RU2094077C1 - Хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина - Google Patents
Хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2094077C1 RU2094077C1 RU96113901A RU96113901A RU2094077C1 RU 2094077 C1 RU2094077 C1 RU 2094077C1 RU 96113901 A RU96113901 A RU 96113901A RU 96113901 A RU96113901 A RU 96113901A RU 2094077 C1 RU2094077 C1 RU 2094077C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fetoprotein
- column
- stage
- solution
- alpha
- Prior art date
Links
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 25
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 claims description 22
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 claims description 22
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 11
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 101000827785 Homo sapiens Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 claims description 5
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 claims description 5
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 4
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 claims description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 abstract description 4
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 abstract description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 2
- 102000004641 Fetal Proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010003471 Fetal Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000007445 Chromatographic isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Использование: в области хроматографического разделения с помощью иммуносорбентов. Сущность: предложен способ выделения альфа-фетопротеина из биологического материала человека - путем осаждения и четырехступенчатой хроматографии, 1-ая и 3-ая ступень которой проводится на аффинных иммуносорбентах, а 2-ая и 4-ая на ионообменной ДЕАЕ-сефарозе. 3 з.п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к области биологической химии, в частности к хроматографическому выделению альфа-фетопротеина из биологических жидкостей и тканей.
Известен способ выделения альфа-фетопротеина из абортивного материала путем его обработки бутиловым спиртом, диализа против буферного раствора, аффинной хроматографии на иммобилизованных экстрогенах и элюирования смесью бутилового спирта и буферного раствора [1]
Недостатком способа является невысокая степень чистоты препарата (95%).
Недостатком способа является невысокая степень чистоты препарата (95%).
Наиболее близким по техническим сущности и достигаемому результату является хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина из фетального материала, включающий его очистку и колоночную хроматографию в три стадии. На первой стадии проводят аффинную хроматографию на колонке с цианбромированной сефарозой ковалентно связанной с овечьими антителами против альфа-фетопротеина человека с элюацией альфа-фетопротеина глицин солянокислыми буфером при изменении pH до 2, 6, вторую стадию проводят на колонке с голубой сефарозой с элюацией 2 M NaCl, а третью стадию поводят на колонке с Con-A-сефарозой, уравновешенной ацетатным буфером с фракционной элюацией альфа-фетопротеина раствором метил-альфа-Д-глюкопираназаида с градиентом концентраций. Далее собирают 23-27-ю фракции, содержащие альфа-фетопротеин [2]
Недостатком данного способа является невысокий выход целевого продукта 20% поскольку элюирование ведется фракционно.
Недостатком данного способа является невысокий выход целевого продукта 20% поскольку элюирование ведется фракционно.
Задачей настоящего изобретения является разработка хроматографического способа выделения альфа-фетопротеина высокой степени чистоты из фетального материала человека с повышенным выходом целевого продукта.
Поставленная цель достигается описанным способом хроматографического выделения альфа-фетопротеина, включающим предварительную очистку биологического фетального материала путем осаждения раствором сульфата аммония и колоночную хроматографию в четыре стадии, на первой стадии на колонке, заполненной цианбромированной сефарозой иммобилизованной поликлональными антителами животных, например, кроликов, овец, коз, мышей против альфа-фетопротеина человека с элюацией альфа-фетопротеина раствором карбоната натрия, на второй стадии на колонке с ионообменной диэтиламиноэтил сефарозой уравновешенной натрий-фосфатным буфером при элюации раствором ацетатного буфера и нейтрализации элюата раствором гидроксида натрия, на третьей стадии - на колонке, заполненной цианбромированной сефарозой иммобилизированной антителами животных против белков нормальной сыворотки человека при элюации раствором карбоната натрия, а на четвертой стадии вновь на колонке с ионообменной диэтиламиноэтил сефарозой уравновешенной натрий-фосфатным буфером при элюации раствором хлорида натрия, содержащий натрий-фосфатный буфер и сахарозу.
После проведения колоночной хроматографии продукт можно заморозить и лиофильно высушить для хранения.
В качестве исходного материала рекомендуется использовать абортальную или плацентарную сыворотки или пуповинную кровь.
Пример осуществления способа. Предварительную очистку проводят с помощью фракционирования белков сыворотки осаждением 1,3 M раствором сульфата аммония. После выделения осадка на центрифуге (40 мин 8000g) супернатанат разводят в 3 раза забуференным физиологическим раствором и пропускают через колонку (3,0 x 10 см, скорость подачи 500 мл/ч) с имуносорбентом, который представляет собой ковалентно связанные с BrCN-активированной сефарозой CL-4B поликлональные антитела кролика против альфа-фетопротеина человека. Перед нанесением колонку промывают сначала 0,01 M раствором HCL, затем уравновешивают забуференным физиологическим раствором, pH 7,4. Затем колонку промывают сначала буферным раствором, содержащим 0,5 M хлорида натрия и физиологическим раствором хлорида натрия (0,9%) до тех пор, пока оптическая плотность выходящего из колонки раствора не снизится до 0,005 оптических единиц. После пропускания раствора через колонку альфа-фетопротеин элюируют с помощью 1% раствора углекислого натрия (pH 11,3). Профиль элюции контролируют спектрофотометрически, при 280 нм. После снятия белка с колонки pH раствора снижают до pH 7,4, добавляя 1N раствор HCL. Объем снятой с аффинной колонки альфа-фетопротеина составлял 2 объема иммуносорбента с титром 1/128, что соответствует концентрации белка 0,5 мг/мл.
Полученный раствор альфа-фетопротеина (АФП) разбавляют в 2,5 раза дистиллированной водой и концентрируют на колонке с ДЕАЕ-сефарозой, уравновешенной 0,02 M натрий-фосфатным буфером, pH 7,4. Затем колонку промывают 0,02 M фосфатным буфером, pH 6,2. Белок с колонки элюируют 0,1 M раствором ацетатного буфера, pH 4,5. Элюат нейтрализуют 1N раствором гидроокиси натрия до pH 7,4.
Далее проводят третью стадию колоночной хроматографии очистку от примеси ("негативная" иммуносорбция). Для того, чтобы очистить выделенный альфа-фетопротеин от возможных следовых количеств белков сыворотки, полученный раствор белка наносят на аффинную колонку с антителами кролика против нормальной сыворотки человека. Элюацию ведут раствором карбоната натрия.
Далее раствор АФП после очистки от примесных белков разбавляют в 3 раза и концентрируют на колонке с ДЕАЕ-сефарозой, уравновешенной 0,02 M натрия-фосфатным буфером, pH 7,4. Колонку тщательно промывают 0,02 M фосфатным буфером и проводят элюцию с использованием 0,3 M раствора хлорида натрия, содержащий 0,02 M натрий-фосфатного буфера и 5% сахарозы. Конечная концентрация альфа-фетопротеина составила 20 мг/мл. Сразу после получения конечного продукта его замораживают и сушат лиофильно.
Таким образом получен альфа-фетопротеин с выходом из исходного сырья примерно 30% чистотой 99%
Контроль качества выделенного АФП. Для контроля качества полученного препарата проводили гельхрамотографию на TOYOPEARL HW-55 (200 x 12 мм, проба
10 мг), предварительно диализовав раствор АФП против 0,005 M натрий-фосфатного буфера, pH 7,4.
Контроль качества выделенного АФП. Для контроля качества полученного препарата проводили гельхрамотографию на TOYOPEARL HW-55 (200 x 12 мм, проба
10 мг), предварительно диализовав раствор АФП против 0,005 M натрий-фосфатного буфера, pH 7,4.
Таком образом предложенное изобретение позволяет выделить альфа-фетопротеин из фетального биологического материала последовательным применением иммунно-аффинной хроматограффии на BrCN-сефарозе и ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе. Иммунно-аффинная хроматография включает в себя иммуносорбицию на поликлональных антителах животных против альфа-фетопротеина человека, и иммуносорбцию на антителах животных белков нормальной сыворотки человека.
За счет двухстадийной иммуносорбции и двухстадийной ионообменной сорбции получен препарат высокой степени чистоты с высоким выходом целевого продукта.
Claims (4)
1. Хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина, включающий предварительную очистку исходного биологического фетального материала и многостадийную колоночную хроматографию, отличающийся тем, что предварительную очистку проводят путем осаждения раствором сульфата аммония, а хроматографию ведут в четыре стадии, на первой стадии на колонке, заполненной цианбромированной сефарозой, иммобилизованной поликлональными антителами животных против альфа-фетопротеина человека с элюацией альфа-фетопротеина раствором карбоната натрия, на второй стадии на колонке с ионообменной диэтиламиноэтил сефарозой, уравновешенной натрийфосфатным буфером при элюации раствором ацетатного буфера и нейтрализацией элюата раствором гидроксида натрия, на третьей стадии на колонке, заполненной цианбромированной сефарозой, иммобилизованной антителами животных против белков нормальной сыворотки человека, при элюации раствором карбоната натрия, а на четвертой стадии вновь на колонке с ионообменной диэтиламиноэтил сефарозой, уравновешенной натрийфосфатным буфером, при элюации раствором хлорида натрия, содержащего натрийфосфатный буфер и сахарозу.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после колоночной хроматографии продукт замораживают и сушат лиофильно.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве биологического фетального материала используют абортальную или плацентарную сыворотку или пуповинную кровь.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антител животных используют антитела кроликов, овец, коз, мышей.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96113901A RU2094077C1 (ru) | 1996-07-23 | 1996-07-23 | Хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96113901A RU2094077C1 (ru) | 1996-07-23 | 1996-07-23 | Хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2094077C1 true RU2094077C1 (ru) | 1997-10-27 |
| RU96113901A RU96113901A (ru) | 1998-01-20 |
Family
ID=20183052
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96113901A RU2094077C1 (ru) | 1996-07-23 | 1996-07-23 | Хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2094077C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2163139C1 (ru) * | 2000-02-23 | 2001-02-20 | Родионов Сергей Юрьевич | Способ получения препарата альфа-фетопротеина |
| RU2457214C2 (ru) * | 2005-03-11 | 2012-07-27 | Вайет | Способ хроматографии в режиме слабого распределения |
-
1996
- 1996-07-23 RU RU96113901A patent/RU2094077C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. SU, авторское свидетельство, 583536, кл. A 61 K 38/00, 1979. 2. D. Chudy, V.Zizkovsky. A simple and rapid metod for CH isolation of human alpha-fetopeotein from human cord serum, Neoplasma, 34, 4, 1987, 491-495. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2163139C1 (ru) * | 2000-02-23 | 2001-02-20 | Родионов Сергей Юрьевич | Способ получения препарата альфа-фетопротеина |
| RU2457214C2 (ru) * | 2005-03-11 | 2012-07-27 | Вайет | Способ хроматографии в режиме слабого распределения |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU1837880C (ru) | Способ разделени белков крови | |
| JP4218980B2 (ja) | 治療用の免疫グロブリンｇ濃厚液および該濃厚液の製造方法 | |
| US6627737B1 (en) | Factor IX purification methods | |
| US4228154A (en) | Purification of plasma albumin by ion exchange chromatography | |
| US10792654B2 (en) | Solid phase for mixed-mode chromatographic purification of proteins | |
| JPH1129494A (ja) | 抗体の高収率精製およびウイルス不活性化のためのクロマトグラフイー法 | |
| JPH05268985A (ja) | モノクローナル抗体の精製法 | |
| KR930003665B1 (ko) | 에리스로포이에틴의 정제방법 | |
| US6001974A (en) | Method of separating albumin from serum by ion-exchange chromatography with membrane adsorbers | |
| ES2307585T3 (es) | Procedimiento para purificar hcg recombinante que tiene una bioactividad especifica. | |
| JP2001513762A (ja) | 高度に精製されたｖＷＦまたは因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を得る方法 | |
| US5055557A (en) | Ultrapurification of factor IX and other vitamin K-dependent proteins | |
| RU2094077C1 (ru) | Хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина | |
| WO2020125757A1 (en) | A method for improving aggregate removal by protein a chromatography | |
| JPS6034916A (ja) | 第１ｘ因子および他のビタミンｋ依存性タンパク質の高純度精製 | |
| RU2792819C1 (ru) | Способ получения гомологического иммуноглобулина против COVID-19 | |
| JP3486196B2 (ja) | ストレプトリジンｏの精製方法、この方法により得られる完全ストレプトリジンｏおよびその使用 | |
| RU2325171C1 (ru) | Способ выделения и очистки трофобластического бета-1-гликопротеина | |
| EP0310719A1 (en) | Method for purification of antibodies | |
| EP0544115B1 (en) | Method for binding immunoglobulin G to protein A | |
| Stiehm et al. | Some immunologic properties of papain digest fragments of multiple myeloma proteins | |
| RU2025474C1 (ru) | Способ получения s-сульфоната проинсулина | |
| RU2145610C1 (ru) | Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека | |
| CA1151542A (en) | Process for preparing the third component of the complement from human blood plasma | |
| WO1990000176A1 (en) | Improved process for purifying insulin |