RU2186786C1 - Способ получения гиалуроновой кислоты - Google Patents
Способ получения гиалуроновой кислоты Download PDFInfo
- Publication number
- RU2186786C1 RU2186786C1 RU2001108163/04A RU2001108163A RU2186786C1 RU 2186786 C1 RU2186786 C1 RU 2186786C1 RU 2001108163/04 A RU2001108163/04 A RU 2001108163/04A RU 2001108163 A RU2001108163 A RU 2001108163A RU 2186786 C1 RU2186786 C1 RU 2186786C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ratio
- ethyl alcohol
- hyaluronic acid
- temperature
- extraction
- Prior art date
Links
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims abstract description 52
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 52
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 claims abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 16
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 16
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 11
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 5
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 8
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 8
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 5
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 5
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 4
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 108010027350 protosubtilin Proteins 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N tetraphosphorus decaoxide Chemical compound O1P(O2)(=O)OP3(=O)OP1(=O)OP2(=O)O3 DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 108050009363 Hyaluronidases Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 238000011882 arthroplasty Methods 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical group 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000510 mucolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000010525 oxidative degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- OTNVGWMVOULBFZ-UHFFFAOYSA-N sodium;hydrochloride Chemical compound [Na].Cl OTNVGWMVOULBFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003190 viscoelastic substance Substances 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу получения гиалуроновой кислоты из петушиных гребней. Сырье обескровливают этиловым спиртом в соотношении 1:2, измельчают, проводят водную экстракцию и отделяют водную фракцию. Затем осаждают продукт этиловым спиртом в соотношении 1:3, фильтруют и сушат. На стадии водной экстракции сырье обрабатывают раствором ферментного препарата коллагеназы с содержанием 0,035-0,040% к массе сырья в течение 45-50 мин при температуре 45-50oС и рН 6,8-7,0. Технический результат - повышение выхода и улучшение качества целевого продукта. 4 ил., 2 табл.
Description
Изобретение относится к птицеперерабатывающей и химико-фармацевтической промышленности и касается способов получения препаратов гиалуроновой кислоты (ГК), которые вырабатывают из вторичного сырья птицеперерабатывающей промышленности и применяют в различных областях медицины, в том числе в дерматологии, гинекологии, офтальмологии, в косметической практике и в ветеринарии.
Известен способ получения ГК, согласно которому ее получают из измельченных петушиных гребней экстракцией раствором гидрохлорида натрия с последующей нейтрализацией раствором трихлоруксусной кислоты, вакуумной фильтрацией, стерилизацией фильтрата при 70oС в течение 30 мин и выпариванием в среде Р2О5 [Игнатова Е.Ю., Гуров А.И. Принципы извлечения и очистки гиалуроновой кислоты // Хим-фарм. Журнал. - 1990. - 3. - С. 42-46].
К недостаткам способа следует отнести и малую степень очистки препарата от белков и нуклеиновых кислот, недостаточно высокие органолептические показатели, а также выход полимера.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения гиалуроновой кислоты, предусматривающий обескровливание сырья этиловым спиртом в соотношении 1:2, измельчение до 2-3 мм сырья и обработку ультразвуком с частотой 16-20 кГц в течение 10 мин с последующей экстракцией водой с температурой 45-50oС в течение 20-25 мин, при этом отделение водной фракции осуществляется вакуумным фильтрованием, после чего проводится осаждение этиловым спиртом в соотношении 1:3, фильтрование и вакуумная или сублимационная сушка препарата. [Патент РФ 2114802. Способ получения гиалуроновой кислоты/ Л.В. Антипова, С.В.Полянских, М.П.Алексюк (РФ). - Приоритет от 31.05.96].
Недостатком описанного способа является недостаточный выход и чистота целевого продукта, а также высокая энергоемкость процесса за счет применения ультразвуковой установки.
Технической задачей изобретения является увеличение выхода и степени чистоты препарата ГК, снижение уровня токсичности, энергоемкости и повышение безопасности производства.
Поставленная задача достигается тем, что в способе получения гиалуроновой кислоты, включающем обескровливание сырья этиловым спиртом в соотношении 1: 2, измельчение, водную экстракцию, отделение водной фракции, осаждение целевого продукта этиловым спиртом в соотношении 1:3 с последующим фильтрованием и сушкой продукта, новым является то, что проводят обработку сырья на стадии водной экстракции продукта раствором ферментного препарата коллагеназы с содержанием 0,035-0,040% к массе сырья в течение 45-50 мин при температуре 45-50oС и рН 6,8-7,0.
Технический результат выражается не только в достижении поставленной задачи, но и в увеличении степени извлечения ГК, повышении качества целевого продукта, повышении экологичности производства, разработке и внедрении комплексной технологии.
ГК - типичный мукополисахарид. Важным структурным признаком его является наличие чередующихся остатков аминосахаров и остатков уроновых кислот.
В тканях и жидкостях ГК существует в свободном состоянии или ассоциирована с белками, образуя вязкие растворы.
Биополимер входит в состав основного вещества многих видов соединительной ткани до 5% к массе (петушиные гребни, стекловидное тело глаза, синовиальная жидкость, кожа). В тканях петушиного гребня ГК распределена в мукоидных волокнах подкожного слоя, наиболее широкого у основания, где ее массовая доля - до 7500 мкг/мг.
Гиалуроновая кислота - белое, твердое аморфное вещество, растворимое в воде и нерастворимое в органических растворителях. Характерным ее свойством является высокая вязкость. Молекулярная масса составляет от 5•104-8•106, что зависит от происхождения препарата, способа и метода определения.
По своей конформации молекулы ГК представляют собой беспорядочно свернутые клубочки. Применение кислотного гидролиза, метилирования, использование нескольких видов ферментативного гидролиза гиалуронидазами различного происхождения и ряда других методов позволило предложить для ГК формулу, в которой чередуются остатки глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина. Эти дисахаридные фрагменты связаны в молекулы гиалуроновой кислоты - 1,4 - связями (см. формулу 1, приведенную в конце описания).
Биологическое значение ГК состоит прежде всего в том, что она является цементирующим, как бы склеивающим веществом соединительно-тканных систем организма. Она является основой функционирования муколитической системы, определяющей, в частности, проницаемость тканей и сосудов. Вследствие высокого значения молекулярной массы кислота выполняет роль структурообразователя, "связывателя" воды в промежуточных полостях, гелеобразных матрицах, что определяет тургор тканей и повышает их сопротивление действию сжимающих нагрузок. Способствует стойкости организма к проникновению инфекции.
Антифрикционные и демпферные свойства тканевых жидкостей, в частности синовиальной, определяются наличием в них биополимера.
Биологические свойства кислоты определили широкое ее использование при изготовлении лекарственных, фармацевтических препаратов и косметических изделий. Например, обоснована целесообразность использования ГК как заменителя стекловидного тела. Использование ее растворов в качестве операционной среды, предохраняющей внутренние ткани глаза от механических воздействий, резко повышает эффективность операций на глазе человека. На основе ГК создаются вязкоэластические материалы.
Кроме офтальмологии кислота используется в ревматологии (для замещения синовиальной жидкости), при лечении артрозов, в артопластике и остеомии для защиты хрящевых поверхностей и периферийного нерва, в дерматологии - для защиты кожных ран при экземах и трофических расстройствах кожи; в производстве косметических препаратов (гели, кремы, лосьоны).
При определении общего химического состава коллагенсодержащего сырья пользовались методиками определения: массовой доли влаги [ГОСТ 9793-74. Продукты мясные. Методы определения влаги.]; жира - методом Сокслета [Журавская И. К. и др. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов, 1985]; белка [Журавская И.К. и др. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов, 1985] . Фракционный состав белков определяли последовательным экстрагированием водо-, соле- и щелочерастворимых белковых фракций соответственно дистиллированной водой, раствором хлористого калия с массовой долей 5% и раствором гидроксида натрия с массовой долей 10% с последующим количественным определением белка с биуретовым реактивом, определение протеолитиче-ской активности проводили в соответствии с [ГОСТ 20264.2-88. Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности].
В качестве объекта для получения ГК используют петушиные гребни. Сравнительный анализ химического состава гребня по отношению к другим коллагенсодержащим продуктам убоя птицы показал преобладание в нем массовой доли белка (19,8% к массе сырья) при массовом превалировании протеиноидной фракции (14,4% к массе сырья).
Высокая доля коллагеновых волокон в структуре ткани с низкой массовой долей жиров подтверждает целесообразность получения интересующего биополимера с применением методов биотехнологии.
Для разрушения упроченных белковых структур соединительной ткани гребня целесообразно применение ферментных препаратов, комплексы которых характеризуются высокими уровнями протеолитической и коллагеназной активностями.
Требования к ферментным системам для направленной модификации химического состава и биотрансформации структурно-механических свойств коллагенсодержащего сырья птицеперерабатывающей промышленности обусловлены преобладанием различных фракций белков в составе сырья и связаны прежде всего высокой субстратной специфичностью к гидролизу белковых фракций, максимумом активности в нейтральной зоне рН и умеренном интервале температур.
Ассортимент протеиназ составлен из промышленных ферментных препаратов животного и микробного происхождения.
Первоначальный отбор ферментных препаратов осуществляли путем оценки уровня общего и специфического протеолиза на соответствующих белковых субстратах в нейтральной зоне рН.
Требованиям удовлетворяют ферментные препараты протосубтилин Г20х, мегатерии, коллагеназа, обладающие требуемой специфичностью и высокими уровнями специфической активности.
Протосубтилин Г20х (СТП 100-02-88, введ. 23.03.88) и мегатерин (ТУоп 00479942-002-94, введ. 01.01.94) выпускаются в промышленном масштабе Вышневолоцким заводом ферментных препаратов (пос. Зеленогорский Тверской области).
Коллагеназа получена экстракцией из печени дальневосточного краба и произведена на АО "Биопрогресс" г. Щелково.
Результаты исследований показали, что максимальной протеолитической активностью обладает фермент коллагеназа (252,9 ед/г), обладающий еще и специфическим действием на коллаген, что положительно влияет на увеличение выхода целевого продукта.
В то же время следует подчеркнуть, что головы птицы с гребнем находят очень ограниченное применение на пищевые цели, а отдельный гребень не используется как исходное сырье совсем. Его выход составляет 1,5-2,0% к массе тушки. Таким образом, птицеперерабатывающая промышленность имеет реальные и достаточные резервы в получении важнейшего биополимера за счет увеличения доли полезного использования вторичных малоценных продуктов.
Необходимым условием при производстве гиалуроновой кислоты является, прежде всего, возможность выделения ее в нативном высокополимеризованном состоянии в виде высоко очищенных препаратов, свободных от белка.
Способ получения ГК осуществляется следующим образом.
Свежие петушиные гребни подвергают предварительной обработке промывкой проточной водопроводной водой с последующим обескровливанием этиловым спиртом в соотношении 1:2. Отмытые от крови во избежание окислительной деструкции ткани могут быть "законсервированы" на длительное (до 24 мес.) время при температуре 4-22oС в 95%-ном этаноле.
Для дальнейшей обработки гребни измельчают на гомогенизаторе (дезинтеграторе, шаровой мельнице). С целью отделения белка и высвобождения кислоты из ее комплексов с белками и другими мукополисахаридами подготовленные гребни подвергают водной экстракции с обработкой раствором коллагеназы с содержанием от 0,035 до 0,050% к массе сырья при температуре 45-50oС, рН 6,8-7,0 и продолжительности 45-50 мин.
Водный раствор ГК отделяли от остатка ткани путем вакуумного фильтрования. Из отфильтрованных растворов ГК осаждали 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1: 3 и снова фильтровали. С целью увеличения продолжительности сроков хранения и удобства применения ГК подвергают вакуумной или сублимационной сушке. Далее в зависимости от назначения ГК хранят в высушенном виде при температуре - 18oС или растворяют в физиологическом буферном растворе и упаковывают в удобную тару, например в шприцы.
Полученный таким способом биопрепарат представляет собой сплетение тончайших нитей большой жесткости. Он легко растворим в воде, давая совершенно прозрачные неопалесцирующие растворы.
Применение ферментов позволяет повысить степень высвобождения ГК из комплексов с белками и мукополисахаридами, что положительно сказывается на выходе и чистоте готового продукта.
Для каждого фермента характерна определенная область оптимальных значений рН, при которых его активность максимальна. На фиг.1 приведена зависимость активности коллагеназы от изменения рН среды.
Для коллагеназы оптимум рН равен 7. При смещении рН в область щелочных или кислых значений протеолитическая активность резко снижается, что отрицательно сказывается на степени гидролиза и выходе препарата ГК.
Активность фермента зависит от температуры, эта зависимость приведена на фиг.2. В данном случае активность фермента до температуры в 37oС повышается, что обусловлено повышением скорости теплового движения молекул. Затем начинает снижаться и при 60oС достигает минимума, что происходит вследствие денатурационных и коагуляционных изменений в структуре фермента. Экстракцию целесообразно проводить при температуре 45-50oС, причем при 45oС активность фермента достаточно высока, то есть оптимальной температурой водной экстракции, совмещенной с ферментативной обработкой, является температура 45oС.
При температуре, меньшей 45oС, активность фермента больше, следовательно, степень гидролиза выше, но при оптимальной для фермента температуре в 37oС снижается скорость экстракции ГК, что приводит к увеличению продолжительности всего технологического цикла.
Температура выше 50oС связана с невысокой степенью гидролиза белка и с началом развития коагуляционных и денатурационных процессов, что отрицательно влияет на качество и чистоту препарата.
Изучение влияния концентрации фермента на выход препарата показало, что максимальный выход ГК наблюдается при концентрации фермента равной 0,037% к массе сырья, дальнейшее ее увеличение вызывает глубокий распад структуры коллагена и, следовательно, невозможность полного выделения ГК из комплекса с белками. Зависимость степени гидролиза и выхода продукта от концентрации фермента изображена на фиг.3.
При концентрации фермента менее 0,035% к массе сырья не достигается необходимая степень гидролиза, что снижает выход ГК и увеличивает продолжительность всего процесса производства.
Необходимым условием для достижения максимальной степени гидролиза является подбор оптимальной продолжительности ферментации. Продолжительность ферментной обработки влияет не только на степень гидролиза, но и на выход конечного продукта. Из фиг.4 видно, что оптимальная продолжительность ферментативной обработки 45 мин, при уменьшении времени ферментации не достигается максимальный распад субстрата, а увеличение - не целесообразно, так как не повышает выхода целевого продукта.
Осадок не растворившихся после выделения ГК тканей целесообразно использовать на кормовые цели.
ГК извлекают из водной среды путем осаждения ее 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:3.
Способ получения ГК поясняется конкретными примерами.
Пример 1. Свежие петушиные гребни подвергают предварительной промывке проточной водопроводной водой и обескровливают этиловым спиртом в соотношении 1:2. К 100 г измельченных гребней до размера кусочков 2-3- мм прибавляют воду в соотношении 1:3 и 0,037 г коллагеназы и экстрагируют ГК при рН 7 в течение 45 мин при температуре 45oС. Экстракт отделяют вакуумным фильтрованием. Из водной среды ГК выделяют путем осаждения 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:3. Отфильтрованный осадок упаривают над пятиокисью фосфора в вакууме или с применением сублимационной сушки. Полученный препарат хранят в высушенном виде или в растворе спирта при температуре -18oС.
Пример 2. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. рН среды при ферментации и водной экстракции равно 6.
Пример 3. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. рН среды при ферментации и водной экстракции равно 8.
Пример 4. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. Ферментацию и водную экстракцию проводят при температуре 3-5oС.
Пример 5. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. Ферментацию и водную экстракцию проводят при температуре 55oС.
Пример 6. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. Ферментацию и водную экстракцию проводят раствором коллагеназы с содержанием 0,041% к массе сырья.
Пример 7. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. Ферментацию и водную экстракцию проводят раствором коллагеназы с содержанием 0,030% к массе сырья.
Пример 8. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. Продолжительность ферментации и водной экстракции 30 мин.
Пример 9. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. Продолжительность ферментации и водной экстракции 60 мин.
Данные по примерам 1-9 представлены в таблице 1.
Данные таблицы 1 показывают, что способ получения ГК по режимам, приведенным в примерах 4, 8, приводит к недостаточно высокому выходу продукта, по примерам 2, 3, 5 еще и к недостаточной чистоте препарата (массовая доля белка до 4-5%, препарат желтого цвета).
Производство ГК по примерам 6, 7 приводит к неоправданно высокому или недостаточно высокому расходу ферментного препарата для обеспечения необходимой степени гидролиза сырья, что существенно влияет на выход препарата и его чистоту.
Максимальный выход ГК достигается при режимах по примерам 1, 9, но процесс по примеру 1 менее продолжителен и позволяет получить полимер высокой степени очистки.
Преимущества предлагаемого технического решения по сравнению с прототипом представлены в таблице 2.
Предложенный способ позволяет сократить сырьевые расходы, увеличить степень извлечения, чистоту и выход препарата ГК, снизить энергоемкость процесса, улучшить безопасность и экологичность производства.
Claims (1)
- Способ получения гиалуроновой кислоты, включающий обескровливание петушиных гребней этиловым спиртом в соотношении 1: 2, измельчение, водную экстракцию, отделение водной фракции, осаждение целевого продукта этиловым спиртом в соотношении 1: 3 с последующим фильтрованием и сушкой продукта, отличающийся тем, что на стадии водной экстракции проводят обработку сырья раствором ферментного препарата коллагеназы с содержанием 0,035-0,040% к массе сырья в течение 45-50 мин при температуре 45-50oС и рН 6,8-7,0.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001108163/04A RU2186786C1 (ru) | 2001-03-26 | 2001-03-26 | Способ получения гиалуроновой кислоты |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001108163/04A RU2186786C1 (ru) | 2001-03-26 | 2001-03-26 | Способ получения гиалуроновой кислоты |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2186786C1 true RU2186786C1 (ru) | 2002-08-10 |
Family
ID=20247648
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001108163/04A RU2186786C1 (ru) | 2001-03-26 | 2001-03-26 | Способ получения гиалуроновой кислоты |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2186786C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2420295C1 (ru) * | 2010-01-11 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Способ выделения гиалуроновой кислоты из шкур |
| RU2720287C1 (ru) * | 2019-07-03 | 2020-04-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пензенский государственный университет" (ФГБОУ "ПГУ") | Штамм бактерий streptomyces violascens - продуцент гиалуроновой кислоты |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986006728A1 (en) * | 1985-05-09 | 1986-11-20 | Hill David Cullis | Preparation of hyaluronic acid |
| RU2114862C1 (ru) * | 1996-05-31 | 1998-07-10 | Воронежская государственная технологическая академия | Способ получения гиалуроновой кислоты |
| RU2128666C1 (ru) * | 1991-04-19 | 1999-04-10 | ФИДИА С.п.А. | Фракция гиалуроновой кислоты или ее соли, способ очистки этой фракции, способы получения этой фракции, фармацевтический препарат и средства, используемые в офтальмологии |
| RU2157381C1 (ru) * | 1999-03-01 | 2000-10-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Тульская индустрия ЛТД" | Способ получения гиалуроновой кислоты |
-
2001
- 2001-03-26 RU RU2001108163/04A patent/RU2186786C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986006728A1 (en) * | 1985-05-09 | 1986-11-20 | Hill David Cullis | Preparation of hyaluronic acid |
| RU2128666C1 (ru) * | 1991-04-19 | 1999-04-10 | ФИДИА С.п.А. | Фракция гиалуроновой кислоты или ее соли, способ очистки этой фракции, способы получения этой фракции, фармацевтический препарат и средства, используемые в офтальмологии |
| RU2114862C1 (ru) * | 1996-05-31 | 1998-07-10 | Воронежская государственная технологическая академия | Способ получения гиалуроновой кислоты |
| RU2157381C1 (ru) * | 1999-03-01 | 2000-10-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Тульская индустрия ЛТД" | Способ получения гиалуроновой кислоты |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 6. ИГНАТОВА Е.Ю. и др. Принципы извлечения и очистки гиалуроновой кислоты. - Хим. - фарм. журнал, 1990, № 3, с. 42-46. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2420295C1 (ru) * | 2010-01-11 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Способ выделения гиалуроновой кислоты из шкур |
| RU2720287C1 (ru) * | 2019-07-03 | 2020-04-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пензенский государственный университет" (ФГБОУ "ПГУ") | Штамм бактерий streptomyces violascens - продуцент гиалуроновой кислоты |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6980974B2 (ja) | ヒアルロン酸のナトリウム塩の調製及び精製プロセス | |
| US6946551B2 (en) | Preparation of hyaluronic acid from eggshell membrane | |
| WO2001064756A1 (fr) | Sulfate de chondroitine tire du saumon | |
| AU2007280846B2 (en) | Branched hyaluronic acid and method of manufacture | |
| CN112778412B (zh) | 一种低内毒素胶原蛋白的制备方法 | |
| Kulkarni et al. | Extraction, purification and characterization of hyaluronic acid from Rooster | |
| Fan et al. | Preparation and characterization of carboxymethylated carrageenan modified with collagen peptides | |
| CN107188990A (zh) | 鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法 | |
| WO2007131424A1 (fr) | Procédé de préparation de compositions de protéoglycane et de collagène à faible poids moléculaire, produits résultants et utilisations de ceux-ci | |
| RU2186786C1 (ru) | Способ получения гиалуроновой кислоты | |
| CN116333095A (zh) | 一种富多糖胶原蛋白肽及其制备方法和应用 | |
| Ürgeová et al. | Comparison of enzymatic hydrolysis of polysaccharides from eggshells membranes | |
| Lambe et al. | Isolation, purification and characterization of hyaluronic acid: a concise review | |
| RU2250047C1 (ru) | Пищевой общеукрепляющий профилактический продукт из хрящевой ткани гидробионтов и способ его получения | |
| RU2114862C1 (ru) | Способ получения гиалуроновой кислоты | |
| RU2139715C1 (ru) | Способ получения солей гликозаминогликанов | |
| CN116355114B (zh) | 一种鲟鱼硫酸软骨素的制备方法及其在促糖尿病慢性伤口愈合敷料中的应用 | |
| Anokhova et al. | Sensitivity of different collagens to proteolytic enzyme treatment | |
| KR101447975B1 (ko) | 초음파를 이용한 히알루론산 추출 방법 | |
| RU2623738C1 (ru) | Биологически активная добавка из морских гидробионтов - источник хондроитинсульфата и способ ее получения | |
| RU2610669C1 (ru) | Способ получения протеолитического препарата для медицинского применения | |
| RU2795425C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата папаина и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора | |
| JP4719878B2 (ja) | アオヤギ由来のコンドロイチン硫酸 | |
| Abdulameer et al. | Anticoagulant effectiveness of glycosaminoglycan extracted from the scale of Binni, Mesopotamichthys sharpeyi (Cyprinidae) | |
| RU2304441C1 (ru) | Способ получения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040327 |