RU2169771C1 - Method of detection of polymerase chain reaction product - Google Patents
Method of detection of polymerase chain reaction product Download PDFInfo
- Publication number
- RU2169771C1 RU2169771C1 RU2000108137/13A RU2000108137A RU2169771C1 RU 2169771 C1 RU2169771 C1 RU 2169771C1 RU 2000108137/13 A RU2000108137/13 A RU 2000108137/13A RU 2000108137 A RU2000108137 A RU 2000108137A RU 2169771 C1 RU2169771 C1 RU 2169771C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gel
- agar
- dna
- detection
- pcr
- Prior art date
Links
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 title abstract 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 15
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims abstract description 54
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims abstract description 46
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims abstract description 43
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims abstract description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 abstract 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 42
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 26
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000005370 electroosmosis Methods 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 6
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 241000224527 Trichomonas vaginalis Species 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 3
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical class [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical class [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical class [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Chemical class 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical group NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical class [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000001636 atomic emission spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229910052729 chemical element Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицинской микробиологии, конкретно к способам диагностики инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). The invention relates to medical microbiology, specifically to methods for diagnosing infectious diseases by the method of polymerase chain reaction (PCR).
Метод ПЦР применяют для выявления в исследуемых образцах специфических фрагментов нуклеиновых кислот микроорганизмов. Метод позволяет выявить единичные клетки возбудителей инфекционных заболеваний независимо от их природы, так как основан на многократном увеличении числа копий специфического участка ДНК (так называемая направленная амплификация ДНК), характерного для исследуемого организма. The PCR method is used to detect specific samples of microorganism nucleic acids in the samples under study. The method allows one to identify single cells of infectious disease pathogens regardless of their nature, as it is based on a multiple increase in the number of copies of a specific DNA region (the so-called directed amplification of DNA) characteristic of the organism under study.
Метод ПЦР состоит из трех основных процедур: подготовки исследуемого материала, которая обычно сводится к изоляции ДНК или РНК, собственно проведения ПЦР и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК). The PCR method consists of three main procedures: preparing the test material, which usually comes down to isolating DNA or RNA, actually performing PCR and detecting the PCR product (amplified DNA).
Реакцию обычно проводят в пробирках Эппендорфа. Все компоненты реакции вносят автоматической микропипеткой со съемным наконечником. Перед внесением в реакцию исследуемый материал обычно подвергается предварительной обработке. Тип обработки зависит как от вида возбудителя, так и от вида клинического материала. В простейших случаях достаточно прокипятить пробу в течение 5-10 минут, в более сложных время обработки может составить 3-4 часа. При постановке реакции в пробирку последовательно вносят определенные количества: деинонизированной стерильной воды; буфер для проведения реакции; стабилизатор реакции (бычий сывороточный альбумин или желатин); смесь всех четырех типов дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (элементов, из которых происходит синтез новых нитей ДНК); водный раствор обоих праймеров, специфичных в отношении связывания с исследуемым образцом; материал исследуемого клинического образца и термостабильную ДНК-полимеразу Tag. Сверху на пробу наслаивают стерильное вазелиновое масло для предотвращения испарения реакционной смеси во время проведения ПЦР. The reaction is usually carried out in Eppendorf tubes. All components of the reaction contribute automatic micropipette with a removable tip. Before introducing into the reaction, the studied material is usually subjected to preliminary processing. The type of treatment depends on both the type of pathogen and the type of clinical material. In the simplest cases, it is enough to boil the sample for 5-10 minutes, in more complex cases, the processing time can be 3-4 hours. When staging the reaction, certain quantities are sequentially introduced into the test tube: deinonized sterile water; reaction buffer; reaction stabilizer (bovine serum albumin or gelatin); a mixture of all four types of deoxyribonucleotide triphosphates (elements from which the synthesis of new DNA strands occurs); an aqueous solution of both primers specific for binding to the test sample; material of the investigated clinical sample and thermostable DNA polymerase Tag. Sterile liquid paraffin oil is layered on top of the sample to prevent evaporation of the reaction mixture during PCR.
Пробирки помещают в термоциклер (амплификатор) и проводят реакцию по заданной программе в автоматическом режиме. Контроль реакции осуществляют одновременно с постановкой ПЦР на клиническом материале путем внесения в две дополнительные пробирки всех компонентов реакции, но в одну из них вместо материала клинического образца вносят контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя - положительный контроль, а в другую - вместо клинического материала вносится соответствующее количество деинонизированной воды - отрицательный контроль. The tubes are placed in a thermal cycler (amplifier) and the reaction is carried out according to a given program in automatic mode. The reaction is monitored simultaneously with PCR on the clinical material by adding all the reaction components to two additional tubes, but instead of the material of the clinical sample, a control preparation of the DNA of the studied pathogen is introduced - a positive control, and the other - instead of the clinical material, the appropriate amount of deinonized water - negative control.
Заключительной стадией ПЦР является детектирование продуктов ПЦР. Присутствие специфического ПЦР-продукта в подавляющем большинстве случаев детектируют электрофоретическим разделением ПЦР-амплификационной смеси на окрашенном бромистым этидием геле. Используемый для разделения смеси гель должен обладать строго определенными физико-химическими характеристиками: низкой токсичностью по отношению к культуре клеток, хорошими диффузионными свойствами, высокой прозрачностью, иметь определенные показатели прочности студня, электроэндоосмоса (ЭЭО), зольности и содержания серы, как показателя присутствия сульфат-групп, что обеспечивается применением гелеобразователя определенного вида. The final stage of PCR is the detection of PCR products. The presence of a specific PCR product in the vast majority of cases is detected by electrophoretic separation of the PCR amplification mixture on ethidium bromide stained gel. The gel used to separate the mixture should have strictly defined physicochemical characteristics: low toxicity to cell culture, good diffusion properties, high transparency, have certain indicators of jelly strength, electroendosmosis (EEE), ash content and sulfur content, as an indicator of the presence of sulfate groups, which is ensured by the use of a gelling agent of a certain type.
В настоящее время для детектирования продуктов ПЦР известно применение только двух типов гелеобразователей: агарозы и полиакриламида с различными добавками. Currently, only two types of gelling agents are known for detecting PCR products: agarose and polyacrylamide with various additives.
Известно использование полиакриламида для приготовления 4-6% геля, используемого в качестве инертного носителя для проведения электрофоретического разделения амплифицированных фрагментов ДНК с последующим окрашиванием зон их локализации бромистым этидием или нитратом серебра (з. РФ N 97101436, опубл. 27.02.99). It is known to use polyacrylamide to prepare a 4-6% gel used as an inert carrier for electrophoretic separation of amplified DNA fragments, followed by staining of their localization areas with ethidium bromide or silver nitrate (c. RF N 97101436, publ. 27.02.99).
Однако при приготовлении вышеназванного геля требуется соблюдать осторожность, избегать попадания сухого гелеобразователя или раствора на слизистые и кожные покровы из-за токсичности используемого мономера акриламида, что приводит одновременно и к повышенной нейротоксичности полученного геля, а, кроме этого, полученный полиакриламидный гель используется для разделения и извлечения коротких фрагментов ДНК. However, when preparing the aforementioned gel, care must be taken to avoid getting a dry gelling agent or solution on the mucous membranes and skin due to the toxicity of the acrylamide monomer used, which simultaneously leads to increased neurotoxicity of the obtained gel, and, in addition, the obtained polyacrylamide gel is used to separate and extracting short DNA fragments.
Наиболее близким к заявляемому является способ детекции продуктов ПЦР посредством электрофоретического разделения ПЦР - амплификационной смеси на окрашенном бромистым этидием геле, приготовленном из агарозы (Федоров И.А., Суханов Ю. С., А.Х. Асади Мобархан, Артемьев М.И. Полимеразная цепная реакция(ПЦР).- М.,- 1996,- с.14). Closest to the claimed is a method for detecting PCR products by electrophoretic separation of PCR amplification mixture on a gel stained with ethidium bromide, prepared from agarose (Fedorov I.A., Sukhanov Yu.S., A.Kh. Asadi Mobarkhan, Artemyev M.I. Polymerase chain reaction (PCR) .- M., - 1996, - p.14).
Электрофорез ДНК в агарозном геле является стандартным методом разделения и идентификации ДНК, особенно для высокомолекулярной ДНК. Детекцию осуществляют следующим образом. Готовят агарозный гель, растворяя навеску агарозы в буферном растворе при нагревании, затем вносят краситель, заливают полученный раствор в пластиковую подложку с вставленными гребенками и оставляют до застывания геля. Гребенки поднимают и промывают полученную пластину с лунками электрофорезным буфером. В лунки геля вносят продукты ПЦР клинического образца, положительного и отрицательного контроля, пластину помещают в аппарат для электрофореза. После окончания электрофоретического разделения продуктов ПЦР гель помещают на стекло трансиллюминатора и просматривают его в УФ-свете. По появлению в исследуемом образце светящейся полосы, характерной по форме и расположению для полосы положительного контроля, говорят о наличии искомой ДНК. Agarose gel DNA electrophoresis is a standard method for DNA separation and identification, especially for high molecular weight DNA. Detection is as follows. An agarose gel is prepared by dissolving a portion of agarose in a buffer solution when heated, then dye is added, the resulting solution is poured into a plastic substrate with inserted combs and left to solidify the gel. The combs are lifted and washed the resulting plate with wells electrophoresis buffer. Clinical PCR products, positive and negative controls, are introduced into the wells of the gel, and the plate is placed in an electrophoresis apparatus. After electrophoretic separation of the PCR products, the gel is placed on the glass of the transilluminator and viewed in UV light. The appearance of a luminous band in the sample under study, which is characteristic in shape and location for the positive control band, indicates the presence of the desired DNA.
Агароза является составной частью природного гелеобразователя агара и получается выделением из агара путем его ацетилирования. В зависимости от свойств исходного агара и от способа выделения агарозы из него получают различные марки агароз, отличающиеся друг от друга по физико-химическим свойствам. Agarose is an integral part of the natural agar gelling agent and is obtained by isolation from agar by acetylation. Depending on the properties of the initial agar and on the method for isolating agarose, various types of agaroses are obtained from it, which differ from each other in physicochemical properties.
Для получения электрофоретического геля, используемого при детекции ПЦР, применяют только определенные марки агароз, которые пригодны для биомолекулярного разделения. Качество очистки этих агароз достаточно высокое, а их количество ограничено. Так, например, фирма "Sigma" выпускает 12 марок агароз, однако для ПЦР- детектирования пригодны только две. Фирмой ICN выпускается более 15 типов агароз, но для ПЦР детектирования используют только агарозу марки "HGT"(high genetictechnology grade). Такое же соотношение и на фирмах "Serva" и "Difco", специализирующихся на выпуске биопрепаратов. Выпускаемые зарубежными фирмами агарозы нетоксичны, обладают высокими показателями прочности и прозрачности образуемого геля, имеют показатель ЭЭО 0,17 - 0,23 и зольность 0,46 ± 0,1. To obtain the electrophoretic gel used in the detection of PCR, only certain types of agaroses are used that are suitable for biomolecular separation. The quality of purification of these agaroses is quite high, and their quantity is limited. For example, the Sigma company produces 12 grades of agarose, however, only two are suitable for PCR detection. ICN produces more than 15 types of agaroses, but only “HGT” (high genetictechnology grade) agarose is used for PCR detection. The same ratio is at the companies "Serva" and "Difco", specializing in the production of biological products. Agaroses produced by foreign companies are non-toxic, have high strength and transparency of the gel formed, have an EEE of 0.17 - 0.23 and an ash content of 0.46 ± 0.1.
Получение агароз данных марок (electrophoresis grade и genetictechnology grade) сопряжено со значительными материальными затратами первоначально на очистку агара, используемого для дальнейшей переработки, а затем на выделение из него агарозы путем его ацетилирования и последующей либо экстракцией агарозы либо осаждения агаропектина и неагаровых примесей. Стоимость агароз такого типа составляет от 135 до 350 $ за 100 г. В России агароз подобного качества не выпускается. Высокая стоимость тест-систем, в состав которых входит и агароза, является одним из недостатков, препятствующих в настоящее время широкому использованию ПЦР в клинической практике диагностики заболеваний (Ж.микроб., эпидемиол. и иммунологии, -1997, N 5, с. 87). Obtaining agaroses of these grades (electrophoresis grade and genetictechnology grade) involves significant material costs initially for cleaning the agar used for further processing, and then for isolating agarose from it by acetylation and subsequent either extraction of agarose or precipitation of agaropectin and non-agar impurities. The cost of this type of agarose is from $ 135 to $ 350 per 100 g. In Russia, agarose of this quality is not produced. The high cost of test systems, which include agarose, is one of the drawbacks that currently impedes the widespread use of PCR in the clinical practice of diagnosing diseases (J. microbe, epidemiol. And immunology, -1997, N 5, p. 87 )
Опыты по использованию агароз других марок для приготовления электрофоретической среды с целью детектирования продуктов ПЦР показали их низкую эффективность и неэкономичность. Применение агароз различной степени очистки требует подбора их концентрации для приготовления геля необходимой прочности, прозрачности и электрофоретической подвижности ДНК для качественного учета результатов. При этом прочность и прозрачность гелей из агароз находится в обратнопропорциональной зависимости с подвижностью детектируемой ДНК. Испытанные гели из агароз других марок дают либо низкую прозрачность, либо высокую диффузию полос, что затрудняет учет результатов, повышает вероятность ошибок и ведет к повторному проведению анализа, т.е. удлинению и удорожанию анализа. Experiments on the use of other brands of agarose for the preparation of an electrophoretic medium for the detection of PCR products have shown their low efficiency and uneconomicity. The use of agaroses of varying degrees of purification requires the selection of their concentration for the preparation of the gel of the required strength, transparency and electrophoretic mobility of DNA for the qualitative consideration of the results. Moreover, the strength and transparency of agarose gels is inversely proportional to the mobility of the detected DNA. Tested gels from agaroses of other brands give either low transparency or high diffusion of the bands, which makes it difficult to take into account the results, increases the likelihood of errors and leads to repeated analysis, i.e. lengthening and appreciation of the analysis.
Технической задачей изобретения является увеличение числа способов электрофоретического детектирования продукта ПЦР за счет использования нового гелеобразователя. An object of the invention is to increase the number of methods for electrophoretic detection of a PCR product through the use of a new gelling agent.
Поставленная задача решается способом детектирования продукта ПЦР, включающим приготовление геля с использованием гелеобразователя и проведения электрофореза реакционной смеси в геле с последующим просмотром его в УФ-свете, при этом в качестве гелеобразователя используют агар, содержащий серы и азота не более 0,3 мас.% и 0,1 мас.% соответственно, имеющий зольность не более 1,2%, прозрачность и прочность 1% геля не ниже 80% и 500 г/см2, соответственно, а показатель ЭЭО составляет 0,34 ± 0,01.The problem is solved by the method of detecting a PCR product, including the preparation of a gel using a gelling agent and electrophoresis of the reaction mixture in a gel, followed by viewing it in UV light, while an agar containing sulfur and nitrogen of not more than 0.3 wt.% Is used as a gelling agent and 0.1 wt.%, respectively, having an ash content of not more than 1.2%, transparency and strength of 1% gel is not lower than 80% and 500 g / cm 2 , respectively, and the EEE is 0.34 ± 0.01.
Применение заявляемого агара с вышеприведенными характеристиками приводит к получению высокопрозрачного, прочного геля, обладающего высокой разрешающей способностью при разделении фрагментов ДНК, что позволяет использовать такой агар как гелеобразователь в предложенном способе детектирования продуктов ПЦР. The use of the inventive agar with the above characteristics results in a highly transparent, durable gel with high resolution in the separation of DNA fragments, which allows the use of such agar as a gelling agent in the proposed method for detecting PCR products.
Агар представляет собой смесь двух полисахаридов: агарозы - линейного нейтрального галактанового гидроколлоида и агаропектина. Кроме этих двух основных компонентов природные агары содержат значительное количество неагаровых примесей органического и неорганического происхождения. Органические примеси, как правило, азотистые соединения (белки), а минеральные вещества представлены солями кальция, магния, железа, алюминия, сульфатами. В зависимости от степени очистки агар используется в пищевой, фармацевтической, текстильной, бумажной и других отраслях промышленности. Очищенный агар является незаменимым препаратом, используемым для приготовления питательных сред в микробиологии, для вирусологических, иммунологических и иммунохимических исследований, а также специальных исследований в области молекулярной биологии и генетики, генной инженерии и биотехнологии. Agar is a mixture of two polysaccharides: agarose - a linear neutral galactan hydrocolloid and agaropectin. In addition to these two main components, natural agars contain a significant amount of nonagar impurities of organic and inorganic origin. Organic impurities are usually nitrogenous compounds (proteins), and minerals are represented by salts of calcium, magnesium, iron, aluminum, sulfates. Depending on the degree of purification, agar is used in food, pharmaceutical, textile, paper and other industries. Purified agar is an indispensable drug used for the preparation of culture media in microbiology, for virological, immunological and immunochemical studies, as well as special studies in the field of molecular biology and genetics, genetic engineering and biotechnology.
Существует большое количество марок агаров, отличающихся по своим свойствам из-за качества исходного сырья и применения различных способов его выделения. Так, для проведения вирусологических, иммунохимических, генетических и специальных бактериологических исследований агар должен быть максимально очищенным от всякого рода органических и минеральных загрязнений, что позволяет получить предельно осветленный, прозрачный и прочный гель. Для оценки качества агаров используют следующие показатели: содержание серы и азота, зольность, прозрачность и прочность образуемого ими геля, а также величина ЭЭО. There are a large number of brands of agar, differing in their properties due to the quality of the feedstock and the use of various methods for its isolation. So, for virological, immunochemical, genetic and special bacteriological studies, the agar should be maximally purified from all kinds of organic and mineral contaminants, which allows to obtain extremely clarified, transparent and strong gel. The following indicators are used to assess the quality of agar: sulfur and nitrogen content, ash content, transparency and strength of the gel formed by them, as well as the EEE value.
Увеличение содержания в агаре серы (более 0,3%) приводит к образованию геля, в котором вследствие выраженного эндоосмоса и адсорбции при электрофорезе искажается картина полос ДНК. Кроме того, повышенное содержание сульфатированных полисахаридов (повышенное содержание серы) вызывает гидролиз нуклеиновых кислот, что также ведет к снижению качества ЭЛЕКТРОФОРЕЗА и тем самым затрудняет идентификацию ДНК. Наличие сульфогрупп является также причиной низкой прочности и прозрачности агарового геля. Присутствие в агаре неагаровых примесей, характеризуемое зольностью, ведет к таким же последствиям, что и повышенное содержание серы (Rees D.A. "Advan. Carbohyd. Chem. - 1969. - N.25 - P.321 - 328). An increase in the content of sulfur in the agar (more than 0.3%) leads to the formation of a gel in which the pattern of DNA bands is distorted due to pronounced endosmosis and adsorption during electrophoresis. In addition, an increased content of sulfated polysaccharides (increased sulfur content) causes hydrolysis of nucleic acids, which also leads to a decrease in the quality of ELECTROPHORESIS and thereby complicates the identification of DNA. The presence of sulfo groups is also the reason for the low strength and transparency of the agar gel. The presence of non-agar impurities in the agar, characterized by ash, leads to the same consequences as the increased sulfur content (Rees D.A. "Advan. Carbohyd. Chem. - 1969. - N.25 - P.321 - 328).
Использование агара с более высоким показателем ЭЭО (выше 0,34) приводит к ухудшению разрешающей способности геля при электрофорезе, увеличивая диффузию и размытость полос. The use of agar with a higher EEE (above 0.34) leads to a deterioration in the resolution of the gel during electrophoresis, increasing the diffusion and blurring of the bands.
В случае, если агар имеет показатель прочности геля ниже 500 г/см2, это приводит к быстрому разрыву геля.If the agar has a gel strength index below 500 g / cm 2 , this leads to a rapid rupture of the gel.
Температура плавления агара с вышеперечисленными свойствами составляет (34,0 ± 0,3)oC (как и у высококачественных агароз), что позволяет использовать высокое напряжение (от 1- до 20 В/см), тем самым увеличивая подвижность ДНК и снижая диффузию полос, получая узкие полосы, в целом добиваясь минимального времени электрофореза (8-15') и высокой разрешающей способности при идентификации ДНК.The melting point of agar with the above properties is (34.0 ± 0.3) o C (like high-quality agaroses), which allows the use of high voltage (from 1- to 20 V / cm), thereby increasing the mobility of DNA and reducing diffusion bands, getting narrow bands, generally achieving a minimum electrophoresis time (8-15 ') and high resolution for DNA identification.
В России в настоящее время выпускают микробиологический агар (ГОСТ 17206-84), однако он оказался непригодным для вирусологических и иммунохимических исследований из-за своего токсического воздействия на клетки и ингибирующего действия на вирусы, а кроме того, он дает искаженную картину распределения белков по фракциям и число фракций (Н.П. Дмитриенко. Лабораторное дело, -1973, - N 6, с.378). Microbiological agar (GOST 17206-84) is currently being produced in Russia, however, it turned out to be unsuitable for virological and immunochemical studies because of its toxic effect on cells and its inhibitory effect on viruses, and in addition, it gives a distorted picture of the distribution of proteins by fractions and the number of fractions (NP Dmitrienko. Laboratory, -1973, - N 6, s. 378).
Данный агар, содержащий 3,5 ± 0,005% золы и 0,63 ± 0,0005% серы (в пересчете на SO4 -2), имеющий прозрачность образованного им 1% геля 45 ± 0,7 и прочность 320 ± 5,7 г/см2, оказался непригодным и в качестве электрофоретического геля для детектирования продуктов ПЦР, т.к. образует малопрочный гель с низкой прозрачностью и высокой диффузией полос, что дает искажение полос ДНК при облучении УФ-светом.This agar containing 3.5 ± 0.005% ash and 0.63 ± 0.0005% sulfur (in terms of SO 4 -2 ), having a transparency of 1% gel formed by it of 45 ± 0.7 and strength 320 ± 5.7 g / cm 2 was also unsuitable as an electrophoretic gel for detecting PCR products, because forms a low-strength gel with low transparency and high diffusion of bands, which gives distortion of DNA bands when irradiated with UV light.
Зарубежными фирмами "Serva", "Difco", "Ferak" и др. выпускается несколько типов агаров для микробиологических исследований, имеющих следующие физико-химические показатели: агар "Difco"(США): прозрачность и прочность 1,5% геля 51 ± 0,6 300 ± 5,1 г/см2, соответственно, зольность 1,86 ± 0,003%; содержание серы 0,91 ± 0,0004%; агар "Ferak" (ФРГ) имеет зольность 4,06% и прочность 1% геля 440 г/см2. Также как и для российского микробиологического агара, картина, которую получают при их использовании в качестве электрофоретической среды для детектирования продуктов ПЦР, искажена: полосы ДНК широкие, не имеют четкой границы за счет высокой диффузии.Foreign companies "Serva", "Difco", "Ferak" and others produce several types of agar for microbiological research, having the following physicochemical parameters: Difco agar (USA): transparency and strength of 1.5% gel 51 ± 0 6,300 ± 5.1 g / cm 2 , respectively, an ash content of 1.86 ± 0.003%; sulfur content 0.91 ± 0.0004%; agar "Ferak" (Germany) has an ash content of 4.06% and a strength of 1% gel 440 g / cm 2 . As well as for Russian microbiological agar, the picture obtained when used as an electrophoretic medium for detecting PCR products is distorted: DNA bands are wide, do not have a clear border due to high diffusion.
Таким образом, способ получения и степень очистки агара изменяют его физико-химические показатели, что приводит к изменению областей его использования. При этом не удалось обнаружить сведений об использовании именно агара для приготовления геля, используемого в качестве электрофоретического носителя для детектирования амплификационных продуктов ПЦР. Thus, the method of preparation and the degree of purification of the agar change its physico-chemical parameters, which leads to a change in the areas of its use. However, it was not possible to find information about the use of agar specifically for the preparation of a gel used as an electrophoretic carrier for detecting PCR amplification products.
Сочетание заявляемых физико-химических показателей агара позволило впервые применить данный высокоочищенный агар в качестве гелеобразователя для целей детектирования продуктов ПЦР и заменить им чрезвычайно дорогие импортные агарозу и полиакриламид. The combination of the claimed physical and chemical indicators of agar made it possible for the first time to use this highly purified agar as a gelling agent for the detection of PCR products and replace it with extremely expensive imported agarose and polyacrylamide.
В основу способа получения агара с заявляемыми свойствами положен принцип последовательного удаления неагаровых примесей и фракций кислых полисахаридов для снижения в нем содержания высокосульфатированных молекулл. Способ представляет из себя цикл со строгой хронологической последовательностью этапов экстракций и коагулирования неагаровых примесей в градиенте pH, экстракции сульфатных групп, освобождения коагеля от коагулянта, желировании агара, удаления из геля агара растворимых в воде примесей с последующим его дегидрированием методом прессования и сублимационного высушивания (Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1997. -N 5, с. 101-104; Технологическая инструкция по изготовлению высокоочищенного агара в производственных условиях, N 95-90; Фармокопейная статья 42 - 359 ВС - 90). The method for producing agar with the claimed properties is based on the principle of sequential removal of non-agar impurities and fractions of acid polysaccharides to reduce the content of highly sulfated molecules in it. The method is a cycle with a strict chronological sequence of stages of extraction and coagulation of nonagar impurities in a pH gradient, extraction of sulfate groups, release of the coagel from the coagulant, gelation of the agar, removal of water-soluble impurities from the agar gel, followed by its dehydrogenation by pressing and freeze-drying (G Microbiology, Epidemiology and Immunobiology.- 1997. -N 5, pp. 101-104; Technological instructions for the manufacture of highly purified agar under industrial conditions, N 95-90; Ф Armocopy article 42 - 359 BC - 90).
Для оценки качества агара определение физико-химических показателей производили по следующим методикам: прочность, оптическую плотность, зольность и температуру застудневания геля агара проводили в соответствии с ГОСТ-26185-84; содержание общего азота по Нееслеру; серу определяли путем сжигания пробы в хлорной кислоте с последующим турбидиметрическим определением сульфат иона модифицированным методом Dodgson и Pricce (Biochim.biophys. Acta, v.86, p.l69, 1964); содержание неорганических химических примесей - с помощью атомно-абсорбционного спектрометра фирмы Hitachi; качественное определение на присутствие химических элементов осуществляли методом оптической эмиссионной спектроскопии в дуге постоянного тока; электроэндоосмос (ЭЭО) - в качестве маркеров определения использовали реополиглюкин с содержанием декстрана (молекулярной массой 30-40 тыс) и бычий сывороточный альбумин ("Методические указания по применению физико-химических и химических методов контроля медицинских биологических препаратов", 1982). To assess the quality of agar, the determination of physico-chemical parameters was carried out according to the following methods: strength, optical density, ash content and gelation temperature of the agar gel was carried out in accordance with GOST-26185-84; Neesler total nitrogen content; sulfur was determined by burning a sample in perchloric acid followed by turbidimetric determination of the sulfate ion using the modified Dodgson and Pricce method (Biochim.biophys. Acta, v.86, p.l69, 1964); the content of inorganic chemical impurities - using a Hitachi atomic absorption spectrometer; a qualitative determination of the presence of chemical elements was carried out by optical emission spectroscopy in a DC arc; electroendoosmosis (EEO) - reopoliglukin with dextran content (molecular weight 30-40 thousand) and bovine serum albumin (Methodological Instructions for the Use of Physico-Chemical and Chemical Control Methods of Medical Biological Preparations, 1982) were used as markers for determination.
Для детекции использовали гель, приготовленный из высокоочищенного агара, имеющего следующие физико-химические показатели: зольность - 1,20 ± 0,002%, содержание серы - 0,29 ± 0,0002% (в пересчете на SO4 -2), содержание кальция - 0,19 ± 0,0001%, магния 0,02 ± 0,00001%; железа -0,02 ± 0,00001%; показатель ЭЭО 0,34 ± 0,001, прочность 1% геля 650 г/см2 и прозрачность 1% геля 82%.For detection, we used a gel prepared from highly purified agar having the following physicochemical parameters: ash content - 1.20 ± 0.002%, sulfur content - 0.29 ± 0.0002% (in terms of SO 4 -2 ), calcium content - 0.19 ± 0.0001%, magnesium 0.02 ± 0.00001%; iron-0.02 ± 0.00001%; the EEE value is 0.34 ± 0.001, the strength of 1% gel is 650 g / cm 2 and the transparency of 1% gel is 82%.
В качестве красителя для окрашивания геля при электрофоретическом детектировании продуктов ПЦР используют различные интеркалирующие и флюоресцирующие красители, например бромистый этидий или акридиновый оранжевый (Sharp Р.А., Sugden В. и др. "Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilis parainfluenzae using analytical agarose ". Biochemistry, 1973. V.12, p. 3055). Various intercalating and fluorescent dyes, for example ethidium bromide or acridine orange (Sharp P. A., Sugden B., et al. "Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilis parainfluenzae using analytical agarose) are used as gel coloring dyes for electrophoretic detection of PCR products. ". Biochemistry, 1973. V.12, p. 3055).
Способ детектирования осуществляли методом электрофореза в агаровом геле на образцах, содержащих ДНК Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis и т.д. The detection method was carried out by agar gel electrophoresis on samples containing DNA of Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, etc.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами. The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Example 1
Детекцию продуктов амплификации проводят путем гельэлектрофореза реакционной смеси в окрашенном бромидом этидия 2% агаровом геле с последующим просмотром его в ультрафиолетовом свете. Амплифицированные фрагменты ДНК идентифицируют сравнением с положительным контролем, в котором содержалась ДНК Chlamydia trachomatis. В лунку для отрицательного контроля вместо образца вносят дистиллированную воду. Amplification products are detected by gel electrophoresis of the reaction mixture in ethidium bromide-stained 2% agar gel, followed by viewing it in ultraviolet light. Amplified DNA fragments are identified by comparison with the positive control, which contained the DNA of Chlamydia trachomatis. Distilled water is added to the well for negative control instead of the sample.
Обнаружение Chlamydia trachomatis проводят в четыре этапа:
а) приготовление агарового геля
Агаровый гель готовят на основе высокоочищенного агара, имеющего вышеприведенные показатели.The detection of Chlamydia trachomatis is carried out in four stages:
a) preparation of agar gel
The agar gel is prepared on the basis of highly purified agar having the above indicators.
2 г агара растворяют в 98 мл буфера для электрофореза. Буфер состоит из 10,7 г Трис, 5,5 г борной кислоты, 4 мл 0,5 М ЭДТА на 1 литр дистиллированной воды, pH - 7,6. Агар вносят в буфер, доводят до кипения и полного растворения агара в буфере. Затем, после остывания геля до 50-60oC вносят бромистый этидиум в конечной концентрации 5 мг в 1 мл. Готовый гель вместе с красителем заливают на пластиковую подложку с вставленными гребенками и оставляют на 30 минут до застывания геля. Гребенки вынимают, промывают лунки электрофорезным буфером.2 g of agar was dissolved in 98 ml of electrophoresis buffer. The buffer consists of 10.7 g of Tris, 5.5 g of boric acid, 4 ml of 0.5 M EDTA per 1 liter of distilled water, pH 7.6. Agar is added to the buffer, brought to a boil and the agar is completely dissolved in the buffer. Then, after cooling the gel to 50-60 o C make ethidium bromide in a final concentration of 5 mg in 1 ml. The finished gel along with the dye is poured onto a plastic substrate with inserted combs and left for 30 minutes until the gel solidifies. The combs are removed, washed with electrophoresis buffer.
б) внесение образца
В лунки геля под буфер вносят по 7 мкл полученной после амплификации смеси из клинических образцов, положительного и отрицательного контроля. Пластину помещают в аппарат для электрофореза.b) sample application
In the wells of the gel under the buffer contribute 7 μl obtained after amplification of the mixture from clinical samples, positive and negative controls. The plate is placed in an electrophoresis apparatus.
в) проведение электрофореза
Электрофорез проводят при напряжении 20 V/см в течение 10 минут (напряжение, устанавливаемое в блоке питания при расстоянии между электродами 10 см равно 200 V).c) electrophoresis
Electrophoresis is carried out at a voltage of 20 V / cm for 10 minutes (the voltage set in the power supply at a distance between the electrodes of 10 cm is 200 V).
г) учет результатов
Вынимают гель из прибора для электрофореза и помещают его на стекло трансиллюминатора. При освещении геля ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм продукт амплификации виден в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета. Наличие полосы, характерной по форме и расположению для полосы положительного контроля? свидетельствует о том, что в клиническом образце присутствует искомая ДНК. При отсутствии такой полосы или ее размытости и смещении результат принимают за отрицательный или проводят повторное исследование.d) accounting of results
The gel is removed from the electrophoresis device and placed on a transilluminator glass. When the gel is illuminated with ultraviolet light with a wavelength of 254 nm, the amplification product is visible as a luminous strip of red-orange color. Is there a band characteristic of the shape and location of the positive control band? indicates that the desired DNA is present in the clinical sample. In the absence of such a band or its blurring and bias, the result is taken as negative or re-examination is carried out.
Пример 2. Example 2
Определение присутствия Trichomonas vaginalis проводят аналогично вышеприведенному способу, за исключением того, что в качестве положительного контроля в лунку вносят ДНК Trichomonas vaginalis и дальше осуществляют определение аналогично примеру 1. Получают четкие линии, позволяющие их однозначное отнесение. Determination of the presence of Trichomonas vaginalis is carried out similarly to the above method, except that as a positive control, Trichomonas vaginalis DNA is introduced into the well and then they are determined analogously to Example 1. Clear lines are obtained that allow their unambiguous assignment.
Таким образом, заявляемый способ детекции позволяет расширить объем исследований методом ПЦР в стране и снизить затраты на постановку этого метода за счет использования в качестве гелеобразователя агара с определенными характеристиками взамен дорогостоящей агарозы. Thus, the inventive method of detection allows you to expand the scope of studies by PCR in the country and reduce the cost of setting this method by using agar with certain characteristics instead of expensive agarose as a gelling agent.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000108137/13A RU2169771C1 (en) | 2000-03-31 | 2000-03-31 | Method of detection of polymerase chain reaction product |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000108137/13A RU2169771C1 (en) | 2000-03-31 | 2000-03-31 | Method of detection of polymerase chain reaction product |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2169771C1 true RU2169771C1 (en) | 2001-06-27 |
Family
ID=20232721
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000108137/13A RU2169771C1 (en) | 2000-03-31 | 2000-03-31 | Method of detection of polymerase chain reaction product |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2169771C1 (en) |
-
2000
- 2000-03-31 RU RU2000108137/13A patent/RU2169771C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ФЕДОРОВ Н.А. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). - М., 1996, с.24-26. ДЗАДЗИЕВА М.Ф. и др. Диагностическая ценность полимеразной цепной реакции. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1997, N 5, с.85-87. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bonner et al. | [96] Isolation and characterization of chromosomal nucleoproteins | |
| Kostal et al. | Recent advances in the analysis of biological particles by capillary electrophoresis | |
| Huneeus et al. | Fibrillar proteins from squid axons: I. Neurofilament protein | |
| US5876928A (en) | Method of detecting and characterizing a nucleic acid or a sequence of the latter, and enzymatic reactant for the application of this method | |
| KR101005924B1 (en) | Nucleic Acid Extraction Device | |
| US6746841B1 (en) | FTA- coated media for use as a molecular diagnostic tool | |
| DE3689784T2 (en) | The cationic meriquinone of a benzidine containing ionic components, test combinations containing them and their use in investigations. | |
| KR101006562B1 (en) | Nucleic Acid Extraction Method | |
| EP3377902A1 (en) | Method and device for detecting bacteria | |
| WO2021002476A1 (en) | Method and kit for detecting target nucleic acid fragment | |
| CN108410951A (en) | A kind of new nucleic acid extracting reagent and its application | |
| EP1177420B1 (en) | Fta-coated media for use as a molecular diagnostic tool | |
| Yadav et al. | Polydiacetylene vesicles acting as colorimetric sensor for the detection of plantaricin LD1 | |
| DE69123010T2 (en) | New method for the quantitative determination of extracellular DNA in a biological fluid | |
| RU2169771C1 (en) | Method of detection of polymerase chain reaction product | |
| Appenroth et al. | Effects of light quality on amino acid composition of proteins in Wolffia arrhiza (L.) Wimm. using a specially modified Bradford method | |
| CN112771158B (en) | Alkaline phosphatase composition and method for producing dephosphorylated nucleic acid and labeled nucleic acid | |
| JP7402429B2 (en) | Alkaline phosphatase composition and method for producing dephosphorylated nucleic acid and labeled nucleic acid | |
| EP0958300A1 (en) | Electrokinetic sample preparation | |
| US5605800A (en) | Method of detecting and characterizing a nucleic acid or a sequence of the latter, and enzymatic reactant for the application of this method | |
| Riehl et al. | Crosslinking of N‐Acetyl‐phenylalanyl [s4U] tRNAPhe to Protein S10 in the Ribosomal P Site | |
| CN111424073A (en) | A kind of closed tube nucleic acid amplification detection method and device | |
| CN110578012A (en) | A kit for rapid detection of Pseudomonas aeruginosa | |
| CN112195176A (en) | Method for separating and purifying nucleic acid solid from biological material | |
| CN119757294B (en) | A highly sensitive detection method for D-lactic acid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050401 |