RU2166510C2 - Псевдодипептиды, способы их получения, фармацевтические композиции, способы лечения - Google Patents

Abstract

Описываются новые псевдопептиды, полученные путем конденсации гистамина или метилзамещенного гистамина и аминокислоты, общей формулы I, где А означает аминогруппу или амидогруппу, представленную СН₃ОСОNH; R₁ и R'₁ представляют атом водорода или один из них представляет атом водорода, а другой - углеводородный радикал; R" представляет атом водорода или группу СН₃; Y, Z каждый являются атомами водорода; n - целое число больше или равное 1, при условии, что β- аланин-гистамин исключается. Соединения могут найти применение как активное начало в таких областях, как терапия и косметология, а также в качестве фактора, улучшающего стабильность композиций, применяемых в терапии, косметологии, сельском хозяйстве и пищевой промышленности. Описываются также способы их получения, фармацевтические композиции и способы лечения. 9 с. и 20 з.п.ф-лы, 1 ил., 9 табл.

Description

Изобретение относится к продуктам, получаемым из гистамина и, в особенности, к продуктам конденсации гистамина или метилзамещенного гистамина и аминокислоты, способу их приготовления и применения как активного начала в таких областях, как терапия и косметология, а также в качестве фактора (агента), улучшающего стабильность композиций, применяемых в терапии, косметологии, сельском хозяйстве и пищевой промышленности (области).

Биологические характеристики дипептидов, подобных β-аланил-гистидину, представляют интерес в отношении их возможности увеличивать естественные защитные и репарационные свойства организма. Однако, несмотря на то, что соединения, подобные β-аланил-гистидину, включающие в свой состав одну или более аминокислот, обладают различными видами активностей и хорошо переносятся организмом, их эффективность значительно снижена из-за быстрого разрушения указанных соединений в организме. Кроме того, несмотря на снижение чувствительности очень малых пептидов к ферментативному разрушению (J. Dressman "Opportunities for peptide absorbtion in the GI tract", Communication GTRV 1992, Paris), процесс ферментативной дезактивации дипептидов может в некоторых случаях привести к высвобождению гистамина. Такая "прогистаминная активность", связанная с потерей активности исходного препарата, является нежелательной в рамках данного изобретения.

Поэтому главной целью данного изобретения является создание пептоидных продуктов, близких к вышеуказанным дипептидам, но эффективность которых не снижается из-за отсутствия их разрушения в организме.

Другим объектом изобретения является создание псевдопептидных продуктов, получаемых из гистамина и характеризующихся действием на повышение уровня защитных и репарационных процессов в организме.

Еще одним объектом изобретения является получение вышеупомянутого псевдопептидного продукта, биодоступность которого улучшена благодаря ацетилированию концевой аминогруппы.

Еще одним объектом изобретения является получение пептоидного продукта, имеющего вышеупомянутую ацетильную группу, как указано выше, так, что гидролиз продукта ферментами, относящимися к ацетилпептид гидролазам, приводит к высвобождению физиологически активных соединений in situ.

Таким образом, изобретение относится к созданию псевдодипептидных продуктов, получаемых путем конденсации гистамина или метилзамещенного гистамина и аминокислоты, имеющих формулу:

,
где A представляет радикал, выбранный из группы, включающей аминный, амидный, лактамовый или уретановый; R₁, R'₁, R₂, R'₂... R_n, R'_n являются атомами водорода или углеводородными радикалами, которые могут быть замещены одной или несколькими функциональными группами; Y и Z являются либо атомом водорода, либо фтора, либо углеводородным радикалом, который может быть заменен одной или несколькими функциональными группами; n - целое число, больше или равное 1; ковалентная связь с гистамином или метилзамещенным гистамином является пептидной связью между карбоксильной группой (карбоксильным радикалом) аминокислоты и аминогруппой (аминным радикалом) гистамина.

Другим объектом изобретения является псевдодипептид, определенный ранее, в котором атом кислорода карбонильной группы, находящейся в месте конденсации аминокислоты и гистамина, замещен атомом серы.

Среди аминокислот, соответcвующих формуле изобретения, следующие аминокислоты дают наилучшие результаты:
β- аланин, формулой которого является
H₂N-CH₂-CH₂-COOH
γ- аминомасляная кислота, формулой которой является
H₂N-CH₂-CH₂-CH₂-COOH
β- аминоизомасляная кислота, формулой которой является

5-аминовалерьяновая кислота, формулой которой является
H₂N-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-COOH
3-фенил-3-аминопропионовая кислота, формулой которой является

6-аминокапроновая кислота, формулой которой является
H₂N-(CH₂)₅-COOH
8-аминооктановая кислота, формулой которой является:
H₂N-(CH₂)₇-COOH
4-метил-аминомасляная кислота, формулой которой является
CH₃-HN-CH₂-CH₂-CH₂-COОH
DL-β-аминомасляная кислота, формулой которой является

L-глутаминовая кислота, формулой которой является

.

Аминокислоты, в которых произведено пироглутаминирование аминогруппы (аминорадикала)

,
или следующие аминокислоты, в которых концевая аминогруппа была ацетилирована. Фактически гидролиз этой группы некоторыми ферментами, типа ацетилпептидгидролаз, позволяет поддерживать in situ образование активного продукта.

N-ацетил-β-аланин

N-ацетил-3-фенил-3-аминопропионовая кислота

.

Помимо этого ацилирование аминокислоты придает ей заданные антиоксидантные свойства, что усиливает биологическую активность псевдодипептидного продукта в соответствии с изобретением

.

Тем не менее, β-аланин является аминокислотой, позволяющей получать псевдодипептидный продукт, полностью удовлетворяющий объектам данного изобретения. β- Аланин может быть сопряжен как с гистамином, формула которого

так и с 1-метил-гистамином или 1-метил-имидоазолетил-амином

или с 3-метил-гистамином или 3-метил-имидоазолетил-амином

.

Предпочтительным псевдодипептидом в рамках данного изобретения является β- аланил-гистамин, формула которого

.

Получение псевдодипептидного продукта согласно изобретению может быть произведено как с помощью химического процесса, так и с помощью синтеза, частично или полностью ферментативного.

Процесс химического получения продукта происходит по следующей схеме

Первая стадия процесса заключается в N-защите аминогруппы аминокислоты (AA) путем конденсации с X-агентом и O-активации карбоксигруппы путем образования связи с Y-группой (Y- конденсация).

N-защита предпочтительно осуществляется путем замещения атома водорода в аминокислотной аминогруппе на X- группировку, которой могут быть ацил-, ацилоксирадикалы и другие. Среди протекторных групп, представляющих наибольший интерес, можно назвать бензилоксикарбонильную, трет-бутилоксикарбонильную (Boc), 9-флуоренилметил-оксикарбонильную (Fmoc), бензильные радикалы, фталоил, 2-нитрофенил-сульфенил, трифторацетил, но трет-бутилоксикарбонильная - являются предпочтительной.

Хотя можно обойтись и без этого, но активация карбоксигруппы является одной из характеристик процесса получения псевдодипептидного продукта согласно данному изобретению. Эта активация проводится преимущественно путем эстерификации аминокислотной карбоксигруппы соединениями из следующей группы: цианометилового спирта, o-нитрофенола, 2,4,5-трихлорфенола, p-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола, пентафторфенола, N-гидроксифталемида, N-гидроксисукцинимида, 1- гидроксипиперидина и 5-хлор-8-гидроксихинолина.

Так, если в качестве Y-группы использовать пентафторфенол, то реакция с аминокислотой (R-COOH) согласно изобретению осуществляется следующим образом

.

Вторым этапом процесса получения продукта является образование связи с гистамином, которое может быть осуществлено в присутствии или отсутствие агента конденсации, при этом аминокислота имеет протектор аминогруппы и/или активатор карбоксильной группы для реакции с гистамином преимущественно в форме дигидрохлорида. Следует отметить, что конденсирующий агент несущественен для взаимодействия с аминокислотой, имеющей активированную карбоксильную группу (O-активация аминокислоты).

Образование связи в отсутствие конденсирующих агентов осуществляется в органическом растворителе (например, хлороформе, 1,2-диметоксиэтане, диметилформамиде и т.д.) вместе с кислотой (например, уксусной и др.) или основанием (например, триэтиламином и др. ), в водно-органическом растворителе (например, смесях пиридин-вода или вода-1,2-диметоксиэтан и т.д.) вместе с основанием (например, едким натром или бикарбонатом натрия и др.), затем с кислотой (например, соляной кислотой и др.); в некоторых каталитических условиях (например, имидазол, N-этилморфолин и др.).

В случае использования конденсирующего агента, им могут являться, например, дициклогексил-карбодиимид (DCC), 1- изобутилоксикарбонил-2-изобутилокси-1,2-ди-гидрохинолин, карбонилдиимидазол, K-реагент Вудворда, a-хлорвинил этиловый эфир, а,a-дихлордиэтиловый эфир, дихлорметил метиловый эфир, DCC с добавлениями, DCC-пентахлорфенол, DCC-пентафторфенол, цианамид, кетимины и кетены, соли оксазолия, EEDQ (1-этоксикарбонил-2- этокси-1,2-дигидрохинолин), инамины ацилфосфониумов, трифенилфосфит и имидазол, комплексы двухвалентной меди, SiCl₄ и др.

На третьем этапе синтеза продукта удаляется конденсирующая группа X или N-защитная группа. Удаление защитной группы осуществляется путем гидрогенолиза, восстановлением натрия в жидком аммиаке, гидразинолизом, ацидолизом, гидролизом или ферментативным путем. Предпочтительное осуществление этого этапа заключается в снятии защиты путем проведения ацидолиза соляной кислотой в уксусной кислоте. На этом последнем этапе псевдодипептидный продукт получается в форме гидрохлорида, и поэтому он должен быть обработан щелочной смолой, для того чтобы перевести продукт в форму основания.

В качестве примера может быть рассмотрено получение β- аланил-гистамина следующим образом:
370 мг гистамина гидрохлорида (2 ммоль) растворяют в 7 мл диметилформамида (DMF). 0,56 мл триэтиламина (4 ммоль) смешивают с 800 мг N-трет-бутилоксикарбонил-β-аланил-пентафторфенилового эфира (2,25 ммоль). Смесь перемешивают в течение 30 минут при 0^oC, а затем, в течение 3 часов, при комнатной температуре. Осадок отфильтровывают и затем промывают диметилформамидом, который затем выпаривают в вакууме. К осадку добавляют эфир, и полученное маслянистое вещество-N-трет-бутилоксикарбонил- β-аланил-гистамин отделяется от смеси декантированием. Затем получают аланил-гистамин гидрохлорид путем обработки N-трет-бутилоксикарбонил- β- -аланил-гистамина в течение 30 минут соляной кислотой, растворенной в уксусной кислоте. Уксусная кислота частично удаляется под вакуумом и к осадку снова добавляют эфир. Затем осадок отфильтровывают. Перекристаллизация в системе этанол/метанол (50/50) - этиловый эфир приводит к получению 300 мг β-аланил-гистамин гидрохлорида. Окончательно β-аланил-гистамин в своей основной форме получают при элюировании гидрохлорида продукта с помощью соответствующих смол.

Метод ферментативного синтеза осуществляют путем нижеприведенной реакции конденсации аминокислоты (AA), содержащей N-защищенную (X) и активированную карбоксильную (Y) группы

В этом случае N-защита, которая была уже описана при получении препарата химическим путем, позволяет повысить растворимость аминокислоты в реакционной среде. Можно выбрать конденсирующую X-группу таким образом, чтобы увеличить растворимость аминокислоты в соответствующем органическом растворителе. Предпочтительно использовать в качестве аминопротектора бензилоксикарбонильный радикал.

X=Ph-CH₂-O-CO-
O-активация карбоксильной группы может быть осуществлена путем эстерификации карбоксильного радикала аминокислоты одним из спиртов, входящих в следующую группу: алифатические спирты, предпочтительно этанол, галогеноалкил спирты, такие как 2,2,2,- трихлорэтанол, ароматические спирты, такие как фенол, а также спирты, уже упомянутые для получения продукта химическим путем. Однако третичные спирты должны быть исключены.

Реакция конденсации с гистамином (или его метилированными формами), или солью гистамина (или его метилированными формами), например, дигидрохлоридом гистамина, проводится в различных органических растворителях, таких как, алифатические углеводороды (циклогексан, гептан и др.) или ароматические соединения (толуол), третичные спирты (трет-бутанол, трет-амиловый спирт), алкилгалоиды (метиленхлорид), эфиры (изопропиловый эфир), ацетонитрил, диметилформамид или диметилсульфоксид. Указанные растворители могут быть использованы как одни, так и в смеси друг с другом, они могут быть как безводными, так и содержащими небольшое количество воды.

Реакция может быть проведена как без оснований, так и с ними, как, например, с триэтиламином.

Ферментным катализатором может являться гидролаза (липаза) микробного, животного или растительного происхождения, как в очищенном, так и неочищенном состоянии.

Так, в качестве катализатора могут использоваться липазы, экстрагированные из микроорганизмов: Pseudomonas sp., Candida rugosa, Mucor sp. или же - животного происхождения: панкреатическая липаза свиньи (LPP), протеазы: трипсин, химотрипсин, субстилизин, папаин и др.

Катализаторы, нерастворимые в реакционной среде, распределяются в растворе непосредственно или на инертном носителе, для того чтобы облегчить их рециклизацию.

Реакция проводится в диапазоне температур от 4^oC до 70^oC, но предпочтительно от 35^oC до 45^oC при постоянном перемешивании.

Продукт сопряжения собирается путем фильтрации или экстракции в соответствующем растворителе.

Удаление защитных групп и очистка могут быть проведены в соответствии с вышеописанным методом для препаративного химического процесса. Однако этап удаления защитных групп может быть проведен с помощью ферментативной реакции в соответствии со следующей диаграммой

.

Указанный процесс сходен с таковым, описанным как реакция конденсации. Однако в том случае, когда R=H, реакцию осуществляют в воде.

На этапе конденсации могут применяться растворы, хотя и реже используемые, но позволяющие снизить необходимым образом затраты производства. Сюда относится использование аминокислот без защиты аминогруппы (где X=Н), но с активированной карбоксильной группой или N-замещенных аминокислот, но без активации карбоксильной группы (где Y=H) или даже аминокислот (X=Y=H). Условия проведения реакций аналогичны тем, что описаны выше для случая использования N-защищенной аминокислоты с активированной карбоксильной группой.

В нижеприведенном примере N-ацетил-β-аланил-гистамин получают следующим образом:
- 2,38 г (15 ммоль) этилового эфира N-ацетил-бетааланина и 1,11 г (10 ммоль) гистамина растворяют в 40 мл смеси трет-амиловый спирт - гептан (25: 75)
- добавляют 0,5 г липазы Amano P (Pseudomonas sp.) и суспензию поддерживают при 40^oC при постоянном перемешивании в течение 48 часов.

Полное исчезновение гистамина контролируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии под высоким давлением (RPC -18-H₂O-CH₃CN-TFA: 99/1/0,1).

Катализатор затем восстанавливают путем фильтрации. Органический растворитель выпаривают под вакуумом для получения маслянистого вещества.

Этот осадок измельчают в этиловом эфире для удаления избытка этилового эфира N-ацетил- β -аланина. В нашем случае выход N-ацетил- β -аланил-гистамина составил 1,9 г.

Фармакологические свойства
Как уже было отмечено, псевдодипептидные продукты, полученные согласно данному изобретению, могут усиливать некоторые защитные и репарационные свойства организма. Таким образом, они препятствуют старению и дегенеративным изменениям тканей глаза, мышц, кожи и др. и улучшают здоровье.

Антиоксидантные характеристики указанных продуктов и их более избирательный характер действия в качестве ловушек свободных радикалов, а также их способность удалять токсичные для организма продукты пероксидации частично объясняют наблюдаемые фармакологические свойства. Способность этих продуктов препятствовать "окислительному стрессу" и тем самым дополнять собственную антиоксидантную систему защиты организма позволяет им препятствовать развитию различных патологий. Так, можно упомянуть их противовоспалительное действие, участие в защите от радиационного воздействия при проведении радиотерапии, их антиатеросклеротическое действие (ингибирование окисления сывороточных липопротеидов низкой плотности), антикатарактальные и противоопухолевые характеристики, описанные в настоящее время в научной литературе.

Как уже было отмечено, псевдодипептидные продукты в соответствии с данным изобретением обладают геропротекторными свойствами, а также замедляют дегенеративные изменения кожных и слизистых покровов. В целом, эти свойства продуктов обусловлены их антиоксидантной активностью и, в частности, антисвободнорадикальной, псевдопероксидазной, антиретикулярной (способностью препятствовать образованию межмолекурных сшивок) и регенераторной активностями для тканей, которые они проявляют.

Более того, существуют многочисленные экспериментальные и эпидемиологические доказательства теории о том, что накопление биохимических повреждений, обусловленных свободными радикалами, вносит существенный вклад в процесс старения. Это особенно явно проявляется при воздействии солнечной радиации, вызывающей образование активных свободнорадикальных форм кислорода, которые, в свою очередь, являются причиной раннего старения кожи, так же как и основным фактором формирования так называемой старческой катаракты.

Большинство клеточных составляющих обычно представляют собой потенциальные мишени для атаки свободными радикалами. Ненасыщенные жирные кислоты, являющиеся составной частью мембранных фосфолипидов, особенно чувствительны к подобной атаке. Их окисление приводит к дезорганизации мембран, к потере внутриклеточных компонентов, к образованию токсичных альдегидов и липопротеиновых комплексов (липофусцинов). Белки также представляют собой мишени для свободных радикалов, атака которых приводит к денатурации белков и их фрагментации. Повреждение соединительной ткани свободными радикалами также является важнейшим аспектом их деструктивного воздействия. Компоненты, содержащие сахара, также атакуются свободными радикалами, при этом деполимеризуется гиалуроновая кислота, а также повреждаются гликопротеиновые рецепторы мембран. Наконец, мишенями большой функциональной значимости являются нуклеиновые кислоты.

Другой характеристикой псевдодипептидных продуктов по данному изобретению, объясняющей их защитное действие на белки при "окислительном стрессе", является наличие имидазольного кольца гистамина. Действительно, в окислительные процессы, обуславливающие повреждение белков, частично вовлечено имидазольное кольцо аминокислоты - гистидина (см. "Hydroxyl radical mediated damage to proteins with special reference to the crystallins" - Biochemistry, vol. 31 (1992), p.4296). Это показывает, что гистидин псевдодипептидов может играть роль отвлекающей ловушки для свободных радикалов.

Продукты псевдодипептидов, заявленные в изобретении, могут противодействовать "окислительному стрессу" и на другом уровне. Указанные вещества способны взаимодействовать не только с различными видами свободных радикалов, но и воздействовать на токсичные промежуточные продукты - перекиси, возникающие вследствие взаимодействия свободных радикалов с некоторыми компонентами клетки. Такая активность была названа "пероксидазной", по аналогии с названием фермента, осуществляющего в организме разрушение и нейтрализацию указанных перекисных соединений, препятствуя при этом развитию цепных окислительных реакций, которые, в частности, ведут к повреждению клеточных мембран. В этом аспекте мы добились репарирующей активности.

Несколько тестов in vitro было проведено для того, чтобы выявить различные антиоксидантные свойства препаратов.

Экспериментальная процедура описана J. М. C. Gutteridge в Biochemistry Journal, vol. 224 (1984), p. 761-767:
- субстрат окисления: дезоксирибоза
- система генерации супероксид анион радикалов: ксантин оксидаза/гипоксантин
- детекция: тиобарбитуровая кислота/малоновый диальдегид (МДА) (см. Тест А в конце текста).

Указанная активность также проявляется в протекторном действии на мембранные фосфолипиды. Свободнорадикальные активные формы кислорода взаимодействуют с фосфолипидами, формируя нестабильные продукты, которые нарушают структуру мембран и индуцируют ее разрывы.

Это воздействие на мембраны показано в следующих тестах.

Тест 1 (см. в конце текста)
- субстрат окисления: фосфатидилхолиновые липосомы,
- система генерации свободных радикалов: Fe / аскорбиновая кислота,
- обнаружение: тиобарбитуровая кислота (ТБК) / малоновый диальдегид (МДА).

Протокол эксперимента описан в "Antioxidant activity of L-carnosine, a natural histidine-containing dipeptide in crystalline lens" Biochim. Biophys. Acta (1989), vol. 1004, p. 363-371.

Тест 2 (см. в конце текста)
- субстрат окисления: линолевая кислота (0,25 мг/мл)
- система генерации свободных радикалов: Fe/аскорбиновая кислота,
обнаружение: тиобарбитуровая кислота (ТБК)/малоновый диальдегид (МДА).

Пероксидазный тип активности псевдодипептидов данного изобретения проявляется в уменьшении концентрации перекисей типа L-OOH, возникающих вследствие атаки мембранных фосфолипидов свободными радикалами кислорода. Такие перекиси могут распадаться и вызывать разрушение клеточных мембран. Механизм действия псевдодипептидов на перекиси дополняет их антирадикальную активность, поскольку позволяет эффективно устранять разрушительное воздействие перекисей на биологические мембраны. Указанный тип активности назван "пероксидазной" по аналогии с некоторыми ферментами (каталазой, глутатионпероксидазой), которые взаимодействуют с перекисью водорода.

Псевдодипептидные продукты, заявленные в изобретении, такие как β- аланил-гистамин, ингибируют следующую реакцию
L-OOH ---> продукты распада (тетрадиены, кетодиены),
путем восстановления перекисей по типу
L-OOH ---> L-OH.

Ряд тестов, проведенных с перекисями, такими как 13- моногидроперекись линолевой кислоты или гидроперекись фосфотидилхолина показали, что псевдодипептидный продукт данного изобретения β- аланил-гистамин ведет себя сходным образом с β- аланил-гистидином, или карнозином. Поведение этого продукта схоже также с химическим восстановительным агентом боргидридом натрия, осуществляющим идентичным образом реакцию распада перекисей.

Следующие тесты иллюстрируют указанный тип активности.

Тест 1A (см. в конце текста)
Кинетику изменения концентрации перекисей исследовали с помощью трех следующих методов:
1^*) Спектрофотометрия при 233 нм, ε = 2,8• 10⁴ М^-1 см^-1
(O. S. Privett, C. Nickell, W.O. Lundberg and P.D. Boyer. J. Am. Oil Chem. Soc., vol. 32 (1955), p.505-511.

2^*) Йодометрическое титрование: М. Hicks, J.M. Gebicki, Analytical Biochemistry, vol. 99, (1979), p. 249-253.

3^*) Тонкослойная хроматография на пластинах силикагеля
(гексан/эфир/уксусная кислота 8/7/0,1).

Примечание к тесту 1А:
(a) 0,5 мМ 13-моногидроперекись линолевой кислоты без восстанавливающего агента (получение согласно H.W. Gardner Lipids, Vol. 10 (1975), p.248-252.

(b) активность полностью ингибируется путем добавления 0,5 мМ ЭДТА
(с) химический восстанавливающий агент.

Тест 2 (см. в конце текста)
"Пероксидазный" тип активности также был выявлен на липосомной модели окисления. Гидроперекиси фосфатидилхолина (PC-ООН) приготовлены по методу, уже описанному для моногидроперекиси линолевой кислоты.

Восстановление гидроперекисей оценивали по титрованию остаточных гидроперекисей методом М. Hicks, J.M. Gebicki, Analytical Biochemistry, vol. 99, (1979), p. 249-253.

Следует отметить, что судя по вышеприведенным тестам, в ряде случаев L-карнозин дает лучшие результаты, чем β- аланил-гистамин. Однако наличие ферментативного разрушения карнозина уже на уровне кожи не позволяет надеяться на успешные результаты его применения in vivo.

Псевдодипептиды, заявленные в данном изобретении, могут воздействовать на последствия окислительного стресса, проявляя свой "антилипофусциновый эффект". Как мы уже видели, окисление жирных кислот и, особенно, фосфолипидов, ведет к их разрушению. Возникающие при этом продукты фрагментации токсичны, в частности они индуцируют межмолекулярные сшивки в белках. Образующиеся в результате этого пигментированные липопротеиновые комплексы названы "липофусцинами".

Перекисное окисление жирных кислот, индуцированное свободными радикалами, не только разрушает эти кислоты, но и инактивирует белки за счет образования поперечносшитых полимеров. Этот процесс, повреждающий ряд ферментов и клеточных органоидов, рассматривается как один из значительных факторов процесса старения. Полимеры, возникающие за счет образования поперечных молекулярных связей между полиненасыщенными жирными кислотами и белками, названы липофусцинами.

Псевдодипептиды по данному изобретению созданы с целью усиления естественных механизмов защиты организма и позволяют ограничить степень повреждения белков, за счет уменьшения процесса образования липопротеидных комплексов.

Другой механизм действия псевдодипептидов по данному изобретению основан на их антигликирующих свойствах, которые заключаются в способности указанных продуктов ингибировать спонтанную конденсацию между аминогруппами белков и сахарами, главным образом глюкозой.

Последовательность данных химических реакций известна на протяжении последнего десятилетия химикам, изучающим пищевые продукты, под названием реакций Мейяра (Maillard). Эти реакции индуцируют накопление необратимых сшивок между белками, количество которых возрастает по мере старения. Подобным образом возникают поперечные сшивки между такими белками, как коллаген и эластин (см. K. Reiser, R.J. Mс Cormick and R.B. Rucker "Enzymatic and nonenzymatic cross-linking of collagen and elastin" - FASEB Journal, vol.6, (1992), p. 2439-3449), в результате чего возрастает жесткость и ригидность тканей, являющиеся типичными проявлениями старения тканей. Прежде всего, это явление относится к белкам, имеющим длительную продолжительность жизни - белкам хрусталика, коллагену, миелину. Подобные явления у такой категории лиц связаны с формированием диабетических катаракт и ускорением образования "ретикулярных" белков, т.е. белковых сетей, удерживаемых поперечными сшивками.

Антигликирующий эффект осуществляется благодаря тому, что продукты псевдодипептидов по данному изобретению являются аминированными нуклеофильными агентами, которые сами по себе направлены против белковой ретикуляризации, опосредованной сахарами, и так становятся препятствием на уровне интермедиатов реакции Мейяра (Maillard) (см. выше). В продуктах по данному изобретению содержится стерически недостаточно скрытый нуклеофильный амин, обеспечивающий указанное свойство.

Наконец, для псевдодипептидов, заявленных в изобретении, продемонстрирована активность действия на клеточную регенерацию в процессах заживления. Обычно процесс заживления слагается из трех фаз: фазы сосудистых и воспалительных изменений, пролиферативной фазы, в которой происходит пролиферация фибробластов и синтез нового коллагена, а также фазы реорганизации рубца, в которой достигается равновесие между лизисом и биосинтезом коллагена.

В указанном процессе псевдодипептидные продукты действуют как хемоатрактанты или активаторы движения клеток, участвующих в восстановлении тканей, на заживляемые участки.

Тест, демонстрирующий действие псевдодипептидного продукта в соответствии с изобретением β-аланил-гистамина, на репарацию соединительной ткани кожи был проведен на крысах. Эксперимент произведен на группе из 12 крыс линии Вистар. На коже крыс были сделаны надрезы длиной 12 мм, проходящие целиком через эпидермис и дерму. В конце периода заживления у крыс на раны наносили β- аланил-гистамин в течение 3-х недель. В то же время, в контрольной группе из 12 крыс была проведена обработка ран плацебо в течение указанной продолжительности эксперимента.

После 3-х недель эксперимента гистологический анализ заживляемой ткани показал, что рубец едва видим или даже совсем невидим на поверхности кожи. Эпидермис хорошо восстановлен. Ороговевающие слои эпидермиса идентичны таковым, окружающим нормальную эпидерму. Заметны различия во внешнем виде ран контрольных животных и животных, обработанных псевдодипептидом.

Заживление зоны дермы выглядит в виде относительно узких полос, расходящихся от эпидермиса к мышечному слою. Граница с неповрежденной зоной отчетлива и ровная без выраженной переходной зоны. Плотность и вид элементов соединительной ткани явно одинаковы как в капиллярном, так и нижележащем слоях. Между тем, тонкие эластические или ретикулиновые волокна, в целом, более многочисленны в поверхностных слоях дермы.

Основное вещество соединительной ткани представлено в большем количестве, чем в норме, что обнаруживается с помощью окраски толуидиновым синим (метахромазия при кислых значениях pH и окраске по Лиссберry (Lissberg)).

С другой стороны, эпидермис крыс контрольной группы животных характеризовался рубцовой припухлостью с утолщением, превышающим уровень для нормальной кожи. Наблюдалась также гиперплазия фибробластов и новообразованных кровеносных сосудов (неоваскуляризация) по всей зоне заживления (формирование рубца). Помимо этого фибробласты умеренно гипертрофированы. Изредка наблюдались утолщенные коллагеновые тяжи, но большая часть коллагеновых волокон короткого размера и средней толщины.

В соответствии с другим механизмом действия, продукты псевдодипептидов, заявленные в изобретении, стимулируют процесс заживления, воздействуя на клетки иммунной системы, вовлеченные на ранней стадии в процесс заживления: лимфоциты, тучные клетки, моноциты, которые играют главную роль в секреции факторов роста.

Указанная иммуностимулирующая активность выявляется благодаря тесту in vitro на мышиных спленоцитах. Методика взята из работы J. Kunert-Radek, Н. Stepien, K. Lyson and М. Pawlikowski "Effects of calcium channel modulators on the proliferation of mouse spleen lymphocytes in vitro" - Agents and Actions, vol. 29, N 3-4 (1990), p.254- 258.

Клеточная пролиферация оценивалась по степени включения тимидина, меченного тритием, в клетки, и выражалась в количестве импульсов радиоактивного распада за мин, после вычитания фона.

Результаты, полученные с использованием в качестве эталона иммуностимулятора конканавалина A, представлены для сравнения.

Иммуностимулирующий эффект оценивается индексом стимуляции (ИС)

Представленные значения величины соответствуют среднему из трех измерений.

Обычно максимум иммуностимулирующего эффекта наблюдался для концентрации β-аланил-гистамина, равной 25 мкг/мл (γ). Короче говоря, наблюдается достаточный иммуностимулирующий эффект (клеточная пролиферация) указанного псевдодипептида для концентраций в диапазоне от 5 до 25 мкг/мл (см. Тест 3 в конце текста).

Наблюдаемая активность сравнима с таковой эталонного митогена - конканавалина A.

Псевдодипептидные продукты, заявленные в изобретении, могут участвовать в защите организма от аллергических реакций и, в частности, блокировать анафилактический шок, а также быть регуляторами активности иммунного ответа.

Указанный тип продуктов может также ограничивать проницаемость кровеносных сосудов, ответственную за развитие отека, и обладать антагонистическим действием по отношению к брадикинину, являющемуся эффектором развития отека (см. К. Nagai Ed. - "Studies of carnosine and related chemicals on the physiology of wound repair mechanism", p. 24-26, Tokyo, 1976). Потенциально антигистаминный характер данного ряда соединений мог бы играть роль в проявлении указанных свойств.

Терапевтическое и косметологическое применение
Существенной характеристикой свойств, в целом изложенных выше, является участие в укреплении естественных защитных и репарационных свойств организма, положенных в основу важных терапевтических и косметологических применений псевдодипептидов по данному изобретению.

Антиоксидантные свойства псевдодипептидных продуктов, в соответствии с изобретением, позволяют предложить указанные продукты для лечения патологий, вызванных "окислительным стрессом".

Важным терапевтическим применением является лечение катаракты. Причины, вызывающие разные типы катаракт, различны. Патогенетические механизмы указанных патологических процессов, будь то сенильная или диабетическая катаракта, могут быть объединены в две категории: механизм окислительного стресса (M. A. Babizhayev, A.I. Deyev, L.F. Linberg "Lipid peroxidation as a possible cause of cataract", Mechanisms of Ageing Dev., vol. 44 (1988); p. 69-89), и механизм гликирования, вызывающий сшивание белков (Т. J. Lyons, G. Silvestri, J. A. Dunn, D. G. Dyer, J.W. Baynes "Role of glycation of lens crystyllins in diabetic and non diabetic senile cataracts", Diabetes, vol. 40, N 8, (1991), p.1010-1015).

Как было показано ранее, антиоксидантные свойства псевдодипептидов, и, в особенности, экспериментально обнаруженные их антирадикальная, "пероксидазоподобная" и антигликирующая активности, делают псевдодипептидные продукты, заявленные в изобретении, эффективными препаратами для лечения катаракты.

Псевдодипептидные продукты в соответствии с изобретением могут препятствовать окислительным процессам, ответственным за развитие атеросклероза. В развитии указанной патологии окисление липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), находящихся в кровеносном русле, ответственно за фрагментацию их белковой составляющей - апопротеина В и липидной фракции этих частиц. Формирующиеся фрагменты могут индуцировать появление таких аномальных клеток, как нагруженные холестерином моноциты и макрофаги, способные к агрегации на стенках кровеносных сосудов, что ведет к формированию атеросклеротических бляшек.

Псевдодипептидные продукты, в соответствии с изобретением, могут быть использованы для лечения вышеуказанного заболевания, тем более что недавно было показано, что процессы гликирования также вовлечены в формирование атероматозной бляшки (см. T.J. Lyons - "Glycation and oxidation - A role in the pathogenesis of atherosclerosis" - American Journal of Cardiology, vol. 71, N 6, (1993), p. 1326-1331).

Псевдодипептидные продукты, заявленные в изобретении, могут также препятствовать канцерогенезу, поскольку показано, что свободнорадикальные активные формы кислорода ответственны за повреждение цепей ДНК, и такого рода изменения способны запускать процесс трансформации здоровых клеток в опухолевые.

Сходным образом антиоксидантные свойства псевдодипептидных продуктов по данному изобретению позволяют их использовать для лечения патологий воспалительного генеза и, в особенности, для лечения ревматоидного артрита. Дело в том, что характерным симптомом воспалительных заболеваний суставов (артритов) является нарушение состава синовиальной жидкости; при этом обнаружено, что деградация одного из ее существенных компонентов - гиалуроновой кислоты - происходит вследствие "окислительного стресса". Исследования последних лет (см. В. Halliwell, J.M.C. Gutteridge "Chronic inflammation and the autoimmune disease" - Free radicals in Biology and Medicine - B. Halliwell, J. M. C. Gutteridge Eds. - Clarenton Press (1989), Oxford, p. 422-438) показали, что перекисное окисление липидов также вовлечено в развитие указанного процессам, и этим может объясняться успешное действие продуктов по данному изобретению на течение указанных заболеваний.

Антиоксидантные свойства псевдодипептидных продуктов в соответствии с изобретением могут также быть использованы в качестве дополнительных средств при проведении радиотерапии. Радиопротектронный эффект, уже известный для β-аланилгистидина, основывается на цитостимулирующих свойствах указанного типа веществ, в особенности в отношении клеток костного мозга, очень чувствительных к радиационным воздействиям, применяемым в радиотерапии.

Согласно последним данным некоторые симптомы эпилепсии могут быть результатом повреждения определенных зон головного мозга активными формами кислорода (см. G.R. Jackson, K. Werbach-Perer, J.R. Perez-Polo - "Role of nerve growth factor in oxidant-antioxidant balance and neuronal injury. 11. A conditioning lesion paradigon" - Journal of Neuroscience Research, vol. 25, N 3 (1990), p. 369-374). Стимулирующее действие продуктов по данному изобретению на способность к регенерации тканей (в данном случае, нервной), является достаточно важным фактором для патологий, связанных с дегенерацией нервной ткани. Указанные продукты по изобретению могут быть также использованы для лечения паркинсонизма, в патогенез которого также может вовлекаться "окислительный стресс", затрагивающий ткань мозга.

В отношении кожи антиоксидантные свойства псевдодипептидных продуктов, заявленных в изобретении, могут быть использованы для нейтрализации эффектов активных форм кислорода, возникающих под действием солнечного света. В этом отношении они будут эффективно блокировать фотоаллергические реакции (под действием свободных радикалов в коже формируются фотосенсибилизаторы). В отношении чувствительных к окислению веществ (например, хлорпромазина), псевдодипептидные продукты будут препятствовать их трансформации в токсичные соединения.

Такая специфика действия находит для псевдодипептидов наилучшее применение во время проведения фотохимиотерапии определенных заболеваний кожи. Действительно, указанные виды лечения основываются на использовании фотосенсибилизатора (например, псоралена), который при облучении дает положительный эффект, взаимодействуя с ДНК, но указанные воздействия, к сожалению, связаны с формированием свободных радикалов, ответственных за нежелательные вторичные эффекты.

Продукты данного изобретения могут также применяться, чтобы препятствовать кожным проявлениям у больных с порфирией, поскольку порфирины потенциируют повреждающее действие, вызванное свободными радикалами.

Они могут быть также назначены больным с целью уменьшения повреждений кожи, связанных с "окислительным стрессом" при аутоиммунных заболеваниях, таких, например, как системная красная волчанка.

Также псевдодипептиды эффективны при назначении против солнечных ожогов: эритемы, отеке и образовании пигментных клеток в коже при загаре.

Антиоксидантные свойства соединений в соответствии с изобретением могут, разумеется, быть использованы для предотвращения старения кожи. Теоретические и экспериментальные доказательства, подтверждающие данный подход, приведены ранее.

Наконец, было продемонстрировано, что указание вещества (псевдодипептиды) активно противостоят различным проявлениям старения тканевых структур кожи.

- Неферментативному образованию сшивок (ретикуляризации), опосредованному сахарами, в таких белках, как коллаген или эластин (V. М. Monnier "Nonenzymatic glycosylation, the Maillard reaction and the aging process" - Journal of Gerontology, vol. 45, N 4, (1990), p. B105-111);
- Формированию липопротеиновых комплексов (липофусцинов).

Другой диапазон применений определяется цитостимулирующими свойствами псевдодипептидных продуктов, заявленных в изобретении, и, как было показано, их иммуностимулирующими свойствами. Указанные свойства позволяют улучшать регенерацию и заживление тканей, и, в известной степени, регулировать функции, в которые вовлечены медиаторы иммунного ответа.

Таким образом, псевдодипептиды могут быть использованы для улучшения нарушенной регенерации соединительной ткани кожи. Они благоприятствуют восстановлению слизистых оболочек после ожогов или химио- и радиотерапии.

В соответствии с механизмом действия указанные продукты могут также использоваться для предотвращения развития и уменьшения морщин.

Цитостимулирующие и регенеративные свойства псевдопептидов оказывают особое воздействие на мышечные ткани, где находятся высокие концентрации родственного природного дипептида β- аланилгистидина. Хотя физиологическая роль этого соединения в настоящее время не полностью установлена, она может быть тесно связана с улучшением мышечной сократимости и регуляции сердечного сокращения. Возможно также использовать указанный вид активности для лечения определенных дегенеративных мышечных заболеваний, таких как миодистрофия Дюшена.

Заживляющее действие псевдодипептидных продуктов, в соответствии с изобретением находит свое применение в различных областях. Можно назвать лечение язвы желудка, для которого дипептидный продукт, родственный карнозину, дал хорошие результаты (М. Ito, Т. Tanaka, Y. Suzuki - "Effect of N-(3-aminopropionyl) - L-histidinato zinc (Z-103) on healing and hydrocortisone- induced release of acetic acid ulcers in rats with limited food- intake-time" - Japanese Journal of Pharmacology, vol. 54, (1990), p. 513-521). Кроме того, антиоксидантные и противовоспалительные свойства продуктов, указанных в изобретении, полезны для лечения этой патологии.

Заживляющее действие псевдодипептидных продуктов в соответствии с изобретением также является существенным для лечения повреждений роговицы. Они могут применяться в постоперационном периоде, например после нанесения насечек на роговицу с целью коррекции миопии.

Также указанные вещества могут иметь большие преимущества при их использовании для лечения синдрома "сухого глаза", которое не только способствует заживлению эпителия роговицы, но также, благодаря тому, что эти вещества по поведению подобны "искусственной слезе", обеспечивает защиту поврежденных тканей против "окислительного стресса" (в нормальных условиях здоровой роговицы, воспалении, облучении ультрафиолетовым светом), и поэтому могут быть использованы в композициях, помогающих восстановлению слезной пленки на поверхности роговицы.

Состав, содержащий дипептиды, заявленные в изобретении, может также противостоять явлениям дегенерации сетчатки, благодаря своему иммуностимулирующему и регенеративному действию. Поскольку окислительный стресс также вовлечен в развитие этой патологии (см. R.E. Anderson, L.M. Rapp, R.D. Wiegand - Current Eye Research, vol. 3, (1984), p.223- 237), указанные вещества могут проявить усиленное воздействие.

Другое важное применение псевдодипептидных продуктов изобретения специфично в отношении их свойств как иммуномодуляторов. В особенности это свойство может благоприятствовать включению псевдодипептидных продуктов, по данному изобретению в парфюмерные изделия и дезодоранты с целью препятствовать развитию аллергических реакций и, в особенности, анафилактического шока, провоцированного некоторыми сильнопахнущими веществами (композициями).

Применение в качестве стабилизаторов и консервантов
Прекрасная переносимость псевдодипептидных продуктов по данному изобретению и их умеренные антиоксидантные и цитостимулирующие свойства позволяют предложить указанные продукты для консервирования и защиты чувствительных веществ от окисления при приготовлении пищевых продуктов, а также для переживающих органов и тканей ex vivo.

Можно упомянуть защиту от окисления липосом для улучшения их стабильности и предотвращения образования сопутствующих токсичных продуктов, защиту гиалуроновой кислоты, включенной в косметические формулы, от деполимеризирующего воздействия свободных радикалов, защиту масел и легкоокисляемых компонентов обычных пищевых и диетических продуктов.

Продукты по данному изобретению позволяют улучшить вакцины, получаемые из крови и сывороток, сохранение органов и, в особенности, сердец, предназначенных для трансплантации.

Различные виды применений псевдодипептидных продуктов по данному изобретению раскрыты в следующих примерах, в которых указаны дозы и составы продуктов, используемых как лекарство или в качестве стабилизирующего агента.

Пример 1
Данный пример относится к использованию β-аланилгистамина для лечения пациентов, страдающих катарактой.

Исследование было выполнено с целью оценки возможных изменений во времени мутности хрусталика пациентов, страдающих катарактой. Все пациенты вначале были подвергнуты офтальмологическому обследованию. Оно включало запись истории болезни пациента, измерение остроты зрения при наилучшей коррекции, прямую и обратную офтальмоскопию, оценку помутнений с помощью щелевой лампы, клиническую оценку градаций степени помутнения хрусталика при максимальном мидриазе, классификацию катаракты по типу, получение ретроиллюминационных изображений хрусталика. Кроме того, были взяты пробы крови для химического анализа вначале и в последующие периоды обследования.

Полное обследование позволило установить начальный статус пациентов перед лечением, который определялся как исходный (базовый) уровень.

Офтальмологические обследования проводились каждые две недели в течение двух месяцев, затем - каждый месяц. Они включали оценку максимальной остроты зрения после коррекции, прямую и обратную офтальмоскопию, исследование с помощью щелевой лампы, и после максимального расширения зрачка (за исключением пациентов с первичной открытоугольной глаукомой) проведение клинической оценки степени (градации) помутнений, классификацию катаракты. Изображения хрусталика регистрировали при ретроиллюминационном обследовании и с помощью щелевой лампы.

У всех испытуемых изменения в хрусталиках исследовались путем биомикроскопии с помощью щелевой лампы. С помощью этой же техники осуществляли фотографическую регистрацию, включающую исходный уровень, промежуточное и заключительное обследования, выполненные в конце срока применения препарата.

Используя фотощелевую лампу, хрусталик фотографировали послойно для визуализации всего переднего сегмента глаза, начиная с роговицы и кончая задней капсулой хрусталика.

С помощью этой же техники проводили исследование рефлекса глазного дна согласно общепринятой методике ретроиллюминации. Изменения хрусталика оценивали по их анатомической локализации и степени выраженности.

Кортикальные помутнения оценивали и регистрировали в виде изображения методом ретроиллюминации. Впоследствии проводили линейную денситометрию негативных изображений на микроденситометре. Степень помутнения выражали в величинах оптической плотности, используя стандартную шкалу помутнений. Измерения кортикальных помутнений проводили также с учетом общей площади, экспонированной к облучению светом. Задние субкапсулярные помутнения измеряли с использованием ретроиллюминации по наибольшей высоте от нижней части до вершины и по наибольшей ширине, используя соответствующую шкалу увеличения щелевой лампы.

Также получали изображения ядерных и кортикальных помутнений хрусталика, которые впоследствии шкалировались по градациям помутнения.

Полученные с помощью щелевой лампы негативы анализировали с помощью телевизионной трубки (plumbicon tube). С помощью указанного оборудования измеренные интенсивности света с большой точностью переводятся в электрические сигналы, которые интегрируются и накапливаются в компьютерной системе, анализирующей изображения. С помощью специальной программы изображения хрусталика оцифровывались и воспроизводились в виде двух- или трехмерных изображений.

Детальное описание данного метода преобразования изображений дано в работе: Babizhayev М.A., Zhukotskii A.V. and Sologub A.A. (1992), "Image analysis of the lens opacities induced in developing chick embryo by glucocorticoid", Exp. Eye Res. vol. 55, p. 521-537.

Примеры оценки изображений даны на чертеже. Представленные гистограммы (см. чертеж) показывают на конкретном примере значение данного вычислительного метода. Случай задней субкапсулярной катаракты изучен перед и после двух с половиной месяцев лечения путем закапывания в глаз глазных капель, содержащих 1% β- аланилгистамина. На гистограммах дано количественное распределение мутностей с соответствующими интегральными пиками 58,44±18,14 (до воздействия) и 44,95± 8,77 (после двух с половиной месяцев лечения).

Проведенный анализ показывает частичное снижение степени помутнения в задней субкапсулярной области хрусталика.

Результаты, полученные описанным методом, согласуются с данными клинического обследования.

В данном исследовании испытуемые пациенты были распределены на следующие группы:
Группа сравнения 1, испытуемые без воздействия (5 испытуемых, 7 глаз).

Группа 2, в которой испытуемые получали глазные капли, содержащие в изотоническом солевом растворе 1% β- аланилгистамин (pH 7,4). Ежедневно они закапывали капли дважды в день (10 испытуемых, 15 глаз).

Группа 3 была подвергнута тем же воздействиям, что и группа 2, но со стимуляцией путем энергичного воздействия в первые 2 недели, заключающегося в двух субконъюнктивальных инъекциях дважды в неделю, от 0,10 до 0,15 мл раствора препарата того же состава, что и в группе 2 (3 пациента, 4 глаза).

Группа 4 получала дважды в день в качестве глазных капель изотонический солевой раствор (5 пациентов, 7 глаз). Группа 4 подобна группе сравнения 1.

Следуя протоколу эксперимента, описанному выше, были определены величины оптической плотности хрусталика, характеризующие степень его помутнения, а также острота зрения, в целом, на протяжении 24 месяцев. На основании указанных двух параметров получены таблицы, представляющие результаты по изменению остроты зрения (таблица 1) и помутнения (таблицы 2 и 3) по прошествии 24 месяцев.

На основании рассмотрения двух выбранных параметров можно заключить, что данный продукт весьма значительно улучшает зрение и уменьшает развитие катаракты.

Сходным образом были испытаны глазные капли, в основу которых положен активный ингредиент N-ацетил- β-аланилгистамин в виде 1% изотонического солевого раствора, которые также показали результаты, соответствующие цели данного изобретения. Даже с единичной дневной дозой местного применения для глаза результаты оказались идентичны полученным ранее. Указанный установленный факт может объясняться лучшим проникновением в ткани ацетилированной формы активного ингредиента.

Хотя вышеприведенный пример указывает на применении глазных капель, возможно использование продуктов по данному изобретению в виде всех общепринятых глазных композиций, таких как гель (глазное желе) или иные (см. "Remington's pharmaceutical sciences handbook" Hack Pub. Co. USA), содержащих от 1 до 100 мМ β-аланилгистамина.

Пример 2
Была продемонстрирована репарирующая активность на слизистую оболочку продуктов по данному изобретению при использовании композиций, содержащих очень малые дозы продукта. Указанное действие изучено при воспалительных процессах слизистой оболочки десен (гингивитах) различной этиологии (плохо пригнанные коронки, химический ожог при случайном попадании едких жидкостей, лучевая гамма-терапия верхней части глотки).

Во всех случаях повреждение слизистой оболочки десен и щек останавливалось. Помимо и дополнительно к использованию повседневных классических воздействий, проводимых систематически, 50% пациентов получали водный гель, ароматизированный апельсином и содержащий 0,28% N-ацетил-3-фенил-3-аминопропионилгистамина.

Наблюдения, проведенные в указанных различных случаях, показали прекрасную переносимость и значительное снижение времени заживления от 20 до 55%.

Это позволяет сделать заключение о положительном эффекте относительно использованных доз препарата.

Пример 3
Нами также были продемонстрированы заживляющие свойства при использовании крема для заживления следующего состава:
Наносферы (диаметр 100 нм), содержащие 5% γ-аминобутирил-гистамина - 10 г
Индифферентная среда для лекарства (гидродисперсия) qs - 100 г
(pH 6,5).

Этот крем применялся дважды в день легким втиранием (массажем) на закрытые раны. Рубец и зона, прилегающая к рубцу, поглаживались до полного втирания помады.

Изучаемыми случаями являлись: 3 постхирургических рубца, возникших менее 14 месяцев назад, 2 случая с келоидами и 5 случаев с последствиями перенесенного воспаления сальных желез (прыщей).

Во всех случаях наблюдалось значительное улучшение рубца, уменьшение степени набухания и неровностей кожи вплоть до полного их исчезновения в двух случаях.

В то же время было замечено восстановление естественного (однородного) цвета кожи с исчезновением набухания. Полученные результаты подтверждают значительный положительный эффект препаратов.

Пример 4
Глазные капли следующего состава были использованы для лечения повреждений роговицы и, в особенности, такой патологии, как "синдром сухого глаза":
липосомы, приготовленные из фосфатидилхолина - 8 мг/мл
фибронектин из плазмы человека - 10 мкг/мл
β- аланилгистамин - 25 мкг/мл
в буферной среде с pH в пределах 6,2 - 7,4.

Фибронектин и β-аланилгистамин были инкапсулированы в липосомы.

Фибронектин является молекулой клеточной адгезии, которая обеспечивает свойства заживления и воссоздание тонкой пленки слезной жидкости.

Глазные капли наносили на поверхность глаза в течение 10 дней, исходя из двух инсталляций в день. Наносимое количество препарата должно быть достаточным для того, чтобы сформировать непрерывную пленку на поверхности глаза.

Результаты
Использованная композиция длительно воссоздает защитный слой на поверхности глаза, как было показано при изучении удержания на поверхности роговицы флуоресцентных маркеров (методика заимствована из R.F. Barber, P.N. Shek "Liposomes and tear film. 1.Release of vesicle entrapped carboxyfluorescein" - Biochimica Biophysica Acta: Lipids and Lipid Metabolism, vol. 879 (L81), N 2 (1986), p. 157-163).

Положительный эффект заживления прослеживается с помощью щелевой лампы: наблюдается быстрое восстановление роговичного эпителия.

Пример 5
В этом примере использована помада для обработки поверхностных ожогов 1-ой и 2-ой степеней:
парагидроксикоричная кислота - 0,1 г
мятное масло - 0,3 г
лавандовое масло - 0,5 г
ментол (в форме наносфер) - 0,05 г
β-аминоизобутирилгистамин - 0,5 г
индифферентная среда для лекарства гидродисперсия qs - 100 г
Мы применяем помаду, нанося ее тонким слоем, как можно раньше после возникновения ожога. В первое время нанесение помады повторяется каждый час, пока не прекратится боль. При ожогах первой степени эритема быстро исчезает. При поверхностных ожогах второй степени, сопровождающихся пузырями и отеком покрасневшего эпидермиса на площади ожога, мы наблюдали рассасывание отека в течение 2-х часов, уменьшение боли в течение 3-х или 4-х часов.

В течение двух или трех прошедших дней регенерация подлежащих тканей проходила более быстро. Возможным было открывание пузырьков с жидкостью, удерживаемой последними, с формированием нового слоя эпидермиса и удалением отмерших тканей. С одной стороны, мы наблюдали ускорение восстановления эпителия, а с другой стороны - его прекрасное качество.

Пример 6
Антирадикальная активность псевдодипептидных продуктов по данному изобретению была продемонстрирована в следующем примере косметических композиций, используемых как лосьоны после бритья:
6-аминокапроил-гистамин (в форме 5% наносфер) - 16 г
жидкий ароматизированный водно-спиртовый растворитель 6 qs - 100 г
регулярное употребление в качестве лосьона после бритья позволяет сохранить кожу в хорошем состоянии.

Пример 7
Основываясь на той же активности, что и в вышеприведенных примерах, использовался лосьон против солнечных ожогов, имеющий следующий состав:
3-фенил-3-аминопропионил-гистамин - 1 г
микродисперсия водно-липидного растворителя qs - 100 г
Исследованы различные случаи во время проведения курсов облучения ультрафиолетовым светом (область В) в салонах красоты. При одинаковой степени загара, в случаях применения крема после сеанса облучения, эпидермис характеризовался лучшим качеством в последующие после облучения дни.

Пример 8
Основываясь на той же самой активности, использовался крем для ухода за кожей лица следующего состава:
раствор 5-аминовалерьянил-гистамина (в форме 4% наносфер) - 20 г
ионы Cu⁺⁺, Fe⁺⁺ (в форме ацетилметионина) индифферентная среда для лекарства гидродисперсия qs - 100 г
(pH 6,5)
Для геропротекторного крема, применяемого дважды в день, мы отметили снижение числа мелких морщин, появление более нежной и естественно окрашенной кожи.

Для крема, обладающего выраженным восстанавливающим действием в ответ на различные повреждающие воздействия, ежедневное применение вполне достаточно. Мы наносили крем путем втирания до его полного впитывания, суспензия наносфер - формирует гомогенную пленку с продолжительным высвобождением действующих ингредиентов. Возможно нанесение пленки после применения того же крема.

Мы наблюдали на коже лица определенные результаты воздействия, демонстрирующие следующие критерии хорошего здоровья: мягкость и свежесть комплекции кожи, равномерный цвет и хорошее увлажнение.

Пример 9
Псевдодипептидные продукты могут быть также использованы для защиты легкоокисляемых косметических масел, богатых ненасыщенными жирными кислотами, входящими в косметические и диетические продукты.

Для этого необходимо добавить от 15 до 25 ммоль псевдодипептидов по данному изобретению на литр масла, согласно следующей формуле:
20 ммоль ацетилированного β-аланилгистамина
масляный экстракт из микроскопических морских водорослей, культивированных в морской воде, обогащенной ненасыщенными жирными кислотами, включая EPA qs до 1 литра.

Мы сравнили сохранность (по степени, старения) масел с протектором и без такового, определяя в конце месяца хранения концентрацию малонового диальдегида. В незащищенном масле мы наблюдали гораздо большее накопление малонового диальдегида, чем в защищенном, что указывает на активность ацетилированного β-аланилгистамина в защите против окисления.

Пример 10
В соответствии с ранее изложенными принципами мы приготовили косметическое масло следующего состава:
25 ммоль 8-аминооктаноилгистамина
масло из лепестков роз (розовое масло) qs до 1 литра.

Мы сравнили защищенное и незащищенное масла в конце 5 недели методом кислотного титрования. Доза кислоты для незащищенного масла была значительно (более чем в 10 раз) больше, чем в защищенном. Таким образом, можно заключить, что присутствие 8-аминооктаноилгистамина оказывает антиокислительное действие в розовом масле.

Все вышеприведенные примеры показывают, что псевдодипептиды по данному изобретению проявляют статистически достоверную активность в диапазоне от 1 до 100 миллимолей на литр, имея пик активности в диапазоне концентраций 10-25 мМ.

Claims (29)

1. Псевдодипептиды, полученные путем конденсации гистамина или метилзамещенного гистамина и аминокислоты общей формулы I

где А - аминогруппа или амидогруппа, представленная CH₃OCONH;
R₁, R'₁ - атом водорода или один из них атом водорода, другой - углеводородный радикал;
R'' = H, CH₃;
y и Z каждый являются атомами водорода;
n - целое число больше или равное 1,
при условии, что исключается β-аланин-гистамин.

2. Псевдодипептиды формулы I по п.1, полученные конденсацией гистамина или метилзамещенного гистамина и аминокислоты формулы

где Х - атом водорода или ацетильная группа, значения остальных радикалов указаны в п.1.

3. Псевдодипептиды формулы 1 по п.2, где аминокислота имеет формулу

где R₁ - атом водорода или фенильный радикал;
R₂ = водород; p целое число, 0 ≅ p ≅ 3.

4. Псевдодипептиды формулы I по п.2, где указанная аминокислота выбрана из группы, состоящей из γ-аминомасляной, β-аминоизобутиловой, 5-аминовалериановой, 3-фенил-3-аминопропионовой, 6-аминокапроновой, 8-аминооктановой, N-ацетил-3-фенил-3-аминопропионовой кислоты, N-ацетил-β-аланина.

5. Способ получения псевдодипептидов общей формулы I по пп.1 - 4, характеризующийся следующими этапами: приготовлением указанной N-защищенной аминокислоты с использованием защитной группы Х, приготовлением указанной N-защищенной аминокислоты, активированной по карбоксильной группе, конденсацией указанной N-защищенной аминокислоты с активированной карбоксильной группой с гистамином или метилзамещенным гистамином с последующим удалением либо сохранением Х-группы в соответствии с получаемым псевдодипептидом.

6. Способ получения псевдодипептидов по п.5, заключающийся в том, что аминокислота О-активирована путем этерификации карбоксильной группы.

7. Способ получения псевдодипептидов по п.6, заключающийся в том, что этап этерификации карбоксильной группы аминокислоты проводят путем взаимодействия с компонентами, выбранными из группы: цианометиловый спирт, о-нитрофенол, 2,4,5-трихлорфенол, п-нитрофенол, 2,4-динитрофенол, пентахлорфенол, пентафторфенол, N-гидроксифталимид, N-гидроксисукцинимид, 1-гидроксипиперидин, 5-хлор-8-гидроксихинолин.

8. Способ получения псевдодипептидов общей формулы I по пп.1 - 4 формулы изобретения, заключающийся в конденсации аминокислоты с гистамином или метилзамещенным гистамином в присутствии ферментативного катализатора типа гидролазы.

9. Способ по п.8, заключающийся в том, что ферментный катализатор является гидролазой, выбранной в группе, состоящей из липаз, экстрагированных из микроорганизмов или липаз животного происхождения и протеаз.

10. Способ по п.8, характеризующийся следующими этапами: приготовлением указанной N-защищенной аминокислоты с использованием защитной группы Х, приготовлением указанной N-защищенной аминокислоты с активированной карбоксильной группой, конденсацией указанной активированной по карбоксильной группе N-защищенной аминокислоты с гистамином или метилзамещенным гистамином с помощью указанного катализатора и, в случае необходимости, отщеплением Х-группировки, защищающей аминогруппу в соответствии с получаемым псевдодипептидом.

11. Способ по п.10, заключающийся в том, что проводят О-активацию функциональной карбоксильной группы указанной аминокислоты путем этерификации.

12. Способ по п.11, заключающийся в том, что этерификацию проводят путем реакции с компонентами, выбранными из следующей группы, состоящей из алифатических или ароматических спиртов, исключая третичные спирты, но предпочтительно включая этанол, 2,2,2-трихлорэтанол, фенол, цианометиловый спирт, О-нитрофенол, п-нитрофенол, 2,4,5-трихлорфенол, 2,4-динитрофенол, пентахлорфенол, N-гидроксифталимид, N-гидроксисукцинимид, 1-гидроксипиперидин, 5-хлор-8-гидроксихинолин.

13. Способ по одному из пп.8 - 12, заключающийся в том, что псевдодипептид, являющийся N-ацетил-β-аланилгистамином, получен следующим образом: 2,38 г (15 ммоль) этилового эфира N-ацетил-β-аланина и 1,11 г (10 моль) гистамина растворяют в 40 мл смеси трет-амиловый спирт-гексан (25 : 75), добавляют 0,5 г липазы Amano P (Pseudomonas sp) и суспензию поддерживают при 40^oС при постоянном перемешивании до полного исчезновения гистамина, липазу отфильтровывают, растворитель трет-амиловый спирт-гептан удаляют под вакуумом до получения маслянистого вещества, и остаток обрабатывают этиловым эфиром для удаления избытка этилового эфира N-ацетил-β-аланина, получают 1,9 г N-ацетил-β-аланил гистамина.

14. Псевдодипептиды формулы I по пп.1 - 4, обладающие антиоксидантной активностью.

15. Псевдодипептиды по п.14, обладающие "пероксидазной" активностью.

16. Псевдодипептиды по п.14, обладающие репарирующей активностью.

17. Псевдодипептиды по п.14, обладающие антиатеросклеротической активностью.

18. Псевдодипептиды по п.14, обладающие противовоспалительной активностью.

19. Псевдодипептиды по п.14, обладающие противоаллергической или иммуностимулирующей активностью.

20. Псевдодипептиды по п.14, обладающие консервирующей или стабилизирующей активностью в материалах, чувствительных к окислению, пищевых продуктах и органах или тканях, сохраняемых ех vivo.

21. Фармацевтическая композиция, обладающая антиоксидантной активностью, содержащая в качестве активного вещества эффективное количество псевдодипептида формулы I

где А - аминогруппа или амидогруппа, представленная CH₃OCONH;
R₁, R'₁ - атом водорода или один из них - атом водорода, другой - углеводородный радикал;
R'' = Н, CH₃;
y и Z каждый являются атомами водорода;
n - целое число больше или равное 1,
в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

22. Фармацевтическая композиция по п.21 для использования в качестве косметических средств регенерирующего и омолаживающего действия для кожи.

23. Фармацевтическая офтальмологическая композиция для лечения катаракты, содержащая в качестве активного вещества псевдодипептид формулы I

где А - аминогруппа или амидогруппа, представленная CH₃OCONH,
R₁, R'₁ - атом водорода или один из них атом водорода, другой - углеводородный радикал;
R'' = Н, CH₃;
y и Z каждый являются атомами водорода,
n - целое число больше или равное 1, в эффективном количестве в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

24. Композиция по п.23 в виде глазных капель или геля.

25. Фармацевтическая офтальмологическая композиция для лечения повреждений роговицы и, в особенности, синдрома "сухого глаза", содержащая в качестве активного вещества псевдодипептид формулы I

где А - аминогруппа или амидогруппа, представленная CH₃OCONH,
R₁, R'₁ - атом водорода или один из них - атом водорода, другой - углеводородный радикал;
R'' = Н, CH₃;
y и Z каждый являются атомами водорода,
n - целое число больше или равное 1,
в эффективном количестве в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

26. Композиция по п.25 в виде глазных примочек (лосьонов).

27. Способ лечения катаракты путем введения пациенту фармацевтической композиции по любому из пп.23 - 24.

28. Способ лечения воспалительных состояний, связанных с "окислительным стрессом", путем введения пациенту псевдодипептида формулы I по пп.1 - 4 в эффективном количестве.

29. Способ лечения по п.28, где в число воспалительных состояний входят такие заболевания, как фотоаллергия, порфирия, красная волчанка.

Приоритет по пунктам:
22.02.93 - по пп.3, 5 - 7, 22 - 24 и 27;
30.08.93 - по пп.1, 2, 4, 8 - 21, 25, 26, 28 и 29.

Images