RU2184780C2 - Peptide-simulator of protein gp120 hiv-1 epitope - Google Patents
Peptide-simulator of protein gp120 hiv-1 epitope Download PDFInfo
- Publication number
- RU2184780C2 RU2184780C2 RU2000121342A RU2000121342A RU2184780C2 RU 2184780 C2 RU2184780 C2 RU 2184780C2 RU 2000121342 A RU2000121342 A RU 2000121342A RU 2000121342 A RU2000121342 A RU 2000121342A RU 2184780 C2 RU2184780 C2 RU 2184780C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptides
- hiv
- phage
- protein
- peptide
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims abstract description 16
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 10
- 238000003314 affinity selection Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 6
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 abstract description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 abstract description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 abstract 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 abstract 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 13
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 6
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 description 2
- 229940033332 HIV-1 vaccine Drugs 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229940033330 HIV vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии, конкретно - к получению с помощью фагового дисплея пептидов-имитаторов антигенной детерминанты белка gp120 вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), узнаваемой вируснейтрализующими моноклональными антителами 2G12. The invention relates to biotechnology, genetic and protein engineering, and specifically, to obtaining, using a phage display, peptide mimetics of the antigenic determinant of the human
Одной из основных проблем при создании эффективных вакцинных препаратов против СПИДа является высокая антигенная вариабельность ВИЧ. Интенсивное разрушение Т-лимфоцитов, несущих на своей поверхности рецептор CD4+, наряду с мощным антительным ответом на структурные белки р24, gp120 и gp41 способствует появлению и селекции генетических вариантов ВИЧ-1 даже в течение индивидуального инфекционного процесса [1]. При использовании инактивированных цельновирионных ВИЧ-вакцин существует также опасность аутоиммунных процессов вследствие мимикрии структуры вирусного белка gp120 под структуру иммуноглобулинов [2].One of the main challenges in creating effective AIDS vaccines is the high antigenic variability of HIV. Intensive destruction of T-lymphocytes carrying CD4 + receptor on their surface, along with a powerful antibody response to structural proteins p24, gp120 and gp41, promotes the appearance and selection of HIV-1 genetic variants even during an individual infection process [1]. When using inactivated whole-virus HIV vaccines, there is also a danger of autoimmune processes due to the mimicry of the structure of the gp120 viral protein under the structure of immunoglobulins [2].
Решению проблемы может помочь использование при создании вакцин пептидов, отличающихся по аминокислотной последовательности от антигенных детерминант вирусов, но сохраняющих способность связываться с противовирусными антителами. Такие пептиды являются имитаторами антигенных детерминант. Пептиды-имитаторы могут быть достаточно вырожденными и иметь перекрестную реактивность с антителами к разным изолятам вируса. Вырожденные пептиды могут иметь свойство индуцировать при иммунизации антитела, перекрестно реагирующие с антигенными вариантами одного и того же вируса (явление молекулярной мимикрии). Пептиды, мимикрирующие вируснейтрализующие эпитопы вирусов, по-видимому, будут вызывать наработку протективных антител и могут быть вследствие этого использованы при создании вакцин против ВИЧ и других высоковариабельных патогенов. Например, было показано, что имитаторы HBsAg, селектированные с подтип-специфической сывороткой, при инъекции экспериментальным животным способны индуцировать образование антител, не обладающих специфичностью к подтипам вируса гепатита В [3]. The use of peptides when creating vaccines that differ in amino acid sequence from antigenic determinants of viruses, but retain the ability to bind to antiviral antibodies, can help solve the problem. Such peptides mimic antigenic determinants. Mimetic peptides can be quite degenerate and have cross-reactivity with antibodies to different virus isolates. Degenerate peptides can tend to induce antibodies that cross-react with antigenic variants of the same virus during immunization (the phenomenon of molecular mimicry). Peptides that mimic virus-neutralizing virus epitopes are likely to produce protective antibodies and can therefore be used to create vaccines against HIV and other highly variable pathogens. For example, it was shown that HBsAg simulators selected with a subtype-specific serum, when injected into experimental animals, can induce the formation of antibodies that do not have specificity for hepatitis B virus subtypes [3].
Уникальные возможности для получения пептидов-имитаторов природных антигенов предоставляют фаговые библиотеки пептидов, включающие в себя все возможные пептиды заданной длины, экспонированные в составе одного из поверхностных белков нитчатых бактериофагов. При этом в геноме каждого фага такой библиотеки закодирована последовательность только одного из вариантов пептидов. Отбор пептидов осуществляется с помощью антител определенной специфичности (при получении вакцин это должны быть протективные антитела). При этом интересен тот факт, что на моноклональные антитела (МКА) из фаговой пептидной библиотеки обычно отбирается ряд пептидов, отличающихся по аминокислотному составу от оригинального антигена, но имитирующих его по связыванию. Phage libraries of peptides that include all possible peptides of a given length exposed as part of one of the surface proteins of filamentous bacteriophages provide unique opportunities for producing peptides that mimic natural antigens. Moreover, the sequence of only one of the peptide variants is encoded in the genome of each phage of such a library. Peptides are selected using antibodies of a specific specificity (when receiving vaccines, these must be protective antibodies). At the same time, it is interesting that a number of peptides that differ in amino acid composition from the original antigen but mimic its binding are usually selected for monoclonal antibodies (MCAs) from the phage peptide library.
Хорошим примером пептидов-имитаторов ВИЧ-1 является работа Keller с соавторами [4] , в которой показано, что пептиды, селектированные из фаговой пептидной библиотеки по связыванию с МКА 447-52D к V3-петле gp120 вируса иммунодефицита человека, могут индуцировать специфичный гуморальный иммунный ответ на gp120. A good example of HIV-1 mimetic peptides is the work of Keller et al. [4], which showed that peptides selected from a phage peptide library for binding to MKA 447-52D to the V3 loop of human immunodeficiency virus gp120 can induce a specific humoral immune answer to gp120.
Одними из самых перспективных вируснейтрализующих МКА являются 2G12 [5]. Было показано, что моноклональные антитела 2G12 против белка gpl20 ВИЧ-1 обладают нейтрализующей активностью против широкого спектра изолятов ВИЧ-1 различных субтипов, активируют систему комплемента по классическому пути и вызывают антителозависимую клеточную цитотоксичность. Ни одно из известных антител не конкурирует с 2G12 за связывание с белком gpl20. В соответствии с этим МКА 2G12 относят к уникальной группе антител, в которой на сегодняшний день МКА 2G12 является единственным представителем [6]. One of the most promising neutralizing MCAs is 2G12 [5]. It was shown that monoclonal antibodies 2G12 against the HIV-1 gpl20 protein have neutralizing activity against a wide range of HIV-1 isolates of various subtypes, activate the complement system in the classical way and cause antibody-dependent cellular cytotoxicity. None of the known antibodies competes with 2G12 for binding to the gpl20 protein. In accordance with this, MCA 2G12 belong to a unique group of antibodies, in which today MCA 2G12 is the only representative [6].
МКА 2G12 в комплексе с другими антителами используются для пассивной иммунотерапии больных СПИДом в клиниках США и Европы [7]. В связи с этим является перспективным использование 2G12 эпитопа для экспонирования в составе рекомбинантной вакцины против ВИЧ-1 [8]. Структура эпитопа, узнаваемого МКА 2G12, до сих пор не определена, показано только, что он сильно зависит от конформации поверхностного гликопротеина gp120 [5]. В настоящее время не известны фрагменты gp120, способные связываться с МКА 2G12. MCA 2G12 in combination with other antibodies are used for passive immunotherapy of AIDS patients in clinics in the USA and Europe [7]. In this regard, it is promising to use the 2G12 epitope for exposure as part of a recombinant HIV-1 vaccine [8]. The structure of the epitope recognized by MCA 2G12 has not yet been determined; it has only been shown that it strongly depends on the conformation of the surface glycoprotein gp120 [5]. Currently, fragments of gp120 capable of binding to 2A12 MCA are not known.
Технической задачей изобретения является поиск пептидов-имитаторов эпитопа белка gp120 ВИЧ-1, узнаваемого МКА 2G12, с помощью фаговых пептидных библиотек. An object of the invention is the search for peptides that mimic the epitope of the HIV-1 gp120 protein recognized by 2G12 MCA using phage peptide libraries.
Поставленная цель достигается путем аффинной селекции из фаговых пептидных библиотек, содержащих десятки миллионов разных пептидов длиной 15 а. о, тех пептидов, которые способны связываться с моноклональными антителами 2G12 (МКА 2G12) к нейтрализующему эпитопу белка gp120 ВИЧ-1. Пептиды в библиотеке экспонированы на поверхности бактериофагов в составе минорного белка оболочки рIII, при этом каждая фаговая частица содержит 5 копий одного пептида [9]. This goal is achieved by affinity selection from phage peptide libraries containing tens of millions of different peptides with a length of 15 a. o, those peptides that are able to bind to monoclonal antibodies 2G12 (MKA 2G12) to a neutralizing epitope of the gp120 HIV-1 protein. Peptides in the library are exposed on the surface of bacteriophages as part of the minor protein of the pIII coat, with each phage particle containing 5 copies of one peptide [9].
Метод аффинной селекции заключается в следующем. Биотинилированные моноклональные антитела иммобилизуются на пластиковой поверхности, обработанной стрептавидином, и к ним добавляется фаговая библиотека. После наступления кинетического равновесия несвязавшиеся фаги отмываются буфером, а связавшиеся с антителами фаги элюируются и размножаются для нового цикла селекции. Трех раундов аффинной селекции обычно достаточно для получения обогащенной популяции фагов, содержащих целевые последовательности [10, 11]. Для отбора всех вариантов специфичных клонов в первом раунде селекции используют насыщающее по отношению к фаговым частицам количество МКА. Для создания конкуренции между фагами за связывание с МКА и отбора наиболее специфичных вариантов во втором и третьем раундах селекции используют меньшие по отношению к фагам концентрации антител. Обогащение фаговой популяции определяют по увеличению выхода фагов после каждого раунда селекции. Из обогащенной таким образом фаговой библиотеки после 1, 2, 3-го раундов аффинной селекции отбирают индивидуальные фаговые клоны и определяют специфичность их связывания с соответствующими МКА в ИФА. По результатам ИФА отбирают эффективно взаимодействующие с МКА фаги. Аминокислотный состав специфичных к МКА пептидов, расположенных на поверхности фаговых частиц, определяют секвенированием фаговых ДНК по модифицированному методу Сэнгера [12] в кодирующей пептид области. The affinity selection method is as follows. Biotinylated monoclonal antibodies are immobilized on a plastic surface treated with streptavidin, and a phage library is added to them. After the onset of kinetic equilibrium, unbound phages are washed with buffer, and phages bound to antibodies are eluted and propagated for a new selection cycle. Three rounds of affinity selection are usually sufficient to obtain an enriched population of phages containing target sequences [10, 11]. In order to select all variants of specific clones in the first round of selection, the amount of MCA saturating with respect to phage particles is used. In order to create competition between phages for binding to MABs and to select the most specific variants in the second and third rounds of selection, lower antibody concentrations relative to phages are used. Enrichment of the phage population is determined by the increase in the output of phages after each round of selection. After the 1st, 2nd, 3rd rounds of affinity selection, individual phage clones are selected from the phage library enriched in this way and the specificity of their binding to the corresponding MABs in ELISA is determined. Based on the results of ELISA, phages efficiently interacting with MCA are selected. The amino acid composition of MCA-specific peptides located on the surface of phage particles is determined by phage DNA sequencing according to the modified Sanger method [12] in the region encoding the peptide.
Анализ сходства аминокислотных последовательностей отобранных пептидов с последовательностью gp120, проведенный с учетом экспонированности аминокислот на поверхности белка по данным рентгеноструктурного анализа [13], показал, что общие структурные мотивы селектированных пептидов находятся в районе 380 - 420 аминокислотных остатков в нумерации gp 120 ВИЧ-1. По-видимому, аминокислотные остатки Phe-383, Tyr-384, Ser-387, Ser-393, Thr-394, Trp-395, Leu-416, Arg-419, Leu-420 определяют связывание МКА 2G12 с белком gpl20. Данные аминокислоты удалены друг от друга в последовательности, но сближены в пространстве и образуют на поверхности gpl20 эпитоп, узнаваемый МКА 2G12 (фиг.4). An analysis of the similarity of the amino acid sequences of the selected peptides with the gp120 sequence, taking into account the exposure of amino acids on the surface of the protein according to X-ray diffraction analysis [13], showed that the general structural motifs of the selected peptides are in the region of 380 - 420 amino acid residues in the gp 120 HIV-1 numbering. Apparently, the amino acid residues Phe-383, Tyr-384, Ser-387, Ser-393, Thr-394, Trp-395, Leu-416, Arg-419, Leu-420 determine the binding of MCA 2G12 to the gpl20 protein. These amino acids are removed from each other in sequence, but are close in space and form on the gpl20 surface an epitope recognized by MCA 2G12 (Fig. 4).
Практическое использование. Practical use.
Для практического использования селектированные нами пептиды-миметики можно получать химическим синтезом или, что более экономично, с использованием рекомбинантной технологии в составе различных белков-носителей. Использование в качестве белка-носителя экспрессионного вектора на основе нитчатых бактериофагов (M13,fd), позволяющего экспонировать чужеродные пептиды на поверхности вириона, является наиболее эффективным и практичным:
- фаг, размножаясь в E/Coli, выходит в культуральную среду не лизируя клетку хозяина, что упрощает процедуру его очистки;
- фаг накапливается в культуральной среде в концентрации 1012 вирионов на миллилитр, поэтому его легко наработать в больших количествах;
- конформация пептида, отобранного в составе фага, является оптимальной и при использовании других белков-носителей может сильно меняться;
- при встраивании пептида в поверхностный белок фага (2700 копий на вирион) получается очень эффективная мультимерная система презентации, позволяющая преодолеть проблему слабой иммуногенности пептидов. По своей эффективности такая система часто превосходит такие системы, как НВс-антиген.For practical use, the mimetic peptides selected by us can be obtained by chemical synthesis or, more economically, using recombinant technology in various carrier proteins. The use of an expression vector based on filamentous bacteriophages (M13, fd), which allows exposing foreign peptides on the surface of the virion, is the most effective and practical:
- the phage, multiplying in E / Coli, enters the culture medium without lysing the host cell, which simplifies the procedure for its purification;
- the phage accumulates in the culture medium at a concentration of 10 12 virions per milliliter, so it is easy to accumulate in large quantities;
- the conformation of the peptide selected as part of the phage is optimal and when using other carrier proteins can vary greatly;
- when a peptide is inserted into a surface phage protein (2700 copies per virion), a very effective multimeric presentation system is obtained, which allows overcoming the problem of weak immunogenicity of peptides. In its effectiveness, such a system often surpasses systems such as the HBc antigen.
Сущность изобретения заключается в том, что селектированные из фаговой пептидной библиотеки пептиды обладают свойством связываться с нейтрализующими ВИЧ-1 МКА 2G12. The essence of the invention lies in the fact that peptides selected from a phage peptide library have the property of binding to HIV-1 neutralizing MCA 2G12.
Полученные нами результаты по локализации эпитопа, узнаваемого МКА 2G12, соответствуют представлениям других исследователей, а также дополняют их, потому что впервые нами были предсказаны аминокислотные остатки, входящие в состав данного эпитопа. Поскольку данные антитела обладают значительным иммунотерапевтическим действием, а в сыворотках ВИЧ-инфицированых пациентов встречаются крайне редко вследствие недоступности эпитопа иммунной системе для индукции гуморального ответа [8] , то пептиды-имитаторы эпитопа 2G12 могут быть использованы при разработке рекомбинантных вакцин против ВИЧ-1 и диагностических тест-систем. Our results on the localization of the epitope recognized by MCA 2G12 correspond to the ideas of other researchers and also complement them, because for the first time we predicted the amino acid residues that make up this epitope. Since these antibodies have a significant immunotherapeutic effect, and are extremely rare in the sera of HIV-infected patients due to the inaccessibility of the epitope to the immune system to induce a humoral response [8], 2G12 epitope mimetic peptides can be used in the development of recombinant HIV-1 vaccines and diagnostic test systems.
Таким образом, нами впервые получены пептиды, имитирующие полноразмерный гликопротеин gp120 по связыванию с вируснейтрализующими антителами 2G12. Пептиды экспонированы на поверхности нитчатых бактериофагов в составе минорного белка оболочки рIII, при этом каждая фаговая частица содержит 5 копий одного пептида. Thus, we first obtained peptides that mimic the full-sized gp120 glycoprotein by binding to 2G12 virus-neutralizing antibodies. Peptides are exposed on the surface of filamentous bacteriophages as part of the minor protein of the envelope pIII, with each phage particle containing 5 copies of one peptide.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами. The invention is illustrated by the following figures.
Фиг.1. Схема аффинной селекции. Figure 1. Affinity selection scheme.
Фиг. 2. Результаты взаимодействия фаговых клонов в ИФА. В качестве отрицательного контроля взят фаг fuse2, который не экспонирует рандомизованный пептид. FIG. 2. The results of the interaction of phage clones in ELISA. The fuse2 phage, which does not exhibit a randomized peptide, was taken as a negative control.
Фиг.3. Аминокислотные последовательности пептидов - имитаторов вируснейтрализующего эпитопа белка gp120 ВИЧ-1, узнаваемого МКА 2G12. Выделены совпадающие аминокислотные остатки. Figure 3. Amino acid sequences of peptides imitating the virus-neutralizing epitope of HIV-1 gp120 protein, recognized by MCA 2G12. Matching amino acid residues are highlighted.
Фиг. 4. Поверхность молекулы gpl20 ВИЧ-1. Темным цветом выделены аминокислотные остатки, входящие в состав эпитопа, узнаваемого МКА 2G12. FIG. 4. The surface of the gpl20 molecule of HIV-1. The amino acid residues that make up the epitope recognized by MCA 2G12 are highlighted in dark color.
Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже следуют примеры его осуществления. For a better understanding of the essence of the invention, the following are examples of its implementation.
Пример 1. Способ проведения аффинной селекции пептидов, имитирующих вируснейтрализующий эпитоп белка gpl20 ВИЧ-1, узнаваемый моноклональными антителами 2G12. Example 1. The method of affinity selection of peptides that mimic the virus-neutralizing epitope of the HIV-1 gpl20 protein, recognized by 2G12 monoclonal antibodies.
Первый раунд аффинной селекции фаговой библиотеки проводят по следующей схеме [10] . На пластиковую чашку Петри диаметром 35 мм наносят 900 мкл дистиллированной воды и 100 мкл 1М NaHCO3, pH 8,6, добавляют 10 мкл водного стрептавидина (1мг/мл). Чашку Петри инкубируют ночь при 4oС, сливают стрептавидин и заливают 1 мл блокирующего раствора (0,1М NaHCO3, 5 мг/мл BSA, 0,1 мкг/мл стрептавидина, 0,02% азида натрия), инкубируют чашку при 4oС в течение 1 ч. Отмывают чашку 6 раз буфером TBS/Tween (50мМ трис-HCl, рН7,5, Tween-20 0,5% v/v) и добавляют 400 мкл TBS/Tween, содержащий BSA (1 мг/мл) и 0,02% азид натрия, биотинилированные антитела (конечная концентрация в растворе 250 нМ), инкубируют чашку в течение 2 ч при 4oС, затем добавляют 4 мкл 10мМ биотина, выдерживают при 4oС в течение 1ч, отмывают чашку 6 раз с TBS/Tween, наносят 400 мкл TBS/Tween, 4 мкл 10мМ биотина и 5 мкл исходной фаговой библиотеки (5х1011 вирионов). Чашку инкубируют при 4oС в течение 4 ч, отмывают 10 раз TBS/Tween, наносят 400 мкл элюирующего буфера (0,1N HCl, рН доводится глицином до 2.2, 1 мг/мл BSA), инкубируют 10 мин, элюат переносят в пластиковые пробирки, содержащие 75 мкл 1М Трис-НСl рН 9.1 для нейтрализации кислоты, конечный рН раствора (7-8.5) проверяют индикаторной бумагой. Амплификацию фагового элюата проводят добавлением суспензии элюированных фагов к аликвоте клеток Escherichia coli К91Кan, выращенных на ТВ-среде (1,2% бактотриптон, 2,4% дрожжевой экстракт, 0,5% глицерин, 1,7мМ KH2PO4, 7,2мМ К2НРO4). Фаги выращивают в LB среде [10]. Фаги титруют с использованием клеток К91Кan, выращенных на ТВ-среде, с последующим высевом на чашки с агаром, содержащим канамицин (100 мкг/мл) и тетрациклин (40 мкг/мл) и подсчетом выросших колоний. Титр фагов определяют по числу колоний (трансдуцирующих единиц (TU)) по G.P.Smith [10]. Количество фаговых частиц рассчитывают по формуле 1 TU = 20 вирионов.The first round of affinity selection of the phage library is carried out according to the following scheme [10]. 900 μl of distilled water and 100 μl of 1 M NaHCO 3 , pH 8.6 are applied to a plastic Petri dish with a diameter of 35 mm, 10 μl of aqueous streptavidin (1 mg / ml) is added. A Petri dish is incubated overnight at 4 ° C. , streptavidin is drained and 1 ml of blocking solution is poured (0.1 M NaHCO 3 , 5 mg / ml BSA, 0.1 μg / ml streptavidin, 0.02% sodium azide), the cup is incubated at 4 o C for 1 h. Wash the dish 6 times with TBS / Tween buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, Tween-20 0.5% v / v) and add 400 μl TBS / Tween containing BSA (1 mg / ml) and 0.02% sodium azide, biotinylated antibodies (final concentration in a solution of 250 nM), incubate the cup for 2 hours at 4 ° C, then add 4 μl of 10 mM biotin, incubate at 4 ° C for 1 h, wash the cup 6 times with TBS / Tween, apply 400 μl TBS / Tween, 4 μl 10 mM biotin and 5 μl of the original phage library (5x10 11 virions). The cup is incubated at 4 ° C. for 4 hours, washed 10 times with TBS / Tween, 400 μl of elution buffer is applied (0.1 N HCl, pH is adjusted with glycine to 2.2, 1 mg / ml BSA), incubated for 10 minutes, the eluate is transferred into plastic tubes containing 75 μl of 1M Tris-Hcl pH 9.1 to neutralize the acid, the final pH of the solution (7-8.5) is checked with indicator paper. Amplification of phage eluate is carried out by adding a suspension of eluted phages to an aliquot of Escherichia coli K91Kan cells grown on TV medium (1.2% bactotrypton, 2.4% yeast extract, 0.5% glycerin, 1.7 mM KH 2 PO 4 , 7, 2 mM K 2 HPO 4 ). Phages are grown in LB medium [10]. Phages are titrated using K91Kan cells grown on TV medium, followed by plating on agar plates containing kanamycin (100 μg / ml) and tetracycline (40 μg / ml) and counting the grown colonies. The phage titer is determined by the number of colonies (transducing units (TU)) by GPSmith [10]. The number of phage particles is calculated by the
Второй и третий раунд аффинной селекции проводят следующим образом. В пластиковую пробирку вносят 100 мкл фаговой суспензии (1011 TU), биотинилированные МКА (конечная концентрация антител во втором раунде составляет 100 нМ, в третьем - 0,1 нМ), инкубируют в течение ночи при 4oС, добавляют 400 мкл TBS/Tween и немедленно наносят на стрептавидинобработанную чашку (как описано выше), инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Чашку отмывают TBS/Tween, связавшиеся фаги элюируют, титруют и амплифицируют как описано выше. После третьего раунда селекции получают индивидуальные фаговые колонии, которые используют для наработки одноцепочечной ДНК и фагов для иммуноферментного анализа (ИФА). Определение последовательности ДНК проводят по модифицированному методу Сэнгера [12]. В качестве праймера используют олигонуклеотид 5'-TGAATTTTCTGTATGAGG [10].The second and third round of affinity selection is carried out as follows. 100 μl of phage suspension (10 11 TU), biotinylated MCA (final concentration of antibodies in the second round is 100 nM, in the third - 0.1 nM) are added to a plastic tube, incubated overnight at 4 ° C, 400 μl of TBS / are added Tween and immediately applied to a streptavidin-treated plate (as described above), incubated for 10 min at room temperature. The plate was washed with TBS / Tween, the bound phages were eluted, titrated and amplified as described above. After the third round of selection, individual phage colonies are obtained, which are used to generate single-stranded DNA and phages for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). DNA sequence determination is carried out according to the modified Sanger method [12]. A 5'-TGAATTTTCTGTATGAGG oligonucleotide is used as a primer [10].
Пример 2. Анализ связывания пептидов, имитирующих высококонсервативный эпитоп белка gpl20 ВИЧ-1, с моноклональными антителами 2G12 методом ИФА. Example 2. The analysis of the binding of peptides that mimic the highly conserved epitope of the gpl20 HIV-1 protein with 2G12 monoclonal antibodies by ELISA.
Подтверждение специфичности связывания выделенных фагов с МКА проводят методом непрямого иммуноферментного анализа [11]. Confirmation of the specificity of binding of the isolated phages to MAB is carried out by the method of indirect enzyme immunoassay [11].
На 96-луночный планшет для ИФА (ВНИИ Медбиополимер) наносят по 50 мкл в лунку фагового препарата (1010 вирионов) и инкубируют в течение ночи в холодильнике. После 3-кратной промывки PBS/Tween в каждую лунку добавляют по 150мкл блокирующего буфера (1% раствор казеина в PBS), блокируют неспецифические места сорбции на пластике 1 ч при 37oС, промывают 3 раза PBS/Tween и добавляют по 1 мкг биотинилированных МКА в объеме 50 мкл. После инкубации в течение суток в холодильнике промывают 3 раза PBS/Tween и добавляют по 50 мкл разбавленного в 500 раз (в блокирующем буфере) конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена. Реакцию проводят 30 мин при 37oС, промывают планшет 6 раз PBS/Tween и добавляют по 50 мкл ЦФБ с ОФД. Выдерживают планшет 20 мин в темноте при комнатной температуре и останавливают реакцию добавлением 50 мкл 2Н раствора серной кислоты. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре Multiscan (Labsystem).On a 96-well ELISA plate (VNII Medbiopolymer), 50 μl per well of phage preparation (10 10 virions) are applied and incubated overnight in the refrigerator. After washing 3 times with PBS / Tween, 150 μl of blocking buffer (1% casein solution in PBS) was added to each well, non-specific sites of sorption on plastic were blocked for 1 h at 37 ° C, washed 3 times with PBS / Tween and 1 μg of biotinylated was added MCA in a volume of 50 μl. After incubation for one day in the refrigerator, wash 3 times with PBS / Tween and add 50 μl of horseradish streptavidin-peroxidase conjugate diluted 500 times (in blocking buffer). The reaction is carried out for 30 minutes at 37 ° C. , the plate is washed 6 times with PBS / Tween, and 50 μl of CPB with RPD are added. The plate is held for 20 minutes in the dark at room temperature and the reaction is stopped by adding 50 μl of a 2N sulfuric acid solution. The optical density is measured on a Multiscan spectrophotometer (Labsystem).
Превышение значений оптической плотности над контролем в несколько раз позволяет считать, что отобранные фаговые клоны действительно эффективно взаимодействуют с МКА и имитируют узнаваемые МКА эпитопы белка gp120 ВИЧ-1. The excess of optical density over the control by several times suggests that the selected phage clones really effectively interact with MABs and mimic recognizable MAB epitopes of HIV-1 gp120 protein.
Таким образом, впервые получены пептиды-имитаторы вируснейтрализующего эпитопа белка gpl20 ВИЧ-1, узнаваемого вируснейтрализующими антителами 2G12. Thus, for the first time, peptides that mimic the virus-neutralizing epitope of the HIV-1 gpl20 protein recognized by the virus-neutralizing antibodies 2G12 were obtained.
Литература
1. Coffin J.M.// Science.-1995.-Vol.267.-P.483-489.Literature
1. Coffin JM // Science.-1995.-Vol.267.-P.483-489.
2. Atlan H., Gerstenm M. J., Salk P. L, Salk J.// Immunol. Today., 1993. , Vol. 14., p. 200-202. 2. Atlan H., Gerstenm M. J., Salk P. L, Salk J. // Immunol. Today., 1993., Vol. 14., p. 200-202.
3. Delmastro P., Meola A., Monaci P., Cortese R., Golfre G. //Vaccine., 1997., Aug;15(11), p. 1276-1285. 3. Delmastro P., Meola A., Monaci P., Cortese R., Golfre G. // Vaccine., 1997., Aug; 15 (11), p. 1276-1285.
4. Keller P.M., Arnold B.A., Show A.R., Tolman R.L., Van-Middlesworth F. , Bondy S. , Rusiecki V.K, Koening S., et al.// Virology, 1993, V. 193, p. 709-716. 4. Keller P.M., Arnold B.A., Show A.R., Tolman R.L., Van-Middlesworth F., Bondy S., Rusiecki V.K, Koening S., et al. // Virology, 1993, V. 193, p. 709-716.
5. Trcola A. , Purtscher M. , Muster Т. et al // J. Virol., 1996, P. 1100-1108. 5. Trcola A., Purtscher M., Muster T. et al // J. Virol., 1996, P. 1100-1108.
6. Moore J., Sodroski J.//J. Virology, 1996., P. 1863-1872. 6. Moore J., Sodroski J.//J. Virology, 1996., P. 1863-1872.
7. Trcola A. , Pomales A.B., Yuang H. et al. // J. Virology, 1995. P. 6609-6617. 7. Trcola A., Pomales A.B., Yuang H. et al. // J. Virology, 1995. P. 6609-6617.
8. Kunert R., Ruker F., Katinger H. // AIDS Res. Hum. Retrovir. - V. 14. , 13. - P1115-1128. 8. Kunert R., Ruker F., Katinger H. // AIDS Res. Hum. Retrovir. - V. 14., 13. - P1115-1128.
9. Scott J.K., Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library.//Science., 1990., V. 249, p. 386-390. 9. Scott J.K., Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library.//Science., 1990., V. 249, p. 386-390.
10. G.P. Smith Cloning in fuse vectors (laboratory manual)//1992. 10. G.P. Smith Cloning in fuse vectors (laboratory manual) // 1992.
11. Motti с. , Nuzzo M., Meola A., Galfre G., Felici F., Cortese R., Nicosia M. And Monaci P.//Gene, 1994, V.I 46, P. 191-198. 11. Motti p. , Nuzzo M., Meola A., Galfre G., Felici F., Cortese R., Nicosia M. And Monaci P. // Gene, 1994, V.I 46, P. 191-198.
12. Kretz К., Callen W., Hedden V, Cycle sequencing// Methods of Enzimology. V. 154. P.527-536. 12. Kretz, K., Callen W., Hedden V, Cycle sequencing // Methods of Enzimology. V. 154. P.527-536.
13. Kwong P. D., Wyatt R., Robinson J., Sweet R.W., Sodroski J., Hendrickson W.A. //Nature.,1998., V. 393., P. 648. 13. Kwong P. D., Wyatt R., Robinson J., Sweet R.W., Sodroski J., Hendrickson W.A. //Nature.,1998., V. 393., P. 648.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000121342A RU2184780C2 (en) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | Peptide-simulator of protein gp120 hiv-1 epitope |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000121342A RU2184780C2 (en) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | Peptide-simulator of protein gp120 hiv-1 epitope |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2184780C2 true RU2184780C2 (en) | 2002-07-10 |
| RU2000121342A RU2000121342A (en) | 2002-07-10 |
Family
ID=20239050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000121342A RU2184780C2 (en) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | Peptide-simulator of protein gp120 hiv-1 epitope |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2184780C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2402777C2 (en) * | 2004-10-08 | 2010-10-27 | Аффитек Ас | Method of screening phage display library |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB229407A (en) * | 1923-11-26 | 1925-02-26 | Belliss & Morcom Ltd | Improvements in reciprocating air compressors |
| RU2121502C1 (en) * | 1996-08-01 | 1998-11-10 | Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Госкомсанэпиднадзора РФ | Strain of hominis immunodeficiti virus (hiv-1) hiv-1/russia/ gm-12-95 (ru 1295) of subtype b for diagnostic and vaccine preparations |
-
2000
- 2000-08-09 RU RU2000121342A patent/RU2184780C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB229407A (en) * | 1923-11-26 | 1925-02-26 | Belliss & Morcom Ltd | Improvements in reciprocating air compressors |
| RU2121502C1 (en) * | 1996-08-01 | 1998-11-10 | Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Госкомсанэпиднадзора РФ | Strain of hominis immunodeficiti virus (hiv-1) hiv-1/russia/ gm-12-95 (ru 1295) of subtype b for diagnostic and vaccine preparations |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2402777C2 (en) * | 2004-10-08 | 2010-10-27 | Аффитек Ас | Method of screening phage display library |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Irving et al. | Random-peptide libraries and antigen-fragment libraries for epitope mapping and the development of vaccines and diagnostics | |
| Emini et al. | Priming for and induction of anti-poliovirus neutralizing antibodies by synthetic peptides | |
| Crawford-Miksza et al. | Analysis of 15 adenovirus hexon proteins reveals the location and structure of seven hypervariable regions containing serotype-specific residues | |
| Nelson et al. | An affinity-enhanced neutralizing antibody against the membrane-proximal external region of human immunodeficiency virus type 1 gp41 recognizes an epitope between those of 2F5 and 4E10 | |
| EP0570357B1 (en) | Peptides that induce antibodies which neutralize genetically divergent HIV-1 isolates | |
| Motti et al. | Recognition by human sera and immunogenicity of HBsAg mimotopes selected from an M13 phage display library | |
| Keller et al. | Identification of HIV vaccine candidate peptides by screening random phage epitope libraries | |
| Perham et al. | Engineering a peptide epitope display system on filamentous bacteriophage | |
| Kumar et al. | A novel strategy for efficient production of anti-V3 human scFvs against HIV-1 clade C | |
| Poisson et al. | Characterization of RNA-binding domains of hepatitis delta antigen | |
| Jolivet‐Reynaud et al. | Localization of hepatitis B surface antigen epitopes present on variants and specifically recognised by anti‐hepatitis B surface antigen monoclonal antibodies | |
| Pereboeva et al. | Identification of antigenic sites on three hepatitis C virus proteins using phage‐displayed peptide libraries | |
| Jolivet-Reynaud et al. | Specificities of multiple sclerosis cerebrospinal fluid and serum antibodies against mimotopes | |
| Gauntt et al. | Anti-Coxsackievirus B3 neutralizing antibodies with pathological potential | |
| Resnick et al. | Chimeras from a human rhinovirus 14-human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) V3 loop seroprevalence library induce neutralizing responses against HIV-1 | |
| RU2179980C2 (en) | Peptide-simulator of human immunodeficiency type-1 virus protein gp41 conservative epitope recognized by virus-neutralizing monoclonal antibody 2f5 (variants) | |
| RU2184780C2 (en) | Peptide-simulator of protein gp120 hiv-1 epitope | |
| JP3390002B2 (en) | Peptides and analogs and mixtures thereof for detecting antibodies to HTLV-I and HTLV-II viruses - Patents.com | |
| Levi et al. | A retro-inverso miniantibody with anti-HIV activity | |
| Hariharan et al. | Analysis of the cross-reactive anti-gp120 antibody population in human immunodeficiency virus-infected asymptomatic individuals | |
| Siman-Tov et al. | Differentiation of a passive vaccine and the humoral immune response toward infection: analysis of phage displayed peptides | |
| McLain et al. | Different effects of a single amino acid substitution on three adjacent epitopes in the gp41 C-terminal tail of a neutralizing antibody escape mutant of human immunodeficiency virus type 1 | |
| Tumanova et al. | Construction of peptides mimicking a HIV-1 gp41 epitope recognized by virus-neutralizing antibodies 2F5 | |
| Li et al. | N-terminal residues of an HIV-1 gp41 membrane-proximal external region antigen influence broadly neutralizing 2F5-like antibodies | |
| S Shcherbakova et al. | Artificial polyepitope HIV-1 immunogen containing mimotope of 2F5 epitope |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140810 |