RU2060034C1

RU2060034C1 - Method of immunoglobulin preparation preparing

Info

Publication number: RU2060034C1
Application number: RU93032577A
Authority: RU
Inventors: В.А. Алешкин; И.В. Борисова; Г.В. Быко-Янко
Original assignee: Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского
Priority date: 1993-06-22
Filing date: 1993-06-22
Publication date: 1996-05-20

Abstract

FIELD: medicine, immunology. SUBSTANCE: spirituous precipitate B (fraction III) is extracted in 40-60-fold volume of sodium chloride solution to remove lipoproteins and treated with chloroform. Precipitation of immunoglobulin fraction from extract is carried out in the presence of 12% polyethylene glycol. Purification degree from immunologically inactive fractions is increased by 3-5-fold as compared with prototype. The cost of preparation is decreased by 25% as compared with that of prototype. Preparation can be used for immunotherapy and immunoprophylaxis of bacterial and viral diseases. EFFECT: improved method of immunoglobulin preparing.

Description

Изобретение относится к медицине, в частности, к иммунологии и может быть использовано для иммунотерапии и иммунопрофилактики бактериальных и вирусных заболеваний. The invention relates to medicine, in particular to immunology, and can be used for immunotherapy and immunoprophylaxis of bacterial and viral diseases.

Препараты человеческого иммуноглобулина, применяемые в настоящее время, получили высокую оценку в практике борьбы с рядом заболеваний. Однако современные коммерческие препараты гаммаглобулина, изготовленные этаноловым методом по Кону, содержат, в основном, IgG-иммуноглобулины и лишь небольшие количества иммуноглобулинов других классов, которые удаляются с балластными фракциями в процессе производства. Currently used human immunoglobulin preparations have been praised in the practice of combating a number of diseases. However, modern commercial gammaglobulin preparations made by the Cohn ethanol method contain mainly IgG immunoglobulins and only small amounts of other classes of immunoglobulins that are removed with ballast fractions during production.

В коммерческих препаратах иммуноглобулина содержатся антитела против токсинов многих вирусов, но антитела против ряда возбудителей бактериальной природы (эшерихии, сальмонеллы, шинеллы) содержатся в относительно невысоких титрах. Антибактериальные антитела в нормальной сыворотке относятся, в основном, к фракции IgM, которая попадает в препараты в небольших количествах. Commercial immunoglobulin preparations contain antibodies against the toxins of many viruses, but antibodies against a number of pathogens of a bacterial nature (Escherichia, Salmonella, Chinella) are contained in relatively low titers. Antibacterial antibodies in normal serum relate mainly to the IgM fraction, which gets into preparations in small quantities.

Применение обычных препаратов гаммаглобулина недостаточно эффективно при ряде инфекций у новорожденных и детей первых месяцев жизни, кровь которых отличается низким содержанием иммуноглобулинов классов М и А. The use of conventional gammaglobulin preparations is not effective enough for a number of infections in newborns and children in the first months of life, whose blood is characterized by a low content of immunoglobulins of classes M and A.

В настоящее время в ряде стран выпускаются и применяются в клинике препараты, обогащенные IgM и/или IgA для профилактики и лечения тяжелых бактериальных инфекций, сепсиса, иммунодефицитных заболеваний. Currently, a number of countries produce and use in the clinic drugs enriched with IgM and / or IgA for the prevention and treatment of severe bacterial infections, sepsis, and immunodeficiency diseases.

Известен способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП) из осадка Б (III фракции Кона), являющегося балластной фракцией при спиртовом фракционировании сыворотки (Экспериментально-производственный регламент N 338-91 иммуноглобулин человека, сухой, для энтерального применения. УТВ. 06.09.91). A known method for producing a complex immunoglobulin preparation (CIP) from sediment B (Cohn III fraction), which is the ballast fraction in alcohol fractionation of serum (Experimental production regulation N 338-91 human immunoglobulin, dry, for enteral use. UTV. 06.09.91).

Способ предусматривает солевую экстракцию осадка Б в 0,9%-ном растворе хлорида натрия (в соотношении 1:10, т.е. в десятикратном объеме). Обработку экстракта осадка Б ведут хлоридом (10% по объему) с декстрансульфатом (0,1%) с целью удаления липопротеидов и последующее осаждение иммуноглобулинов полиэтиленгликолем (5%). Препарат, полученный по этому способу содержит 55-60% IgG, 25-30% IgМ и 15-20% IgA он содержит высокие титры антител против ряда энтеробактерий (эшерихий, шигелл, сальмонелл) и ряда вирусов (в частности, ротавирусов). Недостатком способа является то, что он не позволяет получать препарат, свободный от примесей иммунологически неактивных белковых фракций, присутствие которых в препарате вызывает аллергизацию организма. Содержание иммунологически неактивных фракций достигает в нем 3-5%
Кроме того, способ предусматривает применение в технологии дорогостоящего реагента декстрансульфата.The method involves salt extraction of sediment B in a 0.9% sodium chloride solution (in a ratio of 1:10, i.e. in a tenfold volume). Sediment B is treated with chloride (10% by volume) with dextran sulfate (0.1%) to remove lipoproteins and subsequent precipitation of immunoglobulins with polyethylene glycol (5%). The drug obtained by this method contains 55-60% IgG, 25-30% IgM and 15-20% IgA; it contains high titers of antibodies against a number of enterobacteria (Escherichia, Shigella, Salmonella) and a number of viruses (in particular rotaviruses). The disadvantage of this method is that it does not allow to obtain a drug free from impurities of immunologically inactive protein fractions, the presence of which in the preparation causes allergization of the body. The content of immunologically inactive fractions in it reaches 3-5%
In addition, the method involves the use in the technology of an expensive reagent dextran sulfate.

Целью изобретения является получение иммуноглобулинового препарата, свободного от примесей балластных белков, упрощение технологии и снижение себестоимости. The aim of the invention is to obtain an immunoglobulin preparation free of ballast protein impurities, simplification of technology and cost reduction.

Это достигается тем, что экстракцию осадка Б проводят в сорока-шестидесятикратном объеме 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Последующую обработку экстракта осадка Б проводят одним хлороформом без добавления декстрансульфата, что дает возможность снизить содержание иммунологически неактивных примесей до 0-1% Это происходит благодаря лучшему связыванию хлороформа с положительно заряженными группами на поверхности липопротеидов в разбавленном растворе и выпадению комплекса хлороформ + липопротеины в легко отделяемый осадок. Сорока-шестидесятикратный объем хлорида натрия является оптимальным, т. к. при снижении объема ниже 40 образующийся осадок полностью не отделяется от раствора, а увеличение выше 60 ведет к нерациональному расходу реагентов и увеличению времени технологического процесса. Исключение из технологического процесса декстрансульфата позволяет снизить себестоимость препарата. This is achieved by the fact that the extraction of sediment B is carried out in a forty-sixty-fold volume of a 0.9% sodium chloride solution. Subsequent treatment of the precipitate extract B is carried out with chloroform alone without the addition of dextransulfate, which makes it possible to reduce the content of immunologically inactive impurities to 0-1%. This is due to better binding of chloroform to positively charged groups on the surface of lipoproteins in a dilute solution and precipitation of the chloroform + lipoproteins complex in an easily separated sediment. Forty-sixty times the volume of sodium chloride is optimal, because when the volume decreases below 40, the precipitate formed does not completely separate from the solution, and an increase above 60 leads to irrational consumption of reagents and an increase in the process time. The exclusion of dextransulfate from the process allows to reduce the cost of the drug.

П р и м е р. К 1 кг осадка Б добавляют 50 л 0,9%-ного раствора хлорида натрия при постоянном перемешивании. Объем экстракта 50 л, содержание белка 0,5%
К экстракту осадка Б добавляют 5 л хлороформа (10% по объему). Смесь медленно перемешивают в течение 2 ч, затем центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин до получения прозрачного центрифугата. Осадок удаляют. Объем центрифугата составляет 50 л, содержание белка 0,1%
К 50 л экстракта для концентрирования иммуноглобулинов добавляют 50%-ный раствор полиэтиленгликоля (м. м. 6 тыc.) до конечной концентрации 12% при постоянном перемешивании.PRI me R. To 1 kg of sediment B add 50 l of 0.9% sodium chloride solution with constant stirring. Extract volume 50 l, protein content 0.5%
5 L of chloroform (10% by volume) was added to the precipitate extract B. The mixture is slowly stirred for 2 hours, then centrifuged for 30 minutes at 3000 rpm to obtain a clear centrifuge. The precipitate is removed. The centrifugate volume is 50 l, the protein content is 0.1%
To 50 l of the extract for the concentration of immunoglobulins add a 50% solution of polyethylene glycol (m. 6 thousand) to a final concentration of 12% with constant stirring.

Осадок иммуноглобулинов отделяют путем декантации и центрифугирования в течение 15-30 мин при 3000 об/мин на центрифуге с охлаждением. Осадок промывают 300-400 мл дистиллированной воды, подкисленной до рН 5 ± 0,2. The precipitate of immunoglobulins is separated by decantation and centrifugation for 15-30 minutes at 3000 rpm in a centrifuge with cooling. The precipitate is washed with 300-400 ml of distilled water, acidified to pH 5 ± 0.2.

Осадок иммуноглобулинов растворяют в охлажденном 0,9%-ном растворе хлорида натрия до содержания белка около 5-6% рН 6,3. После растворения осадка препарат центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин на центрифуге с охлаждением для удаления нерастворимых примесей. The immunoglobulin precipitate is dissolved in a cooled 0.9% sodium chloride solution until a protein content of about 5-6% pH 6.3. After dissolving the precipitate, the preparation is centrifuged for 15 min at 3000 rpm in a centrifuge with cooling to remove insoluble impurities.

К раствору после центрифугирования добавляют глюкозу до конечной концентрации 2% в качестве стабилизатора. After centrifugation, glucose is added to the solution to a final concentration of 2% as a stabilizer.

Специфическая активность (титр антител) полученного препарата не отличается от прототипа: к шигеллам 1:320; к сальмонеллам 1:640; к эшерихиям 1: 1280; к ротавирусу 1:128000. The specific activity (antibody titer) of the resulting preparation does not differ from the prototype: to Shigella 1: 320; Salmonella 1: 640; to the Escherichia 1: 1280; to rotavirus 1: 128000.

Содержание иммунологически неактивных фракций, определяемых методом бумажного электрофореза, составляет 0-1% т.е. уменьшается по сравнению с прототипом в 3-5 раз. The content of immunologically inactive fractions determined by paper electrophoresis is 0-1% i.e. reduced compared with the prototype 3-5 times.

Т. о. высокоочищенный от иммунологически неактивных фракций комплексный иммуноглобулиновый препарат получен экономически эффективным способом. T. about. a complex immunoglobulin preparation highly purified from immunologically inactive fractions was obtained in a cost-effective way.

Себестоимость препарата по сравнению с прототипом снижена на 25% The cost of the drug compared with the prototype is reduced by 25%

Claims

A method of producing an immunoglobulin preparation from human blood by salt extraction of an alcoholic precipitate of blood serum, purification of it from lipoproteins, followed by isolation of the target product by precipitation in the presence of polyethylene glycol, characterized in that the extraction of an alcoholic precipitate is carried out with a forty-sixty-fold volume of a 0.9% sodium chloride solution followed by removal of the lipoprotein fraction by chloroform.