Claims (81)
1. Способ ex vivo экспансии естественных клеток-киллеров (NK), включающий:1. Method for ex vivo expansion of natural killer (NK) cells, comprising:
(a) получение исходной популяции мононуклеарных клеток (MNC) из пуповинной крови;(a) obtaining the initial population of mononuclear cells (MNC) from umbilical cord blood;
(b) стимуляцию MNC в присутствии антигенпрезентирующих клеток (APC) и IL-2; и(b) MNC stimulation in the presence of antigen presenting cells (APC) and IL-2; and
(c) повторную стимуляцию клеток с использованием APC с получением размноженных NK-клеток, при этом способ осуществляют в биореакторе, и он соответствует правилам производства и контроля качества лекарственных средств (GMP).(c) re-stimulating the cells using APC to produce expanded NK cells, the method being carried out in a bioreactor and complying with GMP regulations.
2. Способ по п. 1, при этом способ дополнительно включает истощение клеток, положительных в отношении CD3.2. The method of claim 1, wherein the method further comprises depleting CD3 positive cells.
3. Способ по п. 2, где истощение осуществляют между стадиями (b) и (c).3. The method of claim. 2, where the depletion is carried out between stages (b) and (c).
4. Способ по п. 3, где клетки удаляют из биореактора.4. The method of claim 3 wherein the cells are removed from the bioreactor.
5. Способ по п. 1, где получение исходной популяции MNC из пуповинной крови включает размораживание пуповинной крови в присутствии декстрана, человеческого сывороточного альбумина (HSA), ДНКазы и/или хлорида магния.5. The method of claim 1, wherein obtaining an initial population of MNCs from cord blood comprises thawing the cord blood in the presence of dextran, human serum albumin (HSA), DNase, and/or magnesium chloride.
6. Способ по п. 1, где получение исходной популяции MNC из пуповинной крови включает размораживание пуповинной крови в присутствии декстрана и ДНКазы.6. The method of claim. 1, where obtaining the initial population of MNC from cord blood includes thawing cord blood in the presence of dextran and DNase.
7. Способ по п. 5, где пуповинную кровь промывают в присутствии 10% декстрана.7. The method according to p. 5, where the cord blood is washed in the presence of 10% dextran.
8. Способ по п. 5 или 7, где пуповинную кровь суспендируют в присутствии хлорида магния.8. The method according to claim 5 or 7, wherein the cord blood is suspended in the presence of magnesium chloride.
9. Способ по п. 8, где хлорид магния присутствует при концентрации 200 мМ.9. The method of claim 8 wherein magnesium chloride is present at a concentration of 200 mM.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где получение включает осуществление центрифугирования в градиенте плотности фиколла с получением мононуклеарных клеток (MNC).10. The method according to any one of paragraphs. 1-9, wherein the preparation comprises performing ficoll density gradient centrifugation to obtain mononuclear cells (MNC).
11. Способ по любому из пп. 1-10, при этом способ не включает удаление или добавление каких-либо компонентов среды на стадии (b).11. The method according to any one of paragraphs. 1-10, wherein the method does not include the removal or addition of any media components in step (b).
12. Способ по любому из пп. 1-11, где биореактор представляет собой газопроницаемый биореактор.12. The method according to any one of paragraphs. 1-11, where the bioreactor is a gas permeable bioreactor.
13. Способ по п. 12, где газопроницаемый биореактор представляет собой G-Rex100M.13. The method of claim 12 wherein the gas permeable bioreactor is G-Rex100M.
14. Способ по п. 13, где стимуляцию на стадии (b) осуществляют в 3-5 л среды.14. The method according to p. 13, where the stimulation in stage (b) is carried out in 3-5 liters of medium.
15. Способ по любому из пп. 1-13, где APC подвергают гамма-облучению.15. The method according to any one of paragraphs. 1-13, where the APC is subjected to gamma irradiation.
16. Способ по п. 15, где APC сконструированы для экспрессии мембраносвязанного IL-21 (mbIL-21).16. The method of claim 15 wherein the APCs are engineered to express membrane-bound IL-21 (mbIL-21).
17. Способ по любому из пп. 1-16, где APC сконструированы для экспрессии IL-21, IL-15, IL-7, IL-18 и/или IL-2.17. The method according to any one of paragraphs. 1-16, where the APCs are engineered to express IL-21, IL-15, IL-7, IL-18 and/or IL-2.
18. Способ по любому из пп. 1-16, где MNC и APC культивируют при соотношении 1:2.18. The method according to any one of paragraphs. 1-16, where MNC and APC are cultured at a ratio of 1:2.
19. Способ по любому из пп. 1-18, где IL-2 присутствует при концентрации 50-200 МЕ/мл.19. The method according to any one of paragraphs. 1-18, where IL-2 is present at a concentration of 50-200 IU/ml.
20. Способ по п. 19, где IL-2 присутствует при концентрации 100 МЕ/мл.20. The method of claim 19, wherein the IL-2 is present at a concentration of 100 IU/mL.
21. Способ по любому из пп. 1-20, где IL-2 пополняют через каждые 2-3 дня.21. The method according to any one of paragraphs. 1-20 where IL-2 is replenished every 2-3 days.
22. Способ по любому из пп. 1-20, где стадию (b) осуществляют в течение 6-8 дней.22. The method according to any one of paragraphs. 1-20, where stage (b) is carried out within 6-8 days.
23. Способ по п. 22, где стадию (b) осуществляют в течение 7 дней.23. The method according to p. 22, where stage (b) is carried out within 7 days.
24. Способ по любому из пп. 1-23, где стадия (b) не включает расщепление клеток.24. The method according to any one of paragraphs. 1-23, where step (b) does not include cell splitting.
25. Способ по п. 24, где к клеткам два раза добавляют IL-2.25. The method of claim 24 wherein IL-2 is added to the cells twice.
26. Способ по любому из пп. 1-25, при этом способ включает использование 3, 4, 5 или 6 биореакторов.26. The method according to any one of paragraphs. 1-25, wherein the method includes the use of 3, 4, 5 or 6 bioreactors.
27. Способ по п. 26, при этом способ включает использование меньше чем 10 биореакторов.27. The method of claim 26, wherein the method includes the use of less than 10 bioreactors.
28. Способ по любому из пп. 1-27, где NK-клетки размножаются по меньшей мере 500-кратно, 800-кратно, 1000-кратно, 3000-кратно или 5000-кратно.28. The method according to any one of paragraphs. 1-27, where NK cells multiply at least 500-fold, 800-fold, 1000-fold, 3000-fold, or 5000-fold.
29. Способ по любому из пп. 1-28, где культивирование NK-клеток в биореакторе дает более чем 1000-кратное количество NK-клеток по сравнению с статической жидкой культурой.29. The method according to any one of paragraphs. 1-28, where the cultivation of NK cells in a bioreactor yields more than 1000 times the number of NK cells compared to static liquid culture.
30. Способ по любому из пп. 1-29, при этом способ не включает совместимость по человеческому лейкоцитарному антигену (HLA).30. The method according to any one of paragraphs. 1-29, wherein the method does not include human leukocyte antigen (HLA) compatibility.
31. Способ по п. 30, где исходную популяцию NK-клеток не получают от идентичного по гаплотипу донора.31. The method of claim 30, wherein the initial NK cell population is not derived from a haplotype-identical donor.
32. Способ по любому из пп. 1-31, при этом способ осуществляют за меньше чем 15 дней.32. The method according to any one of paragraphs. 1-31, wherein the method is carried out in less than 15 days.
33. Способ по п. 32, при этом способ осуществляют за 14 дней.33. The method according to p. 32, while the method is carried out in 14 days.
34. Способ по любому из пп. 1-33, где размноженные NK-клетки обладают повышенной противоопухолевой активностью по сравнению с NK-клетками, размноженными из периферической крови.34. The method according to any one of paragraphs. 1-33, where expanded NK cells have increased antitumor activity compared to NK cells expanded from peripheral blood.
35. Способ по п. 34, где размноженные NK-клетки имеют более высокую экспрессию генов клеточного цикла, клеточного деления, и/или репликации ДНК по сравнению с NK-клетками, размноженными из периферической крови.35. The method of claim 34, wherein the expanded NK cells have a higher expression of cell cycle, cell division, and/or DNA replication genes compared to NK cells expanded from peripheral blood.
36. Способ по любому из пп. 1-34, где размноженные NK-клетки имеют более высокий пролиферативный потенциал по сравнению с NK-клетками, размноженными из периферической крови.36. The method according to any one of paragraphs. 1-34, where expanded NK cells have a higher proliferative potential compared to NK cells expanded from peripheral blood.
37. Способ любого по п. 1-36, где размноженные NK-клетки не демонстрируют истощения.37. The method of any of claims 1-36 wherein the expanded NK cells do not show depletion.
38. Способ по п. 37, где истощение определяют путем измерения экспрессии перфорина, гранзима, CD57, KLRG1 и PD1.38. The method of claim 37 wherein depletion is determined by measuring the expression of perforin, granzyme, CD57, KLRG1 and PD1.
39. Способ по п. 38, где размноженные NK-клетки имеют высокую экспрессию перфорина и гранзима.39. The method of claim 38, wherein the expanded NK cells have a high expression of perforin and granzyme.
40. Способ по п. 38, где размноженные NK-клетки имеют низкую экспрессию или отсутствие экспрессии CD57, KLRG1 и PD1.40. The method of claim 38, wherein the expanded NK cells have low or no expression of CD57, KLRG1 and PD1.
41. Способ по любому из пп. 1-40, где размноженные NK-клетки включают клинически релевантную дозу.41. The method according to any one of paragraphs. 1-40, where expanded NK cells include a clinically relevant dose.
42. Способ по любому из пп. 1-41, где пуповинная кровь представляет собой замороженную пуповинную кровь.42. The method according to any one of paragraphs. 1-41, where cord blood is frozen cord blood.
43. Способ по п. 42, где замороженная пуповинная кровь была протестирована на инфекционное заболевание.43. The method of claim 42, wherein the frozen cord blood has been tested for an infectious disease.
44. Способ по любому из пп. 1-43, где пуповинная кровь представляет собой объединенную пуповинную кровь.44. The method according to any one of paragraphs. 1-43 where cord blood is pooled cord blood.
45. Способ по п. 44, где пуповинная кровь является объединенной из 3, 4, 5, 6, 7 или 8 отдельных единиц пуповинной крови.45. The method of claim 44 wherein the cord blood is pooled from 3, 4, 5, 6, 7, or 8 individual cord blood units.
46. Способ по любому из пп. 1-45, где NK-клетки не являются аутологичными.46. The method according to any one of paragraphs. 1-45, where NK cells are not autologous.
47. Способ по любому из пп. 1-46, где NK-клетки не являются аллогенными.47. The method according to any one of paragraphs. 1-46, where NK cells are not allogeneic.
48. Способ по любому из пп. 1-47, где APC представляют собой универсальные антигенпрезентирующие клетки (uAPC).48. The method according to any one of paragraphs. 1-47, where APCs are universal antigen presenting cells (uAPCs).
49. Способ по п. 48, где uAPC сконструированы для экспрессии (1) CD48 и/или CS1 (CD319), (2) мембраносвязанного интерлейкина-21 (mbIL-21) и (3) 41BB лиганда (41BBL).49. The method of claim 48, wherein the uAPCs are engineered to express (1) CD48 and/or CS1 (CD319), (2) membrane-bound interleukin-21 (mbIL-21), and (3) 41BB ligand (41BBL).
50. Способ по п. 48, где uAPC экспрессируют CD48.50. The method of claim 48, wherein the uAPCs express CD48.
51. Способ по п. 48, где uAPC экспрессируют CS1.51. The method of claim 48, wherein the uAPCs express CS1.
52. Способ по п. 48, где uAPC экспрессируют CD48 и CS1.52. The method of claim 48, wherein the uAPCs express CD48 and CS1.
53. Способ по п. 48, где uAPC по существу не имеют экспрессии эндогенных молекул HLA класса I, II или CD1d.53. The method of claim 48, wherein the uAPCs are substantially free of expression of endogenous HLA class I, II, or CD1d molecules.
54. Способ по п. 48, где uAPC экспрессируют ICAM-1 (CD54) и LFA-3 (CD58).54. The method of claim 48, wherein the uAPCs express ICAM-1 (CD54) and LFA-3 (CD58).
55. Способ по любому из пп. 1-54, где uAPC также определены как aAPC, происходящие из лейкозных клеток.55. The method according to any one of paragraphs. 1-54, where uAPCs are also defined as aAPCs derived from leukemic cells.
56. Способ по п. 55, где происходящие из лейкозных клеток aAPC также определены как K562 клетки.56. The method of claim 55, wherein the leukemia-derived aAPCs are also defined as K562 cells.
57. Способ по любому из пп. 1-56, дополнительно включающий криоконсервирование размноженных NK-клеток.57. The method according to any one of paragraphs. 1-56, further comprising cryopreservation of expanded NK cells.
58. Фармацевтическая композиция, содержащая популяцию NK-клеток, полученную способом по любому из пп. 1-57, и фармацевтически приемлемый носитель.58. Pharmaceutical composition containing a population of NK cells obtained by the method according to any one of paragraphs. 1-57, and a pharmaceutically acceptable carrier.
59. Композиция, содержащая эффективное количество NK-клеток, полученных способом по любому из пп. 1-57, для применения в лечении заболевания или расстройства у субъекта.59. Composition containing an effective amount of NK cells obtained by the method according to any one of paragraphs. 1-57 for use in the treatment of a disease or disorder in a subject.
60. Применение композиции, содержащей эффективное количество NK-клеток, полученных способом по любому из пп. 1-57, для лечения иммуноопосредованного расстройства у субъекта.60. The use of a composition containing an effective amount of NK cells obtained by the method according to any one of paragraphs. 1-57, for the treatment of an immune-mediated disorder in a subject.
61. Способ лечения заболевания или расстройства, включающий введение субъекту эффективного количества размноженных NK-клеток по любому из пп. 1-57.61. A method of treating a disease or disorder, comprising administering to a subject an effective amount of expanded NK cells according to any one of paragraphs. 1-57.
62. Способ по п. 61, дополнительно включающий введение химиотерапии.62. The method of claim 61 further comprising administering chemotherapy.
63. Способ по п. 62, где химиотерапию вводят до введения размноженных NK-клеток.63. The method of claim 62, wherein the chemotherapy is administered prior to the introduction of expanded NK cells.
64. Способ по п. 62 или 63, где химиотерапия является миелоаблативной.64. The method of claim 62 or 63, wherein the chemotherapy is myeloablative.
65. Способ по п. 62 или 63, где химиотерапия не является миелоаблативной.65. The method of claim 62 or 63, wherein the chemotherapy is not myeloablative.
66. Способ по п. 62 или 63, где химиотерапия представляет собой лимфоистощающую химиотерапию.66. The method of claim 62 or 63, wherein the chemotherapy is lymph depleting chemotherapy.
67. Способ по п. 66, где лимфоистощающая химиотерапия представляет собой лимфоистощающую химиотерапию на основе флударабина.67. The method of claim 66, wherein the lymph depleting chemotherapy is fludarabine-based lymph depleting chemotherapy.
68. Способ по любому из пп. 62-67, где химиотерапия представляет собой леналидомид.68. The method according to any one of paragraphs. 62-67, where the chemotherapy is lenalidomide.
69. Способ по любому из пп. 62-68, при этом способ не включает осуществления HLA-типирования.69. The method according to any one of paragraphs. 62-68, wherein the method does not include performing HLA typing.
70. Способ по любому из пп. 62-69, где заболевание или расстройство представляет собой иммуноопосредованное расстройство.70. The method according to any one of paragraphs. 62-69, where the disease or disorder is an immune mediated disorder.
71. Способ по п. 70, где иммуноопосредованное расстройство представляет собой аутоиммунное расстройство, болезнь «трансплантат против хозяина», отторжение аллотрансплантата или воспалительное состояние.71. The method of claim 70, wherein the immune-mediated disorder is an autoimmune disorder, graft-versus-host disease, allograft rejection, or an inflammatory condition.
72. Способ по любому из пп. 61-69, где заболевание или расстройство представляет собой рак.72. The method according to any one of paragraphs. 61-69, where the disease or disorder is cancer.
73. Способ по п. 72, где рак представляет собой множественную миелому.73. The method of claim 72 wherein the cancer is multiple myeloma.
74. Способ по любому из пп. 61-73, где у субъекта не развивается болезнь «трансплантат против хозяина» или другая токсичность.74. The method according to any one of paragraphs. 61-73, wherein the subject does not develop graft versus host disease or other toxicity.
75. Способ по любому из пп. 61-74, дополнительно включающий введение эффективного количества по меньшей мере еще одного терапевтического средства.75. The method according to any one of paragraphs. 61-74 further comprising administering an effective amount of at least one other therapeutic agent.
76. Способ по п. 75, где по меньшей мере еще одно терапевтическое средство включает химиотерапию, иммунотерапию, хирургическую операцию, лучевую терапию или биотерапию.76. The method of claim 75, wherein at least one other therapeutic agent comprises chemotherapy, immunotherapy, surgery, radiation therapy, or biotherapy.
77. Способ по п. 75, где NK-клетки и/или по меньшей мере еще одно терапевтическое средство вводят внутривенно, интраперитонеально, интратрахеально, интратуморально, внутримышечно, эндоскопически, внутриочагово, чрескожно, подкожно, регионарно или путем прямой инъекции или перфузии.77. The method of claim 75, wherein the NK cells and/or at least one other therapeutic agent is administered intravenously, intraperitoneally, intratracheally, intratumorally, intramuscularly, endoscopically, intralesionally, transdermally, subcutaneously, regionally, or by direct injection or perfusion.
78. Способ по любому из пп. 75-77, где второе терапевтическое средство включает элотузамаб.78. The method according to any one of paragraphs. 75-77, where the second therapeutic agent includes elotuzamab.