RU2140284C1 - Method of human leukocyte interferon preparing - Google Patents
Method of human leukocyte interferon preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2140284C1 RU2140284C1 RU98113448A RU98113448A RU2140284C1 RU 2140284 C1 RU2140284 C1 RU 2140284C1 RU 98113448 A RU98113448 A RU 98113448A RU 98113448 A RU98113448 A RU 98113448A RU 2140284 C1 RU2140284 C1 RU 2140284C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- interferon
- virus
- induction
- leukocytes
- inducer
- Prior art date
Links
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 title claims description 4
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 title claims description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 8
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims abstract description 10
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 claims abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 24
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 7
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 210000004544 dc2 Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицинской промышленности, в частности к производству человеческого лейкоцитарного интерферона. The invention relates to the medical industry, in particular to the production of human leukocyte interferon.
Известен способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона, в котором для индукции используют аллантоисный вирус болезни Ньюкасл, очищенный и концентрированный методом ультрафильтрации на мембранах с размером пор 0,1 - 0,45 мМ (1). A known method of producing human leukocyte interferon, in which the allantoic virus of Newcastle disease, purified and concentrated by ultrafiltration on membranes with pore sizes of 0.1 - 0.45 mmol, is used for induction (1).
Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.
Осветленную вируссодержащую аллантоисную жидкость подают на микрофильтрационные мембраны VVPP или GVLP или HVLP (Миллипор, США) с порогом отсечения 0,1 или 0,2 или 0,45 мМ соответственно, заправленные в плоскорамную разделительную установку и концентрируют не менее чем в 40 раз, затем проводят диафильтрацию концентрата вируса в постоянном объеме 8-10 объемами 0,9% хлористого натрия. Суспендируют лейкоциты в 199 среде, содержащей необходимые добавки, и добавляют очищенный концентрат вируса-индуктора к лейкоцитам, из расчета 2 - 4 ГАЕ на 1000000 лейкоцитов, инкубируют взвесь при 37oC в течение 18 - 20 часов, постоянно перемешивая. Затем лейкоциты удаляют центрифугированием, а надосадочную жидкость, содержащую интерферон, подкисляют 10% соляной кислотой до pH 2,2 - 2,4. Выдерживают подкисленный полуфабрикат интерферона в течение 10 дней для инактивации вируса-индуктора. Противовирусная активность полученного таким способом интерферона составляет 8 - 10000 МЕ в мл. Этот метод позволяют исключить из технологии этап центрифугирования после стадии индукции и вести биосинтез интерферона одновременно с индукцией без смены питательной среды. Однако полученный этим способом интерферон характеризуется нестабильными значениями титра активности, а используемый индуктор обладает высокой инфекционностью, что вызывает гибель до 40% клеток-продуцентов интерферона уже в первый час после добавления вируса.The clarified virus-containing allantoic fluid is supplied to VVPP or GVLP or HVLP microfiltration membranes (Millipore, USA) with a cutoff threshold of 0.1 or 0.2 or 0.45 mM, respectively, charged into a flat-plate separation unit and concentrated at least 40 times, then diafiltration of the virus concentrate is carried out in a constant volume of 8-10 volumes of 0.9% sodium chloride. The leukocytes are suspended in 199 medium containing the necessary additives, and the purified concentrate of the inducer virus is added to the leukocytes, at the rate of 2-4 GAU per 1,000,000 leukocytes, the suspension is incubated at 37 ° C for 18 to 20 hours, constantly stirring. Then the leukocytes are removed by centrifugation, and the supernatant containing interferon is acidified with 10% hydrochloric acid to a pH of 2.2 - 2.4. The acidified semi-finished interferon is maintained for 10 days to inactivate the inducer virus. The antiviral activity of the interferon obtained in this way is 8-10,000 IU per ml. This method makes it possible to exclude from the technology the centrifugation stage after the induction stage and conduct biosynthesis of interferon simultaneously with induction without changing the nutrient medium. However, the interferon obtained by this method is characterized by unstable activity titer values, and the inducer used is highly infectious, which causes the death of up to 40% of interferon producing cells already in the first hour after the virus is added.
Задачей изобретения является повышение выхода интерферона и обеспечение стабильных показателей активности препарата. The objective of the invention is to increase the yield of interferon and ensure stable activity indicators of the drug.
Для решения поставленной задачи в способе получения интерферона, включающем выделение лейкоцитов, их суспендирование в питательной среде, индукцию, биосинтез интерферона, инактивацию вируса-индуктора, согласно изобретению для индукции используют холодоадаптированный вирус болезни Ньюкасл, полученный при последовательных до 30 пассажей, в развивающихся куриных эмбрионах при температуре ниже 35oC.To solve the problem in a method for producing interferon, which includes the isolation of leukocytes, their suspension in a nutrient medium, induction, biosynthesis of interferon, inactivation of the inducer virus, according to the invention, a cold-adapted Newcastle disease virus obtained by sequential up to 30 passages in developing chicken embryos is used for induction at a temperature below 35 o C.
Предлагаемый метод позволяет получить интерферон со стабильными значениями титра противовирусной активности 11000 - 14000 МЕ/мл, и снизить процент гибели интерферонпродуцирующих клеток на стадии индукции до 25%. The proposed method allows to obtain interferon with stable values of the titer of antiviral activity 11000 - 14000 IU / ml, and to reduce the percentage of death of interferon-producing cells at the induction stage to 25%.
Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.
Пример 1. Вирус маточного штамма "Н" болезни Ньюкасл пассировали 19 раз при пониженной до 32oC температуре. Полученный вирус приобрел признаки температурочувствительности и холодоадаптированности. Для получения производственного штамма в аллантоисную полость 9-10 дневного куриного эмбриона вводят с соблюдением условий стерильности 0,2 мл исходной суспензии маточного холодоадаптированного вируса болезни Ньюкасл, в разведении 10-6. Инкубируют в течение 48 часов при температуре (32±0,5)oC. После инкубации эмбрионы охлаждают в течение 18 - 20 часов при 4oC, отсасывают вируссодержащую аллантоисную жидкость. Вируссодержащую жидкость после осветления, пропускают, через микрофильтрационные мембраны, с порогом отсечения 0,1 или 0,2 или 0,45 мМ (Миллипор США) и концентрируют, не менее чем в 40 раз, проводят диафильтрацию концентрата вируса в постоянном объеме 8 - 10 объемами 0,9 % хлористого натрия. Лейкоциты суспендируют в 199 среде и добавляют очищенный концентрат вируса - индуктора. Индуцирующая доза вируса составляет 4,9 ГАЕ на 1000000 лейкоцитов. Взвесь инкубируют в течение 18 - 20 часов, при постоянном перемешивании, затем лейкоциты удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость, содержащую интерферон, подкисляют 10% соляной кислотой до pH 2,2 - 2,4. Полуфабрикат интерферона выдерживают 10 дней для инактивации вируса - индуктора. Титр, полученного таким способом интерферона a-типа, составляет 14000 МЕ/мл, процент гибели интерферонпродуцирующих клеток на стадии индукции не более 25%.Example 1. The virus of the uterine strain "H" of Newcastle disease was passaged 19 times at a temperature reduced to 32 o C. The resulting virus has acquired signs of temperature sensitivity and cold adaptation. To obtain a production strain, a 9-10-day-old chicken embryo is introduced into the allantoic cavity under sterile conditions, 0.2 ml of the original suspension of uterine cold-adapted Newcastle disease virus, at a dilution of 10 -6 . Incubated for 48 hours at a temperature of (32 ± 0.5) o C. After incubation, the embryos are cooled for 18 to 20 hours at 4 o C, the virus-containing allantoic fluid is aspirated. After clarification, the virus-containing liquid is passed through microfiltration membranes with a cut-off threshold of 0.1 or 0.2 or 0.45 mm (Millipore USA) and concentrated, not less than 40 times, the virus concentrate is diafiltered in a constant volume of 8-10 volumes of 0.9% sodium chloride. White blood cells are suspended in 199 medium and a purified concentrate of the virus inducer is added. The inducing dose of the virus is 4.9 GAU per 1,000,000 leukocytes. The suspension is incubated for 18 to 20 hours, with constant stirring, then the white blood cells are removed by centrifugation. The supernatant containing interferon is acidified with 10% hydrochloric acid to a pH of 2.2 - 2.4. Interferon prefabricated can withstand 10 days to inactivate the virus - inducer. The titer of a-type interferon obtained in this way is 14,000 IU / ml, the percentage of death of interferon-producing cells at the induction stage is not more than 25%.
Пример 2. Вирус маточного штамма "Н" болезни Ньюкасл пассировали 19 раз при пониженной до 31,5 oC температуре. Полученный вирус приобрел признаки температурочувствительности и холодоадаптированности. Для получения производственного штамма в аллантоисную полость 9 - 10 дневного куриного эмбриона вводят с соблюдением условий стерильности 0,2 мл исходной суспензии маточного холодоадаптированного вируса болезни Ньюкасл, в разведении 10-6. Инкубируют в течение 48 часов при температуре (32± 0,5)oC. После инкубации эмбрионы охлаждают в течение 18-20 часов при 4oC. Выруссодержащую жидкость после осветления, пропускают через микрофильтрационные мембраны, с порогом отсечения 0,1 или 0,2 или 0,45 мМ (Миллипор, США), и концентрируют, не менее чем в 40 раз, проводят диафильтрацию концентрата вируса в постоянном объеме 8 - 10 объемами 0,9% хлористого натрия. Лейкоциты суспендируют в 199 среде и добавляют очищенный концентрат вируса-индуктора. Индуцирующая доза вируса составляет 4 ГАЕ на 1000000 лейкоцитов Взвесь инкубируют в течение 18 - 20 часов, при постоянном перемешивании, затем лейкоциты удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость, содержащую интерферон, подкисляют 10% соляной кислотой до pH 2,2 - 2,4. Полуфабрикат интерферона выдерживают 10 дней для инактивации вируса-индуктора. Титр, полученного таким способом интерферона a-типа, составляет 11000 МЕ/мл, процент гибели интерферонпродуцирующих клеток на стадии индукции не более 25%.Example 2. The virus of the uterine strain "H" of Newcastle disease was passaged 19 times at a temperature reduced to 31.5 o C. The resulting virus has acquired signs of temperature sensitivity and cold adaptation. To obtain a production strain, a 9-10 day old chicken embryo is introduced into the allantoic cavity under sterile conditions, 0.2 ml of the original suspension of the cold-adapted uterine virus of Newcastle disease, at a dilution of 10 -6 . They are incubated for 48 hours at a temperature of (32 ± 0.5) o C. After incubation, the embryos are cooled for 18-20 hours at 4 o C. After the clarification, the branched liquid is passed through microfiltration membranes with a cutoff threshold of 0.1 or 0 , 2 or 0.45 mM (Millipore, USA), and concentrated, not less than 40 times, diafiltration of the virus concentrate is carried out in a constant volume of 8-10 volumes of 0.9% sodium chloride. White blood cells are suspended in 199 medium and a purified concentrate of the inducer virus is added. The inducing dose of the virus is 4 GAE per 1,000,000 leukocytes. The suspension is incubated for 18 to 20 hours, with constant stirring, then the leukocytes are removed by centrifugation. The supernatant containing interferon is acidified with 10% hydrochloric acid to a pH of 2.2 - 2.4. Interferon prefabricated can withstand 10 days to inactivate the inducer virus. The titer obtained in this way of a-type interferon is 11000 IU / ml, the percentage of death of interferon-producing cells at the induction stage is not more than 25%.
Источник информации
1. Патент РФ N 2066188, кл. A 61 K 37/66, 1996 г.Sourse of information
1. RF patent N 2066188, cl. A 61 K 37/66, 1996
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU98113448A RU2140284C1 (en) | 1998-07-06 | 1998-07-06 | Method of human leukocyte interferon preparing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU98113448A RU2140284C1 (en) | 1998-07-06 | 1998-07-06 | Method of human leukocyte interferon preparing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2140284C1 true RU2140284C1 (en) | 1999-10-27 |
Family
ID=20208393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU98113448A RU2140284C1 (en) | 1998-07-06 | 1998-07-06 | Method of human leukocyte interferon preparing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2140284C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2175555C2 (en) * | 2000-02-03 | 2001-11-10 | Государственное унитарное предприятие "Иммунопрепарат" | Method of interferon virus-inductor preparing |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1364343A1 (en) * | 1984-07-13 | 1988-01-07 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Method of producing manъs leukocytic interferon alfa-2 |
| SU1713591A1 (en) * | 1983-12-13 | 1992-02-23 | Эдьт Дьедьсерведьесети Дьяр (Инопредприятие) | Method of human leukocyte interferon preparation |
| RU1709615C (en) * | 1990-03-23 | 1995-01-09 | Уфимский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова | Method for producing human leukocytic interferon |
| WO1996028184A1 (en) * | 1995-03-15 | 1996-09-19 | Pearson C Robert | Lymphoblastoid natural interferon alpha production |
| RU2080873C1 (en) * | 1993-12-27 | 1997-06-10 | Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" | Method of human leukocyte interferon preparing |
-
1998
- 1998-07-06 RU RU98113448A patent/RU2140284C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1713591A1 (en) * | 1983-12-13 | 1992-02-23 | Эдьт Дьедьсерведьесети Дьяр (Инопредприятие) | Method of human leukocyte interferon preparation |
| SU1364343A1 (en) * | 1984-07-13 | 1988-01-07 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Method of producing manъs leukocytic interferon alfa-2 |
| RU1709615C (en) * | 1990-03-23 | 1995-01-09 | Уфимский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова | Method for producing human leukocytic interferon |
| RU2080873C1 (en) * | 1993-12-27 | 1997-06-10 | Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" | Method of human leukocyte interferon preparing |
| WO1996028184A1 (en) * | 1995-03-15 | 1996-09-19 | Pearson C Robert | Lymphoblastoid natural interferon alpha production |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2175555C2 (en) * | 2000-02-03 | 2001-11-10 | Государственное унитарное предприятие "Иммунопрепарат" | Method of interferon virus-inductor preparing |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0870508B1 (en) | Influenza vaccine | |
| ES2559308T3 (en) | Improved procedure for cell culture | |
| US4664912A (en) | Process for the large scale production of rabies vaccine | |
| JPH11511324A (en) | How to increase interferon production in cell culture | |
| IE863405L (en) | Low dosage of interferon to enhance vaccine efficiency | |
| JPS63243032A (en) | Heat treatment method for thrombin | |
| EP0017570B1 (en) | Process for the preparation of interferon and culture medium composition used in it | |
| FI72143B (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV MAENNISKOINTERFERON | |
| US6514728B1 (en) | Process for preparation of cytokines using Sendai virus expression system | |
| JPS585671B2 (en) | Method for producing human follicle stimulating hormone | |
| RU2140284C1 (en) | Method of human leukocyte interferon preparing | |
| JPS6342699A (en) | Recombinant protein production | |
| US3256152A (en) | Concentration and purification of interferons, viral inhibiting substances (vis), viral inhibiting factors (vif), or viral inhibitory material | |
| KR100255228B1 (en) | Mammalian Cell Line Expressing Glycoprotein and Method of Making Glycoprotein | |
| JPS586475B2 (en) | Method for producing human chorionic gonadotropin | |
| RU2154104C1 (en) | Cold-adapted strain "h" of newcastle disease virus used as interferon inductor | |
| RU2066188C1 (en) | Method of human leukocyte interferon preparing | |
| US4452893A (en) | Cell growth medium supplement | |
| RU2108804C1 (en) | Preparation "locferon" for treatment and prophylaxis of viral diseases and a method of its preparing | |
| RU2435862C1 (en) | Method for producing high-polymer rna from used beer yeast | |
| RU2162338C1 (en) | Method of ceruloplasmin preparing | |
| Familletti et al. | [11] Induction, production, and concentration of interferon produced by a myeloblast culture | |
| Altstein et al. | Transforming activity of green monkey SA7 (C8) adenovirus in tissue culture | |
| RU1709615C (en) | Method for producing human leukocytic interferon | |
| RU2111008C1 (en) | Method of preparing virus-inductor of interferon |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070707 |