Claims (52)
1. Способ анализа одного или более аналитов множества единичных клеток, где способ включает:1. A method for analyzing one or more analytes of a plurality of single cells, wherein the method includes:
(a) обеспечение наличия множества элементов, сохраняющий связность (CE);(a) providing a plurality of elements that maintain connectivity (CE);
(b) компартментализацию CE с получением множества первых компартментов, где каждый компартмент содержит множество CE; (b) compartmentalizing the CEs to obtain a plurality of first compartments, where each compartment contains a plurality of CEs;
(c) обеспечение наличия набора первых репортерных групп в аналите каждого CE в каждом из множества первых компартментов, где каждая первая репортерная группа в наборе первых репортерных групп, представленных в аналите каждого первого компартмента, отличается от первых репортерных групп, представленных в первом аналите каждого из других первых компартаментов;(c) providing a set of first reporter groups in the analyte of each CE in each of a plurality of first compartments, where each first reporter group in the set of first reporter groups present in the analyte of each first compartment is different from the first reporter groups present in the first analyte of each of other first apartments;
(d) объединение CE, содержащих первые репортерные группы во второй компортамент или компартменты;(d) combining CEs containing the first reporter groups into a second compartment or compartments;
(e) расщепление CE, содержащих первые репортерные группы во множество третьих компаратментов;(e) splitting the CEs containing the first reporter groups into a plurality of third compartments;
(f) обеспечение наличия набора вторых репортерных групп в аналите каждого CE в каждом из множества третьих компартментов, где каждая вторая репортерная группа в наборе вторых репортерных групп, представленных в аналите каждого третьего компартмента, отличается от вторых репортерных групп, представленных во втором аналите каждого из других третьих компартментов;(f) providing a set of second reporter groups in the analyte of each CE in each of a plurality of third compartments, where each second reporter group in the set of second reporter groups represented in the analyte of each third compartment is different from the second reporter groups represented in the second analyte of each of other third compartments;
(g) объединение CE, содержащих первые и вторые репортерные группы; (g) combining CEs containing first and second reporter groups;
(h) анализ аналитов, содержащих репортерные группы каждого компартмента, где в результате такого анализа обнаруживается единичная клетка, которая является источником каждого аналита.(h) analysis of analytes containing reporter groups of each compartment, where as a result of such analysis, a single cell is found that is the source of each analyte.
2. Способ по п. 1, где CE представляет собой клетку, погруженную клетку, консервированную клетку или клетки, зафиксированную клетку, транспозон или модифицированную транспозазой клетку.2. The method of claim 1, wherein the CE is a cell, a submerged cell, a preserved cell or cells, a fixed cell, a transposon, or a transposase-modified cell.
3. Способ по п. 1 или 2, где первую репортерную группу вводят с помощью лигирования или транспозонной последовательности.3. The method of claim 1 or 2, wherein the first reporter group is introduced by ligation or a transposon sequence.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где стадии (b)-(f) повторяют с использованием одного или более наборов дополнительных репортерных групп.4. The method according to any one of paragraphs. 1-3, where steps (b)-(f) are repeated using one or more sets of additional reporter groups.
5. Способ по п. 4, где дополнительные репортерные группы отличаются от первых и вторых репортерных групп.5. The method of claim 4 wherein the additional reporter groups are different from the first and second reporter groups.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где аналит представляет собой ДНК, РНК или белок или их комбинацию. 6. The method according to any one of paragraphs. 1-5, where the analyte is DNA, RNA or protein, or a combination thereof.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где каждый набор репортерных групп используют для идентификации другого аналита. 7. The method according to any one of paragraphs. 1-6, where each set of reporter groups is used to identify a different analyte.
8. Способ по любому из пп. 1-6, где каждый набор репортерных групп используют для идентификации того же аналита.8. The method according to any one of paragraphs. 1-6 where each set of reporter groups is used to identify the same analyte.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где первые репортерные группы используют для идентификации источника образца для каждой единичной клетки. 9. The method according to any one of paragraphs. 1-8, where the first reporter groups are used to identify the source of the sample for each single cell.
10. Способ по любому из пп.1-9, где выявление аналитов из того же CE осуществляют одновременно. 10. The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the detection of analytes from the same CE is carried out simultaneously.
11. Композиция, содержащая множество элементов, сохраняющий связность (CE), где каждый CE содержит множество аналитов; где аналиты каждого CE являются компонентами единичной клетки или ядра, где по меньшей мере некоторые из аналитов каждого CE содержат первую и вторую репортерную группу CE. 11. Composition containing multiple elements, maintaining connectivity (CE), where each CE contains multiple analytes; where the analytes of each CE are components of a single cell or nucleus, where at least some of the analytes of each CE contain the first and second reporter group CE.
12. Композиция по п. 11, где CE представляет собой клетку, погруженную клетку, консервированную клетку или клетки, зафиксированную клетку, транспозон или модифицированную транспозазой клетку.12. The composition of claim 11, wherein the CE is a cell, a submerged cell, a preserved cell or cells, a fixed cell, a transposon, or a transposase-modified cell.
13. Композиция по п. 11 или 12, где каждый CE содержит два или более аналитов различных видов, где по меньшей мере некоторый из каждого из аналитов различных видов содержит репортерные группы, где комбинация репортерных групп и/или данных секвенирования аналита обеспечивает идентификацию аналита. 13. The composition of claim 11 or 12, wherein each CE contains two or more analytes of different species, where at least some of each of the different species analytes contains reporter groups, where the combination of reporter groups and/or analyte sequencing data provides identification of the analyte.
14. Композиция по п. 13, где различные виды аналитов выбирают из группы, состоящей из ДНК, РНК, кДНК, белка, липидов, углеводов, клеточных органелл, продуктов метаболизма клетки, нуклеиновой кислоты из единичной клетки или нуклеиновой кислоты или белка из единичной клетки и дополнительно модифицированную. 14. Composition according to claim 13, where different types of analytes are selected from the group consisting of DNA, RNA, cDNA, protein, lipids, carbohydrates, cell organelles, products of cell metabolism, nucleic acid from a single cell or nucleic acid or protein from a single cell and further modified.
15. Композиция по любому из пп. 11-14, где аналит, который содержит первую репортерную группу, представляет собой нуклеиновую кислоту.15. The composition according to any one of paragraphs. 11-14, where the analyte, which contains the first reporter group, is a nucleic acid.
16. Композиция по п. 15, где нуклеиновая кислота содержит:16. The composition according to claim 15, where the nucleic acid contains:
(i) ДНК; необязательно где ДНК содержит геномную ДНК; или(i) DNA; optionally where the DNA contains genomic DNA; or
(ii) РНК или кДНК; или(ii) RNA or cDNA; or
(iii) сохраняющий связность транспозон, где сохраняющий связность транспозон содержит уникальную последовательность, репортерную группу или метку. (iii) a connectivity-preserving transposon, wherein the connectivity-preserving transposon contains a unique sequence, reporter group, or label.
17. Композиция по любому из пп. 11-16, дополнительно содержащая кодирующую последовательность ДНК, которая кодирует репортерные группы, необязательно где кодирующая последовательность ДНК включает плазмиду. 17. The composition according to any one of paragraphs. 11-16 further comprising a DNA coding sequence that encodes reporter groups, optionally wherein the DNA coding sequence includes a plasmid.
18. Композиция по п.11, где аналит, который содержит первую репортерную группу, представляет собой ДНК, РНК, белок или их комбинацию.18. The composition of claim 11, wherein the analyte that contains the first reporter group is DNA, RNA, protein, or a combination thereof.
19. Композиция по любому из пп. 11-18, где CE содержат дополнительные наборы репортерных групп, где дополнительные наборы репортерных групп отличаются от первой репортерной группы и, необязательно, в случае присутствия, от вторых репортерных групп.19. The composition according to any one of paragraphs. 11-18, where the CEs comprise additional reporter group sets, where the additional reporter group sets are different from the first reporter group and optionally, if present, from the second reporter groups.
20. Композиция по п. 11, где аналит, который содержит первую репортерную группу, представляет собой мРНК или кДНК.20. The composition of claim 11, wherein the analyte that contains the first reporter group is mRNA or cDNA.
21. Композиция по п. 20, где:21. Composition according to claim 20, where:
(i) CE содержат твердую подложку, способную иммобилизировать мРНК или кДНК, необязательно где твердая подложка содержит олигонуклеотидные (dT) зонды, иммобилизированные на твердой подложке; и/или(i) the CEs comprise a solid support capable of immobilizing mRNA or cDNA, optionally wherein the solid support contains oligonucleotide (dT) probes immobilized on the solid support; and/or
(ii) первая репортерная группа содержит первую последовательность штрих-кода; и/или(ii) the first reporter group contains the first barcode sequence; and/or
(iii) вторая репортерная группа содержит вторую последовательность штрих-кода.(iii) the second reporter group contains a second barcode sequence.
22. Композиция по п. 11, где22. Composition according to claim 11, where
(i) первая репортерная группа идентифицирует тип образца или идентификацию образца; или(i) the first reporter group identifies the sample type or sample identification; or
(ii) каждая из первой и второй репортерной группы идентифицирует источник аналитов; или(ii) each of the first and second reporter groups identifies the source of the analytes; or
(iii) комбинация репортерных групп идентифицирует источник аналитов; или(iii) the combination of reporter groups identifies the source of the analytes; or
(iv) где данные секвенирования каждого аналита обеспечивает идентификацию аналита.(iv) where the sequencing data of each analyte provides identification of the analyte.
23. Композиция по любому из пп. 11-22, где единичная клетка связана с заболеванием, необязательно где единичная клетка связана с раковым заболеванием или генетическим заболеванием.23. The composition according to any one of paragraphs. 11-22, where the single cell is associated with a disease, optionally where the single cell is associated with a cancer or genetic disease.
24. Композиция по любому из пп.11-23, где единичная клетка или клетки подвергаются лизису.24. A composition according to any one of claims 11-23, wherein the single cell or cells undergo lysis.
25. Композиция по любому из пп. 11-24, где CE подвергают компартментализации.25. The composition according to any one of paragraphs. 11-24, where the CE is subjected to compartmentalization.
26. Набор, содержащий26. Set containing
(a) набор штрих-кодирующих реагентов для уникальной метки компартментов и осуществления комбинаторного индексирования разделения-объединения клеток или ядер,(a) a set of bar-coding reagents for unique labeling of compartments and performing combinatorial indexing of separation-combination of cells or nuclei,
(b) лигазу для присоединения репортерной группы, и(b) a ligase for attaching a reporter group, and
(c) транспосомы для модификации нуклеиновых кислот клеток или ядер.(c) transposoms for modifying nucleic acids of cells or nuclei.
27. Набор по п. 26, где штрих-кодирующие реагенты включают олиглнуклеотиды, снабженные штрих-кодами.27. The kit of claim 26, wherein the barcoding reagents include barcoded oliglenucleotides.
28. Композиция, содержащая множество лизированных единичных клеток или ядер, где каждая лизированная единичная клетка или ядро содержит множество нуклеиновых кислот, где по меньшей мере некоторые нуклеиновые кислоты каждой лизированной единичной клетки или ядра содержит первую репортерную группу, где две или более лизированных клеток или ядра присутствуют в компартменте, и нуклеиновые кислоты присутствуют на твердой подложке, обеспечивающей CE, где нуклеиновые кислоты модифицированы второй репортерной группой, где комбинация репортерных групп нуклеиновых кислот является уникальной по отношению к каждой единичной клетке или ядру.28. A composition containing a plurality of lysed single cells or nuclei, where each lysed single cell or nucleus contains a plurality of nucleic acids, where at least some of the nucleic acids of each lysed single cell or nucleus contains a first reporter group, where two or more lysed cells or nuclei are present in the compartment, and the nucleic acids are present on a solid support providing CE, where the nucleic acids are modified with a second reporter group, where the combination of nucleic acid reporter groups is unique with respect to each single cell or nucleus.
29. Композиция по п. 28, где компартмент представляет собой каплю или микролунку.29. The composition of claim 28, wherein the compartment is a drop or microwell.
30. Композиция по п. 28, где твердая подложка представляет собой гранулу или гранулу, содержащую метку.30. The composition of claim 28, wherein the solid support is a bead or bead containing a label.
31. Композиция по п. 30, где гранула имеет размер приблизительно 10-200 мкм.31. The composition according to claim 30, wherein the granule has a size of approximately 10-200 microns.