RU2054037C1 - Recombinant plasmid dna peco 29ki encoding synthesis of restriction endonuclease eco 29ki and strain escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco 29ki - Google Patents
Recombinant plasmid dna peco 29ki encoding synthesis of restriction endonuclease eco 29ki and strain escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco 29ki Download PDFInfo
- Publication number
- RU2054037C1 RU2054037C1 SU5068192A RU2054037C1 RU 2054037 C1 RU2054037 C1 RU 2054037C1 SU 5068192 A SU5068192 A SU 5068192A RU 2054037 C1 RU2054037 C1 RU 2054037C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- restriction
- eco29ki
- dna
- restriction endonuclease
- restriction enzyme
- Prior art date
Links
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims abstract description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 claims description 2
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims description 2
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 12
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 10
- 108010044289 DNA Restriction-Modification Enzymes Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000006465 DNA Restriction-Modification Enzymes Human genes 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 230000007064 DNA hydrolysis Effects 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 108010088237 ATCGAT-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- 241001330169 Gluconobacter albidus Species 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000958303 Streptomyces achromogenes Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101000626652 Xanthomonas vasicola Type II restriction enzyme XhoI Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ZXXMMSQZSA-N alpha-D-fructofuranose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N alpha-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 101150012763 endA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N nitrate group Chemical group [N+](=O)([O-])[O-] NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002826 nitrites Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 101150072534 sbcB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относятся к биотехнологии и представляют собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую синтез эндонуклеазы рестрикции Eco29kI и штамм бактерий Escherichia coli, который может быть использован для получения эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-CCGCiGG-3' в составе двухцепочечной ДНК. Рестриктаза Eco29kI, продуцируемая предлагаемым штаммом, является изошизомером известной рестриктазы SacII и может найти применение в генно-инженерных исследованиях, как в экспериментах по конструированию рекомбинантных ДНК in vitro, так и при изучении первичной структуры ДНК. The invention relates to biotechnology and is a recombinant plasmid DNA that determines the synthesis of restriction endonuclease Eco29kI and a bacterial strain Escherichia coli, which can be used to obtain a restriction endonuclease (restriction enzyme) that recognizes and cleaves the nucleotide sequence 5'-CCGCiGG-3 'in double-stranded DNA . The restriction enzyme Eco29kI produced by the proposed strain is an isoshizomer of the known restriction enzyme SacII and can be used in genetic engineering studies, both in experiments on the construction of recombinant DNAs in vitro, and in studying the primary structure of DNA.
Известна рестриктаза SacII, продуцируемая штаммом, бактерий Streptomyces achromogenes АТСС 12767, которая узнает и расщепляет участок ДНК 5'-CCgCIGG-3'. Содержание рестриктазы в биомассе не указано. The known restriction enzyme SacII produced by the strain of bacteria Streptomyces achromogenes ATCC 12767, which recognizes and cleaves a portion of DNA 5'-CCgCIGG-3 '. The content of restriction enzyme in the biomass is not indicated.
Известен, также изошизомер рестриктазы SacII, выделенный из штамма Gluconobacter albidus IFO 3262, способ получения которого описан в патенте США 4668631. Выход очищенного фермента составляет 375 ед на 1 г сырой биомассы клеток. Also known is the SacII restriction enzyme isoschizomer isolated from the Gluconobacter albidus IFO 3262 strain, the preparation of which is described in US Pat. No. 4,668,631. The yield of purified enzyme is 375 units per 1 g of crude cell biomass.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение является получение штамма, продуцирующего рестриктазу заданной специфичности с более высоким выходом, быстро растущего на стандартных питательных средах. The problem to which the invention is directed is to obtain a strain producing a restriction enzyme of a given specificity with a higher yield, rapidly growing on standard nutrient media.
Сущность предлагаемых изобретений состоит в том, что получена рекомбинантная плазмида pECO29kI с генами системы рестрикции-модификации Eco29kI, обуславливающая синтез рестриктазы Eco29kI, и штамм бактерий, содержащий эту рекомбинантную ДНК продуцент рестриктазы Eco29kI. The essence of the proposed inventions is that a recombinant plasmid pECO29kI with the genes of the restriction-modification system Eco29kI, which causes the synthesis of restriction enzyme Eco29kI, and a bacterial strain containing this recombinant DNA producer restriction enzyme Eco29kI, were obtained.
Полученная рекомбинантная плазмида pECO29kI размером 6,6 т.п.н. кодирующая эндонуклеазу рестрикции Eco29kI, является неконъюгативной, совместимой с мультикопийными плазмидами ColE1-типа, и состоит из следующих элементов: из двух ClaI-фрагментов ДНК природной плазмиды p29k размерами: 1,95 т.п.н. каждый, содержащих гены рестрикции-модификации Eco29kI и ClaI-фрагмента ДНК pUC129 размером 2,7 т.п.н. Плазмида содержит четыре участка узнавания рестриктазой HingIII, расположенных на расстоянии: 0,68 т.п.н. 1,4 т.п.н. 1,75 т.п.н. и 2.8 т.п.н. три участка узнавания для R.ClaI, расположенных на расстоянии 1,95 т.п.н. 1.95 т.п.н. 2,7 т.п.н. два участка узнавания для R.XhoI, расположенных на расстоянии 1,72 т.п.н. 4,9 т.п.н. и по одному участку узнавания рестриктазами SalI, BgIII, BamHI; bla-ген, ответственный за синтез бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость клеток к ампициллину; eco29kIR-ген, кодирующий эндонуклеазу рестрикции Eco29kI, обеспечивающий ограничение фага ⌀ 80 vir; eco29kIM-ген, кодирующий метилазу Eco29kI, обеспечивающий модификацию нуклеотидной последовательности CCGCGC и защиту ДНК от расщепления рестриктазой Eco29kI; ori-репликон плазмиды рМВ1. The resulting recombinant plasmid pECO29kI size of 6.6 TPN encoding the restriction endonuclease Eco29kI, is non-conjugative, compatible with ColE1-type multicopy plasmids, and consists of the following elements: two ClaI DNA fragments of the natural plasmid p29k in size: 1.95 kb each containing the restriction-modification genes of Eco29kI and the ClaI DNA fragment of pUC129 2.7 kb in size. The plasmid contains four recognition sites with the restriction enzyme HingIII located at a distance of 0.68 kb. 1.4 kb 1.75 kb and 2.8 kb three recognition sites for R. ClaI located at a distance of 1.95 kb 1.95 kb 2.7 kb two recognition sites for R.XhoI located at a distance of 1.72 kb 4.9 kb and one recognition site by restriction enzymes SalI, BgIII, BamHI; bla-gene, responsible for the synthesis of beta-lactamase, which provides cell resistance to ampicillin; eco29kIR gene encoding the restriction endonuclease Eco29kI, providing phage restriction of ⌀ 80 vir; eco29kIM gene encoding Eco29kI methylase, which provides modification of the CCGCGC nucleotide sequence and protects DNA from restriction enzyme digestion with Eco29kI; ori-replicon of plasmid pMB1.
Способ конструирования плазмиды заключается в том, что плазмидную ДНК вектора pUC129 гидролизуют эндонуклеазой рестрикции ClaI и соединяют ДНК-лигазой с ДНК природной плазмиды p29k, расщепленной этой же рестриктазой в условиях неполного гидролиза. Смесь соединенных фрагментов трансформируют в клетки Escherichia coli К802, содержащие природную плазмиду p29k. Трансформанты высевают на среду с ампициллином и из выросших клонов выделяют экстрахромосомальную ДНК, которой трансформируют компетентные клетки E.coli К802. Трансформанты отбирают на агаризованной среде, содержащей ампициллин и бактериофаг лямбда vir, и из полученных на этой среде клонов выделяют плазмидную ДНК, обозначенную как pECO29kI. A method for constructing a plasmid is that the plasmid DNA of vector pUC129 is hydrolyzed with a ClaI restriction endonuclease and DNA ligase is coupled to DNA of a natural plasmid p29k digested with the same restriction enzyme under conditions of incomplete hydrolysis. A mixture of the combined fragments is transformed into Escherichia coli K802 cells containing the natural plasmid p29k. Transformants are plated on medium with ampicillin and extrachromosomal DNA is isolated from the grown clones, which transform competent E. coli K802 cells. Transformants were selected on an agar medium containing ampicillin and bacteriophage lambda vir, and plasmid DNA designated pECO29kI was isolated from the clones obtained on this medium.
Предлагаемый штамм-продуцент эндонуклеазы рестрикции Eco29kI получают трансформацией плазмидной ДНК pECO29kI в штамм Escherichia coli Z85. В этом штамме плазмидная ДНК pECO29kI стабильна и обеспечивает повышенный синтез фермента. Содержание рестриктазы Eco29kI в предлагаемом штамме 10 млн единиц/на грамм сырой биомассы клеток. The proposed producer strain restriction endonuclease Eco29kI is obtained by transformation of plasmid DNA pECO29kI into Escherichia coli strain Z85. In this strain, plasmid DNA pECO29kI is stable and provides increased enzyme synthesis. The content of restriction enzyme Eco29kI in the proposed strain of 10 million units / gram of crude cell biomass.
Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИВФМ РАН и хранится в ней под номером ВКМ CR-369D. The strain is deposited in the All-Union Collection of Microorganisms at the Institute of Fundamental Physics of the Russian Academy of Sciences and is stored in it under the number VKM CR-369D.
Штамм Escherichia coli BKM CR-369D имеет следующие характеристики. Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, размером 0,7-0,8 мкм в поперечнике и 2-3, иногда 5 мкм, в длину, подвижные, грамотрицательные с латеральными жгутиками. Располагаются одиночно, парами или цепочками, неспороносные. The strain Escherichia coli BKM CR-369D has the following characteristics. Cultural and morphological characters. The cells are straight, rod-shaped, with a size of 0.7-0.8 microns across and 2-3, sometimes 5 microns, in length, mobile, gram-negative with lateral flagella. They are located singly, in pairs or chains, not spore-bearing.
Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон и LB-агар). При росте на мясо-пептонном агаре или LB-агаре колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, мутные. При росте в жидких средах: в МПБ-бульоне или LB-бульоне образуют ровную интенсивную муть. The strain grows well on ordinary nutrient media (MPA, MPB, LB broth and LB agar). When growing on meat peptone agar or LB agar, the colonies are smooth, round, pressed, shiny, cloudy. When growing in liquid media: in the BCH-broth or LB-broth form a uniform intense turbidity.
Физиолого-биохимические признаки. Physiological and biochemical characteristics.
Клетки растут в предела от 4 до 50оС, оптимальная температура роста 37оС, оптимум рН 6,8-7,4.Cells growing in a range of 4 to 50 ° C, optimum growth temperature 37 ° C, optimum pH 6.8-7.4.
В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: альфа-глюкозу, альфа-фруктозу, галактозу, арабинозу, лактозу, трегалактозу. As a carbon source, many carbohydrates, alcohols, organic acids are used, in particular: alpha-glucose, alpha-fructose, galactose, arabinose, lactose, trehalactose.
В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот. As a source of nitrogen, both mineral salts in ammonium and nitrate forms, and in organic form in the form of peptone, amino acids, are used.
Нитраты восстанавливают до нитритов. Nitrates are reduced to nitrites.
Желатину не разжижают. Gelatin is not liquefied.
Индол не образуют. Indole does not form.
Генетические признаки: генотип Δ (lac pro), thi, strA, supE, endA, sbcB, hsdR-, F'traD36, proAB, lac1q, ZЛМ15, recA: Tn10. Штамм проявляет устойчивость к ампициллину (50 мкг/мл), обусловленную наличием в составе ДНК pECO29kI гена бета-лактамазы, обеспечивающего устойчивость клеток с плазмидой к ампициллину и тетрациклину (20 мкг/мл), обусловленную наличием в штамме Z85 транспозона Tn10. Genetic traits: genotype Δ (lac pro), thi, strA, supE, endA, sbcB, hsdR-, F'traD36, proAB, lac1q, ZЛМ15, recA: Tn10. The strain is resistant to ampicillin (50 μg / ml), due to the presence of the beta-lactamase gene in the pECO29kI DNA, which ensures the resistance of cells with the plasmid to ampicillin and tetracycline (20 μg / ml), due to the presence of Tn10 transposon in strain Z85.
Условия хранения штамма:
Штамм бактерий Escherichia coli BKM CR-369D хранят на чашках и косяках. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Может храниться не менее года в 15% глицерине при -20-70оС, в лиофильно-высушенном состоянии с сахаро-желатиновым агаром или в полужидкой агаризованной среде LB под вазелиновым маслом.The storage conditions of the strain:
The bacterial strain Escherichia coli BKM CR-369D is stored on plates and jambs. Reseeding on fresh media once a month. Can be stored for at least one year in 15% glycerol at -20-70 ° C, in the freeze-dried state with a sugar-gelatin or agar agar semi-solid LB medium under mineral oil.
П р и м е р 1. Конструирование плазмиды pECO29kI. PRI me R 1. Construction of plasmids pECO29kI.
Экстрахромосомольную ДНК, в частности, плазмиду p29k, выделенную из природного штамма E.coli 29k, гдиролизуют рестриктазой ClaI в условиях неполного гидролиза при 37оС в течение 15 мин в буфере, содержащем 10 мМ трис HCl, pH7,5, 50 мМ NaCl, 10 mM MgC12, 1 mM дитиотреитола. Векторную плазмидную ДНК pUC129 гидролизуют рестриктазой ClaI в течение часа в буфере, указанном выше. Ферменты инактивируют экстракцией ДНК водонасыщенным фенолом и, после переосаждения этанолом, 2 кг ClaI-гидролизата ДНК из E.coli 29k смешивают с 0,2 мкг ClaI-гидролизата pUC129, добавляют АТФ до 5 мМ и проводят реакцию в присутствии 0,1 ед. ДНК-лигазы фага 14 при 10оС 16 ч в буфере 66 мМ трис-HCl pH 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgC12, 1 мМ дитиотреитола. Лизагу инактивируют прогреванием при 65оС 10 мин и инкубационную смесь используют для трансформации компетентных клеток E.coli К802, содержащих природную плазмиду p29k.Ekstrahromosomolnuyu DNA, in particular, p29k plasmid was extracted from a natural strain of E.coli 29k, gdirolizuyut restriction enzyme ClaI in incomplete hydrolysis conditions at 37 ° C for 15 min in buffer containing 10 mM Tris HCl, pH7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgC12, 1 mM dithiothreitol. The vector plasmid DNA pUC129 was hydrolyzed with the restriction enzyme ClaI for one hour in the buffer indicated above. Enzymes are inactivated by extraction of DNA with water-saturated phenol and, after ethanol reprecipitation, 2 kg of ClaI-DNA hydrolyzate from E. coli 29k is mixed with 0.2 μg of pUC129 ClaI-hydrolyzate, ATP is added to 5 mM and the reaction is carried out in the presence of 0.1 units. DNA ligase at 10 14 ° C for 16 hours in buffer 66 mM tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgC12, 1 mM dithiothreitol. The lysaga is inactivated by heating at 65 ° C. for 10 minutes and the incubation mixture is used to transform competent E. coli K802 cells containing the natural plasmid p29k.
Из трансформантов, выросших на селективной агаризованной среде с ампициллином (50 мкг/мл), выделяют суммарную экстрахромосомальную ДНК и используют ее для транфсормации клеток E.coli К802. Среди трансформантов, выросших на среде с ампициллином и с бактериофагом лямбда vir в количестве 100 фаговых частиц на бактериальную клетку, отбирают клоны, содержащие систему рестрикции-модификации Eco29kI. Из полученных трансформантов выделяют плазмидную ДНК pECO29kI и проводят рестрикционный анализ с помощью эндонуклеаз рестрикции: HindIII, EcoRI, AvaI, SmaI, ClaI, XhoI, KpnI, SalI с использованием соответствующих буферов для инкубации. From transformants grown on a selective agar medium with ampicillin (50 μg / ml), total extrachromosomal DNA is isolated and used to transform E.coli K802 cells. Among the transformants grown on medium with ampicillin and with the bacteriophage vir lambda in the amount of 100 phage particles per bacterial cell, clones containing the Eco29kI restriction-modification system were selected. PECO29kI plasmid DNA was isolated from the obtained transformants and restriction analysis was performed using restriction endonucleases: HindIII, EcoRI, AvaI, SmaI, ClaI, XhoI, KpnI, SalI using the appropriate incubation buffers.
П р и м е р 2. Получение штамма Escherichia coli Z85 (pECO29kI). PRI me R 2. Obtaining a strain of Escherichia coli Z85 (pECO29kI).
Плазмидой pECO29kI трансформируют компетентные клетки E.coli Z85. Среди трансформантов, выросших на среде с ампициллином (50 мкг/мл) и бактериофагом лямбда vir в количестве 100 фаговых частиц на клетку, отбирают клоны, содержащие систему рестрикции-модификации Eco29kI и один из них используют в качестве штамма-продуцента рестриктазы Eco29I. Plasmid pECO29kI transform competent E. coli Z85 cells. Among the transformants grown on medium with ampicillin (50 μg / ml) and bacteriophage vir lambda in the amount of 100 phage particles per cell, clones containing the Eco29kI restriction-modification system were selected and one of them was used as the Eco29I restriction enzyme producer strain.
П р и м е р 3. Получение и очистка рестриктазы. PRI me R 3. Obtaining and purification of restrictase.
Культуру клеток E.coli Z85 (pECO29kI) выращивают в 1 л LB-бульона (5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 10 г бактотриптон на 1 л воды) при 37 град С до титра 2х109 кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (6000 об/мин 15 мин), 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера, содержащего 10 мМ трис HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола. Клетки разрушают ультразвуком, полученный экстракт центрифугируют при 48000 g при 2оС.A cell culture of E. coli Z85 (pECO29kI) is grown in 1 L of LB broth (5 g of yeast extract, 10 g of NaCl, 10 g of bactotrypton per 1 l of water) at 37 ° C to a titer of 2x10 9 cells / ml. Cells are pelleted by centrifugation (6000 rpm 15 min), 1 g of crude biomass is suspended in 5 ml of buffer containing 10 mM Tris HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM 2-mercaptoethanol. Cells are destroyed by ultrasound, the resulting extract is centrifuged at 48000 g at 2 about C.
Для определения активности рестриктазы Eco29kI готовят серийные разведения супернатанта: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 в буфере (10 мМ трис HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанол). В инкубационную смесь (9 мкл), содержащую 10 мМ трис HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 75 мМ KCl, 10 мМ MgC12, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТЕ, 1 мкг ДНК фага лямбда, добавляют 1 мкл соответствующего разведения экстракта и инкубируют при 37 град. С в течение 1 ч. Результаты гидролиза проверяют с помощью электрофореза в 1,2% агарозном геле. За единицу активности берут количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч. To determine the activity of Eco29kI restriction enzyme, serial dilutions of the supernatant are prepared: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 in buffer (10 mM Tris HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM 2-mercaptoethanol). To the incubation mixture (9 μl) containing 10 mM Tris HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 75 mM KCl, 10 mM MgC12, 1 mM EDTA, 10 mM DTE, 1 μg lambda phage DNA, add 1 μl of the appropriate dilution extract and incubated at 37 deg. C for 1 h. The hydrolysis results are checked by electrophoresis on a 1.2% agarose gel. The amount of enzyme necessary for complete specific cleavage of 1 μg of lambda phage DNA for 1 h is taken as a unit of activity.
Уровень активности рекстриктазы Eco29kI, определенный в бесклеточном экстракте штамма E.coli Z85 (pECO29kI), около 10000000 ед в пересчете на 1 г сырой биомассы. The level of activity of the Eco29kI rextractase, determined in the cell-free extract of the E. coli strain Z85 (pECO29kI), is about 10,000,000 units in terms of 1 g of raw biomass.
Рестриктаза Eco29kI может быть очищена фракционированием клеточного экстракта последовательно на колонках с DEAE-целлюлозой (DE-Б2 Whatman) с последующей хроматографией на фосфоцеллюлозе (Р11, Whatman), гидроксилапатите и гепарин-агарозе при фракционировании сульфатом аммония после хроматографии на фосфоцеллюлозе. Препарат фермента окончательно концентрируют при диализе против 50% глицерина. Выход очищенного фермента составляет 500000 ед/г биомассы клеток. The restriction enzyme Eco29kI can be purified by fractionation of the cell extract sequentially on columns with DEAE cellulose (DE-B2 Whatman), followed by chromatography on phosphocellulose (P11, Whatman), hydroxylapatite and heparin agarose when fractionated with ammonium sulfate after chromatography on phosphocellulose. The enzyme preparation is finally concentrated during dialysis against 50% glycerol. The yield of purified enzyme is 500,000 units / g of cell biomass.
Очищенный фермент стабилен при -20оС в течение полугода. При 20оС рестриктаза Eco29kI сохраняет 95% своей активности в течение 14 дней, при 37оС 50% в течение 14 дней, при 65оС 95% в течение 60 мин. Рестриктаза пригодна для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования.The purified enzyme is stable at -20 ° C for six months. At 20 ° C Eco29kI restriction enzyme retains 95% of its activity for 14 days at 37 C 50% for 14 days, at 65 C 95% for 60 min. Restriction enzyme is suitable for DNA structure analysis and molecular cloning.
П р и м е р 4. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Eco29kI и места гидролиза ДНК. Example 4. Determination of the nucleotide sequence recognized by the restriction enzyme Eco29kI and the site of DNA hydrolysis.
Для определения последовательности узнавания рестриктазы проводят сравнение величин длин фрагментов, полученных экспериментально при гидролизе ДНК фага лямбда рестриктазой Eco29kI с величинами длин фрагментов, рассчитанных на ЭВМ по соответствующим программам для различных последовательностей нуклеотидов. Была обнаружена только одна последовательность 5'-CCGC!GG-3', для которой рассчитанные величины фрагментов совпадали с экспериментальными и были локализованы в следующих районах первичной нуклеотидной последовательности ДНК фага лямбда (п.н.): 20323, 20533, 21609, 40389. To determine the recognition sequence of the restriction enzyme, the fragment lengths obtained experimentally by hydrolysis of lambda phage DNA with the restriction enzyme Eco29kI are compared with the fragment lengths calculated on a computer using appropriate programs for different nucleotide sequences. Only one 5'-CCGC! GG-3 'sequence was found, for which the calculated fragment sizes coincided with the experimental ones and were localized in the following regions of the primary nucleotide sequence of lambda phage DNA (bp): 20323, 20533, 21609, 40389.
Для подтверждения полученных данных проводят картирование участков узнавания рестриктазой Eco29kI на ДНК фага лямбда, используя совместный гидролиз с рестриктазой NruI. To confirm the obtained data, mapping of recognition sites by restriction enzyme Eco29kI onto lambda phage DNA is carried out using joint hydrolysis with restriction enzyme NruI.
Для определения места гидролиза ДНК рестриктазой Eco29kI используют ДНК pUC128. После отжига с синтетическим праймером (17-mer) и реакцией полимеризации матрицу обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Eco29kI. Часть пробы вторично подвергают полимеризации и оба полученных препарата исследуют в условиях, предложенных Simcon с соавторами. Четыре стандартные секвенирующие реакции проводят согласно протоколу Sanger с соавторами. PUC128 DNA was used to determine the site of DNA hydrolysis by restriction enzyme Eco29kI. After annealing with a synthetic primer (17-mer) and a polymerization reaction, the matrix is treated with an Eco29kI restriction endonuclease. A portion of the sample is polymerized a second time and both of the resulting preparations are tested under the conditions proposed by Simcon et al. Four standard sequencing reactions are carried out according to the protocol of Sanger et al.
Проведенные опыты позволяют сделать однозначный вывод, что рестриктаза Eco29kI является истинным изошизомером рестриктазы SacII и узнает последовательность нуклеотидов
5'-CCGC!GG-3'
Кроме того, полученная рестриктаза Eco29kI характеризуется следующими оптимальными условиями реакции:
оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,2-8,5
оптимальная температура действия 37оС.Our experiments allow us to make an unambiguous conclusion that the restriction enzyme Eco29kI is a true isoschisomer of the restriction enzyme SacII and recognizes the nucleotide sequence
5'-CCGC! GG-3 '
In addition, the obtained restriction enzyme Eco29kI is characterized by the following optimal reaction conditions:
optimal pH for the action of restriction enzyme 7.2-8.5
the optimum temperature is 37 o C.
NaCl 20-120 мМ
Таким образом, получена рекомбинантная плазмида pECO29kI, содержащая гены системы рестрикции-модификации Eco29kI. Данная плазмида обеспечивает высокий уровень синтеза эндонуклеазы рестрикции Eco29kI.NaCl 20-120 mm
Thus, the recombinant plasmid pECO29kI containing the genes of the Eco29kI restriction-modification system was obtained. This plasmid provides a high level of synthesis of restriction endonuclease Eco29kI.
Предлагаемый штамм E.coli BKM CR-369D, как продуцент специфической эндонуклеазы Eco29kI, обеспечивает высокий уровень содержания фермента, не менее 10000000 ед на 1 г сырого вещества биомассы клеток, что достаточно для получения рестриктазы в препаративных количествах. Выход очищенного фермента составляет не менее 500000 ед/г биомассы клеток, что в 1300 раз выше, чем в случае прототипа. The proposed strain of E.coli BKM CR-369D, as a producer of specific endonuclease Eco29kI, provides a high level of enzyme content of at least 10,000,000 units per 1 g of crude biomass of cells, which is sufficient to obtain restriction enzyme in preparative quantities. The yield of purified enzyme is at least 500,000 units / g of cell biomass, which is 1300 times higher than in the case of the prototype.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5068192 RU2054037C1 (en) | 1992-07-30 | 1992-07-30 | Recombinant plasmid dna peco 29ki encoding synthesis of restriction endonuclease eco 29ki and strain escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco 29ki |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5068192 RU2054037C1 (en) | 1992-07-30 | 1992-07-30 | Recombinant plasmid dna peco 29ki encoding synthesis of restriction endonuclease eco 29ki and strain escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco 29ki |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2054037C1 true RU2054037C1 (en) | 1996-02-10 |
Family
ID=21616037
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU5068192 RU2054037C1 (en) | 1992-07-30 | 1992-07-30 | Recombinant plasmid dna peco 29ki encoding synthesis of restriction endonuclease eco 29ki and strain escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco 29ki |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2054037C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2236454C2 (en) * | 2002-04-30 | 2004-09-20 | Тараканов Борис Васильевич | Method for construction of recombinant strains of microorganisms expressing procaryotic and eucaryotic genes |
-
1992
- 1992-07-30 RU SU5068192 patent/RU2054037C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Патент US N 4668631, кл. C 12N 9/22, 1987. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2236454C2 (en) * | 2002-04-30 | 2004-09-20 | Тараканов Борис Васильевич | Method for construction of recombinant strains of microorganisms expressing procaryotic and eucaryotic genes |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102794727B1 (en) | Class II, Type II CRISPR system | |
| KR102623312B1 (en) | Enzyme with RUVC domain | |
| Sawers et al. | Expression and operon structure of the sel genes of Escherichia coli and identification of a third selenium-containing formate dehydrogenase isoenzyme | |
| JP2003535584A (en) | N. Cloning and Production of BstNBI Cleavage Endonuclease and Methods for Using Cleavage Endonuclease in Single Strand Displacement Amplification | |
| EP0483797B1 (en) | Method for cloning and producing the Nco I restriction endonuclease | |
| EP0522018A1 (en) | CLONED $i(Kpn)I RESTRICTION-MODIFICATION SYSTEM | |
| US5192675A (en) | Cloned KpnI restriction-modification system | |
| US5312746A (en) | Cloning and expressing restriction endonucleases and modification methylases from caryophanon | |
| US4806480A (en) | Novel E. coli hybrid plasmid vector conferring sucrose fermenting capacity | |
| US5534428A (en) | Cloned Ssti/SacI restriction-modification system | |
| US5470740A (en) | Cloned NsiI restriction-modification system | |
| JPH05507412A (en) | Cloning and expression of various restriction endonucleases and modified methylases from Neisseria | |
| RU2054037C1 (en) | Recombinant plasmid dna peco 29ki encoding synthesis of restriction endonuclease eco 29ki and strain escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco 29ki | |
| Lubys et al. | Cloning and analysis of translational control for genes encoding the Cfr9I restriction-modification system | |
| RU2054042C1 (en) | Recombinant plasmid dna eco 1831ri encoding synthesis of restriction endonuclease eco 1831ri, strain of bacterium escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco 1831ri | |
| RU2038382C1 (en) | Strain of bacterium escherichia coli - a producer of endonuclease restriction cfrbi | |
| US5824530A (en) | Overexpression of recombinant bacteriophage T4 endonuclease VII and uses thereof | |
| RU2053298C1 (en) | Strain of bacterium escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco 75 ki | |
| RU2044053C1 (en) | Strain of bacterium escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco27k1 | |
| RU2070925C1 (en) | Strain of bacterium escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco 71 ki | |
| RU2044055C1 (en) | Strain of bacterium klebsiella azeanae - a producer of restriction endonuclease kaz 48 ki | |
| Woisetschläger et al. | Localization of the kdsA gene with the aid of the physical map of the Escherichia coli chromosome | |
| RU2044054C1 (en) | Strain of bacterium escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco 110 ki | |
| JPH029373A (en) | Production of asei restriction endonuclease and methylase | |
| SU1294824A1 (en) | Prism recombination plasmida and method for constructing same and e. coli c 600 p5 rm strain - producer of site-specific endonuclease p5 and ii |