RU2159625C1 - Пробиотический препарат комплексного действия - Google Patents
Пробиотический препарат комплексного действия Download PDFInfo
- Publication number
- RU2159625C1 RU2159625C1 RU99111728A RU99111728A RU2159625C1 RU 2159625 C1 RU2159625 C1 RU 2159625C1 RU 99111728 A RU99111728 A RU 99111728A RU 99111728 A RU99111728 A RU 99111728A RU 2159625 C1 RU2159625 C1 RU 2159625C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- stabilizer
- biomass
- preparation
- probiotic preparation
- drug
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 title claims description 19
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 title claims description 19
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 title claims description 13
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims abstract description 15
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 12
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 10
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 11
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 25
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 abstract description 14
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 14
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 abstract description 10
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 3
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- 101000959794 Homo sapiens Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100039350 Interferon alpha-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010041940 bifikol Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 102000051099 human IFNA2 Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Препарат может быть использован в медицине, биотехнологии, ветеринарии для получения пробиотиков комплексного действия. Препарат содержит следующие компоненты, об.%: смесь биомассы Bacillus subtilis ВКПМ-4759 с титром 1х107 - 10х109 живых микробных клеток и биомассы Bacillus licheniformis 2336/105 с титром 1х108 - 10х109 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92-98% и стабилизатор (сыворотки крови КРС, или молоко, или смесь 4% сахарозы и 1% желатина) - 2-8%. Препарат обладает одновременно антибактериальной и антивирусной активностями, способен к пролонгированному синтезу интерферона в различных отделах открытых полостей организма, отличающихся по содержанию в них кислорода. 3 з.п. ф-лы, 5 табл.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, ветеринарии и касается получения пробиотиков комплексного действия.
Создание пробиотиков комплексного действия, обладающих антимикробной, иммуномодулирующей активностью, является актуальной для медицины и ветеринарии заданной задачей (1,2). Для расширения спектра действия пробиотиков рекомендуется разрабатывать препараты из нескольких штаммов и видов бактерий, способных осуществлять свою жизнедеятельность и биологическую активность в различных компартаментах открытых полостей (биотопов) организма теплокровных (1). В качестве таких комплексных препаратов можно назвать "Бификол", "Биоспорин", "Бактерин-СЛ" (3). Последние два представляют собой препараты на основе спорообразующих бактерий Bacillus subtillis и Bacillus licheniformis, имеющих различные потребности в кислороде, что позволяет пролонгировать действие препарата и осуществлять специфическую активность не только в аэробных отделах желудочно-кишечного тракта, но и в анаэробных, которые, как известно, по протяженности занимают не менее 2/3 последнего.
Для получения пробиотиков с иммуномодулирующими и антивирусными свойствами рекомендуется включать в препараты компоненты, повышающие резистентность организма (иммуноглобулины, лизоцим) или оказывающие иммуностимулирующие и антивирусное действие (цитокины, пептиды тимуса) (2).
Альтернативным подходом в этом направлении является создание рекомбинантных пробиотиков, состоящих из генетически модифицированных микроорганизмов, продуцирующих биологически активные белки клонированный генов (4). Рекомбинантные пробиотики более просты в изготовлении, так как для этого не требуется дорогостоящая очистка целевых компонентов. В качестве примера можно привести пробиотический штамм Streptococcus lactus, в который был клонирован ген интерлейкина с целью дальнейшего использования рекомбинантного штамма для усиления иммунитета слизистых покровов (5). Другим примером является штамм Bacillus subtilis B-4759, синтезирующий альфа-2-интерферон человека, который при введении в организм оказывает антивирусное и иммуномодулирующее действие (6, 7).
На основе данного штамма создан рекомбинантный пробиотический препарат "Субалин" (8), который является наиболее близким аналогом предполагаемого изобретения.
Существенным недостатком препарата-прототипа является то, что штамм Bacillus subtilis B-4759, лежащий в его основе, является строгим аэробом и не может проявлять специфическую активность а анаэробных биотопах желудочно-кишечного и урогенитального трактов.
Технической задачей изобретения является создание биопрепарата, обладающего одновременно антибактериальной и антивирусной активностью, способного к пролонгированному синтезу интерферона в различных отделах открытых полостей организма, отличающихся по cодержанию в них кислорода.
Это достигается тем, что помимо штамма Bacillus subtilis B-4759, обладающего антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов и продуцирующего интерферон в аэробных условиях, в состав нового препарата дополнительно включают рекомбинантный штамм Bacillus licheniformis 2336/105 (9), способный к синтезу интерферона в микроаэрофильных условиях.
Новый пробиотический препарат комплексного действия "Субалин-форте" содержит в качестве основы живые клетки Bacillus subtilis B-4759 и Bacillus licheniformis 2336/105, а также стабилизатор, при следующем соотношении, об. %:
Биомасса Bacillus subtilis B-4759 (1•109-10•109) и Bacillus licheniformis 2336/105 (1•108-10•108) живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92 - 98
Стабилизатор - 8 - 2
Необходимость стабилизатора обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при дальнейшем высушивании препарата.
Биомасса Bacillus subtilis B-4759 (1•109-10•109) и Bacillus licheniformis 2336/105 (1•108-10•108) живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92 - 98
Стабилизатор - 8 - 2
Необходимость стабилизатора обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при дальнейшем высушивании препарата.
В качестве стабилизатора препарат может содержать сыворотку крови, молоко и т.д., предпочтительно сахарозожелатиновую смесь (4% сахарозы, 1% желатина).
Рекомбинантные штаммы, включаемые в препарат, должны характеризоваться стабильностью плазмидной ДНК и гена интерферона в ее составе при пассировании культуры через организм.
Исследование стабильности плазмидной ДНК с геном интерферона в штаммах B. subtilis B-4759 и B.lichenifomis 2336/105 проводят на беспородных белых мышах весом 18-20 г. В опыт отбирают животных, у которых в предварительных экспериментах не высевались из фекалий бактерии рода Bacillus. Животным вводят перорально по 1 дозе препарата. Через 18 ч проводят высев микрофлоры фекалий на мясо-пептонном агаре (МПА). Выросшие изолированные колонии B.subtilis и B.livheniformis перекладывают на МПА с канамицином и без канамицина для подсчета количества клонов, потерявших рекомбинантную плазмиду. Из культур, выросших на МПА, готовят суспензию в физиологическом растворе и повторно вводят перорально животным. Через 18 ч повторяют процедуру высева культур Bacillus из фекалий и определения количества клонов, утративших плазмиду. Было проведено 10 пассажей культур через организм. Все анализируемые клоны росли после 10-го пассажа на среде с канамицином, что свидетельствует о репликационной стабильности плазмиды в штаммах в условиях пассирования через организм.
Для определения структурной стабильности рекомбинантной плазмиды в пассированных штаммах выделяют плазмидную ДНК из 50 случайно отобранных после пассажа клонов обоих штаммов и подвергают рестрикционному анализу. В опыте не было выявлено образцов с измененной по сравнению с исходной картиной гидролиза, что свидетельствует о высокой структурной стабильности штаммов, являющихся основой нового пробиотического препарата.
Сохранность гена интерферона в составе плазмиды определяют методом ПЦР со специфическими к гену интерферона праймерами, фланкирующими его структурную часть. Во всех исследуемых образцах плазмидной ДНК при проведении ПЦР наблюдается в агарозном геле ампликон, соответствующий по длине структурной части гена, что свидетельствует об отсутствии делеционных изменений в гене интерферона.
Полученный комплексный пробиотический препарат "Субалин-форте" характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов, полученных из коллекции ГИСКа им. Тарасевича (г. Москва) (табл. 1).
Антивирусную активность препарата определяют после инкубации препарата при 37oC на богатой среде в аэробных и микроаэрофильных условиях. После инкубации и центрифугирования получают культурную надосадочную жидкость и в ней определяют содержание интерферона после предварительного концентрирования сульфатом аммония или трихлоруксусной кислотой (до конечной концентрации 3%). Антивирусную активность препарата определяют по ингибированию цитопатического действия вируса энцефаломиокардита. В качестве препаратов сравнения используют препараты-аналоги: Биоспорин и Субалин в тех же дозах (табл. 2).
Препарат Субалин-форте характеризуется безвредностью для теплокровных (табл. 3), что было показано в опытах на животных.
Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. На основе штаммов Bacillus subtilis B-4759 и Bacillus licheniformis 2236/105 с типичными морфологическими, культуральными, биохимическими свойствами приготовлены 5 вариантов препарата "Субалин-форие" с различным содержанием микробных клеток.
Вариант I
Препарат, содержащий, об%:
Биомасса B. subtilis B-4759 0,5•108 и B.licheniformis 2236/105 0,5•107 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92
Стабилизатор (сыворотка крови КРС) - 8
Вариант II
Препарат, содержащий, об.%:
Биомасса B.subtilis B-4759 1•109 и B.licheniformis 2336/105 1•108 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 94
Стабилизатор (молоко) - 6
Вариант III
Препарат, содержащий, об.%:
Биомасса B.subtilis B-4759 5•109 и B.liсheniformis 2336/105 5•108 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 95
Стабилизатор (4% сахароза + 1% желатин) - 5
Вариант IV
Препарат, содержащий, об.%:
Биомасса B. subtilis B-4759 10•109 и B.licheniformis 2336/105 10•108 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 98
Стабилизатор (4% сахароза + 1% желатин) - 2
Вариант V
Препарат, содержащий, об.%:
Биомасса B.subtilis B-4759 5•1010 и B.licheniformis 2336/105 5•109 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 97
Стабилизатор (сыворотка крови КРС) - 3
Изготовленные варианты лиофильно высушивают, помещают в двойные полиэтиленовые (бумажные с полиэтиленовой пропиткой) пакетики, которые впоследствии запаивают.
Препарат, содержащий, об%:
Биомасса B. subtilis B-4759 0,5•108 и B.licheniformis 2236/105 0,5•107 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92
Стабилизатор (сыворотка крови КРС) - 8
Вариант II
Препарат, содержащий, об.%:
Биомасса B.subtilis B-4759 1•109 и B.licheniformis 2336/105 1•108 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 94
Стабилизатор (молоко) - 6
Вариант III
Препарат, содержащий, об.%:
Биомасса B.subtilis B-4759 5•109 и B.liсheniformis 2336/105 5•108 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 95
Стабилизатор (4% сахароза + 1% желатин) - 5
Вариант IV
Препарат, содержащий, об.%:
Биомасса B. subtilis B-4759 10•109 и B.licheniformis 2336/105 10•108 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 98
Стабилизатор (4% сахароза + 1% желатин) - 2
Вариант V
Препарат, содержащий, об.%:
Биомасса B.subtilis B-4759 5•1010 и B.licheniformis 2336/105 5•109 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 97
Стабилизатор (сыворотка крови КРС) - 3
Изготовленные варианты лиофильно высушивают, помещают в двойные полиэтиленовые (бумажные с полиэтиленовой пропиткой) пакетики, которые впоследствии запаивают.
Проверку безвредности, специфической активности в отношении тест-культур (представителей различных групп патогенных и условно патогенных микроорганизмов), а также продукцию интерферона альфа-2 в аэробных и микроаэрофильных условиях представленных вариантов препарата "Субалин-форте" осуществляют на лабораторных животных.
Пример 2. Для определения безвредности нового пробиотического препарата содержимое пакетика разводят в 0,5 мл физиологического раствора и вводят эту дозу перорально мыши. Для каждого варианта препарата используют не менее 10 мышей массой 18-20 г. Препарат считают безвредным, если все мыши остаются живыми в течение пяти суток наблюдения. Результаты эксперимента представлены в табл. 4.
Пример 3. Для определения специфической активности исследуют антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляют методом "отсроченного" антагонизма. Для этого содержимое пакетика растворяют в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевают петлей в центр чашки Петри с агаризованной средой Гаузе-2 на 72 ч. Затем к выросшей культуре подсевают штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводят через 18 ч инкубирования при 37oC по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служит параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе-2 без исследуемой культуры. Данные представлены в табл. 4. В таблице представлены также данные, характеризующие безвредность препарата. Безвредность изучалась на белых беспородных мышах при введении им перорально препарата в дозах, в 100 раз превышающих рекомендуемые.
Как видно из приведенных данных, все варианты препарата Субалин-форте являются безвредными и обладают высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Пример 3. Для определения специфической антивирусной активности варианты препарата Субалин-форте исследуют на продукцию интерферона в аэробных и микроаэробных условиях. Для этого содержимое пакетика инкубируют при 37oC в 100 мл богатой питательной среды (LB), содержащей 10 мкг/мл канамицина. Инкубацию проводят на качалке для создания аэрированных условий и в термостате - для микроаэрофильных условий. После 8-10-часовой инкубации культуру центрифугируют, к супернатанту добавляют трихлоруксусную кислоту до концентрации 3% с последующим двухкратным 12-часовым диализом против буфера HEPES, либо осаждают сульфатом аммония с последующим растворением в 10 мл HEPES буфера с добавлением ингибитора протез. Полученные образцы анализируют на антивирусную активность по содержанию в них интерферона.
Пример 4. Антивирусную активность комплексного пробиотика определяют по ингибированию цитопатического действия вируса EMC (энцефаломиокардита мышей). Суспензию диплоидных клеток фибробластов человека (ДФЧ) ДК-58 доводят до концентрации 2•109 кл/мл роствовой средой. В каждую лунку полистирольного планшета вносят по 100 мкл (2•109 клеток) суспензии ДФЧ в ростовой среде и инкубируют при 37oC до формирования монослоя клеток. Под микроскопом сформировавшийся монослой клеток похож на мозаику, образовавшуюся вытянутыми игольчатыми клетками. После формирования монослоя ростовую среду отсасывают, в первую лунку вносят 20 мкл культурального образца, полученного, как описано выше, и 100 мкл поддерживающей среды; после осторожного перемешивания 100 мкл из первой лунки переносят во вторую, смешивая со 100 мкл поддерживающей среды и т.д. Клетки выдерживают 24 часа при 37oC и после этого вносят 100 тканевых цитопатических доз вируса EMC, вызывающих поражение в половине проб, и выдерживают при 37oC 24-48 часов. Через 1 сутки проводят первый учет, через 2 суток - второй. Величину антивирусной активности в исследуемых образцах определяют методом сравнения с антивирусной активностью референс-препарата, в качестве которого используют препарат реаферона (рекомбинантный альфа-2-интерферон), и выражают в международных единицах (ME). Результаты, представленные в таблице 5, свидетельствуют о том, что препарат Субалин-форте в различных вариантах обладает антивирусной активностью.
Испытания вариантов препарата показали идентичность вариантов по специфической активности и безвредности. Оптимальные количества живых микробных клеток B.subtilis B-4759 и B.licheniformis 2336/105 в 1 мл физиологического раствора составляет 1•109-10•109 и 1•108-10•108 клеток соответственно при их объемном содержании 92-98%. Дальнейшее увеличение микробных клеток не изменяет существенным образом специфические свойства препарата.
Полученные данные свидетельствуют о том, что исследованные варианты препарата Субалин-форте безвредны для животных, характеризуются антагонистической активностью в отношении тест-культур, а также способностью продуцировать интерферон как аэробных, так и в микроаэрофильных условиях.
Таким образом, предложенный новый пробиотический препарат комплексного действия Субалин-форте, обладающий одновременно антибактериальной и антивирусной активностями, способный к пролонгированному синтезу интерферона в различных отделах открытых полостей организма, отличающихся по содержанию в них кислорода.
Литература
1. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., и др. //Вестник Росс. АМН. - 1997 - N 3 - с. 4-7.
1. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., и др. //Вестник Росс. АМН. - 1997 - N 3 - с. 4-7.
2. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. //Вестник Росс. АМН. - 1997 - N 3 - с. 7-9.
3. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.А. //Микробиол. журнал - 1993 - т. 55 - N 4 - с. 92-112
4. Сорокулова И.Б., Белявская В.А. и др.//Вестник Росс.АМН - 1997. - N 3. - С.46-49.
4. Сорокулова И.Б., Белявская В.А. и др.//Вестник Росс.АМН - 1997. - N 3. - С.46-49.
5. Steidler L., Robinson K., Chamberlain L. et al.//Infec. and Immunit. -1998.-V.66. N.7. - P.3183-3189.
6. Патент РФ 1839459, кл. C 12 N 1/21, 1990 г.
7. Смирнов В. В. , Чудновская Н.В., Рыбалко С.Л., Сорокулова И.В., Белявская В.А. и др.//Доклады НАН Украины, 1995, N 2, с.124-126.
8. Патнт РФ 2035185, кл. A 61 K 35/66, 1992 г.
9. Заявка на патент РФ N 98112850, 30.06.98 г.
Claims (3)
1. Пробиотический препарат комплексного действия, включающий живую биомассу бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-4759 и стабилизатор, отличающийся тем, что дополнительно содержит живую биомассу рекомбинантных бактерий Bacillus licheniformis 2336/105 при следующем соотношении компонентов, об.%:
Смесь биомассы Bacillus subtilis ВКПМ В-4759 с титром 1x109 - 10x109 живых микробных клеток и биомассы Bacillus licheniformis 2336/105 с титром 1x108 - 10x109 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92 - 98
Стабилизатор - 2 - 8
2. Пробиотический препарат комплексного действия по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора используют сыворотку крови КРС.
Смесь биомассы Bacillus subtilis ВКПМ В-4759 с титром 1x109 - 10x109 живых микробных клеток и биомассы Bacillus licheniformis 2336/105 с титром 1x108 - 10x109 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92 - 98
Стабилизатор - 2 - 8
2. Пробиотический препарат комплексного действия по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора используют сыворотку крови КРС.
3. Пробиотический препарат комплексного действия по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора используют молоко.
4. Пробиотический препарат комплексного действия по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора используют смесь 4% сахарозы и 1% желатина.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99111728A RU2159625C1 (ru) | 1999-05-25 | 1999-05-25 | Пробиотический препарат комплексного действия |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99111728A RU2159625C1 (ru) | 1999-05-25 | 1999-05-25 | Пробиотический препарат комплексного действия |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2159625C1 true RU2159625C1 (ru) | 2000-11-27 |
Family
ID=20220759
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99111728A RU2159625C1 (ru) | 1999-05-25 | 1999-05-25 | Пробиотический препарат комплексного действия |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2159625C1 (ru) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2236147C2 (ru) * | 2002-12-16 | 2004-09-20 | Уральская государственная сельскохозяйственная академия | Способ кормления сельскохозяйственных животных |
| RU2264453C2 (ru) * | 2003-12-30 | 2005-11-20 | Ирина Борисовна Сорокулова | Биопрепарат "ирилис" ветеринарного назначения |
| RU2264454C2 (ru) * | 2003-12-30 | 2005-11-20 | Ирина Борисовна Сорокулова | Биопрепарат "ирилис" на основе бактерий рода bacillus для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиоза различной этиологии и штаммы бактерий bacillus subtilis и bacillus licheniformis, используемые для изготовления биопрепарата |
| RU2265366C2 (ru) * | 2003-09-15 | 2005-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью ООО "ЭЛЕСТ" | Биологически активная добавка к кормам сельскохозяйственных, домашних животных и птицы для увеличения сохранности молодняка, повышения усвояемости кормов, стимуляции ростовых процессов и плодовитости животных |
| RU2265367C2 (ru) * | 2003-09-15 | 2005-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Элест" | Способ кормления сельскохозяйственных животных и птицы |
| RU2274462C1 (ru) * | 2004-07-30 | 2006-04-20 | Омский государственный аграрный университет | Способ лечения и профилактики нематодозов поросят |
| WO2006115430A1 (en) | 2005-04-28 | 2006-11-02 | Irina Grigorievna Osipova | Irilis biopreparation based on bacillus-strain bacteria, bacillus subtilis and bacillus licheniformis contained therein |
| RU2287335C1 (ru) * | 2005-12-15 | 2006-11-20 | ООО Лаборатории технологии оздоровительных препаратов "Л-ТОП" | Препарат для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта "бактистатин" |
| RU2326692C2 (ru) * | 2005-12-29 | 2008-06-20 | Евгений Николаевич Афанасьев | Пробиотическое лекарственное средство для сельскохозяйственных животных и птицы |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2035181C1 (ru) * | 1994-02-18 | 1995-05-20 | Тамара Васильевна Воробьева | Средство для лечения лейкозов и способ лечения лейкозов |
-
1999
- 1999-05-25 RU RU99111728A patent/RU2159625C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2035181C1 (ru) * | 1994-02-18 | 1995-05-20 | Тамара Васильевна Воробьева | Средство для лечения лейкозов и способ лечения лейкозов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СМИРНОВ В.В. и др. Спорообразующие анаэробные бактерии - продуценты биологически активных веществ. - Киев: Наукова думка, 1982, с.280. ВОРОБЬЕВ А.А. и др. Вестник Российской академии медицинских наук. - 1997, N 3, с.4-7. * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2236147C2 (ru) * | 2002-12-16 | 2004-09-20 | Уральская государственная сельскохозяйственная академия | Способ кормления сельскохозяйственных животных |
| RU2265366C2 (ru) * | 2003-09-15 | 2005-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью ООО "ЭЛЕСТ" | Биологически активная добавка к кормам сельскохозяйственных, домашних животных и птицы для увеличения сохранности молодняка, повышения усвояемости кормов, стимуляции ростовых процессов и плодовитости животных |
| RU2265367C2 (ru) * | 2003-09-15 | 2005-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Элест" | Способ кормления сельскохозяйственных животных и птицы |
| RU2264453C2 (ru) * | 2003-12-30 | 2005-11-20 | Ирина Борисовна Сорокулова | Биопрепарат "ирилис" ветеринарного назначения |
| RU2264454C2 (ru) * | 2003-12-30 | 2005-11-20 | Ирина Борисовна Сорокулова | Биопрепарат "ирилис" на основе бактерий рода bacillus для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиоза различной этиологии и штаммы бактерий bacillus subtilis и bacillus licheniformis, используемые для изготовления биопрепарата |
| RU2274462C1 (ru) * | 2004-07-30 | 2006-04-20 | Омский государственный аграрный университет | Способ лечения и профилактики нематодозов поросят |
| WO2006115430A1 (en) | 2005-04-28 | 2006-11-02 | Irina Grigorievna Osipova | Irilis biopreparation based on bacillus-strain bacteria, bacillus subtilis and bacillus licheniformis contained therein |
| US8414878B2 (en) | 2005-04-28 | 2013-04-09 | Irina Grigorievna Osipova | Irilis biopreparation based on bacillus-strain bacteria, bacillus subtilis and bacillus licheniformis contained therein |
| RU2287335C1 (ru) * | 2005-12-15 | 2006-11-20 | ООО Лаборатории технологии оздоровительных препаратов "Л-ТОП" | Препарат для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта "бактистатин" |
| RU2326692C2 (ru) * | 2005-12-29 | 2008-06-20 | Евгений Николаевич Афанасьев | Пробиотическое лекарственное средство для сельскохозяйственных животных и птицы |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2142287C1 (ru) | Штаммы бактерий bacillus subtilis и bacillus licheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций, и препарат на основе этих штаммов | |
| CN110144304B (zh) | 干酪乳杆菌菌株及其应用 | |
| JP2004532628A (ja) | 生物活性蛋白質を含有する微生物を用いた水産養殖および農業における疾病制御の輸送 | |
| RU2159625C1 (ru) | Пробиотический препарат комплексного действия | |
| KR20190019087A (ko) | 미생물총 치료를 위한 조성물 및 방법 | |
| RU2035185C1 (ru) | Профилактический биопрепарат субалин | |
| CN101638665B (zh) | 乳酸菌单质粒Nisin诱导表达载体的构建及使用方法 | |
| Pringgenies et al. | Explorations of symbiotic microbe from sea cucumber gut as an anti-multi-drug resistant microbe agent for utilization in hand sanitizer products | |
| KR102525173B1 (ko) | 바실루스속 세균, 인터류킨-22 산생 유도제, 피부 장벽 기능 증강제 | |
| RU2146935C1 (ru) | Сухой иммунопробиотический препарат для птицеводства | |
| CN115850409B (zh) | 一种抗多种病原菌的无前导肽细菌素subticin A3及制备方法与应用 | |
| CN108948163A (zh) | 澳洲坚果植物防御素及其应用 | |
| CN105061562B (zh) | 一种具有抗肺癌作用的寡肽及其应用 | |
| CN113512559A (zh) | 牛支原体Mbov_0701突变基因及其突变株和应用 | |
| CN101648993B (zh) | 具有抑菌与抗癌作用的小肽a及其应用 | |
| EP1894995A4 (de) | Irilis-biopräparation auf der basis von darin enthaltenen bacillus-bakterienstämmen bacillus subtilis und bacillus licheniformis | |
| Inooka | Isolation of Antibiotic-Producing Cells from Plate Cultures of Egg Powder Enclosing DNA (Hepg2) Crown Cells and Salmon Roe | |
| RU2823029C1 (ru) | Способ повышения антимикробной активности бесклеточного супернатанта bifidobacterium bifidum 791 в отношении klebsiella pneumoniae и escherichia coli | |
| CN112724198A (zh) | 一种抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| CN119661652B (zh) | 一种广谱的细菌源抗菌肽cAMP-919nc及其应用 | |
| CN114853849B (zh) | 一种酱香型白酒大曲抗菌多肽及其在制备抗炎药物中的应用 | |
| RU2807482C1 (ru) | Штамм бактерий Bacillus thuringiensis ssp. aizawai, проявляющий инсектицидную активность против вредителей - насекомых отряда Lepidoptera | |
| Haditomo et al. | Screening of potential isolate candidates probiotic against Aeromonas hydrophila from Boyolali, Indonesia | |
| KR101830946B1 (ko) | 바실러스 리체니포미스 유래 박테리오신을 포함하는 황색포도상구균 rf122에 대한 항균용 조성물 | |
| WO2019235952A1 (ru) | Функциональная питьевая вода |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20100805 |
|
| QC41 | Official registration of the termination of the licence agreement or other agreements on the disposal of an exclusive right |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20100805 Effective date: 20110715 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150526 |