RU2180115C2 - Способ выявления вируса болезни ауески сельскохозяйственных животных - Google Patents
Способ выявления вируса болезни ауески сельскохозяйственных животных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2180115C2 RU2180115C2 RU2000111315A RU2000111315A RU2180115C2 RU 2180115 C2 RU2180115 C2 RU 2180115C2 RU 2000111315 A RU2000111315 A RU 2000111315A RU 2000111315 A RU2000111315 A RU 2000111315A RU 2180115 C2 RU2180115 C2 RU 2180115C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- aujeszky
- probe
- virus
- disease virus
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 11
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 title abstract description 12
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 8
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims description 25
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims description 22
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 16
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 claims description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 13
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 2
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004936 Lavsan® Polymers 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000010460 detection of virus Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- JCTDJBXPFQZVAE-SGOWSBBBSA-N 2-[3-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]propyl]-8-amino-3-oxooctanoic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCC(C(=O)CCCCCN)C(O)=O)SC[C@@H]21 JCTDJBXPFQZVAE-SGOWSBBBSA-N 0.000 description 1
- ZGZLYKUHYXFIIO-UHFFFAOYSA-N 5-nitro-2h-tetrazole Chemical compound [O-][N+](=O)C=1N=NNN=1 ZGZLYKUHYXFIIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000012805 animal sample Substances 0.000 description 1
- -1 biotin ester Chemical class 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- BRMYHTNDDMKDGY-UHFFFAOYSA-N o-(4-aminobutyl)hydroxylamine Chemical compound NCCCCON BRMYHTNDDMKDGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления заболеваний сельскохозяйственных животных, а именно: болезни Ауески. Фрагмент ДНК вируса болезни Ауески клонируют в векторную плазмиду рUC18. Полученную конструкцию метят биотином путем химической модификации ДНК по цитозиновым звеньям. Изобретение позволяет повысить уровень чувствительности выявления вирусной ДНК по сравнению с известными методиками. 2 табл.
Description
Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления инфекционных заболеваний, а именно болезни Ауески (Aujezsky's disease), вызываемой вирусом (Suid herpesvirus I, SHV-1).
До настоящего времени основным методом диагностики болезни Ауески являлась длительная и достаточно трудоемкая процедура биопробы на кроликах и изоляции вируса в чувствительной культуре клеток. Более перспективным методом диагностики является метод гибридизации нуклеиновых кислот, основанный на использовании ДНК-зондов.
Известен способ выявления вируса болезни Ауески в пробах биоматериала от свиньи, основанный на использовании ДНК-зонда, при конструировании которого Hind111-фрагмент ДНК вируса клонировали в плазмиду, а мечение ДНК осуществляли ник-трансляцией радиоактивным фосфором (см. McFarlane R.G., Thawley D. G. . DNA hybridisation procedure to detect pseudorabies virns DNA in swine tissue.// Amer. J. Vet. Res.-1985.-V.46, N 5.-P.1133-1136).
Однако зонды, меченные радиоактивной меткой, нестабильны (период полураспада составляет около двух недель), и проведение анализов с их использованием небезопасно для персонала лабораторий.
Известен способ выявления вируса, основанные на использовании ДНК-зонда, при конструировании которого фрагменты ДНК вируса клонировали в плазмиду. При этом мечение полученного зонда проводили нерадиоактивным способом - путем введения биотина с последующим выявлением ДНК вируса в фиксированных формалином и залитых в парафин срезах тканей (Belak К., Funa К., Kelly R., Belak S. Rapid diagnosis of Aujezsky's disease in pigs by improved in situ hybridization using biotinilated probes on paraffin embedded tissue sections// J. Veter. Med, Reihe В.- 1989. - V. 36, 1.-P. 4793).
Однако методика постановки реакции с использованием такого зонда предусматривает трудоемкую процедуру подготовки тканей: фиксацию формалином и заливку их парафином.
Наиболее близким решением, принятым за прототип, является известный способ выявления ДНК вируса болезни Ауески сельскохозяйственных животных, наиболее близкий к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту. Способ включает клонирование Hind111 и Pstl фрагментов ДНК в плазмидный вектор pBR325. Мечение полученного зонда осуществляют ник-трансляцией с био-11-dUTP. Однако полученный таким методом нерадиоактивно меченный ДНК-зонд обладает недостаточно высокой чувствительностью выявления ДНК вируса - 10-100 пкг (Chan V. T.W., Fleming K.A., McGee J.O'D. Detection of subprogram quantities of specific DNA sequences on blot hybridization with biotinylated probes.//Nucl. Acids Res.- 1985.-V.13, N22.-P.8083-8091).
Сущность изобретения заключается в конструировании рекомбинантного зонда на основе двунитиевого вектора путем клонирования Pstl-фрагмента вирусного генома длиной 300 п.н. в плазмиду pUC18. В качестве метки используется биотин, который вводится в ДНК-зонд путем химической модификации ДНК по цитозиновым звеньям.
Технический результат изобретения заключается в проведении анализа на наличие вируса болезни Ауески в пробах от животных с высокой чувствительностью и специфичностью.
Пример 1. Выделение ДНК вируса болезни Ауески сельскохозяйственных животных из инфицированной культуры клеток RK13 и из проб от животных. Клетки осаждают центрифугированием, к супернатанту добавляют 50%-ный ПЭГ до концентрации 6% и 5М NaCl до концентрации 2,8%. Смесь оставляют на ночь при 4oС, затем центрифугируют. Осадок ресуспендируют в ТЕ-буфере, добавляют IМ трис-НСl рН 8,0 до 0,01М, 0,1М ЭДТА до 1мМ, 5М NaCI до 0,15М, SDS до 1%, протеиназу К до концентрации 0,1 мг/мл и выдерживают при 37oС в течение 3 ч. После этого к смеси добавляют равный объем 52%-ной сахарозы и ведут депротеинизацию раствора с помощью фенола и хлороформа. На конечной стадии вирусную ДНК очищают на колонке (0,9х21 см) с Sepharose CL 4В и осаждают этанолом.
При выделении вирусной ДНК из проб от животных к образцу добавляют IM трис-НСI рН 8,0 до 0,01М, 0,1М ЭДТА до 1мМ, NaCI до 0,15М, SDS до 1%, протеиназу до 0,1 мг/мл и выдерживают при 37oС в течение 3 ч. Далее вирусную ДНК выделяют, обрабатывая пробы фенолом и хлороформом и осаждая этанолом.
Пример 2. Клонирование фрагментов ДНК вируса болезни Ауески в плазмиде pUC18. ДНК, выделенную из вируса, расщепляют рестриктазой PstI. Этой же рестриктазой расщепляют ДНК плазмиды pUC18. Гидролизаты ДНК вируса и плазмиды соединяют и проводят сшивку ДНК-лигазой фага Т4. Продуктами сшивки трансформируют E. coIi JM 103. Отбор клонов проводят по фенотипу: белый фенотип имеют клоны, содержащие плазмиду pUC18 со вставками. ДНК позитивных клонов анализируют рестрикционным анализом. Клон 16РН содержит вставку фрагмента ДНК вируса длиной 300 п.н. Для проверки специфичности сконструированного зонда проводят выделение ДНК из нового "урожая" вируса, фиксируют ее на нитроцеллюлозном фильтре и проводят гибридизацию с зондом 16РН, меченным радиоактивным фосфором. В качестве контролей используют фиксированные на фильтре ДНК вируса инфекционного ринотрахеита, аденовируса крупного рогатого скота, ДНК из тимуса теленка и препарат из неинфицированной культуры клеток RK13, в которой размножали вирус болезни Ауески. Зонд 16РН активно гибридизуется только с ДНК вируса болезни Ауески.
Пример 3. Нерадиоактивное мечение ДНК-зонда pUC18-SHVl-16PH. К 30-40 мкг ДНК pUC18-SHVl-16PH в 50 мкл дистиллированной воды добавляют 50 мкл IМ аминооксибутиламина и прогревают смесь на кипящей водяной бане 7 мин с последующим охлаждением во льду. Процедуру повторяют еще раз, затем раствор наносят на колонку (1 мл) со смолой Sephadex G-50 и ведут гель-фильтрацию ДНК в дистиллированной воде. К ДНК после гель фильтрации (объем 150-170 мкл) добавляют IM NaHCO3 до концентрации 0,1М и 30 мкл 0,1М раствора N-гидроксисуксинимидного эфира аминокапроил-биотина ("активированного биотина"). Смесь выдерживают при комнатной температуре 1,5 ч, затем отделяют биотинилированную ДНК от избытка эфира биотина гель фильтрацией на Sephadex G-50. Выход меченой ДНК составляет 70-80 %, она электрофоретически однородна в 1%-ном агарозном геле.
Пример 4. Гибридизация биотинилированного ДНК-зонда с вирусной ДНК. Вирусную ДНК, выделенную из инфицированной культуры клеток, наносят точками на капроновые фильтры и ведут гибридизацию с биотин-меченным ДНК-зондом pUC18-SHVl-16PH в концентрации 200 нг/мл. Раствор для предгибридизации и гибридизации содержит 6xSSC, 5хДенхардта, 0,5% SDS, 100 мкг/мл денатурированной ДНК лосося. Гибридизацию ведут 16 ч при 60oС, фильтры отмывают 2 раза в 2xSSC, 0,1% SDS и 2 раза в 0,2xSSC, 0,1% SDS при температуре гибридизации.
Пример 5. Выявление биотинилированного ДНК-зонда на фильтрах после гибридизации. После гибридизации с биотинилированным ДНК-зондом и отмывки от зонда фильтры обрабатывают блокирующим буфером в течение 30 мин при комнатной температуре (блокирующий буфер: 0,1 М трис-НСl рН 7,5; 0,1 М NaCl; 3mM MgCl2; 0,5% твин-20). После стадии блокирования фильтр помещают на 5 мин в реакционный буфер, затем переносят его на чистый лист лавсана и смачивают разбавленным в 1000 раз конъюгатом стрептавидина со щелочной фосфатазой. На фильтр размером 10х10 см необходимо 2 мл разбавленного в 1000 раз реакционным буфером конъюгата (реакционный буфер: 0,1 М трис-НСl рН 7,5; 0,1 М NaCI, 3mM MgCl2, 0,05% твин-20). Фильтр накрывают вторым листом лавсана, убирают пузырьки воздуха между листами и оставляют на 30 мин, затем отмывают от избытка конъюгата 3 раза по 5 мин блокирующим буфером и 1 раз 5 мин АР-буфером (АР-буфер: 0,1М трис-НСl рН 9,5, 0,1 М NaCl, 5 mM MgCl2). После этого фильтр помещают в раствор красителей для фосфатазы, который готовят непосредственно перед использованием следующим образом: навески 2,5 мг 5-бром-3-индолилфосфата и 4 мг нитротетразолевого синего растворяют каждую отдельно в 50 мкл диметилформамида, растворы переносят в пробирку с 15 мл АР-буфера и перемешивают. Окраска пятен или полос, содержащих биотиновые производные ДНК, развивается в течение нескольких часов в темноте.
Таким образом, сконструирован ДНК-зонд pUC18-SHVl-16PH на основе плазмидной ДНК pUC18 путем клонирования Pstl- фрагмента вирусного генома длиной 300 п. н. Нерадиоактивно меченный двунитевой ДНК-зонд содержит биотиновые звенья, ковалентно связанные с цитозиновыми основаниями.
Проведены исследования по определению чувствительности и специфичности биотинилированного ДНК-зонда pUC18-SHVl-16PH, полученного на основе двунитиевой плазмидной ДНК в сравнении с ДНК-зондом, меченным радиоактивным фосфором. Оба зонда содержали один и тот же фрагмент вирусного генома. Гибридизацию с зондами вели на ДНК вируса болезни Ауески, выделенной из инфицированной культуры клеток. В качестве контроля аналогичные опыты проводили с ДНК вируса инфекционного ринотрахеита и аденовируса крупного рогатого скота 1-го типа. Результаты опытов представлены в таблице 1.
Приведенные в таблице данные показывают, что чувствительность выявления вирусной ДНК с помощью биотинилированного плазмидного ДНК-зонда pUC18-SHVl-16PH составляет 1-10 пкг, что в 10 раз превышает чувствительность аналогичного ДНК-зонда, меченного радиоактивным фосфором. Полученный ДНК-зонд специфичен к ДНК вируса болезни Ауески сельскохозяйственных животных и не гибридизуется с другими вирусными ДНК.
Заявленный способ выявления вируса болезни Ауески был испытан на пробах биоматериала от больных животных (см. таблицу 2).
В работе использовали (с учетом положительных или отрицательных результатов биопробы и вирусологических исследований): суспензии внутренних органов кролика, двух павших поросят с признаками болезни Ауески, проб внутренних органов павшей свиньи, мозг и легкие норок с признаками поражения центральной нервной системы при жизни, а также лисы после положительных или отрицательных результатов анализа. Всего тремя методами исследовали 15 проб.
Результаты экспериментов показали, что созданный ДНК-зонд позволяет выявлять ДНК вируса у инфицированных животных и может использоваться для диагностики заболевания. Так, результаты гибридизации полностью совпали с результатами выделения вируса в культуре клеток и биопробы при исследовании 5 проб, полученных от павших поросят, лисы, а также внутренних органов кроликов, зараженных биоматериалом от них. При этом были получены наиболее сильные сигналы гибридизации.
Результаты исследования проб биоматериала от норки (мозг, легкие) были отрицательными по всем методам. В дальнейшем у этих животных в зверосовхозе установили другой диагноз - фузариотоксикоз.
При исследовании 6 проб внутренних органов свиньи, павшей с признаками поражения центральной нервной системы, результаты биопробы были отрицательными по всем пробам, вирус удалось изолировать только из легких, но все исследуемые пробы дали положительный сигнал в гибридизации. По всей вероятности, это связано со способностью метода молекулярной гибридизации - выявлять не только инфекционные (способные реплицироваться в чувствительной системе), но и неинфекционные частицы вируса.
Таким образом, сконструирован плазмидный (биотинилированный) ДНК- зонд, специфичный к ДНК вируса болезни Ауески.
Проведены испытания данного способа выявления вируса болезни Ауески на пробах от животных. Они показали достаточно высокую чувствительность и специфичность метода при выявлении ДНК вируса. Этот способ может применяться для диагностики вируса болезни Ауески в животноводческих хозяйствах, при этом время анализа составляет 30 часов, что по срокам постановки диагноза превосходит метод выделения вируса в культуре клеток в 36 раз, а метод биопробы на кроликах - в 18 раз.
Данный способ может быть использован в ветеринарной практике для экспресс-диагностики различных форм проявления болезни Ауески во время эпизоотии как в хозяйствах промышленного типа, так и в частных. Использование ДНК-зонда, полученного таким способом, более чем на 1 порядок повышает чувствительность выявления вирусной ДНК по сравнению с двунитиевым ДНК-зондом, полученным на основе клонирования Hind111-фрагмента в плазмиду pBR325, и является более перспективным для проведения гибридизационного анализа.
Claims (1)
- Способ выявления вируса болезни Ауески сельскохозяйственных животных, предусматривающий выделение вирусной ДНК, конструирование ДНК-зонда, мечение ДНК-зонда биотином, гибридизацию на фильтре ДНК-зонда с вирусной ДНК с последующим выявлением вирусной ДНК по появлению окрашенных пятен, отличающийся тем, что ДНК-зонд конструируют путем клонирования Pstl-фрагмента вирусного генома длиной 300 п. н. в плазмидный вектор рUC18, а мечение зонда биотином осуществляют путем модификации цитозиновых звеньев.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000111315A RU2180115C2 (ru) | 2000-05-06 | 2000-05-06 | Способ выявления вируса болезни ауески сельскохозяйственных животных |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000111315A RU2180115C2 (ru) | 2000-05-06 | 2000-05-06 | Способ выявления вируса болезни ауески сельскохозяйственных животных |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2180115C2 true RU2180115C2 (ru) | 2002-02-27 |
| RU2000111315A RU2000111315A (ru) | 2002-07-10 |
Family
ID=20234302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000111315A RU2180115C2 (ru) | 2000-05-06 | 2000-05-06 | Способ выявления вируса болезни ауески сельскохозяйственных животных |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2180115C2 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2116364C1 (ru) * | 1993-07-30 | 1998-07-27 | Завод "Эластик" | Способ извлечения ртути и других цветных металлов из отработанных гальванических элементов и/или отходов их производства |
-
2000
- 2000-05-06 RU RU2000111315A patent/RU2180115C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2116364C1 (ru) * | 1993-07-30 | 1998-07-27 | Завод "Эластик" | Способ извлечения ртути и других цветных металлов из отработанных гальванических элементов и/или отходов их производства |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Burr et al. | Detection of canine herpesvirus 1 in a wide range of tissues using the polymerase chain reaction | |
| Molitor et al. | Polymerase chain reaction (PCR) amplification for the detection of porcine parvovirus | |
| Rishi et al. | Genomic cloning of human Echinococcus granulosus DNA: isolation of recombinant plasmids and their use as genetic markers in strain characterization | |
| Gow et al. | Studies on enterovirus in patients with chronic fatigue syndrome | |
| Clewley et al. | Detection of parvovirus B19 DNA, antigen, and particles in the human fetus | |
| CN110499393A (zh) | 犬腺病毒、犬腺病毒i型和犬腺病毒ii型的实时荧光定量pcr检测及鉴别引物和探针 | |
| Pritchard et al. | Development of a polymerase chain reaction to detect Vietnamese isolates of duck virus enteritis | |
| Todd et al. | Dot blot hybridization assay for chicken anemia agent using a cloned DNA probe | |
| Tham et al. | Detection of chicken anaemia agent DNA sequences by the polymerase chain reaction | |
| Limn et al. | Detection of goose parvovirus genome by polymerase chain reaction: distribution of goose parvovirus in Muscovy ducklings | |
| CN106566895B (zh) | 一种同时检测鲤科疱疹病毒ι型、ⅱ型和ⅲ型的pcr引物、试剂盒及用途 | |
| CN118147369A (zh) | 牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合、crRNA分子、反应体系及应用 | |
| CN101418351B (zh) | 虾白斑综合症病毒病检测试剂盒及检测方法 | |
| CN111154915A (zh) | 一种猪圆环病毒4型与3型pcr鉴别诊断试剂盒及其检测方法 | |
| Jarrett et al. | Alimentary fibropapilloma in cattle: a spontaneous tumor, nonpermissive for papillomavirus replication | |
| RU2180115C2 (ru) | Способ выявления вируса болезни ауески сельскохозяйственных животных | |
| CN101418352B (zh) | 一种虾白斑综合症病毒病检测试剂盒 | |
| RU2054487C1 (ru) | Способ выявления вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота | |
| Belák et al. | Rapid detection of Aujeszky's disease (pseudorabies) virus infection of pigs by direct filter hybridisation of nasal and tonsillar specimens | |
| Nel et al. | A comparison of different cloned genome segments of epizootic haemorrhagic disease virus as serogroup-specific probes | |
| Wójcik et al. | Sister chromatid exchange in selected horse breeds (Equus caballus) | |
| Arnauld et al. | Development of a PCR-based method coupled with a microplate colorimetric assay for the detection of porcine parvovirus and application to diagnosis in piglet tissues and human plasma | |
| RU2728342C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов и способ выявления пестивируса Н крупного рогатого скота | |
| CN110184385B (zh) | 淡水小龙虾线头病毒pcv-87r特异性序列及应用 | |
| Jacobs et al. | Detection of wild-type Aujeszky's disease virus by polymerase chain reaction in sheep vaccinated with a modified live vaccine strain |