RU2166868C1 - Способ получения биологически активного средства - Google Patents

Abstract

Изобретение может быть использовано в биотехнологии, в частности при получении биологически активного общеукрепляющего средства. Для получения средства ликопинсодержащую биомассу лиофилизируют с последующим ее измельчением. Затем проводят экстрагирование биомассы хлороформом дважды в течение 30 мин при соотношении биомасса : хлороформ = 1 : 8 в атмосфере азота при интенсивном перемешивании. Экстракты объединяют и проводят пробу на отсутствие следов хлороформа. Концентрат ликопина смешивают с растительным маслом и полученную 2%-ную суспензию капсулируют. Способ позволяет получить добавку, обладающую антиоксидантными и адаптогенными свойствами, увеличить ее биологическую ценность, повысить эффективность способа и снизить трудоемкость.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения биологически активного общеукрепляющего средства.

В настоящее время в результате массированного загрязнения окружающей среды наблюдаются изменения в течении симптомов заболеваний и в связи с этим падает эффективность многих традиционных методов диагностики, средств и методов лечения. Поэтому в настоящее время в медицине уделяется усиленное внимание медико-экологической реабилитации населения, направленной на снижение патологических процессов, вызванных неблагоприятным экологическим фоном [1]. В этом отношении наибольшая эффективность в восстановлении здоровья создается совместным применением фармакологических препаратов и биологически активных природных средств.

Среди последних наибольшее внимание в настоящее время привлекает каротиноид ликопин, обладающий особыми лечебно-профилактическими свойствами. Ликопин представляет собой C₄₀-изопреноид, имеющий темно-красную окраску. Этот каротиноид распространен среди многих растений, однако наибольшее его количество содержится в томатах. Много ликопина находится также в мицелии некоторых представителей мукоровых грибов, у которых этот каротиноид составляет до 1,5% от веса сухой биомассы [2].

Первоначально ликопин привлек внимание как окрашивающее средство для пищевой промышленности, где этот каротиноид заменил собой ряд синтетических красителей, небезопасных для здоровья (потенциальных канцерогенов).

В последние годы ликопин пользуется особым вниманием медиков в связи с тем, что его антиоксидантная активность выше чем у β-каротина. Известно, что развитие целого ряда заболеваний сопровождается активацией свободнорадикального окисления и приводит к перекисному окислению липидов (ПОЛ), что лежит в основе патогенеза [3]. Это обстоятельство служит основой поиска ингибиторов ПОЛ, среди которых наибольшее применение в последнее время получил ликопин [4]. Вероятно, это свойство ликопина объясняет установленную закономерность, состоящую в том, что люди, употребляющие пищу, богатую ликопином, менее подвержены заболеванию раком простаты [5]. Есть также данные о том, что ликопин может задерживать развитие рака поджелудочной железы и, возможно, желудка [4]. Все сказанное свидетельствует о том, что использование ликопина как биологически активного средства необходимо для поддержания жизненного статуса.

Известны несколько способов извлечения ликопина из природных объектов [в частности из томатов [6, 8] и из мицелия мукоровых грибов (+) и (-) штаммов Blakeslea trispora [2, 7]. Ликопин из томатов Lycopersicum esculentum [8] получают путем обезвоживания биомассы, центрифугированием, экстракцией н-гексаном с добавлением фосфолипидов из сои, отделением растворителя, повторной экстракцией н-гексаном. Дополнительная очистка проводится на колонке с окисью алюминия и элюцией продукта смесью ацетона с гексаном.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения и извлечения ликопина [2], согласно последнему продуцентами синтеза ликопина являются Т (+) и Т (-), ВКМ F-904 (+), ВКМ F-903 (+), ВКМ F-812 (+) штаммы Blakeslea trispora. Штаммы выращивают раздельно, а затем совместно на питательной среде. В качестве посевного материала используют спорангиоспоры, соотношение посевных (+) и (-) мицелиев составляет 1:7, выращивание осуществляют в более аэробных условиях в течение 86-92 часов, а подсолнечное масло для выращивания используется в количестве 5%. Выход ликопина составляет 1,3-1,5 г/л. Для получения кристаллического ликопина проводят экстракцию биомассы горячим (85^oC) подсолнечным маслом. После кристаллизации при охлаждении промывают препарат этанолом. Дальнейшая очистка ведется перекристаллизацией из толуола кипящим абсолютным этанолом. Получают 97% ликопин. Для получения ликопина, не содержащего примесей других каротиноидов, используют колоночную хроматографию на окиси алюминия.

Недостатком данного способа является длительность и трудоемкость извлечения ликопина из биомассы (+) и (-) штаммов В. trispora, низкая извлекаемость ликопина при использовании подсолнечного масла, потери при последующей перекристаллизации, что приводит к значительному уменьшению выхода конечного продукта. Кроме того, при таком способе извлечения ликопина происходит потеря ряда биологически активных соединений, содержащихся в липидных глобулах мицелия, в которых растворен ликопин. Эти нейтральные липиды, биологическая ценность которых состоит не только в том, что они содержат более 50% эссенциальной жирной кислоты C_18:2, но и в наличии пальмито-олеиновой кислоты (C_16:1), защищающей мембраны от стрессовых воздействий. Кроме того, в липидных глобулах гриба наряду с ликопином, содержатся убихиноны и другие природные антиоксиданты.

Технический результат изобретения заключается в разработке более эффективного и менее трудоемкого способа извлечения ликопина из мицелия грибов. Кроме того, способ позволяет одновременно извлекать ряд других биологически ценных соединений (липидов, содержащих линолевую кислоту, убихинонов и других антиоксидантов). Тем самым, увеличивается биологическая ценность извлекаемого продукта, который предлагается использовать как общеукрепляющую пищевую добавку, обладающую антиоксидантными и адаптогенными свойствами.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что после выращивания продуцента извлечение ликопина ведут из лиофилизированной биомассы, которую подвергают измельчению. Экстракцию осуществляют дважды по 30 минут хлороформом, и объединенный экстракт упаривают до получения концентрированной суспензии ликопина, которую сушат в вакууме до отрицательной реакции на ионы хлора. Выход ликопина - 85-90% от исходного содержания. Полученный концентрат ликопина (КЛ) содержит 3,0-3,5% ликопина. КЛ смешивают с растительным маслом до получения 2%-ной суспензии ликопина, из которой путем капсулирования получают биологически активное средство "Миколикопин".

Кроме того, КЛ может быть использован для получения других лечебно-профилактических препаратов в виде капсул, драже, растворов и таблеток. Примеры конкретного выполнения способа извлечения ликопина.

Пример 1. 150 г лиофилизированной биомассы подвергают измельчению в гомогенизаторе. Измельченную биомассу дважды экстрагируют хлороформом (1:5) в течение 30 минут при соотношении биомасса:хлороформ = 1:8. Экстракцию ведут в атмосфере азота при интенсивном перемешивании (обороты мешалки - 180-200 об/мин). Биомассу отделяют фильтрованием и полученные экстракты объединяют. Далее объединенный экстракт концентрируют на роторном испарителе и удаляют следы хлороформа под вакуумом до отрицательной реакции на ионы хлора, используя качественную реакцию с медной проволокой. Выход ликопина составляет 85-90%.

Для получения биологически активного средства, называемого "Миколикопином", к КЛ добавляют растительное масло (например масло подсолнечное рафинированное дезодорированное ГОСТ 1129-93) до получения 2% суспензии ликопина и на этой основе готовят желатиновые капсулы. Капсулы вырабатывают с использованием желатиновой массы в капсуляторах для формирования капсул типа "Глобекс". Средняя масса капсул (в граммах) - 0,31±0,04, содержание ликопина в капсуле - 0,04-0,06 г. Спектрофотометрические характеристики ликопина (в гексане): три максимума поглощения при 443±4, 471±4, 502±4 нм. Капсулы имеют сферическую, яйцевидную или продолговатую форму, поверхность гладкая, без повреждений, цвет от темно-вишневого до коричневого.

Пример 2. То же, что в примере 1, но экстракцию ликопина ведут из сырой биомассы. Выход ликопина 65-70% от исходного содержания.

Пример 3. То же, что в примере 1, но экстракцию ликопина ведут из сырой замороженной биомассы. Выход ликопина - 60-65%.

Пример 4. То же, что в примере 2, но для большего извлечения ликопина используют дополнительную обработку (гомогенизацию) биомассы с Na₂SO₄. Выход ликопина 70-73%.

Пример 5. То же, что в примере 1, но для извлечения ликопина используют ацетон. Выход ликопина - 60-65%.

Пример 6. То же, что в примере 1, но для извлечения ликопина используют гексан. Выход ликопина - 60-65%.

Проведенное доклиническое изучение безопасности капсул "Миколикопина" в лаборатории лекарственной токсикологии ВИЛАР свидетельствует о низкой токсичности и отсутствии противопоказаний для его применения в рекомендованных дозах. В лаборатории по созданию нетоксичных иммуномодуляторов НИИЭД и ТО РОНЦ им Н.Н.Блохина РАМН проведены испытания, показавшие, что "Миколикопин" кроме антиоксидантного, обладает антимутагенным эффектом, радиопротекторным, иммуномодулирующим действием. Причем радиопротекторное действие "Миколикопина" практически в 2 раза выше, чем суспензии кристаллического (очищенного до 95%) ликопина в растительном масле.

Таким образом, данный способ позволяет значительно повысить выход ликопина (до 93%) за счет использования нового способа извлечения ликопина из биомассы продуцента и создать новое биологически активное средство, обладающее антиоксидантным, радиопротекторным, антимутагенным и иммуномодулирующим эффектами, которое можно использовать и как биологически активную добавку (БАД) к пище. Следует особо отметить, что, благодаря присутствию в "Миколикопине" дополнительных соединений липидной природы, образуемых продуцентом, это средство проявляет более выраженное протекторное действие при неблагоприятных воздействиях, например, при γ- облучении, чем средство, сделанное на основе кристаллического ликопина.

Литература
1. Вольфович Д.П., Куликова В.П., Прокопенко Ю.И. 2000. Новые препараты БАД фирмы "Битра" на основе автолизата пивных дрожжей //Журнал международной академии авторов научных открытий, май-июнь, c. 31-34.

2. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская А.С. 1998. Способ получения ликопина. Патент РФ N 2115678, C 09 B 61/00, 20.07.98.

3. Клебанов Г. И., Капитанов А.Б., Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В. и др. 1998. Антиоксидантные свойства ликопина //Биологические мембраны. Т. 15. N 2. С. 227-237.

4. Gerster H. 1997. The potential role of lycopene for human health //J. Am. College of Nutrition. V. 16. N 2. P. 109-126.

5. Glowannucci E., Clinton S.K. Tomatoes, lycopene, and prostate cancer //Proc. Soc. Exp. Biol. Med., V. 218, N 2, P. 1229-139.

6. Капитонов А. Б., Пименов А.М., Нестерова О.А., Сергеенко В.И. 1994. Способ профилактики и лечения атеросклероза. Патент РФ N 95113015.

7. Ивакин А.Ф., Феофилова Е.П., Киселева А.И., Панова И.А., Зырянов В.В. и др. 1995. Способ получения ликопина. Патент РФ N 2102416.

8. Seshizzi P., Morazzoni P.A process for the extraction of lycopene and extract containing it. EP 0818225 A1.

Claims (1)

1. Способ получения биологически активного средства, включающий получение ликопинсодержащей биомассы, ее экстрагирование и концентрирование, отличающийся тем, что ликопинсодержащую биомассу лиофилизируют с последующим ее измельчением, экстрагирование биомассы осуществляют дважды хлороформом в течение 30 мин при соотношении биомасса: хлороформ = 1 : 8 в атмосфере азота при интенсивном перемешивании, экстракты объединяют, концентрат ликопина смешивают с растительным маслом и полученную 2%-ную суспензию капсулируют.