RU2174408C2 - Preparation for prophylaxis and treatment of diphtheria and method of its preparing - Google Patents
Preparation for prophylaxis and treatment of diphtheria and method of its preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2174408C2 RU2174408C2 RU99121065A RU99121065A RU2174408C2 RU 2174408 C2 RU2174408 C2 RU 2174408C2 RU 99121065 A RU99121065 A RU 99121065A RU 99121065 A RU99121065 A RU 99121065A RU 2174408 C2 RU2174408 C2 RU 2174408C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- diphtheria
- preparation
- treatment
- serum
- drug
- Prior art date
Links
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 title claims abstract description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 14
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 title 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 28
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 claims abstract description 16
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims abstract description 15
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 9
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 24
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 13
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 3
- SGNXVBOIDPPRJJ-PSASIEDQSA-N 1-[(1r,6r)-9-azabicyclo[4.2.1]non-4-en-5-yl]ethanone Chemical compound CC(=O)C1=CCC[C@@H]2CC[C@H]1N2 SGNXVBOIDPPRJJ-PSASIEDQSA-N 0.000 abstract 1
- 239000003948 anatoxin Substances 0.000 abstract 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract 1
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 2
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- IYLLULUTZPKQBW-UHFFFAOYSA-N Acrinol Chemical compound CC(O)C(O)=O.C1=C(N)C=CC2=C(N)C3=CC(OCC)=CC=C3N=C21 IYLLULUTZPKQBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035049 Blood-Borne Infections Diseases 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000322338 Loeseliastrum Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940036117 diphtheria immunoglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 206010040400 serum sickness Diseases 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, в частности иммунологии, и может быть использовано для иммунопрофилактики и иммунотерапии дифтерии. The invention relates to medicine, in particular immunology, and can be used for immunoprophylaxis and immunotherapy of diphtheria.
Традиционным способом лечения дифтерии является внутримышечное введение противодифтерийной сыворотки (ПДС), полученной из крови лошадей, гипериммунизированных дифтерийным анатоксином, содержащей специфические иммуноглобулины, нейтрализующие токсины дифтерийных бактерий. В 1 мл сыворотки содержится не менее 1500 международных антитоксических единиц активности (МЕ). Являясь эффективным способом лечения дифтерии, ПДС обладает рядом недостатков: введение значительного количества чужеродного белка обуславливает возможность развития анафилактических реакций и сывороточной болезни (Фаворова Л.А. и др. Дифтерия. - М.: Медицина, 1988. - С. 187-192). A traditional method for treating diphtheria is the intramuscular administration of antidiphtheria serum (PDS) obtained from the blood of horses hyperimmunized with diphtheria toxoid containing specific immunoglobulins that neutralize toxins of diphtheria bacteria. 1 ml of serum contains at least 1,500 international antitoxic units of activity (IU). Being an effective method of treating diphtheria, PDS has several disadvantages: the introduction of a significant amount of foreign protein makes it possible to develop anaphylactic reactions and serum sickness (Favorova L.A. et al. Diphtheria. - M .: Medicine, 1988. - P. 187-192) .
Известен препарат иммуноглобулина противодифтерийного человека, получаемый из плазмы доноров, вакцинированных дифтерийным анатоксином. В 1 мл препарата содержится от 5 до 50 МЕ противодифтерийных антител. Профилактическая доза препарата 300 МЕ при внутримышечном введении, лечебная - от 1200 до 20000 МЕ (Алешин В.А., Зацепин Ю.К., Башлай А.Г. и др. Получение противодифтерийного иммуноглобулина. // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине. - Уфа, 1995. - Ч. 1. - С. 100-102). Known drug immunoglobulin anti-diphtheria man, obtained from the plasma of donors vaccinated with diphtheria toxoid. In 1 ml of the drug contains from 5 to 50 IU of anti-diphtheria antibodies. The prophylactic dose of the drug is 300 IU with intramuscular injection, the therapeutic dose is from 1200 to 20,000 IU (Aleshin V.A., Zatsepin Yu.K., Bashlai A.G. et al. Obtaining anti-diphtheria immunoglobulin. // The role of immunobiological drugs in modern medicine. - Ufa, 1995. -
Однако выпуск противодифтерийного гомологичного иммуноглобулина ограничен недостаточностью сырьевой базы и несовершенством схем иммунизации. Все более ограничивает возможность заготовки донорской крови рост "традиционных" инфекций, передающихся через кровь (сифилис, гепатиты, ВИЧ-инфекция, новые T- и B-лимфотропные вирусы, диагностика которых пока еще затруднена) (Райхер Л. И. , Райхер И.И. Аффинноочищенные ксеногенные антитела. Перспективы развития, проблемы. // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине. - Уфа, 1995. - Ч. 2. - С. 86-91). However, the release of anti-diphtheria homologous immunoglobulin is limited by the lack of raw materials and the imperfection of immunization schemes. The growth of “traditional” blood-borne infections (syphilis, hepatitis, HIV infection, new T- and B-lymphotropic viruses, the diagnosis of which is still difficult) is increasingly limiting the possibility of donor blood collection (L. Reicher, I. Reicher I. Affinity-purified xenogenic antibodies. Prospects for development, problems. // The role of immunobiological preparations in modern medicine. - Ufa, 1995. - Part 2. - P. 86-91).
Кроме того, для приготовления одной серии препарата иммуноглобулина противодифтерийного человека требуется кровь не менее чем 1000 доноров, поэтому он представляет собой смесь молекул разного аллотипа, введение которых может приводить к развитию аллергических реакций у больных (Пыцкий В.И., Адрианова Н. В. , Артомасова А.В. Аллергические заболевания. - М.: Медицина. - 1991. - С. 176). In addition, the preparation of one batch of an anti-diphtheria human immunoglobulin preparation requires blood from at least 1000 donors, therefore it is a mixture of molecules of different allotypes, the introduction of which can lead to the development of allergic reactions in patients (Pytsky V.I., Adrianova N.V. , Artomasova A.V. Allergic diseases. - M.: Medicine. - 1991. - S. 176).
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения гетерогенного сывороточного препарата, включающий в себя обработку сыворотки риванолом, пепсином, гидроокисью алюминия, с последующей ультрафильтрацией и стерилизующей фильтрацией (патент N 2062617, кл. A 61 K 35/16, 39/00, 1996). Closest to the proposed invention is a method for producing a heterogeneous serum preparation, comprising treating serum with rivanol, pepsin, aluminum hydroxide, followed by ultrafiltration and sterilizing filtration (patent N 2062617, class A 61
Однако данный способ не позволяет получать препараты с высокой степенью очистки: конечный продукт представляет собой комплекс F(ab)2-фрагментов иммуноглобулинов различной специфичности, причем антитела (антитоксины) против того антигена, которым иммунизировался продуцент, составляют не более 25% от общего содержания белка. Вследствие этого антитоксические сыворотки остаются перегруженными балластными белками и в ряде случаев могут вызывать анафилактические реакции различной степени тяжести со стороны реципиента. Кроме того, препараты контаминированы групповыми веществами крови (ГВК), что может также стать причиной осложнений при введении сывороток.However, this method does not allow to obtain preparations with a high degree of purification: the final product is a complex of F (ab) 2 fragments of immunoglobulins of various specificities, moreover, antibodies (antitoxins) against the antigen by which the producer was immunized do not exceed 25% of the total protein content . As a result, antitoxic sera remain overloaded with ballast proteins and in some cases can cause anaphylactic reactions of varying severity on the part of the recipient. In addition, the drugs are contaminated with group blood substances (HVA), which can also cause complications with the introduction of sera.
Технический результат изобретения заключается в получении высокоочищенного противодифтерийного препарата со сниженной реактогенностью из гетерогенного сырья. Препарат для профилактики и лечения дифтерии представляет собой лиофилизированную форму. The technical result of the invention is to obtain a highly purified anti-diphtheria drug with reduced reactogenicity from heterogeneous raw materials. The drug for the prevention and treatment of diphtheria is a lyophilized form.
Задача решается путем получения препарата для профилактики и лечения дифтерии из ферментированной гипериммунной сыворотки лошади с применением иммунноаффинной очистки. The problem is solved by obtaining a drug for the prevention and treatment of diphtheria from fermented hyperimmune horse serum using immunoaffinity purification.
Сущность изобретения заключается в следующем. Препарат для профилактики и лечения дифтерии представляет собой лиофилизированную монорецепторную фракцию F(ab)2-фрагментов IgG лошади, выделенную из ферментированной гипериммунной сыворотки лошади с помощью иммуносорбента, содержащего в качестве лиганда очищенный концентрированный дифтерийный анатоксин. Иммунноаффинная очистка позволяет получать высокоочищенный препарат для профилактики и лечения дифтерии с активностью противодифтерийных антител не менее 2500 МЕ/мл и содержанием белка 3-4%.The invention consists in the following. The drug for the prevention and treatment of diphtheria is a lyophilized monoreceptor fraction of F (ab) 2 horse IgG fragments isolated from fermented hyperimmune horse serum using an immunosorbent containing purified concentrated diphtheria toxoid as a ligand. Immunoaffinity purification allows to obtain a highly purified preparation for the prevention and treatment of diphtheria with anti-diphtheria antibody activity of at least 2500 IU / ml and a protein content of 3-4%.
Полученный препарат является монофракционным, в то время как препарат-прототип имеет ярко выраженные примеси неактивного белка (фиг. 1). Препарат для профилактики и лечения дифтерии является монорецепторным: в реакции двойной иммунодиффузии с дифтерийным анатоксином образует одну линию преципитации, в то время как сыворотка (прототип) - 2-3 линии (фиг. 2). The resulting preparation is monofractional, while the prototype preparation has pronounced impurities of an inactive protein (Fig. 1). The drug for the prevention and treatment of diphtheria is monoreceptor: in the reaction of double immunodiffusion with diphtheria toxoid forms one line of precipitation, while serum (prototype) - 2-3 lines (Fig. 2).
Характеристика препаратов, полученных по известным способам и предложенным, представлена в табл. 1-3. The characteristics of the preparations obtained by known methods and proposed are presented in table. 1-3.
Высокая степень очистки и отсутствие ГВК обеспечивают снижение реактогенности препарата для профилактики и лечения дифтерии, полученного из гетерогенного сырья (табл. 1, 2), при этом он обладает высокими протективными свойствами: минимальная доза антитоксина в сыворотках крови 0,03-0,125 МЕ/мл, соответствующая защитному титру при дифтерии, защищает 100% животных от введения 1,8-5,6 LD50 дифтерийного токсина (табл. 3). Лиофильное высушивание позволяет получать высокоактивные сухие дозированные препараты, пригодные для длительного хранения.A high degree of purification and the absence of HVA reduce the reactogenicity of the drug for the prevention and treatment of diphtheria obtained from heterogeneous raw materials (Table 1, 2), while it has high protective properties: the minimum dose of antitoxin in blood serum is 0.03-0.125 IU / ml , corresponding to the protective titer for diphtheria, protects 100% of the animals from the administration of 1.8-5.6 LD 50 diphtheria toxin (table. 3). Freeze drying allows you to get highly active dry dosage formulations suitable for long-term storage.
Осуществление способа. The implementation of the method.
Для приготовления препарата для профилактики и лечения дифтерии используют гипериммунную лошадиную сыворотку, для чего ее ферментируют пепсином, осуществляют солевое фракционирование белков и термоденатурацию балластного белка. Выделение целевого продукта из ферментированной гипериммунной сыворотки осуществляют с применением специфического иммуносорбента, содержащего в качестве лиганда очищенный концентрированный дифтерийный анатоксин. Препарат концентрируют с помощью ультрафильтрации на мембранах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 100 кД. Стерилизующую фильтрацию проводят на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм. To prepare the drug for the prevention and treatment of diphtheria, hyperimmune horse serum is used, for which it is fermented with pepsin, salt fractionation of proteins and thermal denaturation of the ballast protein are carried out. Isolation of the target product from fermented hyperimmune serum is carried out using a specific immunosorbent containing purified concentrated diphtheria toxoid as a ligand. The drug is concentrated by ultrafiltration on membranes with a threshold for retention of substances with a molecular weight of 100 kD. Sterilizing filtration is carried out on membranes with a pore diameter of 0.22 μm.
Пример
1. Ферментолиз гипериммунной сыворотки.Example
1. Fermentolysis of hyperimmune serum.
30 л гипериммунной лошадиной сыворотки загружают в реактор и разбавляют 60 л апирогенной дистиллированной воды до содержания 3% белка. Вносят при помешивании 243 г пепсина, растворенного в небольшом количестве подкисленной дистиллированной воды. Протеолиз проводят при pH 3,2 при комнатной температуре 1 ч и 1 ч при pH 4,2. (pH доводят до нужного значения 2,5 моль/л раствором соляной кислоты или 2,5 моль/л раствором гидроксида натрия). 30 l of hyperimmune horse serum is loaded into the reactor and diluted with 60 l of pyrogen-free distilled water to a content of 3% protein. With stirring, 243 g of pepsin dissolved in a small amount of acidified distilled water are added. Proteolysis is carried out at a pH of 3.2 at room temperature for 1 h and 1 h at a pH of 4.2. (pH is adjusted to the desired value with 2.5 mol / L hydrochloric acid solution or 2.5 mol / L sodium hydroxide solution).
По окончании 2-го часа протеолиза в реактор через загрузочный люк добавляют 14,5% сульфата аммония (13 кг), pH доводят до значения 4,3-4,33. Смесь подогревают до 56oC и выдерживают при этой температуре 45 минут. После этого ферментат освобождают от балластного белка фильтрацией через миткалевые кассетные фильтры. Осадок балластных белков отбрасывают, а прозрачный фильтрат, содержащий белки с антитоксической активностью, собирают и подводят в нем pH до 7,0-7,2.At the end of the 2nd hour of proteolysis, 14.5% ammonium sulfate (13 kg) was added to the reactor through the loading hatch, the pH was adjusted to a value of 4.3-4.33. The mixture is heated to 56 o C and maintained at this temperature for 45 minutes. After this, the enzyme is freed from the ballast protein by filtration through calico cassette filters. The ballast protein precipitate is discarded, and a clear filtrate containing proteins with antitoxic activity is collected and adjusted to pH 7.0-7.2.
2. Приготовление моноспецифического иммуносорбента. 2. Preparation of monospecific immunosorbent.
Для получения иммуносорбента используют стандартный препарат цианбромированной сефарозы 4В ("Pharmacia, Швеция"), а в качестве специфического лиганда - очищенный концентрированный дифтерийный анатоксин с активностью 450 Lf/мл. 200 г сухой сефарозы заливают двумя литрами 0,001 моль/л раствора соляной кислоты на 30 минут и отмывают от консервантов тем же раствором. 1,2 л дифтерийного анатоксина соединяют с осадком набухшей сефарозы (900 мл), хорошо перемешивают и выдерживают при температуре 4oC в течение 24 часов. После чего определяют объем надосадочной жидкости (V1) и титр анатоксина (T1) в реакции флокуляции. Если титр не превышает 10 Lf/мл, то декантат отбрасывают, в противном случае сорбцию продолжают. Образованный комплекс сефароза - анатоксин отмывают от несвязавшегося белка стерильным апирогенным карбонатно-бикарбонатным буферным раствором pH 9,0 под контролем спектрофотометрии. Последнюю порцию промывных вод после установления нейтрального pH проверяют на пироген по общепринятой методике.To obtain the immunosorbent, a standard preparation of cyanogen bromide sepharose 4B (Pharmacia, Sweden) is used, and a purified concentrated diphtheria toxoid with an activity of 450 Lf / ml is used as a specific ligand. 200 g of dry Sepharose is poured with two liters of a 0.001 mol / L hydrochloric acid solution for 30 minutes and washed with preservatives in the same solution. 1.2 l of diphtheria toxoid is combined with a precipitate of swollen Sepharose (900 ml), mixed well and kept at a temperature of 4 o C for 24 hours. Then determine the volume of the supernatant (V 1 ) and the titer of toxoid (T 1 ) in the flocculation reaction. If the titer does not exceed 10 Lf / ml, the decantate is discarded; otherwise, sorption is continued. The formed Sepharose-toxoid complex is washed from an unbound protein with a sterile pyrogen-free carbonate-bicarbonate buffer pH 9.0 under the control of spectrophotometry. After establishing a neutral pH, the last portion of the washings is checked for pyrogen according to the generally accepted method.
При отсутствии пирогенов в промывных водах свободные активные группы цианбромированной сефарозы блокируют двумя литрами 1 моль/л раствора этаноламина pH 9,0 в течение двух часов в затемненном месте при постоянном помешивании. In the absence of pyrogens in the washings, the free active groups of cyanogen bromide sepharose are blocked with two liters of a 1 mol / L ethanolamine solution pH 9.0 for two hours in a darkened place with constant stirring.
Иммуносорбент трехкратно отмывают чередующимися стерильными апирогенными буферными растворами: 2 л ацетатного pH 4,0; 2 л борно-боратного pH 8,0. Промывные воды (V1) контролируют на наличие дифтерийного анатоксина в реакции флокуляции (T2). Титр иммуносорбента рассчитывают по формуле
где A - титр иммуносорбента;
V, T - объем и титр анатоксина;
V1, T1 - объем и титр надосадочной жидкости;
V2, T2 - объем и титр промывных вод;
C - объем иммуносорбента.The immunosorbent is washed three times with alternating sterile pyrogen-free buffer solutions: 2 l of acetate pH 4.0; 2 l of boric borate pH 8.0. Wash water (V 1 ) is monitored for the presence of diphtheria toxoid in the flocculation reaction (T 2 ). The immunosorbent titer is calculated by the formula
where A is the titer of the immunosorbent;
V, T - volume and titer of toxoid;
V 1 , T 1 - volume and titer of the supernatant;
V 2 , T 2 - volume and titer of wash water;
C is the volume of immunosorbent.
Таким образом, получают 900 мл суспензии иммуносорбента с титром 588 Lf/мл.
Thus, 900 ml of an immunosorbent suspension with a titer of 588 Lf / ml are obtained.
3. Выделение монорецепторной фракции F(ab)2-фрагментов IgG лошади, концентрирование препарата.3. Isolation of the monoreceptor fraction of F (ab) 2 horse IgG fragments, drug concentration.
Для выделения F(ab)2-фрагментов IgG лошади используют бесколоночный "Batch"-метод. При этом все используемые емкости и растворы должны быть стерильными и апирогенными. Сорбент и ферментированную антитоксическую сыворотку с активностью 110 МЕ/мл соединяют в количествах, эквивалентных по титру
где Vф, Tф - объем и титр ферментата,
Vи.с., Tи.с. - объем и титр иммуносорбента.To isolate the F (ab) 2 fragments of horse IgG, a columnless “Batch” method is used. In this case, all containers and solutions used must be sterile and pyrogen-free. The sorbent and fermented antitoxic serum with an activity of 110 IU / ml are combined in amounts equivalent to titer
where V f , T f - volume and titer of the enzyme,
V I.S. , T i.s. - volume and titer of immunosorbent.
Т.е. одной порции иммуносорбента достаточно для истощения 4,8 л ферментированной противодифтерийной антитоксической сыворотки.
Those. one serving of immunosorbent is sufficient to deplete 4.8 liters of fermented antidiphtheria antitoxic serum.
Сорбцию специфических антител проводят при комнатной температуре в течение 1 ч, pH 7,0. Сорбент отмывают от несвязавшихся белков стерильным апирогенным забуференным физиологическим раствором (ЗФР) pH 7,0 до нулевой отметки по показаниям спектрофотометра. В качестве элюента используют стерильный апирогенный ЗФР, подкисленный до pH 2,2 - 2,4 1 моль/л соляной кислотой. Sorption of specific antibodies is carried out at room temperature for 1 h, pH 7.0. The sorbent is washed from unbound proteins with a sterile pyrogen-free buffered saline solution (PBS) pH 7.0 to zero according to the readings of a spectrophotometer. Sterile pyrogen-free PBS, acidified to a pH of 2.2 - 2.4 with 1 mol / L hydrochloric acid, is used as an eluent.
Экспозиция иммуносорбента в элюенте составляет 10-15 минут. Специфический белок последовательно элюируют порциями ЗФР pH 2,4: 1,5-1,0-0,5 л. Отбирают элюаты с содержанием белка не менее 0,01%, объединяют и доводят pH до 6,8-7,2. Объединенные элюаты проверяют на пироген по общепринятой методике. The exposure of the immunosorbent in the eluent is 10-15 minutes. A specific protein is subsequently eluted with portions of PBS pH 2.4: 1.5-1.0-0.5 L. Select eluates with a protein content of at least 0.01%, combine and adjust the pH to 6.8-7.2. The combined eluates are tested for pyrogen by a conventional technique.
Иммуносорбент отмывают от белка ЗФР (pH 7,0) и хранят в стерильном апирогенном борно-боратном буферном растворе (pH 8,0) при температуре 4oC. Иммуносорбент используют многократно (до 20 раз).The immunosorbent is washed from the PBS protein (pH 7.0) and stored in a sterile pyrogen-free borate-borate buffer solution (pH 8.0) at a temperature of 4 ° C. The immunosorbent is used repeatedly (up to 20 times).
Получают 90 л элюатов с содержанием специфического белка 0,095-0,1%. Концентрирование элюатов проводят методом ультрафильтрации на установке АР-2 с полыми волокнами марки ВПУ-100 под давлением 0,06 ± 0,02 МПа. Процесс концентрирования продолжают до содержания белка в концентрате в пределах 3-4%. Get 90 l of eluates with a specific protein content of 0.095-0.1%. The concentration of eluates is carried out by ultrafiltration on an AP-2 installation with hollow fibers of the VPU-100 brand under a pressure of 0.06 ± 0.02 MPa. The concentration process is continued until the protein content in the concentrate is within 3-4%.
Получают 3 л концентрированных аффинноочищенных F(ab)2-фрагментов IgG лошади с активностью 2500 МЕ/мл и белком 3%. Очищенный концентрированный антитоксин осветляют с помощью последовательной фильтрации через мембраны с диаметром пор 0,8-0,65-0,45 мкм. Стерилизующую фильтрацию проводят на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм. Стерильный препарат для профилактики и лечения дифтерии разливают в ампулы по 1,0 мл.Get 3 l of concentrated affinity purified F (ab) 2 fragments of horse IgG with an activity of 2500 IU / ml and a protein of 3%. The purified concentrated antitoxin is clarified by sequential filtration through membranes with a pore diameter of 0.8-0.65-0.45 μm. Sterilizing filtration is carried out on membranes with a pore diameter of 0.22 μm. A sterile preparation for the prevention and treatment of diphtheria is poured into ampoules of 1.0 ml.
4. Лиофилизация. 4. Lyophilization.
Ампулы с препаратом для профилактики и лечения дифтерии помещают в приемную кассету и ставят на замораживание в низкотемпературный прилавок аппарата ТГ-50, обеспечивающего температуру замораживания не менее минус 38oC. При принудительной вентиляции препарат замораживают в течение не менее 18 ч, без принудительной вентиляции не менее 20 ч. Загрузка продукта в сублиматор производится по достижении конденсатором температуры не выше минус 50oC, полок не выше минус 15oC. После чего сублиматор вакуумируется. Точка размораживания препарата минус 33-36oC. При достижении препаратом температуры не выше минус 38oC и стабилизации вакуума не более 9 Па начинают подогрев полок. Через час после загрузки подогрев на 0oC и далее по 5oC в час. Конечная температура нагрева полок 34-40oC. После выдерживания препарата при плюсовой температуре в течение 20 ч сушка считается законченной.Ampoules with the drug for the prevention and treatment of diphtheria are placed in the receiving cassette and put on freeze in the low-temperature counter of the TG-50 apparatus, which provides a freezing temperature of at least minus 38 o C. When forced ventilation, the drug is frozen for at least 18 hours, without forced ventilation less than 20 hours. The product is loaded into the sublimator when the condenser reaches a temperature of no higher than minus 50 o C, shelves no higher than minus 15 o C. After which the sublimator is evacuated. The defrosting point of the drug is minus 33-36 o C. When the drug reaches a temperature of no higher than minus 38 o C and the vacuum stabilizes no more than 9 Pa, the shelves begin to heat up. One hour after loading, heating at 0 o C and then at 5 o C per hour. The final heating temperature of the shelves is 34-40 o C. After keeping the drug at positive temperature for 20 hours, the drying is considered complete.
Таким образом, предложенный способ позволяет получать препарат для профилактики и лечения дифтерии со сниженной реактогенностью, обладающий высокими протективными свойствами, в лиофилизированной форме. Thus, the proposed method allows to obtain a drug for the prevention and treatment of diphtheria with reduced reactogenicity, with high protective properties, in lyophilized form.
Claims (2)
Монорецепторная фракция F(ab)2-фрагментов IgG лошади с активностью противодифтерийных антител не менее 2500 МЕ/мл - 3 - 4 мас.%
0,9% раствор хлорида натрия с pH 6,8 - 7,2 - До 1 мл
2. Препарат для профилактики и лечения дифтерии по п.1, отличающийся тем, что представляет собой лиофилизированную форму.1. The drug for the prevention and treatment of diphtheria, containing F (ab) 2 IgG fragments of a horse, characterized in that it is a monoreceptor fraction of F (ab) 2 IgG fragments of a horse with an anti-dephteric antibody activity of at least 2500 IU / ml and contains as an excipient, a 0.9% solution of sodium chloride with a pH of 6.8 - 7.2 in the following ratio of ingredients:
Monoreceptor fraction of F (ab) 2 fragments of horse IgG with an activity of anti-diphtheria antibodies of at least 2500 IU / ml - 3 to 4 wt.%
0.9% sodium chloride solution with a pH of 6.8 - 7.2 - Up to 1 ml
2. The drug for the prevention and treatment of diphtheria according to claim 1, characterized in that it is a lyophilized form.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99121065A RU2174408C2 (en) | 1999-10-05 | 1999-10-05 | Preparation for prophylaxis and treatment of diphtheria and method of its preparing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99121065A RU2174408C2 (en) | 1999-10-05 | 1999-10-05 | Preparation for prophylaxis and treatment of diphtheria and method of its preparing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU99121065A RU99121065A (en) | 2001-08-10 |
| RU2174408C2 true RU2174408C2 (en) | 2001-10-10 |
Family
ID=20225565
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99121065A RU2174408C2 (en) | 1999-10-05 | 1999-10-05 | Preparation for prophylaxis and treatment of diphtheria and method of its preparing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2174408C2 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2062617C1 (en) * | 1992-08-24 | 1996-06-27 | Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" | Method of antitoxic serum preparing |
-
1999
- 1999-10-05 RU RU99121065A patent/RU2174408C2/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2062617C1 (en) * | 1992-08-24 | 1996-06-27 | Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" | Method of antitoxic serum preparing |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Дифтерийный анатоксин: Руководство по вакцинному и сывороточному делу./ Под ред.П.Н.Бургасова. - М.: Медицина, 1978, с.133-157, 274-277. АЛЕШИН В.А., ЗАЦЕПИН Ю.К., БАШЛАЙ А.Г. и др. Получение противодифтерийного иммуноглобулина. Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине, Уфа, 1995, ч.1, с.100-102. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1341505C (en) | Intravenously administered polyclonal immunoglobulin preparation containing igm and method of manufacture | |
| US4396608A (en) | Intravenously injectable immune serum globulin | |
| US4499073A (en) | Intravenously injectable immune serum globulin | |
| Thalley et al. | Rattlesnake and scorpion antivenoms from the egg yolks of immunized hens | |
| US6322788B1 (en) | Anti-bacterial antibodies and methods of use | |
| RU2008916C1 (en) | Method for aqueous solution of immunoglobulin pasteurization | |
| US4318902A (en) | Concentrated immunoglobulin solution suited for intravenous administration | |
| EP2560691A2 (en) | Process for preparing an immunoglobulin composition | |
| JPH08511015A (en) | Therapeutic antibody fragment | |
| WO2020259633A1 (en) | Human immunoglobulin against methicillin-resistant staphylococcus aureus, preparation method therefor, and use thereof | |
| US4120950A (en) | Medicament for preventing and treating pseudomonas aeruginosa infections and method of its preparation | |
| RU2174408C2 (en) | Preparation for prophylaxis and treatment of diphtheria and method of its preparing | |
| Morell | Various immunoglobulin preparations for intravenous use | |
| AT410636B (en) | METHOD FOR PRODUCING A VACCINE | |
| CN115232798A (en) | Hybridoma cell strain 5B3, tsutsugamushi oriental 56kDa protein monoclonal antibody, preparation method and application thereof | |
| US20200190166A1 (en) | Polyvalent immunotherapeutics of high specificty based on modified antibodies and a lyophilized injectable formulation highly safe and effective | |
| Yap et al. | An evaluation of the safety of three intravenous immunoglobulin preparations in patients with primary hypogammaglobulinaemia | |
| Kobayashi et al. | Clinical trial of sulfonated immunoglobulin preparation for intravenous administration: I. Replacement therapy for primary immunodeficiency syndromes | |
| US20240409623A1 (en) | Polyclonal Ovine Fab Raised Against Ricin | |
| Tizard | Passive immunization | |
| CN108484760A (en) | A kind of antiricin immunoglobulin F（ab’）2And preparation method thereof | |
| AU622277B2 (en) | Monoclonal antibodies in immune serum globulin | |
| CN121064323A (en) | A polyclonal antibody for treating lung infections, its preparation method and application | |
| RU2287345C2 (en) | Agent for stimulation of producing blood coagulation viii factor | |
| RU2381037C1 (en) | Serum immunobiological preparation for emergency anthrax prevention and treatment |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20180419 |