Claims (81)
1. Рибонуклеотидная (РНК) последовательность, способная к упаковке в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса, при этом указанная последовательность РНК содержит:1. A ribonucleotide (RNA) sequence capable of packaging into a viral particle of a DNA-containing virus, wherein said RNA sequence contains:
(1) представляющую интерес последовательность РНК (RSI), например, последовательность РНК, кодирующую представляющий интерес ген (GOI), РНК, кодирующую белок (например, терапевтический белок, антигенный белок или белок для редактирования гена, такой как эффекторный фермент CRISPR/Cas ("белок Cas" для краткости), белок ZFN, белок TALEN), такую как mRNA, или некодирующую функциональную РНК (такую как транспортная РНК (tRNA), рибосомальная РНК (rRNA), малая интерферирующая РНК (siRNA), короткая шпилечная РНК (shRNA), антисмысловая РНК, антисмысловой олигонуклеотид, микро-РНК (miRNA) или РНК-компонент системы CRISPR-Cas (например, Cas9, Cas12, Cas13), включая направляющую РНК (или gRNA), такую как одиночная направляющая РНК (или sgRNA, химерная РНК, РНК-химера), РНК CRISPR (crRNA) и tracrRNA) или ее предшественник, и(1) RNA sequence of interest (RSI), e.g. RNA sequence encoding a gene of interest (GOI), RNA encoding a protein (e.g. a therapeutic protein, an antigenic protein, or a gene editing protein such as a CRISPR/Cas effector enzyme ("Cas protein" for short), a ZFN protein, a TALEN protein), such as mRNA, or a non-coding functional RNA (such as transfer RNA (tRNA) , ribosomal RNA (rRNA), small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), antisense RNA, antisense oligonucleotide, micro RNA (miRNA), or the RNA component of the CRISPR-Cas system (e.g. Cas9, Cas12, Cas13), including guide RNA (or gRNA), such as single guide RNA (or sgRNA, chimeric RNA, chimera RNA), CRISPR RNA (crRNA) and tracrRNA) or its precursor, and
(2) сигнал упаковки РНК (RPS), способный взаимодействовать, например, связываться, непосредственно или опосредованно, со взаимодействующей с РPS молекулой, что облегчает упаковку последовательности РНК в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса;(2) RNA packaging signal (RPS), capable of interacting e.g. bind, directly or indirectly, to a PPS-interacting molecule, which facilitates packaging of the RNA sequence into a viral particle of a DNA-containing virus;
при этом необязательно последовательность ДНК, кодирующая указанную последовательность РНК или соответствующая ей, или последовательность, обратно комплементарная указанной последовательности ДНК, характеризуется сниженной, уменьшенной способностью или по сути не характеризуется способностью к упаковке в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса (например, последовательность ДНК или обратно комплементарная ей последовательность не содержит сигнала упаковки ДНК, такого как функциональный ITR AAV для упаковки AAV).wherein, optionally, a DNA sequence encoding or corresponding to said RNA sequence, or a sequence reverse complementary to said DNA sequence, has a reduced, reduced, or essentially no ability to be packaged into a viral particle of a DNA-containing virus (e.g. the DNA sequence or its reverse complementary sequence does not contain a DNA packaging signal such as a functional AAV ITR for AAV packaging).
2. Последовательность РНК по п. 1, где вирусная частица ДНК-содержащего вируса представляет собой вирусную частицу AAV или онколитическую вирусную частицу.2. The RNA sequence of claim 1, wherein the DNA virus particle is an AAV virus particle or an oncolytic virus particle.
3. Последовательность РНК по п. 1 или 2, где RPS расположен на 5’-конце RSI или рядом с ним, на 3’-конце RSI или рядом с ним или внутри RSI (например, внутри интрона mRNA).3. The RNA sequence of claim 1 or 2, wherein the RPS is located at or near the 5' end of the RSI, at or near the 3' end of the RSI, or within the RSI (for example, within an intron of the mRNA).
4. Последовательность РНК по любому из пп. 1-3, содержащая более одного (например, 1, 2, 3 или больше) RPS, которые являются идентичными или разными.4. RNA sequence according to any one of paragraphs. 1-3, containing more than one (eg, 1, 2, 3 or more) RPS that are identical or different.
5. Последовательность РНК по п. 4, где два или более (например, 3) из указанных более чем одного RPS примыкают друг к другу или находятся в тандеме посредством одинаковых или разных линкеров.5. The RNA sequence of claim 4, wherein two or more (eg 3) of said more than one RPS are adjacent to each other or are in tandem via the same or different linkers.
6. Последовательность РНК по п. 4 или 5, содержащая два или более RPS, которые не примыкают друг к другу (например, по одному, каждый из которых расположен на одном конце представляющей интерес последовательности РНК (RSI) или рядом с ним).6. The RNA sequence of claim 4 or 5, comprising two or more RPSs that are not adjacent to each other (eg, one each located at or adjacent to one end of the RNA sequence of interest (RSI).
7. Последовательность РНК по любому из пп. 2-6, где RPS содержит транскрибированный модифицированный инвертированный концевой повтор (ITR) AAV, где указанный транскрибированный модифицированный ITR AAV7. RNA sequence according to any one of paragraphs. 2-6, wherein the RPS contains a transcribed modified AAV inverted terminal repeat (ITR), wherein said transcribed modified AAV ITR
(a) содержит транскрибированный функциональный Rep-связывающий элемент (RBE), необязательно дополнительно содержащий транскрибированный функциональный RBE’, и(a) contains a transcribed functional Rep-binding element (RBE), optionally further comprising a transcribed functional RBE', and
(b) не содержит либо транскрибированного сайта концевого разрешения (TRS), либо транскрибированного обратно комплементарного TRS (rcTRS), либо их обоих;(b) does not contain either a transcribed terminal resolution site (TRS), a transcribed reverse complementary TRS (rcTRS), or both;
необязательно указанный транскрибированный модифицированный ITR AAV дополнительно содержит транскрибированную последовательность D-области (D-последовательность или D’-последовательность), и/илиoptionally, said transcribed modified AAV ITR further comprises a transcribed D-region sequence (D-sequence or D'-sequence), and/or
необязательно взаимодействующая с RPS молекула представляет собой Rep78, Rep68, Rep52 и/или Rep40.optionally the RPS interacting molecule is Rep78, Rep68, Rep52 and/or Rep40.
8. Последовательность РНК по п. 7, где транскрибированный модифицированный ITR AAV находится в пределах 1000 нуклеотидов, 800 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 300 нуклеотидов или 200 нуклеотидов 3’-конца РНК; необязательно транскрибированный модифицированный ITR AAV расположен в направлении 5’ относительно последовательности поли-А, сигнальной последовательности поли-А (например, AAUAAA) или последовательности терминации транскрипции РНК (например, гистонового нижележащего элемента).8. The RNA sequence according to claim 7, where the transcribed modified AAV ITR is within 1000 nucleotides, 800 nucleotides, 500 nucleotides, 300 nucleotides or 200 nucleotides of the 3' end of the RNA; the optionally transcribed modified AAV ITR is located in the 5' direction of the poly-A sequence, the poly-A signal sequence (e.g. AAUAAA) or RNA transcription termination sequences (e.g. histone downstream element).
9. Последовательность РНК по любому из пп. 7, 8, где транскрибированный модифицированный ITR AAV модифицирован на основе транскрибированного флип- или флоп-ITR дикого типа; необязательно указанный флип- или флоп-ITR дикого типа происходит из AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 или AAV13 (необязательно указанный флоп-ITR дикого типа характеризуется нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 1).9. RNA sequence according to any one of paragraphs. 7, 8, wherein the transcribed modified AAV ITR is modified from the wild-type transcribed flip or flop ITR; optionally said wild-type flip or flop ITR is derived from AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 or AAV13 (optionally said wild-type flop-ITR is characterized nucleotide sequence under SEQ ID NO: 1).
10. Последовательность РНК по любому из пп. 7-9, где транскрибированный модифицированный ITR AAV не содержит ни транскрибированного TRS, ни транскрибированного rcTRS.10. RNA sequence according to any one of paragraphs. 7-9, wherein the transcribed modified AAV ITR contains neither transcribed TRS nor transcribed rcTRS.
11. Последовательность РНК по любому из пп. 7-10, где транскрибированный модифицированный ITR AAV содержит транскрибированную последовательность D-области (необязательно указанный модифицированный ITR AAV характеризуется нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 3).11. RNA sequence according to any one of paragraphs. 7-10, wherein the transcribed modified AAV ITR comprises a transcribed D-region sequence (optionally, said modified AAV ITR is characterized by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3).
12. Последовательность РНК по любому из пп. 7-10, где транскрибированный модифицированный ITR AAV не содержит транскрибированную последовательность D-области (необязательно указанный модифицированный ITR AAV характеризуется нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2).12. RNA sequence according to any one of paragraphs. 7-10, wherein the transcribed modified AAV ITR does not contain a transcribed D-region sequence (optionally, the modified AAV ITR is characterized by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2).
13. Последовательность РНК по любому из пп. 7-12, дополнительно содержащая второй транскрибированный модифицированный ITR AAV, содержащий последовательность второго транскрибированного функционального RBE, но не содержащий либо второго транскрибированного TRS, либо второго транскрибированного rcTRS, либо их обоих; необязательно указанный второй транскрибированный модифицированный ITR AAV дополнительно содержит последовательность второй транскрибированной D-области.13. RNA sequence according to any one of paragraphs. 7-12, further comprising a second transcribed modified AAV ITR containing the sequence of a second transcribed functional RBE, but not containing either a second transcribed TRS or a second transcribed rcTRS, or both; optionally, said second transcribed modified AAV ITR further comprises a second transcribed D-region sequence.
14. Последовательность РНК по п. 13, где транскрибированный модифицированный ITR AAV и второй транскрибированный модифицированный ITR AAV являются идентичными (или разными).14. The RNA sequence of claim 13, wherein the transcribed modified AAV ITR and the second transcribed modified AAV ITR are identical (or different).
15. Последовательность РНК по любому из пп. 7-14, где транскрибированный модифицированный ITR AAV и второй транскрибированный модифицированный ITR AAV (если присутствует) предусматривают делецию в соответствующей последовательности D-области транскрибированного ITR AAV дикого типа или соответствующего транскрибированного TRS/rcTRS дикого типа, мутацию в них или вставку в них.15. RNA sequence according to any one of paragraphs. 7-14, wherein the transcribed modified AAV ITR and the second transcribed modified AAV ITR (if present) comprise a deletion, mutation therein, or insertion into the corresponding D region sequence of the transcribed wild-type AAV ITR or the corresponding transcribed wild-type TRS/rcTRS.
16. Последовательность РНК по любому из пп. 13-15, где второй транскрибированный модифицированный ITR AAV находится в пределах 1000 нуклеотидов, 800 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 250 нуклеотидов или 150 нуклеотидов 5’-конца последовательности РНК.16. RNA sequence according to any one of paragraphs. 13-15, wherein the second transcribed modified AAV ITR is within 1000 nucleotides, 800 nucleotides, 500 nucleotides, 250 nucleotides, or 150 nucleotides of the 5' end of the RNA sequence.
17. Последовательность РНК по любому из пп. 2-6, где RPS содержит последовательность MS2, PP7-связывающий сайт или com-связывающий сайт, и взаимодействующая с RPS молекула содержит взаимодействующий с RPS белок (RPSIP), способный взаимодействовать, например, связываться, непосредственно или опосредованно, с RPS, такой как происходящий из бактериофага белок оболочки MS2 (MCP) для последовательности MS2, белок оболочки бактериофага РР7 (PCP) для PP7-связывающего сайта или фаговый белок COM (COM) для com-связывающего сайта.17. RNA sequence according to any one of paragraphs. 2-6, wherein the RPS contains an MS2 sequence, a PP7 binding site or a com binding site, and the RPS interacting molecule contains an RPS interacting protein (RPSIP) capable of interacting with, e.g. bind, directly or indirectly, to an RPS, such as bacteriophage-derived MS2 coat protein (MCP) for the MS2 sequence, bacteriophage PP7 coat protein (PCP) for the PP7-binding site, or phage COM protein (COM) for the com-binding site.
18. Последовательность РНК по п. 17, где RPSIP ассоциирован, непосредственно или опосредованно, с (например, слит с) белковым компонентом вирусной системы упаковки для вирусной частицы ДНК-содержащего вируса (таким как Rep78 и/или Rep68 аденоассоциированного вируса 2 (AAV2) или активирующий сборку белок (AAP)).18. The RNA sequence of claim 17, wherein RPSIP is associated, directly or indirectly, with (for example, fused to) a protein component of a viral packaging system for a viral particle of a DNA virus (such as adeno-associated virus 2 (AAV2) Rep78 and/or Rep68 or assembly-activating protein (AAP)).
19. Последовательность РНК по любому из пп. 1-18, где последовательность РНК содержит или предпочтительно не содержит транскрибированный сигнал упаковки ДНК, например, транскрибированную последовательность ITR AAV дикого типа (например, последовательность РНК содержит транскрибированную модифицированную последовательность ITR AAV, предусматривающую добавление, делецию и/или замену нуклеотида соответствующей последовательности транскрибированного ITR AAV дикого типа для снижения способности вирусной частицы ДНК-содержащего вируса к упаковке ДНК).19. RNA sequence according to any one of paragraphs. 1-18, wherein the RNA sequence contains or preferably does not contain a transcribed DNA packaging signal, for example, a transcribed wild-type AAV ITR sequence (e.g. the RNA sequence contains a transcribed modified AAV ITR sequence that involves the addition, deletion and/or substitution of a nucleotide corresponding to the transcribed wild-type AAV ITR sequence to reduce the ability of the DNA-containing virus viral particle to package DNA).
20. Последовательность РНК по любому из пп. 1-19, дополнительно содержащая:20. RNA sequence according to any one of paragraphs. 1-19, additionally containing:
(1) транскрибированный энхансер транскрипции;(1) transcribed transcription enhancer;
(2) транскрибированную последовательность интрона или последовательность экзона (такую как последовательность для усиления экспрессии белка);(2) a transcribed intron sequence or exon sequence (such as a sequence to enhance protein expression);
(3) последовательность 5’-UTR;(3) 5’UTR sequence;
(4) последовательность 3’-UTR;(4) 3’UTR sequence;
(5) последовательность поли-A или последовательность сигнала полиаденилирования (поли-A) и необязательно GU-богатую область ниже сигнальной последовательности поли-A;(5) a poly-A sequence or a polyadenylation signal sequence (poly-A) and optionally a GU-rich region downstream of the poly-A signal sequence;
(6) посттранскрипционный регуляторный элемент или последовательность, такую как транскрибированная последовательность посттранскрипционного регуляторного элемента вируса гепатита сурка (WHP) (WPRE), и/или(6) a post-transcriptional regulatory element or sequence, such as a transcribed woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element (WHP) sequence (WPRE), and/or
(7) последовательность терминации транскрипции (такую как гистоновый нижележащий элемент),(7) a transcription termination sequence (such as a histone downstream element),
необязательно последовательность РНК содержит RPS, расположенный в направлении 3’ относительно посттранскрипционного регуляторного элемента или последовательности и в направлении 5’ относительно последовательности поли-A или сигнальной последовательности поли-A.optionally, the RNA sequence contains an RPS located in the 3' direction of the post-transcriptional regulatory element or sequence and in the 5' direction of the poly-A sequence or poly-A signal sequence.
21. Последовательность РНК по п. 20, содержащая, в ориентации 5’-3’, RSI, необязательную транскрибированную последовательность WPRE; RPS (такой как транскрибированный модифицированный ITR AAV, последовательность MS2, PP7-связывающий сайт или com-связывающий сайт) и последовательность поли-A или сигнальную последовательность поли-A.21. The RNA sequence according to claim 20, containing, in the 5’-3’ orientation, RSI, an optional transcribed WPRE sequence; RPS (such as a transcribed modified AAV ITR, MS2 sequence, PP7 binding site or com binding site) and a poly-A sequence or poly-A signal sequence.
22. Последовательность РНК по любому из пп. 1-21, где GOI предусматривает белок (например, флуоресцентный белок, терапевтический белок, антигенный белок или белок для редактирования гена, такой как белок Cas, белок ZFN, белок TALEN), фермент (такой как белок Cre или эффекторный фермент CRISPR/Cas, например, Cas9, Cas12, Cas13 или их вариант), структурный белок, mRNA, некодирующую РНК (ncRNA), siRNA, piRNA, короткую шпилечную РНК или shRNA, микро-РНК (miRNA) или ее предшественника (включая pre-miRNA и pri-miRNA), рибосомальную РНК (rRNA), антисмысловую последовательность или олигонуклеотид (ASO), РНК-компонент системы CRISPR-Cas, в том числе направляющую РНК (или gRNA), такую как одиночная направляющая РНК (или sgRNA, химерная РНК, РНК-химера), РНК CRISPR (crRNA) и tracrRNA, направляющая РНК или gRNA для эффекторного фермента CRISPR/Cas, rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA, lncRNA, Xist и HOTAIR.22. RNA sequence according to any one of paragraphs. 1-21, where the GOI includes a protein (eg, fluorescent protein, therapeutic protein, antigenic protein or gene editing protein such as Cas protein, ZFN protein, TALEN protein), enzyme (such as Cre protein or CRISPR/Cas effector enzyme, e.g. Cas9, Cas12, Cas13 or a variant thereof), structural protein, mRNA, non-coding RNA (ncRNA), siRNA, piRNA, short hairpin RNA or shRNA, micro-RNA (miRNA) or its precursor (including pre-miRNA and pri-miRNA) , ribosomal RNA (rRNA), antisense sequence or oligonucleotide (ASO), the RNA component of the CRISPR-Cas system, including guide RNA (or gRNA), such as single guide RNA (or sgRNA, chimeric RNA, RNA chimera), CRISPR RNA (crRNA) and tracrRNA, guide RNA or gRNA for the CRISPR/Cas effector enzyme, rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA, lncRNA, Xist and HOTAIR.
23. Последовательность РНК по любому из пп. 1-22, которая представляет собой однонитевую РНК длиной менее чем приблизительно 8900 нуклеотидов, длиной менее чем приблизительно 8000 нуклеотидов, длиной менее чем приблизительно 7000 нуклеотидов, длиной менее чем приблизительно 6000 нуклеотидов, длиной менее чем приблизительно 5200 нуклеотидов, длиной менее чем приблизительно 4000 нуклеотидов, длиной менее чем приблизительно 3000 нуклеотидов, длиной менее чем приблизительно 2000 нуклеотидов, длиной приблизительно 4700-5200 нуклеотидов, длиной приблизительно 4700-5000 нуклеотидов, длиной приблизительно 4700-4800 нуклеотидов или длиной приблизительно 4700 нуклеотидов.23. RNA sequence according to any one of paragraphs. 1-22, which is a single-stranded RNA less than about 8900 nucleotides long, less than about 8000 nucleotides long, less than about 7000 nucleotides long, less than about 6000 nucleotides long, less than about 5200 nucleotides long, less than about 4000 nucleotides long , less than about 3000 nucleotides long, less than about 2000 nucleotides long, about 4700-5200 nucleotides long, about 4700-5000 nucleotides long, about 4700-4800 nucleotides long, or about 4700 nucleotides long.
24. Полинуклеотид, содержащий кассету, кодирующую последовательность РНК по любому из пп. 1-23; необязательно полинуклеотид представляет собой последовательность ДНК (например, ДНК-плазмиду), необязательно содержащую заполняющую последовательность в остове ДНК-плазмиды и/или необязательно не содержащую функциональный сигнал упаковки ДНК, такой как ITR AAV.24. A polynucleotide containing a cassette encoding an RNA sequence according to any one of claims. 1-23; optionally the polynucleotide is a DNA sequence (for example, DNA plasmid) optionally containing a filler sequence in the backbone of the DNA plasmid and/or optionally not containing a functional DNA packaging signal such as the AAV ITR.
25. Полинуклеотид по п. 24, дополнительно содержащий промотор, функционально связанный с последовательностью РНК, кодируемой кассетой, и управляющий ее транскрипцией.25. The polynucleotide according to claim 24, additionally containing a promoter operably linked to the RNA sequence encoded by the cassette and controlling its transcription.
26. Полинуклеотид по п. 25, где промотор представляет собой универсальный промотор.26. The polynucleotide according to claim 25, wherein the promoter is a universal promoter.
27. Полинуклеотид по п. 25, где промотор представляет собой тканеспецифический промотор.27. The polynucleotide of claim 25, wherein the promoter is a tissue-specific promoter.
28. Полинуклеотид по любому из пп. 25-27, где промотор представляет собой конститутивный промотор.28. Polynucleotide according to any one of paragraphs. 25-27, wherein the promoter is a constitutive promoter.
29. Полинуклеотид по любому из пп. 25-27, где промотор представляет собой индуцируемый промотор.29. Polynucleotide according to any one of paragraphs. 25-27, where the promoter is an inducible promoter.
30. Полинуклеотид по любому из пп. 25-29, дополнительно содержащий энхансер, который усиливает транскрипцию последовательности РНК, управляемой промотором.30. Polynucleotide according to any one of paragraphs. 25-29, further containing an enhancer that enhances transcription of the RNA sequence driven by the promoter.
31. Вирусная частица рекомбинантного ДНК-содержащего вируса, содержащая РНК-геном (такой как последовательность РНК по любому из пп. 1-23 или последовательность РНК, транскрибированная с полинуклеотида по любому из пп. 24-30), упакованный в белковую оболочку (такую как капсид) ДНК-содержащего вируса (такого как вирус AAV или онколитический вирус).31. A viral particle of a recombinant DNA-containing virus containing an RNA genome (such as an RNA sequence according to any one of paragraphs 1-23 or an RNA sequence transcribed from a polynucleotide according to any one of paragraphs 24-30), packaged in a protein shell (such as a capsid) of a DNA virus (such as an AAV virus or an oncolytic virus).
32. Вирусная частица рекомбинантного ДНК-содержащего вируса по п. 31, где ДНК-содержащий вирус представляет собой AAV, и вирусная частица рекомбинантного ДНК-содержащего вируса представляет собой частицу рекомбинантного РНК-содержащего аденоассоциированного вируса (rRAAV), содержащую:32. The recombinant DNA virus particle of claim 31, wherein the DNA virus is an AAV and the recombinant DNA virus particle is a recombinant RNA adeno-associated virus (rRAAV) particle comprising:
(1) капсид AAV и(1) AAV capsid and
(2) последовательность РНК по любому из пп. 1-23 или последовательность РНК, транскрибированную с полинуклеотида по любому из пп. 24-30, упакованную в указанный капсид AAV.(2) the RNA sequence according to any one of claims. 1-23 or an RNA sequence transcribed from a polynucleotide according to any one of paragraphs. 24-30, packaged in the indicated AAV capsid.
33. Вирусная частица рекомбинантного ДНК-содержащего вируса по п. 32, где капсид AAV включает капсид из AAV серотипа AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV-DJ, AAV PHP.eB, Anc80L65, Anc80L65AAP, AAVrh74 или 7m8.33. The viral particle of a recombinant DNA-containing virus according to claim 32, where the AAV capsid includes a capsid from AAV serotype AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV-DJ, AAV PHP.eB, Anc80L65, Anc80L65AAP, AAVrh74 or 7m8.
34. Популяция вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV), содержащая множество вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) по любому из пп. 31-33, где по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) в указанной популяции содержат последовательность РНК по любому из пп. 1-23 или последовательность РНК, транскрибированную с полинуклеотида по любому из пп. 24-30, упакованную в них.34. A population of viral particles of a recombinant DNA virus (for example, rRAAV particles) containing many viral particles of a recombinant DNA virus (for example, rRAAV particles) according to any one of paragraphs. 31-33, wherein at least about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more viral particles of a recombinant DNA virus (for example, rRAAV particles) in the specified population contain an RNA sequence according to any one of paragraphs. 1-23 or an RNA sequence transcribed from a polynucleotide according to any one of paragraphs. 24-30, packed in them.
35. Клетка-хозяин, содержащая последовательность РНК по любому из пп. 1-23, полинуклеотид по любому из пп. 24-30, последовательность РНК, транскрибированную с полинуклеотида по любому из пп. 24-30, вирусную частицу рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицу rRAAV) по любому из пп. 31-33 и/или популяцию вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) по п. 34.35. A host cell containing the RNA sequence according to any one of claims. 1-23, polynucleotide according to any one of paragraphs. 24-30, an RNA sequence transcribed from a polynucleotide according to any one of paragraphs. 24-30, a viral particle of a recombinant DNA virus (for example, rRAAV particle) according to any one of paragraphs. 31-33 and/or a population of viral particles of a recombinant DNA virus (for example, rRAAV particles) according to paragraph 34.
36. Клетка-хозяин по п. 35, дополнительно содержащая вирусную систему упаковки, которая облегчает упаковку последовательности РНК по любому из пп. 1-23 или последовательности РНК, транскрибированной с полинуклеотида по любому из пп. 24-30, в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса.36. The host cell according to claim 35, further comprising a viral packaging system that facilitates packaging of the RNA sequence according to any one of claims. 1-23 or an RNA sequence transcribed from a polynucleotide according to any one of paragraphs. 24-30, into a viral particle of a DNA-containing virus.
37. Клетка-хозяин по п. 36, где вирусная система упаковки содержит:37. The host cell according to claim 36, where the viral packaging system contains:
(1) ген rep AAV (например, последовательность, кодирующая Rep78, Rep68, Rep52 и/или Rep40) и ген cap AAV (например, последовательность, кодирующая VP1, VP2, VP3, AAP и/или MAAP) под транскрипционным контролем одного или нескольких промоторов, которые управляют транскрипцией указанного гена rep и гена cap, или продукты их экспрессии;(1) AAV rep gene (e.g. sequence encoding Rep78, Rep68, Rep52 and/or Rep40) and the AAV cap gene (e.g. a sequence encoding VP1, VP2, VP3, AAP and/or MAAP) under the transcriptional control of one or more promoters that direct the transcription of said rep gene and cap gene, or their expression products;
(2) одну или несколько последовательностей, кодирующих один или несколько белков, необходимых для упаковки AAV, например, гены E2A, E4 и VA аденовируса, или указанные один или несколько белков, и(2) one or more sequences encoding one or more proteins required for AAV packaging, for example, the adenovirus E2A, E4 and VA genes, or said one or more proteins, and
(3) взаимодействующую с RPS молекулу или кодирующую ее последовательность;(3) an RPS interacting molecule or coding sequence thereof;
при этом необязательно способность вирусной системы упаковки упаковывать последовательность ДНК в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса снижается, уменьшается или по сути устраняется, например, (1) удалением части или всех сигналов упаковки ДНК, таких как ITR AAV, в полинуклеотиде, кодирующем последовательность РНК по любому из пп. 1-23, или в полинуклеотиде по любому из пп. 24-30, (2) модификацией, например, мутацией, указанного гена rep AAV, указанного гена cap AAV и/или указанных одной или нескольких последовательностей, кодирующих один или несколько белков, необходимых для упаковки AAV, со снижением, уменьшением или по сути устранением способности соответствующего транслированного белка облегчать упаковку последовательности ДНК в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса (например, мутация Y156F в обычной последовательности белков Rep78 и Rep68, KDE-mu или EKE-mu), и/или (3) увеличением размера полинуклеотида, кодирующего последовательность РНК по любому из пп. 1-23, или полинуклеотида по любому из пп. 24-30.wherein, optionally, the ability of the viral packaging system to package a DNA sequence into a viral particle of the DNA-containing virus is reduced, reduced, or essentially eliminated, for example, by (1) removing some or all of the DNA packaging signals, such as the AAV ITR, in the polynucleotide encoding the RNA sequence any of paragraphs. 1-23, or in a polynucleotide according to any one of paragraphs. 24-30, (2) modification, for example, mutation, said AAV rep gene, said AAV cap gene, and/or said one or more sequences encoding one or more proteins required for AAV packaging, reducing, reducing, or substantially eliminating the ability of the corresponding translated protein to facilitate packaging of a DNA sequence into a viral particle DNA virus (eg. mutation Y156F in the normal sequence of the proteins Rep78 and Rep68, KDE-mu or EKE-mu), and/or (3) an increase in the size of the polynucleotide encoding the RNA sequence according to any one of paragraphs. 1-23, or a polynucleotide according to any one of paragraphs. 24-30.
38. Клетка-хозяин по любому из пп. 35-37, которая представляет собой клетку млекопитающего (такую как клетки HEK293) или клетку насекомого (такую как клетки Sf9 или Sf21).38. Host cell according to any one of paragraphs. 35-37, which is a mammalian cell (such as HEK293 cells) or an insect cell (such as Sf9 or Sf21 cells).
39. Способ получения вирусной частицы рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицы rRAAV) по любому из пп. 31-33 или популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) по п. 34, при этом способ включает:39. A method for producing a viral particle of a recombinant DNA-containing virus (for example, rRAAV particles) according to any one of paragraphs. 31-33 or populations of viral particles of a recombinant DNA virus (for example, rRAAV particles) according to claim 34, wherein the method includes:
a) культивирование клетки-хозяина по любому из пп. 35-38 в течение достаточного времени иa) culturing a host cell according to any one of claims. 35-38 for sufficient time and
b) сбор рекомбинантной вирусной частицы ДНК-содержащего вируса или популяции рекомбинантных вирусных частиц ДНК-содержащего вируса.b) collecting a recombinant DNA virus particle or a population of recombinant DNA virus particles.
40. Способ по п. 39, дополнительно включающий выделение или очистку указанной вирусной частицы рекомбинантного ДНК-содержащего вируса или указанной популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса.40. The method of claim 39, further comprising isolating or purifying said recombinant DNA virus viral particle or said population of recombinant DNA virus viral particles.
41. Способ получения вирусной частицы рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицы rRAAV) или популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса, при этом способ включает:41. A method for producing a viral particle of a recombinant DNA-containing virus (for example, rRAAV particles) or a population of viral particles of a recombinant DNA-containing virus, wherein the method includes:
a) обеспечение контакта вирусной системы упаковки (например, системы упаковки AAV) с последовательностью РНК по любому из пп. 1-23 или последовательностью РНК, транскрибированной с полинуклеотида по любому из пп. 24-30, в течение периода времени, достаточного для получения вирусной частицы рекомбинантного ДНК-содержащего вируса или популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса, иa) ensuring contact of the viral packaging system (e.g. AAV packaging system) with the RNA sequence according to any one of claims. 1-23 or an RNA sequence transcribed from a polynucleotide according to any one of paragraphs. 24-30, for a period of time sufficient to obtain a viral particle of a recombinant DNA virus or a population of viral particles of a recombinant DNA virus, and
b) сбор рекомбинантной вирусной частицы ДНК-содержащего вируса или популяции рекомбинантных вирусных частиц ДНК-содержащего вируса и необязательноb) collecting a recombinant DNA virus viral particle or a population of recombinant DNA virus viral particles, and optionally
c) выделение или очистку собранной вирусной частицы рекомбинантного ДНК-содержащего вируса или популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса.c) isolating or purifying the collected recombinant DNA virus particle or population of recombinant DNA virus virus particles.
42. Способ по п. 41, где вирусная система упаковки (например, система упаковки AAV) содержит:42. The method according to claim 41, where the viral packaging system (for example, AAV packaging system) contains:
(1) один или несколько белков для сборки белковой оболочки (например, VP1, VP2 и/или VP3 для сборки капсида AAV) вирусной частицы ДНК-содержащего вируса для упаковки последовательности РНК или одну или несколько кодирующих их последовательностей;(1) one or more proteins for assembling a protein shell (e.g. VP1, VP2 and/or VP3 for assembling an AAV capsid) of a viral particle containing a DNA virus for packaging an RNA sequence or one or more sequences encoding them;
(2) один или несколько белков (например, Rep78, Rep68, Rep52 и/или Rep40 для упаковки AAV) для облегчения сборки белковой оболочки и/или упаковки последовательности РНК в белковую оболочку вирусной частицы ДНК-содержащего вируса или одну или несколько кодирующих их последовательностей (например, генов E2a, E4 и VA аденовируса) и(2) one or more proteins (for example, Rep78, Rep68, Rep52 and/or Rep40 for AAV packaging) to facilitate the assembly of a protein coat and/or packaging of an RNA sequence into the protein coat of a viral particle of a DNA virus or one or more sequences encoding them (e.g. adenovirus E2a, E4 and VA genes) and
(3) взаимодействующую с RPS молекулу или кодирующую ее последовательность;(3) an RPS interacting molecule or coding sequence thereof;
при этом необязательно способность вирусной системы упаковки упаковывать последовательность ДНК в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса снижается, уменьшается или по сути устраняется, например, (1) удалением части или всех сигналов упаковки ДНК, таких как ITR AAV, в полинуклеотиде, кодирующем последовательность РНК по любому из пп. 1-23, или в полинуклеотиде по любому из пп. 24-30, (2) модификацией, например, мутацией, указанного гена rep AAV, указанного гена cap AAV и/или указанных одной или нескольких последовательностей, кодирующих один или несколько белков, необходимых для упаковки AAV, со снижением, уменьшением или по сути устранением способности соответствующего транслированного белка облегчать упаковку последовательности ДНК в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса (например, мутация Y156F в обычной последовательности белков Rep78 и Rep68, KDE-mu или EKE-mu), и/или (3) увеличением размера полинуклеотида, кодирующего последовательность РНК по любому из пп. 1-23 или полинуклеотида по любому из пп. 24-30.wherein, optionally, the ability of the viral packaging system to package a DNA sequence into a viral particle of the DNA-containing virus is reduced, reduced, or essentially eliminated, for example, by (1) removing some or all of the DNA packaging signals, such as the AAV ITR, in the polynucleotide encoding the RNA sequence any of paragraphs. 1-23, or in a polynucleotide according to any one of paragraphs. 24-30, (2) modification, for example, mutation, said AAV rep gene, said AAV cap gene, and/or said one or more sequences encoding one or more proteins required for AAV packaging, reducing, reducing, or substantially eliminating the ability of the corresponding translated protein to facilitate packaging of a DNA sequence into a viral particle DNA virus (eg mutation Y156F in the normal sequence of the proteins Rep78 and Rep68, KDE-mu or EKE-mu), and/or (3) an increase in the size of the polynucleotide encoding the RNA sequence according to any one of paragraphs. 1-23 or polynucleotide according to any one of paragraphs. 24-30.
43. Система упаковки последовательности РНК по любому из пп. 1-23 или последовательности РНК, транскрибированной с полинуклеотида по любому из пп. 24-30, в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса, содержащую:43. RNA sequence packaging system according to any one of claims. 1-23 or an RNA sequence transcribed from a polynucleotide according to any one of paragraphs. 24-30, into a viral particle of a DNA-containing virus containing:
(1) один или несколько белков для сборки белковой оболочки (например, VP1, VP2 и/или VP3 для сборки капсида AAV) вирусной частицы ДНК-содержащего вируса для упаковки последовательности РНК или одну или несколько кодирующих их последовательностей;(1) one or more proteins for assembling a protein shell (e.g. VP1, VP2 and/or VP3 for assembling an AAV capsid) of a viral particle containing a DNA virus for packaging an RNA sequence or one or more sequences encoding them;
(2) один или несколько белков (например, Rep78, Rep68, Rep52 и/или Rep40 для упаковки AAV) для облегчения сборки белковой оболочки и/или упаковки последовательности РНК в белковую оболочку вирусной частицы ДНК-содержащего вируса или одну или несколько кодирующих их последовательностей (например, генов E2a, E4 и VA аденовируса) и(2) one or more proteins (for example, Rep78, Rep68, Rep52 and/or Rep40 for AAV packaging) to facilitate the assembly of a protein coat and/or packaging of an RNA sequence into the protein coat of a viral particle of a DNA virus or one or more sequences encoding them (e.g. adenovirus E2a, E4 and VA genes) and
(3) взаимодействующую с RPS молекулу или кодирующую ее последовательность;(3) an RPS interacting molecule or coding sequence thereof;
при этом необязательно способность вирусной системы упаковки упаковывать последовательность ДНК в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса снижается, уменьшается или по сути устраняется, например, (1) удалением части или всех сигналов упаковки ДНК, таких как ITR AAV, в полинуклеотиде, кодирующем последовательность РНК по любому из пп. 1-23, или в полинуклеотиде по любому из пп. 24-30, (2) модификацией, например, мутацией, указанного гена rep AAV, указанного гена cap AAV и/или указанных одной или нескольких последовательностей, кодирующих один или несколько белков, необходимых для упаковки AAV, со снижением, уменьшением или по сути устранением способности соответствующего транслированного белка облегчать упаковку последовательности ДНК в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса (например, мутация Y156F в обычной последовательности белков Rep78 и Rep68, KDE-mu или EKE-mu), и/или (3) увеличением размера полинуклеотида, кодирующего последовательность РНК по любому из пп. 1-23, или полинуклеотида по любому из пп. 24-30.wherein, optionally, the ability of the viral packaging system to package a DNA sequence into a viral particle of the DNA-containing virus is reduced, reduced, or essentially eliminated, for example, by (1) removing part or all of the DNA packaging signals, such as the AAV ITR, in the polynucleotide encoding the RNA sequence any of paragraphs. 1-23, or in a polynucleotide according to any one of paragraphs. 24-30, (2) modification, for example, mutation, said AAV rep gene, said AAV cap gene, and/or said one or more sequences encoding one or more proteins required for AAV packaging, reducing, reducing, or substantially eliminating the ability of the corresponding translated protein to facilitate packaging of a DNA sequence into a viral particle DNA virus (eg mutation Y156F in the normal sequence of the proteins Rep78 and Rep68, KDE-mu or EKE-mu), and/or (3) an increase in the size of the polynucleotide encoding the RNA sequence according to any one of paragraphs. 1-23, or a polynucleotide according to any one of paragraphs. 24-30.
44. Способ доставки представляющего интерес гена (GOI) в клетку, растение или животное, при этом способ включает обеспечение контакта клетки, растения или животного с вирусной частицей рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицей rRAAV) по любому из пп. 31-33, популяцией вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) по п. 34 или вирусной частицей рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицей rRAAV) или популяцией вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV), полученных способом по любому из пп. 39-42, где указанный GOI кодируется указанной последовательностью РНК (по любому из пп. 1-23).44. A method of delivering a gene of interest (GOI) into a cell, plant or animal, the method comprising contacting the cell, plant or animal with a viral particle of a recombinant DNA virus (e.g. rRAAV particle) according to any one of paragraphs. 31-33, a population of viral particles of a recombinant DNA virus (for example, rRAAV particles) according to claim 34 or a viral particle of a recombinant DNA virus (for example, rRAAV particle) or a population of recombinant DNA virus particles (e.g. rRAAV particles) obtained by the method according to any one of paragraphs. 39-42, where the specified GOI is encoded by the specified RNA sequence (according to any one of claims 1-23).
45. Способ доставки представляющей интерес последовательности РНК (RSI) в клетку, растение или животное, при этом способ включает обеспечение контакта клетки, растения или животного с вирусной частицей рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицей rRAAV) по любому из пп. 31-33, популяцией вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) по п. 34 или вирусной частицей рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицей rRAAV) или популяцией вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV), полученных способом по любому из пп. 39-42.45. A method of delivering an RNA sequence of interest (RSI) into a cell, plant or animal, the method comprising contacting the cell, plant or animal with a viral particle of a recombinant DNA virus (e.g. rRAAV particle) according to any one of paragraphs. 31-33, a population of viral particles of a recombinant DNA virus (for example, rRAAV particles) according to claim 34 or a viral particle of a recombinant DNA virus (for example, rRAAV particle) or a population of recombinant DNA virus particles (e.g. rRAAV particles) obtained by the method according to any one of paragraphs. 39-42.
46. Способ осуществления диагностики, предупреждения или лечения заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества или дозы популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) по п. 34 или полученных способом по любому из пп. 39-42.46. A method of diagnosing, preventing, or treating a disease or disorder in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount or dose of a population of viral particles of a recombinant DNA virus (e.g. rRAAV particles) according to claim 34 or obtained by the method according to any of paragraphs. 39-42.
47. Применение вирусной частицы рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицы rRAAV) по любому из пп. 31-33, популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) по п. 34 или вирусной частицы рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицы rRAAV) или популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV), полученных способом по любому из пп. 39-42, в изготовлении лекарственного препарата для диагностики, предупреждения или лечения заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом.47. The use of a viral particle of a recombinant DNA virus (for example, rRAAV particles) according to any one of paragraphs. 31-33, populations of viral particles of a recombinant DNA virus (for example, rRAAV particles) according to claim 34 or a viral particle of a recombinant DNA virus (for example, rRAAV particles) or a population of recombinant DNA virus particles (e.g. rRAAV particles) obtained by the method according to any one of paragraphs. 39-42, in the manufacture of a medicinal product for the diagnosis, prevention or treatment of a disease or disorder in a subject in need thereof.