Claims (7)
1. Способ очистки рекомбинантного ромиплостима, полученного в прокариотической системе экспрессии, включающий выделение и отмывку телец включения, рефолдинг белка и хроматографическую очистку, отличающийся тем, что основное удаление контаминирующих примесей клеточных белков, нуклеиновых кислот, липидов и эндотоксинов проводят на стадии выделения телец включения путем их последовательной отмывки, а дополнительное удаление примесей включает проведение 2-х последовательных стадий хроматографии на одном и том же катионообменном сорбенте, где первая стадия является разделяющей, а вторая - полирующей и концентрирующей.1. A method for purifying recombinant romiplostim obtained in a prokaryotic expression system, including isolation and washing of inclusion bodies, protein refolding and chromatographic purification, characterized in that the main removal of contaminating impurities of cellular proteins, nucleic acids, lipids and endotoxins is carried out at the stage of isolation of inclusion bodies by their sequential washing, and the additional removal of impurities includes carrying out 2 successive stages of chromatography on the same cation-exchange sorbent, where the first stage is separating, and the second is polishing and concentrating.
2. Способ по п. 1, где хроматографическую очистку проводят последовательно вначале в режиме проскока на сильном анионообменном сорбенте, с последующей сорбцией целевого белка на аффинном сорбенте, модифицированном рекомбинантным белком А, и далее проводят две стадии хроматографии на катионообменном сорбенте.2. The method according to claim 1, where chromatographic purification is carried out sequentially first in the breakthrough mode on a strong anion-exchange sorbent, followed by sorption of the target protein on an affinity sorbent modified with recombinant protein A, and then two stages of chromatography are carried out on a cation-exchange sorbent.
3. Способ по п. 2, где катионообменный сорбент представляет собой гидрофильную полимерную матрицу с размером частиц приблизительно от 30 мкм до 75 мкм, и размером пор приблизительно 100 нм.3. The method of claim 2, wherein the cation exchange sorbent is a hydrophilic polymeric matrix with a particle size of about 30 µm to 75 µm and a pore size of about 100 nm.
4. Способ по п. 1, где очищенный белок получают переводом в буфер готовой формы гель-фильтрацией.4. The method of claim 1 wherein the purified protein is obtained by gel filtration into a formulation buffer.
5. Способ по п. 1, где буфер для отмывки телец включения содержит Triton Х-100, мочевину, NaCl и ЭДТА.5. The method of claim 1 wherein the inclusion body wash buffer contains Triton X-100, urea, NaCl and EDTA.
6. Способ по п. 1, где буфер для проведения рефолдинга включает 3 mM цистин и 4 mM цистеин.6. The method of claim 1 wherein the refolding buffer comprises 3 mM cystine and 4 mM cysteine.
7. Способ по п. 1, где рефолдинг проводят при концентрации белка от 0,7 до 1 мг/мл.7. The method according to claim 1, where the refolding is carried out at a protein concentration of 0.7 to 1 mg/ml.