RU2067763C1

RU2067763C1 - Method of kinetic analysis of cell population reactivity

Info

Publication number: RU2067763C1
Authority: RU
Inventors: Л.Е. Немировский; И.Г. Соловьева; С.В. Лямов
Original assignee: Немировский Лазарь Ефимович
Priority date: 1992-06-29
Filing date: 1992-06-29
Publication date: 1996-10-10

Abstract

FIELD: medicine, laboratory diagnosis. SUBSTANCE: for analysis in automatic cytometer where cultural flask is combined with analytical cuvette very diluted cell culture is used. Slowed down regime of cell activation is produced that ensures to record functional cell groups. These three-dimensional compositions are "enhancers" for changes in separate cells and reflect the level of cell population activation. Under these conditions it is possible to carry out the continuous cell monitoring at effect of adequate gene inductor. Process analysis at nonspecific stage of gene induction ensures to obtain quantitative reactivity value without dependence of cell type and inductor nature. EFFECT: high efficiency, simplified method, quickness, low price. 10 dwg

Description

Изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к проблеме активации клеток. The invention relates to the field of cell biology, in particular to the problem of cell activation.

Активация клеток фундаментальный цитобиологический процесс, лежащий в основе реализации различных клеточных функций. Оценка реактивности клеточных популяций на основе динамического анализа активации клеток может быть использована в медицине, сельском хозяйстве, ветеринарии, общей биологии, прикладной экологии, генетике и других областях знаний. Она позволяет ввести количественные критерии адекватности (неадекватности) взаимодействия клеток-мишеней с факторами среды и меры этих взаимодействий. Cell activation is a fundamental cytobiological process that underlies the implementation of various cellular functions. The assessment of the reactivity of cell populations based on a dynamic analysis of cell activation can be used in medicine, agriculture, veterinary medicine, general biology, applied ecology, genetics and other fields of knowledge. It allows one to introduce quantitative criteria for the adequacy (inadequacy) of the interaction of target cells with environmental factors and the measures of these interactions.

Наиболее принятыми способами оценки клеточной реактивности является анализ взаимодействия клеток с адекватными активаторами с помощью цитохимических, морфологических и изотопных методов исследования. The most accepted methods for assessing cell reactivity are the analysis of the interaction of cells with adequate activators using cytochemical, morphological and isotopic research methods.

Типичным и хорошо распространенным способом оценки клеточной реактивности является реакция бласттрансформации лейкоцитов (лимфоцитов) периферической крови человека и животных морфологический и изотопный варианты [1] Этот метод достаточно информативен, однако требует существенных временных затрат (3-4 суток), трудоемок, содержит субъективную компоненту оценки; кроме того, некоторые из используемых реактивов оказывают токсическое воздействие на персонал. Morphological and isotopic variants of the leukocytes (lymphocytes) of human and animal peripheral blood leukocytes (lymphocytes) are a typical and well-common way of assessing cell reactivity [1] This method is quite informative, but it requires significant time (3-4 days), it is time-consuming, it contains a subjective evaluation component ; in addition, some of the reagents used have toxic effects on personnel.

Наиболее близким техническим решением является оценка клеточной реактивности с помощью проточного цитометра [2] Клетки помещают в культуральные сосуды в стерильных условиях и культивируют в течение 48-96 часов с адекватным индуктором, используя специальные питательные среды. В том случае, когда исследуют кинетику процесса, культуру разливают в целый ряд культуральных флаконов и, с учетом статистических закономерностей, материал исследуют в сериях флаконов с заданным временным интервалом. Изредка исследуют процесс активации на "коротком" временном отрезке 1-4 часа с интервалом 15-30 мин, наиболее часто многосуточный процесс 2-4 суток с интервалом 12-24 часа. Анализ состояния клеток ведется с использованием различных флюорохромов, позволяющих оценить количество ДНК, РНК или белка в клетке, и на этом основании делают заключение о характере процесса активации. Рассматривая конкретно модель пролиферативного процесса, как правило, оценивают его интенсивность: число ДНК-синтезирующих клеток, количество ДНК в клетке, а также формы распределений по этим параметрам. На этом основании дают сравнительную характеристику популяций, указывая на большую или меньшую реактивность клеток в зависимости от их пролиферативной активности. Такую оценку проводят и на основании измерения количества РНК и белка в единичных клетках. К достоинствам проточной цитометрии следует отнести высокую скорость, точность измерения клеточных параметров. Вместе с тем, классическая постановка клеточных культур для оценки реактивности требует длительного времени (несколько суток), дорогих реактивов и оборудования, достаточно трудоемка. Клетки, подвергнутые анализу с помощью проточного цитометра, не могут быть объектом дальнейшего исследования. Более того, достаточно подробная кинетика поведения клеток в ходе реализации быстрого биологического процесса практически невозможна. Кроме того, "перезарядка" прибора для каждой новой пробы также требует больших временных затрат, и поэтому производительность такого дорогостоящего прибора в итоге невысока. The closest technical solution is to assess cell reactivity using a flow cytometer [2]. The cells are placed in culture vessels under sterile conditions and cultured for 48-96 hours with an adequate inducer using special nutrient media. In the case when the kinetics of the process is examined, the culture is poured into a number of culture bottles and, taking into account statistical patterns, the material is examined in a series of bottles with a given time interval. Occasionally, the activation process is studied on a "short" time period of 1-4 hours with an interval of 15-30 minutes, most often a multi-day process of 2-4 days with an interval of 12-24 hours. The analysis of the state of the cells is carried out using various fluorochromes, which make it possible to estimate the amount of DNA, RNA, or protein in the cell, and on this basis a conclusion is drawn on the nature of the activation process. When considering a specific model of a proliferative process, as a rule, its intensity is assessed: the number of DNA synthesizing cells, the amount of DNA in the cell, as well as the shape of the distribution of these parameters. On this basis, give a comparative characterization of populations, indicating a greater or lesser reactivity of cells depending on their proliferative activity. This assessment is also carried out on the basis of measuring the amount of RNA and protein in single cells. The advantages of flow cytometry include high speed, accuracy of measurement of cellular parameters. At the same time, the classical formulation of cell cultures for evaluating reactivity requires a long time (several days), expensive reagents and equipment, quite time-consuming. Cells analyzed by flow cytometer cannot be the subject of further research. Moreover, a sufficiently detailed kinetics of cell behavior during the implementation of a fast biological process is almost impossible. In addition, the "recharge" of the device for each new sample also requires a lot of time, and therefore the performance of such an expensive device is ultimately low.

В предлагаемом способе аналитическая кювета совмещена с культуральным сосудом, а процессе анализируется в сильно разбавленной клеточной суспензии на неспецифической стадии генной индукции в динамическом режиме. Созданный таким образом замедленный режим активации инициировал формирование 3-х-мерных функциональных клеточных ансамблей как механизма создания локальной концентрации сигнальных продуктов и межклеточного обмена информацией. С другой стороны, разреженная культура удовлетворяла требованиям системы светорассеяния как аналитической системы. Автоматизированная система анализа поведения клеток в культуре исключает во многом субъективную компоненту анализа. Вывод о характере реактивности клеток базируется на результатах оценки исходного состояния клеток (гистограмма их распределения по размерам), кинетических характеристик активации клеток и показателей завершения переходного процесса. Непрерывный контроль за процессом активации клеток на неспецифической стадии генной индукции позволяет регистрировать с высоким усреднением (2000 измерений за 10 сек) параметры исходного состояния клеток, а также такие параметры, как интеграл активации, доля вовлеченных в активацию клеток, начальная и средняя скорость процесса, длительность неспецифической стадии, скорость релаксации неспецифической стадии генной индукции. In the proposed method, the analytical cell is combined with the culture vessel, and the process is analyzed in a highly diluted cell suspension at a non-specific stage of gene induction in a dynamic mode. The delayed activation mode created in this way initiated the formation of 3-dimensional functional cell ensembles as a mechanism for creating a local concentration of signal products and intercellular information exchange. On the other hand, a sparse culture met the requirements of a light scattering system as an analytical system. An automated system for analyzing cell behavior in culture excludes in many respects the subjective component of the analysis. The conclusion about the nature of cell reactivity is based on the results of evaluating the initial state of cells (a histogram of their size distribution), kinetic characteristics of cell activation, and indicators of completion of the transition process. Continuous monitoring of the cell activation process at the non-specific stage of gene induction allows us to record with high averaging (2000 measurements in 10 sec) the parameters of the initial state of the cells, as well as parameters such as the activation integral, the fraction of cells involved in the activation, the initial and average speed of the process, the duration non-specific stage, relaxation rate of the non-specific stage of gene induction.

Сопоставление предлагаемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что позволяет помимо измерения изменений размеров клеток под влиянием генного индуктора регистрировать и функциональные клеточные ансамбли, количество и размеры которых надежно отражают уровень активации клеток. Проведение анализа именно на неспецифической стадии генной индукции позволяет не только сократить временные затраты оценки реактивности клеточных популяций, но и проводить адекватное сравнение качественно различающихся живых систем. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию изобретения "новизна". A comparison of the proposed solution with the prototype shows that the claimed method differs from the known one in that, in addition to measuring changes in cell sizes under the influence of a gene inducer, it is also possible to register functional cell ensembles, the number and sizes of which reliably reflect the level of cell activation. Conducting an analysis precisely at the non-specific stage of gene induction allows not only to reduce the time spent evaluating the reactivity of cell populations, but also to conduct an adequate comparison of qualitatively different living systems. Thus, the claimed method meets the criteria of the invention of "novelty."

Известны технические решения, которые позволяют вести кинетический анализ поведения клеток в различных биологических процессах. Однако такой анализ производится с помощью забора проб клеток и требует временных затрат. В заявляемом техническом решении кинетический анализ проводится в автоматическом режиме с минимальным интервалом между измерениями вплоть до 10 сек без вмешательства в процесс культивирования и без изъятия клеток. Такой методический прием позволяет вести непрерывный мониторинг различных биологических процессов. Known technical solutions that allow kinetic analysis of cell behavior in various biological processes. However, such an analysis is performed using cell sampling and is time consuming. In the claimed technical solution, the kinetic analysis is carried out automatically with a minimum interval between measurements up to 10 seconds without interfering with the cultivation process and without removing cells. This methodological technique allows continuous monitoring of various biological processes.

Известны аналитические системы, в которых инкубационный (культуральный) сосуд также выполняет функцию аналитической кюветы. Например, в хемилюминометрах и иных кюветных флюориметрах. В этих приборах могут исследоваться и живые клетки, подвергнутые различным воздействиям и обработанные различными флюоресцентными зондами, существенно не нарушающими их жизнеспособности. При этом возможен и кинетический анализ воздействия того или иного агента на клетки. Так исследуется влияние агентов, тропных к клеточной мембране, различных радиомиметиков, пылевых частиц и т.п. Однако в этом случае регистрируется совокупная реакция, учитывающая изменение клеток и культуральной среды, которая интегрируется как реакция мембран, митохондрий, генома и т.п. и не используется для оценки интегральной клеточной реактивности. Все это дает возможность сделать вывод о соответствии предлагаемого способа критерию "существенные отличия". Analytical systems are known in which an incubation (culture) vessel also serves as an analytical cell. For example, in chemiluminometers and other cuvette fluorimeters. In these devices, living cells exposed to various influences and treated with various fluorescent probes, which do not substantially violate their viability, can be examined. At the same time, a kinetic analysis of the effect of one or another agent on the cells is also possible. Thus, the effect of agents tropic to the cell membrane, various radiomimetics, dust particles, etc., is investigated. However, in this case, a cumulative reaction is recorded that takes into account the change in cells and culture medium, which is integrated as a reaction of membranes, mitochondria, genome, etc. and is not used to evaluate integral cellular reactivity. All this makes it possible to conclude that the proposed method meets the criterion of "significant differences".

Возможность оценки с помощью нашего способа реактивности клеточной популяции в течение нескольких минут указывает на то, что способ скор, минимально трудоемок, достаточно прост и дешев. При этом простая процедура смены образцов (заполнение кюветы клеточной суспензией) указывает на высокую производительность аналитической системы. The possibility of evaluating the reactivity of the cell population within a few minutes using our method indicates that the method is quick, minimally time-consuming, quite simple and cheap. In this case, a simple procedure for changing samples (filling a cell with a cell suspension) indicates a high productivity of the analytical system.

На фиг. 1, отражающем исходное состояние популяции, представлено распределение лимфоцитов периферической крови здорового донора по размерам, позволяющее оценить следующие параметры, отражающие реактивность популяции: доля интактных клеток и интеграл активации популяции. При формировании обучающей выборки было проанализировано 100 здоровых доноров (фиг. 2а), на фиг. 2б представлена усредненная кривая, характеризующая генеральную совокупность клеточных популяций. Кластерный анализ экспериментального материала позволил выделить 4 группы популяций среди здоровых лиц (фиг. 3а, б). Следует отметить высокую воспроизводимость методики. Один и тот же образец крови, исследованный утром и вечером того же дня, не дал достоверных отличий распределений клеток по размерам (фиг. 4). Исследования процесса активации с интервалом 10 сек позволили зарегистрировать достоверные различия: из 18 значений лишь в одном случае вектор изменений был обратным (фиг. 5). Анализ процесса активации различных пациентов на неспецифической стадии генной индукции с учетом разработанных нами критериев (см. табл. 1) позволил выделить несколько типов реакций (фиг. 6), в том числе и по начальным скоростям процесса (фиг. 7). Предложенным способом были исследованы пациенты с различными нарушениями иммунореактивности (фиг. 8). Метод представляется достаточно универсальным, пригодным не только для клинической практики, но и для экспериментальных исследований (фиг. 9, 10, 11) в различных областях науки. In FIG. Figure 1, which reflects the initial state of the population, presents the size distribution of peripheral blood lymphocytes of a healthy donor, which makes it possible to evaluate the following parameters reflecting the reactivity of the population: the proportion of intact cells and the integral of activation of the population. When forming the training sample, 100 healthy donors were analyzed (Fig. 2a), in FIG. 2b presents an averaged curve characterizing the general population of cell populations. Cluster analysis of the experimental material made it possible to distinguish 4 groups of populations among healthy individuals (Fig. 3a, b). It should be noted the high reproducibility of the technique. The same blood sample examined in the morning and evening of the same day did not give significant differences in cell size distributions (Fig. 4). Studies of the activation process with an interval of 10 seconds allowed us to register significant differences: out of 18 values, in only one case, the vector of changes was the opposite (Fig. 5). Analysis of the activation process of various patients at the non-specific stage of gene induction, taking into account the criteria developed by us (see Table 1), allowed us to identify several types of reactions (Fig. 6), including the initial process speeds (Fig. 7). The proposed method was studied patients with various disorders of immunoreactivity (Fig. 8). The method seems to be quite universal, suitable not only for clinical practice, but also for experimental studies (Fig. 9, 10, 11) in various fields of science.

В качестве примера конкретной реализации способа мы приводим анализ реактивности лимфоцитов периферической крови здорового донора. As an example of a specific implementation of the method, we give an analysis of the reactivity of peripheral blood lymphocytes of a healthy donor.

Из венозной крови, сохранявшейся при температуре 1- 2^oC с помощью фикол-верографинового градиента (1,077) была получена фракция лимфоцитов с примесью небольшого количества эритроцитов. После 10 сек воздействия на эритроциты дистиллированной воды и 3-кратной промывки лимфоцитов раствором Хэнкса, их помещали в среду N 199 в концентрации 20 тыс. кл./мл в рабочую кювету автоматизированной системы малоуглового рассеяния (в нашем случае - система MALVERN 2600с). Для случая дифракции Фраунгофера с помощью специального алгоритма преобразования аналоговых сигналов с фотоприемника из 32 площадок, мы получали распределение клеток по размерам исходное состояние популяции, а также кинетику их активации при воздействии стандартного индуктора. В процессе разработки метода мы использовали различные клеточные популяции, а также различные лиганды: лектины, гормоны, медиаторы и т.п. в частности ФГА фирмы Difcom в концентрации 7,5 мкг/мл. Регистрацию размеров клеток и функциональных клеточных ансамблей проводили путем многократного "опроса" датчиков в течение всего периода неспецифического этапа генной индукции (практически до остановки реакции). Проводилось 2000 опросов за 10 сек с интервалом от 10 до 180 сек в зависимости от скорости процесса. Продолжительность неспецифической стадии генной индукции составляет порядка 60 минут в стандартных условиях реализации предложенного способа.From venous blood maintained at a temperature of 1-2 ^° C using a ficol-verographin gradient (1.077), a fraction of lymphocytes with an admixture of a small amount of red blood cells was obtained. After 10 seconds of exposure to red blood cells with distilled water and a 3-fold washing of lymphocytes with Hanks solution, they were placed in medium N 199 at a concentration of 20 thousand cells / ml in a working cell of an automated small-angle scattering system (in our case, the MALVERN 2600с system). For the case of Fraunhofer diffraction using a special algorithm for converting analog signals from a photodetector from 32 sites, we obtained the size distribution of cells in the initial state of the population, as well as the kinetics of their activation when exposed to a standard inductor. In the process of developing the method, we used various cell populations, as well as various ligands: lectins, hormones, mediators, etc. in particular, PHA from Difcom at a concentration of 7.5 μg / ml. Cell sizes and functional cell ensembles were recorded by repeated “interrogation” of sensors during the entire period of the non-specific stage of gene induction (almost until the reaction stopped). 2000 polls were conducted in 10 seconds with an interval of 10 to 180 seconds, depending on the speed of the process. The duration of the non-specific stage of gene induction is about 60 minutes under standard conditions for the implementation of the proposed method.

В аналитической кювете в условиях стандартного перемешивания среды при температуре 37^oC под влиянием индуктора происходит активация клеток, которая на неспецифической стадии генной индукции реализуется как универсальный стереотипный процесс. Сущность этого процесса, как известно, сводится к реорганизации структуры клетки, а также структуры клеточного ядра с активацией хроматина, увеличение объема клеточных органелл, повышением мощности аппарата биосинтеза и метаболизма и соответствующего увеличения объема ядра и клетки в целом. Известным образом изменяются клеточная мембрана и рецепторный прибор, что приводит к резкому повышению адгезионных свойств клеток. По мере углубления процесса в активацию вступает все большее число клеток, соответственно увеличивается и уровень их активации. Изменение клеточного аффинитета приводит к закономерному формированию функциональных клеточных ансамблей, величина и размеры которых отражают уровень активации популяции. Измерение размеров клеточных ансамблей как меры активации повышает точность предлагаемого способа оценки реактивности популяции.In an analytical cell under conditions of standard mixing of the medium at a temperature of 37 ^o C under the influence of an inducer, the activation of cells occurs, which at the non-specific stage of gene induction is realized as a universal stereotypical process. The essence of this process, as is known, comes down to the reorganization of the cell structure, as well as the structure of the cell nucleus with chromatin activation, an increase in the volume of cellular organelles, an increase in the capacity of the biosynthesis and metabolism apparatus, and a corresponding increase in the volume of the nucleus and the cell as a whole. In a known manner, the cell membrane and receptor device are changed, which leads to a sharp increase in the adhesive properties of cells. As the process deepens, more and more cells enter activation, and their activation level accordingly increases. A change in cellular affinity leads to the regular formation of functional cellular ensembles, the size and dimensions of which reflect the level of activation of the population. Measuring the size of cell ensembles as a measure of activation increases the accuracy of the proposed method for assessing the reactivity of a population.

Лимитирующими факторами процесса активации являются: исходное функциональное состояние клеток, их концентрация, соотношение разных типов клеток, участвующих в кооперации ответной реакции, число (соотношение) индиферентных по отношению к индуктору клеток, доза индуктора, особенности среды. Строгое соблюдение условий анализа позволяет корректно вести сравнительный кинетический анализ процесса активации (фиг. 7). The limiting factors of the activation process are: the initial functional state of the cells, their concentration, the ratio of different types of cells involved in the cooperation of the response, the number (ratio) of cells that are indifferent to the inductor, the dose of the inducer, and features of the medium. Strict adherence to the analysis conditions allows you to correctly conduct a comparative kinetic analysis of the activation process (Fig. 7).

Управляемый по скорости процесс активации позволяет в зависимости от его специфики либо резко ускорять, либо использовать лишь параметры, характеризующие начальный этап активации (например, начальную скорость процесса), и, таким образом, существенно сократить время анализа. В нашей практике при исследовании взаимодействия лимфоцитов периферической крови человека с инсулином время анализа составило 6 мин 36 измерений с интервалом 10 сек. The activation process controlled by speed allows either sharply accelerating, or using only parameters characterizing the initial stage of activation (for example, the initial speed of the process) depending on its specifics, and thus significantly reduce the analysis time. In our practice, when studying the interaction of human peripheral blood lymphocytes with insulin, the analysis time was 6 min 36 measurements with an interval of 10 sec.

Для оценки реактивности клеточных популяций нами были использованы такие параметры исходного состояния, как доля объектов с размерами до 11 мкм, что соответствует доле интактных клеток, а также интеграл активации исходной популяции. Состояние активированной популяции определялось в течение неспецифической стадии активации, при этом учитывалась начальная скорость процесса, доля клеток, вовлеченных в процессе активации, интеграл активации популяции в конце неспецифической стадии генной индукции, а также средний показатель активации единичной клетки (табл. 1). Учет предложенных нами параметров при исследовании модельных клеточных сообществ и позволяет сделать вывод о характере и степени реактивности различных клеточных популяций. To assess the reactivity of cell populations, we used such parameters of the initial state as the proportion of objects with sizes up to 11 μm, which corresponds to the proportion of intact cells, as well as the integral of activation of the initial population. The state of the activated population was determined during the non-specific stage of activation, taking into account the initial speed of the process, the fraction of cells involved in the activation process, the integral of population activation at the end of the non-specific stage of gene induction, and the average activation rate of a single cell (Table 1). Taking into account the parameters proposed by us in the study of model cell communities allows us to conclude on the nature and degree of reactivity of various cell populations.

Активация как сложный кооперативный процесс в зависимости от упомянутых и иных лимитирующих факторов может эффективно отражаться различными сочетаниями предложенных нами кинетических параметров. Так например, активация лимфоцитов периферической крови пациента с острым лимфолейкозом эффективно определяется таким параметром как доля вовлеченных в активацию клеток: в норме 48% 53% 46% 60% у пациента 21% и не требует иных параметров. Однако один этот параметр при сравнении, например, интактных и облученных клеток оказался неэффективным и потребовал привлечения других параметров для проведения сравнительного анализа: интеграл активации для здоровых доноров 2404, 2255, 2476, 4049, 3735, а для облученных клеток 4329, 4882, 5461. Activation as a complex cooperative process, depending on the mentioned and other limiting factors, can be effectively reflected by various combinations of the kinetic parameters proposed by us. For example, the activation of peripheral blood lymphocytes of a patient with acute lymphocytic leukemia is effectively determined by such a parameter as the percentage of cells involved in activation: normally 48% 53% 46% 60% in a patient 21% and does not require other parameters. However, this parameter alone, when comparing, for example, intact and irradiated cells, was ineffective and required the use of other parameters for comparative analysis: the activation integral for healthy donors was 2404, 2255, 2476, 4049, 3735, and for irradiated cells, 4329, 4882, 5461.

Использование предлагаемого способа оценки реактивности клеточных популяций (в сравнении с прототипом) позволяет считать его более эффективным, а также снижает трудоемкость и временные затраты от нескольких суток до 1-1,5 часов, и даже нескольких минут. Кроме того, отпадает необходимость работы в стерильных условиях, использования дорогостоящих реактивов и сред, что существенно удешевляет постановку предложенного метода. Отпадает необходимость в использовании вредных для персонала химикатов. Предложенный способ универсален: пригоден для работы с любыми изолированными клетками человека, животных, растений, дрожжей и т.п. Все это позволяет его широко использовать при решении разнообразных задач в медицине, биологии, ветеринарии, экологии, сельском хозяйстве, а также для решения вопросов радиационной защиты и других. Using the proposed method for evaluating the reactivity of cell populations (in comparison with the prototype) allows us to consider it more effective, and also reduces the complexity and time costs from several days to 1-1.5 hours, and even several minutes. In addition, there is no need to work in sterile conditions, the use of expensive reagents and media, which significantly reduces the cost of setting the proposed method. There is no need to use chemicals harmful to personnel. The proposed method is universal: suitable for working with any isolated cells of a person, animal, plant, yeast, etc. All this allows it to be widely used in solving various problems in medicine, biology, veterinary medicine, ecology, agriculture, as well as for solving radiation protection issues and others.

Claims

A method for kinetic analysis of the reactivity of cell populations by placing cells in a vessel with a culture medium, exposing them to a gene inducer, followed by evaluation of the light-optical parameters of the cells, characterized in that the suspension of cells in the incubation medium is placed in a cell of an automatic cytomer at a concentration of not more than 500,000 cells per milliliter and the reactivity of the cell population with uniform and continuous mixing of cells in a cuvette is determined from the moment the activator is introduced in dynamics at intervals of five seconds und at a non-specific stage of gene induction in real time.