Claims (31)
1. Линия клеток, содержащая эндогенный ген дегидрооротатдегидрогеназы (DHODH), который частично или полностью инактивирован.1. A cell line containing an endogenous dehydroorotate dehydrogenase (DHODH) gene that is partially or completely inactivated.
2. Линия клеток по п. 1, которая представляет собой линию клеток яичника китайского хомячка (СНО).2. The cell line of claim 1, which is a Chinese Hamster Ovary (CHO) cell line.
3. Линия клеток по п. 1 или 2, которая получена путем3. A cell line according to claim 1 or 2, which is obtained by
a) инактивации эндогенного гена DHODH в клетке иa) inactivation of the endogenous DHODH gene in the cell, and
b) культивирования клетки в культуральной среде, содержащей уридин, в условиях, подходящих для создания линии клеток, в которой эндогенный ген DHODH частично или полностью инактивирован.b) culturing the cell in a culture medium containing uridine under conditions suitable for establishing a cell line in which the endogenous DHODH gene is partially or completely inactivated.
4. Линия клеток по п. 3, в которой эндогенный ген DHODH инактивирован с помощью метода редактирования генов.4. A cell line according to claim 3, in which the endogenous DHODH gene is inactivated using a gene editing method.
5. Линия клеток по п. 4, в которой эндогенный ген DHODH инактивирован с помощью метода с использованием системы CRISPR-Cas9.5. A cell line according to claim 4, wherein the endogenous DHODH gene is inactivated by the method using the CRISPR-Cas9 system.
6. Линия клеток по любому из пп. 1-5, в которой одна или более или все аллели эндогенного гена DHODH частично или полностью инактивированы.6. Cell line according to any one of paragraphs. 1-5, in which one or more or all alleles of the endogenous DHODH gene are partially or completely inactivated.
7. Линия клеток по любому из пп. 1-6, которая содержит, кроме того, экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую экзогенную DHODH млекопитающего, и по крайней мере одну экспрессионную кассету для экспрессии рекомбинантного белка, причем указанная экзогенная DHODH включает последовательность, идентичную на по крайней мере 60% последовательности SEQ ID NO:2 или последовательности SEQ ID NO:4.7. Cell line according to any one of paragraphs. 1-6, which further comprises an expression vector containing a nucleotide sequence encoding exogenous mammalian DHODH and at least one expression cassette for recombinant protein expression, said exogenous DHODH comprising a sequence at least 60% identical to SEQ ID NO:2 or sequence SEQ ID NO:4.
8. Экспрессионная система, включающая:8. Expression system, including:
(i) линию клеток по любому из пп. 1-6 и(i) a cell line according to any one of paragraphs. 1-6 and
(ii) экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую DHODH млекопитающего, и по крайней мере одну экспрессионную кассету для экспрессии рекомбинантного белка, причем указанная DHODH включает последовательность, идентичную на по крайней мере 60% последовательности SEQ ID NO:2 или последовательности SEQ ID NO:4.(ii) an expression vector containing a nucleotide sequence encoding a mammalian DHODH and at least one expression cassette for recombinant protein expression, said DHODH comprising at least 60% sequence identity to SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO :4.
9. Линия клеток по п. 7 или экспрессионная система по п. 8, в которой указанная нуклеотидная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:1 или последовательность SEQ ID NO:3.9. The cell line of claim 7 or the expression system of claim 8, wherein said nucleotide sequence comprises SEQ ID NO:1 or SEQ ID NO:3.
10. Линия клеток по п. 7 или 9 или экспрессионная система по п. 8 или 9, в которой указанный рекомбинантный белок представляет собой моноклональное антитело.10. A cell line according to claim 7 or 9 or an expression system according to claim 8 or 9, wherein said recombinant protein is a monoclonal antibody.
11. Линия клеток по любому из пп. 7, 9 и 10 или экспрессионная система по любому из пп. 8-10, в которой указанный вектор содержит первую экспрессионную кассету, подходящую для клонирования легкой цепи антитела, и вторую экспрессионную кассету, подходящую для клонирования тяжелой цепи антитела.11. Cell line according to any one of paragraphs. 7, 9 and 10 or an expression system according to any one of paragraphs. 8-10, wherein said vector contains a first expression cassette suitable for cloning an antibody light chain and a second expression cassette suitable for cloning an antibody heavy chain.
12. Набор, включающий (i) линию клеток по любому из пп. 7 и 9-11, или экспрессионную систему по любому из пп. 8-11, и (ii) культуральную среду, лишенную уридина, в частности, лишенную, кроме того, ингибитора DHODH.12. A set comprising (i) a cell line according to any one of paragraphs. 7 and 9-11, or an expression system according to any one of paragraphs. 8-11 and (ii) a culture medium devoid of uridine, in particular also devoid of the DHODH inhibitor.
13. Способ продуцирования рекомбинантного белка in vitro, включающий стадии:13. A method for producing a recombinant protein in vitro, comprising the steps:
А a1) предоставления линии клеток по любому из пп. 7 и 9-11;And a1) providing a cell line according to any one of paragraphs. 7 and 9-11;
илиor
а2) предоставления линии клеток по любому из пп. 1-6, иa2) providing a cell line according to any one of paragraphs. 1-6, and
а2') введения экспрессионного вектора, определенного в любом из пп. 9-11, в линию клеток, предоставленную на стадии а2);a2') introducing an expression vector defined in any one of paragraphs. 9-11 to the cell line provided in step a2);
илиor
a3) предоставления линии клеток, содержащей эндогенный ген DHODH,a3) providing a cell line containing the endogenous DHODH gene,
a3') частичной или полной инактивации эндогенного гена DHODH в линии клеток, предоставленной на стадии a3), иa3') partial or complete inactivation of the endogenous DHODH gene in the cell line provided in step a3), and
a3”) введения экспрессионного вектора, определенного в любом из пп. 9-11, в линию клеток, содержащую частично или полностью инактивированный эндогенный ген DHODH, полученный на стадии а3');a3”) introduction of the expression vector defined in any of paragraphs. 9-11 into a cell line containing a partially or completely inactivated endogenous DHODH gene obtained in step a3');
B) культивирования указанной линии клеток в условиях, подходящих для продукции рекомбинантного белка; иB) culturing said cell line under conditions suitable for the production of the recombinant protein; And
C) выделения и/или очистки указанного рекомбинантного белка.C) isolating and/or purifying said recombinant protein.
14. Способ по п. 13, в котором стадию B) проводят в культуральной среде, лишенной уридина, в частности, лишенной, кроме того, ингибитора DHODH.14. The method according to claim 13, wherein step B) is carried out in a culture medium devoid of uridine, in particular also devoid of the DHODH inhibitor.
15. Способ по п. 13 или 14, включающий, кроме того, стадию D) составления указанного рекомбинантного белка в фармацевтическую композицию.15. The method according to claim 13 or 14, further comprising the step D) of formulating said recombinant protein into a pharmaceutical composition.
16. Применение линии клеток по любому из пп. 7 и 9-11, экспрессионной системы по любому из пп. 9-11 или набора по п. 12 для продуцирования рекомбинантного белка.16. The use of a cell line according to any one of paragraphs. 7 and 9-11, the expression system according to any one of paragraphs. 9-11 or a kit according to claim 12 for the production of a recombinant protein.
17. Применение по п. 16, в случае которого линию клеток, экспрессионную систему или набор используют в сочетании с культуральной средой, лишенной уридина, в частности, в отсутствие ингибитора DHODH.17. Use according to claim 16, in which case the cell line, expression system or kit is used in combination with a culture medium devoid of uridine, in particular in the absence of a DHODH inhibitor.