RU2191008C2 - АНТАГОНИСТ-ЛИГАНД RAR-γ ИЛИ АГОНИСТ-ЛИГАНД RAR-α В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРА АПОПТОЗА - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, конкретно - к фармакологии. Предложено новое средство для ингибирования апоптоза в популяции клеток Т-лимфоцитов. Средство представляет собой агонист, специфичный к рецепторам ретиноевой кислоты RAR-альфа (в частности, 4-((5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталинил)карбоксамидо)бензойную кислоту), или 4-[7-(1-адамантил)-6-метоксиэтоксиме-токси-2-нафтил]бензойной кислоты. Средство предназначено для лечения заболеваний, связанных с избыточной скоростью апоптоза, в том числе, синдрома иммунодефицита, вызванного вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) или отторжения трансплантата. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения. 4 з.п. ф-лы, 4 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к применению специальных ретиноидов для получения фармацевтической композиции, предназначенной для уменьшения скорости развития апоптоза.

Гибель клеток включает в себя механизм двух типов. Первый из них, являющийся классическим типом, называют некрозом. Морфологически некроз характеризуется набуханием митохондрий и цитоплазмы и деформацией клеточных ядер, после чего происходит разрушение клетки и ее автолиз, причем последнее явление сопровождается воспалением. Некроз характеризуется пассивным и случайным развитием. Некроз ткани обычно связан с клетками, которые подвергнуты физическому травматическому воздействию или, например, химическому отравлению.

Другая форма гибели клеток называется апоптозом (Кеrr, J.F.R. и Wyllie, A. H., Br.J.Cancer, 265, 239 (1972); однако, следует отметить, что в отличие от некроза, апоптоз не вызывает каких-либо воспалительных явлений. Известно, что апоптоз развивается в разнообразных физиологических состояниях. Апоптоз является чрезвычайно высокоселективной формой самоубийства клетки, которое характеризуется заметными морфологическими и биохимическими явлениями. Так, например, наблюдаемые явления, к которым, в частности, относится конденсация хроматина, могут быть связаны или не связаны с эндонуклеазной активностью, образованием апоптотических тел и фрагментацией дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) за счет активации эндонуклеазы в фрагменты ДНК размером 180-200 пар оснований (такие фрагменты могут наблюдаться при электрофорезе в агарозном геле).

Апоптоз может рассматриваться как запрограммированная гибель клеток, включенная в программу развития, дифференцировки и обновления тканей. Можно также считать, что дифференцировка, рост и созревание клеток тесно связаны с апоптозом и что те вещества, которые способны играть роль в дифференцировке, росте и созревании клеток, также связаны с явлением апоптоза. Следует отметить, что у здорового человека все эти явления находятся в равновесии.

В области медицины при некоторых патологических ситуациях наблюдается измененный, если не разрегулированный, механизм апоптоза, или механизм апоптоза, который не предусматривает дерегуляцию другого биологического явления с целью достижения равновесия. Так, сообщается, что преднамеренная модуляция апоптоза путем его индуцирования или подавления может обеспечить лечение большого числа таких заболеваний, которые связаны с недостаточной скоростью апоптоза, как это имеет место в случае рака, или с аутоиммунными заболеваниями или аллергиями, или, напротив, таких заболеваний, которые связаны с избыточной скоростью апоптоза, как это имеет место в случае синдрома иммунологической недостаточности под действием вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера) или чрезмерного повреждения, которое имеет место в ходе инфаркта миокарда.

В литературе описан целый ряд ингибиторов апоптоза, таких как циклогексимид, циклоспорин и некоторые интерлейкины.

В области ретиноидов известно, что полностью транс-ретиноевая кислота является мощным модулятором (например, ингибитором, или, напротив, стимулятором, в зависимости от природы обрабатываемых клеток) дифференцировки и пролиферации многих типов нормальных или трансформированных клеток. Так, например, ретиноевая кислота ингибирует дифференцировку таких эпителиальных клеток, как эпидермальные кератиноциты. Она также ингибирует пролиферацию многих трансдермальных клеток, например клеток меланомы. Такие воздействия на пролиферацию и дифференцировку могут оказывать клетки одного и того же типа одновременно, как это имеет место, например, в случае промиелоцитов человека (клетки HL-60); так, известно, что пролиферация таких клеток ингибируется полностью транс-ретиноевой кислотой и что в то же время индуцируется их дифференцировка в гранулоциты и их апоптоз.

Вообще говоря, известно, что полностью транс-ретиноевая кислота воздействует на дифференцировку и пролиферацию клеток в результате взаимодействия с рецепторами клеток, обозначаемыми как RAR (рецепторы ретиноевой кислоты), которые присутствуют в клеточных ядрах. К настоящему времени идентифицировано три подтипа RAR-рецептора, которые классифицированы как RAR-α, RAR-β и RAR-γ, соответственно. После связывания с лигандом (например, с полностью транс-ретиноевой кислотой) такие рецепторы взаимодействуют со специальными реактивными элементами (RAREs) в промоторной области генов, которые регулируются ретиноевой кислотой. Для связывания с реактивными элементами такие RAR образуют гетеродимеры с рецепторами другого типа, известными как RXR. Природным лигандом RXR является 9-цис-ретиноевая кислота. Такие RXR считаются главными регуляторными белками, поскольку они взаимодействуют, образуя гетеродимеры, подобно RAR, с другими членами суперсемейства стероид/тироидных рецепторов, таких как рецептор витамина D3 (VDR), трииодтироксиновый рецептор (TR) и PPAR (рецепторы, активированные пролифератором пероксисома). Помимо этого, RXR способны взаимодействовать со специфическими реактивными элементами (RXRE) в виде гомодимеров. Этими сложными взаимодействиями, а также существованием многочисленных RAR- и RXR-рецепторов, которые по-разному экспрессируются, в зависимости от типа ткани и клетки, объясняются плейотропные эффекты ретиноидов практически во всех клетках.

В современной литературе описаны многие синтетические структурные аналоги полностью транс-ретиноевой кислоты или 9-цис-ретиноевой кислоты, которые обычно обозначают как "ретиноиды". Некоторые из таких молекул способны связывать и специфически активировать RAR или, с другой стороны, RXR. Кроме этого, некоторые аналоги способны связывать и активировать конкретный подтип RAR-рецептора (α, β или γ). Наконец, другие аналоги не проявляют какой-либо конкретной селективной активности в отношении таких различных рецепторов. Примером такого действия может служить тот факт, что 9-цис-ретиноевая кислота активирует RAR и RXR в одно и то же время, проявляя при этом минимальную селективность в отношении конкретного рецептора (неспецифический агонист-лиганд), тогда как полностью транс-ретиноевая кислота селективно активирует RAR (RAR-специфичные агонисты-лиганды), куда входят все подтипы. Рассуждая в общем и качественно, можно говорить, что данное вещество (или лиганд) обладает специфичностью в отношении данного семейства рецепторов (или соответственно в отношении конкретного рецептора данного семейства) в том случае, если указанное вещество обладает аффинностью в отношении всех рецепторов такого семейства (или соответственно в отношении конкретного рецептора данного семейства), которая выше, чем та аффинность, что проявляется в отношении всех рецепторов любого другого семейства (или соответственно в отношении всех других рецепторов данного семейства или другого семейства).

Имеется сообщение о том, что 9-цис-ретиноевая кислота и полностью транс-ретиноевая кислота являются модуляторами апоптоза (т.е. активатором или ингибитором апоптоза, в зависимости от конкретного типа клеток) и что 9-цис-ретиноевая кислота является более активным веществом из этих двух модуляторов, причем объяснение этого явления может быть найдено в том факте, что 9-цис-ретиноевая кислота активирует как RAR, так и RXR, в отличие от полностью транс-ретиноевой кислоты, которая активирует только RAR.

В свете того, что было сказано выше, очевидно, что существует определенный интерес в разработке новых модуляторов апоптоза.

В этом отношении авторам настоящей заявки удалось установить, что агонисты-лиганды, специфичные к рецепторам типа RAR-α, или антагонисты-лиганды, которые специфичны к рецепторам типа RAR-γ, являются отличными ингибиторами апоптоза в клетках различного типа, главным образом в тимоцитах, в тех случаях, когда апоптоз вызывают с использованием рецепторов типа RAR-γ или Т-клеточных рецепторов.

Таким образом, настоящее изобретение относится к использованию, по крайней мере, одного лиганда, выбранного из агониста-лиганда, специфичного к рецепторам типа RAR-α, и антагониста-лиганда, который специфичен к рецепторам типа RAR-γ, при получении фармацевтической композиции, предназначенной для снижения скорости апоптоза, по крайней мере, в одной клеточной популяции. Более конкретно, эта популяция клеток соответствует клеткам, в которых апоптоз может регулироваться путем индукции и/или ингибирования с использованием рецепторов типа RAR-γ и/или RAR-α, либо апоптоз можно индуцировать с помощью рецепторов Т-клеток.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит физиологически приемлемую среду.

Под агонистом-лигандом, специфичным в отношении рецепторов типа RΑR-α, согласно изобретению подразумевается любой агонист-лиганд, имеющий константу диссоциации с рецепторами типа RAR-α, по крайней мере, в 10 раз меньшую его константы диссоциации с рецепторами типа RAR-γ, и который вызывает дифференцировку клеток F9.

Под антагонистом-лигандом, специфичным в отношении рецепторов типа RAR-γ, согласно изобретению подразумевается любой лиганд, имеющий константу диссоциации с рецепторами типа RAR-γ, по крайней мере, в 10 раз ниже его константы диссоциации с рецепторами типа RAR-α, и который не вызывает дифференцировку клеток F9.

Так, например, известно, что полностью транс-ретиноевая кислота и некоторые ее аналоги способны индуцировать дифференцировку эмбриональных клеток тератокарциномы мыши (клетки F9); поэтому такие вещества рассматриваются как агонисты RAR-рецепторов. Секреция активатора плазминогена, сопровождающая такую дифференцировку, является показателем биологической реакции клеток F9 на ретиноиды (Skin pharmacol., 1990, 3: стр.256-267).

Константы диссоциации определяют с помощью тестов, стандартных для специалистов в данной области. Такие тесты, главным образом, описаны в следующих работах: (1) "Selective Synthetic Ligands for Nuclear Retinoic Acid Receptor Subtypes" in RETINOIDS, Progress in Research and Clinical Applications, Chapter 19 (pp.261-267), Marcel Dekker Inc., edited by Maria A. Livrea and Lester Parker; (2) "Synthetic Retinoids: Receptor Selectivity and Biological Activity" in Pharmacol Skin, Basel, Karger, 1993, Volume 5, pp.117-127; (3) "Selective Synthetic Ligands for Human Nuclear Retinoic Acid Receptors" in Skin Pharmacology, 1992, Vol.5, pp.57-65; (4) "Identification of Synthetic Retinoids with Selectivity for Human Nuclear Retinoic Acid Receptor-γ" in Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol.186, 2, July 1992, pp.977-983; (5) "Selective High Affinity RAR-α or RAR-β Retinoic Acid Receptor Ligands" in Mol.Pharmacol., Vol.40, pp.556-562.

Другие характеристики, аспекты, цели и преимущества изобретения станут даже еще более понятными из прочтения следующего описания и различных специальных примеров, которые представлены в целях иллюстрации и ни в коей мере не носят ограничительного характера.

Агонистами-лигандами, обладающими специфичностью в отношении рецепторов типа RAR-α и которые следует упомянуть в первую очередь, являются 4-((5,6,1,8-тетрагидро-5,5,8,8-тет-раметил-2-нафталинил)карбоксиамидо)бензойная кислота, 4-((5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталин)карбамоил)бензойная кислота и 2-гидрокси-4-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-карбоксиамидо)бензойная кислота.

Среди агонистов-лигандов, обладающих специфичностью в отношении рецепторов типа RAR-α, согласно изобретению преимущество в использовании отдается, по крайней мере, одному агонисту-лиганду, имеющему константу диссоциации с рецепторами типа RAR-α, по крайней мере, в 20 раз меньшую его константы диссоциации в отношении рецепторов типа RAR-γ, например такому, как 4-((5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетра-метил-2-нафталинил)карбоксамидо)бензойная кислота и 2-гидрокси-4-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин)-2-кар-боксамидо)бензойная кислота.

Агонистами-лигандами, специфичными к рецепторам типа RAR-γ и которые следует упомянуть, главным образом, являются 2-гидрокси-4-[7-(1-адамантил)-6-бензилокси-2-нафтил] бензойная кислота, 2-гидрокси-4-[7-(1-адамантил)-6-гексилокси-2-нафтил] бензойная кислота, 4-[7-(1-адамантил)-6-метоксиэтоксиметокси-2-нафтил] бензойная кислота, 5-[7-(1-адамантил)-6-бензилокси-2-нафтил] -2-тиофенкарбоновая кислота, 4-[7-(1-адамантил)-6-бензилокси-2-нафтил] бензойная кислота, 4-[7-(1-адамантил)-6-бензилоксикарбонил-2-нафтил] бензойная кислота, 2-гидрокси-4-[7-(1-адамантил)-6-(4-фторбензил)окси-2-нафтил] бензойная кислота, 4-[7-(1-адамантил)-6-гептилокси-2-нафтил]бензойная кислота, 6-[7-(1-адамантил)-6-метоксиэтокси-метокси-2-нафтил]никотиновая кислота, 2-гидрокси-4-[7-(1-адамантил)-6-метоксиэтоксиметокси-2-нафтил] бензойная кислота, 2-хлор-4-[7-(1-адамантил)-6-метоксиэтоксиметокси-2-нафтил] бензойная кислота, 4-[7-(1-адамантил)-6-метоксибутилокси-2-нафтил]бензойная кислота, 4-[7-(1-адамантил)-6-метоксиметоксипропил-2-нафтил]бензойная кислота, 4-[7-(1-адамантил)-6-метоксиэтоксипропил-2-нафтил] бензойная кислота и 4-[7-(1-адамантил)-6-ацетилоксибутокси-2-нафтил]бензойная кислота.

Из антагонистов-лигандов, обладающих специфичностью в отношении рецепторов типа RAR-γ, в настоящем изобретении предпочтение отдается использованию, по крайней мере, одного антагониста-лиганда, имеющего константу диссоциации с рецепторами типа RAR-γ, по крайней мере, в 20 раз меньшую, чем его константа диссоциации с рецепторами типа RAR-α, такого как 4-[7-(1-адамантил)-6-метоксиэтоксиметокси-2-нафтил]бензойная кислота.

Таким образом, композиция согласно настоящему изобретению может применяться, если необходимо понизить скорость развития апоптоза в случае, по крайней мере, одной популяции клеток. Более конкретно, популяция клеток соответствует клеткам, в которых апоптоз может регулироваться индукцией и/или ингибированием с помощью рецептора типа RAR-γ и/или RAR-α, или в которых апоптоз может регулироваться индукцией с помощью рецепторов Т-клеток, и поэтому это, в частности, имеет место в клеточных популяциях, в которых присутствуют рецепторы типа RAR-γ и/или RAR-α, или рецепторы Т-клеток, например, в таких, которые являются производными тимуса (вилочковой железы), в которых присутствуют все три типа таких рецепторов.

Таким образом, уменьшение скорости развития апоптоза может оказаться необходимым в том случае, когда имеет место избыточная скорость апоптоэа, причем такая избыточная скорость может быть результатом генетических или приобретенных состояний у пациента, для которого желательно применение фармацевтической композиции. Такие генетические или приобретенные состояния благоприятствуют накоплению сигналов, индуцирующих апоптоз, или снижают пороговое значение индукции апоптоза этими сигналами.

В качестве примеров заболеваний или нарушений, связанных с избыточной скоростью апоптоза, следует специально отметить синдром иммунодефицита, вызванного вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), нейродегенеративные заболевания, миелодиспластические синдромы (например, апластическая анемия), ишемические синдромы (например, инфаркт миокарда), заболевания печени, вызываемые токсинами (например, спиртом), алопецию, повреждение кожи за счет УФ-облучения, плоский лишай, атрофию кожи, катаракту и отторжение различных трансплантатов.

Так, более специфическими примерами могут служить нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амиотрофный латеральный склероз и другие, связанные с дегенерацией мозга, например болезнь Creutzfeld-Jakob.

Композиция согласно изобретению может применяться энтерально, парентерально, местно или глазным путем. Предпочтительно, чтобы такая фармацевтическая композиция выпускалась в форме, подходящей для применения системным путем (для инъекции или вливания).

Для применения энтеральным путем композиция, особенно фармацевтическая композиция, может производиться в виде таблеток, твердых желатиновых капсул, таблеток с покрытием, сиропов, суспензий, растворов, порошков, гранул, эмульсий, микросфер или наносфер, либо липидных или полимерных везикул, позволяющих осуществлять контролируемое выделение. В случае парентерального применения композиция может использоваться в виде растворов или суспензий для вливания или инъекции.

Лиганды, выбираемые из агонистов-лигандов, обладающих специфичностью к рецепторам типа RAR-α, и антагонистов-лигандов, которые обладают специфичностью в отношении рецепторов типа RAR-γ и которые используют согласно изобретению, обычно применяют в суточной дозе примерно от 0,01 мг/кг до 100 мг/кг веса тела, однократно или до трех приемов в день.

При местном применении фармацевтическая композиция согласно изобретению лучше всего подходит для лечения кожи и слизистой и может использоваться в виде мазей, кремов, молочковых препаратов, помад, порошков, пропитанных буферов, растворов, гелей, спрэев, лосьонов или суспензий. Они могут быть также в виде микросфер или наносфер, либо липидных или полимерных везикул, или полимерных пластырей или гидрогелей, которые позволяют осуществлять контролируемое выделение. При местном применении такая композиция может быть как безводной, так и в форме водного раствора.

При глазном применении композицию согласно изобретению главным образом используют в виде глазной примочки.

Лиганды, выбираемые из агонистов-лигандов, специфичных к рецепторам типа RAR-α, и антагонистов-лигандов, которые специфичны в отношении рецепторов типа RAR-γ, при местном и глазном применениях используются в концентрации 0,001-10 мас. %, предпочтительно 0,1-1 мас.%, в расчете на общую массу композиции.

Разумеется, описанные выше композиции могут дополнительно содержать инертные или даже фармакодинамически активные добавки или комбинации таких добавок, в частности, смачивающие агенты, депигментирующие агенты, такие как гидрохинон, азелаиновая кислота, кофеиновая кислота или койевая кислота; мягчительные средства; увлажняющие агенты, такие как глицерин, ПЭГ 400, тиаморфолинон и его производные или даже мочевина; антисеборрейные агенты или агенты против акне, такие как S-карбоксиметилцистеин, S-бензилцистеамин и их соли или производные, или пероксид бензоила; противогрибковые агенты, такие как кетоконазол или полиметилен-4,5-изотиа-золидин-3-оны; антибактериальные агенты, каротеноиды и в особенности β-каротин; такие противопсориатические агенты, как антралин и его производные; и, наконец, эйкоза-5,8, 11,14-тетраиноевые и эйкоза-5,8,11-триноевые кислоты, их сложные эфиры и амиды.

Эти композиции могут также содержать вещества, улучшающие запах, такие предохраняющие агенты, как сложные эфиры парагидроксибензойной кислоты, стабилизирующие агенты, влагорегулирующие агенты, рН-регулирующие агенты, агенты для изменения осмотического давления, эмульгирующие агенты, фильтры УФ-А и УФ-В, такие антиоксиданты как α-токоферол, бутилгидроксианизол или бутилгидрокситолуол.

Как правило, для специалиста в данной области должно быть ясно, что добавляемые в композиции возможные соединения выбираются таким образом, чтобы преимущества, присущие настоящему изобретению, не изменялись или изменялись незначительно.

Ниже приведены некоторые примеры настоящего изобретения, причем они представлены лишь в целях иллюстрации изобретения и никоим образом его не ограничивают.

ПРИМЕР 1.

В этом примере демонстрируется in vitro эффективность RAR-γ - специфичного антагониста-лиганда в качестве ингибитора апоптоза, когда апоптоз индуцируется другими ретиноидами.

Культивирование и получение клеток.

Суспензию тимоцитов получали из вилочковой железы необработанных мышей-самцов NMRI в возрасте 4-х недель (поставляемых LATI,

, Венгрия). Использовали среду RPMI-1640 среду (Sigma), обогащенную бычьей эмбриональной сывороткой (Gibco), содержащую 2 мМ глутамина, 100 ед. пенициллина и 100 мкг стрептомицина/мл. Тимоциты промывали, затем разбавляли этой средой до получения конечной концентрации 10⁷ клеток/мл и инкубировали при 37^oС в увлажненном инкубаторе в атмосфере, содержащей 5% СО₂ и 95% воздуха. Гибель клеток оценивали по поглощению трипанового синего.

Качественный и количественный анализ ДНК.

Тимоциты инкубировали в 24 лунках в присутствии различных испытуемых соединений. После 6 часов инкубации 0,8 мл объемы клеточной суспензии подвергали лизису путем добавления 0,7 мл лизисного буфера, содержащего 0,5% (об. /об.) Тритона Х-100, 10 мМ Трис, 20 мМ ЭДТА, рН 8.0, после чего их подвергали центрифугированию (13000•g, 15 минут).

- Количественный анализ ДНК: ДНК, содержащуюся в супернатанте (фрагменты) и осадок (интактный хроматин) осаждали равным объемом 10% трихлоруксусной кислоты, ресуспендировали в 5% трихлоруксусной кислоте и затем количественно определяли с использованием дифениламинового реагента (Burton К., (1956) Biochem.J., 62, 315-322).

- Качественный анализ ДНК: параллельно супернатант преципитировали в течение ночи в этаноле, содержащем 0,15 мМ NaCl. Осадок повторно растворяли в буфере, содержащем 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8.0, после чего растворы обрабатывали РНКазой и последовательно экстрагировали системой из равного объема фенола и хлороформа/изоамилового спирта (24/1); затем ДНК осаждали в этаноле перед электрофорезом в течение 3 часов при 60 V в 1,8% агарозном геле. После этого фрагменты ДНК визуализировали ультрафиолетом после окрашивания геля этидиумбромидом. Полученные гели давали картину полос из фрагментов ДНК, состоящих из 180-200 пар оснований и типичных для индукции апоптоза. В ходе экспериментов степень фрагментации коррелировала с числом погибших клеток, окрашиваемых трипановым синим.

Результаты количественного анализа представлены в табл. 1.

Процентное содержание фрагментов ДНК, приведенное в табл. 1, соответствует разности между процентным содержанием фрагментов ДНК, полученных в обработанных тимоцитах, и процентным содержанием фрагментов ДНК, полученных в среде необработанных тимоцитов (основная скорость апоптоза для таких тимоцитов).

Из приведенной табл. 1 ясно следует, что апоптоз, индуцированный ATRA, 9-цис-RА и CD437, ингибируется CD2665, который является антагонистом-лигандом, специфичным к рецепторам типа RAR-γ.
ПРИМЕР 2.

В данном примере демонстрируется in vitro эффективность RAR-α-специфического агониста-лиганда в качестве ингибитора апоптоза в том случае, когда апоптоз был индуцирован другим ретиноидом.

Использовали ту же методику, что и в предыдущем примере, за исключением того, что изменяли природу испытуемых лигандов и их концентрацию.

Так, CD437 (6-3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил)-2-нафтаноевую кислоту), используемую при одной концентрации, инкубировали с тимоцитами в присутствии различных концентраций CD336 (4-((5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетра-метил-2-нафталинил)карбоксамидо)бензойной кислотой).

В табл. 2 представлены полученные результаты.

Процентное содержание ДНК-фрагментов, указанное в этой таблице, соответствует разности между процентным содержанием фрагментов ДНК, полученных в обработанных тимоцитах, и процентным содержанием ДНК-фрагментов, полученных в необработанных тимоцитах (базовая скорость апоптоза для таких тимоцитов).

Из данных табл. 2 ясно следует, что апоптоз, который индуцируется действием CD437, являющегося агонистом-лигандом, обладающим специфичностью в отношении рецепторов типа RAR-γ, подвергается ингибированию дозозависимым способом под действием CD336, являющимся агонистом-лигандом со специфичностью в отношении рецепторов типа RAR-α.
ПРИМЕР 3.

В этом примере продемонстрирована эффективность RAR-α-специфичного агониста-лиганда in vitro в качестве ингибитора апоптоза в том случае, когда апоптоз индуцируется активирующим рецептором Т-клеток.

Использовали ту же методику, что и в примере 1, за исключением того, что изменяли природу испытуемых соединений и их концентрацию.

Известно, что Т-клетки дифференцируются в вилочковой железе в зрелые Т-лимфоциты. В ходе дифференцировки Т-клетки пролиферируют и приобретают рецепторы, присущие Т-клеткам. Клетки, которые экспрессируют потенциально аутореактивные клеточные рецепторы и которые взаимодействуют с клетками, представляющими атиген, подвергаются апоптозу (негативная селекция) (Smith с сотр. , (1989), Nature, 337, 181-184). Такая селекция может in vitro имитироваться стимуляцией молекулы CD3, которая связана с рецептором Т-клеток, в результате одновременного добавления форболдибутирата и Са⁺⁺ ионо-фора (Iseki с сотр., (1991), J.Inununol., 147, 4286-4292).

Форболдибутират (5 нг/мл) и Ca⁺⁺ ионофор (0,5 мкМ) инкубировали с тимоцитами в отсутствие или в присутствии различных концентраций CD336 (4-((5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталинил)карбоксамидо)бензойной кислоты).

Полученные результаты представлены в табл. 3.

В табл. 3 Р+С обозначает форболдибутират (5 нг/мл) и Са⁺⁺ ионофор (0,5 мкМ).

Процентное содержание фрагментов ДНК в приведенной таблице соответствует разности между процентным содержанием ДНК-фрагментов, полученных из необработанных тимоцитов, и процентным содержанием ДНК-фрагментов, полученным в необработанных тимоцитах (базовая скорость апоптоза для таких тимоцитов).

Таким образом, в табл. 3 ясно показано, что апоптоз, индуцируемый действием Р+С, ингибируется дозозависимым образом под действием CD336, представляющим собой агонист-лиганд, специфичный в отношении рецепторов типа RAR-α.
ПРИМЕР 4.

В этом эксперименте демонстрируется эффективность RAR-γ-специфичного антагониста-лиганда in vivo в качестве ингибитора апоптоза, в том случае, когда апоптоз индуцируется RAR-γ-специфичным агонистом-лигандом.

Использовали мышей-самцов NMRI в возрасте 4 недель (поставляемых LATI, Gödöllo, Венгрия). Для индуцирования апоптоза в тимусе таким мышам-самцам производили однократную внутрибрюшинную инъекцию 6-3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил)-2-нафтаноевой кислоты (0,5 мг), которую растворяли в 40 мкл ДМСО и 0,5 мл 20% этанола. Для того чтобы наблюдать эффект ингибирования апоптоза, который индуцируется в тимусе агонистом-лигандом, специфичным к RAR-γ, мышам-самцам производили однократную внутрибрюшинную инъекцию смеси 0,5 мг 6-3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил)-2-нафтаноевой кислоты (CD437) и 5 мг 4-[7-(1-адамантил)-6-метоксиэтоксиметокси-2-нафтил]бензойной кислоты (CD2665), причем такую смесь растворяли в 40 мкл ДМСО и 0,5 мл 20% этанола. В контроле мышам-самцам производили однократную внутрибрюшинную инъекцию смеси, состоящей из 40 мкл ДМСО и 0,5 мл 20% этанола. CD2665 также испытывали в отдельности в количестве 0,5 мг при описанных выше условиях.

Через 48 часов после обработки определяли вес тимуса и полученные результаты суммировали в табл. 4.

Таким образом, инволюция тимуса наблюдалась после обработки CD437 в отдельности и значительного изменения не наблюдалось под действием CD2665, тогда как комбинация CD2665 и CD437 приводит к инволюции тимуса, которая значительно менее выражена, чем под действием одного только CD437.

Claims (5)

1. Применение агониста, специфичного к рецепторам ретиноевой кислоты RAR-альфа, или 4-[7-(1-адамантил)-6-метоксиэтоксиметокси-2-нафтил]-бензойной кислоты в качестве средства для ингибирования апоптоза в популяции клеток Т-лимфоцитов.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист-лиганд, специфичный в отношении рецепторов RAR-альфа, имеет константу диссоциации с рецепторами RAR-альфа, которая, по крайней мере, в 20 раз меньше, чем его константа диссоциации с рецепторами типа RAR-гамма.

3. Применение по пп.1 и 2, отличающееся тем, что агонист-лиганд, специфичный в отношении рецепторов типа RAR-альфа, представляет собой 4-((5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталинил)карбоксамидо)бензойную кислоту.

4. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что средство предназначено для лечения заболеваний, которые связаны с избыточной скоростью апоптоза.

5. Применение по п. 4, отличающееся тем, что указанные заболевания, связанные с избыточной скоростью апоптоза, выбраны из синдрома иммунодефицита, вызванного вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) или отторжения трансплантата.

Images