Claims (83)
1. Способ обнаружения множества лигандов-мишеней, включающий:1. A method for detecting a plurality of target ligands, including:
(a) получение первой и второй субпопуляций гранул, причем каждая гранула содержит:(a) obtaining first and second subpopulations of granules, each granule containing:
зонд захвата, который специфически связывается с лигандом-мишенью,an capture probe that specifically binds to a target ligand,
первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и 3'-конец штрихкода для связывания с праймером штрихкода, иa first polynucleotide containing a barcode indicating a capture probe and a 3' end of the barcode for binding to the barcode primer, and
второй полинуклеотид, содержащий индекс и 3'-конец индекса для связывания с праймером индекса, причем индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции;a second polynucleotide comprising an index and a 3' end of the index for binding to the index primer, the indices of the first subpopulation being different from those of the second subpopulation;
(b) приведение первых лигандов-мишеней в контакт с зондами захвата первой субпопуляции гранул и приведение вторых лигандов-мишеней в контакт с зондами захвата второй субпопуляции гранул;(b) bringing the first target ligands into contact with the capture probes of the first subset of beads and bringing the second target ligands into contact with the capture probes of the second subset of beads;
(c) распределение на субстрате первой и второй субпопуляций гранул, содержащих специфически связанные первый и второй лиганды-мишени;(c) distribution on the substrate of the first and second subpopulations of granules containing specifically associated first and second target ligands;
(d) обнаружение зондов захвата, специфически связанных с первым и вторым лигандами-мишенями; и(d) detecting capture probes specifically associated with the first and second target ligands; and
(e) декодирование положений гранул, содержащих обнаруженные зонды захвата, на субстрате.(e) decoding the positions of the beads containing the detected capture probes on the substrate.
2. Способ по п. 1, в котором:2. The method according to claim 1, in which:
зонд захвата содержит нуклеиновую кислоту,capture probe contains nucleic acid,
первый и второй лиганды-мишени содержат нуклеиновые кислоты, иthe first and second target ligands contain nucleic acids, and
стадия (d) включает удлинение зондов захвата, специфически связанных с первым и вторым лигандами-мишенями.step (d) involves extending capture probes specifically associated with the first and second target ligands.
3. Способ по п. 2, в котором первый полинуклеотид содержит зонд захвата.3. The method of claim 2, wherein the first polynucleotide comprises a capture probe.
4. Способ по п. 2 или 3, в котором каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул содержит отличающиеся друг от друга нуклеотидные последовательности.4. The method according to claim 2 or 3, wherein each of the capture probes of the first and second bead subpopulations contains different nucleotide sequences from each other.
5. Способ по п. 4, в котором различные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул содержат одни и те же нуклеотидные последовательности.5. The method of claim 4, wherein the different capture probes for the first and second bead subpopulations contain the same nucleotide sequences.
6. Способ по любому из пп. 2-5, в котором зонды захвата содержат нуклеотидную последовательность, способную гибридизоваться с однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) или его комплементом.6. The method according to any one of paragraphs. 2-5, wherein the capture probes contain a nucleotide sequence capable of hybridizing to a single nucleotide polymorphism (SNP) or its complement.
7. Способ по любому из пп. 2-6, в котором стадия (d) включает полимеразное удлинение зондов захвата.7. The method according to any one of paragraphs. 2-6, wherein step (d) comprises polymerase extension of capture probes.
8. Способ по любому из пп. 2-6, в котором стадия (d) включает лигазное удлинение зондов захвата.8. The method according to any one of paragraphs. 2-6 wherein step (d) includes ligation extension of the capture probes.
9. Способ по любому из пп. 2-8, в котором стадия (d) включает однонуклеотидное удлинение зондов захвата.9. The method according to any one of paragraphs. 2-8, wherein step (d) comprises a single nucleotide extension of capture probes.
10. Способ по любому из пп. 2-8, в котором стадия (d) включает удлинение зондов захвата множеством нуклеотидов.10. The method according to any one of paragraphs. 2-8, wherein step (d) comprises extending capture probes with multiple nucleotides.
11. Способ по любому из пп. 2-10, в котором удлиненные зонды захвата содержат обнаруживаемую метку.11. The method according to any one of paragraphs. 2-10, wherein the elongated capture probes contain a detectable label.
12. Способ по п. 1, в котором зонд захвата содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.12. The method of claim 1 wherein the capture probe comprises an antibody or antigen-binding fragment thereof.
13. Способ по п. 12, в котором каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связывается с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями.13. The method of claim 12, wherein each of the capture probes of the first and second bead subpopulations specifically binds to different target ligands.
14. Способ по п. 12 или 13, в котором различные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связываются с одними и теми же лигандами-мишенями.14. The method of claim 12 or 13, wherein different capture probes for the first and second bead subsets specifically bind to the same target ligands.
15. Способ по любому из пп. 12-14, в котором обнаружение предусматривает приведение первого и второго лигандов-мишеней, специфически связанных с зондами захвата, в контакт со вторичным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, причем вторичное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит обнаруживаемую метку.15. The method according to any one of paragraphs. 12-14, wherein detection comprises bringing first and second target ligands specifically associated with capture probes into contact with a secondary antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein the secondary antibody or antigen-binding fragment thereof contains a detectable label.
16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором сайты связывания штрихкодового праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.16. The method according to any one of paragraphs. 1-15, in which the binding sites of the barcode primer contain the same nucleotide sequence.
17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.17. The method according to any one of paragraphs. 1-16, in which the nucleotide sequences of the indices of the first subset of granules contain the same nucleotide sequence and the nucleotide sequences of the indices of the second subset of granules contain the same nucleotide sequence.
18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором нуклеотидные последовательности сайтов связывания индексного праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.18. The method according to any one of paragraphs. 1-17, in which the nucleotide sequences of the binding sites of the index primer contain the same nucleotide sequence.
19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором приведение первого лиганда-мишени в контакт с зондами захвата первой субпопуляции гранул и приведение вторых лигандов-мишеней в контакт с зондами захвата второй субпопуляции гранул осуществляется в разных реакционных объемах.19. The method according to any one of paragraphs. 1-18, wherein the contacting of the first target ligand with the capture probes of the first bead subset and the contacting of the second target ligands with the capture probes of the second bead subset are performed in different reaction volumes.
20. Способ по любому из пп. 1-19, дополнительно включающий объединение первой и второй субпопуляций гранул до распределения на субстрате первой и второй субпопуляций гранул.20. The method according to any one of paragraphs. 1-19, further comprising combining the first and second subpopulations of granules prior to distribution on the substrate of the first and second subpopulations of granules.
21. Способ по любому из пп. 1-19, в котором первую субпопуляцию гранул распределяют на субстрате до распределения на субстрате второй субпопуляции гранул.21. The method according to any one of paragraphs. 1-19, in which the first subpopulation of granules is distributed on the substrate before distribution on the substrate of the second subpopulation of granules.
22. Способ по любому из пп. 1-21, в котором стадию (d) выполняют до стадии (с).22. The method according to any one of paragraphs. 1-21, in which step (d) is performed before step (c).
23. Способ по любому из пп. 1-22, в котором обнаруженные зонды захвата содержат обнаруживаемую метку.23. The method according to any one of paragraphs. 1-22, in which the detected capture probes contain a detectable label.
24. Способ по любому из пп. 1-23, в котором стадия (d) дополнительно включает определение положения обнаруженных зондов захвата на субстрате.24. The method according to any one of paragraphs. 1-23, wherein step (d) further comprises determining the position of the detected capture probes on the substrate.
25. Способ по п. 24, в котором определение положения обнаруженных зондов захвата включает по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза.25. The method of claim 24, wherein determining the position of the detected capture probes comprises at least one round of sequencing by synthesis.
26. Способ по любому из пп. 1-25, в котором стадия (e) включает декодирование положения индексов гранул, содержащих обнаруженный зонд захвата, путем секвенирования индексов на субстрате.26. The method according to any one of paragraphs. 1-25, wherein step (e) includes decoding the position of the indices of the beads containing the detected capture probe by sequencing the indices on the substrate.
27. Способ по любому из пп. 1-26, в котором стадия (e) включает декодирование положения штрихкодов гранул, содержащих обнаруженный зонд захвата, путем секвенирования штрихкодов на субстрате.27. The method according to any one of paragraphs. 1-26, wherein step (e) includes decoding the barcode position of the beads containing the detected capture probe by barcode sequencing on the substrate.
28. Способ по любому из пп. 1-27, в котором проточная кювета содержит субстрат.28. The method according to any one of paragraphs. 1-27, in which the flow cell contains a substrate.
29. Способ по любому из пп. 1-28, в котором распределенные первая и вторая субпопуляции гранул содержат матрицу.29. The method according to any one of paragraphs. 1-28, in which the distributed first and second subpopulations of granules contain a matrix.
30. Способ по любому из пп. 1-29, в котором первый и второй лиганды-мишени получены от разных субъектов.30. The method according to any one of paragraphs. 1-29, in which the first and second target ligands are from different subjects.
31. Способ по любому из пп. 1-30, в котором каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50 отличающихся друг от друга зондов захвата.31. The method according to any one of paragraphs. 1-30, in which each of the first and second subpopulations of beads contains at least 50 distinct capture probes.
32. Способ по любому из пп. 1-31, дополнительно включающий по меньшей мере 10 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции.32. The method according to any one of paragraphs. 1-31, further including at least 10 different subpopulations of granules, each subpopulation containing an index different from the other subpopulation.
33. Способ обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени, включающий:33. A method for detecting a target nucleic acid, including:
(a) получение нуклеиновой кислоты-мишени, содержащей первый участок, способный гибридизоваться с первым зондом захвата, и второй участок, способный гибридизоваться со вторым зондом захвата;(a) obtaining a target nucleic acid comprising a first region capable of hybridizing with a first capture probe and a second region capable of hybridizing with a second capture probe;
(b) получение популяции гранул, причем каждая гранула содержит:(b) obtaining a population of granules, each granule containing:
первый зонд захвата,first capture probe,
второй зонд захвата, причем второй зонд захвата прикреплен к грануле посредством расщепляемого линкера, при этом второй зонд захвата содержит обнаруживаемую метку, иa second capture probe, wherein the second capture probe is attached to the bead via a cleavable linker, wherein the second capture probe contains a detectable label, and
первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на первый или второй зонд захвата, и 3'-конец штрихкода для связывания с праймером штрихкода;a first polynucleotide containing a barcode indicating a first or second capture probe and a 3' end of the barcode for binding to the barcode primer;
(c) лигирование первого зонда захвата со вторым зондом захвата, включающее:(c) ligating the first capture probe to the second capture probe, comprising:
гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с первым и вторым зондами захвата гранулы популяции гранул с образованием двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей одноцепочечный гэп между первым и вторым зондами захвата, иhybridizing the target nucleic acid with the first and second bead capture probes of the bead population to form a double-stranded nucleic acid having a single-stranded gap between the first and second capture probes, and
заполнение гэпа между первым и вторым зондами захвата;filling a gap between the first and second capture probes;
(d) расщепление расщепляемого линкера с образованием первого зонда захвата, содержащего обнаруживаемую метку;(d) cleaving the cleavable linker to form a first capture probe containing a detectable label;
(e) распределение популяции гранул на субстрате; и(e) the distribution of the population of granules on the substrate; and
(f) декодирование положения гранулы, содержащей первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку, на субстрате.(f) decoding the position of the bead containing the first capture probe containing a detectable label on the substrate.
34. Способ по п. 33, в котором первый зонд захвата содержит первый полинуклеотид.34. The method of claim 33, wherein the first capture probe comprises a first polynucleotide.
35. Способ по п. 33 или 34, в котором стадию (с) выполняют перед стадией (d).35. The method according to claim 33 or 34, wherein step (c) is performed before step (d).
36. Способ по любому из пп. 33-35, в котором каждая гранула содержит второй полинуклеотид, содержащий индекс, указывающий на источник нуклеиновой кислоты-мишени, и 3′-конец индекса для связывания с праймером индекса.36. The method according to any one of paragraphs. 33-35, wherein each bead contains a second polynucleotide containing an index indicating the source of the target nucleic acid and the 3' end of the index for binding to the index primer.
37. Способ по любому из пп. 33-36, в котором стадия (f) включает определение положения первого зонда захвата, содержащего обнаруживаемую метку, на субстрате.37. The method according to any one of paragraphs. 33-36, in which step (f) includes determining the position of the first capture probe containing a detectable label on the substrate.
38. Способ по любому из пп. 33-37, в котором стадия (f) включает декодирование положения штрихкода гранулы, содержащей первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку, на субстрате путем секвенирования штрихкода на субстрате.38. The method according to any one of paragraphs. 33-37, wherein step (f) includes decoding the barcode position of the bead containing the first capture probe containing a detectable label on the substrate by sequencing the barcode on the substrate.
39. Способ по любому из пп. 33-38, в котором проточная кювета содержит субстрат.39. The method according to any one of paragraphs. 33-38, in which the flow cell contains a substrate.
40. Способ по любому из пп. 33-39, в котором распределенная популяция гранул содержит матрицу.40. The method according to any one of paragraphs. 33-39, in which the distributed population of beads contains a matrix.
41. Способ по любому из пп. 33-40, в котором популяция гранул содержит первую и вторую субпопуляции гранул, причем каждая гранула содержит второй полинуклеотид, содержащий индекс и 3′-конец индекса для связывания с праймером индекса, при этом индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции.41. The method according to any one of paragraphs. 33-40, wherein the bead population comprises first and second bead subpopulations, each bead containing a second polynucleotide containing an index and the 3' end of an index for binding to an index primer, wherein the indices of the first subpopulation are different from those of the second subpopulation.
42. Способ по п. 41, в котором нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.42. The method of claim 41, wherein the nucleotide sequences of the indices of the first bead subset comprise the same nucleotide sequence and the nucleotide sequences of the indices of the second bead subset comprise the same nucleotide sequence.
43. Способ по п. 41 или 42, в котором стадию лигирования или расщепления с первой субпопуляцией гранул выполняют в объеме реакции, отличающемся от стадии лигирования или расщепления со второй субпопуляцией гранул.43. The method of claim 41 or 42, wherein the ligation or cleavage step with the first bead subset is performed at a different reaction volume than the ligation or cleavage step with the second bead subset.
44. Способ по любому из пп. 41-43, дополнительно включающий объединение первой и второй субпопуляций гранул до распределения популяций гранул на субстрате.44. The method according to any one of paragraphs. 41-43, further comprising combining the first and second subpopulations of granules prior to spreading the populations of granules on the substrate.
45. Способ по любому из пп. 41-43, в котором первую субпопуляцию гранул распределяют на субстрате до распределения на субстрате второй субпопуляции гранул.45. The method according to any one of paragraphs. 41-43, in which the first subpopulation of granules is distributed on the substrate before distribution on the substrate of the second subpopulation of granules.
46. Способ по любому из пп. 33-45, в котором стадия (f) включает декодирование положения индексов гранул, содержащих обнаруженный зонд захвата, путем секвенирования индексов на субстрате.46. The method according to any one of paragraphs. 33-45, wherein step (f) includes decoding the position of the indices of the beads containing the detected capture probe by sequencing the indices on the substrate.
47. Набор, содержащий:47. A set containing:
первую и вторую субпопуляции гранул, причем каждая гранула содержит:first and second subpopulations of granules, each granule containing:
зонд захвата, который специфически связывается с лигандом-мишенью,an capture probe that specifically binds to a target ligand,
первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и 3'-конец штрихкода для связывания с праймером штрихкода, иa first polynucleotide containing a barcode indicating a capture probe and a 3' end of the barcode for binding to the barcode primer, and
второй полинуклеотид, содержащий индекс и 3' -конец индекса для связывания с праймером индекса,the second polynucleotide containing the index and the 3' end of the index for binding to the index primer,
причем индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции,moreover, the indices of the first subpopulation differ from the indices of the second subpopulation,
при этом первый объем содержит первую субпопуляцию гранул, а второй объем содержит вторую субпопуляцию гранул.wherein the first volume contains the first subpopulation of granules, and the second volume contains the second subpopulation of granules.
48. Набор по п. 47, в котором зонд захвата выбран из нуклеиновой кислоты, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.48. The kit of claim 47, wherein the capture probe is selected from a nucleic acid, an antibody, or an antigen-binding fragment thereof.
49. Набор по п. 47 или 48, в котором первый полинуклеотид содержит зонд захвата.49. The kit of claim 47 or 48, wherein the first polynucleotide contains a capture probe.
50. Набор по любому из пп. 47-49, в котором каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связывается с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями.50. Set according to any one of paragraphs. 47-49, wherein each of the capture probes of the first and second bead subsets specifically binds to different target ligands.
51. Набор по п. 50, в котором различные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связываются с одними и теми же лигандами-мишенями.51. The kit of claim 50, wherein different capture probes of the first and second bead subsets specifically bind to the same target ligands.
52. Способ декодирования положений полинуклеотидов в матрице, включающий:52. A method for decoding the positions of polynucleotides in a matrix, including:
(a) получение субстрата, имеющего матрицу полинуклеотидов, распределенных на поверхности субстрата, причем каждый полинуклеотид содержит 3'-конец штрихкода для связывания с праймером штрихкода, при этом каждый полинуклеотид связан с зондом захвата;(a) obtaining a substrate having a matrix of polynucleotides distributed on the surface of the substrate, each polynucleotide contains the 3' end of a barcode for binding to a barcode primer, each polynucleotide is associated with a capture probe;
(b) гибридизацию множества праймеров с сайтами связывания праймера; и(b) hybridizing a plurality of primers to primer binding sites; and
(c) определение последовательностей штрихкодов путем удлинения гибридизованных праймеров, причем последовательность каждого штрихкода указывает на положение полинуклеотида в матрице.(c) determining barcode sequences by extending the hybridized primers, each barcode sequence indicating the position of the polynucleotide in the template.