RU2005115052A - Способ флуоресцентной наноскопии - Google Patents

Claims (5)

1. Способ наноскопии окрашенных объектов, находящихся в растворе или в срезе фиксированного и заключенного в полимер образца, в котором используется флуоресцентный микроскоп, содержащий цифровые видеокамеры с запирающими фильтрами для выделения света флуоресценции образца, способные регистрировать с низким уровнем шума изображение отдельных флуоресцирующих молекул, возбуждаемых лазерным источником света, компьютер для записи видеоизображений, поступающих от видеокамеры, отличающийся тем, что периодически с помощью УФ вспышки одна-две тысячи нефлуоресцирующих молекул красителя, покрывающих структуры объекта, превращаются во флуоресцирующие за счет отрыва от них блокирующих флуоресценцию химических групп, изображения образовавшихся флуоресцентных молекул регистрируется в виде раздельных пятен на кадрах видеокамеры, при этом молекулы обесцвечиваются в процессе регистрации, кадры с остаточным флуоресцентным излучением вычитаются из кадров, содержащих смесь изображений флуоресцентных частиц и остаточной флуоресценции и разностные кадры спасаются в память компьютера с целью дальнейшего поиска центров пятен, являющихся координатами молекул красителя, процесс повторяется десятки тысяч раз с целью вычисления координат всех молекул красителя в освещаемой части объекта и компьютерной реконструкции двух- или трехмерного изображения объекта с разрешением лучше, чем 20-50 нм.

2. Способ наноскопии по п.1, отличающийся тем, что вместо регулярно создаваемых и обесцвечиваемых флуоресцентных молекул объект прокрашивается видимыми раздельно флуоресцентными наночастицами, содержащими каждая множество флуоресцентных устойчивых к отбеливанию светом молекул, способных двигаться в растворе между структурами объекта в Броуновском движении и под действием двумерного электрофореза, при этом лазер постоянно возбуждает флуоресценцию частиц, видеокамера и компьютер регистрируют десятки тысяч кадров с одной-двумя тысячами видимых раздельно пятен в каждом кадре, отражающих положение частиц, по вычисленным координатам центров пятен во всех кадрах реконструируется жидкая часть пространства в объекте, доступная для движущихся частиц, а также недоступная для флуоресцентных частиц часть пространства, занятая неподвижными структурами объекта.

3. Способ наноскопии по п.1, отличающийся тем, что используется видеокамера 2, идентичная видеокамере 1, но расположенная так относительно объектива, что на ее сенсоре фокусируется изображение плоскости объекта, сдвинутой по глубине на 50-2000 нм относительно плоскости, которая фокусируется на видеокамеру 1, при этом различие в распределении интенсивности света в сечениях пятен, полученных через обе камеры, используется для вычисления третьей координаты положения молекул красителя в объекте и для построения трехмерного изображения объекта, объект в растворе предпочтительно освещается через предметное стекло под углом полного внутреннего отражения, а объект в твердом срезе толщиной от долей микрометра до нескольких микрометров может освещаться через объектив на всю глубину твердого среза или через предметное стекло под углом полного внутреннего отражения.

4. Способ наноскопии по п.1, отличающийся тем, что различающиеся структуры объекта одновременно окрашиваются различными красителями, флуоресцирующими на разных длинах волн, а набор дихроичных зеркал и светофильтров используется для избирательного проецирования изображений различных структур на две или более видеокамеры, что умножает количество одновременно регистрируемых молекул.

5. Способ наноскопии по п.1, отличающийся тем, что впридачу к изображению, сформированному согласно одному из способов, перечисленных в пп.1-4 в объект периодически вводятся различные "запертые (caged)" молекулы, способные превращаться из нефлуоресцирующие во флуоресцирующие в результате химических реакций или различных физических воздействий, отрывающих блокирующие флуоресценцию химические группы, с такой скоростью, что все образовавшихся флуоресцентные молекулы регистрируется в виде раздельных пятен на кадрах видеокамеры, при этом молекулы обесцвечиваются в процессе регистрации, кадры с остаточным флуоресцентным излучением вычитаются из кадров, содержащих смесь изображений флуоресцентных частиц и остаточной флуоресценции и разностные кадры спасаются в память компьютера с целью дальнейшего поиска центров пятен, являющихся координатами молекул красителя, процесс повторяется много раз за счет создания различными способами все новых флуоресцентных молекул в освещенной зоне с целью вычисления координат всех молекул красителя в объекте и компьютерной реконструкции положения таких "специальных" молекул на ранее полученном двух- или трехмерном изображении объекта.