RU2177998C2 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ УРИДИН-ФОСФОРИЛАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pERURPHO1 И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL 21(ДЕ3)/pERURPHO1 ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ УРИДИН-ФОСФОРИЛАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pERURPHO1 И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL 21(ДЕ3)/pERURPHO1 ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2177998C2 RU2177998C2 RU2000105215A RU2000105215A RU2177998C2 RU 2177998 C2 RU2177998 C2 RU 2177998C2 RU 2000105215 A RU2000105215 A RU 2000105215A RU 2000105215 A RU2000105215 A RU 2000105215A RU 2177998 C2 RU2177998 C2 RU 2177998C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- coli
- uridine phosphorylase
- perurph01
- strain
- plasmid dna
- Prior art date
Links
- 108010019092 Uridine phosphorylase Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 102000006405 Uridine phosphorylase Human genes 0.000 title claims abstract 8
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 title abstract 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 4
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 8
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 101000714491 Escherichia phage T7 Major capsid protein Proteins 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 abstract description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 abstract 1
- 102100020892 Uridine phosphorylase 1 Human genes 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000005918 transglycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010007733 Catabolic state Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010036162 GATC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010026624 GTCGAC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102100036286 Purine nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 108010009099 nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- -1 β-cyanoethyl diisopropylamino Chemical group 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии, и позволяет получать уридин-фосфорилазу Е. coli с высоким выходом (80% суммарного содержания белка) и по упрощенным технологиям. Рекомбинантная плазмидная ДНК рЕRURPHО1, кодирующая аминокислотную последовательность уридин-фосфорилазы Е. coli, состоит из NdeI/SalI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фаза Т7, ген β-лактамазы, и NdeI/SalI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена уридин-фосфорилазы Escherichia coli. Штамм - продуцент Е. coli BL 21(ДЕЗ)/рЕRURPHО1, полученный трансформацией клеток Е. coli плазмидной ДНК рЕRURPHО1, культивируют до накопления рекомбинантной уридин-фосфорилазы в количестве 60-70% от суммарного белка. Клетки разрушают ультразвуком в буферном растворе и отделяют растворимую фракцию. Штамм-продуцент Е. coli BL 21(ДЕЗ)/рЕRURPHО1 выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др. ) (или индуцируют изопропилтио-β-D-галактозидом и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры. 3 с. п. ф-лы, 1 ил.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно включает сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК pERURPHO1, обусловливающую биосинтез уридин-фосфорилазы Е. соli, штамм Е. соli BL21(DE3)/pERURPHO1 - суперпродуцент уридин-фосфорилазы и способ получения уридин-фосфорилазы на основе вышеуказанной рекомбинантной ДНК и штамма-продуцента для реакции трансгликозилирования при синтезе нуклеозидов.
Уридин-фосфорилаза Escherichia соli (КФ 2.4.2.3) представляет собой белок с мол. массой 27 Кда, функционирующий в виде гексамера с мол. массой 162 Кда [3] , и катализирует катаболическую реакцию фосфоролиза уридина в клетках Е. соli [1,2] , что позволяет использовать ее в реакции трансгликозилирования при синтезе модифицированных нуклеозидов, которые находят применение в медицине в качестве терапевтических препаратов [4] .
Для практических целей до последнего времени использовали не только изолированную из Е. соli уридин-фосфорилазу, но главным образом ферментативную активность целых бактериальных клеток Е. соli, либо смесь нуклеозид-фосфорилаз из этих клеток без обогащения или разделения [5-8] .
Наиболее близким к заявке является способ получения уридин-фосфорилазы из штамма-продуцента Е. соli, полученного при помощи методов микробиологической селекции [11] . Описано также клонирование гена уридин-фосфорилазы Е. соli в плазмиде pVMK27 [3] и плазмиде pUUDP [10] , однако не приведены данные о продуктивности штамма-продуцента рекомбинантного фермента.
Настоящее изобретение решает задачу получения высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента фермента, рекомбинантной уридин-фосфорилазы с высоким выходом и по упрощенной технологии.
Поставленная задача решается за счет того, что штамм-продуцент, полученный трансформацией клеток Escherichia соli плазмидной ДНК, культивируют до накопления рекомбинантной уридин-фосфорилазы в количестве 60-70% от суммарного белка клеток, разрушают клетки в буферном растворе и отделяют растворимую фракцию. Содержание в этой фракции уридин-фосфорилазы составляет до 80% суммарного содержания белка, и фермент может быть использован без дополнительной очистки или очищен до гомогенного состояния стандартными методами.
Используют штамм-продуцент Escherichia соli BL21(DE3), содержащий плазмидную ДНК pERURPHO1 - суперпродуцент уридин-фосфорилазы.
Используют рекомбинантную плазмидную ДНК pERURPHO1:
- кодирующую аминокислотную последовательность уридин-фосфорилазы Е. соli;
- имеющую молекулярную массу 2,94 МДа;
- состоящую из:
NdeI/SalI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+) [12] , содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, и NdeI/SalI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена уридин-фосфорилазы Escherichia coli;
- содержащую:
в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой pERURPHOl клеток Е. соli к пенициллиновым антибиотикам;
уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: XbaI - 38 п. о. , ВglII - 96 п. о. , РvuII - 741 п. о. , РstI - 2288 п. о. , РvuI - 2413 п. о. , SalI - 4389 п. о.
- кодирующую аминокислотную последовательность уридин-фосфорилазы Е. соli;
- имеющую молекулярную массу 2,94 МДа;
- состоящую из:
NdeI/SalI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+) [12] , содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, и NdeI/SalI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена уридин-фосфорилазы Escherichia coli;
- содержащую:
в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой pERURPHOl клеток Е. соli к пенициллиновым антибиотикам;
уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: XbaI - 38 п. о. , ВglII - 96 п. о. , РvuII - 741 п. о. , РstI - 2288 п. о. , РvuI - 2413 п. о. , SalI - 4389 п. о.
Изобретение позволяет получать рекомбинантную уридин-фосфорилазу с высоким выходом по простой технологии и с высоким выходом.
Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pERURPHOl обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена уридин-фосфорилазы.
Для конструирования плазмиды использован химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.
Источником структурного гена уридин-фосфорилазы служит хромосомная ДНК Е. соli. Рекомбинантный ген выделяют с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами и затем клонируют в векторную плазмиду рЕТ-20b(+).
Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia сoli BL21(DE3)/pERURPHО1 характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или YТ-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.
Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40oС при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т. д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).
Штамм-продуцент Е. соli BL21(DE3)/pERURPHO1 отличается от штамма-реципиента Е. соli BL21(DE3) только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pERUPHO1, которая и придает ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам. Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток Е. соli BL21(DE3) соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.
Клетки Е. соli BL21(DE3)/pERURPHO1 являются суперпродуцентом уридин-фосфорилазы. При индукции изопропилтио-β-D-галактозидом, а также и без индукции происходит эффективный биосинтез уридин-фосфорилазы, которая накапливается в клетках в количестве более 60% суммарного белка бактерий.
Штамм-продуцент депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, ВКПМ В-7889 от 11.01.2000 г.
Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pERURPHO1, для чего ген уридин-фосфорилазы выделяют из хромосомной ДНК Е. соli с помощью ПЦР с синтетическими олитонуклеотидными праймерами (см. чертеж), содержащими сайты рестриктаз NdeI (N-конец гена, праймер А2) и SalI (С-конец гена, праймер В2), полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с расщепленной по тем же сайтам векторной плазмидой рЕТ-20b(+) [12] .
Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки Е. соli BL21(DE3) и высевают на YТ-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют гибридизацией 32Р-мечеными олигонуклеотидами А2 и В2 (см. чертеж), и из гибридизующихся клонов выделяют плазмидную ДНК, которую подвергают рестриктному анализу с помощью рестриктаз и BglII. Штамм-продуцент Е. соli BL21(DE3)/pERURPHOl выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др. ) (или индуцируют изопропилтио-β-D-галактозидом, и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры.
Выделение уридин-фосфорилазы из клеток продуцента включает следующие стадии:
- разрушение выращенных клеток при помощи ультразвука;
- отделение растворимой фракции центрифугированием; содержание в этой фракции уридин-фосфорилазы составляет до 80% суммарного содержания белка, и фермент может быть использован без дополнительной очистки,
- из растворимой фракции целевой белок может быть очищен до гомогенного состояния стандартными методами.
- разрушение выращенных клеток при помощи ультразвука;
- отделение растворимой фракции центрифугированием; содержание в этой фракции уридин-фосфорилазы составляет до 80% суммарного содержания белка, и фермент может быть использован без дополнительной очистки,
- из растворимой фракции целевой белок может быть очищен до гомогенного состояния стандартными методами.
На чертеже изображена структура гена уридин-фосфорилазы и синтетических праймеров, использованных для выделения гена с помощью ПЦР и отбора клонов путем гибридизации.
Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pERURPHО1.
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил- N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-О- (β-цианэтилдиизопропиламино)- фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл, описанный в работе [9] .
Для приготовления вектора ДНК плазмиды рЕТ-20b(+) [12] (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера R (10 мМ трис-НСl, рН 8,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ КСl, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой NdeI, а затем - в 40 мкл буфура О (50 мМ трис-НСl, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой SalI (10 ед. акт. ) в течение 1 ч при 37oС. Векторный фрагмент величиной 3,7 т. п. о. после электрофореза в 1% агарозном геле электрофоретически перемещают в слой DEAE-бумаги, затем элюируют 1М NaCl и осаждают ДНК из раствора этанолом.
Для приготовления фрагмента гена уридин-фосфорилазы проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК Е. соli (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А2 и В2 (по 60 пмоль каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, содержащем каждый из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94oС, отжиг - 30 с при 60oС, элонгация - 40 с при 72oС, 30 циклов ПЦР. После этого реакционную смесь депротеинизируют хлороформом, упаривают досуха, остаток растворяют в 20 мкл воды, затем расщепляют теми же рестриктазами, которые использовались при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля.
Полученный синтетический фрагмент с геном уридин-фосфорилазы в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-НСl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rАТР, 10 мМ дитиотреит) и лигируют с помощью 10 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10oС.
Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. соli BL21(DE3). Трансформанты высевают на чашки с YT-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью гибридизации колоний in situ с 32Р-меченым олигонуклеотидом А2 (см. чертеж). Из гибридизующихся клонов выделяют ДНК плазмиды pERURPHOl и анализируют с помощью эндонуклеаз NdeI и SalI.
Пример 2. Получение штамма Е. соli BL21(DE3)/pERURPHO1 ( ВКПМ В-7889) - продуцента уридин-фосфорилазы и определение его продуктивности.
Клетки Е. соli BL21(DE3), несущие плазмиду pERURPHOl, структура которой подтверждена данными анализа (см. пример 1), являются суперпродуцентом уридин-фосфорилазы.
Штамм продуцента Е. соli BL21(DE3)/ pERURPHOl выращивают при 37oС в 100 мл YT-бульона (рН 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А550 0,7-0,8, прибавляют изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают процесс еще 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А550 и количество культуры, соответствующее 1 мл с А550 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим обрабатывают 20 с ультразвуком, нагревают 3 мин при 100oС и пробы по 1 мкл используют для электрофореза в 15% SPS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют для определения относительного количества белка в полосе целевого белка.
Пример 3. Получение уридин-фосфорилазы.
Влажные клетки (10 г) суспендируют в 20 мл буфера (30 мМ Na-фосфат, рН 7,0, 5% глицерин) и разрушают ультразвуком с помощью ультразвукового дезинтегратора Sonifier 240 (Branson) (3 импульса по 20 с при А 2,0 и 0oС ). Гомогенат центрифугируют 10 мин при 10000 g и полученный супернатант с содержанием фермента до 80% от суммарного белка используют для реакции трансгликозилирования.
Источники информации
1. O'Donovan G. A. , Neuhard Y. //Bacteriol. Revs. , 1970, v. 34, p. 278.
1. O'Donovan G. A. , Neuhard Y. //Bacteriol. Revs. , 1970, v. 34, p. 278.
2. Kremlitsky T. A. , Koszatska G. W. , Tuttle J. V. , Rideout J. L. , Eliot G. B. //Carbohydrate Res. , 1981, v. 97, p. 139-146.
3. Walton L. , Richards C. A. , Elwell L. P. //Nucl. Acids. Res. , 1989, v. l7, p. 6741.
4. Hutchinson D. W. //Trends Biotechnol. , 1990, v. 8, p. 348-353.
5. Mikhailopulo I. A. , Zinchenko A. I. , Kozimierszuk Z. , Barai V. N. , Bokut S. B. , Kalinichenko E. N. //Nucleosides a. Nucleotides, 1993, v. 12, p. 417-422.
6. Jap. Pat. 5170767, 09.07.93.
7. Jap. Pat. 06217784, 09.08.94.
8. US Pat. 4374315, 31.08.82.
9. Atkinson Т. , Smith M. //in: Oligonucleotide synthesis; apractical approach. 1984. Ed Gait M. J. p. 35-81. IRL Press, Oxford.
10. Вейко В. П. , Чеботаев Д. В. , Овчарова Н. В. , Гулько Л. Б. //Биоорган. химия, 1998, т. 24, с. 381-387.
11. Vita A. , Amici A. , Cacciammani Т. , Lanciomtti M. , Magni G. // Int J. Biochem. 1986, v. 18, p. 431-435.
12. Novagen Catalog 1996-1997.
Claims (3)
1. Способ получения уридин-фосфорилазы Е. coli, включающий культивирование в богатой среде штамма-продуцента, полученного трансформацией клеток Escherichia coli плазмидной ДНК с последующим разрушением клеток в буферном растворе с помощью ультразвука, отличающийся тем, что в качестве плазмидной ДНК используют специально сконструированную ДНК рЕRURPHО1, в качестве штамма-продуцента используют штамм Escherichia coli BL 21(DЕ3), а растворимую фракцию отделяют.
2. Рекомбинантная плазмидная ДНК рЕRURPHО1, кодирующая аминокислотную последовательность уридин-фосфорилазы Е. coli, имеющая молекулярную массу 2,94 МДа, состоящая из NdeI/SalI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, и NdeI/SalI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена уридин-фосфорилазы Escherichia coli; в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой рЕRURPHО1 клеток Е. coli к пенициллиновым антибиотикам; уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: Xbal - 38 п. о. , BglII - 96 п. о. , PνuII - 741 п. о. , PstI - 2288 п. о. . , PνuI - 2413 п. о. , SalI - 4389 п. о.
3. Штамм Escherichia coli BL21(DE3), содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК рЕRURPHО1, суперпродуцент уридин-фосфорилазы (ВКПМ В-7889).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000105215A RU2177998C2 (ru) | 2000-03-03 | 2000-03-03 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ УРИДИН-ФОСФОРИЛАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pERURPHO1 И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL 21(ДЕ3)/pERURPHO1 ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000105215A RU2177998C2 (ru) | 2000-03-03 | 2000-03-03 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ УРИДИН-ФОСФОРИЛАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pERURPHO1 И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL 21(ДЕ3)/pERURPHO1 ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2177998C2 true RU2177998C2 (ru) | 2002-01-10 |
| RU2000105215A RU2000105215A (ru) | 2002-01-27 |
Family
ID=20231351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000105215A RU2177998C2 (ru) | 2000-03-03 | 2000-03-03 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ УРИДИН-ФОСФОРИЛАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pERURPHO1 И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL 21(ДЕ3)/pERURPHO1 ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2177998C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2569110C2 (ru) * | 2009-12-22 | 2015-11-20 | Пласмия Биотек, С.Л | Комбинация термостабильных биокатализаторов для синтеза нуклеозидов |
-
2000
- 2000-03-03 RU RU2000105215A patent/RU2177998C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| БРЫКУН и др. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. - МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ, 1990, т.6, с.7-11. ВЕЙКО В.П. и др. МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 1996, т.30, № 1, с.170-176. ВЕЙКО В.П. и др. ОРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, т.21, № 11, с.834-837. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2569110C2 (ru) * | 2009-12-22 | 2015-11-20 | Пласмия Биотек, С.Л | Комбинация термостабильных биокатализаторов для синтеза нуклеозидов |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101265508B1 (ko) | 개량형 니트릴 하이드라타제 | |
| KR100882418B1 (ko) | 이노신을 생산하는 미생물 및 그를 이용한 이노신 제조방법 | |
| CN109097315B (zh) | 一种高产脂肽的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN117511889A (zh) | 酶及其在非天然氨基酸二肽制备中的应用 | |
| KR100244066B1 (ko) | D-N-카르바모일-α-아미노산의 제조법 | |
| HU216653B (hu) | Eljárás kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő polipeptidek rekombináns úton történő előállítására | |
| KR20200134333A (ko) | 발효에 의한 히스타민 생산을 위해 조작된 생합성 경로 | |
| CN119932000A (zh) | 一种青霉素G酰化酶AxPGA突变体及表达质粒、基因工程菌和应用 | |
| RU2177998C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ УРИДИН-ФОСФОРИЛАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pERURPHO1 И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL 21(ДЕ3)/pERURPHO1 ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | |
| US7709240B2 (en) | AMP deaminase originating streptomyces and utilization thereof | |
| RU2179188C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПУРИННУКЛЕОЗИД-ФОСФОРИЛАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pERPUPHO1 И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/pERPUPHO1 ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | |
| JP4437170B2 (ja) | 微生物、該微生物より得られるラクタマーゼ酵素、およびその使用 | |
| RU2188234C2 (ru) | Способ получения рекомбинантной тимидин-фосфорилазы, рекомбинантная плазмидная днк pertpho1 и штамм escherichia coli bl21(de3)/pertpho1-продуцент тимидин-форфорилазы | |
| RU2405833C2 (ru) | Способ микробиологического синтеза пуринового нуклеозида 5'-аминоимидазол-4-карбоксамидрибозида (аикар) и штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент аикар | |
| US6890739B1 (en) | Use of uridine diphosphate glucose 4-epimerase | |
| RU2619170C2 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APCH3 | |
| CN117210429A (zh) | 一种组氨酸三甲基化酶EgtD突变体及其应用 | |
| CN113462704B (zh) | 一种植物细胞分裂素狭霉素的生物合成基因簇及其生物材料以及在合成狭霉素中的应用 | |
| KR0184755B1 (ko) | 재조합 내열성 티로신 페놀리아제 및 이를 이용한 엘-도파의 제조방법 | |
| CN110551739A (zh) | 吡唑霉素生物合成基因簇、重组菌及其应用 | |
| RU2593172C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-TA1 GyrA-AcSer, КОДИРУЮЩАЯ СЕРИНОВУЮ АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ, СПОСОБНУЮ in vivo АЦЕТИЛИРОВАТЬ N-КОНЦЕВОЙ СЕРИН ДЕЗАЦЕТИЛТИМОЗИНА α1 И ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ Eschrichia coli C3030/pER-TA1GyrA-AcSer - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННЫХ БЕЛКОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА | |
| RU2302465C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ГЛЮКАГОНА ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-Gl, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ГЛЮКАГОНА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ Escherichia coli ER-2566/pER-Gl - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА | |
| KR100270508B1 (ko) | 신규세파로스포린디아세틸라아제유전자및이를이용한단백질제조방법 | |
| JP3557271B2 (ja) | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 | |
| RU2181771C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк perpins1, кодирующая аминокислотную последовательность рекомбинантного проинсулина человека, и штамм escherichia coli bl21(de3)/perpins1-продуцент рекомбинантного человеческого проинсулина |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20131024 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170304 |