[go: up one dir, main page]

RU2175261C2 - Новые аффинные лиганды и их применение - Google Patents

Новые аффинные лиганды и их применение Download PDF

Info

Publication number
RU2175261C2
RU2175261C2 RU98107896/12A RU98107896A RU2175261C2 RU 2175261 C2 RU2175261 C2 RU 2175261C2 RU 98107896/12 A RU98107896/12 A RU 98107896/12A RU 98107896 A RU98107896 A RU 98107896A RU 2175261 C2 RU2175261 C2 RU 2175261C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
group
matrix
general formula
affinity
conjugates
Prior art date
Application number
RU98107896/12A
Other languages
English (en)
Other versions
RU98107896A (ru
Inventor
Кристофер Р. ЛОУ
Кеннет СПРАУЛ
Ронгксиу ЛИ
Дейвид Дж. СТЮАРТ
Джеймс К. ПИРСОН
Стивен Дж. Бертон
Original Assignee
Ново Нордиск А/С
Прометик Биосайенсис Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ново Нордиск А/С, Прометик Биосайенсис Лтд. filed Critical Ново Нордиск А/С
Publication of RU98107896A publication Critical patent/RU98107896A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2175261C2 publication Critical patent/RU2175261C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D251/00—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings
    • C07D251/02—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings
    • C07D251/12—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D251/26—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hetero atoms directly attached to ring carbon atoms
    • C07D251/40—Nitrogen atoms
    • C07D251/54—Three nitrogen atoms
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B01J20/289—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers bonded via a spacer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/321—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3251—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising at least two different types of heteroatoms selected from nitrogen, oxygen or sulphur
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3253—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising a cyclic structure not containing any of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur, e.g. aromatic structures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3255—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising a cyclic structure containing at least one of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur, e.g. heterocyclic or heteroaromatic structures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3289—Coatings involving more than one layer of same or different nature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D251/00—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings
    • C07D251/02—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings
    • C07D251/12—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D251/26—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hetero atoms directly attached to ring carbon atoms
    • C07D251/40—Nitrogen atoms
    • C07D251/48—Two nitrogen atoms
    • C07D251/50—Two nitrogen atoms with a halogen atom attached to the third ring carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D251/00—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings
    • C07D251/02—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings
    • C07D251/12—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D251/26—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hetero atoms directly attached to ring carbon atoms
    • C07D251/40—Nitrogen atoms
    • C07D251/54—Three nitrogen atoms
    • C07D251/70—Other substituted melamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/58—Use in a single column

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к новым конъюгатам аффинный лиганд - матрица, содержащим лиганд, связанный с матрицей-носителем, необязательно посредством спейсерной группы, расположенной между матрицей и лигандом, и к новым конъюгатам аффинный лиганд - матрица, к их получению и использованию для очистки белковых материалов, таких как, например, иммуноглобулины, инсулины, фактор VII, или человеческий фактор роста, или его аналоги, производные и фрагменты, и их предшественники. Изобретение позволяет обеспечить получение недорогих и стабильных аффинных колонок. 26 с. и 57 з.п.ф-лы, 12 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к новым аффиным лигандам, к их получению и к связыванию этих лигандов с матрицами, которые могут состоять из твердых, полутвердых, крупнозернистых или коллоидальных материалов, либо из растворимых полимеров. Кроме того, настоящее изобретение относится к новым конъюгатам аффинный лиганд-матрица, к их получению и к использованию для очистки белковых материалов, таких как, например, иммуноглобулины, инсулины, фактор VII, или человеческий гормон роста или их аналоги, производные, фрагменты и предшественники.
Современные методы очистки белков, в большинстве своем, основаны на хроматографической технике разделения, такой как, гельпроникающая хроматография (ГПХ), ионообменная хроматография (ИОХ), гидрофобная хроматография (ГХ), обращенно-фазовая хроматография высокого давления (ОФ-ЖХВД) и аффинная хроматография (АХ). Эти методы могут быть легко адаптированы для лабораторной очистки пептидов и белков, предназначенных для научно-исследовательских экспериментов, с получением чистых и биологически активных веществ. В большинстве случаев, в таких экспериментах, мало или вовсе не уделялось внимания экономичности процесса, подтверждению его целесообразности, или осуществлению тонкой очистки на месте, поскольку эти материалы крайне редко используются для клинических экспериментов, а поэтому трудовые затраты значительно превышают стоимость оборудования и матриц.
Однако, крупномасштабная промышленная обработка должна учитывать такие факторы, как экономичность, надежность матриц и их очистка на месте с использованием, например, NaOH, мочевины или этанола. В настоящее время, спрос на недорогостоящие и прочные матрицы, являющиеся стабильными в 1 М NaOH, 7 М мочевине, или 80% (об./об.) этаноле, удовлетворяется рядом поставщиков, специализирующихся на поставке продуктов для ГПХ, ИОХ, ГХ и ОФ-ЖХВД. Комбинация этих способов в течение многих лет позволяла получать почти чистые в своей основной массе белковые продукты, хотя использование конечных буферов и множества стадий очистки приводит к небольшому выходу продукта, к увеличению стоимости процедуры и к низкой стабильности основной массы препарата.
Уже давно стало понятно, что методы аффинной хроматографии должны быть также применимы для крупномасштабных операций. К сожалению, использование адсорбентов, образуемых природными биологическими лигандами, такими как, моноклональные или поликлональные антитела, приводит к удорожанию производства, поскольку эти лиганды часто сами требуют экстенсивной очистки и являются биологически и химически лабильными, что затрудняет иммобилизацию этих молекул с сохранением их биологической активности. Поэтому, уже давно назрела необходимость заменить дорогостоящие, химически и биологически лабильные моноклональные или поликлональные антитела менее дорогостоящими и более надежными лигандами, имитирующими специфичность антител.
Аффинная хроматография занимает уникальное место в технологии разделения, поскольку очищаемый белок избирательно и обратимо адсорбируется на комплементарном связывающем веществе, таком как, молекула антитела. При этом, коэффициенты очистки, при высоких выходах, часто составляют несколько тысяч раз, в отличие от стандартных методов очистки, где коэффициенты очистки составляют от 5 до 50 раз. Высокие коэффициенты очистки, получаемые при аффинной хроматографии, позволяют резко снизить число стадий очистки в последующем процессе. Кроме того, очень незначительный уровень специфического связывания, наблюдаемого при аффинной хроматографии, позволяет выделять данный белок из сложных биологических смесей; отделять формы белка с неправильной укладкой от нативных молекул и осуществлять специфическое выделение белка даже из больших объемов тканевых экстрактов или культур для ферментации.
Аффинный сорбент представляет собой твердую, обычно, проницаемую матрицу-носитель, с которой ковалентно связывается соответствующий лиганд и которая содержится в стандартной хроматографической колонке. Неочищенный образец, содержащий комплементарный биополимер, пропускают через матрицу-носитель в условиях, стимулирующих специфическое связывание с иммобилизованным лигандом. Колонку промывают буфером для удаления незадержанных молекул, а затем проводят стадию элюирования, в которой белок элюируют в его чистой форме. Типичный аффинный адсорбент состоит из твердого носителя, спейсерной "ножки" (спейсерная группа) и лиганда. Твердый носитель может быть изготовлен из агарозы, образованной из гранул, с открытой пористой структурой. Спейсерная группа может способствовать связыванию белка благодаря тому, что она делает лиганд более доступным. Длина и природа спейсерной группы может быть определена самим специалистом. Лиганд должен обладать способностью к специфическому и обратимому связыванию белка, предназначенного для очистки, даже после иммобилизации. Помимо антител, в качестве аффинных лигандов был использован ряд других соединений, включая кофакторы ферментов, аминокислоты, пептиды, белки, конканавалин А, лектин, тиолы и красители.
Аффинная хроматография была использована во многих способах применения. Исчерпывающий список дан, например, в "Affinity Chromatography A Practical Approach", IRL Press, 1985, и в "Affinity Chromatography, Principles and Methods", Pharmacia Fine Chemicals, 1979.
Для крупномасшабной очистки специфических ферментов или групп ферментов был использован стандартный субстрат или субстрат, аналогичный аффинным лигандам, а в частности, красители (Scawen M.D. & Atkinson Т. 1987, Reactive Dyes in Protein and Enzyme Technology, Ed. Clonis Y.D. et al.; Macmilian Press, pp. 51-85).
Аффинная хроматография на основе красителя уже в течение многих лет представляет для специалистов особый интерес из-за относительно низкой стоимости матриц, используемых в такой хроматографии, их надежности и устойчивости к NaOH, мочевине и этанолу. Некоторыми из лигандов, более широко используемых в аффинной хроматографии такого типа, являются различные реакционно-способные текстильные красители на основе триазина, иммобилизованные на агарозе и других носителях. Использование аффинной хроматографии на иммобилизованных красителях описано Lowe C.R. & Pearson J.C. (1984, Methods in Enzymology 104, pp.97-113). Были описаны селективные взаимодействия NAD+-связывающего центра алкогольдегидрогеназы лошадиной печени с красителями-аналогами синего Cibacron Blue F3G-A (Lowe C.R. et ai., 1986; Journal of Chromatography 376, pp.121-230). Кроме того, был проиллюстрирован метод селективной очистки, разработанный с использованием компьютерной технологии в целях получения новых аффинных адсорбентов, имитирующих фенил-аргинин-дипептидный субстрат, для очистки свиного панкреатического калликреина (Burton N. P. & Lowe C.R., 1992, Journal of Molecular Recognition 6, pp. 55-58).
В патенте США N 4562252 описана структура конкретного лиганда, состоящего из двух м-аминофенилбороксильных групп, связанных с триазиновым кольцом и используемого для выделения гликопротеинов.
Однако, несмотря на быстрый прогресс в области аффинной технологии за последние годы, остается актуальной необходимость в разработке технологий, с помощью которых для данного белка мог бы быть идентифицирован специфический имитирующий лиганд для приготовления недорогостоящих и стабильных аффинных колонок, которые позволили бы осуществлять многократную крупномасштабную очистку указанного белка, например, при выделении и очистке белковых материалов, таких как, иммуноглобулины, инсулины, фактор VII, человеческий гормон роста или их аналоги, производные, фрагменты и предшественники, происходящие от природных или рекомбинантных источников.
Настоящее изобретение относится к новым аффинным лигандам, к их получению и связыванию с матрицами; а также к использованию этих новых комплексов аффинный лиганд - матрица для очистки белковых материалов.
Настоящее изобретение основано на том соображении, что селективность гидрофобных лигандов может быть повышена путем увеличения сложности и пространственной геометрии гидрофобного компонента и что включение различных функциональных групп, способных принимать участие в электростатических и водородсвязывающих взаимодействиях, стимулирует селективные взаимодействия с белоксвязывающими сайтами. Эта работа привела к обнаружению характерной группы новых аффинных лигандов, которые, как было неожиданно обнаружено, могут быть, в основном, использованы для выделения и очистки белков с помощью аффинной хроматографии.
В отличие от вышеупомянутого селективного метода, в котором субстраты ферментов, их аналоги, или имитаторы субстратов используются в качестве лигандов, лиганды, описанные в настоящей заявке, направлены на любую поверхность белковой молекулы, что делает их принципиально применимыми для очистки любого белка. Эти лиганды были сконструированы с помощью техники компьютерного моделирования и/или скрининга библиотек лигандов-имитаторов. Кроме того, настоящее изобретение имеет то преимущество, что для конструирования и разработки лиганда не требуется какой-либо конкретной архитектуры для структуры белоксвязывающего сайта, а поэтому материалы и способы, описанные в настоящей заявке, имеют значительно большую ценность.
Отличительным признаком настоящего изобретения является разработка общего метода разделения, выделения и очистки белков. Было синтезировано семейство различных незначительно отличающихся друг от друга химических структур, которые способны взаимодействовать с различными белками. Структура лиганда, особенно эффективного для данного белка, была идентифицирована путем скрининга ряда лигандов, имеющих подходящие для настоящего изобретения связывающие свойства.
Так, например, аффинные лиганды высокой селективности и специфичности, которые в настоящее время используются для выделения и очистки иммуноглобулинов, часто являются белковыми материалами, происходящими либо от бактериальных, либо от рекомбинантных источников, и включают такие материалы, как Белок А, Белок G и Белок L. Иммобилизация этих и аналогичных белков часто приводит к значительной потере биологической активности. Продолжительное и многократное использование иммобилизованных белков в качестве аффинной среды приводит к дополнительному снижению биологической активности. Кроме того, природа этих биологических макромолекул накладывает жесткие ограничения на использование буферных солей, органических растворителей и уровней pH в аффинной хроматографии и аналогичных методах.
Новые аффинные лиганды настоящего изобретения могут быть использованы вместо белка А и белка G и являются значительно более гибкими в применении, более стабильными, менее дорогостоящими и часто дают эквивалентные уровни очистки.
Другим примером применения может служить использование новых аффиных матриц настоящего изобретения в биотехнологии.
Настоящее изобретение относится к конъюгатам "аффинный лиганд - матрица", содержащим лиганд общей формулы (а):
Figure 00000001

где R1 представляет атом водорода, алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, гидроксиалкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, циклогексильную группу, аминогруппу, фенильную группу, нафтильную группу, 1-фенилпиразольную группу, индазольную группу, бензтиазольную группу, бензоксазольную группу или бензимидазольную группу, где каждое из бензольного, нафталинового, фенилпиразольного, индазольного, бензтиазольного, бензоксазольного или бензимидазольного колец необязательно замещено одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из группы, включающей алкильные группы, содержащие, 1-6 атомов углерода; алкоксигруппы, содержащие, 1-6 атомов углерода; ацилокси- или ациламино-группы, содержащие 1-6 атомов углерода; амино-группы; гидроксильные группы; карбоксильные группы; сульфокислотные группы; карбамоильные группы; сульфамоильные группы; алкилсульфонильные группы, содержащие 1-6 атомов углерода или атомы галогена;
Y представляет атом кислорода, атом серы или группу N-R2;
Z представляет атом кислорода, атом серы или группу N-R3;
каждый из R2 и R3 независимо представляет атом водорода; алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода; гидроксиалкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода; бензильную группу или
Figure 00000002
фенилэтильную группу;
каждый из R4, R5 и R6 независимо представляет атом водорода; гидроксильную группу; алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода; алкокси-группу, содержащую 1-6 атомов углерода; аминогруппу; ацилокси- или ациламино-группу, содержащую 1-6 атомов углерода; карбоксильную группу; сульфоксильную группу, карбамоильную или сульфамоильную группу; алкилсульфонильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода; или атом галогена;
один из символов X представляет атом азота, а другой символ X представляет атом азота или атом углерода, несущий атом хлора или цианогруппу;
Q представляет бензольное, нафталиновое, бензтиазольное, бензоксазольное, 1-фенилпиразольное, индазольное или бензимидазольное кольцо;
n представляет целое число от 0 до 6;
p представляет целое число от 0 до 20; и
где указанный лиганд связан с матрицей-носителем в положении А необязательно посредством спейсерной группы, расположенной между матрицей и лигандом.
Необязательная спейсерная группа предпочтительно представлена общей формулой:
-T-[-L-V-]m-, (b)
где Т представляет атом кислорода, атом серы или группу N- R7, где R7 представляет атом водорода или алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода;
V представляет атом кислорода, атом серы, группу -COO-, группу CONH или группу NHCO или группу - PO3-H-, группу NH-арилен-SO2-CH2-CH2 или N-R8, где R8 представляет атом водорода или алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода;
L представляет необязательно замещенную углеводородную связь, содержащую от 2 до 20 атомов углерода; и
m = 0 или 1.
Матрица-носитель может быть любым соединением или материалом, состоящим или не состоящим из макрочастиц, растворимым или нерастворимым, пористым или непористым, который может быть использован для конъюгирования с аффинными лигандами с образованием конъюгата аффинный лиганд - матрица, и с помощью которого может быть осуществлено выделение аффинных лигандов из растворенных веществ в контактирующем растворе.
Hастоящее изобретение относится к новым конъюгатам аффинный лиганд - матрица, которые могут быть использованы для выделения и очистки белковых материалов, таких как, иммуноглобулины, инсулины, фактор VII, или человеческий гормон роста, или их аналоги, производные и фрагменты и предшественники, происходящие от природных или рекомбинантных источников.
В предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к новым конъюгатам аффинный лиганд - матрица, которые представлены общей формулой (I):
Figure 00000003

где R1, Y, Z, R2, R3, R4, R5, R6, X, Q, n и p определены выше;
T представляет атом кислорода, атом серы или группу N-R7;
V представляет атом кислорода, атом серы, группу -COO-, группу CONH, или группу NHCO или группу -PO3-H, группу NH- арилен-SO2-CH2-CH2 или группу N-R8,
каждый из R7 и R8 независимо представляет атом водорода или алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода;
L представляет необязательно замещенную углеводородную связь, содержащую от 2 до 20 атомов углерода; и
m = 0 или 1; и
M представляет остаток матрицы-носителя.
Используемый в настоящем описании термин "алкильная группа, содержащая 1-6 атомов углерода", взятая отдельно или в комбинации с другими группами, означает прямую или разветвленную, насыщенную углеводородную цепь, имеющую 1-6 атомов углерода, такую как, например, метил, этил, н- пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, н- пентил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, н-гексил, 4-метилпентил, неопентил, н-гексил и 2,2-диметилпропил.
Используемый в настоящем описании термин "гидроксиалкильная группа, содержащая 1-6 атомов углерода", взятая отдельно или в комбинации с другими группами, означает прямую или разветвленную, насыщенную углеводородную цепь, имеющую 1-6 атомов углерода, замещенных одной или несколькими гидроксигруппами, предпочтительно одной гидроксигруппой, такими как, например, гидроксиметил, 2-гидроксиэтил, 3-гидроксипропил, 2-гидроксипролил, 4-гидроксибутил, 5-гидроксипентил и 6-гидроксигексил.
Используемый в настоящем описании термин "алкокси-группа, содержащая 1-6 атомов углерода", взятая отдельно или в комбинации с другими группами, означает прямой или разветвленный моновалентный заместитель, включающий алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, связанную через кислород простой эфирной группы, имеющей свою свободновалентную связь от кислорода, и содержащий 1-6 атомов углерода, например, метокси, этокси, пропокси, изопропокси, бутокси, пентокси.
Используемый в настоящем описании термин "галоген" означает фтор, хлор, бром или иод.
Используемый в настоящем описании термин "ацилокси или ациламино, содержащий от 1 до 6 атомов углерода" означает моновалентный заместитель, включающий алкильную группу, содержащую 1-5 атомов углерода, связанную посредством карбонилокси- или оксикарбонильной группы, такой как, метилкарбонилокси-, этилкарбонилокси-, метилоксикарбонильная или этилоксикарбонильная группа, или связанную посредством карбониламино- или аминокарбонильной группы, такой, как метилкарбониламино, этилкарбониламино, метиламинокарбонильная или этиламинокарбонильная группа.
Используемый в настоящем описании термин "алкилсульфонил, содержащий 1-6 атомов углерода" означает моновалентный заместитель, включающий алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, связанную посредством сульфонильной группы, такой как, например, метилсульфонил, этилсульфонил, н-пропилсульфонил, изопропилсульфонил, н-бутилсульфонил, втор- бутилсульфонил, изобутилсульфонил, трет-бутилсульфонил, н- пентилсульфонил, 2-метилбутилсульфонил, 3-метилбутилсульфонил, н-гексилсульфонил, 4-метилпентилсульфонил, неопентилсульфонил, н-гексилсульфонил и 2,2-диметипропилсульфонил.
Используемый в настоящем описании термин "один или несколько заместителей, независимо выбранных из..." предпочтительно относится к 1-3 заместителям. При этом, предпочтительно, если он относится к 1-2 заместителям, а более предпочтительно к одному заместителю.
В настоящем описании, термин "инсулин", независимо от того, используется ли он во многозначном смысле или в обобщенном смысле, относится как к природным инсулинам, так и к их аналогам и производным, и к предшественникам. Под термином "инсулин" подразумевается также инсулин, происходящий от любого вида животных, включая человека. В контексте настоящего описания, термин "аналог инсулина" означает инсулин человека, имеющий одну или несколько аминокислотных замен, одну или несколько аминокислотных делеций, одну или несколько аминокислотных инсерций, или комбинации указанных модификаций. Термин "производное инсулина" означает инсулин, химически модифицированный в одном или нескольких своих остатков. Термин "предшественник инсулина" означает любую молекулу, которая, после ее ферментативной или химической трансформации, образует инсулин, фрагменты инсулина, например, des-Thr(B30)-инсулина, аналоги инсулина или производные инсулина.
Используемый в настоящем описании термин "необязательно замещенная углеводородная связь, содержащая от 2 до 20 атомов углерода", означает одну или несколько линейных или разветвленных алкильных цепей, необязательно замещенных, например, гидрокси- или алкокси-группами, содержащими 1-6 атомов углерода, и необязательно соединенных вместе амино-, эфирными, тиоэфирными, сложноэфирными, амидными или сульфонамидными связями с образованием цепи, содержащей от 2 до 20 атомов углерода. Эта конструкция является предпочтительно гибкой. Конструкция таких необязательно замещенных углеводородных связей описана, например, в работе Lowe, C.R. & Dean, P.D.G., 1974, Affinity Chromatography, John Wiley & Sons, London, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения, указанные конъюгаты представлены общей формулой (I):
Figure 00000004

где представляет атом водорода, алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, гидроксиалкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, циклогексильную группу, аминогруппу, фенильную группу или нафтильную группу, которая может быть замещена на бензольном или нафталеновом кольце алкильными группами, содержащими 1-6 атомов углерода, алкокси- группами, содержащими 1-6 атомов углерода, ацилокси- или ациламино-группами, содержащими 1-6 атомов углерода, аминогруппами, гидроксильными группами, карбоксильными группами, сульфоксильными группами, карбамоильными группами, cульфамоильными группами, алкилсульфонильными группами или атомами галогена;
Т представляет атом кислорода, атом серы или группу N- R7;
Y представляет атом кислорода, атом серы или группу N-R2;
Z представляет атом кислорода, атом серы или группу N-R3;
каждый из R2 и R3 независимо представляет атом водорода, алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, гидроксиалкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, бензильную группу или
Figure 00000005
фенилэтильную группу;
каждый из R4, R5 и R6 независимо представляет атом водорода, гидроксильную группу, алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, алкокси-группу, содержащую 1-6 атомов углерода, аминогруппу, ацилокси- или ациламино-группу, содержащую 1-6 атомов углерода, карбоксильную группу, сульфоксильную группу, карбамоильную или сульфамоильную группу, алкилсульфонильную группу или атом галогена;
один из символов X представляет атом азота, а другие символы X представляют атом азота или атом углерода, несущие атом хлора или цианогруппу;
V представляет атом кислорода, атом серы, -COO-, группу CONH, или группу NHCO, или группу -PO3H-, группу NH-арилен- SO2-CH2-CH2, или N-R8,
каждый из R7 и R8 независимо представляет атом водорода или алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода;
L представляет необязательно замещенную углеводородную связь, содержащую от 2 до 20 атомов углерода; и
Q представляет бензольное или нафталиновое кольцо;
n представляет целое число от 0 до 6;
p представляет целое число от 0 до 20;
m = 0 или 1; и
М представляет остаток матрицы-носителя, который может быть любым соединением или материалом, состоящим или не состоящим из макрочастиц, растворимым или нерастворимым, пористым или непористым, который может быть использован в сочетании с аффинными лигандами с образованием нового конъюгата аффинный лиганд - матрица" общей формулы (I) и который служит удобным средством выделения аффинных лигандов из растворенных веществ в контактирующем растворе.
Следует отметить, что настоящее изобретение относится, inter alia, к использованию соединений, которые являются пиридинами, диазинами или триазинами, несущими заместитель T-[L-V]0-1-M, или его предшественник, и другие заместители, связанные с кольцом посредством гетероатома. Такими заместителями может быть любая (пространственно) затрудняющая группа, содержащая 0-10 или 20 атомов углерода.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения R1 представляет фенильную или нафтильную группу, каждая из которых необязательно замещена на бензольном или нафталиновом кольце одним или несколькими группами, независимо выбранными из гидроксильных групп или карбоксильных групп.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения R2 представляет атом водорода.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения R3 представляет атом водорода.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения R4 представляет атом водорода, гидроксильную группу, карбоксильную группу или аминогруппу.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения R5 представляет атом водорода, гидроксильную группу, карбоксильную группу или аминогруппу.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения R6 представляет атом водорода, гидроксильную группу, карбоксильную группу или аминогруппу.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения, R7 представляет атом водорода.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения Т представляет атом кислорода или группу NH.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения Y представляет N-R2, где R2 является таким, как указано выше.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения Z представляет N-R3, где R3 является таким, как указано выше.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения оба X представляют атом азота.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения Q представляет бензольное или нафталиновое кольцо.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения n представляет 0 или 2.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения p представляет 0 или 2.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения m представляет 0 или 1.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения L представляет этильную, пропильную, гидроксипропильную, бутильную, пентильную, гексильную, октильную или децильную группу, а V и m являются такими, как указано выше.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения V представляет атом кислорода, группу -COO-, группу -PO3H-, или группу N-R8, а более предпочтительно атом кислорода или группу NH, а L и m являются такими, как указано выше.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения m представляет 1, a L и V являются такими, как указано выше.
Термин "целое число между x и y" может включать величины x (включая нуль) и y.
Настоящее изобретение также относится к способам изготовления новых конъюгатов "аффинный лиганд - матрица" настоящего изобретения, предусматривающим проведение реакции, в любом порядке, галоген-содержащего гетероциклического соединения общей формулы (II):
Figure 00000006

где символы X имеют значения, указанные выше, a W обозначает атом галогена,
(i) с соединением общей формулы (III):
R1-(CH2)p-Y-H, (III)
где символы R1, Y и p являются такими, как указано выше, а H обозначает водород;
(ii) с соединением общей формулы (IV):
Figure 00000007

где символы R4, R5, R6, Q, Z и n имеют значения, определенные выше; и
(iii) либо с необязательно дериватизированной матрицей-носителем общей формулы V:
H-T-[-L-V-]m-M, (V)
где символы L, М, V, Т и m имеют значения, определенные выше,
либо со связывающей структурной единицей общей формулы (VI)
H-T-L-V-H, (VI)
где символы H, L, V и Т имеют значения, определенные выше,
с получением соединения общей формулы (VII)
Figure 00000008

где R1, R4, R5, R6, Q, L, Т, V, X, Y, Z, m, n и p являются такими, как указано выше; а затем проведение реакции соединения общей формулы (VII) с матрицей-носителем, остаток которой представлен М, с использованием методов активации и присоединения, хорошо известных каждому специалисту.
Примерами галогенсодержащих гетероциклических соединений общей формулы (II) могут служить 5-хлор-2,4,6-трифторпиримидин, 5-циано-2,4,6-трихлорпиримидин, фторангидрид циануровой кислоты, бромангидрид циануровой кислоты, а в основном, хлорангидрид циануровой кислоты.
Примерами соединений общей формулы (III) могут служить амины, такие как, аммиак, метиламин, этиламин, пропиламин, изопропиламин, диизопропиламин, изобутиламин, амиламин, гексиламин, этаноламин, диэтаноламин, анилин, N-метиланилин, N-этиланилин, N-изопропиланилин, 1,4- диаминобутан, 1,6-диаминогексан, N-трет-бутиланилин, п-толуидин, п-бутиланилин, 2,4-диметиланилин, п-анизидин, п-этоксианилин, п- аминоацетанилид, п-аминофенол, п-хлоранилин, ортанилиновая кислота, метанилиновая кислота, сульфанилиновая кислота, 4-метил- анилин-2-сульфокислота, 4-метоксианилин-2-сульфокислота, анилин- 2,5-дисульфокислота, N-метилметанилиновая кислота, орто-, мета- и пара-аминобензойная кислота, п-аминобензамид, п- аминобензолсульфонамид, 1-амино-2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- и 8- нафтол, 2-амино-3-, 4-, 5-, 6-, 7- и 8-нафтол, 5-, 6- и 7-амино- 1-нафтол-3-сульфокислота, N-бензиланилин, бензиламин, 4- метилбензиламин, 4-гидрокси-бензиламин, 4-метоксибензиламин, 4-ацетоксибензиламин, 4-ацетиламинобензиламин, N-метилбензиламин,
Figure 00000009
фенилэтиламин, N- бутилбензиламин, N-бензил
Figure 00000010
фенилэтиламин, N-(
Figure 00000011
гидрокси-этил)-бензиламин, N-трет- бутилбензиламин, N-бензилтирамин и тирамин; фенолы, такие как, фенол, орто-, мета- и пара-крезол, катехол, резорцин, гидрохинон, п-хлорфенол, 1-нафтол и 2-нафтол, 1-нафтол-4- нафтол-4-сульфокислота, 2-нафтол-6-сульфокислота и 2-гидрокси-3-нафтойная кислота; тиолы, такие как, этилтиол, тиогликолевая кислота, тиофенол и тио-п-крезол; и ароматические гетероциклы, такие как, 5-амино-1-фенилпиразол, 6-аминоиндазол, 2- аминобензимидазол, 2-амино-бензтиазол и 2-амино-5- хлорбензоксазол.
Примерами соединений общей формулы (IV) являются амины, такие как, анилин, N-метиланилин, N-этиланилин, N- изопропиланилин, N-трет-бутиланилин, п-толуидин, п-бутиланилин, 2,4-диметиланилин, п-анизидин, п-этоксианилин, п-аминоацетанилид, п-аминофенол, п-хлоранилин, ортанилиновая кислота, метанилиновая кислота, сульфанилиновая кислота, 4-метиланилин-2-сульфокислота, 4-метоксианилин-2-сульфокислота, анилин-2,5-дисульфокислота, N- метилметанилиновая кислота, орто-, мета- и пара-аминобензойная кислота, 1-амино-2-,3-, 4-, 5-,6-,7- и 8-нафтол, 2-амино-3-, 4-,5-,6-,7- и 8-нафтол, 5-, 6- и 7-амино-1-нафтол-3-сульфокислота, п-аминобензамид, п-аминобензолсульфонамид, N- бензиланилин, бензиламин, 4-метилбензиламин, 4-гидроксибензиламин, 4-метоксибензиламин, 4-ацетоксибензиламин, 4- ацетиламинобензиламин, N-метилбензиламин,
Figure 00000012
фенилэтиламин, N-бутилбензиламин, N-бензил
Figure 00000013
фенилэтиламин, N-(
Figure 00000014
гидроксиэтил)-бензиламин, N-трет-бутилбензиламин, N-бензилтирамин и тирамин; фелолы, такие как, фенол, орто-, мета- и пара-крезол, катехол, резорцин, гидрохинон, п-хлорфенол, 1-нафтол и 2-нафтол, 1-нафтол-4-сульфокислота, 2-нафтол-6-сульфокислота и 2-гидрокси-3-нафтойная кислота; тиолы, такие как тиофенол и тио-п-крезол; и ароматические гетероциклы, такие как, 5-амино-1- фенилпиразол, 6-аминоиндазол, 2-аминобензимидазол, 2- аминобензтиазол и 2-амино-5-хлорбензоксазол.
В качестве примеров матриц-носителей, остаток которой представлен М, могут служить нерастворимые матрицы-носители, такие как, природный полимер, например, полипептид или белок, такой как, перекрестносшитый альбумин или полисахарид, такой как, агароза, альгинат, караген, хитин, целлюлоза, декстран или крахмал; синтетические полимеры, такие как, полиакриламид, полистирол, полиакролеин, поливиниловый спирт, полиметилакрилат, перфторуглеводород; неорганические соединения, такие как, кремнезем, стекло, кизельгур, окись алюминия, окись железа, или другие окиси металлов, или сополимеры, составляющие любую комбинацию из двух или более природных полимеров, синтетических полимеров, или неорганических соединений. Понятие "матрицы-носители, остаток которых представлен М", также включает в себя растворимые матрицы-носители, которые содержат полимеры, такие как, декстран, полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт или гидролизованный крахмал, и которые образуют конъюгаты аффинный лиганд - матрица, используемые для разделения жидкостей; или матрицы-носители, которые содержат такие соединения, как перфтордекалин, и которые образуют конъюгаты аффинный лиганд - матрица, используемые для изготовления аффинных эмульсий. Для большей ясности следует указать, что в контексте настоящего описания, понятие "матрица-носитель" означает любое соединение или материал (независимо от того, является ли он крупнозернистым или некрупнозернистым, растворимым или нерастворимым, пористым или непористым), который может быть использован для получения нового конъюгата аффинный лиганд-матрица настоящего изобретения и который обеспечивает удобный способ отделения аффинного лиганда от растворимых веществ в контактирующем растворе.
Кроме того, понятие "матрицы-носители, остаток которых представлен М", означает матрицы-носители, такие как, агароза, целлюлоза, декстран, крахмал, альгинат, караген, синтетические полимеры, кремнезем, стекло и окиси металлов, которые были модифицированы или являются модифицированными путем обработки активирующим агентом до или во время присоединения лиганда.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения, М представляет необязательно активированную агарозу, кремнезем, целлюлозу, стекло, мелкий жемчуг, гидроксиэтилметакрилат, полиакриламид, стиролдивинилбензол, Hyper D, перфторуглеводороды.
М предпочтительно обозначает агарозу, необязательно активированную трезилом, сульфонилхлорилом, тозилом, винилсульфоном или эпокси.
В соответствии с настоящим изобретением, предпочтительными конъюгатами аффинный лиганд - матрица являются
i)
Figure 00000015

ii)
Figure 00000016

iii)
Figure 00000017

iv)
Figure 00000018

v)
Figure 00000019

vi)
Figure 00000020

vii)
Figure 00000021

viii)
Figure 00000022

где М определен выше.
Существует большое число активирующих агентов, которые могут быть использованы в универсальных методах присоединения лигандов к матрице-носителю. Эти соединения и метод их использования хорошо известны специалистам, а поскольку в основе настоящего изобретения лежит природа лиганда, связываемого с матрицей, а не метод связывания, то любой из этих активирующих агентов может быть использован для изготовления новых конъюгатов "матрица-лиганд". Неограничивающими примерами таких активирующих агентов могут служить такие различные соединения, как бромистый циан, хлорангидрид циануровой кислоты, эпихлоргидрин, дивинилсульфон, п-толуолсульфонилхлорид, 1,1'- карбонилдиимидазол, метапериодат натрия, толуол-4-сульфонат-2- фтор-1-метилпиридиния, глицидоксипропилтриметоксисилан и 2,2,2- трифторэтансульфонилхлорид. Как показано выше, методы, которыми осуществляют такие стадии активации, хорошо известны специалистам.
Аналогично, для присоединения соединений общей формулы (IV) к матрице-носителю могут быть использованы конденсирующие агенты широкого ряда, такие как, агароза, целлюлоза, декстран, крахмал, альгинат, караген, кремнезем или стекло. И в этом случае, эти соединения и методы их использования хорошо известны специалистам, а поскольку, как и в предыдущем случае, в основе настоящего изобретения лежит природа лиганда, а не метод связывания, то любой из этих активирующих агентов может быть использован для изготовления новых конъюгатов матрица - лиганд. Неограничивающими примерами таких конденсирующих агентов могут служить N- этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин, дициклогексилкарбодиимид и 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) - карбодиимид.
В качестве примеров связывающих звеньев общей формулы (VI), которые могут быть использованы для получения соединений общей формулы (VII), могут служить диамины, такие как, этилендиамин, N,N'-диметилэтилендиамин, N-этилэтилендиамин, N-(
Figure 00000023
гидроксиэтил)-этилендиамин, пропилендиамин, N-метилпропилендиамин, N-(
Figure 00000024
гидроксиэтил)-пропилендиамин, 1,4-диаминобутан, 1,5-диаминопентан, 1,6-диаминогексан, 1,7- диаминогептан, 1,8-диаминооктан, 1,9-диаминононан, 1,10-диаминодекан, 1,12-диаминододекан, пиперазин, 3-гидрокси-1,5-диаминопентан, м- и п-фенилендиамин, м- и п-аминобензиламин; аминоспирты, такие как этаноламин, N-метилэтаноламин, N-пропилэтаноламин, диэтаноламин, 3-гидроксипропиламин, 2,3-дигидроксипропиламин, изопропаноламин, 5-аминопентан-1-ол и 6-аминогексан-1-ол; аминофенолы, такие как, о-, м- и п-аминофенол; аминокарбоновые кислоты, такие как глицин, N-метилглицин, 3- и 4-aминомасляная кислота, 3-аминоизомасляная кислота, 5-аминовалериановая кислота, 6-аминокапроевая кислота, 7- аминогептановая кислота, м- и п-аминобензойная кислота; аминофосфоновые кислоты, такие как м-аминобензолфосфоновая кислота и п-аминобензилфосфоновая кислота; и аминоариленвинилсульфоновые предшественники, такие как анилин-3
Figure 00000025
сульфатоэтилсульфон и анилин-4
Figure 00000026
сульфатоэтилсульфон.
Реакция галогенсодержащих гетероциклических соединений общей формулы (II) с соединениями общей формулы (III), (IV) и (V) или (VI) может быть осуществлена в не смешиваемом с водой органическом растворителе; или в смешиваемом с водой органическом растворителе, или в смеси воды и смешиваемого с водой органического растворителя. Примерами подходящих не смешиваемых с водой органических растворителей являются толуол, ксилол или хлорбензол; примерами подходящих смешиваемых с водой органических растворителей являются ацетон, метилэтилкетон или диоксан. Первая реакция галогенсодержащего гетероциклического соединения может быть осуществлена при температурах от 0oC до 25oC, а идеально, от 0oC до 5oC; вторая реакция может быть осуществлена при температурах от 20oC до 50oC, а идеально от 30oC до 45oC; а третья реакция может быть осуществлена при температурах от 20oC до 100oC. В процессе этих реакций, продуцируемую неорганическую кислоту,
такую как, соляная кислота или фтористоводородная кислота, нейтрализуют с использованием связывающего кислоту агента, такого как, гидроксид натрия, карбонат натрия, бикарбонат натрия, гидроксид кальция или карбонат кальция.
Кроме того, соединения общей формулы (VII) могут взаимодействовать с реакционно-способным полимеризуемым мономером с образованием полимеризуемого соединения общей формулы (VIII):
Figure 00000027

где R1, R4, R5, R6, Q, L, T, V, X, Y, Z, m, n и p являются такими, как указано выше; R9 представляет атом водорода или алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода; R10 представляет карбонильную группу, метиленовую группу, группу -NH-CH2- или группу -S-CH2-. Примерами реакционноспособных полимеризуемых мономеров являются акрилоилхлорид, метакрилоилхлорид, аллилбромид, аллиламин или 3,4-эпоксибутен. Полимеризуемые соединения общей формулы (VIII) могут быть полимеризованы необязательно в присутствии других полимеризуемых мономеров с образованием конъюгатов аффинный лиганд - матрица общей формулы (I). Такие способы полимеризации хорошо известны специалистам.
Настоящее изобретение также относится к использованию всех указанных конъюгатов аффинный лиганд - матрица -носитель для разделения, выделения, очистки, количественной оценки, идентификации и характеризации белковых материалов, таких как, иммуноглобулины, инсулины, фактор VII, или человеческий гормон роста, либо их аналоги, производные и фрагменты, и предшественники.
Иммуноглобулины представляет собой семейство белков, часто обозначаемых Ig, которые имеют одинаковую структуру. Иммуноглобулины, в целом, часто называют антителами, и любое из этих названий может быть использовано для описания этой группы белков. Иммуноглобулины существуют в виде различных форм; например, наиболее известными типами антител являются IgA, IgD, IgE, IgG, IgM и IgY и их различные подклассы. Иммуноглобулины могут присутствовать в физиологических жидкостях организма, таких как, плазма, асциты, слюна, молоко или яичный желток, либо они могут быть продуцированы методами генной инженерии. Для получения желаемых свойств иммуноглобулинов, они могут быть модифицированы различными методами. Эти методы хорошо известны специалистам и позволяют получить модифицированные антитела, которые также заявлены в формуле изобретения настоящего изобретения. В качестве неограничивающих примеров способов модификации антител могут служить методы получения фрагментов антител, меченых антител, конъюгатов антител или антитело-содержащих гибридных белков путем химической модификации, путем обработки одним или несколькими ферментами, или путем использования комбинации того и другого метода. Существует большое количество химически модифицирующих реагентов и ферментов, которые могут быть использованы для модификации антитела, и эти соединения, а также их использование хорошо известны специалистам. Другим путем получения модифицированных или новых антител является их продуцирование методами генной инженерии. Эти методы хорошо известны специалистам и могут быть использованы для продуцирования, например, фрагментов антител или антитело- содержащих гибридных продуктов. Модифицированные или новые антитела, полученные методами генной инженерии, также заявлены в формуле изобретения.
Ценная группа конъюгатов аффинный лиганд - матрица-носитель представлена общей формулой (IX):
Figure 00000028

где R1, R4, R5, R6, M, Q, n и p указаны выше, a j представляет целое число от 2 до 20.
Особенно ценная группа конъюгатов аффинный лиганд - матрица-носитель представлена общей формулой (X):
Figure 00000029

где j и M являются такими, как указано выше.
Обычно, реакция соединений общей формулы (XI):
Figure 00000030

с 3-пропокси-(1,2-эпокси)-агарозой при температуре 10-30oC в присутствии связывающего кислоту агента приводит к продуцированию новых конъюгатов аффинный лиганд - матрица, которые обладают исключительной эффективностью при очистке белковых материалов. Эти новые конъюгаты аффинный лиганд - матрица обладают высокой аффинностью по отношению к белкам группы иммуноглобулинов. Эти уникальные свойства указанных конъюгатов делают их исключительно ценными при разделении, выделении, очистке, количественной оценке, идентификации и характеризации белков этого класса.
В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к новым аффинным лигандам общей формулы (XII):
Figure 00000031

где R1, R4, R5, R6, Q, X, Y, Z, n и p являются такими, как указано выше, а галоген (Halogen) представляет атом фтора, хлора, брома или йода.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу связывания новых аффинных лигандов общей формулы (XII), описанных выше, с матрицей общей формулы (V), описанной выше, путем реакции новых аффинных лигандов с матрицей при температуре от -20oC до 121oC, необязательно в присутствии связывающего кислоту агента.
В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к новым аффинным лигандам общей формулы (XIII):
Figure 00000032

где R1, R4, R5, R6, Q, X, Y, Z, m, n и p являются такими, как указано выше; a j представляет целое число от 2 до 20.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения вышеуказанных новых аффинных лигандов общей формулы (XIII) путем реакции соединения вышеописанной общей формулы (XII) с алкилендиамином общей формулы H2N- (CH2)j- NH2 при температурах от 0oC до 100oC в присутствии агента, связывающего кислоту.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к новым аффинным лигандам общей формулы (XIV):
Figure 00000033

где R1, R4, R5, Q, X, Y, Z, m, n и p являются такими, как указано выше; q = 0 или 1, a j представляет целое число от 2 до 20.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения новых аффинных лигандов вышеуказанной общей формулы (XIV) путем реакции соединения вышеуказанной общей формулы (XII) с аминогидрокси-соединением общей формулы H2N-(CH2)j- (CO)q-OH при температурах от 0oC до 100oC, необязательно в присутствии агента, связывающего кислоту.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к новым аффинным лигандам вышеуказанной общей формулы (VIII), где R1, R4, R5, R6, L, Q, Т, V, X, Y, Z, m, n и p являются такими, как указано выше; R9 представляет атом водорода или алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода; R10 представляет карбонильную группу, метиленовую группу, группу - NH-CH2- или группу -S-CH2-, L предпочтительно представляет этильную, бутильную или гексильную группу, Т предпочтительно представляет группу -NH-, V предпочтительно представляет группу - NH-, a m предпочтительно равно 1.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к новым аффинным лигандам общей формулы (XV):
Figure 00000034

где R1, R4, R5, R6, Q, n и p являются такими, как указано выше.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к новым аффинным лигандам общей формулы (XVI):
Figure 00000035

где R1, R4, R5, R6, Q, n и p являются такими, как указано выше, a j представляет целое число от 2 до 20.
В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к аффинным лигандам общей формулы (XII), (XIII), (XIV), (VIII), (XV) и (XVI), где R1 представляет фенильную или нафтильную группу, каждая из которых необязательно замещена на бензольном или нафталиновом кольце одной или несколькими группами, независимо выбранными из гидроксильных или карбоксильных групп.
В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к аффинным лигандам общей формулы (XII), (XIII), (XIV), (VIII), (XV) и (XVI), где R4 представляет атом водорода, гидроксильную группу, карбоксильную группу или аминогруппу.
В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к аффинным лигандам общей формулы (XII), (XIII), (XIV), (VIII), (XV) и (XVI), где R5 представляет атом водорода, гидроксильную группу, карбоксильную группу или аминогруппу.
В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к аффинным лигандам общей формулы (XII), (XIII), (XIV), (VIII), (XV) и (XVI), где R6 представляет атом водорода, гидроксильную группу, карбоксильную группу или аминогруппу.
В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к аффинным лигандам общей формулы (XII), (XIII), (XIV), (VIII), (XV) и (XVI), где Q представляет бензольное или нафталиновое кольцо.
В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к аффинным лигандам общей формулы (XII), (XIII), (XIV) и (VIII), где X представляет атом азота.
В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к аффинным лигандам общей формулы (XII), (XIII), (XIV) и (VIII), где Y представляет группу -NH-.
В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к аффинным лигандам общей формулы (XII), (XIII), (XIV) и (VIII), где Z представляет группу -NH-.
В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к аффинным лигандам общей формулы (XII), (XIII), (XIV), (VIII), (XV) и (XVI), где n = 0 или 2.
В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к аффинным лигандам общей формулы (XII), (XIII), (XIV), (VIII), (XV) и (XVI), где p = 0 или 2.
В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к аффинным лигандам общей формулы (XIII), (XIV) и (XVI), где j = 2, 4 или 6.
В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к аффинным лигандам вышеуказанной общей формулы (XI), где j представляет целое число от 2 до 20.
Предпочтительными аффинными лигандами настоящего изобретения являются:
Figure 00000036

Figure 00000037

Figure 00000038

Figure 00000039

Figure 00000040

Figure 00000041

Figure 00000042

Figure 00000043

Figure 00000044

Figure 00000045

Figure 00000046

Figure 00000047

Figure 00000048

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу связывания новых аффинных лигандов общих формул (VII), (XIII), (XIV) и (XI), определенных выше, с углеводной матрицей или матрицей из органического полимера путем реакции указанной углеводной матрицы или матрицы из органического полимера с активирующим агентом и последующей реакции активированной матрицы с новым аффинным лигандом, необязательно в присутствии агента, связывающего кислоту. Настоящее изобретение также относится к способу связывания новых аффинных лигандов общей формулы (XIV), определенной выше, с углеводной матрицей или с матрицей из органического полимера путем реакции конденсации с указанной матрицей. Настоящее изобретение также относится к способу связывания новых аффинных лигандов общих формул (VII), (XIII), (XVI) и (XI), определенных выше, с матрицами, полученными на основе окиси металла, стекла или двуокиси кремния, и необязательно покрытыми органическим полимером, путем реакции необязательно покрытых матриц на основе окиси металла, стекла или двуокиси кремния с активирующим агентом, и последующей реакции активированной матрицы с новым аффинным лигандом необязательно в присутствии агента, связывающего кислоту. В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу связывания новых аффинных лигандов общей формулы (XIV), определенной выше, с матрицами из окиси металла, стекла или двуокиси кремния, необязательно покрытыми органическим полимером, путем конденсации этих лигандов с указанной матрицей. В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу связывания новых аффинных лигандов общих формул (XV) и (XII), определенных выше, с матрицей общей формулы (V), определенной выше, путем реакции новых аффинных лигандов с матрицей при температуре от -20oC до 121oC, необязательно в присутствии агента, связывающего кислоту. Настоящее изобретение также относится ко всем конъюгатам аффинный лиганд - матрица, полученным вышеописанными способами.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к использованию аффинных лигандов настоящего изобретения и конъюгатов аффинный лиганд - матрица, содержащих лиганды настоящего изобретения, для разделения, выделения, очистки, характеризации, идентификации или количественной оценки белков или белковых материалов, таких как, иммуноглобулины или их подклассы, фрагменты, предшественники, или производные, независимо от того, происходят они от природных или от рекомбинантных источников, например, иммуноглобулин G (IgG), иммуноглобулин М (IgM), иммуноглобулин А (IgA) или их подклассы, фрагменты, предшественники или производные, происходящие как от природных, так и от рекомбинантных источников. В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к разделению, выделению, очистке, характеризации, идентификации или количественной оценке иммуноглобулинов любым способом, в котором указанные иммуноглобулины наносят на конъюгаты аффинный лиганд - матрица настоящего изобретения при pH 5,0-12,0, а затем удаляют, элюируют или десорбируют путем снижения pH до 4,9 или ниже.
Настоящее изобретение также относится к способу разделения или очистки белковых материалов, предусматривающему проведение аффинной хроматографии с использованием в качестве биоспецифического лиганда общей формулы (а), лиганда, описанного выше.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к использованию аффинных лигандов настоящего изобретения и конъюгатов аффинный лиганд - матрица, содержащих лиганды настоящего изобретения, для разделения, выделения, очистки, характеризации, идентификации или количественной оценки инсулинов, их аналогов, производных, фрагментов и предшественников, происходящих как от природных, так и от рекомбинантных источников, а также фактора VII или человеческого гормона роста или их аналогов, производных, фрагментов и предшественников.
Например, была сконструирована библиотека, содержащая более 60 различных лигандов. Эту библиотеку скринировали с использованием частично очищенного предшественника инсулина, и отобранные лиганды иммобилизовали на агарозе путем твердофазного синтеза. С использованием соответствующей техники связывания, матрицы оптимизировали по длине и природе спейсерной группы, лигандной плотности и т. п. , в результате чего получали 3 прототипа, отличающиеся по своей динамической емкости связывания, составляющей 2-5 мг/мл. Рекомбинантный предшественник инсулина был очищен до чистоты более 95% из осветленного сбраживаемого дрожжевого бульона путем проведения одной стадии, имитирующей аффинную очистку в очень мягких условиях.
Таким образом, особенно предпочтительным использованием аффинных лигандов настоящего изобретения и конъюгатов аффинный лиганд - матрица, содержащих аффинные лиганды настоящего изобретения, является очистка инсулинов, их аналогов, производных, фрагментов и предшественников, происходящих как от натуральных, так и от рекомбинантных источников. Особенно предпочтительные конъюгаты - аффинный лиганд - матрица для такого использования содержат лиганд, выбранный из нижеследующих лигандов:
Figure 00000049

Figure 00000050

Figure 00000051

где лиганд связан с матрицей-носителем в положении А, как описано выше, необязательно посредством "спейсерной ножки", расположенной между матрицей и лигандом, представленным общей формулой (b), определенной выше. Предпочтительным лигандом является 11а, а предпочтительной матрицей-носителем является необязательно активированная агароза, целлюлоза, кремнезем или стекло.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к разделению, выделению, очистке, характеризации, идентификации или количественной оценке инсулинов или аналогов инсулинов, их производных и предшественников любым способом, в котором указанные инсулины, производные, аналоги и предшественники инсулина наносят на конъюгаты аффинный лиганд - матрица настоящего изобретения при pH в пределах от 4,0 до 9,0, а затем удаляют, элюируют или десорбируют путем снижения pH до 3,99 или ниже, либо повышения до 9,01 или выше. Процедура элюции может быть, например, альтернативно, осуществлена путем понижения ионной силы или путем добавления сорастворителей, таких как органические растворители.
Более подробно, настоящее изобретение описано в нижеследующих примерах. Эти примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как некое ограничение настоящего изобретения.
Пример 1
В данном примере проиллюстрирован синтез типичного аффинного лиганда, проведенный посредством реакции галогенсодержащих гетероциклических соединений общей формулы (II) с соединениями общей формулы (III) и (IV).
19,8 ч. анилина растворяли в 50 ч. ацетона, и этот раствор вводили в суспензию, полученную в результате выливания раствора 36,8 ч. хлорангидрида циануровой кислоты в 200 ч. ацетона в смесь, содержащую 50 ч. льда и 50 ч. воды. Смесь перемешивали 2 ч, в течение которых pH поддерживали между 6 и 7 путем добавления раствора, содержащего 16,8 ч. бикарбоната натрия и 300 ч. воды. По истечении этого времени, осадок 2-анилин-4,6-дихлор-1,3,5- триазина отфильтровывали, промывали водой, сушили в вакууме и кристаллизовали из дихлорметана.
Раствор 2,74 ч. тирамина в смеси 50 ч. ацетона и 10 ч. воды добавляли к раствору 4,82 ч. 2-анилин-4,6-дихлор-1,3,5-триазина в 100 ч. ацетона. Полученную смесь нагревали до температуры 50oC и выдерживали при этой температуре в течение 2 ч, при поддерживании pH от 6 до 7 путем добавления раствора 1,68 ч. бикарбоната натрия в 30 ч. воды. По истечении этого времени, осадок 2-анилин- 4-[
Figure 00000052
(4'-гидроксифенил)-этиламино]-6-хлор-1,3,5- триазина отфильтровывали, промывали водой и сушили в вакууме.
Пример 2
В данном примере проиллюстрирована методика иммобилизации продукта примера 1 на твердофазном носителе.
10 ч. агарозы, несущей аминогруппы, переносили в ацетоновый растворитель путем замены растворителя с использованием 100 ч. 30% водного раствора ацетона, затем 100 ч. 70% водного раствора ацетона, а затем 100 ч. ацетона. 1 ч. 2-анилин-4- [
Figure 00000053
(4'-гидроксифенил)-этил- амино]-6-хлор-1,3,5-триазина растворяли в 20 ч. ацетона и нагревали до температуры 50oC. Этот теплый ацетоновый раствор добавляли к ацетоновой суспензии производного агарозы, несущего аминогруппы. К полученной суспензии добавляли раствор 0,42 ч. бикарбоната натрия в 5 ч. воды, и смесь перемешивали в течение 16 ч при 50oC. По истечении этого времени, агарозную матрицу-носитель отмывали от несвязанного 2-анилин-4-[
Figure 00000054
(4'-гидроксифенил)-этиламино]-6-хлор-1,3,5- триазина ацетоном. Затем полученный дериватизированный аффинный носитель переносили обратно в воду путем промывки сначала 70% водным раствором ацетона, затем 30% водным раствором ацетона и, наконец, водой.
Пример 3
В этом примере проиллюстрировано использование новой аффинной матрицы, описанной в примере 2, в качестве специфической хроматографической матрицы для иммуноглобулинов.
1,25 ч. плазмы человека разбавляли 3,75 ч. водного фосфатного буфера, имеющего pH 7 и концентрацию 10 миллимоль на литр, а затем наносили на колонку, содержащую 1 ч. аффинной матрицы, полученной, как описано в примере 2. Затем аффинную колонку промывали фосфатным буфером до тех пор, пока УФ-мониторинг промывочных растворов не указывал на то, что весь несвязанный белок удален. Затем аффинную матрицу промывали цитратным буфером, имеющим pH 3,8 и концентрацию 0,2 миллимоль на литр, до тех пор, пока УФ-мониторинг промывочного раствора не указывал на то, что удаление связанного белка завершилось. Было обнаружено, что белок, содержащийся в этом промывочном растворе, является иммуноглобулином G.
В таблице 1, кроме того, представлены примеры новых аффинных лигандов настоящего изобретения, которые могут быть получены способом, описанным в примере 1, но с заменой 36,8 ч. хлорангидрида циануровой кислоты, использованного в примере 1, на соответствующее количество галогенсодержащего гетероциклического соединения, представленного в колонке II данной таблицы; а также, с заменой 19,8 ч. анилина, используемого в примере 1, на соответствующее количество амина, представленного в колонке III данной таблицы; и с заменой 2,74 ч. тирамина, используемого в примере 1, на соответствующее количество амина, представленного в колонке IV этой таблицы. Номера примеров указаны в колонке I данной таблицы.
Эти лиганды, описанные в примерах 4-38, могут быть присоединены к агарозной матрице методом, подробно описанным в примере 2, и использованы для очистки иммуноглобулина G методом, описанным в примере 3.
Пример 39
6 ч. этилендиамина добавляли к раствору 2,5 ч. 2-анилино-4-[
Figure 00000055
(4'-гидроксифенил)-этиламино] -6-хлор-1,3,5-триазина в 20 ч. толуола, и смесь нагревали при 100oC в течение 16 ч. Затем толуол выпаривали из смеси при пониженном давлении, и остаток 5 раз промывали 100 ч. воды, а затем сушили при 70oC.
В таблице 2, кроме того, представлены примеры новых аффинных лигандов настоящего изобретения, которые могут быть получены способом, описанным в примере 39, но с заменой 2,5 ч. 2-анилино-4- [
Figure 00000056
(4'-гидроксифенил)-этиламино]- 6-хлор-1,3,5-триазина, используемого в примере 39, на соответствующее количество хлортриазина, представленного в колонке II таблицы 2, и с заменой этилендиамина, используемого в примере 39, на соответствующее количество диамина или аминогидрокси- соединения, представленных в Колонке III таблицы 2.
Пример 58
В этом примере проиллюстрирован способ иммобилизации соединения, полученного в примере 39, на твердофазном носителе.
60 ч. агарозы, несущей эпоксидные группы, промывали 300 ч. воды, а затем 300 ч. раствора, состоящего из 5,95 ч. бикарбоната калия, растворенного в 180 ч. метанола и 120 ч. воды. 1 ч. соединения, полученного, как описано в примере 39, растворяли в 60 ч. метанола и добавляли к раствору 40 ч. водного раствора бикарбоната калия. Затем 100 ч. этого водного раствора метанола добавляли к полученной суспензии из 60 ч. агарозы, несущей эпокси-группы, и полученную суспензию слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Полученную матрицу на основе агарозы промывали сначала смесью 360 ч. метанола и 240 ч. воды, а затем 600 ч. воды.
Пример 59
Повторяли процедуру примера 3, за исключением того, что колонку, содержащую 1 ч. аффинной матрицы, которую получали как описано в примере 2, заменяли на колонку, содержащую 1 ч. аффинной матрицы, полученной, как описано в примере 58. Белок, содержащийся в промывочном растворе с pH 3,8, был снова идентифицирован как иммуноглобулин G.
Пример 60
В этом примере проиллюстрирована иммобилизация продукта, полученного в примере 39, на твердофазном носителе.
80 ч. агарозы последовательно промывали 1050 ч. воды, 1050 ч. 30%-ного водного раствора ацетона, 1050 ч. 70% водного раствора ацетона и 1425 ч. ацетона. 80 ч. агарозы затем суспендировали в 100 ч. ацетона, и полученную суспензию нагревали до 37oC. К агарозной суспензии добавляли 15 ч. пара-толуолсульфонилхлорида, растворенного в 15 ч. пиридина и 25 ч. ацетона, и полученную смесь выдерживали в течение 8 ч при 37oC. Затем активированную агарозу промывали 225 ч. ацетона, 225 ч. 70% водного раствора ацетона, затем 225 ч. 30% водного раствора ацетона, и наконец, 225 ч. воды.
45 ч. этой активированной матрицы промывали 225 ч. раствора, содержащего 2,3 ч. бикарбоната калия, растворенного в смеси 178 ч. метанола и 47 ч. воды. К активированной агарозной суспензии добавляли раствор 0,75 ч. соединения, полученного, как описано в примере 39, в смеси из 45 ч. метанола и 30 ч. воды, содержащей 1,5 ч. бикарбоната калия, а затем полученную смесь оставляли на 16 ч при комнатной температуре. Полученную аффинную матрицу промывали 270 ч. метанола и 180 ч. воды, содержащей 9 ч. бикарбоната калия, а затем 450 ч. воды.
Перед использованием, 115 ч. полученной аффинной матрицы суспендировали в растворе 0,36 ч. гидроксида натрия в 45 ч. воды.
Пример 61
При повторении процедуры примера 3, но с заменой колонки, содержащей 1 ч. аффинной матрицы, получение которой описано в примере 2, на колонку, содержащую 1 ч. аффинной матрицы, получение которой описано в примере 60, белок, содержащийся в промывочном растворе при pH 3,8, был снова идентифицирован как иммуноглобулин G.
Пример 62
10 ч. аффинной матрицы, полученной, как описано в примере 60, выдерживали в фосфатном буфере, имеющем pH 8,0, в течение 16 ч. Повторяли процедуру примера 3, за исключением того, что используемую там матрицу заменяли на эквивалентное количество этой новой аффинной матрицы, а вместо плазмы человека, используемой в примере 3, использовали бесклеточный супернатант от культуральной клеточной среды, содержащей мышиный иммуноглобулин. Белок, содержащийся в промывочном растворе с pH 3,8, снова был идентифицирован как мышиный иммуноглобулин М.
В таблице 3, кроме того, представлены примеры связывания новых аффинных лигандов настоящего изобретения, которые могут быть получены способом, описанным в примере 58, но с заменой нового аффинного лиганда, используемого в примере 58, на соответствующее количество нового аффинного лиганда, указанного в колонке II таблицы 3, и с заменой 39 ч. агарозы, активированной эпихлоргидрином и используемой в примере 58, на соответствующее количество углевода, указанного в колонке III таблицы 3, и активированного реагентом, указанным в колонке IV таблицы 3.
Пример 70
Повторяли процедуру получения лиганда, подробно описанную в примере 1, за исключением того, что 2,74 ч. тирамина подвергали реакции с 4,84 ч. 2-фенокси-4,6-дихлор-1,3,5- триазина вместо 4,82 ч. 2-анилино-4,6-дихлор-1,3,5-триазина с получением 2-фенокси-4-
Figure 00000057
[(4'-гидроксифенил)-этиламино]-6-хлор- 1,3,5-триазина, который может быть использован вместо 2-анилино-4-[
Figure 00000058
(4'-гидроксифенил)-этил- амино]-6-хлор-1,3,5-триазина для получения аффинной матрицы способом, описанным в примере 2. Аналогично, иммуноглобулин G может быть стандартным способом выделен из плазмы человека методом, описанным в примере 3.
Пример 71
Вместо 4,84 ч. 2-фенокси-4,6-дихлор-1,3,5- триазина, используемого в примере 70, были использованы 5,16 ч. 2-фенилтио-4,6-дихлор-1,3,5-триазина, в результате чего был получен 2-фенилтио-4-[
Figure 00000059
-(4'-гидроксифенил)-этиламино]-6- хлор- 1,3,5- триазин, который может быть аналогичным образом использован для очистки иммуноглобулина G.
Пример 72
В этом примере проиллюстрирован альтернативный способ продуцирования конъюгатов аффинный лиганд - матрица, как описано в примере 2 и примере 58.
10 ч. агарозы, несущей аминоэтиламино-группы, перемешивали при 0-5oC с 5 ч. ацетона и 5 ч. водного фосфатного буфера, pH 7, при концентрации, составляющей 0,5 моль на литр. К этой суспензии добавляли 2,5 ч. раствора, содержащего 1 ч. хлорангидрида циануровой кислоты в 10 ч. ацетона, а затем смесь перемешивали в течение 1 ч при температуре 0-5oC. Полученную агарозу, активированную дихлортриазином, последовательно промывали 50 ч. 50% водного раствора ацетона, 50 ч. воды, 50 ч. 50% водного раствора ацетона и 100 ч. воды. 20 ч. промытой агарозы, активированной дихлортриазином, добавляли к 20 ч. водного раствора, содержащего 1 ч. тирамина в 200 ч. воды, и полученную суспензию перемешивали в течение 16 ч при комнатной температуре. По истечении этого времени, полученную дериватизированную матрицу промывали 200 ч. воды и добавляли к 20 ч. водного раствора, содержащего 0,55 ч. анилина, растворенного в 200 ч. воды. Полученную суспензию перемешивали в течение 16 ч при 90oC, после чего, дериватизированную матрицу промывали 200 ч. воды.
Пример 73
При повторении процедуры примера 3, но с заменой колонки, содержащей 1 ч. аффинной матрицы, получение которой описано в примере 2, на колонку, содержащую 1 ч. аффинной матрицы, получение которой описано в примере 72, белок, содержащийся в промывочном растворе с pH 3,8, был снова идентифицирован как иммуноглобулин G.
Пример 74
В этом примере проиллюстрирован синтез библиотеки конъюгатов аффинный лиганд - матрица настоящего изобретения, которые могут быть затем скринированы для определения их белок-связывающих свойств.
1 ч. агарозы, несущей аминогруппы, смешивали с 1 ч. 1 М фосфатно-калиевого буфера, pH 7,0, и оставляли для осаждения под действием силы тяжести. Забуференную амином агарозу переносили в реакционный сосуд и смешивали при 0-5oC с 0,5 ч. 0,5 М фосфатно-калиевого буфера, pH 7,0, и 0,5 ч. ацетона. Затем добавляли 1/4 ч. раствора, содержащего 1 ч. хлорангидрида циануровой кислоты в 10 ч. ацетона, и смесь перемешивали в течение 1 ч при 0-5oC, после чего, смесь фильтровали и последовательно промывали 10 ч. 50% ацетона, 6 ч. воды, 6 ч. 50% ацетона и 10 ч. воды, в результате чего получали агарозу, активированную 2,4-дихлор-сим-триазин-6-илом.
1 ч. агарозы, активированной 2,4-дихлор-сим-триазин-6-илом, добавляли к 5 молярным эквивалентам аминового соединения, представленного в колонке II таблицы 4 и растворенного в 2-3 ч. раствора, содержащего 1 ч. ацетона и 1 ч. воды, а затем доводили до нейтрального pH путем добавления гидроксида натрия. Суспензию перемешивали в течение 24 ч при 30oC. Полученную агарозу, активированную монохлорсим-триазин-6- илом, последовательно промывали 10 ч. диметилформамида, 10 ч. раствора, содержащего 3 ч. пропан-2-ола и 7 ч. 0,2 М гидроксида натрия, и 10 ч. воды, а затем оставляли для оседания под действием силы тяжести.
1 ч. монохлор-сим-триазин-6-ил-активированной агарозы добавляли к 5 молярным эквивалентам аминового соединения, представленного в колонке III таблицы 4 и растворенного в 2-3 ч. раствора, содержащего 1 ч. диметилформамида и 1 ч. воды, а затем доводили до нейтрального pH путем добавления гидроксида натрия. Суспензию размешивали в течение 72 ч при 85-95oC. Полученные конъюгаты аффинный лиганд - матрица последовательно промывали 10 ч. диметилформамида, 10 ч. раствора, содержащего 3 ч. пропан-2-ола и 7 ч. 0,2 М гидроксида натрия, и 10 ч. воды, а затем оставляли для оседания под действием силы тяжести. Синтезировали библиотеку конъюгатов аффинный лиганд - матрица настоящего изобретения. Примеры которых указаны в колонке I таблицы 4.
Пример 128
В этом примере проиллюстрирован метод скрининга, в результате которого могут быть идентифицированы белок-связывающие свойства конъюгатов аффинный лиганд - матрица, описанных в примере 74.
Хроматографические колонки с 1 мл полного объема упаковывали конъюгатами аффинный лиганд - матрица примеров 75-127. Эти колонки уравновешивали путем интенсивной промывки 10 мл 50 мМ фосфатно-натриевого буфера, pH 8,0. На каждую хроматографическую колонку наносили 1 мл раствора, содержащего 1,5 мг IgG человека на 1 мл 50 мМ фосфатно-натриевого буфера, pH 8,0, а затем колонку промывали 10 мл 50 мМ фосфатно- натриевого буфера, pH 8,0, для удаления несвязанного иммуноглобулина G. Связанный IgG элюировали путем интенсивной промывки каждой колонки 5 мл 50 мМ цитратно-натриевого буфера, pH 3,0. Содержание IgG в промывках и фракциях элюции определяли путем измерения оптической плотности при 280 нм по отношению к буферному контролю. Анализ полученных результатов
выявил, что все конъюгаты аффинный лиганд - матрица примеров 75-127 связывались с IgG человека. Отсюда видно, что для конъюгатов аффинный лиганд - матрица примеров 92, 99, 101, 102, 103, 111, 113 и 119 было достигнуто почти количественное элюирование связанного IgG, в результате чего, можно считать, что эти конъюгаты имеют исключительную эффективность при разделении, выделении или очистке человеческого IgG.
Пример 129
Селективное связывание и элюирование рекомбинантного фактора свертывания крови VIIa (rFVIIa), нанесенного на аффинную матрицу примера 181, из клеточной культуральной среды.
Процедура:
0,85 мл осажденного объема аффинной матрицы, полученной, как описано в примере 181, упаковывали в 5х50 мм-колонку (Pharmacia HR 5/5) и уравновешивали 20 мл буфера А: 20 мМ Трис, 50 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2, pH 8,0. 5 мл супернатанта кондиционированной клеточной культуры ВHК, обогащенной 1,4 мг rFVIIa, наносили на упакованную колонку.
После отмывки несвязывающихся белков 10 мл буфера А, rFVIIa элюировали с использованием 5 мл буфера В: 20 мМ Трицитрат натрия, 50 мМ Трис, pH 8,0.
Скорость потока в процессе хроматографии составляла 0,3 мл/мин.
Поток, вытекающий с колонки, пропускали через устройство с УФ-монитором и собирали в 1 мл-фракции, и каждую фракцию анализировали на содержание rFVIIa и полного белка путем аналитической обращенно-фазовой высокоразрежающей жидкостной хроматографии (ОФ-ВРЖХ).
Результаты:
С помощью УФ-монитора было выявлено, что большая часть из УФ (280 нм)-абсорбирующегося материала выходила во время нанесения надосадочной фракции и последующей промывки буфером А. В процессе последующего элюирования буфером В, наблюдался заметный пик, который соответствовал ожидаемому размеру нанесенного количества rFVIIa.
ОФ-ВРЖХ-анализ собранных фракций показал, что 90% нанесенного количества rFVIIa выходило во фракциях в процессе элюции буфером В. Чистота rFVIIa в этих фракциях составляла выше 95%.
Результаты показали, что в данном случае достигается селективное связывание rFVIIa из обогащенных культуральных сред с используемым лигандом.
Пример 130
Очистка В-цепи1-29 инсулина - А-цепи1-21 А-А-К- инсулина на конъюгате аффинный лиганд - матрица примера 171
255 мг В-цепи1-29 инсулина - А-цепи1-21 Ala-Ala-Lys-инсулина (партия А202558) суспендировали в 51 мл H2O. Для солюбилизации предшественника добавляли 10 капель 1 М уксусной кислоты. Затем добавляли 0,2 М цитрат калия, pH 5,5 до полного объема 510 мл с получением раствора 0,12 мг/мл (ОФ-ВРЖХ- анализ). Измеренный pH составлял 5,53, ионная сила составляла 30,0 мСм/см, а окислительно-восстановительный потенциал составлял 273 мВ.
400 мл вышеуказанного раствора наносили на колонку Pharmacia К16 (1,6 х 6 см), упакованную 12 мл вышеуказанного конъюгата матрицы и уравновешенную в 0,2 М цитрате калия, pH 5,5, при 1,8 мл/мин при температуре окружающей среды. Эту колонку промывали в 50 мл 0,2 М цитрата калия, pH 5,5, а затем элюировали 0,1 М уксусной кислотой при 1,8 мл/мин. Было собрано 12 фракций по 5,0 мл.
Колонку очищали 50 мл 0,5 М NaOH и регенерировали 50 мл 0,1 М лимонной кислоты, 60% (об./об.) этанолом.
Образцы для ОФ-ВРЖХ- анализа разбавляли 2 М уксусной кислотой непосредственно перед анализом (см. табл. 5).
Таким образом, полный выход составил 83%.
Чистота продукта была определена с помощью ОФ-ВРЖХ-анализа и составила 94%. Оставшиеся примеси также были инсулиноподобными.
Пример 131
Очистка des-ThrB30 -инсулина на конъюгате аффинный лиганд - матрица примера 171
150 мг осадка des-ThrB30 -инсулина (INS-J-009) суспендировали в 50 мл H2O. Для растворения суспензии добавляли 5 капель 2 М уксусной кислоты. 0,2 М цитрат калия, pH 5,5, добавляли до объема 500 мл и получали концентрацию 0,076 мг/мл (ОФ-ВРЖХ-анализ). Измеренный pH составлял 5,52, ионная сила составляла 30 мСм/см, а окислительно- восстановительный потенциал составлял 264 мВ. 400 мл вышеуказанного раствора наносили на колонку Pharmacia К16 (1,6 х 6 см), упакованную 12 мл вышеуказанного конъюгата матрицы и уравновешенную в 0,2 М цитрате калия, pH 5,5, при 1,8 мл/мин при температуре окружающей среды. Эту колонку промывали в 50 мл 0,2 М цитрата калия, pH 5,5, а затем элюировали 0,1 М уксусной кислотой при 1,8 мл/мин. Были собраны 10 фракций по 5,0 мл.
Колонку очищали 50 мл 0,5 М NaOH и регенерировали 50 мл 0,1 М лимонной кислоты, 60% (об./об.) этанолом.
Образцы для ОФ-ВРЖХ- анализа разбавляли 2 М уксусной кислотой непосредственно перед анализом (см. табл. 6).
Таким образом, полный выход составил 71%.
Чистота продукта, определенная с помощью ОФ-ВРЖХ-анализа, составляла 91%, а остальные примеси являлись инсулиноподобными.
Пример 132
Очистка В-цепи1-29 инсулина-А-цепи1-21 А-А-К- инсулина на конъюгате аффинный лиганд - матрица примера 145
Два литра центрифугированного бульона (партия 628) доводили до pH 5,5 путем добавления 5 М NaOH, фильтровали через фильтр Leitz Tiefenfilter (Seitz EK), а затем снова фильтровали через фильтр Leitz Tiefenfilter (Seitz EKS). Концентрация, измеренная с помощью ОФ-ВРЖХ, составляла 0,006 мг/мл. Измеренная ионная сила составляла 12,2 мСм/см, а окислительно-восстановительный потенциал составлял 316 мВ.
1000 мл вышеуказанного раствора наносили на колонку Pharmacia К16 (1,6 х 6 см), упакованную 12 мл вышеуказанного конъюгата матрицы и уравновешенную в 0,2 М цитрате калия, pH 5,5, при 1,8 мл/мин при температуре окружающей среды. Колонку промывали в 50 мл 0,2 М цитрата калия, pH 5,5, а затем элюировали 0,1 М уксусной кислотой при 1,8 мл/мин. Было собрано 11 фракций по 5,0 мл.
Колонку очищали 50 мл 0,5 М NaOH и регенерировали 50 мл 0,1 М лимонной кислоты, 60% (об./об.) этанолом.
Образцы для ОФ-ВРЖХ-анализа разбавляли 2 М уксусной кислотой непосредственно перед анализом (см. табл. 7).
Таким образом, полный выход составил 63%.
Чистота продукта, определенная с помощью ОФ-ВРЖХ-анализа, составляла до 88%. Остальные примеси были инсулиноподобными.
Пример 133
Очистка В-цепи1-29 инсулина-А-цепи1-21 А-А-К- инсулина на конъюгате аффинный лиганд - матрица примера 171
Два литра центрифугированного бульона (партия 628) доводили до pH 5,5 путем добавления 5 М NaOH, фильтровали через фильтр Leitz Tiefenfilter (Seitz EK), а затем снова фильтровали через фильтр Leitz Tiefenfilter (Seitz EKS). Концентрация, измеренная с помощью ОФ-ВРЖХ, составляла 0,006 мг/мл. Измеренная ионная сила составляла 12,2 мСм/см, а окислительно-восстановительный потенциал составлял 316 мВ.
1000 мл вышеуказанного раствора наносили на колонку Pharmacia К16 (1,6 х 6 см), упакованную 12 мл вышеуказанного конъюгата матрицы и уравновешенную в 0,2 М цитрате калия, pH 5,5, при 1,8 мл/мин при температуре окружающей среды. Колонку промывали в 50 мл 0,2 М цитрата калия, pH 5,5, а затем элюировали 0,1 М уксусной кислотой при 1,8 мл/мин. Было собрано 11 фракций по 5,0 мл.
Колонку очищали 50 мл 0,5 М NaOH и регенерировали 50 мл 0,1 М лимонной кислоты, 60% (об./об.) этанолом.
Образцы для ОФ-ВРЖХ-анализа разбавляли 2 М уксусной кислотой непосредственно перед анализом (см. табл. 8).
Таким образом, полный выход составил 74%.
Чистота продукта, определенная с помощью ОФ-ВРЖХ-анализа, составляла до 86%. Остальные примеси были инсулиноподобными.
Пример 134
Очистка В-цепи (1-29) ЕЕАЕРК-инсулина- А-цепи (1- 21) ААК-инсулина на конъюгате аффинный лиганд - матрица примера 171
Центрифугированный дрожжевой бульон (партия Y44) фильтровали через фильтр Letz Tiefenfilter (Seitz EK) с получением концентрации 0,35 мг/мл (ОФ-ВРЖХ-анализ). Измеренный pH составлял 5,27, ионная сила составляла 7,38 мСм/см, а окислительно-восстановительный потенциал составлял 221 мВ.
120 мл вышеуказанного раствора наносили на колонку Pharmacia К16 (1,6 х 6 см), упакованную 12 мл вышеуказанного конъюгата матрицы и уравновешенную в 0,2 М цитрате калия, pH 5,5, при 1,8 мл/мин при температуре окружающей среды. Колонку промывали в 50 мл 0,2 М цитрата калия, pH 5,5, а затем элюировали 0,1 М уксусной кислотой при 1,8 мл/мин. Было собрано 11 фракций по 5,0 мл.
Колонку очищали 50 мл 0,5 М NaOH и регенерировали 50 мл 0,1 М лимонной кислоты, 60% (об./об.) этанолом.
Образцы для ОФ-ВРЖХ-анализа разбавляли 2 М уксусной кислотой непосредственно перед анализом (см. табл. 9).
Таким образом, полный выход составил 79%.
Чистота продукта была определена с помощью ОФ-ВРЖХ-анализа и составила 93%. Оставшиеся примеси также были инсулиноподобными.
Пример 135
Очистка В-цепи1-29 [AspB28]-инсулина -А- цепи 1-21А-А-К-инсулина на конъюгате аффинный лиганд-матрица примера 171
Центрифугированный бульон (партия GSG9414) доводили до pH 5,5 путем добавления 5 М NaOH, фильтровали через фильтр Leitz Tiefenfilter (Seitz EK), а затем снова фильтровали через фильтр Leitz Tiefenfilter (Seitz EKS). Концентрация, измеренная с помощью ОФ-ВРЖХ, составляла 0,02 мг/мл. Измеренная ионная сила составляла 17,0 мСм/см, а окислительно-восстановительный потенциал составлял 308 MB.
800 мл вышеуказанного раствора наносили на колонку Pharmacia К16 (1,6 х 6 см), упакованную 12 мл вышеуказанного конъюгата матрицы и уравновешенную в 0,2 М цитрате калия, pH 5,5, при 1,8 мл/мин при температуре окружающей среды. Эту колонку промывали в 50 мл 0,2 М цитрата калия, pH 5,5, а затем элюировали 0,1 М уксусной кислотой при 1,8 мл/мин. Были собраны 12 фракций по 5,0 мл.
Колонку очищали 50 мл 0,5 М NaOH и регенерировали 50 мл 0,1 М лимонной кислоты, 60% (об./об.) этанолом.
Образцы для ОФ-ВРЖХ-анализа разбавляли 2 М уксусной кислотой непосредственно перед анализом (см. табл. 10).
Таким образом, полный выход составил 75%.
Чистота продукта, определенная с помощью ОФ-ВРЖХ-анализа, составляла 84%, а остальные примеси являлись инсулиноподобными.
Пример 136
В данном примере, кроме того, проиллюстрирован способ скрининга, посредством которого могут быть идентифицированы белок-связывающие свойства конъюгатов аффинный лиганд - матрица настоящего изобретения.
Библиотеку конъюгатов аффинный лиганд - матрица настоящего изобретения синтезировали, как описано в примере 74, за исключением того, что 5 молярных эквивалентов аминового соединения, представленного в колонке II таблицы 4, заменяли на соответствующее количество аминового соединения, представленного в колонке II таблицы 5, а 5 молярных эквивалентов аминового соединения, представленного в колонке III таблицы 4, заменяли на соответствующее количество аминового соединения, представленного в колонке III таблицы 5. Была синтезирована библиотека конъюгатов аффинный лиганд - матрица настоящего изобретения. Примеры которой указаны в колонке I таблицы 5.
Хроматографические колонки с полным объемом 1 мл упаковывали конъюгатами аффинный лиганд - матрица примеров 137-180. Колонки уравновешивали путем интенсивной промывки 10 мл 0,2 М ацетата натрия, 0,1 М натрийхлоридным буфером, pH 5,0. 12 мл осветленной культуральной жидкости, содержащей 50 мг/мл предшественника человеческого инсулина, наносили на каждую хроматографическую колонку, которую затем промывали 12 мл 0,2 М ацетата натрия, 0,1 М натрийхлоридным буфером, pH 5,0 для удаления несвязанного вещества. Связанный предшественник человеческого инсулина элюировали путем интенсивной промывки каждой колонки 3 мл 2 М уксусной кислоты. Содержание предшественника человеческого инсулина в сквозном потоке, в промывке и во фракциях элюции определяли посредством высокоразрешающей жидкостной хроматографии (ВРЖХ) с использованием обращенно-фазовой колонки с двуокисью кремния С18 (4 х 250 м) и системы растворителей, содержащей буфер А (0,2 М сульфат натрия, 40 мМ фосфорная кислота и 10% (об./об.) ацетонитрил, pH 2) и буфер В (50% (об./об.) ацетонитрил) и подаваемой со скоростью потока 1 мл в минуту, и в соотношении 55% буфера А к 45% буферу В. Время элюции предшественника человеческого инсулина определяли путем сравнения со стандартными значениями.
Анализ результатов показал, что все конъюгаты аффинный лиганд - матрица примеров 139, 140, 145, 148, 153, 159, 162, 163, 164, 166, 167, 170, 171, 173 связывались с предшественником человеческого инсулина, который был проэлюирован в условиях, описанных в этом примере. Исходя из этого следует отметить, что конъюгаты аффинный лиганд - матрица примеров 139, 140, 145, 148, 153, 159, 162, 163, 164, 166, 167, 170, 171, 173 обладают исключительной эффективностью при разделении, выделении и очистке предшественника человеческого инсулина (см. табл. 11).
Пример 181
В данном примере продемонстрирован способ синтеза конъюгатов аффинный лиганд - матрица настоящего изобретения, которые являются эффективными для очистки фактора VII.
Конъюгат аффинный лиганд - матрица настоящего изобретения синтезировали, как описано в примере 74, за исключением того, что 5 молярных эквивалентов аминового соединения, представленного в колонке II таблицы 4, заменяли соответствующим количеством 2- аминобензимидазола, а 5 молярных эквивалентов аминового соединения, представленного в колонке III таблицы 4, заменяли на 3-амино-2-нафтойную кислоту. Этот конъюгат аффинный лиганд - матрица может быть использован для очистки фактора VIla примера 129 настоящего изобретения.
Пример 182
Очистка В-цепи1-29 ЕЕАЕРК-инсулина-А-цепи1-21 А-А-К-инсулина на конъюгате аффинный лиганд - матрица примера 171
50 мл ионообменного очищенного предшественника инсулина (В- цепь1-29-ЕЕАЕРК-инсулина-А-цепь1-21 А-А-К-инсулина при 2,2 мг/мл) наносили на колонку Pharmacia К16 (1,6 х 6 см), упакованную 12 мл конъюгата матрицы и уравновешенную в 0,2 М цитрате калия, pH 5,5, при 1,8 мл/мин при комнатной температуре. Эту колонку промывали в 50 мл 0,1 М цитрата калия, 0,2 М сульфата калия, pH 5,5, а затем элюировали 0,1 М уксусной кислотой при 1,8 мл/мин. Были собраны 5,0 мл-фракции.
Колонку очищали 50 мл 0,5 М NaOH и регенерировали 50 мл 0,1 М лимонной кислоты, 60% (об./об.) этанолом.
Образцы для ОФ-ВРЖХ-анализа разбавляли 2 М уксусной кислотой непосредственно перед анализом (см. табл. 12).
Была продемонстрирована динамическая емкость связывания 9,5 мг/мл матрицы с выходом предшественника 88%.

Claims (82)

1. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица, содержащие лиганд общей формулы (а)
Figure 00000060

где R1 представляет атом водорода, алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, гидроксиалкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, циклогексильную группу, аминогруппу, фенильную группу, нафтильную группу, 1-фенилпиразольную группу, индазольную группу, бензтиазольную группу, бензоксазольную группу или бензимидазольную группу, где каждое из бензольного, нафталинового, 1-фенилпиразольного, индазольного, бензтиазольного, бензоксазольного или бензимидазольного колец необязательно замещено одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из группы, включающей алкильные группы, содержащие 1-6 атомов углерода; алкоксигруппы, содержащие 1-6 атомов углерода; ацилокси- или ациламиногруппы, содержащие 1-6 атомов углерода; аминогруппы, гидроксильные группы; карбоксильные группы; сульфокислотные группы; карбамоильные группы; сульфамоильные группы; алкилсульфонильные группы, содержащие 1-6 атомов углерода; или атомы галогена;
Y - атом кислорода, атом серы или группа N-R2;
Z - атом кислорода, атом серы или группа N-R3;
R2 и R3 каждый независимо представляет атом водорода; алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода; гидроксиалкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода; бензильную группу или
Figure 00000061
фенилэтильную группу;
R4, R5 и R6 каждый независимо представляет атом водорода; гидроксильную группу; алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода; алкоксигруппу, содержащую 1-6 атомов углерода, аминогруппу; ацилокси- или ациламиногруппу, содержащую 1-6 атомов углерода; карбоксильную группу, сульфоксильную группу, карбамоильную или сульфамоильную группу; алкилсульфонильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода; или атом галогена;
один из Х - атом азота, а другой Х - атом азота или атом углерода, несущие атом хлора или цианогруппу;
Q представляет бензольное, нафталиновое, 1-фенилпиразольное, индазольное, бензтиазольное, бензоксазольное или бензимидазольное кольцо;
n = 0 - 6, целое число;
p = 0 - 20, целое число,
и где лиганд связан с матрицей-носителем в положении А необязательно посредством спейсерной группы, расположенной между матрицей и лигандом, при условии, что формула (а) не включает продукты реакции соединений 4-хлор-2,6-ди(фениламино)-1,3,5-триазин-3'-сульфокислоты, 4-хлор-2,6-ди(фениламино)-1,3,5-триазин-3', 2"-дисульфокислоты, и 4-хлор-2-(4"-аминофениламино)-1,3,5-триазин-3',2"-дисульфокислоты с Декстраном Т 500.
2. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по п.1, где необязательная спейсерная группа, расположенная между лигандом и матрицей, представлена общей формулой (b)
-T-[-L-V-]m-,
где Т - атом кислорода, атом серы или группа N-R7, где R7 - атом водорода или алкильная группа, содержащая 1-6 атомов углерода;
V представляет атом кислорода, атом серы, группу -СОО-, группу CONH, или группу NHCO, или группу -РO3Н-, группу NH-арилен-SO2-СН2-СН2, или группу N-R8, где R8 - атом водорода или алкильная группа, содержащая 1-6 атомов углерода;
L представляет необязательно замещенную углеводородную связь, содержащую 2-20 атомов углерода;
m = 0 или 1.
3. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица, которые представлены общей формулой (1)
Figure 00000062

где R1, Y, Z, R2, R3 R4, R5, R6, X, Q, n и p определены выше;
T - атом кислорода, атом серы или группа N-R7;
V - атом кислорода, атом серы, группа -СОО-, группу CONH, или группа NHCO или группа -РO3Н-, группа NН-арилен-SO2-СН2-СН2, или группа N-R8;
R7 и R8 каждый независимо - атом водорода или алкильная группа, содержащая 1-6 атомов углерода;
L представляет необязательно замещенную углеводородную связь, содержащую 2 - 20 атомов углерода;
m = 0 или 1;
М - остаток матрицы-носителя.
4. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где М - остаток матрицы-носителя, который может быть любым соединением или материалом, находящимся или ненаходящимся в виде частиц, растворимым или нерастворимым, пористым или непористым, который может быть использован в сочетании с аффинными лигандами для образования новых конъюгатов аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов и который обеспечивает удобный способ отделения аффинных лигандов от растворимых веществ в контактирующем растворе.
5. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где R1 представляет фенильную или нафтильную группу, каждая из которых необязательно замещена на бензольном или нафталиновом кольце одной или несколькими группами, независимо выбранными из гидроксильных и карбоксильных групп.
6. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где R2 - атом водорода.
7. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где R3 - атом водорода.
8. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где R4 - атом водорода, гидроксильная группа, карбоксильная группа или аминогруппа.
9. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где R5 представляет атом водорода, гидроксильную группу, карбоксильную группу или аминогруппу.
10. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где R6 - атом водорода, гидроксильная группа, карбоксильная группа или аминогруппа.
11. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где R7 - атом водорода.
12. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где Т - атом кислорода или группа NH.
13. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где Y - N-R2, где R2 определен выше.
14. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где Z - N-R3, где R3 определен выше.
15. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где оба Х - атом азота.
16. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где Q - бензольное или нафталиновое кольцо.
17. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где n = 0 или 2.
18. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где р = 0 или 2.
19. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где m = 0 или 1.
20. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где L представляет этильную, пропильную, гидроксипропильную, бутильную, пентильную, гексильную, октильную или децильную группу, а V и m определены выше.
21. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где V - атом кислорода или группа NH, a L и m определены выше.
22. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где m = 1, a L и V определены выше.
23. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где остаток матрицы-носителя М представляет необязательно активированную агарозу, двуокись кремния, целлюлозу, стекло, мелкий жемчуг, гидроксиэтилметакрилат, полиакриламид, стиролдивинилбензол, Hyper D, перфторуглеводороды.
24. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, где М представляет агарозу, необязательно активированную трезилом, сульфонилхлоридом, тозилом, винилсульфоном, или эпокси.
25. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, выбранные из
i)
Figure 00000063

ii)
Figure 00000064

iii)
Figure 00000065

iv)
Figure 00000066

v)
Figure 00000067

vi)
Figure 00000068

vii)
Figure 00000069

viii)
Figure 00000070

где М определен выше.
26. Способ получения новых конъюгатов аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, включающий взаимодействие в любом порядке галогенсодержащего гатероциклического соединения общей формулы (II)
Figure 00000071

где X имеют значения, указанные выше;
W - атом галогена,
(i) с соединением общей формулы (III)
R1-(CH2)p-Y-H
где символы R1, p и Y определены выше
(ii) с соединением общей формулы (IV)
Figure 00000072

где R4, R5, R6, Q, Z и n определены выше и
(iii) либо с необязательно дериватезированной матрицей-носителем общей формулы (V)
H-T-[-L-V-]m-M,
где L, М, V, Т и m определены выше.
27. Способ получения новых конъюгатов аффинный лиганд - матрица по любому из предыдущих пунктов, включающий взаимодействие в любом порядке галогенсодержащего гетероциклического соединения общей формулы (II) по п.26: (i) с соединением общей формулы (III) по п.26, (ii) с соединением общей формулы (IV) по п.26 и (iii) со связующим звеном общей формулы (VI)
H-T-L-V-H,
где L, V и Т определены выше,
с получением соединения общей формулы (VII)
Figure 00000073

где R1, R4, R5, R6, Т, Q, L, V, X, Y, Z, m, n и р определены выше,
и последующей реакцией соединения общей формулы с (VII) матрицей-носителем.
28. Новые аффинные лиганды общей формулы (XII)
Figure 00000074

где R1, R4, R5, R6 Q, X, Y, Z, n и p указаны выше;
галоген представляет атом фтора, хлора, брома или иода, при условии, что формула (XII) не включает такие соединения, как 4-хлор-2,6-ди(фениламино)-1,3,5-триазин-3'-сульфокислота, 4-хлор-2,6-ди(фениламино)-1,3,5-триазин-3', 2''-дисульфокислота и 4-хлор-2-(4"-аминофениламино)-1,3,5-триазин-3', 2"-дисульфокислота.
29. Способ связывания новых аффинных лигандов общей формулы (XII) по п. 28 с матрицей новой формулы (V) по п.26 взаимодействием новых аффинных лигандов с матрицей при температуре от -20°С до 121°С необязательно в присутствии агента, связывающего кислоту.
30. Новые аффинные лиганды общей формулы (XIII)
Figure 00000075

где R1, R4, R5, R6, Q, X, Y, Z, m, n и p указаны выше,
j = 2 - 20, целое число.
31. Способ получения вышеуказанных новых аффинных лигандов общей формулы (XIII) по п.30 путем взаимодействия соединения общей формулы (XII) по п.28 с алкилендиамином общей формулы H2N-(CH2)j-NH2 при 0 - 100°С в присутствии агента, связывающего кислоту.
32. Новые аффинные лиганды общей формулы (XIV)
Figure 00000076

где R1, R4, R5, Q, X, Y, Z, m, n и p указаны выше;
q = 0 или 1;
j = 2 - 20, целое число.
33. Способ получения новых аффинных лигандов общей формулы (XIV) по п.32 путем взаимодействия соединения общей формулы (XII) по п.28 с аминогидроксисоединением общей формулы Н2N-(СН2)j-(СО)q-ОН2 при 0 - 100°С необязательно в присутствии агента, связывающего кислоту.
34. Новые аффинные лиганды общей формулы (VIII)
Figure 00000077

где R1, R4, R5, R6, L, Q, T, V, X, Y, Z, m, n и p определены выше;
R9 представляет атом водорода или алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода;
R10 карбонильную группу, метиленовую группу, группу -NH-CH2- или группу -S-CH2-.
35. Новые аффинные лиганды общей формулы (XV)
Figure 00000078

где R1, R4, R5, R6, Q, n и p определены выше,
при условии, что формула (XV) не включает соединения 4-хлор-2,6-ди(фенил-амино)-1,3,5-триазин-3'-сульфокислоты, 4-хлор-2,6-ди(фенил-амино)-1,3,5-триазин-3', 2"-дисульфокислоты, и 4-хлор-2-(4"-аминофениламино)-1,3,5-триазин-3',2"-дисульфокислоты.
36. Новые аффинные лиганды общей формулы (XVI)
Figure 00000079

где R1, R4, R5, R6, Q, n и p указаны выше;
j = 2 - 20, целое число.
37. Аффинные лиганды по любому из пп.28, 30, 32, 34, 35 или 36, где R1 представляет фенильную или нафтильную группу, каждая из которых необязательно замещена на бензольном или нафталиновом кольце одной или несколькими группами, независимо выбранными из гидроксильных групп и карбоксильных групп.
38. Аффинные лиганды по любому из пп.28, 30, 32, 34, 35 или 36, где R4 - атом водорода, гидроксильная группа, карбоксильная группа или аминогруппа.
39. Аффинные лиганды по любому из пп.28, 30, 32, 34, 35 или 36, где R5 - атом водорода, гидроксильная, карбоксильная или аминогруппа.
40. Аффинные лиганды по любому из пп.28, 30, 32, 34, 35 или 36, где R6 - атом водорода, гидроксильная, карбоксильная или аминогруппа.
41. Аффинные лиганды по любому из пп.28, 30, 32, 34, 35 или 36, где Q бензольное или нафталиновое кольцо.
42. Аффинные лиганды по любому из пп.28, 30, 32 или 34, где X - атом азота.
43. Аффинные лиганды по любому из пп.28, 30, 32, 34 или 35, где Y - группа -NH-.
44. Аффинные лиганды по любому из пп.28, 30, 32, 34 или 35, где Z - группа -NH-.
45. Аффинные лиганды по любому из пп.28, 30, 32, 34, 35 или 36, где n = 0 или 2.
46. Аффинные лиганды по любому из пп.28, 30, 32, 34, 35 или 36, где p = 0 или 2.
47. Аффинные лиганды по любому из пп.30, 32 или 36, где j = 2, 4 или 6.
48. Аффинные лиганды по п.34, где L представляет этильную, бутильную, или гидроксильную группу.
49. Аффинные лиганды по п.34, где Т - группа -NH-.
50. Аффинные лиганды по п.34, где V - группа -NH-.
51. Аффинные лиганды по п.34, где m = 1.
52. Новые аффинные лиганды общей формулы (XI)
Figure 00000080

где j = 2 - 20, целое число.
53. Аффинные лиганды по любому из пп.28-51, выбранные из группы, включающей
Figure 00000081

Figure 00000082

Figure 00000083

Figure 00000084

Figure 00000085

Figure 00000086

Figure 00000087

Figure 00000088

Figure 00000089

Figure 00000090

Figure 00000091

Figure 00000092

Figure 00000093

54. Аффинные лиганды по любому из пп.28, 30, 32, 34-53, применимые для получения конъюгатов аффинный лиганд - матрица.
55. Способ связывания новых аффинных лигандов общей формулы (VII) по п. 27, общей формулы (XIII) по п.30, общей формулы (XVI) по п.36 и общей формулы (XI) по п.52 с углеводной матрицей или с матрицей из органического полимера путем взаимодействия указанной углеводной матрицы или матрицы из органического полимера с активирующим агентом и последующей реакции активированной матрицы с новым аффинным лигандом необязательно в присутствии агента, связывающего кислоту.
56. Способ связывания новых аффинных лигандов общей формулы (XIV) по п. 32 с углеводной матрицей или с матрицей из органического полимера путем конденсации с указанной матрицей.
57. Способ связывания новых аффинных лигандов общей формулы (VII) по п. 21, общей формулы (XIII) по п.30, общей формулы (XVI) по п. 36 и общей формулы (XI) по п.52 с матрицами из окиси металла, стекла или двуокиси кремния, необязательно с покрытием из органического полимера, путем взаимодействия такой матрицы из окиси металла, стекла или двуокиси кремния, имеющей необязательное покрытие, с активирующим агентом и последующей реакции этой активированной матрицы с новым аффинным лигандом необязательно в присутствии агента, связывающего кислоту.
58. Способ связывания новых аффинных лигандов общей формулы (XIV) по п. 32 с матрицами из окиси металла, стекла или двуокиси кремния, имеющими необязательное покрытие из органического полимера, путем конденсации с указанной матрицей.
59. Способ связывания новых аффинных лигандов общей формулы (XV) по п. 35, и общей формулы (XII) по п.28 с матрицей общей формулы (V) по п.26 путем взаимодействия новых аффинных лигандов с матрицей при температурах от -20°С до 121°C, необязательно в присутствии агента, связывающего кислоту.
60. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица, полученные по любому из пп.26, 27, 29, 54-58.
61. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по любому из пп.1-25, применимые для аффинной хроматографии с целью разделения, выделения, очистки, идентификации или количественного определения белковых материалов.
62. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по п.61, отличающиеся тем, что белковыми материалами являются IgG, IgM, IgA, инсулины, фактор VII или гормон роста человека, их аналоги, производные, и фрагменты, и предшественники.
63. Способ проведения аффинной хроматографии для разделения или очистки белковых материалов, отличающийся тем, что в качестве биоспецифического лиганда используют конъюгат по п.1, отвечающий формуле (а).
64. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по п.61, отличающиеся тем, что белковыми материалами являются иммуноглобулины или их подклассы, фрагменты, предшественники или производные независимо от того, происходят ли они от природных или от рекомбинантных источников.
65. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по п.61, отличающиеся тем, что белковыми материалами являются иммуноглобулин G(IgG), иммуноглобулин М (IgM), иммуноглобулин A (IgA), или их подклассы, фрагменты, предшественники или производные независимо от того, происходят ли они от природных или от рекомбинантных источников.
66. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по п.61, отличающиеся тем, что белковыми материалами являются инсулины или аналоги инсулинов, их производные, фрагменты и предшественники независимо от того, происходят ли они от природных или от рекомбинантных источников.
67. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по п.61, отличающиеся тем, что белковыми материалами являются FVII или его аналоги, производные, фрагменты и предшественники, независимо от того, происходят ли они от природных или рекомбинантных источников.
68. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по п.61, отличающиеся тем, что включают лиганд, выбранный из следующих лигандов:
Figure 00000094

Figure 00000095

Figure 00000096

где лиганд присоединен к матрице-носителю в положении (А) необязательно посредством спейсерной группы, представленной общей формулой (b), определенной выше.
69. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по п.68, отличающиеся тем, что лигандом является лиганд 11a.
70. Конъюгаты аффинный лиганд - матрица по п.68 или 69, отличающиеся тем, что матрицей-носителем является необязательно активированная агароза, целлюлоза, кремнезем или стекло.
71. Способ хроматографии иммуноглобулинов, включающий их нанесение на конъюгаты аффинный лиганд - матрица, отличающийся тем, что нанесение осуществляют на конъюгат по любому из пп.1 и 3, при рН 5 - 12, а затем удаляют, элюируют или десорбируют путем снижения рН до 4,9 или ниже.
72. Способ по п.71, отличающийся тем, что при хроматографии осуществляют разделение иммуноглобулинов.
73. Способ по п.71, отличающийся тем, что при хроматографии осуществляют выделение иммуноглобулинов.
74. Способ по п.71, отличающийся тем, что при хроматографии осуществляют очистку иммуноглобулинов.
75. Способ по п.71, отличающийся тем, что при хроматографии осуществляют идентификацию иммуноглобулинов.
76. Способ по п.71, отличающийся тем, что при хроматографии осуществляют количественную оценку иммуноглобулинов.
77. Способ хроматографии инсулинов, их аналогов, производных и предшественников, включающий их нанесение на конъюгаты аффинный лиганд - матрица, отличающийся тем, что нанесение осуществляют на конъюгат по любому из пп. 1 и 3 при рН 4,0 - 4,9, а затем удаляют, элюируют или десорбируют путем снижения рН до 3,99 или ниже или повышения рН до 9,01 или выше.
78. Способ по п.77, отличающийся тем, что при хроматографии осуществляют разделение инсулинов, их аналогов, производных и предшественников.
79. Способ по п.77, отличающийся тем, что при хроматографии осуществляют выделение инсулинов, их аналогов, производных и предшественников.
80. Способ по п.77, отличающийся тем, что при хроматографии осуществляют очистку инсулинов, их аналогов, производных и предшественников.
81. Способ по п.77, отличающийся тем, что при хроматографии осуществляют идентификацию инсулинов, их аналогов, производных и предшественников.
82. Способ по п.77, отличающийся тем, что при хроматографии осуществляют количественную оценку инсулинов, их аналогов, производных и предшественников.
83. Способ выделения рекомбинантного FVIIa из среды с клеточной культурной путем селективного связывания FVIIa с конъюгатом аффинный лиганд - матрица
Figure 00000097

где М - остаток агарозы,
при котором FVIIa наносят на указанный конъюгат аффинный лиганд - матрица в присутствии 5мМ Са2+, а затем элюируют.
RU98107896/12A 1995-09-20 1996-09-19 Новые аффинные лиганды и их применение RU2175261C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9519197.9A GB9519197D0 (en) 1995-09-20 1995-09-20 Novel affinity ligands and their use
GB9519197.9 1995-09-20
GB9519197,9 1995-09-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU98107896A RU98107896A (ru) 2000-02-20
RU2175261C2 true RU2175261C2 (ru) 2001-10-27

Family

ID=10780990

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU98107896/12A RU2175261C2 (ru) 1995-09-20 1996-09-19 Новые аффинные лиганды и их применение

Country Status (16)

Country Link
EP (1) EP0959975B1 (ru)
JP (1) JP4824147B2 (ru)
KR (1) KR100537386B1 (ru)
CN (1) CN1089617C (ru)
AR (1) AR003634A1 (ru)
AT (1) ATE285827T1 (ru)
AU (1) AU702901B2 (ru)
CA (1) CA2232626C (ru)
DE (1) DE69634142T2 (ru)
DK (1) DK0959975T3 (ru)
ES (1) ES2236748T3 (ru)
GB (1) GB9519197D0 (ru)
MY (1) MY127957A (ru)
RU (1) RU2175261C2 (ru)
WO (1) WO1997010887A1 (ru)
ZA (1) ZA967917B (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA014365B1 (ru) * 2004-07-27 2010-10-29 Проуметик Байосайенсез Лимитед Замещённые триазины в качестве лигандов белка приона и их применение для обнаружения или удаления прионов
RU2440582C2 (ru) * 2004-12-23 2012-01-20 Ново Нордиск А/С Аффинные лиганды, связывающие антитела
RU2541429C2 (ru) * 2004-10-21 2015-02-10 Джи-И Хелткер Байо-Сайенсиз АБ Хроматографический лиганд

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5760187A (en) * 1996-02-22 1998-06-02 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Purification process of a human growth hormone
JP4425994B2 (ja) 1996-08-30 2010-03-03 ウプフロント クロマトグラフィー アクティーゼルスカブ 免疫グロブリンの単離
EP0945447A1 (en) * 1998-03-27 1999-09-29 Janssen Pharmaceutica N.V. Trisubstituted 1,3,5-triazine derivatives for treatment of HIV infections
GB9910807D0 (en) * 1999-05-10 1999-07-07 Prometic Biosciences Limited Novel detoxification agents and their use
KR100820605B1 (ko) 1999-09-24 2008-04-08 얀센 파마슈티카 엔.브이. 항바이러스 조성물
US6153364A (en) * 1999-12-16 2000-11-28 Eastman Kodak Company Photographic processing methods using compositions containing stain reducing agent
US6153365A (en) 1999-12-16 2000-11-28 Eastman Kodak Company Photographic processing compositions containing stain reducing agent
CA2407276A1 (en) 2000-04-28 2001-11-08 Accurate Polymers, Ltd. Simulated activity of protein a displayed by ligands attached to a cellulose bead surface
US6440651B1 (en) 2000-10-05 2002-08-27 Eastman Kodak Company Concentrated photographic fixer additive and fixing compositions and method of photographic processing
US6288227B1 (en) 2000-10-05 2001-09-11 Eastman Kodak Company Solublized 2,6-dinaphthylaminotriazines
US6943162B2 (en) 2001-01-26 2005-09-13 Smithkline Beecham Corporation Piperazinyltriazines as estrogen receptor modulators
US7173032B2 (en) * 2001-09-21 2007-02-06 Reddy Us Therapeutics, Inc. Methods and compositions of novel triazine compounds
GB0224446D0 (en) * 2002-10-21 2002-11-27 Univ Cambridge Tech Affinity adsorbents for immunoglobulins
GB0228724D0 (en) 2002-12-09 2003-01-15 Prometic Biosciences Ltd Multidimensinal libraries
US7109040B2 (en) * 2002-12-13 2006-09-19 Agilent Technologies, Inc. Modular isotope coding approach to proteomic analysis
US7700743B2 (en) * 2003-07-22 2010-04-20 Millipore Corporation Immobilised affinity medium and its use in separation
SE0400501D0 (sv) * 2004-02-27 2004-02-27 Amersham Biosciences Ab Antibody purification
WO2005082483A1 (en) * 2004-02-27 2005-09-09 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab A process for the purification of antibodies
SE0401665D0 (sv) * 2004-06-24 2004-06-24 Amersham Biosciences Ab Purification of immunoglobulins
WO2006024175A1 (en) * 2004-09-03 2006-03-09 Prometic Biosciences Inc. 2,4,6-TRIAMINO-S-TRIAZINE-BASED COMPOUNDS WHICH BIND TO THE TAIL (Fc) PORTION OF IMMUNOGLOBULINS AND THEIR USE
JP2008525381A (ja) 2004-12-23 2008-07-17 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 関心のあるビタミンｋ依存性タンパク質を含んでなる組成物中におけるタンパク質混入物の量の減少
GB0509438D0 (en) * 2005-05-09 2005-06-15 Prometic Biosciences Ltd Affinity adsorbets for fibrinogen
GB0509443D0 (en) * 2005-05-09 2005-06-15 Prometic Biosciences Ltd Affinity adsorbents for factor VIII and von willebrand's factor
GB0509442D0 (en) * 2005-05-09 2005-06-15 Prometic Biosciences Ltd Affinity adsorbents for fibrinogen
CA2611734A1 (en) 2005-06-10 2006-12-14 Prometic Biosciences Limited Triazines as protein binding ligands
US20080220968A1 (en) * 2005-07-05 2008-09-11 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab [1, 2, 4] Triazolo [1, 5-A] Pyrimidine Derivatives as Chromatographic Adsorbent for the Selective Adsorption of Igg
GB0604236D0 (en) 2006-03-02 2006-04-12 Prometic Biosciences Ltd Adsorbents for protein purification
CA2682333C (en) 2007-03-28 2015-05-05 Upfront Chromatography A/S Expanded bed column and disposable chromatography
BRPI0810921A2 (pt) 2007-04-30 2014-10-29 Prometic Biosciences Inc Derivados de triazina, composições contendo tais derivados e métodos de tratamento de câncer e doenças autoimunes usando tais compostos
GB0808908D0 (en) * 2008-05-16 2008-06-25 Avecia Biolog Ltd Purification process
US9273077B2 (en) 2008-05-21 2016-03-01 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Phosphorus derivatives as kinase inhibitors
PT2300013T (pt) 2008-05-21 2017-10-31 Ariad Pharma Inc Derivados de fósforo como inibidores de cinases
CN102216325A (zh) * 2008-11-13 2011-10-12 诺沃-诺迪斯克有限公司 使用包括特异性配体的亲和树脂用于纯化人生长激素多肽的方法
ME03596B (me) 2009-04-15 2020-07-20 Abraxis Bioscience Llc Kompozicije nanočesтica bez priona i postupci povezani sa njima
CN102549012B (zh) * 2009-05-07 2015-07-01 诺维信生物制药丹麦公司 纯化白蛋白的方法
CA2764983A1 (en) 2009-06-10 2010-12-16 Abbott Laboratories 2- ( lh-pyrazol-4 -ylamino ) -pyrimidine as kinase inhibitors
EP2459308A1 (en) * 2009-07-28 2012-06-06 instrAction GmbH Specific sorbent for binding proteins and peptides, and separation method using the same
AU2010298720B2 (en) * 2009-09-23 2015-07-23 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Prostaglandin transporter inhibitors and uses thereof
JP6038774B2 (ja) * 2011-03-24 2016-12-07 株式会社カネカ タンパク性物質結合性低分子化合物
EP2704572B1 (en) 2011-05-04 2015-12-30 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Compounds for inhibiting cell proliferation in egfr-driven cancers
AU2013204563B2 (en) 2012-05-05 2016-05-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Compounds for inhibiting cell proliferation in EGFR-driven cancers
US9611283B1 (en) 2013-04-10 2017-04-04 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Methods for inhibiting cell proliferation in ALK-driven cancers
GB2513405A (en) 2013-04-26 2014-10-29 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising ADCs using affinity resins
CN104148018B (zh) * 2013-05-14 2018-04-20 上海亨臻实业有限公司 抗体亲和纯化材料及其用途
EP2918641A1 (en) 2014-03-13 2015-09-16 Basf Se Method for purification of antibodies, antibody fragments or engineered variants thereof using specific anthraquinone dye-ligand structures
GB201419185D0 (en) 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising ADCs using affinity resin
GB201419184D0 (en) 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising biomolecule-effector/reporter-conjugates using affinity resins
RU2627849C1 (ru) * 2016-07-22 2017-08-14 Игорь Анатольевич Мнушкин Способ разделения газового потока на отдельные компоненты или фракции
RU2626354C9 (ru) * 2016-07-25 2017-10-04 Игорь Анатольевич Мнушкин Способ разделения газового потока на отдельные компоненты или фракции
CN109354600B (zh) * 2018-11-29 2021-08-10 浙江海洋大学 一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法
CN113527284B (zh) * 2021-07-16 2024-08-06 东莞市顶盛环保科技有限公司 一种含双酯基均三嗪衍生物的环保多功能材料及其制备方法与应用
CN113563324B (zh) * 2021-07-22 2024-08-06 东莞市顶盛环保科技有限公司 一种含酯基均三嗪的绿色环保多功能材料及其制备方法与应用
CN118719009B (zh) * 2024-07-18 2025-02-14 山东微领生物有限公司 一种层析介质改性方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3726019A1 (de) * 1987-08-05 1989-02-16 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur abtrennung und reinigung von t-pa

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BURTON N.P. LOWE C.P. JORNAL OF MOLECULAR RECOGNITION. - 1992, N5, P.55-68. DE 4445517 A (PALL CORP), 29.06.1995. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA014365B1 (ru) * 2004-07-27 2010-10-29 Проуметик Байосайенсез Лимитед Замещённые триазины в качестве лигандов белка приона и их применение для обнаружения или удаления прионов
RU2541429C2 (ru) * 2004-10-21 2015-02-10 Джи-И Хелткер Байо-Сайенсиз АБ Хроматографический лиганд
RU2440582C2 (ru) * 2004-12-23 2012-01-20 Ново Нордиск А/С Аффинные лиганды, связывающие антитела

Also Published As

Publication number Publication date
ZA967917B (en) 1997-03-20
DK0959975T3 (da) 2005-05-09
CN1089617C (zh) 2002-08-28
GB9519197D0 (en) 1995-11-22
KR100537386B1 (ko) 2006-04-21
KR19990063645A (ko) 1999-07-26
AR003634A1 (es) 1998-08-05
AU702901B2 (en) 1999-03-11
JP4824147B2 (ja) 2011-11-30
ATE285827T1 (de) 2005-01-15
EP0959975A1 (en) 1999-12-01
ES2236748T3 (es) 2005-07-16
JPH11512442A (ja) 1999-10-26
DE69634142D1 (de) 2005-02-03
CN1200680A (zh) 1998-12-02
DE69634142T2 (de) 2005-12-29
MY127957A (en) 2007-01-31
CA2232626A1 (en) 1997-03-27
EP0959975B1 (en) 2004-12-29
AU6924296A (en) 1997-04-09
CA2232626C (en) 2011-11-29
WO1997010887A1 (en) 1997-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2175261C2 (ru) Новые аффинные лиганды и их применение
US6117996A (en) Triazine based ligands and use thereof
EP0441660B1 (en) Affinity separation with activated polyamide microporous membranes
RU98107896A (ru) Новые аффинные лиганды и их применение
US5085779A (en) Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography
HK1046654A1 (en) Novel triazine-based detoxification agents and their use
EP0154315B1 (en) Improved diazonium affinity matrixes
CN101415692B (zh) 用于蛋白质纯化的吸附剂
JPH05504978A (ja) アフィニティークロマトグラフィー用のポリマー性担体を活性化する方法およびそれらから製造された組成物
US4886755A (en) Preparation of polymeric thiol gels for covalent bonding of biologically active ligands
CA1332598C (en) Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography
JP5133236B2 (ja) 生物学的材料を分離するためのアントラキノン染料リガンドを含む吸着剤
JPS61173778A (ja) 重合体担体の活性化方法
FI60216B (fi) Biologiskt aktivt vid affinitetsreaktioner anvaendbart adsorbtionsmedel
FI61811C (fi) Anvaendning av en biologiskt aktiv produkt bestaoende av en i atten oloeslig baerare och ett biologiskt aktivt aemne sa osm adsorptionsmedel foer affinitetskromatografi
KR20240012463A (ko) 생체분자의 단리를 위한 스캐폴드
SU1052509A1 (ru) Способ получени сорбента дл иммобилизации биологических активных веществ
DK171394B1 (da) Understøtning eller bærer i fast fase, immobiliseret enzym i fast fase på en sådan understøtning, ligandbundet chromatografiaffinitetsmatrix samt fremgangsmåde til adskillelse eller rensning af et stof fra opløsning under anvendelse af understøtningen
FALB Covalent Linkage: I. Enzymes Immobilized by Covalent Linkage on Insolubilized
Falb Covalent Linkage: I. Enzymes Immobilized by Covalent Linkage on Insolubilized Supports
Ngo et al. Aza-Arenophilic Interaction: Novel Mode of Protein Adsorption and Applications in Immunoglobulin Purification
Ngo Facile activation of Trisacryl gels with 2-fluoro-1-methylpyridinium salt (FMP): Applications in affinity chromatography and enzyme immobilization
Narinesingh et al. 2-Fluoro-1-methylpyridinium (FMP) Salt-Activated Gels: Properties and Uses in Affinity Chromatography and Enzyme Immobilization for Analytical Applications

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20080920