RU2021127294A

RU2021127294A - Скрининговая платформа crispr/cas для идентификации генетических модификаторов засева или агрегации тау-белка

Info

Publication number: RU2021127294A
Application number: RU2021127294A
Authority: RU
Inventors: Марин ПРИССЕТТ; Мэттью КОСС; Вен Фьюри; Брайан Замбрович
Original assignee: Регенерон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2019-03-18
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2023-04-18

Claims

1. Способ скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка, включающий в себя:

(a) обеспечение популяции клеток, содержащих белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером;

(b) введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, которые нацелены на множество генов;

(c) культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности редактирования генома и увеличения числа клеток, при этом указанное множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с указанным белком Cas, а указанный белок Cas расщепляет указанное множество генов, что приводит к нокауту генной функции с образованием генетически модифицированной популяции клеток;

(d) приведение указанной генетически модифицированной популяции клеток в контакт с агентом засева тау-белка для получения засеянной популяции клеток;

(e) культивирование указанной засеянной популяции клеток для обеспечения возможности образования агрегатов тау-белка, при этом агрегаты первого содержащего повторы домена тау-белка и второго содержащего повторы домена тау-белка образуются в субпопуляции указанной засеянной популяции клеток с образованием положительной в отношении агрегации популяции клеток; и

(f) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (e), по сравнению с указанной генетически модифицированной популяцией клеток из стадии (c),

при этом обогащение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (e), по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, усиливает агрегацию тау-белка.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанный белок Cas содержит SEQ ID NO: 21, необязательно отличающийся тем, что указанный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанные белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в популяции клеток.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в популяцию клеток.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный экзон.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный 5'-экзон.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК нацелена на первый экзон, на второй экзон или на третий экзон.

10. Способ скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка, включающий в себя:

(a) обеспечение популяции клеток, содержащих химерный белок Cas, который содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, химерный адаптерный белок, который содержит адаптерный белок, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером;

(c) культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности активации транскрипции и увеличения числа клеток, при этом указанное множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с указанным химерным белком Cas и указанным химерным адаптерным белком, и указанные комплексы активируют транскрипцию указанного множества генов, что приводит к повышенной экспрессии генов с образованием генетически модифицированной популяции клеток;

при этом обогащение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (e), по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, усиливает агрегацию тау-белка.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes.

13. Способ по любому из пп. 10-12, отличающийся тем, что указанный химерный белок Cas содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с доменом активации транскрипции VP64, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный белок Cas содержит, в направлении от N-конца до C-конца: белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью; сигнал ядерной локализации; и домен активатора транскрипции VP64.

14. Способ по любому из пп. 10-13, отличающийся тем, что указанный адаптерный белок представляет собой белок оболочки MS2, и отличающийся тем, что указанные один или большее число доменов активации транскрипции в указанном химерном адаптерном белке содержат домен активации транскрипции p65 и домен активации транскрипции HSF1, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный адаптерный белок содержит, в направлении от N-конца до C-конца: белок оболочки MS2; сигнал ядерной локализации; домен активации транскрипции p65; и домен активации транскрипции HSF1.

15. Способ по любому из пп. 10-14, отличающийся тем, что указанный химерный белок Cas содержит SEQ ID NO: 36, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38.

16. Способ по любому из пп. 10-15, отличающийся тем, что указанный химерный адаптерный белок содержит SEQ ID NO: 37, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный адаптерный белок кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39.

17. Способ по любому из пп. 10-16, отличающийся тем, что указанные химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в популяции клеток.

18. Способ по любому из пп. 10-17, отличающийся тем, что нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в популяцию клеток.

19. Способ по любому из пп. 10-18, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК нацелена на целевую последовательность для гидовой РНК в пределах 200 п. о. в направлении к 5' от сайта начала транскрипции.

20. Способ по любому из пп. 10-19, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК содержит один или большее число адаптер-связывающих элементов, с которыми может специфически связываться указанный химерный адаптерный белок, необязательно при этом каждая гидовая РНК содержит два адаптер-связывающих элемента, с которыми может специфически связываться указанный химерный адаптерный белок, необязательно при этом первый адаптер-связывающий элемент находится внутри первой петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК, а второй адаптер-связывающий элемент находится внутри второй петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК, необязательно при этом указанный адаптер-связывающий элемент содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и

необязательно при этом указанная каждая из одной или большего числа гидовых РНК представляет собой единую гидовую РНК, содержащую часть CRISPR-РНК (крРНК), слитую с частью трансактивирующей CRISPR-РНК (тракрРНК), и указанная первая петля представляет собой тетрапетлю, соответствующую остаткам 13-16 из SEQ ID NO: 17, а указанная вторая петля представляет собой шпильку 2, соответствующую остаткам 53-56 из SEQ ID NO: 17.

21. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (с) имеет продолжительность от около 3 суток до около 9 суток.

22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что стадия (с) имеет продолжительность около 6 суток.

23. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (d) включает в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в присутствии кондиционированной среды, собранной от культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что указанная кондиционированная среда была собрана после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в течение от около 1 суток до около 7 суток.

25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что указанная кондиционированная среда была собрана после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в течение около 4 суток.

26. Способ по любому из пп. 23-25, отличающийся тем, что стадия (d) включает в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в смеси, состоящей на около 75% из кондиционированной среды и на около 25% из свежей среды.

27. Способ по любому из пп. 23-26, отличающийся тем, что указанную генетически модифицированную популяцию клеток не культивируют совместно с указанными клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

28. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (e) имеет продолжительность от около 2 суток до около 6 суток.

29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что стадия (e) имеет продолжительность около 4 суток.

30. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанные первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), и положительная в отношении агрегации популяция клеток на стадии (е) идентифицируется с помощью проточной цитометрии.

31. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что содержание определяется с помощью секвенирования нового поколения.

32. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что гидовая РНК считается обогащенной, если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с).

33. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (f) включает в себя определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) в первый момент времени на стадии (c) и (или) во второй момент времени на стадии (c).

34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что указанный первый момент времени на стадии (с) представляет собой первый пассаж при культивировании популяции клеток, а указанный второй момент времени представляет собой середину периода культивирования популяции клеток, чтобы обеспечить возможность редактирования генома и увеличения числа клеток или активации транскрипции и увеличения числа клеток.

35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что указанный первый момент времени на стадии (с) наступает после около трех суток культивирования, а указанный второй момент времени на стадии (с) наступает после около шести суток культивирования.

36. Способ по любому из пп. 33-35, отличающийся тем, что ген считается генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции указанного гена усиливает агрегацию тау-белка, если:

(1) содержание гидовой РНК, нацеленной на указанный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) как в первый момент времени на стадии (c), так и во второй момент времени на стадии (c); и (или)

(2) содержание по меньшей мере двух уникальных гидовых РНК, нацеленных на указанный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) либо в первый момент времени на стадии (c), либо во второй момент времени на стадии (c).

37. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что на стадии (f) предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение указанного гена усиливает агрегацию тау-белка:

(1) идентификация того, какие из указанного множества уникальных гидовых РНК присутствуют в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (e);

(2) вычисление вероятности случайного присутствия указанных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), с использованием формулы:

nCn’ * (x-n’)C(m-n) / xCm,

где x представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b),

где m представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1),

где n представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b), которые нацелены на указанный ген, и

где n’ представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), которые нацелены на указанный ген;

(3) вычисление средних оценок обогащения для гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1),

при этом указанная оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание указанной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (e), деленное на относительное содержание указанной гидовой РНК в указанной культивируемой популяции клеток из стадии (c), и

при этом указанное относительное содержание представляет собой количество считываний указанной гидовой РНК, деленное на количество считываний всей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК; и

(4) выбор данного гена, если гидовая РНК, нацеленная на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения.

38. Способ скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка, включающий в себя:

(е) культивирование указанной засеянной популяции клеток для обеспечения возможности образования агрегатов тау-белка, при этом агрегаты первого содержащего повторы домена тау-белка и второго содержащего повторы домена тау-белка образуются в субпопуляции указанной засеянной популяции клеток с образованием положительной в отношении агрегации популяции клеток и не образуются во второй субпопуляции указанной засеянной популяции клеток с образованием отрицательной в отношении агрегации популяции клеток; и

(f) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (e), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (e), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), и (или) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (e), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (e), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d),

при этом обогащение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (e), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (e), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), или при этом истощение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (e), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (e), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, предотвращает агрегацию тау-белка, и (или)

при этом обогащение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (e), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (e), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), или при этом истощение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (e), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (e), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует или усиливает агрегацию тау-белка.

39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9.

40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes.

41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что указанный белок Cas содержит SEQ ID NO: 21, необязательно отличающийся тем, что указанный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22.

42. Способ по любому из пп. 38-41, отличающийся тем, что указанные белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в популяции клеток.

43. Способ по любому из пп. 38-42, отличающийся тем, что нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в популяцию клеток.

44. Способ по любому из пп. 38-43, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный экзон.

45. Способ по п. 44, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный 5'-экзон.

46. Способ по любому из пп. 38-45, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК нацелена на первый экзон, на второй экзон или на третий экзон.

47. Способ скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка, включающий в себя:

при этом обогащение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (e), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (e), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), или при этом истощение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (e), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (e), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, предотвращает агрегацию тау-белка, и (или)

при этом обогащение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (e), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (e), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), или при этом истощение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (e), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (e), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует или усиливает агрегацию тау-белка.

48. Способ по п. 47, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9.

49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes.

50. Способ по любому из пп. 47-49, отличающийся тем, что указанный химерный белок Cas содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с доменом активации транскрипции VP64, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный белок Cas содержит, в направлении от N-конца до C-конца: белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью; сигнал ядерной локализации; и домен активатора транскрипции VP64.

51. Способ по любому из пп. 47-50, отличающийся тем, что указанный адаптерный белок представляет собой белок оболочки MS2, и при этом один или большее число доменов активации транскрипции в указанном химерном адаптерном белке содержат домен активации транскрипции p65 и домен активации транскрипции HSF1, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный адаптерный белок содержит, в направлении от N-конца до C-конца: белок оболочки MS2; сигнал ядерной локализации; домен активации транскрипции p65; и домен активации транскрипции HSF1.

52. Способ по любому из пп. 47-51, отличающийся тем, что указанный химерный белок Cas содержит SEQ ID NO: 36, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38.

53. Способ по любому из пп. 47-52, отличающийся тем, что указанный химерный адаптерный белок содержит SEQ ID NO: 37, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный адаптерный белок кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39.

54. Способ по любому из пп. 47-53, отличающийся тем, что указанные химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в популяции клеток.

55. Способ по любому из пп. 47-54, отличающийся тем, что нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в популяцию клеток.

56. Способ по любому из пп. 47-55, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК нацелена на целевую последовательность для гидовой РНК в пределах 200 п. о. в направлении к 5' от сайта начала транскрипции.

57. Способ по любому из пп. 47-56, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК содержит один или большее число адаптер-связывающих элементов, с которыми может специфически связываться указанный химерный адаптерный белок, необязательно при этом каждая гидовая РНК содержит два адаптер-связывающих элемента, с которыми может специфически связываться указанный химерный адаптерный белок, необязательно при этом первый адаптер-связывающий элемент находится внутри первой петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК, а второй адаптер-связывающий элемент находится внутри второй петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК, необязательно при этом указанный адаптер-связывающий элемент содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и

58. Способ по любому из пп. 38-57, отличающийся тем, что стадия (с) имеет продолжительность от около 3 суток до около 13 суток.

59. Способ по п. 58, отличающийся тем, что стадия (c) имеет продолжительность от около 7 суток до около 10 суток, имеет продолжительность около 7 суток или имеет продолжительность около 10 суток.

60. Способ по любому из пп. 38-59, отличающийся тем, что стадия (d) включает в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в присутствии среды, содержащей клеточный лизат из культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

61. Способ по п. 60, отличающийся тем, что указанный клеточный лизат в указанной среде находится в концентрации, составляющей от около 1 мкг/мл до около 5 мкг/мл.

62. Способ по п. 60 или 61, отличающийся тем, что указанная среда, содержащая указанный клеточный лизат, дополнительно содержит липофектамин или другой реагент для трансфекции.

63. Способ по п. 62, отличающийся тем, что указанная среда, содержащая указанный клеточный лизат, содержит липофектамин в концентрации, составляющей от около 1,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл.

64. Способ по любому из пп. 60-63, отличающийся тем, что указанную генетически модифицированную популяцию клеток не культивируют совместно с указанными клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

65. Способ по любому из пп. 38-64, отличающийся тем, что стадия (e) имеет продолжительность от около 1 суток до около 3 суток.

66. Способ по п. 65, отличающийся тем, что стадия (e) имеет продолжительность около 2 суток.

67. Способ по любому из пп. 38-66, отличающийся тем, что указанные первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), а положительная в отношении агрегации тау-белка популяция клеток и отрицательная в отношении агрегации тау-белка популяция клеток на стадии (е) идентифицируются с помощью проточной цитометрии.

68. Способ по любому из пп. 38-67, отличающийся тем, что содержание определяется с помощью секвенирования нового поколения.

69. Способ по любому из пп. 38-68, отличающийся тем, что гидовая РНК считается обогащенной в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e) и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), и при этом гидовая РНК считается истощенной в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e) и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), или

гидовая РНК считается обогащенной в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e) и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), и при этом гидовая РНК считается истощенной в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e) и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d).

70. Способ по любому из пп. 38-69, отличающийся тем, что стадия (f) включает в себя определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) в первый момент времени и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени, и (или) отличающийся тем, что стадия (f) включает в себя определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) в первый момент времени и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени.

71. Способ по п. 70, отличающийся тем, что указанный первый момент времени на стадии (с) представляет собой первый пассаж при культивировании популяции клеток.

72. Способ по п. 71, отличающийся тем, что указанный первый момент времени на стадии (с) наступает после около 3 суток культивирования, а указанный второй момент времени на стадии (с) наступает после около 7 суток культивирования или после около 10 суток культивирования.

73. Способ по любому из пп. 70-72, отличающийся тем, что:

(I) ген считается генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции данного гена предотвращает агрегацию тау-белка, если:

(1) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) в первый момент времени и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени; и (или)

(2) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e) и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени; и (или)

(3) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) в первый момент времени и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени; и (или)

(4) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e) и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени; или

(II) ген считается генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции данного гена способствует или усиливает агрегацию тау-белка, если:

(1) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) в первый момент времени и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени; и (или)

(2) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e) и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени; и (или)

(3) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) в первый момент времени и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени; и (или)

(4) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (e) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e) и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени.

74. Способ по любому из пп. 38-73, отличающийся тем, что:

(I) предпринимаются следующие шаги на стадии (f) для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции данного гена предотвращает агрегацию тау-белка:

(1) идентификация того, какие из указанного множества уникальных гидовых РНК присутствуют в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (e);

nCn’ * (x-n’)C(m-n) / xCm,

при этом указанная оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (e), деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (e), или указанной засеянной популяции клеток, полученной на стадии (d), и

(4) выбор данного гена, если гидовая РНК, нацеленная на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения; или

(II) предпринимаются следующие шаги на стадии (f) для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции данного гена способствует или усиливает агрегацию тау-белка:

(2) вычисление вероятности случайного присутствия указанных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), с использованием формулы: nCn’ * (x-n’)C(m-n) / xCm,

при этом указанная оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (e), деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (e), или указанной засеянной популяции клеток, полученной на стадии (d), и

75. Способ скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка и (или) дезагрегации тау-белка, включающий в себя:

(a) обеспечение популяции клеток, содержащих белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, при этом указанные клетки являются положительными в отношении агрегации тау-белка клетками, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии;

(c) культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности редактирования генома и увеличения числа клеток, при этом указанное множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с указанным белком Cas, а указанный белок Cas расщепляет указанное множество генов, что приводит к нокауту генной функции с образованием генетически модифицированной популяции клеток, и при этом указанное культивирование приводит к образованию положительной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток и отрицательной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток;

(d) идентификацию указанной положительной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток и указанной отрицательной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток; и

(e) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (c), и (или) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (c),

при этом обогащение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (c), или при этом истощение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (c), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором дезагрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует дезагрегации тау-белка, и (или)

при этом обогащение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (c), или при этом истощение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (c), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует или усиливает агрегацию тау-белка.

76. Способ по п. 75, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9.

77. Способ по п. 76, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes.

78. Способ по п. 77, отличающийся тем, что указанный белок Cas содержит SEQ ID NO: 21, необязательно отличающийся тем, что указанный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22.

79. Способ по любому из пп. 75-78, отличающийся тем, что указанные белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в популяции клеток.

80. Способ по любому из пп. 75-79, отличающийся тем, что нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в популяцию клеток.

81. Способ по любому из пп. 75-80, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный экзон.

82. Способ по п. 81, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный 5'-экзон.

83. Способ по любому из пп. 75-82, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК нацелена на первый экзон, на второй экзон или на третий экзон.

84. Способ скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка и (или) дезагрегации тау-белка, включающий в себя:

(a) обеспечение популяции клеток, содержащих химерный белок Cas, содержащий белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, химерный адаптерный белок, содержащий адаптерный белок, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, при этом указанные клетки являются положительными в отношении агрегации тау-белка клетками, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии;

(c) культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности активации транскрипции и увеличения числа клеток, при этом указанное множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с указанным химерным белком Cas и указанным химерным адаптерным белком, и указанные комплексы активируют транскрипцию указанного множества генов, что приводит к повышенной генной экспрессии с образованием генетически модифицированной популяции клеток, и при этом указанное культивирование приводит к образованию положительной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток и отрицательной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток;

при этом обогащение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (c), или при этом истощение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (c), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором дезагрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует дезагрегации тау-белка, и (или)

при этом обогащение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (c), или при этом истощение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (c), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует или усиливает агрегацию тау-белка.

85. Способ по п. 84, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9.

86. Способ по п. 85, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes.

87. Способ по любому из пп. 84-86, отличающийся тем, что указанный химерный белок Cas содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с доменом активации транскрипции VP64, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный белок Cas содержит, в направлении от N-конца до C-конца: белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью; сигнал ядерной локализации; и домен активатора транскрипции VP64.

88. Способ по любому из пп. 84-87, отличающийся тем, что указанный адаптерный белок представляет собой белок оболочки MS2, и при этом один или большее число доменов активации транскрипции в указанном химерном адаптерном белке содержат домен активации транскрипции p65 и домен активации транскрипции HSF1, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный адаптерный белок содержит, в направлении от N-конца до C-конца: белок оболочки MS2; сигнал ядерной локализации; домен активации транскрипции p65; и домен активации транскрипции HSF1.

89. Способ по любому из пп. 84-88, отличающийся тем, что указанный химерный белок Cas содержит SEQ ID NO: 36, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38.

90. Способ по любому из пп. 84-89, отличающийся тем, что указанный химерный адаптерный белок содержит SEQ ID NO: 37, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный адаптерный белок кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39.

91. Способ по любому из пп. 84-90, отличающийся тем, что указанные химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в популяции клеток.

92. Способ по любому из пп. 84-91, отличающийся тем, что нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в популяцию клеток.

93. Способ по любому из пп. 84-92, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК нацелена на целевую последовательность для гидовой РНК в пределах 200 п. о. в направлении к 5' от сайта начала транскрипции.

94. Способ по любому из пп. 84-93, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК содержит один или большее число адаптер-связывающих элементов, с которыми может специфически связываться указанный химерный адаптерный белок, необязательно при этом каждая гидовая РНК содержит два адаптер-связывающих элемента, с которыми может специфически связываться указанный химерный адаптерный белок, необязательно при этом первый адаптер-связывающий элемент находится внутри первой петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК, а второй адаптер-связывающий элемент находится внутри второй петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК, необязательно при этом указанный адаптер-связывающий элемент содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и

95. Способ по любому из пп. 75-94, отличающийся тем, что стадия (с) имеет продолжительность от около 3 суток до около 14 суток.

96. Способ по п. 95, отличающийся тем, что стадия (c) имеет продолжительность от около 10 суток до около 14 суток.

97. Способ по любому из пп. 75-96, отличающийся тем, что стадия (d) включает в себя синхронизацию прохождения клеточного цикла для получения популяции клеток, преимущественно обогащенной в S-фазе.

98. Способ по п. 97, отличающийся тем, что указанная синхронизация достигается с помощью двойного тимидинового блока.

99. Способ по любому из пп. 75-98, отличающийся тем, что указанные первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), а положительная в отношении агрегации тау-белка популяция клеток и отрицательная в отношении агрегации тау-белка популяция клеток на стадии (d) идентифицируются с помощью проточной цитометрии.

100. Способ по любому из пп. 75-99, отличающийся тем, что содержание определяется с помощью секвенирования нового поколения.

101. Способ по любому из пп. 75-100, отличающийся тем, что гидовая РНК считается обогащенной в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (c), и при этом гидовая РНК считается истощенной в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (c), или

отличающийся тем, что гидовая РНК считается обогащенной в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (c), и при этом гидовая РНК считается истощенной в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (c).

102. Способ по любому из пп. 75-101, отличающийся тем, что стадия (e) включает в себя определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) в первый момент времени и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) во второй момент времени, и (или) при этом стадия (e) включает в себя определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (e), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) в первый момент времени и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) во второй момент времени.

103. Способ по п. 102, отличающийся тем, что указанный первый момент времени на стадии (с) представляет собой первый пассаж при культивировании популяции клеток, а указанный второй момент времени представляет собой середину периода культивирования популяции клеток, чтобы обеспечить возможность редактирования генома и увеличения числа клеток или активации транскрипции и увеличения числа клеток.

104. Способ по п. 103, отличающийся тем, что указанный первый момент времени на стадии (с) наступает после около 7 суток культивирования, а указанный второй момент времени на стадии (с) наступает после около 10 суток культивирования.

105. Способ по любому из пп. 102-104, отличающийся тем, что:

(I) ген считается генетическим модификатором дезагрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции данного гена способствует дезагрегации тау-белка, если:

(1) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) в первый момент времени и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) во второй момент времени; и (или)

(2) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) во второй момент времени; и (или)

(3) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) в первый момент времени и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) во второй момент времени; и (или)

(4) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) во второй момент времени; или

(1) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) в первый момент времени и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) во второй момент времени; и (или)

(2) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) во второй момент времени; и (или)

(3) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) в первый момент времени и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) во второй момент времени; и (или)

(4) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (c) во второй момент времени.

106. Способ по любому из пп. 75-105, отличающийся тем, что:

(I) предпринимаются следующие шаги на стадии (e) для идентификации гена как генетического модификатора дезагрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции данного гена способствует дезагрегации тау-белка:

(1) идентификация того, какие из указанного множества уникальных гидовых РНК присутствуют в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d);

(2) вычисление вероятности случайного присутствия указанных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (e) (1), с использованием формулы:

nCn’ * (x-n’)C(m-n) / xCm,

где m представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (e) (1),

где n’ представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (e) (1), которые нацелены на указанный ген;

(3) вычисление средних оценок обогащения для гидовых РНК, идентифицированных на стадии (e) (1),

при этом указанная оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), или культивируемой популяции клеток из стадии (c) в первый момент времени или во второй момент времени, и

(4) выбор данного гена, если гидовая РНК, нацеленная на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения, или

(II) предпринимаются следующие шаги на стадии (e) для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции данного гена способствует или усиливает агрегацию тау-белка:

(1) идентификация того, какие из указанного множества уникальных гидовых РНК присутствуют в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d);

nCn’ * (x-n’)C(m-n) / xCm,

при этом указанная оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), или культивируемой популяции клеток из стадии (c) в первый момент времени или во второй момент времени, и

107. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) указанный второй содержащий повторы домен тау-белка представляют собой содержащий повторы домен тау-белка человека.

108. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) указанный второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию, способствующую агрегации.

109. Способ по п. 108, отличающийся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) указанный второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию тау-белка P301S.

110. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) указанный второй содержащий повторы домен тау-белка содержат домен тау-белка с четырьмя повторами.

111. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) указанный второй содержащий повторы домен тау-белка содержат SEQ ID NO: 11.

112. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и указанный второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми.

113. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и указанный второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми, и каждый из них содержит домен тау-белка с четырьмя повторами, содержащий мутацию тау-белка P301S.

114. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный первый репортер и указанный второй репортер представляют собой флуоресцентные белки.

115. Способ по п. 114, отличающийся тем, что указанный первый репортер и указанный второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET).

116. Способ по п. 115, отличающийся тем, что указанный первый репортер представляет собой голубой флуоресцентный белок (CFP), а указанный второй репортер представляет собой желтый флуоресцентный белок (YFP).

117. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанные клетки представляют собой эукариотические клетки.

118. Способ по п. 117, отличающийся тем, что указанные клетки представляют собой клетки млекопитающих.

119. Способ по п. 118, отличающийся тем, что указанные клетки представляют собой клетки человека.

120. Способ по п. 119, отличающийся тем, что указанные клетки представляют собой клетки HEK293T.

121. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанное множество уникальных гидовых РНК вводят в концентрации, выбранной таким образом, чтобы большинство клеток получали только по одной из уникальных гидовых РНК.

122. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанное множество уникальных гидовых РНК нацелено на 100 или большее число генов, 1000 или большее число генов, или 10000 или большее число генов.

123. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная библиотека является полногеномной библиотекой.

124. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что нацеливание происходит в среднем на множество целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов.

125. Способ по п. 124, отличающийся тем, что нацеливание происходит в среднем на по меньшей мере три целевых последовательности в каждом из целевого множества генов.

126. Способ по п. 125, отличающийся тем, что нацеливание происходит в среднем на от около трех до около шести целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов.

127. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанное множество уникальных гидовых РНК вводят в популяцию клеток с помощью вирусной трансдукции.

128. Способ по п. 127, отличающийся тем, что каждое из указанного множества уникальных гидовых РНК находится в отдельном вирусном векторе.

129. Способ по п. 127 или 128, отличающийся тем, что указанное множество уникальных гидовых РНК вводят в популяцию клеток с помощью лентивирусной трансдукции.

130. Способ по любому из пп. 127-129, отличающийся тем, что указанная популяция клеток инфицирована с показателем множественности заражения, составляющим меньше чем около 0,3.

131. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанное множество уникальных гидовых РНК вводят в указанную популяцию клеток вместе с маркером отбора, и стадия (b) дополнительно включает в себя отбор клеток, которые содержат маркер отбора.

132. Способ по п. 131, отличающийся тем, что указанный маркер отбора придает устойчивость к лекарственному средству, необязательно отличающийся тем, что указанный маркер отбора придает устойчивость к пуромицину или зеоцину.

133. Способ по п. 132, отличающийся тем, что указанный маркер отбора выбран из неомицинфосфотрансферазы, гигромицин-B-фосфотрансферазы, пуромицин-N-ацетилтрансферазы и бластицидин-S-дезаминазы.

134. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная популяция клеток, в которую на стадии (b) вводят указанное множество уникальных гидовых РНК, включает в себя больше чем около 300 клеток на уникальную гидовую РНК.

135. Популяция из одной или большего числа клеток, содержащих белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером.

136. Популяция клеток по п. 135, отличающаяся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9.

137. Популяция клеток по п. 136, отличающаяся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes.

138. Популяция клеток по п. 137, отличающаяся тем, что указанный белок Cas содержит SEQ ID NO: 21, необязательно отличающаяся тем, что указанный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22.

139. Популяция клеток по любому из пп. 135-138, отличающаяся тем, что указанные белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в указанной клетке.

140. Популяция клеток по любому из пп. 135-139, отличающаяся тем, что нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в указанную клетку.

141. Популяция из одной или большего числа клеток, содержащих химерный белок Cas, содержащий белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, химерный адаптерный белок, содержащий адаптерный белок, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером.

142. Популяция клеток по п. 141, отличающаяся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9.

143. Популяция клеток по п. 142, отличающаяся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes.

144. Популяция клеток по любому из пп. 141-143, отличающаяся тем, что указанный химерный белок Cas содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с доменом активации транскрипции VP64, необязательно отличающаяся тем, что указанный химерный белок Cas содержит, в направлении от N-конца до C-конца: белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью; сигнал ядерной локализации; и домен активатора транскрипции VP64.

145. Популяция клеток по любому из пп. 141-144, отличающаяся тем, что указанный адаптерный белок представляет собой белок оболочки MS2, и при этом один или большее число доменов активации транскрипции в указанном химерном адаптерном белке содержат домен активации транскрипции p65 и домен активации транскрипции HSF1, необязательно отличающаяся тем, что указанный химерный адаптерный белок содержит, в направлении от N-конца до C-конца: белок оболочки MS2; сигнал ядерной локализации; домен активации транскрипции p65; и домен активации транскрипции HSF1.

146. Популяция клеток по любому из пп. 141-145, отличающаяся тем, что указанный химерный белок Cas содержит SEQ ID NO: 36, необязательно отличающаяся тем, что указанный химерный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38.

147. Популяция клеток по любому из пп. 141-146, отличающаяся тем, что указанный химерный адаптерный белок содержит SEQ ID NO: 37, необязательно отличающаяся тем, что указанный химерный адаптерный белок кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39.

148. Популяция клеток по любому из пп. 141-147, отличающаяся тем, что указанные химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в указанной клетке.

149. Популяция клеток по любому из пп. 141-148, отличающаяся тем, что нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в указанную клетку.

150. Популяция клеток по любому из пп. 135-149, отличающаяся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) указанный второй содержащий повторы домен тау-белка представляют собой содержащий повторы домен тау-белка человека.

151. Популяция клеток по любому из пп. 135-150, отличающаяся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) указанный второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию, способствующую агрегации.

152. Популяция клеток по п. 151, отличающаяся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) указанный второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию тау-белка P301S.

153. Популяция клеток по любому из пп. 135-152, отличающаяся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) указанный второй содержащий повторы домен тау-белка содержат домен тау-белка с четырьмя повторами.

154. Популяция клеток по любому из пп. 135-153, отличающаяся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) указанный второй содержащий повторы домен тау-белка содержат SEQ ID NO: 11.

155. Популяция клеток по любому из пп. 135-154, отличающаяся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и указанный второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми.

156. Популяция клеток по любому из пп. 135-155, отличающаяся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и указанный второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми, и каждый из них содержит домен тау-белка с четырьмя повторами, содержащий мутацию тау-белка P301S.

157. Популяция клеток по любому из пп. 135-156, отличающаяся тем, что указанный первый репортер и указанный второй репортер представляют собой флуоресцентные белки.

158. Популяция клеток по п. 157, отличающаяся тем, что указанный первый репортер и указанный второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET).

159. Популяция клеток по п. 158, отличающаяся тем, что указанный первый репортер представляет собой голубой флуоресцентный белок (CFP), а указанный второй репортер представляет собой желтый флуоресцентный белок (YFP).

160. Популяция клеток по любому из пп. 135-159, отличающаяся тем, что указанные клетки представляют собой эукариотические клетки.

161. Популяция клеток по п. 160, отличающаяся тем, что указанные клетки представляют собой клетки млекопитающих.

162. Популяция клеток по п. 161, отличающаяся тем, что указанные клетки представляют собой клетки человека.

163. Популяция клеток по п. 162, отличающаяся тем, что указанные клетки представляют собой клетки HEK293T.

164. Популяция клеток по любому из пп. 135-163, отличающаяся тем, что указанные клетки находятся in vitro.

165. Популяция клеток по любому из пп. 135-164, отличающаяся тем, что указанные первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, не присутствуют стабильно в агрегированном состоянии.

166. Популяция клеток по любому из пп. 135-165, отличающаяся тем, что указанные первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, присутствуют стабильно в агрегированном состоянии.

167. Культура in vitro, содержащая указанную популяцию клеток по любому из пп. 135-166, и культуральную среду, содержащую кондиционированную среду, собранную от культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

168. Культура in vitro по п. 167, отличающаяся тем, что указанная кондиционированная среда была собрана после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в течение от около 1 суток до около 7 суток.

169. Культура in vitro по п. 168, отличающаяся тем, что указанная кондиционированная среда была собрана после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в течение около 4 суток.

170. Культура in vitro по любому из пп. 167-169, отличающаяся тем, что указанная культуральная среда содержит около 75% кондиционированной среды и около 25% свежей среды.

171. Культура in vitro по любому из пп. 167-170, отличающаяся тем, что указанную популяцию клеток не культивируют совместно с культивируемыми клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

172. Культура in vitro, содержащая указанную популяцию клеток по любому из пп. 135-166, и культуральную среду, содержащую клеточный лизат из культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

173. Культура in vitro по п. 172, отличающаяся тем, что указанный клеточный лизат в указанной среде находится в концентрации, составляющей от около 1 мкг/мл до около 5 мкг/мл.

174. Культура in vitro по п. 173, отличающаяся тем, что указанная среда, содержащая указанный клеточный лизат, дополнительно содержит липофектамин или другой реагент для трансфекции.

175. Культура in vitro по п. 174, отличающаяся тем, что указанная среда, содержащая указанный клеточный лизат, содержит липофектамин в концентрации, составляющей от около 1,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл.

176. Культура in vitro по любому из пп. 172-175, отличающаяся тем, что указанный клеточный лизат получали с помощью воздействия ультразвуком на указанные положительные в отношении агрегации тау-белка клетки в течение от около 2 минут до около 4 минут после сбора клеток в буфере, содержащем ингибиторы протеаз.

177. Способ получения кондиционированной среды для индукции агрегации тау-белка, включающий в себя:

(a) обеспечение популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии;

(b) культивирование указанной популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток в среде для получения кондиционированной среды; и

(c) сбор указанной кондиционированной среды.

178. Способ по п. 177, отличающийся тем, что указанные положительные в отношении агрегации тау-белка клетки культивируют на стадии (b) до конфлюентности.

179. Способ по п. 178, отличающийся тем, что указанную кондиционированную среду собирают после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, на стадии (с) в течение от около 1 суток до около 7 суток.

180. Способ по п. 179, отличающийся тем, что указанную кондиционированную среду собирают после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, на стадии (с) в течение около 4 суток.

181. Способ создания популяции клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, включающий в себя:

(a) получение кондиционированной среды для индукции агрегации тау-белка в соответствии со способом по любому из пп. 177-180; и

(b) культивирование популяции клеток, содержащих белок, содержащий домен тау-белка, содержащий повторы, в культуральной среде, содержащей кондиционированную среду, для получения популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток.

182. Способ по п. 181, отличающийся тем, что указанная культуральная среда содержит около 75% кондиционированной среды и около 25% свежей среды.

183. Способ по п. 181 или 182, отличающийся тем, что указанную популяцию клеток не культивируют совместно с указанными клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, используемыми в способе получения указанной кондиционированной среды.

184. Способ по любому из пп. 181-183, отличающийся тем, что указанный содержащий повторы домен тау-белка содержит мутацию, способствующую агрегации.

185. Способ по любому из пп. 181-184, отличающийся тем, что указанный содержащий повторы домен тау-белка содержит мутацию тау-белка P301S.

186. Способ по любому из пп. 181-185, отличающийся тем, что указанный содержащий повторы домен тау-белка содержит домен тау-белка с четырьмя повторами.

187. Способ по любому из пп. 181-186, отличающийся тем, что указанный содержащий повторы домен тау-белка содержит SEQ ID NO: 11.

188. Способ получения среды, содержащей клеточный лизат из культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, для индукции агрегации тау-белка, включающий в себя:

(b) сбор указанных положительных в отношении агрегации тау-белка клеток в буфере, содержащем ингибиторы протеаз;

(c) воздействие ультразвуком на указанные положительные в отношении агрегации тау-белка клетки в течение от около 2 минут до около 4 минут для получения указанного клеточного лизата; и

(d) добавление указанного клеточного лизата к среде для выращивания клеток.

189. Способ по п. 188, отличающийся тем, что указанный клеточный лизат в указанной среде для выращивания клеток находится в концентрации, составляющей от около 1 мкг/мл до около 5 мкг/мл.

190. Способ по п. 189, дополнительно включающий в себя добавление липофектамина или другого реагента для трансфекции в указанную среду для выращивания клеток на стадии (d).

191. Способ культивирования по п. 190, отличающийся тем, что указанная стадия (d) включает в себя добавление липофектамина в концентрации, составляющей от около 1,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл.

192. Способ создания популяции клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, включающий в себя:

(a) получение среды, содержащей клеточный лизат из культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в соответствии со способом по любому из пп. 188-191; и

(b) культивирование популяции клеток, содержащих белок, который содержит домен тау-белка, содержащий повторы, в указанной среде, содержащей клеточный лизат из культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка.

193. Способ по п. 192, отличающийся тем, что указанную популяцию клеток не культивируют совместно с указанными клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, используемыми в способе получения указанной кондиционированной среды.

194. Способ по п. 192 или 193, отличающийся тем, что указанный содержащий повторы домен тау-белка содержит мутацию, способствующую агрегации.

195. Способ по любому из пп. 192-194, отличающийся тем, что указанный содержащий повторы домен тау-белка содержит мутацию тау-белка P301S.

196. Способ по любому из пп. 192-195, отличающийся тем, что указанный содержащий повторы домен тау-белка содержит домен тау-белка с четырьмя повторами.

197. Способ по любому из пп. 192-196, отличающийся тем, что указанный содержащий повторы домен тау-белка содержит SEQ ID NO: 11.