; гидролитические ферменты, такие как эстеразы, присутствующие в клетках-мишенях, расщепляют введенные в нужное место сложные эфиры с образованием ALA, которая затем участвует в синтезе гема и ведет к образованию Рр. Однако соединения по настоящему изобретению характеризуются рядом преимуществ по сравнению с самой 5-аминолевулиновой кислотой. Во-первых, эти соединения способны лучше проникать в кожу и другие ткани по сравнению с ALA; причем они проникают гораздо глубже и быстрее. Это является важным преимуществом особенно в случае местного применения. Во-вторых, как было найдено, сложные эфиры в гораздо большей степени способствуют образованию Рр, чем ALA; уровни образования Рр после введения сложных эфиров ALA гораздо выше, чем после введения ALA. В-третьих, соединения по настоящему изобретению характеризуются более высокой избирательностью в отношении обрабатываемых тканей-мишеней, а именно, эффект усиления образования Рр локализуется на участке поражения и не распространяется на окружающие ткани. Это особенно очевидно в случае опухолей. И наконец, эти соединения после введения лучше локализуются в ткани-мишени. Это особенно важно при системном применении, так как позволяет уменьшить или полностью устранить нежелательные фотосенсибилизирующие эффекты, о которых сообщается в литературе в случае применения других фотосенсибилизаторов на основе порфирина.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая описанное выше соединение или его фармацевтически приемлемую соль вместе с, по крайней мере, одним фармацевтическим носителем или эксципиентом.

Согласно еще одному аспекту данного изобретения предлагается использование описанного выше соединения или его фармацевтически приемлемой соли для получения терапевтического средства для применения в фотохимиотерапии, и особенно, для лечения нарушений или поражений (аномалий) наружных или внутренних поверхностей тела, чувствительных к фотохимиотерапии.

Нарушения и поражения, которые можно лечить согласно настоящему изобретению, включают любые злокачественные, злокачественные и незлокачественные аномалии или нарушения, чувствительные к фотохимиотерапии, например, опухоли или другие новообразования, кожные болезни, такие как псориаз или старческий кератоз, эрозия кожи и другие болезни или инфекции, например, бактериальные, вирусные или грибковые инфекции, например инфекции, вызываемые вирусом герпеса. Изобретение особенно пригодно для лечения заболеваний, нарушений или аномалий с обозначенными участками поражения, на которые можно нанести указанные композиции (термин "поражение" используется здесь в широком смысле и включает опухоли и подобные заболевания).

Внутренние и наружные поверхности тела, которые можно лечить по настоящему изобретению, включают кожу и все другие эпителиальные и серозные поверхности, в том числе, например, слизистую оболочку, выстилки органов, например, респираторных, желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы, и желез с протоками, ведущими к таким поверхностям (например, печень, фолликулы волос с сальными железами, молочные железы и семенные пузырьки). Помимо кожи такие поверхности включают, например, выстилку влагалища, матки и мочевого пузыря. Такие поверхности могут также включать полости, образовавшиеся в теле после иссечения пораженной или раковой ткани, например, полости в головном мозге после иссечения опухолей, таких как глиомы.

Таким образом, типичными примерами поверхностей являются: (i) кожа и конъюнктива; (ii) выстилка рта, глотки, пищевода, желудка, кишечника и кишечных отростков, прямой кишки и анального канала; (iii) выстилка носовых ходов, носовых пазух, носоглотки, трахеи, бронхов и бронхиол; (iv) выстилка мочеточников, мочевого пузыря и мочеиспускательного канала; (v) выстилка влагалища, шейки матки и матки; (vi) пристеночная и висцеральная плевра; (vii) выстилка брюшинной и тазовой полостей, а также поверхности органов, расположенных в этих полостях; (viii) твердая мозговая оболочка и менингеальные оболочки; (ix) любые опухоли в твердых тканях, которые могут быть доступны для фотоактивирующего света, например, непосредственно во время хирургического вмешательства или при помощи оптического волокна, введенного через иглу.

Композиции по данному изобретению можно получить в виде готовых форм обычным образом с использованием одного или нескольких физиологических приемлемых носителей или эксципиентов в соответствии с методами, хорошо известными в этой области. Эти композиции предназначены для местного, перорального или системного применения. Предпочтение отдается композициям для местного применения, которые включают гели, кремы, мази, спреи, лосьоны, примочки, пластыри, мыло, порошки, вагинальные суппозитории, аэрозоли, капли и любые другие фармацевтические формы, обычные в этой области.

Мази и кремы можно получить, например, на водной или масляной основе с добавлением подходящих загущающих и/или гелеобразующих агентов. Лосьоны можно получить на водной или масляной основе, при этом они могут обычно содержать также один или несколько эмульгаторов, диспергаторов, суспендирующих агентов, загустителей или красителей. Порошки можно получить с использованием любой приемлемой порошковой основы. Капли можно получить на водной или безводной основе, также включающей один или несколько диспергаторов, растворителей или суспендирующих агентов. Аэрозольные спреи обычно распыляют из баллонов с повышенным давлением, с использованием подходящего пропеллента.

Альтернативно, композиции можно получить в форме, пригодной для перорального или парентерального введения, например, посредством внутрикожных, внутрибрюшинных или внутривенных инъекций. Альтернативные фармацевтические формы включают таблетки без покрытия или с покрытием, капсулы, суспензии и растворы, содержащие активный компонент, необязательно в сочетании с одним или несколькими общепринятыми инертными носителями и/или разбавителями, такими как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, микрокристаллическая целлюлоза, стеарат магния, поливинилпирролидон, лимонная кислота, винная кислота, вода, смесь воды с этанолом, смесь воды с глицерином, смесь воды с сорбитом, смесь воды с полиэтиленгликолем, пропиленгликоль, стеариловый спирт, карбоксиметилцеллюлоза или жирные вещества, такие как твердый жир, или их подходящие смеси.

Концентрация вышеуказанных соединений в композициях зависит от характера соединения, композиции, способа ведения и состояния нуждающегося субъекта и может быть определено или изменено в соответствии со сделанным выбором. Однако обычно подходящими являются концентрации активного вещества в интервале от 1 до 50% (в весовом отношении). Установлено, что для терапевтических применений подходящим является интервал концентрации активного вещества от 10 до 50%, например, от 15 до 30% (в весовом отношении).

После нанесения на требуемую поверхность этот участок подвергают воздействию света для достижения фотохимиотерапевтического эффекта. Продолжительность времени между введением препарата и началом светового воздействия зависит от характера композиции и способа введения. Обычно этот период составляет от 0,5 до 48 часов, например, от 1 до 10 часов.

Интенсивность облучения обычно составляет от 40 до 200 Дж/см², например, 100 Дж/см².

Длину световой волны для облучения можно выбирать с учетом достижения наибольшего фотохимиотерапевтического эффекта. При использовании в фотохимиотерапии порфиринов их обычно облучают светом примерно с максимальным поглощением порфирина. Так, например, в соответствии с известной методикой применения ALA для фотохомиотерапии рака кожи использовали световые волны в диапазоне 350-640 нм, предпочтительно 610-635 нм. Однако, выбирая широкий диапазон длин волн для облучения, выходящий за пределы максимального поглощения порфирина, можно усилить фотосенсибилизирующее действие. Не желая быть связанными какой-либо теорией, предполагается, что это является следствием того, что, когда и другие порфирины подвергают воздействию света с длинами волн в пределах их спектра поглощения, они превращаются в различные фотопродукты, включая, в частности, фотопротопорфирин (РРр). РРр является хлорином и обладает значительным фотосенсибилизирующим действием; его спектр поглощения простирается до волн большей длины, за пределы длин волн, при которых поглощает Рр, то есть почти до 700 нм (Рр почти не поглощает свет в диапазоне более 650 нм). Таким образом, в обычной фотохимиотерапии используемые длины волн не возбуждают РРр и, как следствие, не достигается дополнительное фотосенсибилизирующее действие. Установлено, что облучение светом в диапазоне 500-700 нм является особенно эффективным. Особенно важно включить в диапазон облучения длины волн 630 и 690 нм.

Другим аспектом данного изобретения является метод фотохимиотерапевтического лечения нарушений или аномалий наружных или внутренних поверхностей тела, который включает нанесение на пораженные поверхности вышеуказанной композиции и облучение указанных поверхностей светом, предпочтительно в диапазоне волн 300-800 нм, например, 500-700 нм.

Методы облучения разных участков тела, например, при помощи ламп или лазеров, хорошо известны в этой области (см., например, Van den Bergh, Chemistry in Britain, May 1986, h. 430-439).

Соединения по настоящему изобретению можно получить в виде готовых форм и/или вводить вместе с другими фотосенсибилизирующими средствами, например, с ALA или фотофрином, или с другими активными компонентами, которые могут усиливать фотохимиотерапевтическое действие. Например, можно включать хелатирующие агенты или хелатообразователи, которые способствуют накоплению Рр; образование хелатного комплекса железа под действием хелатообразователей препятствует его включению Рр для образования гема под действием фермента феррохелатазы, что стимулирует образование Рр. Таким образом усиливается фотосенсибилизирующее действие.

Хелатообразователи на основе аминополикарбоновой кислоты особенно пригодны для использования с этой целью, включая любые описанные в литературе хелатообразователи для детоксификации металлов или получения хелатных комплексов ионов парамагнитных металлов в контрастных веществах для ЯМР - визуализации. Особое внимание следует уделить EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоте), CDTA (циклогександиаминтетрауксусной кислоте), ОТПА и DOTA (диэтилентриаминпентауксусной кислоте и диаминоктилтетрауксусной кислоте). Предпочтение отдается EDTA. Чтобы получить хелатный комплекс железа, можно использовать десферриокамин и другие си-дерофоры, например, в сочетании с хелатообразователями на основе аминополикарбоновой кислоты, такими как EDTA.

Хелатообразователь можно использовать в концентрации от 1 до 20%, например, от 2 до 20% (в весовом отношении).

Кроме того, установлено, что фотохимиотерапевтическое действие можно усилить благодаря применению средств или агентов, способствующих проницаемости поверхности, и особенно диалкилсульфоксидов, таких как диметилсульфоксид (DMCO). Это подробно описано в нашей совместно рассматриваемой заявке N PCT/GB94/01951.

Средства, способствующие проницаемости или, повышающие проницаемость поверхности, могут быть любыми подобными средствами, описанными в фармацевтической литературе, например, НРЕ-101 (выпускаемой фирмой Hisamitsu), DMCO и другие диалкилсульфоксиды, в частности, н-децилметилсульфоксид (NDMS), диметилсульфацетамид, диметилформамид (DMFA) диметилацетамид, гликоли, различные производные пирролидона (Woodford et al., J. Toxicol. Cut. & Ocular Toxicology, 1986, 5: 167-177) и Азон^® (Stoughton et al., Drug Dpv. Ind. Pharm. 1983, 9: 725-744) или их смеси.

Однако предпочтение отдается диметилсульфоксиду, который обладает рядом преимуществ. Так, помимо действия, повышающего проницаемость поверхности (диметилсульфоксид особенно эффективно увеличивает глубину проникновения активного средства в ткань), диметилсульфоксид обладает антигистаминным и противовоспалительным действием. Кроме того, установлено, что диметилсульфоксид усиливает действие таких ферментов, как ALA-синтаза и ALA-дегидрогеназа (ферменты, которые соответственно образуют и конденсируют ALA с порфобилиногеном), увеличивая таким образом образование активной формы Pp.

Средство, повышающее проницаемость или способствующее проницаемости поверхности, можно использовать в концентрации от 2 до 50% (в весовом отношении), например, около 10% (в весовом отношении).

В зависимости от заболевания и характера композиции соединения по настоящему изобретению можно совместно вводить с другими необязательными средствами, например, в виде одной композиции, или они могут вводиться последовательно или раздельно. Во многих случаях особенно эффективное фотохимиотерапевтическое действие может быть достигнуто в результате предварительной обработки средством, способствующим проницаемости поверхности, на отдельной стадии до введения соединений по настоящему изобретению. Кроме того, в некоторых случаях хороший эффект может дать предварительная обработка средством, повышающим проницаемость поверхности, с последующим введением фотохимиотерапевтического средства вместе со средством, повышающим проницаемость поверхности. Когда средство, повышающее проницаемость поверхности, используется для предварительной обработки, его можно применять в больших концентрациях, например, до 100% (в весовом отношении). В случае применения стадии предварительной обработки фотохимиотерапевтическое средство можно вводить в течение нескольких часов после предварительной обработки, например, через 5-60 минут после предварительной обработки.

Таким образом, еще одним аспектом данного изобретения является препарат или продукт, включающий описанное выше соединение или его фармацевтически приемлемую соль вместе с, по крайней мере, одним средством, повышающим проницаемость поверхности, и, необязательно, один или несколько хелатообразователей в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в процессе лечения нарушений или аномалий наружных или внутренних поверхностей тела, чувствительных к фотохимиотерапии.

Альтернативно, данным аспектом настоящего изобретения предусматривается также набор для применения в фотохимиотерапии нарушений или аномалий наружных и внутренних поверхностей тела, который включает:
а) первую емкость (или контейнер), содержащую описанное выше соединение или его фармацевтически приемлемую соль;
b) вторую емкость, содержащую, по крайней мере, одно средство, повышающее проницаемость поверхности; и, возможно или необязательно
c) один или несколько хелатообразователей, которые находятся или в указанной первой емкости или в третьей емкости.

Если средство, повышающее проницаемость поверхности, используют на отдельной стадии предварительной обработки, его применяют в большей концентрации, например, до 100% (в весовом отношении).

Очевидно ясно, что при лечении описанными выше соединениями место нарушения или поражения неизбежно начинает флуоресцировать. Интенсивность данной флуоресценции может использоваться для уничтожения аномальных клеток, локализация флуоресценции позволяет визуализировать размер, степень и расположение аномалии или нарушения. Это стало возможным благодаря уникальной способности сложных эфиров ALA предпочтительно локализоваться в ненормальной ткани.

Аномалия или нарушение, которое обнаружено или подтверждено в процессе обследования, затем можно лечить другими альтернативными терапевтическими методами, например, хирургическими или химическими, либо методом лечения путем непрерывного создания флуоресценции или последующего нанесения соединений по данному изобретению на соответствующий участок. Важно отметить, что диагностические методы могут требовать меньших уровней флуоресценции для визуализации по сравнению с теми, которые применяются при терапевтическом лечении. Так, достаточно использовать указанные соединения в концентрации от 1 до 50%, например, 1-5% (в весовом отношении). Поверхности тела, методы и способы применения были рассмотрены выше в связи с терапевтическим лечением и пригодны для описываемой здесь диагностики. Соединения по данному изобретению можно использовать для диагностики in vitro, например, для исследования клеток, содержащихся в биологических жидкостях. Более высокая флуоресценция, характерная для пораженных тканей, может свидетельствовать о наличии поражения или нарушения. Этот метод является очень чувствительным, и его можно использовать для обнаружения поражений или нарушений на ранней стадии, например, для обнаружения рака мочевого пузыря или легких путем исследования эпителиальных клеток соответственно в моче или мокроте. Другими полезными биологическими жидкостями, помимо мочи и мокроты, которые можно использовать для диагностики, являются кровь, сперма, слезы, цереброспинальная жидкость и т. д. Можно также исследовать пробы тканей или препараты, например, биоптаты тканей или пробы костного мозга. Таким образом, настоящее изобретение относится к использованию соединений по данному изобретению или их солей для диагностики в соответствии с вышеуказанными методами фотохимиотерапии, а также к препаратам и наборам для выполнения указанной диагностики.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является метод диагностики in vitro поражений (аномалий) или нарушений посредством анализа пробы биологической жидкости или ткани субъекта, который включает, по крайней мере, следующие стадии:
i) смешение указанной биологической жидкости или ткани с описанным выше соединением;
ii) воздействие светом на указанную смесь;
iii) определение уровня флуоресценции, и
iv) сравнение полученного уровня флуоресценции с контрольными уровнями.

Настоящее изобретение далее описано более подробно в приводимых ниже примерах, не ограничивающих его объем, со ссылкой на фигуры:
на фигуре 1 показана интенсивность флуоресценции (относительные единицы в зависимости от длины волны (нм)) протопорфирина IX (PpIX) на здоровой коже мышей после местного применения:
(А) свободной ALA
(В) метилового эфира ALA
(С) этилового эфира ALA
(D) пропилового эфира ALA через 0,5, 1, 1,5, 2,5, 3, 3,5 и 14 часов после применения препарата.

На фигуре 2 показано распределение PpIX, измеренное на основании интенсивности флуоресценции (относительные единицы в зависимости от длины волны (нм) в мозге, дерме, ухе, печени и мышце через 14 часов после местного применения путем нанесения на здоровую кожу мышей:
(А) свободной ALA
(В) метилового эфира ALA
(С) этилового эфира ALA
(D) пропилового эфира ALA.

На фигуре 3 показана флуоресценция PpIX (интенсивность флуоресценции, относительные единицы в зависимости от длины волны (нм) на коже мышей через 15 минут, 1 час, 4 часа и 10 часов после внутрибрюшинной инъекции метилового эфира ALA (150 мг/кг).

На фигуре 4 показана флуоресценция PpIX (интенсивность флуоресценции, относительные единицы в зависимости от длины волны (нм)): (А) через 1,5 часа и (В) через 4 часа после местного применения метилового эфира ALA путем нанесения на кожу людей, пораженную базально-клеточным раком (- опухоль; --- здоровая кожа).

На фигуре 5 показана флуоресценция PpIX (интенсивность флуоресценции, относительные единицы в зависимости от длины волны (нм)): (А) через 1,5 часа и (В) через 4 часа после местного применения этилового эфира ALA путем нанесения на кожу людей, пораженную базально-клеточным раком (- опухоль; --- здоровая кожа).

На фигуре 6 показана флуоресценция PpIX (интенсивность флуоресценции, относительные единицы в зависимости от длины волны (нм)): (А) через 1,5 часа и (В) через 4 часа после местного применения пропилового эфира ALA путем нанесения на кожу людей, пораженную базально-клеточным раком (- опухоль; --- здоровая кожа).

На фигуре 7 показана флуоресценция PpIX (интенсивность флуоресценции, относительные единицы в зависимости от длины волны (нм)): (А) через 1,5 часа и (В) через 4 часа после местного применения ALA путем нанесения на кожу людей, пораженную базально-клеточным раком (- опухоль; --- здоровая кожа).

На фигуре 8 показаны результаты измерения образования PpIX после местного применения метилового эфира ALA путем нанесения на кожу людей, пораженную базально-клеточной карциномой, и на окружающую здоровую кожу с помощью CDD микроскопии биопсических проб: (А) графическое представление интенсивности флуоресценции в зависимости от глубины (мкм) и (В) микрофотография.

На фигуре 9 показаны результаты измерения образования PpIX после местного применения ALA путем нанесения на ВСС кожу людей, и на окружающую здоровую кожу посредством CDD микроскопии биопсических проб: (А) графическое изображение интенсивности флуоресценции в зависимости от глубины (мкм) и (В) микрофотография.

На фигуре 10 показана флуоресценция PpIX (интенсивность флуоресценции, относительные единицы в зависимости от длины волны (нм)) через 24 часа после местного применения метилового эфира ALA путем нанесения на кожу, пораженную ВСС, и на здоровую кожу людей.

На фигуре 11 показана флуоресценция PpIX (интенсивность флуоресценции, относительные единицы в зависимости от длины волны (нм)) через 24 часа после местного применения ALA путем нанесения на кожу, пораженную ВСС, и на здоровую кожу людей.

На фигуре 12 показаны результаты измерения образования PpIX через 4,5 часа после местного применения метилового эфира ALA путем нанесения на кожу людей, пораженную ВСС, посредством CDD микроскопии биопсии: (А) графическое изображение интенсивности флуоресценции в зависимости от глубины (мкм) и (В) микрофотография.

На фигуре 13 показаны результаты измерения образования PpIX через 4,5 часа после местного применения метилового эфира ALA путем нанесения на здоровую кожу людей посредством CDD микроскопии биопсии: (А) графическое изображение интенсивности флуоресценции в зависимости от глубины (мкм) и (В) микрофотография.

На фигуре 14 показаны результаты измерения образования PpIX через 24 часа после местного применения метилового эфира ALA путем нанесения на ВСС кожу людей посредством CDD микроскопии биопсии: (А) графическое изображение интенсивности флуоресценции в зависимости от глубины (мкм) и (В) микрофотография.

На фигуре 15 показаны результаты измерения образования PpIX через 24 часа после местного применения метилового эфира ALA путем нанесения на здоровую кожу людей посредством CDD микроскопии биопсии: (А) графическое изображение интенсивности флуоресценции в зависимости от глубины (мкм) и (В) микрофотография.

На фигуре 16 показаны результаты измерения образования PpIX через 24 часа после местного применения метилового эфира ALA путем нанесения кожу людей, пораженную ВСС, посредством CDD микроскопии биопсии: (А) графическое изображение интенсивности флуоресценции в зависимости от глубины (мкм) и (В) микрофотография.

На фигуре 17 показаны результаты измерения образования PpIX через 24 часа после местного применения свободной ALA путем нанесения на здоровую кожу людей посредством CDD микроскопии биопсии: (А) графическое изображение интенсивности флуоресценции в зависимости от глубины (мкм) и (В) микрофотография.

На фигуре 18 показаны результаты измерения образования PpIX через 4,5 часа после местного применения свободной ALA и 20% диметилсульфоксида путем нанесения ВСС на кожу людей посредством CDD микроскопии биопсии: (А) графическое изображение интенсивности флуоресценции в зависимости от глубины (мкм) и (В) микрофотография.

На фигуре 19 показаны результаты измерения образования PpIX через 4, 5 часа после местного применения свободной ALA и 20% диметилсульфоксида путем нанесения на здоровую кожу людей посредством CDD микроскопии биопсии: (А) графическое изображение интенсивности флуоресценции в зависимости от глубины (мкм) и (В) микрофотография.

На фигуре 20 показана продолжительность (интенсивность флуоресценции, относительные единицы в зависимости от времени (часы)) флуоресценции (PpIX), вызванной метиловым эфиром ALA, на коже мышей после местного применения только метилового эфира ALA (-•-), метилового эфира ALA вместе с диметилсульфоксидом (

), метилового эфира ALA вместе с десферриоксамином (DF) (-■-) или метилового эфира ALA вместе с десферриоксамином и диметилсульфоксидом (

). Каждая точка обозначает среднее значение измерений, произведенных, по крайней мере, у трех мышей.

На фигуре 21 представлены фотографии флуоресценциии кожи мышей, сделанные через 1 час после местного применения только свободной ALA (А), метилового эфира ALA (В), этилового эфира ALA (С) и пропилового эфира ALA (D), на которых показана флуоресценция эпидермиса (Ер), эпителиальных фолликул волос и сальных желез (стрелки), но не дермы (De). 250 - кратное увеличение.

На фигуре 22 показан график временной зависимости (дни) относительно объема опухоли, вызванной подкожной трансплантацией "голым" мышам клеток рака толстой кишки человека WiDr, после лечения ALA или метиловым эфиром ALA вместе с DF; (

) контрольная группа; (

) только DF; (-■-) ALA + DF + DMCO; (-•-) метиловый эфир ALA + DF + DMCO.

На фигуре 23 показаны отношения флуоресценции PpIX кожи, пораженной ВСС и окружающей здоровой кожи после местного применения ALA или ее эфиров.

Пример 1
Получение гидрохлорида метил-5-аминолевулината
В 500 мл стеклянный реактор с 200 мл метанола добавляют 1 г гидрохлорида 5-аминолевулиновой кислоты и 1 каплю концентрированной HCl. Затем реакционную смесь перемешивают в течение ночи при температуре 60^oС. Процесс этерификации контролируют посредством спектроскопии ¹Н-ЯМР. Избыток метанола удаляют перегонкой, после чего продукт сушат в вакууме при температуре 30-40^oС с получением гидрохлорида метил-5-аминолевулината. Структура полученного продукта подтверждена спектроскопией ¹Н-ЯМР в ДМСО-d₆.

Пример 2
Получение гидрохлорида этил-5-аминолевулината (этиловый эфир ALA)
1 г гидрохлорида 5-аминолевулиновой кислоты добавляют к 200 мл сухого этанола, содержащего 1-2 капли соляной кислоты, в 250 мл стеклянном реакторе, оснащенном мешалкой, обратным холодильником и термометром. Реакционную смесь этерифицируют в течение ночи при нагревании с обратным холодильником (70-80^oС). После окончания реакции этанол удаляют в вакууме. Затем продукт сушат в высоком вакууме при температуре 30-40^oС с получением 0,94 г гидрохлорида этил-5-аминолевулината. Структура полученного продукта подтверждена спектроскопией ¹Н-ЯМР в ДМСО-d₆.

Пример 3
Получение гидрохлорида н-пропил-5-аминолевулината (пропиловый эфир ALA)
0,5 г гидрохлорида 5-аминолевулиновой кислоты растворяют в 100 мл сухого н-пропанола, содержащего 1-2 капли концентрированного гидрохлорида, в 250 мл стеклянном реакторе, оснащенном мешалкой, обратным холодильником и термометром. Реакционную смесь перемешивают при температуре 70-80^oС в течение примерно 20 часов. После превращения всей 5-аминолевулиновой кислоты в ее н-пропиловый эфир (с последующим выполнением спектроскопии ¹Н-ЯМР) избыток пропанола удаляют и продукт сушат в высоком вакууме (<1 мБар) при температуре 40-50^oС. В результате этой реакции получают 0,49 г гидрохлорида пропил-5-аминолевулината. Структура полученного продукта подтверждена спектроскопией ¹Н-ЯМР в ДМСО-d₆.

Пример 4
Получение гидрохлорида н-гексил-5-аминолевулината (гексиловый эфир ALA)
0,5 г гидрохлорида 5-аминолевулиновой кислоты растворяют в 25 г сухого н-гексанола, с 5-6 каплями концентрированного гидрохлорида в 50 мл стеклянном реакторе, оснащенном обратным холодильником и термометром. Реакционную смесь выдерживают при температуре 50-60^oС в течение примерно 3 дней. Избыток н-гексанола удаляют в вакууме, после чего сушат в высоком вакууме с получением 2,4 г гидрохлорида н-гексил-5-аминолевулината. Структура полученного продукта подтверждена спектроскопией ¹Н-ЯМР в ДМСО-d₆.

Пример 5
Получение гидрохлорида н-гептил-5-аминолевулината (сложный гептиловый эфир 5-аминолевулиновой кислоты)
0,5 г гидрохлорида 5-аминолевулиновой кислоты добавляют к 30 г н-гептанола, содержащего 5 капель концентрированного гидрохлорида, в 100 мл стеклянном реакторе, оснащенном мешалкой, обратным холодильником и термометром. После растворения всей 5-аминолевулиновой кислоты реакционную смесь перемешивают при температуре 70-80^oС в течение примерно 48 часов. После превращения всей 5-аминолевулиновой кислоты в ее н-гептиловый эфир (с последующим выполнением спектроскопии ¹Н-ЯМР) избыток спирта удаляют и продукт сушат в высоком вакууме (< 1 мБар) при температуре 70^oС. В результате этой реакции получают 1,5 г гидрохлорида н-гептил-5-аминолевулината. Структура полученного продукта подтверждена спектроскопией ¹Н-ЯМР в ДМСО-d₆.

Пример 6
Получение гидрохлорида н-октил-5-аминолевулината (октиловый эфир ALA)
1 г гидрохлорида 5-аминолевулиновой кислоты добавляют к 30 г сухого н-октанола, содержащего 5-6 капель концентрированного гидрохлорида, в 50 мл стеклянном реакторе, оснащенном обратным холодильником, мешалкой и термометром. Реакционную смесь перемешивают при температуре 65-70^oС в течение примерно 2 дней. Избыток н-октанола удаляют в вакууме, после чего продукт сушат в высоком вакууме с получением 1,5 г гидрохлорида н-октил-5-аминолевулината.

Структура полученного продукта подтверждена спектроскопией ¹Н-ЯМР в ДМСО-d₆.

Пример 7
Получение готовой формы препарата
20% кремы получают путем смешивания активного компонента, ALA, метилового эфира ALA, этилового эфира ALA или пропилового эфира ALA (полученных в соответствии с примерами 1-3), с кремом - основой "Urguentum Merck" (выпускаемым фирмой Merck), в состав которого входят диоксид кремния, жидкий парафин, вазелин, альбумин, цетостеарол, полисорбат 40, глицерол - моностеарат, миглиол^® 812 (смесь растительных жирных кислот), полипропиленгликоль и очищенная вода.

Кроме того, получены аналогичные кремы, дополнительно содержащие 3-20% диметилсульфоксида.

Пример 8
Определение образования протопорфирина IX в коже мышей посредством CDD микроскопии биопсии.

Выпускаемый промышленностью крем типа "масло в воде", содержащий (20%, в весовом отношении) одно из веществ по данному изобретению (свободная ALA, метиловый эфир ALA, этиловый эфир ALA и пропиловый эфир ALA (см. пример 1), наносят на здоровую кожу "голых" мышей на 0,5, 1, 3 и 6 часов, после чего производят биопсию и оценивают посредством микроскопической флуоресцентной фотометрии, выполняемой при помощи камеры со светочувствительным, термоэлектрически охлаждаемым устройством со связанным зарядом (CCD). Полученные результаты показывают, что свободная ALA и три ее эфирных производных поглощаются кожной тканью, этерифицированные производные ALA деэтерифицируются в коже и превращаются в протопорфирин IX (PpIX) через 0,5 часа после местного применения. Интенсивность флуоресценции PpIX в коже увеличивается пропорционально времени нанесения, и во всех случаях максимальная флуоресценция наблюдается примерно через 6 часов (наибольший исследованный временной период) после применения.

Пример 9
Измерения in situ образования протопорфирина IX в коже мышей при помощи волоконно-оптической системы
Целью этого исследования является определение флуоресценции порфиринов, вызываемой эфирами ALA в здоровой коже "голых" мышей in vivo после местного или системного введения эфирных производных ALA.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Химические вещества.

Метиловый, этиловый и пропиловый эфиры 5-аминолевулиновой кислоты (H₂N-СН₂СООСН₂-CH₂COO-R; R может быть СН₃, СН₂-CH₂-СН₃) получены в научно-исследовательском центре Norsk Hydro Research Center (Порсгрунн, Норвегия) в соответствии с процедурой, описанной в примерах с 1 по 3. Гидрохлорид свободной ALA и мезилат десферриоксамина (DF) представлены фирмой Sigma Chemical Company (Сент-Луис, шт. Миссури, США), диметилсульфоксид представлен фирмой Janssen Chimica (Гил, Бельгия). Кремы типа "масло в воде" (выпускаемой промышленностью крем - основа "Unguentum Merck", Дармштадт, Германия), содержащие 20% одного из эфирных производных ALA (в весовом отношении ), 20% свободной ALA, 20% метилового эфира ALA плюс 5% DF, 20% метилового эфира ALA плюс 20% диметилсульфоксида или 20% метилового эфира ALA плюс 5% DF и 20% диметилсульфоксида, готовили непосредственно перед применением. Все кремы приготовлены в аптеке Норвежского госпиталя радиевой терапии. 5-Аминолевулиновую кислоту и ее метиловый эфир, предназначенные для внутрибрюшинных инъекций, растворяли в физиологическом растворе непосредственно перед употреблением. Все другие химические вещества выпускаются промышленностью и отличаются высокой степенью чистоты.

Подопытные животные.

Самки атимичных "голых" мышей Balb/с nu/nu предоставлены лабораторией животных Норвежского госпиталя радиевой терапии. Животных содержали в специальных стерильных условиях. В начале экспериментов мыши были в возрасте 6-7 недель и весили 18-24 г. Клетки с автоклавируемыми крышками, в каждой по три мыши, во время экспериментов содержали в темном помещении.

Методика эксперимента.

Каждой мыши на здоровую кожу на правом боку наносили один из кремов и накладывали сверху полупроницаемую повязку (3М, Сент-Пол, шт. Миннесота, США) на разные периоды времени (от 0,25 до 24 часов) до выполнения измерений флуоресценции in situ или взятия биопсии для микроскопической флуоресцентной визуализации. Около 0,2 г крема наносили на участок кожи, приблизительно равный на 2,25 см². В случае внутрибрюшинной инъекции мышам вводили 5-аминолевулиновую кислоту и ее метиловый эфир в дозе 15 мг/кг. В каждом эксперименте использовали, по крайней мере, трех мышей.

Спектроскопические измерения флуоресценции in situ.

Использовали флуоресцентный спектрометр LS - 50 Перкина-Элмера, оснащенный фотоумножителем, чувствительным к красному свету. (Hamamatsu R 928). Этот прибор имеет ксеноновый импульсно-дуговой источник света и фазочувствительный детектор, что позволяет производить свободное измерение флуоресцении. Часть возбуждающегося пучка света (с длиной волны 408 нм для измерений флуоресцении) при помощи зеркала отражали в многомодовое оптическое кварцевое волокно с сердцевиной 600 мкм (N 3501393, Dornier Medizintechnik, GmBH, Гермеринг, Германия) и направляли на объект через ручной зонд. Излучение в области 550-750 нм измеряли посредством излучающих волокон, получающих информацию через зонд.

Флуоресцентная микроскопия.

После местного нанесения кремов на кожу мышей на разные периоды времени (как указывалось выше) производили биопсию кожи и замороженные срезы ткани рассекали криостатом до толщины 8 мкм. Флуоресцентную микроскопию выполняли при помощи микроскопа Axioplan (Цейс, Германия) с ртутной лампой мощностью 100 Вт. Изображения флуоресценции снимали камерой со светочувствительным, термоэлектрически охлаждаемым устройством со связанным зарядом (CCD) (разрешение: 385•578 пикселей с динамическим диапазоном 16 бит на пиксель ((Astromed CCD 3200, Кембридж, Великобритания), и распечатывали на видеопринтере (мультисканирующий видеопринтер UP-930 фирмы Sony). Комбинация фильтров, используемая для детектирования флуоресценции порфирина, состояла из фильтра возбуждения с длинами волн 390-440 нм, расщепителя светового пучка с длиной волны 460 нм и фильтр излучения с длиной волны >600 нм.

Результаты.

Флуоресценцию PpIX измеряли in situ при помощи волоконно-оптической системы в здоровой коже "голых" мышей через 0,5, 1, 1,5, 2,5, 3, 3,5 и 14 часов после местного нанесения свободной ALA и ее эфирных производных, описанных выше. Как показано на фигуре 1, после местного применения всех производных PpIX начинал флуоресцировать уже через 1 час, в то время как при применении свободной ALA флуоресценция возникала только через 1,5 часа. Максимальная интенсивность флуоресценции во всех случаях наблюдалась через 14 часов после применения препарата, но флуоресценция PpIX, вызванная в коже эфирами ALA, была более сильной, чем в случае применения свободной ALA. Кроме того, как видно на фигуре 2, через 14 часов после применения препарата не было обнаружено флуоресценции PpIX, вызываемой эфирами ALA на других участках кожи и внутренних органах, включая уши, дерму, мышцы, мозг и печень. Однако в случае применения свободной ALA сильная флуоресценция наблюдалась в ушах, а также на других участках кожи. Таким образом, после местного применения препаратов флуоресценция PpIX, вызванная эфирами ALA, была локальной на коже, в то время как флуоресценция PpIX, вызванная свободной ALA, была обнаружена и на других участках кожи. Мы полагаем, что 5-аминолевулиновая кислота поступает в кровь, и впоследствии PpIX образуется во всех органах, содержащих ферменты синтеза гема, и/или PpIX образуется в коже, а затем переносится кровотоком в другие ткани. Последняя ситуация может привести к чувствительности кожи к свету на тех участках, на которые не наносили свободную ALA. Кроме того, после внутрибрюшинной инъекции метилового эфира ALA в дозе 150 мг/кг флуоресценция PpIX в коже мышей возникала через 15 минут после инъекции, пик был обнаружен примерно через 4 часа, и флуоресценция исчезала через 10 часов после инъекции (фигура 3). Такая динамика аналогична флуоресценции порциринов, вызываемой свободной 5-аминолевулиновой кислотой в коже после внутрибрюшинной инъекции с такой же дозой, хотя флуоресценция исчезала быстрее при использовании сложного эфира по сравнению со свободной 5-аминолевулиновой кислотой.

Пример 10
Измерения образования протопорфирина IX в коже человека, пораженной базально-клеточной карциномой (ВСС), и в окружающей здоровой коже при помощи волоконно-оптической системы
Флуоресценцию PpIX в коже человека, пораженной ВСС, и в окружающей здоровой коже измеряли in situ при помощи волоконно-оптической системы после местного нанесения 20% свободной ALA и ее производных на разные периоды времени.

На фигурах 4, 5, 6 и 7 показано, что по сравнению со свободной ALA образование PpIX, индуцируемое производными ALA было более быстрым, в большем количестве и локализовалась более селективно на участках кожи, пораженных ВСС (то есть гораздо меньшая флуоресценция наблюдалась в окружающей здоровой коже), особенно в случае применения метилового эфира ALA.

Пример 11
Флуоресцентные поверхностные измерения in vivo образования PpIX в коже человека, пораженной ВСС и в окружающей здоровой коже посредством CDD микроскопии биопсии
78-летнему уроженцу Кавказа, у которого имелись многочисленные язвенно-узелковые поражения кожи ВСС, наносили на пораженные участки кожи выпускаемые промышленностью кремы типа "масло в воде", содержащие или только ALA (20%, в весовом отношении), или метиловый эфир ALA (20%, в весовом отношении) (как описывалось в примере 7), и накладывали полупроницаемую повязку на 24 часа. После удаления повязки и крема измеряли при помощи спектрофлуорометра in vivo флуоресценцию на поверхности опухолевой ткани и прилегающей здоровой коже. На тех же участках производили пункционную биопсию и пробы сразу же погружали в жидкий азот. Срезы ткани рассекали криостатным микротомом до толщины 8 мкм. Локализацию флуоресценции порфирина в срезах ткани наблюдали посредством флуоресцентной микроскопии. Те же замороженные срезы затем окрашивали обычным красителем Н&Е, используемым для гистологической идентификации. Флуоресцентную микроскопию выполняли при помощи микроскопа Axioplan (Цейс, Германия). Для получения изображений флуоресценции и выполнения количественных измерений использовали камеру со светочувствительным, термоэлектрически охлаждаемым устройством со связанным зарядом (Astromed CCD 3200, Кембридж, Великобритания) и устройство обработки изображений (Astromed/Visilog, PC 486DX266 MHz VL). Главной целью таких количественных измерений является точное определение порфиринов, образуемых под действием ALA, с поверхности ткани в нижние слои раковых повреждений. Результаты показаны на фигурах 8 и 9, на которых интенсивность флуоресценции выражена в зависимости от глубины поражения раком.

Как показано на фигурах 8 и 9, равномерное распределение флуоресценции PpIX наблюдается от верхних до нижних слоев всех ВСС поражений после применения или свободной ALA или ее метилового эфира. Это позволяет сделать вывод о том, что метиловый эфир ALA, по крайней мере, также эффективен, как и свободная ALA, в отношении проникновения и образования PpIX в месте поражения ВСС. Кроме того, не было обнаружено флуоресценции PpIX в окружающей здоровой коже после местного применения метилового эфира ALA, что свидетельствует о высокой избирательности воздействия метилового эфира ALA только на участки поражения ВСС.

Интенсивность флуоресценции выбранных опухолей in vivo через 24 часа была, по крайней мере, в два раза выше в случае метилового эфира ALA по сравнению с ALA, при этом увеличилась флуоресценция соответствующих здоровых тканей, однако это увеличение составило всего лишь около 50%. Соотношение между опухолью и здоровой тканью равно примерно 1,2:1 для ALA и 2: 1 для метилового эфира ALA. Результаты показаны на фигурах 10 и 11.

Во время проверки, произведенной через одну неделю после применения препарата, было установлено, что в центре всех обработанных участков кожи образовывалась некротическая область, соответствующая опухоли. На прилегающих участках здоровой кожи, которые были обработаны кремом и подвергнуты воздействию света имела место ярко выраженная эритема при использовании ALA и весьма умеренная эритема в случае применения метилового эфира ALA.

Пример 12
Флуоресцентные поверхностные измерения in vivo образования PpIX в коже людей, пораженной ВСС, и в окружающей здоровой коже посредством CCD микроскопии проб биопсии
Имеющиеся данные показывают локализацию и образование порфиринов (главным образом протопорфирина IX) после местного применения свободной ALA и одного из ее производных (метилового эфира) путем нанесения на участки кожи, пораженные узелковым ВСС, и на окружающую здоровую кожу субъектов на 4,5 и 24 часа. Испытания выполняли так, как описано в примере 11.

На каждой из следующих фигур представлены (А) изображения флуоресценции нижнего слоя ВСС повреждений рака или окружающей здоровой кожи. Кроме того, приведены кривые, показывающие интенсивность флуоресценции в зависимости от глубины поражения ВСС или интенсивность флуоресценции здоровой кожи (В).

На фигуре 12 показано равномерное распределение флуоресценции PpIX, вызываемой метиловым эфиром ALA в нижнем слое ВСС через 4,5 часа после местного применения. Некоторая флуоресценция порфирина имеет место в окружающей здоровой коже (фигура 13). Отношение интенсивности между ВСС и здоровой кожей равно примерно 2. Кроме того, абсолютная величина флуоресценции, вызываемой метиловым эфиром ALA, выше величины флуоресценции, вызываемой свободной ALA и 20% диметилсульфоксида после местного применения в течение 4,5 часов, как показано ниже.

На фигурах 14 и 15 показано равномерное распределение флуоресценции порфирина, вызываемой местным применением метилового эфира ALA в течение 24 часов в нижнем слое ВСС и окружающей здоровой коже. Соотношение флуоресценции в ВСС и в здоровой коже также примерно равно 2. Кроме того, как показано ниже, интенсивность флуоресценции порфиринов в ВСС под действием метилового эфира ALA, почти в два раза выше флуоресценции в ВСС после местного применения одной свободной ALA в течение 24 часов.

На фигурах 16 и 17 показано равномерное распределение флуоресценции порфиринов, вызванной свободной ALA в нижнем слое ВСС и в окружающей здоровой коже через 24 часа после местного применения. Однако отношение интенсивности флуоресценции между ВСС и здоровой кожей равно примерно 1, что свидетельствует о низкой избирательности данного лечения. Кроме того, образование порфиринов в ВСС ниже, чем в случае метилового эфира ALA.

На фигурах 18 и 19 показано равномерное распределение флуоресценции порфиринов, вызванной ALA в нижнем слое ВСС и окружающей здоровой коже после местного применения свободной ALA и 20% диметилсульфоксида в течение 4,5 часов. Однако отношение интенсивности флуоресценции между ВСС и здоровой кожей лишь немногим больше 1, что свидетельствует о том, что диметилсульфоксид, вероятно, снижает селективность опухоли образованию порфиринов. Кроме того, при этом в ВСС образуется меньше порфиринов, чем в случае применения метилового эфира ALA.

Пример 13
Исследование воздействия хелатообразователей десферриоксамина (DF) и/или диметилсульфоксида (DMCO) и флуоресценции кожи
I. Влияние DF и/или DMCO на флуоресценцию в здоровой коже мышей in situ определяли через разные периоды времени после местного применения метилового эфира ALA. Были использованы методы, описанные в примере 9.

РЕЗУЛЬТАТЫ
В случае местного применения крема, содержащего только DMCO флуоресценция полностью отсутствовала в здоровой коже мышей, но наблюдалась некоторая флуоресценция PpIX после применения одного десферриоксамина.

DF или DF плюс DMCO (хорошо известное средство, повышающее проницаемость кожи) значительно увеличивают образование PpIX под действием метилового эфира ALA.

II. Флуоресцентная визуализация кожи, обработанной тремя производными (в соответствии с примером 9), показала наличие флуоресценции порфиринов под действием сложноэфирных производных в эпидермисе, эпителиальных фолликулах волос и сальных железах через 1 час после местного применения (фигура 21). Интенсивность флуоресценции порфиринов увеличивалась пропорционально времени, прошедшему после применения.

КРАТКИЙ ОБЗОР
Многих субъектов, страдающих базально-клеточным раком, лечили в нашем госпитале на протяжении последних пяти лет путем местного применения PDT на основе ALA, при этом в более чем 90% случаев наружного ВСС наблюдалась полная регрессия. Однако узелковый ВСС плохо поддавался лечению из-за слабого удержания ALA и, соответственно, низкого образования порфирина под действием ALA в глубоких слоях пораженных тканей. Чтобы усовершенствовать этот метод, вместо свободной ALA мы использовали сложно-эфирные производные ALA. Данные, полученные в этом примере и в примере 9 посредством спектроскопических измерений флуоресценции in situ и флуоресцентной микроскопии биоптанов ткани, показывают, что все три исследованные эфирные производные поглощаются, деэтерифицируются и, наконец, превращаются в порфирины в эпидермисе, эпителиальных фолликулах волос и сальных железах "голых" мышей, при этом образование порфирина выше, чем в случае свободной ALA. Это согласуется с предшествующими примерами, относящимися к исследованию узелковой базально-клеточной карциномы у людей, и свидетельствует о том, что флуоресценция порфиринов под действием эфиров ALA возникает быстрее и имеет более высокую интенсивность и более равномерное распределение, чем флуоресценция порфиринов, вызываемая свободной ALA в местах поражения.

Настоящее исследование также показывает, что DF значительно увеличивает образование PpIX под действием метилового эфира ALA в здоровой коже мышей после местного применения.

Интересно отметить, что сильная флуоресценция порфиринов под действием свободной ALA обнаружена на участках кожи за пределами области, которую обрабатывали кремом (фигура 2). Это свидетельствует о том, что после местного применения препарата свободная ALA поступает в кровь, и впоследствии порфирины образуются во всех органах, содержащих ферменты синтеза гема, или порфирины первоначально образуются в коже или/и печени, а затем переносятся кровотоком в другие ткани. Это может вызвать светочувствительность кожи на участках, куда не наносили свободную ALA. Однако ни одно из исследованных эфирных производных не вызывает флуоресценцию порфирина на других участках кожи.

Пример 14
Влияние метилового эфира ALA или ALA, DF и DMCO PDT на рост опухоли у "голых" мышей, которым были трансплантированы клетки карциномы толстой кишки человека WiDr
"Голым" мышам трансплантировали клетки карциномы толстой кишки человека WiDr путем подкожной инъекции в область правого бока. На место образования опухоли наносили следующие кремы, полученные так, как описывалось в предыдущих примерах, которые содержали: только 10% DF; 20% ALA + 10% DF + 20% DMCO; или 20% метилового эфира ALA + 10% DF + 20% DMCO, и через 14 часов производили облучение лазером (632 нм, 150 мВт/см² в течение 15 минут). В качестве контрольной группы использовали отдельную группу животных с аналогичной опухолью, которые не получали лечения в виде местного применения указанного крема. Реакции обработанных опухолей оценивали в виде соотношения регрессия опухоли/время возобновления роста. Когда объем опухоли увеличивался в 5 раз по сравнению с объемом в день облучения светом, мышей умерщвляли. Результаты показаны на фигуре 22. (Столбцы: стандартная погрешность среднего (SEM) для 3-5 животных в каждой группе). Результаты показывают, что опухоли, которые обрабатывали метиловым эфиром ALA + DF + DMCO, лишь через 34 дня достигали объема, который в пять раз был больше объема опухоли в день, предшествующий облучению светом, тогда как в случае свободной ALA + DF + DMCO объем опухоли увеличивался в пять раз через 24 дня. Таким образом, метиловый эфир ALA более эффективно замедляет рост опухоли.

Пример 15
Избирательность или селективность эфиров ALA (метилового, гексилового, гептилового и октилового) на пораженной ткани
Отношения флуоресценции PpIX между кожей, пораженной ВСС и окружающей здоровой кожей после местного применения ALA или ее сложных эфиров (20%, в течение 4 часов) исследовали с использованием методов, описанных в предыдущих примерах. Результаты показаны на фигуре 23 и свидетельствуют о том, что все эфиры более избирательно вызывают флуоресценцию PpIX в местах поражения ВСС, чем свободная ALA, особенно в случае метилового эфира ALA и гексилового эфира ALA.

Claims (11)

1. Применение эфиров 5-аминолевулиновой кислоты общей формулы 1
R₂ ²N-CH₂COCH₂-СН₂СО-OR¹,
в которой R¹ представляет C_1-10 алкил, необязательно замещенный арилом; и каждый из R², которые могут быть одинаковыми или различными, представляет атом водорода или группу R¹, или их фармацевтически приемлемых солей в качестве фотосенсибилизаторов для фотохимиотерапии, или диагностики рака, псориаза, старческого кератоза, кожных ссадин или царапин, или бактериальных, вирусных или грибковых инфекций.

2. Применение по п.1, при котором арилом является фенил или моноциклическая 5-7-членная гетероароматическая группа.

3. Применение по п.1 или 2, при котором R¹ представляет собой незамещенную алкильную группу.

4. Применение по любому из пп.1-3, при котором указанным соединением является метиловый эфир 5-аминолевулиновой кислоты, этиловый эфир 5-аминолевулиновой кислоты, пропиловый эфир 5-аминолевулиновой кислоты, гексиловый эфир 5-аминолевулиновой кислоты, гептиловый эфир 5-аминолевулиновой кислоты или октиловый эфир 5-аминолевулиновой кислоты, или их соль.

5. Фармацевтическая композиция для фотохимиотерапии или диагностики рака, псориаза, старческого кератоза, кожных ссадин или царапин, или бактериальных, вирусных или грибковых инфекций, включающая соединение формулы 1, определенное в любом из пп.1-4, или его фармацевтически приемлемую соль вместе с по крайней мере одним фармацевтическим носителем или эксципиентом.

6. Способ диагностики или фотохимиотерапевтического лечения рака, псориаза, старческого кератоза, кожных ссадин или царапин, или бактериальных, вирусных или грибковых инфекций, включающий применение к исследуемым или пораженным участкам или поверхностям композиции по п.5 и воздействие на указанные участки или поверхности светом.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что свет имеет длину волны в диапазоне 500-700 нм.

8. Продукт, включающий соединение формулы 1, определенное в любом из пп. 1-4, или его фармацевтически приемлемую соль вместе с по крайней мере одним агентом, способствующим проницаемости поверхности, и, необязательно одним или несколькими хелатирующими агентами в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении или диагностике рака, псориаза, старческого кератоза, кожных ссадин или царапин, или бактериальных, вирусных или грибковых инфекций.

9. Продукт по п.8, отличающийся тем, что агентом, способствующим проницаемости поверхности, является диметилсульфоксид.

10. Способ диагностики in vitro рака, псориаза, старческого кератоза, кожных ссадин или царапин, или бактериальных, вирусных или грибковых инфекций с помощью анализа пробы биологической жидкости или ткани, который включает по крайней мере следующие стадии:
a) смешение указанной биологической жидкости или ткани с соединением формулы 1, определенным в любом из пп.1-4,
b) воздействие светом на указанную смесь,
c) определение уровня флуоресценции, и
d) сравнение полученного уровня флуоресценции с контрольными уровнями.

11. Набор для диагностики или фотохимиотерапии рака, псориаза, старческого кератоза, кожных ссадин или царапин, или бактериальных, вирусных или грибковых инфекций, который включает
a) первую емкость, содержащую соединение формулы 1, определенного в любом из пп.1-4, или его фармацевтически приемлемую соль,
b) вторую емкость, содержащую по крайней мере один агент, способствующий проницаемости поверхности, и, необязательно,
c) один или несколько хелатирующих агентов, содержащихся в указанной первой емкости или третьей емкости.

Images