RU2142134C1 - Test system for detecting antibodies to nuclear protein of hepatitis c of igm class - Google Patents
Test system for detecting antibodies to nuclear protein of hepatitis c of igm class Download PDFInfo
- Publication number
- RU2142134C1 RU2142134C1 RU97109494A RU97109494A RU2142134C1 RU 2142134 C1 RU2142134 C1 RU 2142134C1 RU 97109494 A RU97109494 A RU 97109494A RU 97109494 A RU97109494 A RU 97109494A RU 2142134 C1 RU2142134 C1 RU 2142134C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gly
- arg
- igm
- pro
- solution
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 46
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 title claims description 16
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 title claims description 16
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title description 5
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 35
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 22
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 4
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims description 31
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 23
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims description 11
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 5
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 5
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 6
- 206010065051 Acute hepatitis C Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037621 acute hepatitis C virus infection Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 abstract description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- LIAWOTKNAVAKCX-UHFFFAOYSA-N hydrazine;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.NN LIAWOTKNAVAKCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 125000002467 phosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 abstract 1
- NIFIFKQPDTWWGU-UHFFFAOYSA-N pyrite Chemical compound [Fe+2].[S-][S-] NIFIFKQPDTWWGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 17
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000006154 Chronic hepatitis C Diseases 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical group F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N tetraphosphorus decaoxide Chemical compound O1P(O2)(=O)OP3(=O)OP1(=O)OP2(=O)O3 DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HIXDQWDOVZUNNA-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxychromen-4-one Chemical compound C=1C(OC)=CC(O)=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 HIXDQWDOVZUNNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059193 Acute hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 description 1
- 206010019759 Hepatitis chronic persistent Diseases 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000581002 Murex Species 0.000 description 1
- 101800000514 Non-structural protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 101710132602 Peroxidase 5 Proteins 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Natural products C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000037628 acute hepatitis B virus infection Diseases 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- OJYGBLRPYBAHRT-IPQSZEQASA-N chloralose Chemical compound O1[C@H](C(Cl)(Cl)Cl)O[C@@H]2[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]21 OJYGBLRPYBAHRT-IPQSZEQASA-N 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- OCDXZFSOHJRGIL-UHFFFAOYSA-N cyclohexyloxycyclohexane Chemical compound C1CCCCC1OC1CCCCC1 OCDXZFSOHJRGIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229940100630 metacresol Drugs 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229940064914 retrovir Drugs 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и может найти применение при диагностике гепатита C. The invention relates to the field of medicine and biotechnology and may find application in the diagnosis of hepatitis C.
Известен иммунотест для обнаружения HCV IgM антител в тест пробе (см. заявка PCT 93/20445, 14.10.93, кл. G 01 N 33/563). Тест-система содержит ядерный антиген вируса гепатита C и конъюгат антител против IgM человека, меченных пероксидазой хрена. The known immunotest for detecting HCV IgM antibodies in a test sample (see PCT application 93/20445, 10/14/93, CL G 01 N 33/563). The test system contains a nuclear antigen of hepatitis C virus and a conjugate of antibodies against human IgM labeled with horseradish peroxidase.
Однако в указанном иммунотесте в качестве основы (антигена) используется ядерный белок вируса гепатита C, полученный с помощью рекомбинантной технологии. Получение такого белка в очищенном виде достаточно сложно и трудоемко, так как сопряжено с разработкой штаммов-продуцентов и специальной технологии очистки. Химический синтез пептида, структура которого соответствует антигенным детерминантам ядерного белка вируса, значительно упрощает и существенно ускоряет получение результата. Кроме этого, в описанной выше тест-системе нельзя использовать в качестве основы иммуносорбента микропланшеты, которые широко применяются в настоящее время для диагностики различных патологических состояний. However, in the indicated immunoassay, the hepatitis C virus protein obtained using recombinant technology is used as the basis (antigen). Obtaining such a protein in purified form is quite difficult and time-consuming, since it involves the development of producer strains and special purification technology. Chemical synthesis of the peptide, the structure of which corresponds to the antigenic determinants of the nuclear protein of the virus, greatly simplifies and significantly speeds up the result. In addition, in the test system described above, microplates, which are currently widely used for the diagnosis of various pathological conditions, cannot be used as the basis of the immunosorbent.
Изобретение направлено на разработку тест-системы для обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита C класса IgM в сыворотке крови, которая позволяет квалифицировать активно текущую вирусную инфекцию. Обеспечена ранняя диагностика гепатита C, а также достаточно высокая чувствительность за счет выявления большого числа позитивных сывороток. Упрощено и существенно ускорено получение результата. Имеется возможность использовать микропланшеты в качестве основы иммуносорбента. The invention is directed to the development of a test system for the detection of antibodies to the nuclear protein of hepatitis C virus IgM class in blood serum, which allows you to qualify actively ongoing viral infection. An early diagnosis of hepatitis C is provided, as well as a fairly high sensitivity due to the detection of a large number of positive sera. Simplified and significantly accelerated results. It is possible to use microplates as the basis of an immunosorbent.
Диагностика с использованием тест-системы основана на применении метода иммуноферментного анализа. Для обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита C (анти-ВГСcore IgM) в сыворотке крови необходимо обеспечить контакт исследуемой сыворотки с антигеном и конъюгатом. Diagnostics using a test system is based on the use of enzyme immunoassay. To detect antibodies to the hepatitis C virus nuclear protein (anti-HCVcore IgM) in the blood serum, it is necessary to ensure that the test serum is in contact with the antigen and conjugate.
Выявление IgM-антител к ядерному белку вируса гепатита C в сыворотке крови осуществляется за счет их взаимодействия со специфическим синтетическим пептидом, сорбированным на поверхности лунок полистироловых стрипов. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляется с помощью пероксидазного конъюгата на основе моноклональных антител к тяжелой цепи IgM человека после добавления субстратного раствора. The detection of IgM antibodies to the hepatitis C virus nuclear protein in blood serum is carried out due to their interaction with a specific synthetic peptide sorbed on the surface of the polystyrene strip wells. The resulting antigen-antibody complex is detected using a peroxidase conjugate based on monoclonal antibodies to the human IgM heavy chain after adding a substrate solution.
Тест-система для обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита C класса IgM в сыворотке крови содержит ядерный антиген вируса гепатита C и конъюгат антител против IgM человека, меченных пероксидазой хрена. В качестве антигена предложено использовать синтетический пептид структуры NH2-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe- Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro Arg-Leu-Gly-CONH2, в качестве основы конъюгата-моноклональные антитела к тяжелым цепям IgM человека. Дополнительно введены человеческие сыворотки, инактивированные прогреванием, в качестве негативного и позитивного контроля, концентрат фосфатно-солевого раствора с детергентом-твин 80, раствор для разведения исследуемых проб, цитратный буферный раствор, ортофенилендиамин дигидрохлорид, гидроперит и раствор серной кислоты.The test system for detecting antibodies to the IgM class hepatitis C virus nuclear protein in blood serum contains the hepatitis C virus antigen and an anti-human IgM antibody conjugate labeled with horseradish peroxidase. A synthetic peptide of the structure NH 2 -Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile is proposed to be used as an antigen -Val-Gly-Gly-Val-Tyr Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro Arg-Leu-Gly-CONH 2 , as the base for conjugate-monoclonal antibodies to human IgM heavy chains. In addition, human serum inactivated by heating was introduced as a negative and positive control, a concentrate of phosphate-saline solution with
Выбор пептида осуществлялся из 18 коротких пептидов (16-20 аминокислотных остатков) и 3 длинных (35-80 аминокислотных остатков), соответствующих предлагаемым антигенным детерминантам структурных белков (ядерного-core и поверхностного env) и неструктурных белков NS3, NS4, NS5 вируса ГС. The peptide was selected from 18 short peptides (16-20 amino acid residues) and 3 long (35-80 amino acid residues) corresponding to the proposed antigenic determinants of structural proteins (nuclear-core and surface env) and non-structural proteins NS3, NS4, NS5 of the HS virus.
Специфичность реагирования указанных антигенных участков вирусного протеина с сыворотками, содержащими и не содержащими антитела к вирусу ГС (анти-ВГС), оценивалась в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием аттестованных в зарубежных скрининговых (Abbbott HCV 2.0 EAI, UBI HCV EAI) и подтверждающих тестах (LiaTek HCV, Wellcozyme HCV immunoblot) панелей сывороток. The specificity of the reaction of the indicated antigenic sites of the viral protein with sera containing and not containing antibodies to the HS virus (anti-HCV) was evaluated in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using certified screening in foreign (Abbbott HCV 2.0 EAI, UBI HCV EAI) and confirming tests (LiaTek HCV, Wellcozyme HCV immunoblot) of serum panels.
Авторами установлено, что значительная часть синтезированных пептидных фрагментов полипротеина вируса ГС специфично реагирует с анти-ВГС-позитивными сыворотками, однако с различной частотой и интенсивностью. Наиболее частот сыворотки реагировали с пептидами-антигенными детерминантами ядерного белка (HCV1, HCV2, HCV23) и неструктурного белка NS4. Специфично, но с меньшей частотой и интенсивностью, с сыворотками реагировали пептиды HCV4 и HCV6 (NS4), HCV3 (поверхностный белок) HCV13, HCV14, HCV25 (NS5). The authors found that a significant part of the synthesized peptide fragments of the HS virus polyprotein specifically reacts with anti-HCV-positive sera, but with a different frequency and intensity. Most serum frequencies reacted with antigenic determinant peptides of the nuclear protein (HCV1, HCV2, HCV23) and the non-structural protein NS4. Specifically, but with a lower frequency and intensity, peptides HCV4 and HCV6 (NS4), HCV3 (surface protein) HCV13, HCV14, HCV25 (NS5) reacted with sera.
Выявление комплекса антиген-антитело осуществляется с помощью конъюгата антител к ядерному белку вируса ГС с пероксидазой хрена. Наиболее эффективно применять для данных целей - моноклональные антитела против IgM человека, меченные пероксидазой хрена. Detection of the antigen-antibody complex is carried out using a conjugate of antibodies to the nuclear protein of the HS virus with horseradish peroxidase. The most effective for these purposes is monoclonal antibodies against human IgM labeled with horseradish peroxidase.
Специфичность тест-системы оценивалась по следующим параметрам:
- отсутствие перекрестных реакций с антителами класса IgM к ядерному антигену вируса гепатита B (ГB), к вирусу гепатита A (ГA),
- отсутствие реакции у анти-ВГС-негативных инфекционных больных, этиологически не связанных с вирусами гепатитов (ВИЧ-инфицированных),
- отсутствие реакции у анти-ВГС-негативных доноров крови,
- отсутствие реакции у больных вирусными гепатитами в динамике,
-корреляционная связь между обнаружением анти-ВГС core IgM и РНК вируса ГC при обследовании больных вирусными гепатитами.The specificity of the test system was evaluated by the following parameters:
- the absence of cross-reactions with antibodies of the IgM class to the nuclear antigen of hepatitis B virus (HB), to hepatitis A virus (GA),
- lack of response in anti-HCV-negative infectious patients etiologically not related to hepatitis viruses (HIV-infected),
- lack of response in anti-HCV-negative blood donors,
- lack of response in patients with viral hepatitis in dynamics,
correlation between the detection of anti-HCV core IgM and HCV RNA during examination of patients with viral hepatitis.
Оценка диагностической ценности проводилась по частоте выявления анти-ВГС core IgM у больных острым гепатитом C (ГC), хроническим ГC с манифестацией патологического процесса, анти-ВГC-позитивных доноров крови. Изобретение может быть реализовано следующим образом. Assessment of diagnostic value was carried out by the frequency of detection of anti-HCV core IgM in patients with acute hepatitis C (HS), chronic HS with a manifestation of the pathological process, anti-HCV-positive blood donors. The invention can be implemented as follows.
В тест-системе использовали иммуносорбент представляющий собой полистироловые планшеты (стрипы), лунки которых покрыты синтетическим пептидом NH2-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys- Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg- Arg-Gly-Pro ArgLeu-Gly-CONH2.In the test system, an immunosorbent was used which is polystyrene plates (strips), the wells of which are coated with the synthetic peptide NH 2 -Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro- Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro ArgLeu-Gly-CONH 2 .
Источник: core белок вируса гепатита C, фрагмент 11-45. Source: hepatitis C virus core protein, fragment 11-45.
Заявленный пептид получают трехфазным методом с последовательным наращиванием пептидной цепи на сополимере стирола с 1% дивинилбензола. The claimed peptide is obtained by a three-phase method with sequential peptide chain growth on a styrene copolymer with 1% divinylbenzene.
α - аминогруппы аминокислот блокируют трет-бутилоксикарбонильными группами. Для защиты боковых радикалов трифункциональных аминокислот используют следующие группы: для лизина-2-хлорбензилоксикарбонильную; для гистидина-тозиильную; для треонина, глютаминовой кислоты-соответствующие бензиловые эфиры; для аспарагиновой кислоты-циклогексиловый эфир; для аргинина-мезитиленсульфонильную; для тирозина-2,6- дихлорбензильную. Для конденсации используют дициклогексилкарбодиимид или дициклогексилкарбодиимид с добавкой 1-оксибензотриазола. Деблокирование ведут с помощью 50%-ного раствора трифторуксусной кислоты в среде CН2Cl2, а нейтрализацию 5%-ным раствором диизопропиламина в CH2Cl2. Отщепление полученных пептидов от полимера и деблокирование боковых защитных групп ведут с помощью HF, а очищают гель- и обращеннофазовой хроматографией.α - amino groups of amino acids are blocked by tert-butyloxycarbonyl groups. The following groups are used to protect the side radicals of trifunctional amino acids: for lysine-2-chlorobenzyloxycarbonyl; for histidine tosyl; for threonine, glutamic acid, the corresponding benzyl esters; for aspartic acid, cyclohexyl ether; for arginine-mesitylenesulfonyl; for tyrosine-2,6-dichlorobenzyl. For condensation, dicyclohexylcarbodiimide or dicyclohexylcarbodiimide with the addition of 1-hydroxybenzotriazole is used. Release is carried out using a 50% solution of trifluoroacetic acid in CH 2 Cl 2 medium, and neutralization with a 5% solution of diisopropylamine in CH 2 Cl 2 . Cleavage of the obtained peptides from the polymer and the release of the side protective groups are carried out using HF, and purified by gel and reverse phase chromatography.
Метод получения пептидов твердофазным методом описан в работе Barany G., Merrifield R. B. Solid-phase peptide synthesis. In: Peptides. Analysis, Synthesis, Biology. Eds.: Gross E., Meienhofer J., N.Y. -Academic Press. -1980. -Vol.2.-p. 3-285. The solid-phase method for producing peptides is described by Barany G., Merrifield R. B. Solid-phase peptide synthesis. In: Peptides. Analysis, Synthesis, Biology. Eds .: Gross E., Meienhofer J., N.Y. -Academic Press. -1980. -Vol.2.-p. 3-285.
Пример 1. Для синтеза пептида указанной формулы загружают в реакционный сосуд 0,5 г бензгидриламинополимера. Содержание аминогрупп 1 мМ/г полимера. Пептидную цепь далее наращивают по следующей программе (на присоединение одной аминокислоты, см. табл. 1). Example 1. For the synthesis of a peptide of the specified formula, 0.5 g of benzhydrylaminopolymer is loaded into the reaction vessel. The amino group content is 1 mM / g polymer. The peptide chain is then expanded according to the following program (for the addition of one amino acid, see table. 1).
Если нингидриновый тест положителен, повторяют конденсацию, начиная с п. 5. В случае отрицательного теста производят присоединение следующего аминокислотного остатка, проходя программу с п.1. If the ninhydrin test is positive, the condensation is repeated starting from
По завершении синтеза пептидил-полимер высушивают в вакууме-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянной массы. Выход 2.4 (60% от теории). 1 г пептидил-полимера переносят в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавляют 0,5 мл тиоанизола и 0,5 мл мета-крезола, охлаждают до температуры -78oC и в течение 10 мин перегоняют 10 мл безводного фтористого водорода. Реакционную смесь нагревают до 0oC и перемешивают в течение 90 мин, затем отгоняют фтористый водород. Остаток переносят на фильтр Шотта и промывают этилацетатом и эфиром. Пептид экстрагируют 50 мл 25%-ной уксусной кислоты, разбавляют водой и лиофилизуют. Выход с 1 г пептидил-полимера 135 мг (59%). После обессоливания на колонке с Sephadex G-10 (элюент 50%-ная уксусная кислота) продукт очищают на колонке Altech Rsil C18 в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте в градиенте 20-50% ацетонитрила. Фракции, содержащие пептид, собирают и лиофилизуют. Очищенный пептид индивидуален по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии (колонка Delta PAKC18,5 0,4 15,0 см, скорость потока 1 мл/мин, элюент 0,1%-ная трифторуксусная кислота, градиент 20-50% ацетонитрила). Время удерживания 8,44 мин.Upon completion of the synthesis, the peptidyl polymer is dried in a vacuum desiccator over phosphorus pentoxide to constant weight. Yield 2.4 (60% of theory). 1 g of the peptidyl polymer is transferred to the reactor of the liquid hydrogen fluoride unit, 0.5 ml of thioanisole and 0.5 ml of meta-cresol are added, cooled to a temperature of -78 ° C and 10 ml of anhydrous hydrogen fluoride are distilled for 10 minutes. The reaction mixture is heated to 0 ° C. and stirred for 90 minutes, then hydrogen fluoride is distilled off. The residue was transferred to a Schott filter and washed with ethyl acetate and ether. The peptide is extracted with 50 ml of 25% acetic acid, diluted with water and lyophilized. The output from 1 g of peptidyl polymer is 135 mg (59%). After desalting on a Sephadex G-10 column (eluent 50% acetic acid), the product is purified on an Altech Rsil C18 column in 0.1% trifluoroacetic acid in a gradient of 20-50% acetonitrile. Fractions containing the peptide are collected and lyophilized. The purified peptide is individual according to high performance liquid chromatography (column Delta PAKC18.5 0.4 15.0 cm,
Данные аминокислотного анализа гидролизата пептида 4 N MSA,115, 2 часа:
Asp - 3,17 (3)
Thr - 1,96 (2)
Gly - 2,3 (2)
Ile - 0,7 (1)
Val - 2,7 (3)
Tyr - 1,01 (1)
Phe - 1,03 (1)
Leu - 3,22 (3)
Пример 2. Оценка специфичности
Для оценки специфичности испытуемой тест-системы были исследованы сыворотки 46 больных ГА (наличие только IgM анти-ВГА), 25 больных ГВ (наличие только HBsAg и анти-HBc IgM), 86 ВИЧ-инфицированных (наличие только антител к ВИЧ), 48 анти-ВГС и HBsAg-негативных доноров, 271 больного вирусными гепатитами при параллельном определении РНК ВГС и анти-ВГС core IgM. В целом объем проведенных лабораторных исследований отражен в таблице 2. Исследования сывороток на маркеры вирусных гепатитов проводились с использованием коммерческих препаратов фирм Organon Teknika (Голландия), Murex (Великобритания), Orgenix (Израиль), Аквапаст (Россия). Определение РНК ВГС проводили по методу H. Okamoto (1992). Исследованиями установлено, что реагирования сывороток здоровых доноров с иммуносорбентом практически не наблюдалось. Распределение сывороток доноров по оптической плотности при постановке теста на анти-ВГС core IgM в ИФА происходило в основном в области до 0.15 оптических единиц (о. е.). Суммарно в этой области находилось 81,2% (таблица 3), а средняя оптическая плотность образцов составляла 0,099 о.е. Это свидетельствует о том, что приготовленный иммуносорбент достаточно специфичен. Лишь единичные образцы показали оптическую плотность выше 0,21 о.е; при этом максимальное значение показателя, равное 0,234 о.е., наблюдалось в 1 из 48 образцов (2,1%). Идентичными оказались и результаты тестирования сывороток больных вирусными ГА и ГВ, а также ВИЧ-инфицированных. Средние показатели оптической плотности образцов этих категорий пациентов колебались в пределах 0,083 - 0,135 о.е., а максимальные значения показателей не превысили 0,3 о.е. (0,232 - 0,280 о. е.). Указанные результаты позволяют сделать заключение об отсутствии перекрестного реагирования иммуносорбента с другими инфекционными агентами, связанными и не связанными с поражением печени. С другой стороны, полученные результаты позволили внести коррективы в формулу для расчета уровня cut off, которая в конечном виде представила собой: Средний показатель оптической плотности негативного контрольного образца +0,2 (Ср ОП НК +0,2). Этой формулой пользовались при оценке результатов тестирования сывороток на анти-ВГСcore IgM во всех последующих экспериментах.The amino acid analysis data of the hydrolyzate of the peptide 4 N MSA, 115, 2 hours:
Asp - 3.17 (3)
Thr - 1.96 (2)
Gly - 2,3 (2)
Ile - 0.7 (1)
Val - 2.7 (3)
Tyr - 1.01 (1)
Phe - 1.03 (1)
Leu - 3.22 (3)
Example 2. Specificity Assessment
To assess the specificity of the test system tested, the sera of 46 GA patients (the presence of only anti-HAV IgM only), 25 HB patients (the presence of only HBsAg and anti-HBc IgM), 86 HIV-infected patients (the presence of HIV antibodies only), and 48 HCV and HBsAg-negative donors, 271 patients with viral hepatitis with parallel determination of HCV RNA and anti-HCV core IgM. In general, the volume of laboratory tests is shown in Table 2. Serum studies for viral hepatitis markers were performed using commercial preparations of Organon Teknika (Holland), Murex (Great Britain), Orgenix (Israel), and Aquapast (Russia). The determination of HCV RNA was carried out according to the method of H. Okamoto (1992). Studies have shown that the reaction of healthy donor sera with immunosorbent was practically not observed. The distribution of donor sera by optical density during the test for anti-HCV core IgM in ELISA occurred mainly in the region of up to 0.15 optical units (p.u.). In total, 81.2% were in this region (Table 3), and the average optical density of the samples was 0.099 p.u. This indicates that the prepared immunosorbent is quite specific. Only a few samples showed optical density above 0.21 p.u. the maximum value of the indicator, equal to 0.234 pu, was observed in 1 of 48 samples (2.1%). The results of testing the sera of patients with viral GA and HB, as well as HIV-infected, were also identical. The average optical density of samples of these categories of patients ranged from 0.083 to 0.135 pu, and the maximum values of the indicators did not exceed 0.3 pu (0.232 - 0.280 p.u.). These results allow us to conclude that there is no cross-reaction of the immunosorbent with other infectious agents associated and not associated with liver damage. On the other hand, the results obtained made it possible to make adjustments to the formula for calculating the cut off level, which in the final form was: The average optical density of the negative control sample was +0.2 (Cf OD NC + 0.2). This formula was used in evaluating the results of serum testing for anti-HCVcore IgM in all subsequent experiments.
Одним из самых достоверных критериев специфичности диагностических препаратов является соответствие результатов, полученных с помощью разработанного препарата, и "золотого" стандарта (тест-системы, получившей самые высокие оценки специалистов). В случае с тест-системами на анти-ВГС core IgM такой стандарт отсутствует. В связи с этим были проведены сопоставления результатов тестирования на анти-ВГС core IgM в ИФА и на РНК ВГС методом ПЦР сывороток больных вирусными гепатитами. Результаты этого сопоставления представлены в таблице 4. Полное совпадение результатов отмечено в 192 образцах из 271 (70,8%), что следует признать достаточно высоким показателем при сопоставлении методов, основанных на разных принципах (определение серологических сдвигов - ИФА; определение генома вируса-ПЦР). Следует отметить, что более часто анти-ВГС core IgM выявлялись в сыворотках позитивных по РНК ВГС (66%), чем в РНК-негативных - 26,3% (p < 0,001). Полученные результаты свидетельствуют о высокой специфичности разработанной тест-системы. One of the most reliable criteria for the specificity of diagnostic drugs is the compliance of the results obtained with the help of the developed drug and the "gold" standard (test system that received the highest marks from specialists). In the case of test systems for anti-HCV core IgM, such a standard is absent. In this regard, we compared the results of testing for anti-HCV core IgM in ELISA and for HCV RNA by PCR sera of patients with viral hepatitis. The results of this comparison are presented in Table 4. The complete coincidence of the results was noted in 192 samples from 271 (70.8%), which should be recognized as a rather high indicator when comparing methods based on different principles (determination of serological changes - ELISA; determination of the genome of the PCR virus ) It should be noted that more often anti-HCV core IgM was detected in serum positive for HCV RNA (66%) than in serum RNA negative - 26.3% (p <0.001). The results obtained indicate the high specificity of the developed test system.
И, наконец, еще одним критерием специфичности тест-системы является воспроизводимость результатов при исследовании сывороток одного и того же пациента, полученных в динамике. В связи с этим было проведено исследование сывороток 23 больных (РНК ВГС и анти-ВГСcore IgM-негативных при первичном обследовании) в динамике наблюдения от 14 до 213 дней (72,1 + 10,7). Кратность исследования образцов, полученных на различных сроках заболевания, составила 2-6 раз (2,9 + 0,2), а общее число исследований - 68. При этом во всех случаях исследуемые образцы оказались негативными по анти-ВГС core IgM. And finally, another criterion for the specificity of the test system is the reproducibility of the results in the study of the sera of the same patient, obtained in dynamics. In this regard, a study was conducted of the sera of 23 patients (HCV RNA and anti-HCVcore IgM-negative during the initial examination) in the dynamics of observation from 14 to 213 days (72.1 + 10.7). The multiplicity of studies of samples obtained at different stages of the disease was 2-6 times (2.9 + 0.2), and the total number of studies was 68. In all cases, the samples studied were negative for anti-HCV core IgM.
Пример 3. Оценка диагностической ценности. Example 3. Assessment of diagnostic value.
Оценка диагностической ценности разработанной тест-системы осуществлялась по частоте выявления анти-ВГСcore IgM у больных острым ГС, хроническим ГС с манифестацией патологического процесса (у 21 обследованного имелись результаты морфологического изучения биоптатов печени), анти-ВГС-позитивных доноров крови (объем исследований представлен в таблице 2). Указанные группы пациентов были параллельно обследованы на наличие маркеров вирусного ГС с помощью других тестов (скрининговые тесты на наличие анти-ВГС, иммуноблотинг - для установления спектра антител к различным белкам вируса ГС, ПЦР для выявления РНК ВГС). Особую группу составили 42 больных различными формами ГС, которые получали антивирусную терапию (интерферон, ретровир, TMZ). Эти больные были обследованы на анти-ВГСcore IgM в динамике от 2 до 6 раз, а сроки наблюдения колебались в пределах 10-200 дней. The diagnostic value of the developed test system was assessed by the frequency of detection of anti-HCVcore IgM in patients with acute hepatitis B, chronic hepatitis C with a manifestation of the pathological process (21 examined had the results of a morphological study of liver biopsy samples), anti-HCV positive blood donors (the volume of studies is presented in table 2). These groups of patients were simultaneously examined for the presence of markers of viral HS using other tests (screening tests for the presence of anti-HCV, immunoblotting to establish the spectrum of antibodies to various proteins of the HS virus, PCR to detect HCV RNA). A special group consisted of 42 patients with various forms of HS who received antiviral therapy (interferon, retrovir, TMZ). These patients were examined for anti-HCVcore IgM in dynamics from 2 to 6 times, and the observation time ranged from 10-200 days.
Установлено, что при остром ГС анти-ВГСcore IgM выявлялись у 86,7% больных в первые две декады болезни. Следовательно, определение антител класса IgM является полезным для объективизации диагноза острого ГС, наряду с другим клинико-лабораторными данными. Предполагали, что анти-ВГСcore IgM появляются раньше соответствующих антител класса IgG, было проведено тщательное изучение сывороток, полученных от 13 больных острым ГС, оказавшихся РНК ВГС и анти-ВГСcore IgM-позитивными. Дополнительно были использованы скрининговые тесты на наличие анти-ВГС (выявляют антитела класса IgG) и иммуноблотинг. Результаты сопоставления всех четырех тестов представлены в таблице 5. 2 из 13 образцов оказались отрицательными как в скрининговом тесте, так и в иммуноблотинге. Кроме этого, в двух случаях при наличии позитивного результата в скрининговой тест-системе иммуноблотинг оказался неопределенным. Это подтверждает ценность теста на анти-ВГСcore IgM для диагностики острой ГС-инфекции. Сопоставление спектра антител к различным белкам вируса ГС и анти-ВГСcore IgM позволяет сделать заключение, что при острой ГС-инфекции имеется корреляционная связь только по антителам к ядерному белку вируса, что также подтверждает и специфичность разработанного препарата. It was found that in acute HS anti-HCVcore IgM were detected in 86.7% of patients in the first two decades of the disease. Therefore, the determination of antibodies of the IgM class is useful for objectivizing the diagnosis of acute HS, along with other clinical and laboratory data. It was assumed that anti-HCVcore IgM appear before the corresponding IgG antibodies, a thorough study of sera obtained from 13 patients with acute HS who turned out to be HCV RNA and anti-HCVcore IgM-positive was carried out. Additionally, screening tests for the presence of anti-HCV (detect IgG antibodies) and immunoblotting were used. Comparison results of all four tests are presented in table 5. 2 out of 13 samples were negative both in the screening test and in immunoblotting. In addition, in two cases with a positive result in a screening test system, immunoblotting was uncertain. This confirms the value of the anti-HCVcore IgM test for the diagnosis of acute HS infection. Comparison of the spectrum of antibodies to different proteins of the HS virus and anti-HCVcore IgM allows us to conclude that in acute HS infection there is a correlation only for antibodies to the nuclear protein of the virus, which also confirms the specificity of the developed drug.
У больных хроническим ГС с манифестацией процесса анти-ВГСcore IgM выявлялись в 61,2%. Сопоставление 4 тестов на различные маркеры вирусного ГС, проведенное на материале 12 больных хроническим ГС с наличием анти-ВГСcore IgM, показало, что РНК ВГС присутствовала в 9 образцах (табл. 6). Поскольку антитела класса IgM циркулируют более длительно, чем PHK, можно предположить, что в подобных случаях они являются единственным доказательством имевшей место репродукции вируса. Указанное подчеркивает диагностическую ценность теста на анти-ВГСcore IgM у больных с хроническими формами инфекции. Можно отметить, что во всех образцах сывороток больных хроническим ГС наблюдались значительные количества антител к ядерному белку вируса класса IgG (3-4 балла по иммуноблотингу). Кроме этого, имела место корреляционная связь между PHK ВГС, антителами к белку NS5 (PHK-зависимая PHK-полимераза) и анти-ВГСcore IgM. Указанное свидетельствует, что анти-ВГСcore IgM отражают наличие активной вирусной репродукции у больных хроническим ГС. При наличии последней у больных хроническим ГС можно ожидать и более интенсивных изменений в ткани печени, объективным критерием которых являются результаты прижизненного морфологического изучения биоптатов печени. Результаты изучения биоптатов были доступными у 21 больного. При этом у 7 из них в сыворотке крови обнаруживались анти-ВГСcore IgM, а у 14 - нет. У большинства больных при наличии анти-ВГСcore IgM в сыворотке имело место значительное изменение архитектоники печени, укладывающееся в картину ХАГ (71,4) или цирроза печени (14,3%). В противоположность этому, вторая группа (анти-ВГСcore IgM-негативная) была, в основном, представлена больными хроническим персистирующим гепатитом. Полученные результаты свидетельствуют с необходимости использования антивирусных препаратов для подавления репродукции вируса у больных анти-ВГСcore IgM-позитивным хроническим ГС. Можно предполагать, что при эффективности такого лечения вслед за исчезновением PHK ВГС должны исчезать и антитела класса IgM к ядерному белку вируса. В связи с этим, было осуществлено динамическое наблюдение за 42 больными ГС, получавшими антивирусную терапию. В зависимости от динамики анти-ВГС core IgM все больные были разделены на 3 группы. Первую группу составили 18 человек, у которых зафиксирована положительная (исчезновение антиВГСcore IgM) динамика. Длительность наблюдения составила в среднем 84,6 дня, а кратность обследования - 3,3 раза. У большинства больных этой группы наблюдалась стойкая ремиссия и нормализация биохимических показателей. Вторую группу составили 20 больных, у которых в динамике наблюдения постоянно обнаруживались анти-ВГСcore IgM. Длительность наблюдения составила в среднем 54,9 дней, а кратность обследования 3,1. У больных этой группы, как правило, нормализации клинико-биохимических показателей не наступало, что свидетельствовало о неэффективности использованного для лечения препарата. И, наконец, в 3 группу вошли 4 больных, у которых имела место флюктуация анти-ВГСcore IgM. За такими больными необходимо более длительное наблюдение. In patients with chronic HS with a manifestation of the anti-HCVcorecore process, IgM was detected in 61.2%. A comparison of 4 tests for various markers of viral HS, conducted on the material of 12 patients with chronic HS with the presence of anti-HCVcore IgM, showed that HCV RNA was present in 9 samples (Table 6). Since antibodies of the IgM class circulate longer than PHK, it can be assumed that in such cases they are the only evidence of a reproduction of the virus. The above emphasizes the diagnostic value of the anti-HCVcore IgM test in patients with chronic infections. It can be noted that in all samples of sera of patients with chronic hepatitis, significant amounts of antibodies to the nuclear protein of the IgG class virus were observed (3-4 points by immunoblotting). In addition, there was a correlation between HCV PHK, antibodies to the NS5 protein (PHK-dependent PHK polymerase) and anti-HCVcore IgM. The above indicates that anti-HCVcore IgM reflect the presence of active viral reproduction in patients with chronic HS. In the presence of the latter in patients with chronic HS, more intensive changes in the liver tissue can be expected, the objective criterion of which is the results of intravital morphological study of liver biopsy samples. Biopsy results were available in 21 patients. At the same time, anti-HCVcore IgM was detected in serum in 7 of them, while in 14 - no. In most patients with anti-HCVcore IgM in serum, a significant change in the architectonics of the liver occurred, which fit into the picture of CAH (71.4) or cirrhosis (14.3%). In contrast, the second group (anti-HCVcore IgM-negative) was mainly represented by patients with chronic persistent hepatitis. The results obtained indicate the need to use antiviral drugs to suppress the reproduction of the virus in patients with anti-HCVcore IgM-positive chronic HS. It can be assumed that with the effectiveness of such treatment, after the disappearance of HCV PHK, antibodies of the IgM class to the nuclear protein of the virus should also disappear. In this regard, dynamic monitoring of 42 HS patients who received antiviral therapy was carried out. Depending on the dynamics of anti-HCV core IgM, all patients were divided into 3 groups. The first group consisted of 18 people who recorded a positive (disappearance of anti-HCVcore IgM) dynamics. The duration of observation averaged 84.6 days, and the frequency of examination was 3.3 times. Most patients of this group experienced persistent remission and normalization of biochemical parameters. The second group consisted of 20 patients in whom anti-HCVcore IgM was constantly detected in the dynamics of observation. The duration of observation averaged 54.9 days, and the frequency of examination 3.1. In patients of this group, as a rule, normalization of clinical and biochemical parameters did not occur, which indicated the ineffectiveness of the drug used for treatment. And finally, the 3rd group included 4 patients in whom there was a fluctuation of anti-HCVcore IgM. Such patients need longer monitoring.
Таким образом, результаты динамического наблюдения за больными ГС с использованием теста на анти-ВГСcore IgM позволяют с одной стороны оценить эффективность лечения, а с другой - свидетельствуют о воспроизводимости разработанного метода, что свидетельствует о его специфичности. Thus, the results of dynamic monitoring of patients with HS using the anti-HCVcore IgM test allow one to assess the effectiveness of treatment, on the one hand, and on the other hand, indicate the reproducibility of the developed method, which indicates its specificity.
Последнюю группу для оценки диагностической значимости определения анти-ВГСcore IgM составили 66 доноров крови - позитивных по анти-ВГС при скрининговом тестировании. С использованием иммуноблотинга наличие анти-ВГС было подтверждено у 45 доноров (68%), в 3 случаях установлен неопределенный результат, а 18 позитивных в скрининге результатов не подтвердились иммуноблотингом. Анти-ВГСcore IgM были выявлены в 20 образцах от подтвержденных в иммуноблотинге доноров (44%), в одном из 3 сомнительных образцов и в 1 отрицательном образце (5,4%). Позитивные результаты по анти-ВГСcore IgM в двух последних группах свидетельствуют о необходимости более тщательного обследования и наблюдения за донорами, позитивными по анти-ВГС в скрининговых тестах. Выборочное исследование сывороток 13 анти-ВГС-позитивных доноров (таблица 7) на PHK ВГС позволило установить ее наличие в 9 образцах (69,2%). В этой группе сывороток оказалось 6 образцов положительных по анти-ВГСcore IgM. Во всех случаях они содержали и PHK ВГС в ПЦР, т.е. наблюдалась 100% корреляция результатов. Полученные результаты свидетельствуют о высоком проценте хронической персистирующей инфекции среди доноров - "носителей" анти-ВГС и их потенциальной опасности для окружающих. Наличие анти-ВГСcore IgM у этих лиц можно квалифицировать как признак активной репродукции вируса. The last group to assess the diagnostic significance of the definition of anti-HCVcore IgM was 66 blood donors - positive for anti-HCV during screening testing. Using immunoblotting, the presence of anti-HCV was confirmed in 45 donors (68%), in 3 cases an uncertain result was established, and 18 positive results in screening were not confirmed by immunoblotting. Anti-HCVcore IgM were detected in 20 samples from confirmed immunoblot donors (44%), in one of 3 questionable samples and in 1 negative sample (5.4%). Positive results on anti-HCVcore IgM in the last two groups indicate the need for a more thorough examination and monitoring of donors positive for anti-HCV in screening tests. A selective study of the sera of 13 anti-HCV-positive donors (Table 7) on HCV PHK revealed its presence in 9 samples (69.2%). In this group of sera, there were 6 samples positive for anti-HCVcore IgM. In all cases, they also contained HCV PHK in PCR, i.e. 100% correlation of results was observed. The results indicate a high percentage of chronic persistent infection among donors - "carriers" of anti-HCV and their potential danger to others. The presence of anti-HCVcore IgM in these individuals can be qualified as a sign of active reproduction of the virus.
Тест-система предназначена для выявления IgM-антител к ядерному белку вируса гепатита C в сыворотке крови больных с целью диагностики острого гепатита C, активной репродукции вируса у больных хроническим гепатитом C, контроля эффективности лечения у больных хроническим гепатитом C. The test system is designed to detect IgM antibodies to the hepatitis C virus nuclear protein in the blood serum of patients with the aim of diagnosing acute hepatitis C, active reproduction of the virus in patients with chronic hepatitis C, and monitoring the effectiveness of treatment in patients with chronic hepatitis C.
С состав набора входят:
1. Восьмилуночные стрипы с сорбированными синтетическими пептидами 12 шт.The kit includes:
1. Eight-hole strips with sorbed
2. Человеческая сыворотка, не содержащая IgM-антител к вирусу гепатита, инактивированная прогреванием (негативный контроль) 1,2 мл
3. Человеческая сыворотка, содержащая IgM, инактивированная прогреванием (позитивный контроль) 1,2 мл
4. Конъюгат-моноклональные антитела к тяжелым цепям IgM человека, меченные пероксидазой 0,25 мл
5. Концентрат фосфатно-солевого раствора, содержащий детергент-твин-80 10 мл
6. Раствор для разведения исследуемых проб 10 мл
7. Цитратный буферный раствор (белые таблетки) 11 шт.2. Human serum that does not contain IgM antibodies to hepatitis virus, inactivated by heating (negative control) 1.2 ml
3. Human serum containing IgM, inactivated by heating (positive control) 1.2 ml
4. Conjugate-monoclonal antibodies to human IgM heavy chains labeled with 0.25 ml peroxidase
5. Concentrate of phosphate-saline solution containing detergent-tween-80 10 ml
6. A solution for diluting the
7. Citrate buffer solution (white tablets) 11 pcs.
8. Ортофенилендиамин дигидрохлорид (белые таблетки) 11 шт. 8. Orthophenylenediamine dihydrochloride (white tablets) 11 pcs.
2 мг
9. Гидроперит (белая таблетка) 1 шт.2 mg
9. Hydroperite (white tablet) 1 pc.
1,5 г
10. Раствор серной кислоты 5 мл
Подготовка реагентов
Все растворы и реагенты необходимо выдержать перед началом работы при температуре (15-25)oC в течение 30 мин. Иммуноферментный анализ рекомендуется проводить с использованием иных, не подвергшихся обработке наконечников для пипеток.1.5 g
10.
Reagent Preparation
All solutions and reagents must be maintained before starting work at a temperature of (15-25) o C for 30 minutes An enzyme-linked immunosorbent assay is recommended using other, unprocessed pipette tips.
В зависимости от числа исследуемых сывороток отбирают необходимое количество стрипов (полосок по восемь лунок в каждой). Depending on the number of test sera, the required number of strips is selected (strips of eight holes each).
Для получения промывного и разводящего раствора содержимое флакона с концентратом фосфатно-солевого раствора разводят в 490 мл дистиллированной воды. To obtain a wash and diluting solution, the contents of the vial with the phosphate-saline concentrate are diluted in 490 ml of distilled water.
Таблетку гидроперита растворяют в 18 мл дистиллированной воды. A hydroperite tablet is dissolved in 18 ml of distilled water.
Концентрат конъюгата разводят на фосфатно-солевом растворе (ФСРТ) 1:80. The conjugate concentrate is diluted in phosphate-saline solution (PSRT) 1:80.
Необходимый объем раствора конъюгата определяется числом исследуемых проб (см. табл. 8)
Субстратный раствор готовят сразу после внесения конъюгата в лунки. Одну таблетку цитратного буфера растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Таблетку ортофенилендиамин дигидрохлорида (ОФД) (2 мг) растворяют в 3 мл готового цитратного буферного раствора (ЦБ). Непосредственно перед использованием добавляют 30 мкл раствора гидроперита. Необходимые объемы растворов ЦБ, гидроперита и число таблеток ОФД определяются числом исследуемых проб (см. табл. 9).The required volume of the conjugate solution is determined by the number of test samples (see table. 8)
A substrate solution is prepared immediately after the conjugate is added to the wells. One tablet of citrate buffer is dissolved in 10 ml of distilled water. A tablet of orthophenylenediamine dihydrochloride (CRF) (2 mg) is dissolved in 3 ml of a prepared citrate buffer solution (CB). Immediately before use, 30 μl of hydroperitol solution is added. The required volumes of CB solutions, hydroperite and the number of tablets of the CRF are determined by the number of samples studied (see table. 9).
Пример 4. Проведение иммуноферментного анализа (ИФА). Example 4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Выявление IgM-антител к ядерному белку вируса гепатита C в сыворотке крови осуществляют методом иммуноферментного анализа. The detection of IgM antibodies to the hepatitis C virus nuclear protein in blood serum is carried out by enzyme-linked immunosorbent assay.
1. Подготовка реагентов. 1. Preparation of reagents.
2. Гидратация сорбированного антигена. Отобранные стрипы с сорбированным пептидом помещают в рамку держателя и промывают 1 раз раствором ФСРТ (концентрат фосфатно-солевого раствора). Лунки заполняют до краев, а затем раствор вытряхивают или удаляют насосом. 2. Hydration of the sorbed antigen. Selected strips with a sorbed peptide are placed in a holder frame and washed once with a solution of PSRT (phosphate-saline concentrate). Wells are filled to the brim, and then the solution is shaken out or removed with a pump.
3. Связывание антител. Одну из лунок (A1) оставляют незаполненной (контроль субстрата). В две лунки вносят по 0,1 мл раствора HK (сыворотка, не содержащая IgM-антител к вирусу гепатита C, инактивированная прогреванием), в последующие две лунки - по 0,01 мл раствора ПК (сыворотка, содержащая IgM-антитела, инактивированная прогреванием). Во все остальные лунки вносят при короткой схеме по 90 мкл раствора РИП (раствор для разведения исследуемых проб), а затем - по 10 мкл исследуемых сывороток, тщательно пипетируя раствор (не менее 3 раз). При этом цвет раствора меняется. Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют при температуре (37±1)oС в течение 30 ± 2 мин во влажной камере. При длинной схеме постановки исходную сыворотку разводят 1:100, инкубируют при 4oC в течение 16-18 часов. После инкубации лунки промывают 3-кратно раствором ФСРТ.3. Binding of antibodies. One of the wells (A1) is left blank (substrate control). In two wells, 0.1 ml of HK solution (serum that does not contain IgM antibodies to hepatitis C virus, inactivated by heating) is added, in the next two wells, 0.01 ml of PK solution (serum containing IgM antibodies inactivated by heating) ) In a short circuit, 90 μl of the RIP solution (solution for diluting the test samples) is added in a short circuit, and then 10 μl of the test sera are carefully pipetted (at least 3 times). In this case, the color of the solution changes. The tablet is closed with a lid or placed in a wet plastic bag and incubated at a temperature of (37 ± 1) o C for 30 ± 2 min in a humid chamber. With a long formulation, the original serum is diluted 1: 100, incubated at 4 o C for 16-18 hours. After incubation, the wells are washed 3 times with a solution of PSRT.
4. Присоединение конъюгата. Во все лунки кроме A1 вносят по 0,1 мл раствора конъюгата (моноклональные антитела к тяжелым цепям IgM человека, меченные пероксидазой). Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют при температуре (37+1)oC в течение (30+2) мин.4. Attachment of the conjugate. 0.1 ml of conjugate solution (monoclonal antibodies to human IgM heavy chains labeled with peroxidase) was added to all wells except A1. The tablet is closed with a lid or placed in a moist plastic bag and incubated at a temperature of (37 + 1) o C for (30 + 2) min.
После инкубации лунки 5-кратно промывают раствором ФСРТ. After incubation, the wells are washed 5 times with a solution of PSRT.
5. Проведение ферментативной реакции. Во все лунки вносят по 0,1 мл субстратного раствора. Планшет закрывают крышкой и выдерживают в темноте при температуре (15-25)oC в течение (15+1) мин во влажной камере.5. Conducting an enzymatic reaction. 0.1 ml of substrate solution is added to all wells. The tablet is closed with a lid and kept in the dark at a temperature of (15-25) o C for (15 + 1) min in a humid chamber.
6. Остановка ферментативной реакции. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку по 0,05 мл раствора серной кислоты. 6. Stopping the enzymatic reaction. The reaction is stopped by adding 0.05 ml of a solution of sulfuric acid to each well.
Учет и интерпретация результатов ИФА
При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и НК должно оставаться бесцветным или бледно-желтым, а содержимое лунок с ПК должно приобрести желто-коричневую окраску.Accounting and interpretation of ELISA results
If all stages of the analysis are carried out correctly, the contents of the wells with substrate and NK control should remain colorless or pale yellow, and the contents of the PC wells should acquire a yellow-brown color.
Визуальный учет
Исследуемый образец оценивается как положительный, если имеются отчетливые различия в интенсивности его окрашивания по сравнению с растворами в лунках с контролем субстрата и НК.Visual accounting
The test sample is evaluated as positive if there are distinct differences in the intensity of its staining compared with solutions in wells with substrate and NK control.
Инструментальный учет
Измерение оптической плотности (ОП) проводят при длине волны 490 нм непосредственно в лунках стрипов с помощью вертикальных фотометров. В качестве кюветы сравнения служит лунка A1 с контролем субстрата. При правильном проведении анализа среднее значение ОП в лунках с НК не должно превышать 0,15 оптических единиц (о.е.), а в лунках с ПК быть не менее 0,6 о.е.Instrumental accounting
The measurement of optical density (OD) is carried out at a wavelength of 490 nm directly in the wells of strips using vertical photometers. Well A1 serves as a comparison cuvette with substrate control. With proper analysis, the average OD value in the wells with NK should not exceed 0.15 optical units (pu), and in the wells with PC should be at least 0.6 p.u.
Количественная оценка результатов ИФА проводится по формуле:
K = 0,2 + Среднее значение ОП для НК
Если ОП исследуемой пробы больше K, то считают, что она содержит IgM-антитела к ядерному белку гепатита C.A quantitative assessment of the results of ELISA is carried out according to the formula:
K = 0.2 + The average value of OD for NC
If the OD of the test sample is greater than K, then consider that it contains IgM antibodies to the hepatitis C nuclear protein.
Если ОП исследуемой пробы меньше или равно K, то считают, что она не содержит IgM-антитела к ядерному белку гепатита C. If the OD of the test sample is less than or equal to K, then consider that it does not contain an IgM antibody to the hepatitis C nuclear protein.
Схема постановки ИФА приведена в таблице 10. The ELISA formulation scheme is shown in table 10.
Claims (1)
NH2-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-CONH2,
в качестве основы конъюгата - моноклональные антитела к тяжелым цепям IgM человека, дополнительно содержит человеческие сыворотки, инактивированные прогреванием, в качестве негативного и позитивного контроля, концентрат фосфатно-солевого раствора с детергентом-твин 80, раствор для разведения исследуемых проб, цитратный буферный раствор, ортофенилендиамин дигидрохлорид, гидроперит и раствор серной кислоты.Test system for detecting antibodies to hepatitis C virus IgM nuclear protein in blood serum, including hepatitis C nuclear antigen, anti-human IgM antibody conjugated with horseradish peroxidase, characterized in that it contains a synthetic peptide structure
NH 2 -Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val -Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-CONH 2 ,
monoclonal antibodies to human IgM heavy chains are the base of the conjugate; it additionally contains human serum inactivated by heating, as a negative and positive control, a concentrate of phosphate-saline solution with detergent-tween 80, a solution for diluting the samples, citrate buffer solution, orthophenylenediamine dihydrochloride, hydroperite and sulfuric acid solution.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97109494A RU2142134C1 (en) | 1997-06-11 | 1997-06-11 | Test system for detecting antibodies to nuclear protein of hepatitis c of igm class |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97109494A RU2142134C1 (en) | 1997-06-11 | 1997-06-11 | Test system for detecting antibodies to nuclear protein of hepatitis c of igm class |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97109494A RU97109494A (en) | 1999-05-20 |
| RU2142134C1 true RU2142134C1 (en) | 1999-11-27 |
Family
ID=20193885
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97109494A RU2142134C1 (en) | 1997-06-11 | 1997-06-11 | Test system for detecting antibodies to nuclear protein of hepatitis c of igm class |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2142134C1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5548616B2 (en) * | 2007-08-08 | 2014-07-16 | ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム | VEGFR-1 / NRP-1 targeting peptide |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US502551A (en) * | 1893-08-01 | Calvin f |
-
1997
- 1997-06-11 RU RU97109494A patent/RU2142134C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US502551A (en) * | 1893-08-01 | Calvin f |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1618381B1 (en) | Method of diagnosis of foot and mouth disease and the diagnostic kit | |
| US7728121B2 (en) | Hepatitis-C virus type 4, 5 and 6 | |
| FI89175B (en) | FOERFARANDE OCH PRODUKTER FOER TEST CELLLEUKEMIVIRUS | |
| CN1021375C (en) | Enzyme immunoassay for detecting hiv antigens in human sera | |
| RU2158928C2 (en) | Method and reagents for identifying hepatitis c virus | |
| CA2058515C (en) | Method of preparing biologically active reagents from succinimide-containing polymers, analytical element and methods of use | |
| CN1030300A (en) | Utilize the enzyme-labeled immunity detection method to measure antigen and/or antibody in the human body simultaneously | |
| Gomara et al. | Assessment of synthetic peptides for hepatitis A diagnosis using biosensor technology | |
| Yuki et al. | Relation of disease activity during chronic hepatitis C infection to complexity of hypervariable region 1 quasispecies | |
| EP0330694A4 (en) | Test device and method of preparing same, assay kit and method for the simultaneous detection of two htlv or hiv antibodies | |
| EP1328811B1 (en) | Hcv mosaic antigen composition | |
| CN111944104B (en) | Porous double-template molecularly imprinted polymer microsphere for detecting dengue NS1 protein and application thereof | |
| US6183754B1 (en) | Anticytomegalovirus monoclonal antibodies and processes for the in vitro diagnosis of infections by human cytomegaloviruses and a protein-kinase inducible by cytomegaloviruses and recognizable by aforesaid monoclonal antibodies | |
| Doerr et al. | Human cytomegalovirus infection: recent developments in diagnosis and epidemiology | |
| RU2142134C1 (en) | Test system for detecting antibodies to nuclear protein of hepatitis c of igm class | |
| RU2133622C1 (en) | Method of detection of antibody to hepatitis virus c nuclear protein | |
| RU2138286C1 (en) | Immunosorbent for detection of antibody to hepatitis c virus nuclear protein in blood serum | |
| Grandien et al. | Rapid diagnosis of viral infections in the central nervous system | |
| EP0196873A2 (en) | Diagnostic testing for micro-organisms | |
| RU2137137C1 (en) | Method of identification of mycobacterium leprae in patients with disease regression | |
| CN105606821A (en) | Protein combined chip for Lyme disease immunoserology diagnosis and preparation method and application thereof | |
| WO1995002186A1 (en) | New diagnostic assay for detection of syphilis | |
| RU2269134C2 (en) | Method for prognosis of acute viral hepatitis c finish | |
| RU2137138C1 (en) | Diagnostic composition for identification of syphilis and test-system "akvasif" on its base | |
| RU2104284C1 (en) | Synthetic oligoypeptides specifically interacting with antibodies raised to hepatitis c virus, methods of diagnosis hcv-infection (variants) |