RU2080875C1

RU2080875C1 - Method of preparing polyvalent vaccine against enteric infections

Info

Publication number: RU2080875C1
Application number: SU925063457A
Authority: RU
Inventors: Е.С. Горбунова; С.И. Елкина; Л.А. Беспалова
Original assignee: Горбунова Евгения Степановна
Priority date: 1992-03-18
Filing date: 1992-03-18
Publication date: 1997-06-10

Abstract

FIELD: biotechnology, medicine. SUBSTANCE: vaccine has equal parts of inactivated dysentery Flexner and Zonne shigellae, abdominal typhoid and paratyphoid B salmonellae. Vaccine has "O"-somatic and "H"-flagellum antigen and vaccine solution has additionally "Vi"-surface antigen. Biochemical composition of vaccine: protein, 19.6-20.5%; polysaccharide, 15.0 ± 0.1%; and lipids - traces. Bacterium components were treated separately with an aqueous-saline solution at simultaneous disruption in the presence of antibiotic gentamycin and finely divided glass for 1-1.5 h followed by centrifugation. After dialysis and separate lyophilization all components were mixed at equal parts = 1:1:1:1. EFFECT: high immunogenic activity, low toxicity, retained structure of cellular components. 3 tbl, 4 dwg

Description

Изобретение относится к медицине, к препаратам, содержащим антигены сальмонелл и шигелл, и может быть использовано для создания низкотоксичных и эффективных вакцин против брюшного тифа и дизентерии, при разных способах их введения подкожном, внутримышечном и пероральном. The invention relates to medicine, to preparations containing Salmonella and Shigella antigens, and can be used to create low-toxic and effective vaccines against typhoid fever and dysentery, with different methods of their administration subcutaneous, intramuscular and oral.

Известны ранее используемые ассоциированные вакцины против кишечных и анаэробных инфекций вакцина НИИСИ и ТАБТе. Первая из них включала антигенные компоненты брюшного тифа, паратифов А и Б, дизентерии Флекснера и Зонне, холеры и столбняка и была заменена на вторую, после изъятия высокотоксичных и малоэффективных холерного и дизентерийного компонентов. Known previously used associated vaccines against intestinal and anaerobic infections vaccine NIIIS and TABTe. The first of them included the antigenic components of typhoid fever, paratyphoid A and B, Flexner and Sonne dysentery, cholera and tetanus, and was replaced by the second, after the removal of highly toxic and ineffective cholera and dysentery components.

Однако и вакцина ТАБТе также была снята с производства из-за высокой реактогенности. В настоящее время выпускается моновакцина против брюшного тифа Т-вакцина. However, the TBTe vaccine was also discontinued due to its high reactogenicity. Typhoid mono-vaccine T-vaccine is currently available.

Следует отметить, что еще в середине 60-х годов в строго контролируемых эпидемологических опытах была показана низкая эффективность кишечных компонентов в вышеупомянутых ассоциированных вакцинах, для получения которых использовали метод ферментативного гидролиза. Метод разработан Райстриком и Топли и модифицирован отечественными учеными в 1940 году. В модифицированном методе ферментативное расщепление бактерий проводят панкреатином, при повышенной температуре длительное время (12 ч, +45^oC). Препарат довольно токсичен и его ЛД₅₀ составляет 0,2 0,25 мг/мышь, а иммуногенность по критерию ЕД₅₀ составляет 1,39-2,9 мкг/мышь.It should be noted that back in the mid-60s, in strictly controlled epidemiological experiments, low efficiency of intestinal components in the above-mentioned associated vaccines was shown, for the preparation of which the enzymatic hydrolysis method was used. The method was developed by Raistrik and Topli and modified by domestic scientists in 1940. In a modified method, the enzymatic degradation of bacteria is carried out by pancreatin, at elevated temperature for a long time (12 hours, +45 ^o C). The drug is quite toxic and its LD ₅₀ is 0.2 0.25 mg / mouse, and immunogenicity according to the criterion of ED ₅₀ is 1.39-2.9 μg / mouse.

Несмотря на установленную в эпидемиологических опытах низкую эффективность, выраженную реактогенность и токсичность препаратов, полученных вышеупомянутым методом, его используют и по сей день для производства кишечных вакцин, в частности моновакцины против брюшного тифа Т-вакцины. Данный препарат принят нами за прототип. Despite the low efficiency established in epidemiological experiments, the pronounced reactogenicity and toxicity of the preparations obtained by the above method, it is still used for the production of intestinal vaccines, in particular, monovirus vaccine against typhoid fever T-vaccine. This drug is accepted by us as a prototype.

Поставленная задача заключается в том, чтобы расширить спектр антигенных веществ в брюшнотифозной вакцине, при этом повысить их эффективность путем поликлональной активации, а также снизить токсичность препаратов. The task is to expand the spectrum of antigenic substances in typhoid vaccine, while increasing their effectiveness by polyclonal activation, as well as reducing the toxicity of drugs.

Для решения данной задачи в вакцину, содержащую антигены брюшного тифа, дополнительно включены антигены сальмонелл паратифа Б и антигены дизентерийных бактерий Флекснера и Зонне, упакованные в структурные компоненты клеток -клеточные стенки со жгутиками, содержащие высокоиммуногенные О-соматический и Н-жгутиковый антигены, которые находятся в смеси с растворимыми Vi-антигеном, экстрагируемым с поверхности клеток. To solve this problem, the vaccine containing typhoid antigens also includes antigens of Salmonella paratyphoid B and antigens of dysenteric bacteria Flexner and Sonne, packaged in the structural components of cells - cell walls with flagella containing highly immunogenic O-somatic and H-flagellated antigens that are mixed with soluble Vi antigen, extracted from the surface of the cells.

Суть изобретения заключается в следующем. The essence of the invention is as follows.

Еще в начале 60-х годов в эпидемиологических опытах было показано, что Н-антиген сальмонелл тифа обладает высокой защитной активностью и присутствие его в брюшнотифозных вакцинах делает ее более эффективной. Причем большую роль в этом играет сохранение нормальной конфигурации макромолекулы белкового компонента жгутиков флаггелина, которая легко разрушается под действием кислотности среды (pH ниже 4 или выше 11), повышенных температур и прочих неблагоприятных факторов. Экспериментально установлено, что введение в организм животных таких разрушенных молекул влечет за собой снижение продукции антител и индуцирование только 7S антител (IgG), тогда как 19S-антитела (IgM) полностью отсутствуют, а между тем они выполняют первую линию защиты против целой микробной клетки. In the early 60s in epidemiological experiments it was shown that the Salmonella typhoid H antigen has a high protective activity and its presence in typhoid vaccines makes it more effective. Moreover, the preservation of the normal configuration of the macromolecule of the protein component of flagellin flagella, which is easily destroyed by the acidity of the medium (pH below 4 or above 11), elevated temperatures, and other adverse factors, plays an important role in this. It has been experimentally established that the introduction of such destroyed molecules into animals leads to a decrease in the production of antibodies and induction of only 7S antibodies (IgG), while 19S antibodies (IgM) are completely absent, and meanwhile they fulfill the first line of defense against the whole microbial cell.

Таким образом, сохранение структурных компонентов сальмонелл (жгутиков, оболочек) необходимо для синтеза иммуноглобулинов различных классов (IgG и IgM), которые способствуют формированию полноценного и напряженного иммунитета, что обеспечивается предложенным антигенным составом вакцины. Thus, the preservation of the structural components of salmonella (flagella, membranes) is necessary for the synthesis of immunoglobulins of various classes (IgG and IgM), which contribute to the formation of full and intense immunity, which is provided by the proposed antigenic composition of the vaccine.

Кроме того, известно, что антигены сальмонелл весьма токсичны, что обусловлено в наибольшей степени наличием липидов, особенно липида А, и характером связей между липидами и другими компонентами, составляющими антигенное вещество, белками, полисахаридами. Разрушение этих связей сопровождается выходом липидов в раствор и увеличением токсичности антигенов. В предложенном препарате межмолекулярные связи сохраняются благодаря методу изготовления. In addition, it is known that salmonella antigens are very toxic, which is due to the greatest extent to the presence of lipids, especially lipid A, and the nature of the bonds between lipids and other components that make up the antigenic substance, proteins, polysaccharides. The destruction of these bonds is accompanied by the release of lipids into the solution and an increase in the toxicity of antigens. In the proposed preparation, intermolecular bonds are preserved due to the manufacturing method.

Сравнительные данные, подтверждающие морфологически особенности экспериментальных антигенов сальмонелл и Т-вакцины, как прототипа представлены на фиг. 1, 2, 3, 4, а биологическая активность (токсичность, иммуногенность), химический состав и количественный выход антигенного вещества в табл. 1. Comparative data confirming morphologically the features of the experimental Salmonella antigens and T-vaccines as a prototype are presented in FIG. 1, 2, 3, 4, and biological activity (toxicity, immunogenicity), chemical composition and quantitative yield of antigenic substance in the table. one.

На представленных фотографиях ультратонких срезов антигенов, сделанных в электронном микроскопе (фиг. 1, 2, 3), выявлена макромолекулярная структура жгутиков и клеточных стенок носителей соматического О- и жгутикового Н-антигенов. The presented photographs of ultrathin sections of antigens made using an electron microscope (Figs. 1, 2, 3) reveal the macromolecular structure of flagella and cell walls of carriers of somatic O and flagellar H antigens.

На фиг. 1 представлена структура клеточных остатков в антигенах S.typhi (Ж жгутики, КС -клеточные стенки, ЦМ цитоплазматическая мембрана, РБ и ХС рибосомы и хроматиновая субстанции. Увеличение в 10 000 тыс. раз); на фиг. 2 структура клеточных остатков в антигенах S. paratyphi. Обозначения те же, что на фиг. 1. Увеличение в 10 000 раз; на фиг. 3 нить жгутика S. paratuphi B. (Ж жгутик, ОН осевая нить (в виде продольной и поперечной), ЦЭ -цитоплазматические элементы вне клетки. Увеличение в 30 000 раз); на фиг. 4 - содержимое клеточных остатков в антигенах Т-вакцины (ОМ -осмеофильный материал, представляющий структурные единицы бактериальной клетки. Увеличение в 10 000 раз). In FIG. 1 shows the structure of cell residues in S. typhi antigens (W flagella, CS cell walls, CM cytoplasmic membrane, RB and cholesterol ribosomes and chromatin substances. 10,000 thousand-fold increase); in FIG. 2 structure of cell residues in S. paratyphi antigens. The designations are the same as in FIG. 1. An increase of 10,000 times; in FIG. 3 strand of flagellum S. paratuphi B. (Zh flagellum, OH axial thread (in the form of longitudinal and transverse), CE - cytoplasmic elements outside the cell. Increase by 30,000 times); in FIG. 4 - contents of cell residues in T-vaccine antigens (OM is osmeophilic material representing the structural units of a bacterial cell. 10,000-fold increase).

Особенно показательным является сохранение мономеров флаггелина, составляющего полимерную структуру жгутиков (фиг. 3), что в свою очередь свидетельствует о сохранении молекулярных связей. Especially indicative is the conservation of flagelin monomers, which makes up the polymer structure of flagella (Fig. 3), which in turn indicates the conservation of molecular bonds.

Таким образом, высокоиммуногенные О- и Н-антигены находятся в упаковке в указанных структурах, что и является, по-видимому, причиной их низкой токсичности. Подтверждением тому является наличие в них незначительного содержания липидных компонентов в виде следов (см. табл. 1). Thus, highly immunogenic O and H antigens are packaged in these structures, which is apparently the reason for their low toxicity. Confirmation of this is the presence in them of an insignificant content of lipid components in the form of traces (see table. 1).

В отличие от экспериментальных антигенов электронная микроскопия антигенов брюшного тифа, составляющих Т-вакцину, выявила сильное изменение всех клеточных структур, при этом видны лишь мелкие осколки клеток (фиг. 4). Кроме того, установлено значительное содержание липидов в них и высокая токсичность (см. табл. 1). In contrast to experimental antigens, electron microscopy of typhoid antigens that make up the T-vaccine revealed a strong change in all cellular structures, with only small fragments of cells visible (Fig. 4). In addition, a significant lipid content in them and high toxicity were established (see table. 1).

Таким образом, полученные данные подтверждают сильное нарушение молекулярных связей в антигенных структурных компонентах Т-вакцины и вытекающие из этого последствия. Thus, the data obtained confirm a strong violation of molecular bonds in the antigenic structural components of the T-vaccine and the ensuing consequences.

Кроме названных свойств, предложенная тетравакцина обладает также антигенной активностью при разных методах введения парентеральном и пероральном. Установлено, что подкожная инъекция или пероральное введение вакцины (см. табл. 2) индуцирует синтез специфических антител ко всем сальмонеллезным и дизентерийным компонентам вакцины. При этом на фоне полного отсутствия специфических агглютининов у контрольных, неиммунизированных животных сформировались антитела в высокой концентрации как к сальмонеллам, так и к шигеллам дизентерии. In addition to these properties, the proposed tetravaccine also has antigenic activity with various methods of parenteral and oral administration. It was found that subcutaneous injection or oral administration of the vaccine (see Table 2) induces the synthesis of specific antibodies to all salmonella and dysentery components of the vaccine. Moreover, against the background of the complete absence of specific agglutinins in the control, non-immunized animals, antibodies were formed in high concentration against both salmonella and shigella dysentery.

Особенно важными представляются данные исследований сыворотки крови добровольцев (см. табл. 3), иммунизированных тетравакциной перорально (4 человека), поскольку этот путь введения является наименее реактогенным и безболезненным. Especially important are the data from studies of blood serum of volunteers (see Table 3) immunized with an oral tetra-vaccine (4 people), since this route of administration is the least reactogenic and painless.

Результаты определения специфических антител свидетельствуют о наличии агглютининов к О-, Н- и Vi-антигенам сальмонелл тифа. Подобные результаты говорят о высокой иммунологической эффективности тетравакцины, которая даже при энтеральном введении может индуцировать синтез специфических антител ко всем наиболее иммуногенным компонентам бактериальной клетки, в том числе и к Н-антигенам, тогда как ферментативный метод не обеспечивает его сохранности. The results of the determination of specific antibodies indicate the presence of agglutinins to O-, H- and Vi-antigens of typhoid salmonella. Similar results indicate a high immunological efficacy of tetravaccine, which even after enteral administration can induce the synthesis of specific antibodies to all the most immunogenic components of a bacterial cell, including H-antigens, while the enzymatic method does not ensure its safety.

Препарат обладает также неспецифической иммуностимулирующей активностью, создавая резистентность к неродственным бактериям, при введении его животным, ослабленным сублетальными дозами гамма-облучения, а также иммуномодулирующим действием. The drug also has non-specific immunostimulating activity, creating resistance to unrelated bacteria when administered to animals weakened by sublethal doses of gamma radiation, as well as an immunomodulatory effect.

Так, однократная подкожная инъекция тетравакцины в дозе 50 мкг через 4 часа после лучевого воздействия гамма-излучения ¹³⁷Cs в дозе 300 P, а затем зараженным внутрибрюшинно различными неродственными бактериями способствовало многократному повышению сопротивляемости животных к патогенной кишечной палочке (E. coli 093), бактериям синезеленого гноя (Pseudomonas aeruginosa) и бактериям мышиного тифа (S. typhimurium). Последние вызывают также сальмонеллы у животных и человека.Thus, a single subcutaneous injection of a tetravaccine at a dose of 50 μg 4 hours after radiation exposure to gamma radiation of ¹³⁷ Cs at a dose of 300 P and then infected with intraperitoneally various unrelated bacteria contributed to a multiple increase in the resistance of animals to pathogenic Escherichia coli (E. coli 093), bacteria blue-green pus (Pseudomonas aeruginosa) and typhoid bacteria (S. typhimurium). The latter also cause salmonella in animals and humans.

Иммуномодулирующая активность тетрана установлена на мышах, при совместном его введении с эритроцитами барана (ЭБ). Установлено, что введение вакцины в дозе 50 мкг и ЭБ в дозе 2х10⁶ повышает уровень антител к T-зависимым антигенам эритроцитам барана, что является косвенным свидетельством влияния препарата на T-систему иммунитета.The immunomodulatory activity of tetran is established in mice, when administered together with ram red blood cells (EB). It was found that the introduction of a vaccine at a dose of 50 μg and EB at a dose of 2x10 ⁶ increases the level of antibodies to T-dependent antigens of sheep erythrocytes, which is indirect evidence of the effect of the drug on the T-system of immunity.

Так, через 7 и 14 суток после введения препаратов Ig титров в группах, получивших инъекцию ЭБ и тетравакцины, был равен 6,05±0,3 и 6,4±0,16 соответственно, при этом в контроле иммунизированных только ЭБ, Ig титров антител был равен соответственно 5,3±0,5 и 5,3±0,4. So, after 7 and 14 days after the administration of preparations of Ig titers in the groups that received an injection of EB and tetravaccine, it was 6.05 ± 0.3 and 6.4 ± 0.16, respectively, while in the control of immunized only EB, Ig titers antibody was equal to 5.3 ± 0.5 and 5.3 ± 0.4, respectively.

Таким образом, использование предложенной вакцины позволяет расширить спектр не только как препарат со специфической антимикробной активностью, но также как неспецифический стимулятор иммунологической реактивности организма, повышающего уровень сопротивляемости к инфицированию неродственными микроорганизмами, как патогенными, так и условно патогенными. По-видимому, в основе данного феномена лежит влияние вакцины на Т- и Б-системы иммунитета, о чем свидетельствуют опыты по совместному введению тетравакцины с Т-зависимыми антигенами (ЭБ) и иммунного ответа на это введение. Thus, the use of the proposed vaccine allows us to expand the spectrum not only as a drug with specific antimicrobial activity, but also as a nonspecific stimulator of the body's immunological reactivity, which increases the level of resistance to infection by unrelated microorganisms, both pathogenic and conditionally pathogenic. Apparently, this phenomenon is based on the effect of the vaccine on the T- and B-systems of immunity, as evidenced by experiments on the joint administration of tetravaccine with T-dependent antigens (EB) and the immune response to this introduction.

Итак, суть изобретения заключается в дополнительном включении сальмонелл паратифа Б и шигелл дизентерии Флекснера и Зонне и сохранении структурных компонентов бактериальных клеток (жгутиков, клеточных стенок) и целостности макромолекулярных связей в них. При этом в клеточных структурах сохраняются и удачно сочетаются высокоиммуногенные О-, Н- и Vi-антигены, что сопровождается кумуляцией эффекта и по сравнению с прототипом позволяет увеличить эффективность вакцины в 2-2,5 раза и снизить интегральную токсичность вакцины в 40 раз. So, the essence of the invention lies in the additional inclusion of Salmonella paratyphoid B and Shigella dysentery of Flexner and Sonne and the preservation of the structural components of bacterial cells (flagella, cell walls) and the integrity of the macromolecular bonds in them. At the same time, highly immunogenic O-, H- and Vi-antigens are preserved and successfully combined in the cell structures, which is accompanied by a cumulation of the effect and compared with the prototype allows to increase the effectiveness of the vaccine by 2-2.5 times and reduce the integral toxicity of the vaccine by 40 times.

Описанные свойства вакцины обеспечены способом ее получения. The described properties of the vaccine are provided by the method for its preparation.

Известен способ получения брошнотифозной вакцины методом панкреолиза. Однако он не позволяет получать низкотоксичное и высокоэффективное вакационное средство в связи с сильным повреждением клеточных структур. A known method of producing typhoid vaccine by pancreolysis. However, it does not allow to obtain a low toxic and highly effective vaccination agent due to severe damage to cell structures.

Наиболее удачным техническим решением, принятым за прототип, является "Способ получения иммуностимулятора". The most successful technical solution adopted for the prototype is "A method of obtaining an immunostimulant."

Способ включает водно-солевую экстракцию вещества из бактерий дизентерии, при одновременной механической дезинтеграции и последующую очистку диализом. The method includes water-salt extraction of a substance from dysentery bacteria, with simultaneous mechanical disintegration and subsequent purification by dialysis.

Однако было экспериментально установлено, что для получения предложенной тетравакцины, сохранения ее структуры и ее эффективности необходимо изменить режим щуттелирования и последовательность операций лиофилизации и смешивания компонентов бактерий. Сохранение целостности клеточных структур повышает выход целевого продукта. However, it was experimentally established that in order to obtain the proposed tetra-vaccine, preservation of its structure and its effectiveness, it is necessary to change the mode of scintillation and the sequence of lyophilization and mixing of bacterial components. Preserving the integrity of cell structures increases the yield of the target product.

Поставленная задача повышение выхода целевого продукта, расширение спектра антигенных веществ в его составе, повышение эффективности и снижение токсичности решена тем, что в способе получения вакционного препарата против патогенных кишечных инфекций, включающем раздельное культивирование шигелл Флекснера и Зонне, экстракцию иммуностимулятора из бактерий водно-солевым раствором, с одновременным механическим разрушением в присутствии антибиотика, с последующим центрифугированием, диализом надосадочной жидкости и лиофилизацией, раздельно обрабатывают сальмонеллы тифа, паратифа Б, шигеллы Флекснера и Зонне, проводят механическое разрушение путем щуттелирования в течение 1-1,5 ч, а затем после диализа производят раздельную лиофилизацию каждого компонента и смешивают их в равных пропорциях (1:1:1:1). The task is to increase the yield of the target product, expand the spectrum of antigenic substances in its composition, increase efficiency and reduce toxicity by the fact that in the method of obtaining a vaccine preparation against pathogenic intestinal infections, including separate cultivation of Shigella Flexner and Sonne, extraction of the immunostimulant from bacteria with water-salt solution , with simultaneous mechanical destruction in the presence of an antibiotic, followed by centrifugation, dialysis of the supernatant and lyophilization, times separately treat salmonella of typhoid, paratyphoid B, Shigella Flexner and Sonne, carry out mechanical destruction by gutturing for 1-1.5 hours, and then, after dialysis, separately lyophilize each component and mix them in equal proportions (1: 1: 1: 1 )

Суть изобретения заключается в том, что включение в состав вакцины компонентов сальмонелл тифа, паратифа Б, а также дизентерийных бактерий Флекснера и Зонне создало тем самым полидетерминантную структуру антигенов, что позволило увеличить поликлональную активацию лимфоидных клеток, продуцирующих антитела, вследствие чего повысилась в 2-2,5 раза иммуногенная эффективность препарата, а чтобы снизить в 40 раз токсичность вакцины, нужно было сохранить структурные компоненты клетки (клеточные стенки, жгутики). Для этого оказалось необходимым сократить время щуттелирования до 1-1,5 ч, а лиофилизацию проводить раздельно для каждого компонента, после чего смешать их в равных пропорциях. The essence of the invention lies in the fact that the inclusion in the vaccine of the components of typhoid, paratyphoid B, as well as the dysenteric bacteria Flexner and Sonne, thereby created a polydeterminant structure of antigens, which allowed to increase the polyclonal activation of lymphoid cells producing antibodies, resulting in an increase of 2-2 , 5 times the immunogenic effectiveness of the drug, and in order to reduce the toxicity of the vaccine by 40 times, it was necessary to preserve the structural components of the cell (cell walls, flagella). To do this, it was necessary to reduce the time of scuttling to 1-1.5 hours, and lyophilization separately for each component, and then mix them in equal proportions.

Предположительно можно объяснить снижение токсичности и увеличение эффективности вакцины сохранением межмолекулярных связей. Presumably, a decrease in toxicity and an increase in vaccine efficacy by maintaining intermolecular bonds can be explained.

Сохранение структуры клеточных стенок и жгутиков привело также к увеличению выхода антигенного вещества в 6-7 раз (см. табл.1). Preservation of the structure of cell walls and flagella also led to an increase in the yield of antigenic substance by 6–7 times (see Table 1).

Проведенный анализ уровня известных технических решений по патентам и научно-техническим источникам информации позволил установить, что предложение содержит новые существенные признаки, свойства которых позволяют решить поставленную задачу с получением положительного результата, не явного для специалистов в данной области техники. The analysis of the level of well-known technical solutions for patents and scientific and technical sources of information made it possible to establish that the proposal contains new significant features whose properties make it possible to solve the problem with a positive result that is not obvious to specialists in this field of technology.

Признаки, отличающие предложенное техническое решение от прототипа других вакцин, не выявлены, не выявлены они также и в способах их получения, поэтому оно соответствует критерию изобретения "новизна" и "изобретательский" уровень. Проверенный регламент получения вакцины позволяет сделать вывод в соответствии критерию "промышленная применимость". Signs that distinguish the proposed technical solution from the prototype of other vaccines have not been identified, nor have they been identified in the methods for their preparation, therefore, it meets the criteria of the invention of "novelty" and "inventive" level. The proven schedule for obtaining the vaccine allows us to conclude in accordance with the criterion of "industrial applicability".

Пример реализации способа. Проводят раздельное культивирование каждого из представителей сальмонелл и шигелл на плотных питательных средах, предварительно засеяв каждую из культур на жидкую питательную среду (инкубация 18-24 ч, 37^oC).An example implementation of the method. Separate cultivation of each of the representatives of Salmonella and Shigella on solid nutrient media is carried out, after sowing each of the cultures in a liquid nutrient medium (incubation 18-24 h, 37 ^o C).

После получения микробной массы путем смыва ее с поверхности питательной среды небольшим объемом физиологического раствора (каждую культуру в отдельности) приступают к подготовке ее дезинтеграции. Для этого культуру помещают в бутыли со стерильным битым стеклом, добавляют антибиотик и приступают к щуттелированию культуры в бутылях, укрепленных в щуттель-аппарате. Встряхивание проводят в течение 1-1,5 ч. After receiving the microbial mass by washing it off the surface of the nutrient medium with a small volume of physiological saline (each culture separately), they begin to prepare for its disintegration. To do this, the culture is placed in bottles with sterile broken glass, an antibiotic is added, and the culture is guttered in bottles fixed in the gutter device. Shaking is carried out for 1-1.5 hours

Далее проводят центрифугирование дезинтегрированной культуры и отделение надосадочной жидкости от осадка, т.е. декантирование надосадочной жидкости, в которой содержится антигенное вещество бактерий. Next, centrifugation of the disintegrated culture and separation of the supernatant from the sediment, i.e. decantation of the supernatant, which contains the antigenic substance of bacteria.

После контроля стерильности декантата проводят его очистку от примеси питательной среды путем диализа против водопроводной (1 сутки), а затем дистиллированной воды (1 сутки). After controlling the sterility of the decantate, it is purified from the impurity of the nutrient medium by dialysis against tap water (1 day) and then distilled water (1 day).

Затем проводят раздельное высушивание декантатов каждой из входящих компонентов вакцины в лиофилизированном состоянии. Then carry out separate drying of the decantates of each of the incoming components of the vaccine in a lyophilized state.

После высушивания декантатов (сухое антигенное вещество) приступают к их смешиванию в равных пропорциях (1:1:1:1) по весу. After drying the decantates (dry antigenic substance), they are mixed in equal proportions (1: 1: 1: 1) by weight.

Полученная смесь является вакциной против патогенных кишечных инфекций, содержащей сальмонеллы тифа, паратифа Б и шигеллы Флекснера и Зонне. The resulting mixture is a vaccine against pathogenic intestinal infections containing typhoid salmonella, paratyphoid B and Shigella Flexner and Sonne.

Таким образом, реализация предложенного способа позволяет увеличить выход антигенного вещества, при этом снизить токсичность и увеличить эффективность. Thus, the implementation of the proposed method allows to increase the yield of antigenic substances, while reducing toxicity and increasing efficiency.

Claims

A method of obtaining a multivalent vaccine against intestinal infections, including the separate cultivation of cultures of Salmonella typhi, Salmonella paratyphi B, Shigella Flexneria, Shigella Sonne, separation of biomass from the nutrient medium, separate extraction of antigens, their purification, isolation of immunogenic components, their drying, followed by mixing in equal proportions characterized in that the extraction of antigens is carried out with a water-salt solution while shuttling in the presence of an antibiotic and finely divided glass for 1 1.5 hours, the obtained extracts are centrifuged The supernatants are purified, and after mixing, the desired product is obtained in the form of a mixture of cell walls containing O-antigens of the used cultures, with flagella containing H-antigens and soluble Salmonella Vi-antigens.