RU2027761C1

RU2027761C1 - Strain of bacterium brevibacterium sp - a producer of lysine

Info

Publication number: RU2027761C1
Authority: RU
Inventors: З.М. Зайцева; М.М. Гусятинер; Г.А. Удровский; Я.Б. Лиепа; Л.Б. Шкагале; А.А. Лацарс; Э.Б. Ворошилова; Л.В. Коновалова; В.Г. Ясиновский; Н.К. Краева
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Priority date: 1991-06-11
Filing date: 1991-06-11
Publication date: 1995-01-27

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: new strain Brevibacterium sp.90 - a producer of lysine is obtained. Strain is able to accumulate the high level of the end product on molasses media with decreased concentration of growth factors. In the process of growing on the medium with molasses (PS - 12-13%) strain accumulates lysine at concentration up to 65 g/l for 72 h under condition of flask shaking, and up to 56 g/l for 60 h in industrial fermenters in the process without makeup. Sugar conversion is 45-49%. Strain does not require high concentration of growth factor (leucine) that allows to carry out the process on molasses without hydrolysate PVC usage. Strain shows decreased aeration requirement. EFFECT: increased yield of lysine. 2 tbl

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения штамма-продуцента l-лизина - незаменимой аминокислоты, которую используют в качестве кормовой добавки. The invention relates to the microbiological industry and relates to the production of a producer strain of l-lysine, an essential amino acid that is used as a feed additive.

В известных микробиологических способах получения лизина главным образом используются ауксотрофные по гомосерину мутанты бактерий Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum. Known microbiological methods for producing lysine mainly use homoserine auxotrophic mutants of the bacteria Corynebacterium glutamicum and Brevibacterium flavum.

Известны также аналогорезистентные штаммы Brevibacterium lactofermentum, ауксотрофные по аланину и двойные ауксотрофы по серину и лейцину. Описанные штаммы на средах с мелассой (РВ - 11-13%) при выращивании в колбах на качалке накапливают лизин в количестве 38-50 г/л за 66-72 ч ферментации. При этом конверсия сахара в лизин составляет 32-41%. Analogous resistance strains of Brevibacterium lactofermentum, auxotrophic for alanine and double auxotrophs for serine and leucine, are also known. The described strains on media with molasses (PB - 11-13%) when grown in flasks on a rocking chair accumulate lysine in an amount of 38-50 g / l for 66-72 hours of fermentation. The conversion of sugar to lysine is 32-41%.

По совокупности признаков и достигаемому эффекту в качестве штамма-прототипа выбран отечественный штамм - продуцент лизина Brevibacterium sp. СВ80 (Технология микробного синтеза, Рига, "Зинатне", 1978, с.16). Штамм-прототип продуцирует 40,2 г/л лизина на ферментационной среде с 22% мелассы (10% по сахару) и 3% кукурузного экстракта за 3 сут. ферментации в колбах на качалке. Конверсия источника углерода в лизин составляет 40%. According to the totality of the characteristics and the achieved effect, the domestic strain — the lysine producer Brevibacterium sp. CB80 (Technology of microbial synthesis, Riga, "Zinatne", 1978, p.16). The prototype strain produces 40.2 g / l of lysine in a fermentation medium with 22% molasses (10% sugar) and 3% corn extract in 3 days. fermentation in flasks on a rocking chair. The conversion of the carbon source to lysine is 40%.

Недостатками штамма-прототипа являются низкий уровень накопления лизина и низкий коэффициент конверсии источника углерода. The disadvantages of the strain of the prototype are the low level of accumulation of lysine and a low conversion rate of the carbon source.

Целью изобретения является получение штамма-продуцента с высоким коэффициентом конверсии сахара в лизин, способного накапливать высокий уровень целевого продукта на мелассных средах со сниженной концентрацией ростовых факторов в условиях умеренной аэрации. The aim of the invention is to obtain a producer strain with a high conversion of sugar to lysine, capable of accumulating a high level of the target product on molasses media with a reduced concentration of growth factors under conditions of moderate aeration.

Цель достигается созданием нового штамма Breviobacterium sp.90. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-5593. The goal is achieved by creating a new strain of Breviobacterium sp.90. The strain is deposited in the All-Union collection of industrial microorganisms and has a registration number VKPM B-5593.

Штамм получен путем многоступенчатой селекции с применением мутагена нитрозогуанидина из штамма Brevibacterium sp.22Л. На первом этапе были получены ревертанты исходного штамма, не нуждающиеся для роста в гомосерине. На втором этапе от одного из таких ревертантов получены мутанты, устойчивые к структурному аналогу лизина S-(2-аминоэтил)-цистеину. На третьем этапе селекции от одного из устойчивых мутантов был получен штамм 90, нуждающийся для роста в лейцине. Полученный штамм Brevibacterium sp.90 превышает по продуктивности штамм-прототип и другие известные штаммы. Конверсия сахара в лизин составляет 42-49%, уровень накопления лизина достигает 65 г/л за 68 ч.ферментации при культивировании в колбах на качалке. The strain was obtained by multistage selection using the nitrosoguanidine mutagen from the strain Brevibacterium sp.22L. At the first stage, revertants of the initial strain were obtained that did not need homoserine for growth. At the second stage, mutants resistant to the structural analogue of lysine S- (2-aminoethyl) -cysteine were obtained from one of these revertants. At the third stage of selection, strain 90 was obtained from one of the stable mutants, which needs leucine to grow. The resulting strain of Brevibacterium sp.90 exceeds the productivity of the prototype strain and other known strains. The conversion of sugar to lysine is 42-49%, the level of lysine accumulation reaches 65 g / l for 68 hours of fermentation when cultured in flasks on a rocking chair.

Штамм Brevibacrerium sp.90 имеет сравнительно низкую потребность в ростовых факторах и способен накапливать высокий уровень лизина на мелассных средах без гидролизата БВК либо при небольшой добавке его (2-3%), что соответствует 0,4-0,5% по тех массе БВК. Высокие показатели по продуктивности достигаются при использовании небольших количеств кукурузного экстракта или, что более эффективно, гидролизата кукурузного экстракта (1,0-1,5% по тех. массе кукурузного экстракта). The strain Brevibacrerium sp.90 has a relatively low need for growth factors and is able to accumulate a high level of lysine on molasses media without a BVK hydrolyzate or with a small addition of it (2-3%), which corresponds to 0.4-0.5% by weight of BVK . High productivity indicators are achieved when using small amounts of corn extract or, more efficiently, hydrolyzed corn extract (1.0-1.5% by weight of the corn extract).

Новый штамм Brevibacterium sp.90 имеет следующие культурально-морфологические и биохимические признаки. The new strain of Brevibacterium sp.90 has the following cultural, morphological and biochemical characteristics.

Культурально-морфологические признаки. Cultural and morphological characters.

Клетки овальные, размеры 1,0-1,5х0,6-0,6-0,8 мкм, неподвижные, грамположительные, спор не образуют. The cells are oval, sizes 1.0-1.5x0.6-0.6-0.8 microns, motionless, gram-positive, do not form spores.

Через 3-5 сут. роста при 30^оС на МПА и на агаре Хоттингера колонии диаметром 2-4 мм, желтовато-кремовые, поверхность гладкая, форма выпуклая, край ровный, структура однородная тестообразная. При посеве штрихом через 2 сут. рост умеренный, край гладкий, поверхность матовая. При посеве уколом рост в глубине агара слабый, на поверхности умеренный.In 3-5 days. growth at ³⁰ ° C in IPA and Hottinger agar colonies 2-4 mm in diameter, yellowish creamy, smooth surface, the shape of convex, smooth edge, the structure homogeneous doughy. When sowing with a stroke after 2 days. moderate growth, edge smooth, matte surface. When sowing by injection, growth in the depth of the agar is weak, on the surface is moderate.

Через 3-5 сут роста при 30^оС на глюкозоминеральной среде Гловера, содержащей лейцин, биотин и тиамин, колонии 1-2 мм, край ровный, структура однородная, консистенция тестообразная, поверхность гладкая, цвет колоний светло-кремовый. Рост штриха на этой среде через 2 сут. умеренный.After 3-5 days of growth at ³⁰ ° C for glyukozomineralnoy Glover medium containing leucine, biotin and thiamine, colonies of 1-2 mm, the edge is smooth, homogeneous structure, doughy consistency, smooth surface, the color of the colonies light cream. Stroke growth on this medium after 2 days. moderate.

Физиолого-биохимические признаки. Physiological and biochemical characteristics.

Аэроб. Желатину не разжижает. Aerobe. It does not dilute gelatin.

Хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, фруктозе, маннозе, этаноле, уксусной кислоте. Не pастет на ксилозе, арабинозе, лактозе, раффинозе. It grows well on glucose, sucrose, maltose, fructose, mannose, ethanol, acetic acid. Does not grow on xylose, arabinose, lactose, raffinose.

Усваивает азот в форме солей аммония и мочевины. Не усваивает нитратный азот. Absorbs nitrogen in the form of ammonium and urea salts. Does not absorb nitrate nitrogen.

Растет при температуре 24-42^оС. Оптимальная температура 32^оС.It grows at 24-42 ^° C Optimal Temperature 32 ^° C

Растет на средах с рН от 6 до 8,5. Оптимальное значение рН 6,8-7,2. It grows on media with pH from 6 to 8.5. The optimal pH value is 6.8-7.2.

Для роста в минимальной среде нуждается в биотине, тиамине и L-лейцине. For growth in a minimal environment, it needs biotin, thiamine and L-leucine.

Устойчив к аналогу лизина S-(2-аминоэтил)-цистеину (АЭЦ). Resistant to lysine analog S- (2-aminoethyl) -cysteine (AEC).

Штамм хранится при 4^оС на косяках с агаром Хоттингера в течение 6 мес. или в лиофильно высушенных ампулах в течение 1 г.The strain is stored at ⁴ ° C on jambs Hottinger agar for 6 months. or in freeze-dried ampoules for 1 g.

Лизин с использованием штамма Brevibacterium sp.90 получают следующим образом. Lysine using Brevibacterium sp.90 strain is prepared as follows.

Клетки штамма выращивают на агаризованной полноценной среде, затем засевают колбы с посевной средой. Колбы устанавливают на круговую качалку (220-240 об/мин) и инкубируют в течение 18-24 ч при 30^оС. Выращенный посевной материал вносят в колбы с ферментационной средой, содержащей источник углерода, минеральные соли и ростовые факторы. Ферментацию проводят в колбах на качалке при 30-32^оС в течение 50-70 ч. Уровень накопления лизина в культуральной жидкости составляет 50-65 г/л. Конверсия сахара в лизин 42-49%.The cells of the strain are grown on an agarized complete medium, then flasks are seeded with inoculum. The flasks were mounted on a rotary shaker (220-240 rev / min) and incubated for 18-24 hours at 30 ^C. The grown seed is introduced into the flask with a fermentation medium containing a carbon source, mineral salts and growth factors. Fermentation was carried out in flasks on a shaker at 30-32 ^{° C} for 50-70 hours. The level of lysine accumulation in the culture broth of 50-65 g / l. The conversion of sugar to lysine is 42-49%.

Препарат L-лизина из ферментационного раствора готовят в виде кормового концентрата или выделяют как кристаллический продукт известными способами. The preparation of L-lysine from the fermentation solution is prepared in the form of a feed concentrate or isolated as a crystalline product by known methods.

П р и м е р 1. Клетки штамма Brevibacterium sp.90 при 30^оС в течение 1-2 сут. на МПА, петлей засевают колбы объемом 250 мл с 15 мл посевной среды следующего состава, %: меласса 3; кукурузный экстракт 6; хлорид аммония 0,5; мел 0,8. Все компоненты посевной среды стерилизуются совместно. Колбы помещают на круговую качалку (220 об/мин) и выращивают в течение 24 ч при 32^оС. Готовым посевным материалом в количестве 5% засевают колбы на 750 мл, содержащие 20 мл ферментационной среды следующего состава, %: меласса 24 (РВ-11%); сульфат аммония 3,5; гидрофосфат калия 0,1; сульфат магния семиводный 0,05; мел 3. В состав ферментационной среды в качестве стимулирующих рост факторов вводят 1,5% кукурузного экстракта (среда 1) или 0,5% по тех. массе БВК гидролизата БВК (среда 2). Ферментацию проводят в течение 64 ч. при 32^оС на круговой качалке (250 об/мин). Результаты ферментаций приведены в табл.1.PRI me R 1. Cells of strain Brevibacterium sp.90 at 30 ^about C for 1-2 days. on MPA, loop inoculate 250 ml flasks with 15 ml of inoculum of the following composition,%: molasses 3; corn extract 6; ammonium chloride 0.5; chalk 0.8. All components of the seed medium are sterilized together. The flasks were placed on a rotary shaker (220 rev / min) and grown for 24 hours at 32 ° ^C. The finished seed in an amount of 5% inoculated flask of 750 ml containing 20 ml of fermentation medium of the following composition,%: Molasses 24 (RV- eleven%); ammonium sulfate 3.5; potassium hydrogen phosphate 0.1; magnesium sulfate, seven-water 0.05; chalk 3. In the composition of the fermentation medium, 1.5% of the corn extract (medium 1) or 0.5% for those. the mass of BVK hydrolyzate BVK (environment 2). The fermentation was carried out for 64 hr. At 32 ^{° C} on a rotary shaker (250 rev / min). The fermentation results are shown in table 1.

Как видно из результатов табл.1, предлагаемый штамм Brevibacterium sp. 90 на среде с 1,5% кукурузного экстракта накапливает 50,3 г/л лизина, конверсия при этом составляет 45,2%. As can be seen from the results of table 1, the proposed strain of Brevibacterium sp. 90 on a medium with 1.5% of corn extract accumulates 50.3 g / l of lysine, the conversion is 45.2%.

На среде 2 с гидролизатом БВК (0,5% по БВК) штамм 90 накапливает лизин в концентрации 52,0 г/л. Конверсия составляет 48,4%. On medium 2 with a BVK hydrolyzate (0.5% BVK), strain 90 accumulates lysine at a concentration of 52.0 g / L. The conversion is 48.4%.

П р и м е р 2. Выращивание посевного материала штамма 90 проводят по примеру 1. Ферментационная среда имеет следующий состав, % меласса 28, (РВ-13%) сульфат аммония 4; гидролизат КЭ 2,0 (в расчете на технический вес КЭ; гидрофосфат аммония 0,2; сульфат магния семиводный 0,05; дистиобиотин 100 мкг/л. Ферментацию проводят в колбах на качалке (250 об/мин) при 32^оС в течение 72 ч. Для создания разной аэрации использовали колбы Эрленмейера емкостью 750 мл с объемом среды 20 и 30 мл, а также колбы Эрленмейера объемом 250 мл без отбойников (объем среды 10 и 15 мл) и с четырьмя отбойниками (объем среды 15 мл). Интенсивность кислородного массообмена (сульфитные числа, г О₂/л ˙ ч) и результаты по уровню накопления лизина приведены в табл.2.PRI me R 2. The cultivation of seed material of strain 90 is carried out according to example 1. The fermentation medium has the following composition,% molasses 28, (PB-13%) ammonium sulfate 4; 2.0 TBE hydrolyzate (based on the weight of technical TBE; Ammonium phosphate 0.2 Magnesium sulfate heptahydrate 0.05. distiobiotin 100 g / l fermentation was carried out in flasks on a shaker (250 rev / min) at 32 ^{° C} for 72 hours. To create different aeration, Erlenmeyer flasks with a capacity of 750 ml with a volume of 20 and 30 ml were used, as well as Erlenmeyer flasks with a volume of 250 ml without chippers (medium volume 10 and 15 ml) and with four chippers (medium volume 15 ml). oxygen mass transfer (sulfite numbers, g О ₂ / l л h) and results on the level of lysine accumulation are given in Table 2.

Как видно из табл.2, снижение аэрации с 5,5 до 4,5 г О₂/л ˙ ч, т.е. на 18% , сопровождается уменьшением уровня лизина с 65,3 до 60,0 г/л, т.е. на 8%. При этом конверсия снижается с 49,2 до 47,1, т.е. на 5%. При дальнейшем уменьшении аэрации отрицательный эффект проявляется более сильно.As can be seen from table 2, the reduction of aeration from 5.5 to 4.5 g O ₂ / l ˙ h, i.e. by 18%, accompanied by a decrease in lysine level from 65.3 to 60.0 g / l, i.e. by 8%. In this case, the conversion decreases from 49.2 to 47.1, i.e. by 5%. With a further decrease in aeration, the negative effect manifests itself more strongly.

П р и м е р 3. Выращивание посевного материала штамма 90 и состав ферментационной среды как в примере 1. Отличием является то, что в ферментационную среду вместо гидролизата кукурузного экстракта добавляетcя L-лейцин в концентрации 0,03%. Ферментацию проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с отбойником. Объем ферментационной среды 15 мл. Через 68 ч ферментации содержание лизина достигает 59,7 г/л. Конверсия углеводов в лизин составляет 48%. Example 3. The cultivation of seed material of strain 90 and the composition of the fermentation medium as in example 1. The difference is that instead of the hydrolyzed corn extract, L-leucine at a concentration of 0.03% is added to the fermentation medium. Fermentation is carried out in Erlenmeyer flasks with a volume of 250 ml with a chipper. The volume of the fermentation medium is 15 ml. After 68 hours of fermentation, the lysine content reaches 59.7 g / l. The conversion of carbohydrates to lysine is 48%.

П р и м е р 4. Выращивание посевного материала штамма Brevibacterium sp. 90 и условия проведения ферментации по примеру 1, но используется ферментационная среда следующего состава, %: сахар-сырец 12; сульфат аммоний 4; гидрофосфат калия 0,2; сульфат магния семиводный 0,05; мел 3; L-лейцин 0,05; дестиобиотин 200 мкг/мл; тиамин 100 мкг/мл. Через 72 ч ферментации содержание лизина в культуральной жидкости 50 г/л. Конверсия углеводов в лизин 42%. PRI me R 4. Growing inoculum of strain Brevibacterium sp. 90 and the conditions for the fermentation of example 1, but using a fermentation medium of the following composition,%: raw sugar 12; ammonium sulfate 4; potassium hydrogen phosphate 0.2; magnesium sulfate, seven-water 0.05; chalk 3; L-Leucine 0.05; destobiotin 200 mcg / ml; thiamine 100 mcg / ml. After 72 hours of fermentation, the lysine content in the culture fluid is 50 g / l. The conversion of carbohydrates to lysine is 42%.

П р и м е р 5. выращивание посевного материала и условия ферментации по примеру 3, но в составе ферментационной среды вместо L-лейцина содержится лейцинсодержащая культуральная жидкость с концентрацией в ней l-лейцина 21 г/л. Концентрация лейцина в приготовленной таким образом ферментационной среде 0,3 г/л. Через 68 ч ферментации содержание лизина в культуральной жидкости 56,6 г/л, конверсия углеводов в лизин 47%. PRI me R 5. growing seed and the fermentation conditions of example 3, but in the composition of the fermentation medium instead of L-leucine contains leucine-containing culture fluid with a concentration of l-leucine in it 21 g / l. The concentration of leucine in the thus prepared fermentation medium of 0.3 g / L. After 68 hours of fermentation, the lysine content in the culture fluid was 56.6 g / l, and the conversion of carbohydrates to lysine was 47%.

П р и м е р 6. Выращенным посевным материалом штамма Brevibacterium sp. 90 в посевной среде, как это показано в примере 1, в объеме 1 л засевают 2,5 м³ посевной среды того же состава, помещенной в ферментер емкостью 5 м³. Ферментер оборудован барботером для распределения воздуха и рубашкой для охлаждения. Выращивание культуры проводят при 30-32^оС в течение 21 с непрерывной аэрацией (2-3 м³ воздуха в 1 мин). Выращенной культурой объемом 2,5 м³ засевают 30 м³ ферментационной среды, приготовленной в ферментере емкостью 50 м³. Ферментер оборудован барботажным воздухораспределением. Ферментационная среда имеет следующий состав, %: меласса 25, (РВ-12,5) хлорид аммония 1,3; гидрофосфат аммония 0,1; гидролизат БВК 4 (в пересчете на технический вес продукта 0,8), пропинол 0,1.PRI me R 6. Cultivated seed material of strain Brevibacterium sp. 90 in the inoculum, as shown in example 1, in a volume of 1 liter sow 2.5 m ^{3 of} inoculum of the same composition, placed in a fermenter with a capacity of 5 m ³ . The fermenter is equipped with a bubbler for air distribution and a jacket for cooling. Cultivation is carried out at 30-32 ^about C for 21 with continuous aeration (2-3 m ^{3 of} air in 1 min). A grown culture with a volume of 2.5 m ^{3 is} seeded with 30 m ^{3 of} fermentation medium prepared in a 50 m ³ fermenter. The fermenter is equipped with bubble air distribution. The fermentation medium has the following composition,%: molasses 25, (PB-12.5) ammonium chloride 1.3; ammonium hydrogen phosphate 0.1; hydrolyzate BVK 4 (in terms of the technical weight of the product 0.8), propinol 0.1.

Значение рН в ходе ферментации поддерживается на уровне 6,8-7,0 путем автоматической подачи водного аммиака (25%) по датчику рН. Скорость подачи воздуха 1 объем на 1 объем ферментационной среды в 1 мин. Через 58 ч ферментации концентрация лизина составила 56 г/л. Конверсия углеводов в лизин 46,3%. The pH during fermentation is maintained at a level of 6.8-7.0 by automatically feeding aqueous ammonia (25%) using a pH sensor. Air flow rate 1 volume per 1 volume of fermentation medium in 1 min. After 58 hours of fermentation, the lysine concentration was 56 g / L. The conversion of carbohydrates to lysine is 46.3%.

Представленные примеры показывают, что при использовании нового штамма Brevibacterium sp. 90 высокий выход лизина (до 65 г/л) и высокий уровень конверсии углеводов в лизин (до 49%) достигается при использовании ферментационных сред с низким содержанием ростовых факторов - кукурузного экстракта (1,5-2,0%) или гидролизата БВК (0,5-0,8%). The presented examples show that when using a new strain of Brevibacterium sp. 90 a high yield of lysine (up to 65 g / l) and a high level of conversion of carbohydrates to lysine (up to 49%) is achieved using fermentation media with a low content of growth factors - corn extract (1.5-2.0%) or BVK hydrolyzate ( 0.5-0.8%).

По сравнению со штаммом-прототипом новый штамм имеет более высокий уровень накопления лизина (50,2-65,0 г/л против 40,2 г/л), а также более высокий коэффициент конверсии (45-49% против 40%). Compared with the prototype strain, the new strain has a higher level of lysine accumulation (50.2-65.0 g / l versus 40.2 g / l), as well as a higher conversion ratio (45-49% against 40%).

При применении нового штамма в промышленности имеется возможность использования ферментеров с малой интенсивностью аэрации, не оборудованных мешалками. В условиях умеренной аэрации уменьшается также и тепловыделение, борьба с которым связана с определенными трудностями из-за недостатка воды на охлаждение. When applying a new strain in industry, it is possible to use fermenters with low aeration intensity, not equipped with agitators. Under conditions of moderate aeration, heat generation also decreases, the fight against which is associated with certain difficulties due to the lack of water for cooling.

Claims

STRAIN BACTERIA BREVIBACTERIUM SP - PRODUCER LYSINE.

Bacterial strain Brevibacterium sp. VKPM B-5593 - producer of lysine.