Claims (25)
1. Цитохром Р450- монооксигеназа, которая, как минимум, способна к одной из следующих реакций:1. Cytochrome P450-monooxygenase, which is at least capable of one of the following reactions:
a) окисление в случае необходимости замещенных N-, О-, или S-гетероциклических одно-, двух- или многозвенных ароматических соединений;a) oxidizing, if necessary, substituted N-, O-, or S-heterocyclic one-, two- or multi-link aromatic compounds;
b) окисление в случае необходимости замещенных одно- или многозвенных ароматических углеводородов;b) oxidizing, if necessary, substituted single or multi-link aromatic hydrocarbons;
c) окисление неразветвленных или разветвленных алканов и алкенов иc) the oxidation of unbranched or branched alkanes and alkenes, and
d) окисление в случае необходимости замещенных циклоалканов иd) oxidizing optionally substituted cycloalkanes; and
циклоалкенов,cycloalkenes,
причем монооксигеназа является производной из цитохром Р450- монооксигеназы ВМ-3 из Bacillicus megaterium с последовательностью аминокислот согласно SEQ ID NO:2, которая имеет, по меньшей мере, одну функциональную мутацию в, как минимум, одной из областей последовательности аминокислот 172-224, 39-43, 48-52, 67-70, 330-335, 352-356, 73-82, 86-88; за исключением простого мутанта Phe87Val.moreover, monooxygenase is a derivative of cytochrome P450-monooxygenase BM-3 from Bacillicus megaterium with an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2, which has at least one functional mutation in at least one of the regions of the amino acid sequence 172-224, 39 -43, 48-52, 67-70, 330-335, 352-356, 73-82, 86-88; except for the simple mutant Phe87Val.
2. Монооксигеназа по п.1, отличающаяся тем, что она имеет, по меньшей мере, одну функциональную мутацию, в частности, замещение аминокислоты, как минимум, в одной из областей последовательности 73-82, 86-88 и 172-224.2. Monooxygenase according to claim 1, characterized in that it has at least one functional mutation, in particular, amino acid substitution in at least one of the regions of the sequence 73-82, 86-88 and 172-224.
3. Монооксигеназа по п.1, отличающаяся тем, что она имеет, по меньшей мере, одно- или многократные замещения аминокислот:3. Monooxygenase according to claim 1, characterized in that it has at least one or multiple amino acid substitutions:
a) Phe87Val, Leu188Gln;илиa) Phe87Val, Leu188Gln; or
b) Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly;b) Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly;
а также их функциональные эквиваленты, которые способны, как минимум, к одной из вышеуказанных реакций окисления.as well as their functional equivalents, which are capable of at least one of the above oxidation reactions.
4. Последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая монооксигеназу по одному из предыдущих пунктов.4. The nucleic acid sequence encoding a monooxygenase according to one of the preceding paragraphs.
5. Экспрессионный конструкт, содержащий при генетическом контроле регулятивных последовательностей нуклеиновых кислот кодирующую последовательность нуклеиновых кислот, которая охватывает последовательность нуклеиновых кислот по п.4.5. An expression construct containing, during genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a coding nucleic acid sequence that encompasses the nucleic acid sequence of claim 4.
6. Вектор, охватывающий, как минимум, один из экспрессионных конструктов по п.5.6. A vector spanning at least one of the expression constructs of claim 5.
7. Рекомбинантный микроорганизм, который трансформируется, как минимум, одним вектором по п.6.7. A recombinant microorganism that is transformed with at least one vector according to claim 6.
8. Микроорганизм по п.7, выбранный среди бактерий из рода Escherichia.8. The microorganism according to claim 7, selected among bacteria from the genus Escherichia.
9. Способ микробиологического окисления N-, О-, или S-гетероциклических одно-, или многозвенных ароматических соединений, отличающийся тем, что9. The method of microbiological oxidation of N-, O-, or S-heterocyclic single- or multi-link aromatic compounds, characterized in that
а1) культивируют рекомбинантный микроорганизм, который экспримирует бактериальное происхождение цитохром Р450- монооксигеназы в культуральной среде в присутствии экзогенного, или образованного промежуточно субстрата; илиA1) cultivate a recombinant microorganism that expresses the bacterial origin of cytochrome P450 monooxygenase in a culture medium in the presence of an exogenous or intermediate formed substrate; or
а2) инкубируют содержащую субстрат реакционную среду с цитохром Р450 -монооксигеназой бактериального происхождения; иA2) incubate the substrate-containing reaction medium with cytochrome P450-monooxygenase of bacterial origin; and
b) выделяют образовавшийся продукт окисления или последовательный продукт этого из среды.b) isolate the resulting oxidation product or a sequential product thereof from the medium.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что экзогенный или промежуточно образующийся субстрат выбирают среди в случае необходимости замещенных N-, или S-гетероциклических одно-, или многозвенных ароматических соединений.10. The method according to claim 9, characterized in that the exogenous or intermediate-forming substrate is selected among, if necessary, substituted N- or S-heterocyclic single- or multi-link aromatic compounds.
11. Способ по п.9 или 10, причем монооксигеназа является мутантом по одному из пп.1-3, включая мутант Phe87Val.11. The method according to claim 9 or 10, wherein the monooxygenase is a mutant according to one of claims 1 to 3, including the Phe87Val mutant.
12. Способ по п.11, причем мутант имеет, по меньшей мере, следующие одно- или многократные замещения аминокислот:12. The method according to claim 11, wherein the mutant has at least the following single or multiple amino acid substitutions:
1) Phe87Val;1) Phe87Val;
2) Phe87Val, Leu188Gln; или2) Phe87Val, Leu188Gln; or
3) Phe87Val, Leu188Gln; Ala74Gly.3) Phe87Val, Leu188Gln; Ala74Gly.
13. Способ микробиологического окисления соединения согласно определению по п.1 b), с) или d), отличающийся тем, что13. The method of microbiological oxidation of a compound according to the definition of claim 1 b), c) or d), characterized in that
а1) культивируют рекомбинантный производящий цитохром Р450 микроорганизм по п.7 или 8 в культуре в присутствии экзогенного, или образованного промежуточно окисляющего субстрата; илиA1) cultivate the recombinant cytochrome P450 producing microorganism according to claim 7 or 8 in a culture in the presence of an exogenous or intermediate oxidizing substrate formed; or
а2) инкубируют содержащую субстрат реакционную среду с цитохром Р450- монооксигеназой по одному из пп.1-3; иA2) incubate the substrate-containing reaction medium with cytochrome P450 monooxygenase according to one of claims 1 to 3; and
b) выделяют образовавшийся продукт окисления или последовательный продукт этого из среды; причем не исключается мутант монооксигеназы Phe87Val.b) isolate the resulting oxidation product or a sequential product thereof from the medium; moreover, the mutant Phe87Val monooxygenase mutant is not excluded.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что экзогенный или промежуточно образующийся субстрат выбирают среди14. The method according to item 13, wherein the exogenous or intermediate forming substrate is selected among
a) в случае необходимости замещенных одно- или многозвенных ароматических углеводородов;a) optionally substituted single or multi-link aromatic hydrocarbons;
b) неразветвленных или разветвленных алканов и алкенов;b) unbranched or branched alkanes and alkenes;
c) в случае необходимости замещенных циклоалканов и циклоалкенов.c) optionally substituted cycloalkanes and cycloalkenes.
15. Способ по п.13 или 14, причем монооксигеназа является мутантом по одному из пп.1-3, включая мутант Phe87Val.15. The method according to item 13 or 14, and monooxygenase is a mutant according to one of claims 1 to 3, including the mutant Phe87Val.
16. Способ по п.15, причем мутант имеет, по меньшей мере, следующие одно- или многократные замещения аминокислот:16. The method according to clause 15, wherein the mutant has at least the following single or multiple amino acid substitutions:
1) Phe87Val;1) Phe87Val;
2) Phe87Val, Leu188Gln; или2) Phe87Val, Leu188Gln; or
3) Phe87Val, Leu188Gln; Ala74Gly.3) Phe87Val, Leu188Gln; Ala74Gly.
17. Способ по одному из пп.9-16, отличающийся тем, что в качестве экзогенного субстрата выбирают, как минимум, одно соединение среди вышеопределенных групп соединений от а) до d), добавляют в среду, а окисление проводят путем энзиматического преобразования содержащей субстрат среды в присутствии кислорода, при температуре примерно от 20°С до 40°С, и значении рН примерно от 6 до 9, причем содержащая субстрат среда содержит, кроме того, по отношению к субстрату примерно 10-100 кратный молярный избыток восстановительных эквивалентов.17. The method according to one of claims 9-16, characterized in that at least one compound among the above groups of compounds a) to d) is selected as an exogenous substrate, added to the medium, and the oxidation is carried out by enzymatic conversion of a substrate containing medium in the presence of oxygen, at a temperature of from about 20 ° C to 40 ° C, and a pH value of from about 6 to 9, and the substrate-containing medium also contains, in relation to the substrate, about 10-100 times a molar excess of reducing equivalents.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что в качестве экзогенного субстрата используют соединение, выбранное среди следующих: нn-гексан, н-октан, н-декан, н-додекан, кумол, 1-метилиндол, 5-Cl или Br-индол, инден, бензотиофен, α, β и γ-ионон, акридин, нафталин, 6-метил или 8-метилхинолин, хинолин и хинальдин.18. The method according to 17, characterized in that as an exogenous substrate using a compound selected among the following: nn-hexane, n-octane, n-decane, n-dodecane, cumene, 1-methylindole, 5-Cl or Br -indole, indene, benzothiophene, α, β and γ-ionon, acridine, naphthalene, 6-methyl or 8-methylquinoline, quinoline and quinaldine.
19. Способ микробиолического производства индиго и/ или индирубина, отличающийся тем, что19. The method of microbiological production of indigo and / or indirubin, characterized in that
а1) культивируют рекомбинантный микроорганизм, производящий в культуральной среде окисляющий индол цитохром Р450, в присутствии экзогенного, или образованного промежуточно окисляющего индола; илиA1) cultivate a recombinant microorganism producing in the culture medium oxidizing indole cytochrome P450 in the presence of exogenous or intermediate oxidizing indole; or
а2) инкубируют содержащую индиго реакционную среду с цитохром Р450- монооксигеназой; иA2) incubate the indigo-containing reaction medium with cytochrome P450 monooxygenase; and
b) выделяют образовавшийся продукт окисления или последовательный продукт этого из среды;b) isolate the resulting oxidation product or a sequential product thereof from the medium;
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что из среды выделяют образующийся индиго и/или индирубин, который был получен путем окисления промежуточно образующегося индола.20. The method according to claim 19, characterized in that the resulting indigo and / or indirubin, which was obtained by oxidation of the intermediate indole, is isolated from the medium.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что окисление индола проводят путем культивации микроорганизмов в присутствии кислорода при температуре культивации примерно 20-40°С и значении рН от 6 до 9.21. The method according to claim 20, characterized in that the indole oxidation is carried out by culturing microorganisms in the presence of oxygen at a cultivation temperature of about 20-40 ° C and a pH value of from 6 to 9.
22. Способ по п.20 или 21, причем монооксигеназа является мутантом по одному из пп.1-3, включая мутант Phe87Val.22. The method according to claim 20 or 21, wherein the monooxygenase is a mutant according to one of claims 1 to 3, including the Phe87Val mutant.
23. Способ по п.22, причем мутант имеет, по меньшей мере, следующие одно- или многократные замещения аминокислот:23. The method according to item 22, wherein the mutant has at least the following single or multiple amino acid substitutions:
1) Phe87Val;1) Phe87Val;
2) Phe87Val, Leu188Gln; или2) Phe87Val, Leu188Gln; or
3) Phe87Val, Leu188Gln; Ala74Gly.3) Phe87Val, Leu188Gln; Ala74Gly.
24. Биореактор, включающий энзим по одному из пп.1-3, или рекомбинантный организм по п.7 или 8 в иммобилизированной форме.24. A bioreactor comprising an enzyme according to one of claims 1 to 3, or a recombinant organism according to claim 7 or 8 in immobilized form.
25. Применение цитохром Р450- монооксигеназы по одному из пп.1-3, вектора по п.6, или микроорганизма по п.7 или 8 для микробиологического окисления25. The use of cytochrome P450-monooxygenase according to one of claims 1 to 3, the vector according to claim 6, or the microorganism according to claim 7 or 8 for microbiological oxidation
a) в случае необходимости замещенных N-, О- или S-гетероциклических одно-, двух- или многозвенных ароматических соединений;a) optionally substituted N-, O- or S-heterocyclic one-, two- or multi-link aromatic compounds;
b) в случае необходимости замещенных одно-, или многозвенных ароматических углеводородов;b) optionally substituted single- or multi-link aromatic hydrocarbons;
c) неразветвленных или разветвленных алканов и алкенов;c) unbranched or branched alkanes and alkenes;
d) в случае необходимости замещенных циклоалканов и циклоалкенов, причем не исключается мутант монооксигеназы Phe87Val.d) optionally substituted cycloalkanes and cycloalkenes, wherein the mutant Phe87Val monooxygenase is not excluded.