RU2143113C1

RU2143113C1 - Method for diagnosing infection by detecting genetic material of pathogen in sample under study

Info

Publication number: RU2143113C1
Application number: RU96116019A
Authority: RU
Inventors: Андрей Александрович Елов; Александр Владимирович Виноградов; Борис Михайлович Медников; Николай Васильевич Макаров
Original assignee: Андрей Александрович Елов; Александр Владимирович Виноградов; Борис Михайлович Медников; Николай Васильевич Макаров
Priority date: 1996-08-01
Filing date: 1996-08-01
Publication date: 1999-12-20

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves duplicating DNA or RNA fragments by means of polymerase chain reactions or their like with quantitative polymerase chain reaction version in the presence of two DNA and RNA standards one of which is introduced for analysis sensitivity control and in this way corresponds to duplicated pathogen genome fragment and is available in minimum quantities for being detected. The other one is introduced for controlling statistical significance of the result determined by the volume of sample participating in analysis and corresponds in this way to genetic marker describing this volume. The marker can be some predefined DNA or RNA fragment from host organism cells or special kind of bio-object introduced into the sample as one modeling the pathogen as well as genetic material fragment usable as carrier at the stage of sample fractionation before polymerase chain reaction being set, depending on material type to be analyzed. EFFECT: provided reliability of analysis results. 3 dwg

Description

Изобретение относится к диагностике инфекционных заболеваний, основанном на обнаружении генетического материала (ДНК или РНК) возбудителя. При этом возможно проведение массовых анализов с контролем достоверности результата и практически полной автоматизацией процесса. The invention relates to the diagnosis of infectious diseases, based on the detection of genetic material (DNA or RNA) of the pathogen. In this case, it is possible to conduct mass analyzes with control of the reliability of the result and almost complete automation of the process.

Известны способы выявления возбудителя, основанные на обнаружении и идентификации его генетического материала, включающие несколько стадий. Прежде всего из биологического образца (крови, другой биологической жидкости, мокроты, клеточной культуры, биопсийного материала и т.д.), либо другого источника (пищевых отходов, сточных вод и т.д.) выделяют генетический материал возбудителя (ДНК или РНК) с очисткой его от примесей, препятствующих проведению следующей стадии анализа. Последняя, как правило, представляет собой размножение заданного фрагмента генома путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) [1] или какого-либо ее аналога (например, NASBA [2]). Далее размноженный фрагмент генома возбудителя (если таковой присутствовал в пробе) идентифицируется тем или иным способом [1]; при этом выдается результат анализа в целом. Known methods for identifying the pathogen, based on the detection and identification of its genetic material, including several stages. First of all, from the biological sample (blood, other biological fluid, sputum, cell culture, biopsy material, etc.), or another source (food waste, wastewater, etc.), the pathogen genetic material (DNA or RNA) is isolated with cleaning it from impurities that impede the next stage of analysis. The latter, as a rule, is the reproduction of a given fragment of the genome by polymerase chain reaction (PCR) [1] or some analogue of it (for example, NASBA [2]). Further, the propagated fragment of the pathogen genome (if one was present in the sample) is identified in one way or another [1]; this gives the result of the analysis as a whole.

Недостатком указанных способов является невозможность контроля эффективности как стадии выделения генетического материала, так и ПЦР для каждой из проб. The disadvantage of these methods is the inability to control the effectiveness of both the stage of isolation of genetic material and PCR for each of the samples.

Наиболее распространенный тип биологических образцов представляет собой пробы, содержащие клетки организма-хозяина, причем количество последних характеризует объем введенного в анализ материала, определяющий, в свою очередь, статистическую достоверность результата. К таким относятся цельная кровь или ее клеточная фракция, биопсии тканей, а также культуральные препараты. При этом геном возбудителя может находиться в виде ДНК внутри клеток-хозяев, как в случае ретровирусов (вирус иммунодефицита (ВИЧ), Т-клеточного лейкоза человека и животных, герпеса) и ДНК-содержащих вирусов, в виде РНК внутри клеток-хозяев (РНК-содержащие вирусы, например, вирус гриппа, классической чумы свиней и т.д.), а также в виде ДНК в составе бактерий, присутствующих среди хозяйских клеток (туберкулез, сибирская язва, хламидии и другие бактериальные инфекции). Особенностью таких образцов является то, что генетический материал возбудителя проходит стадии выделения вместе с таковым из хозяйских клеток и также вместе с ним вводится в ПЦР. Это предоставляет возможность контролировать эффективность как стадии выделения, так и ПЦР для каждой из проб, что и реализуется в ближайшем аналоге данного изобретения [3]. С этой целью ПЦР проводится в присутствии двух пар праймеров - одна на фрагмент генома возбудителя, а другая - на маркерный фрагмент генома организма-хозяина. Таким маркером может быть любой фрагмент, не подверженный мутациям и желательно расположенный в составе однокопийного гена. Копирование этого маркера в ходе ПЦР дает на выходе интенсивный сигнал, наличие которого подтверждает эффективность стадий выделения и ПЦР, особенно при отрицательном результате анализа - отсутствии возбудителя. Если геном последнего представлен в виде ДНК, в качестве маркера может быть использован участок генома организма-хозяина, например, фрагмент гена HLA-DQa [3,4]. Если же определяется РНК возбудителя, то необходимо использовать РНК-маркер, примером которого является мРНК глобинового гена [5]. The most common type of biological sample is a sample containing cells of the host organism, and the number of the latter characterizes the amount of material introduced into the analysis, which in turn determines the statistical reliability of the result. These include whole blood or its cell fraction, tissue biopsies, as well as culture preparations. In this case, the pathogen genome can be in the form of DNA inside the host cells, as in the case of retroviruses (immunodeficiency virus (HIV), human and animal T-cell leukemia, herpes) and DNA-containing viruses, in the form of RNA inside the host cells (RNA -containing viruses, for example, influenza virus, classical swine fever, etc.), as well as DNA in the composition of bacteria present among host cells (tuberculosis, anthrax, chlamydia and other bacterial infections). A feature of such samples is that the genetic material of the pathogen passes through the isolation stage together with that of the host cells and is also introduced into PCR with it. This provides the ability to control the effectiveness of both the isolation stage and PCR for each of the samples, which is implemented in the closest analogue of the present invention [3]. To this end, PCR is carried out in the presence of two pairs of primers - one per fragment of the pathogen genome, and the other on the marker fragment of the genome of the host organism. Such a marker can be any fragment that is not susceptible to mutations and preferably located in the single copy gene. Copying this marker during PCR gives an intense signal at the output, the presence of which confirms the effectiveness of the isolation and PCR stages, especially with a negative analysis result - no pathogen. If the genome of the latter is presented in the form of DNA, a portion of the genome of the host organism, for example, a fragment of the HLA-DQa gene [3,4] can be used as a marker. If the RNA of the pathogen is determined, then it is necessary to use an RNA marker, an example of which is the mRNA of the globin gene [5].

Одновременная ПЦР-амплификация фрагмента генома возбудителя и маркерного гена хозяйских клеток была проведена и в количественном варианте - в присутствии двух внутренних ДНК-стандартов на возбудитель (ВИЧ) и маркер (HLA-DQa) [4] . Это позволило определять для проб крови инфицированных лиц число копий ВИЧ в расчете на число маркерных генов (и, соответственно, клеточных геномов), и по изменению этой величины судить об эффективности проводимого лечения. Действительно, определяемое при этом число маркерных генов прямо характеризует объем пробы, из которого генетический материал попал в ПЦР после выделения и очистки. Именно эта величина определяет статистическую достоверность результата анализа, так как недостаточный объем введенной в анализ пробы вполне может быть причиной ложного отрицательного результата анализа. Simultaneous PCR amplification of the pathogen genome fragment and the marker gene of the host cells was carried out quantitatively in the presence of two internal DNA standards for the pathogen (HIV) and marker (HLA-DQa) [4]. This made it possible to determine the number of copies of HIV for blood samples of infected individuals based on the number of marker genes (and, accordingly, cellular genomes), and to judge the effectiveness of the treatment by changing this value. Indeed, the number of marker genes determined in this case directly characterizes the sample volume from which the genetic material got into PCR after isolation and purification. It is this value that determines the statistical reliability of the analysis result, since an insufficient volume of the sample introduced into the analysis may well be the cause of a false negative analysis result.

Недостатком указанного способа является невозможность диагностики проб, не содержащих клеток организма-хозяина, либо содержащих их в незначительных и/или изменяющихся случайным образом количествах, а также отсутствие контроля чувствительности обнаружения возбудителя, определяемой эффективностью процессов размножения фрагмента генома и детекции полученного при этом продукта. К пробам, не содержащим клеток организма-хозяина, либо содержащим их в незначительных и/или изменяющимся случайным образом количествах, относятся, например, такие биологические жидкости, как кровяная сыворотка, моча, мокроты и смывы со слизистых оболочек, а также сточные воды. Общей особенностью таких проб, отличающей их от рассмотренных выше, является невозможность использовать количественную ПЦР маркерного гена организма-хозяина [4] для оценки объема введенной в анализ пробы и уровня потерь генетического материала на стадии выделения. Последнее включает в себя лизис частиц возбудителя (вирусов или бактерий) непосредственно в пробе (например, вирусов гепатита в кровяной сыворотке [6] ), иногда с предварительным концентрированием этих частиц фильтрованием или центрифугированием. Хотя методы ПЦР-детекции позволяют обнаруживать даже одну копию ДНК или РНК [1], чувствительность в любой из проб может быть сильно понижена из-за присутствия ингибиторов ПЦР, ошибок оператора, низкого качества реагентов и т.п. Присутствие же в пробе стандарта на возбудитель в минимальном для ПЦР-детекции количестве (оптимальным представляется количество 10 молекул, см. пример) позволит эффективно контролировать протекание стадий размножения фрагмента генома и детекции полученных при этом продуктов. Наличие сигнала подобного "системного контроля" (т.е. стандарта на возбудитель, см. пример) является обязательным при отрицательном результате анализа. The disadvantage of this method is the impossibility of diagnosing samples that do not contain cells of the host organism, or containing them in insignificant and / or randomly varying quantities, as well as the lack of monitoring of the detection sensitivity of the pathogen, determined by the efficiency of the processes of reproduction of the genome fragment and detection of the product obtained from this. Samples that do not contain the cells of the host body, or that contain them in minor and / or randomly varying quantities, include, for example, biological fluids such as blood serum, urine, sputum and swabs from mucous membranes, as well as sewage. A common feature of such samples that distinguishes them from those considered above is the inability to use quantitative PCR of the marker gene of the host organism [4] to assess the volume of the sample introduced into the analysis and the level of loss of genetic material at the isolation stage. The latter involves the lysis of pathogen particles (viruses or bacteria) directly in the sample (for example, hepatitis viruses in blood serum [6]), sometimes with preliminary concentration of these particles by filtration or centrifugation. Although PCR detection methods can detect even one copy of DNA or RNA [1], the sensitivity in any of the samples can be greatly reduced due to the presence of PCR inhibitors, operator errors, poor quality reagents, etc. The presence in the sample of the standard for the pathogen in the minimum amount for PCR detection (the optimal number is 10 molecules, see the example) will allow you to effectively control the progress of the stages of reproduction of the genome fragment and detection of the products obtained. The presence of a signal of such a "system control" (ie, the standard for the pathogen, see example) is mandatory with a negative analysis result.

В качестве общего решения указанной проблемы предлагается введение в анализируемую пробу искусственного маркера определенного типа в известном количестве с последующим его использованием для оценки объема пробы и уровня потерь генетического материала. Вводимый маркер может быть двух типов. Во-первых, он может представлять собой непатогенный микроорганизм, моделирующий возбудителя (например, Echerichia coli или другой лабораторный микроорганизм), что позволит контролировать все стадии подготовки пробы, включая лизис и даже концентрирование. При этом любой подходящий фрагмент ДНК или РНК из этого введенного микроорганизма может быть использован в качестве описанного выше маркера, определяемого с помощью количественной ПЦР. Второй тип следует применять в тех случаях, когда для выделения анализируемого генетического материала используется ДНК- или РНК-носитель [7]. Именно последний и является искусственным маркером. Такой маркер-носитель, в отличие от неспецифического носителя (например, полиадениловой кислоты в наборе для детекции РНК гепатита C, предлагаемом фирмой Hoffmann La Roche [6]), должен представлять собой ДНК или РНК определенной структуры. Его количество в пробе должно быть в пределах, приемлемых для количественной детекции с использованием ПЦР со стандартом, и вместе с тем быть достаточно велико для его работы как носителя. Последнее, с учетом приводимых в литературе [7] примеров, может составлять микрограммы для плазмидных ДНК или РНК-транскриптов с них, либо нанограммы для фрагментов ДНК или РНК, получаемых путем ПЦР или комбинации ПЦР-транскрипция соответственно. As a general solution to this problem, it is proposed the introduction of an artificial marker of a certain type in a known quantity into the analyzed sample with its subsequent use to assess the volume of the sample and the level of loss of genetic material. An input marker can be of two types. Firstly, it can be a non-pathogenic microorganism simulating a pathogen (for example, Echerichia coli or another laboratory microorganism), which will allow to control all stages of sample preparation, including lysis and even concentration. Moreover, any suitable DNA or RNA fragment from this introduced microorganism can be used as the marker described above, as determined by quantitative PCR. The second type should be used in those cases when a DNA or RNA carrier is used to isolate the analyzed genetic material [7]. It is the latter that is an artificial marker. Such a carrier marker, in contrast to a non-specific carrier (for example, polyadenyl acid in the hepatitis C RNA detection kit offered by Hoffmann La Roche [6]), must be a DNA or RNA of a certain structure. Its amount in the sample should be within the limits acceptable for quantitative detection using PCR with a standard, and at the same time be large enough for it to work as a carrier. The latter, taking into account the examples cited in the literature [7], can make micrograms for plasmid DNA or RNA transcripts from them, or nanograms for DNA or RNA fragments obtained by PCR or a combination of PCR transcription, respectively.

Оптимальной системой для регистрации размноженных фрагментов после ПЦР является электрофоретическая. При этом пространственное разделение при электрофорезе в геле размноженных фрагментов возбудителя и системного контроля обеспечивает их раздельную регистрацию. Применение автоматических и компьютерных средств анализа электрофореграмм и тем более их модификация для диагностических работ обеспечит эффективную обработку, хранение и просмотр результатов. Альтернативные варианты одновременной детекции сигналов мишени и системного контроля без разделения компонентов возможны, но представляются более сложными в техническом исполнении. Примером одного из таких вариантов является использование разноцветных флуоресцентных меток при детекции в ячейке митротитровой плашки. The optimal system for detecting propagated fragments after PCR is electrophoretic. In this case, the spatial separation during electrophoresis in the gel of the multiplied fragments of the pathogen and system control ensures their separate registration. The use of automatic and computer-aided analysis of electrophoregrams and, all the more, their modification for diagnostic work will ensure efficient processing, storage and viewing of results. Alternative options for the simultaneous detection of target signals and system control without separation of components are possible, but seem more complicated in technical design. An example of one of these options is the use of multi-colored fluorescent labels in the detection of a mitrotiter plate in a cell.

Фиг. 1. представляет профили электрофореграмм при детекции ВИЧ-ДНК для двух проб после 1-й ПЦР. Видны сигналы фрагмента маркерного гена (канал 188) и стандарта GS (канал 214), введенного в смесь в количестве, эквивалентном 40000 клеток. Видно, что в случае пробы 1 в анализ введено более 200 тыс. клеток, а в пробе 2 - менее 20 тыс. В последнем случае объем пробы и статистическая достоверность результата понижены по сравнению с пробой 1. FIG. 1. represents the profiles of electrophoregrams in the detection of HIV-DNA for two samples after the 1st PCR. The signals of the marker gene fragment (channel 188) and the GS standard (channel 214) are introduced into the mixture in an amount equivalent to 40,000 cells. It can be seen that in the case of sample 1, more than 200 thousand cells were introduced into the analysis, and in sample 2, less than 20 thousand cells. In the latter case, the volume of the sample and the statistical reliability of the result are reduced compared to sample 1.

Фиг.2. - профили электрофореграмм при детекции ВИЧ-ДНК после 2-й ПЦР для неинфицированной (1) и инфицированной (2) проб. В анализ было введено 10 (A) или 100 (B) молекул системного контроля-стандарта на ВИЧ (IS). Для отрицательного результата строго обязательно наличие сигнала системного контроля (канал 505 для A или 402 для B), подтверждающего высокую чувствительность определения. При положительном результате он может почти исчезнуть на фоне сигнала ВИЧ-ДНК (канал 550 для A или 422 для B). Figure 2. - electrophoregram profiles during the detection of HIV-DNA after the 2nd PCR for uninfected (1) and infected (2) samples. 10 (A) or 100 (B) molecules of the systemic control standard for HIV (IS) were introduced into the analysis. For a negative result, it is strictly necessary to have a system control signal (channel 505 for A or 402 for B), confirming the high sensitivity of the determination. With a positive result, it can almost disappear against the background of the HIV-DNA signal (channel 550 for A or 422 for B).

Пример: Диагностика ВИЧ-инфекции в пробах крови. Example: Diagnosis of HIV infection in blood samples.

Для этой цели используются праймеры и ДНК-стандарты, описанные ранее [4] для мониторинга развития инфекции путем количественной ПЦР. В качестве системного контроля на ВИЧ применяется стандарт-амплификат IS (здесь и далее все обозначения даны по указанной выше работе [4]), который при ПЦР с подходящим комплектом праймеров дает продукты более длинные по сравнению с таковыми для мишени (ВИЧ-ДНК) на 80 нп. Для контроля выделения ДНК используется количественная ПЦР маркерного гена человека HLA-DQa со стандартом GS. Последний при ПЦР с праймерами GH26 и GH27 образует фрагмент длиной 202 нп, что короче по сравнению с таковым для мишени, имеющим длину 242 нп. For this purpose, primers and DNA standards described previously [4] are used to monitor the development of infection by quantitative PCR. As a systemic control for HIV, the standard amplification IS is used (hereinafter all designations are given in the above work [4]), which, when PCR with a suitable set of primers gives products longer than those for the target (HIV-DNA) on 80 np To control DNA extraction, quantitative PCR of the human marker gene HLA-DQa with the GS standard is used. The latter during PCR with primers GH26 and GH27 forms a fragment with a length of 202 np, which is shorter than that for a target having a length of 242 np.

Общей схемой анализа является следующая. Из пробы цельной крови путем центрифугирования отделяется плазма, затем удаляются эритроциты путем отмывки низкоионным буфером. Полученный осадок лейкоцитов лизируется при 95^oC в присутствии фосфоцеллюлозы или другого подходящего носителя (например, Chelex-100), что дает препарат ДНК для ПЦР. Возможно применение и других схем фракционирования клеток и лизиса. Анализ ДНК проводится путем двукратной "гнездовой" ПЦР. При первой амплификации в смесь вводятся: клеточный лизат, стандарты на ВИЧ и на маркер, праймеры для 1-й ПЦР на ВИЧ (P9 и P10), праймеры на маркер (GH26 и GH27). Далее 1/30 - 1/20 часть полученной смеси вводится во вторую амплификацию - ПЦР с "гнездовыми" праймерами на ВИЧ (TP7 и AP4 либо APЗ и AP5). Полученные смеси анализируются электрофорезом в обычном агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Результаты могут быть зарегистрированы путем наблюдения флуоресценции полос ДНК визуально, либо с помощью прибора - в рассмотренных ниже случаях была применена камера ФМК-1000 с линейным CCD-детектором при статистической обработке сигнала процессором ПС-2101х, выпускаемыми АО "Дельтатех". По профилю электрофореграммы после 1-й ПЦР определяют содержание маркерного гена в анализируемой смеси (т.е. число хозяйских клеток в пробе как показано на фиг. 1). Аналогичным образом после 2-й ПЦР (фиг. 2) регистрируют сигналы ВИЧ-ДНК (если он есть) и системного контроля. Только при наличии последнего и одновременном отсутствии сигнала возбудителя (кривая 1 на фиг. 2 A и B) результат анализа можно считать отрицательным.The general analysis scheme is as follows. Plasma is separated from a whole blood sample by centrifugation, then red blood cells are removed by washing with a low-ion buffer. The resulting leukocyte pellet is lysed at 95 ^° C. in the presence of phosphocellulose or another suitable carrier (e.g. Chelex-100), which provides a DNA preparation for PCR. Other cell fractionation and lysis schemes are also possible. DNA analysis is carried out by double "nested" PCR. At the first amplification, the mixture contains: cell lysate, HIV and marker standards, primers for the 1st HIV PCR (P9 and P10), marker primers (GH26 and GH27). Then 1/30 - 1/20 part of the obtained mixture is introduced into the second amplification - PCR with "nested" HIV primers (TP7 and AP4 or AP3 and AP5). The resulting mixtures are analyzed by electrophoresis in a conventional agarose gel containing ethidium bromide. The results can be recorded by observing the fluorescence of DNA bands visually, or using an instrument - in the cases considered below, an FMK-1000 camera with a linear CCD detector was used for statistical signal processing by the PS-2101x processor manufactured by Deltatech JSC. The profile of the electrophoregram after the 1st PCR determines the content of the marker gene in the analyzed mixture (i.e., the number of host cells in the sample as shown in Fig. 1). Similarly, after the 2nd PCR (Fig. 2), HIV-DNA signals (if any) and systemic control are recorded. Only in the presence of the last and simultaneous absence of the pathogen signal (curve 1 in Fig. 2 A and B) can the analysis result be considered negative.

Источники информации
1. Mullis К. В. //US Patent N 4683202, 1985; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S. , Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis К.В., Ehrlich H.A. //Science. 1988. V. 239. P. 487-491.Sources of information
1. Mullis K.V. // US Patent N 4683202, 1985; Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S., Scharf SJ, Higuchi R., Horn GT, K. Mullis, Ehrlich HA // Science. 1988. V. 239. P. 487-491.

2. HIV-I NASBA test kit. Instruction for use. Organon Teknika BV, Boxtel, Holland, 1993. 2. HIV-I NASBA test kit. Instruction for use. Organon Teknika BV, Boxtel, Holland, 1993.

3. Kellog S.E., Sninsky J.J., Kwok S. //Analyt. Biochem. 1990. V.189. P. 202-208; Елов A.A., Козлова A.B., Медников Б.М., Корнилаева Г.В. и Карамов Э.В. Вопросы вирусологии. 1994, N 3, с. 107-109. 3. Kellog S.E., Sninsky J.J., Kwok S. // Analyt. Biochem. 1990. V.189. P. 202-208; Elov A.A., Kozlova A.B., Mednikov B.M., Kornilayeva G.V. and Karamov E.V. Questions of virology. 1994, N 3, p. 107-109.

4. Yolov A.A., Kozlova A.V., Yaroslavtseva N.G., Mednikov B.M., Karamov E.V. - Virus genes. 1995. V.1O. N. 1. P. 45-51. 4. Yolov A.A., Kozlova A.V., Yaroslavtseva N.G., Mednikov B.M., Karamov E.V. - Virus genes. 1995. V.1O. N. 1. P. 45-51.

5. Saksela K. , Stevens C., Rubinstein P., Baltimore D. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1994. V.91. P. 1104-1108. 5. Saksela K., Stevens C., Rubinstein P., Baltimore D. // Proc. Nat. Acad Sci. USA 1994. V.91. P. 1104-1108.

6. Amplicor HCV specimen preparation kit. Hoffmann La Roche. ART: 0753912; US: 87376,1994. 6. Amplicor HCV specimen preparation kit. Hoffmann La Roche. ART: 0753912; US: 87376.1994.

7. Boom R. , Sol C. J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.L., Wertheim van Dillen P. M.E. and van der Noordaa J. - J. Clin. Microbiol. 1990, v. 28, p. 495-503. 7. Boom R., Sol C. J. A., Salimans M. M. M., Jansen C. L., Wertheim van Dillen P. M. E. and van der Noordaa J. - J. Clin. Microbiol. 1990, v. 28, p. 495-503.

Claims

A method for diagnosing infections by detecting the genetic material of the pathogen in the test sample, involving the propagation of DNA or RNA fragments using polymerase chain reactions or their analogues, characterized in that the analysis is carried out in the presence of two DNA or RNA standards, one of which is introduced into the sample the minimum amount for detection and corresponds to the propagated fragment of the pathogen genome, and the other corresponds to the genetic marker characterizing the sample volume.