RU2049821C1

RU2049821C1 - Method of preparing non-radioactive labelled probe for determination of nucleotide series

Info

Publication number: RU2049821C1
Application number: RU92001266A
Authority: RU
Inventors: В.А. Адаричев; Г.М. Дымшиц; С.М. Калачиков
Original assignee: Институт цитологии и генетики СО РАН
Priority date: 1992-10-20
Filing date: 1992-10-20
Publication date: 1995-12-10

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: origin nucleic acid is modified by reamination at pH 3.2-4.5 and temperature 60-90 C within 1-12 min. Reagent having formula R₁-S-R₂ where R₁ is derivative of hydroxyl amine which reacts with cytosine of nucleic acid, R₂ is chemical group which reacts with activated derivative being used as labelling agent is used as reamination agent. EFFECT: improves efficiency of method. 2 cl, 2 dwg

Description

Изобретение относится к молекулярной биологии, медицине и ветеринарии и может быть использовано для детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот (НК) методом молекулярной гибридизации для диагностики наследственных и бактериальных заболеваний человека и животных. The invention relates to molecular biology, medicine and veterinary medicine and can be used to detect specific nucleic acid (NK) sequences by molecular hybridization for the diagnosis of hereditary and bacterial diseases in humans and animals.

Синтез и использование нерадиоактивномеченных гибридизационных зондов является актуальной задачей в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве. Применение в широкой практике гибридизационных тестов на заражение человека, животных, растений различными микроорганизмами сдерживается отсутствием недорогих, технологичных и не использующих радионуклиды способов приготовления зондов. The synthesis and use of non-radioactive labeled hybridization probes is an urgent task in medicine, veterinary medicine and agriculture. The use of hybridization tests for infection of humans, animals, and plants with various microorganisms in general practice is hampered by the lack of inexpensive, technologically advanced and radionuclide-free methods for preparing probes.

Известен способ получения нерадиоактивных зондов, основанный на реакции расширения одноцепочечного разрыва в ДНК с помощью ферментов (ник-трансляция) [1] Способ включает следующие стадии: внесение в ДНК-матрицу одноцепочечных разрядов с помощью фермента ДНК-азы 1; тепловая инактивация фермента ДНК-азы 1; полимеризация дезоксинуклеозидтрифосфатов на матрице ДНК с помощью ДНК-полимеразы 1, причем один из предшественников мечен радиоактивно, а второй несет нерадиоактивную метку; контроль по радиоактивной метке за процессом полимеризации; очистка меченной ДНК от ферментов и невключившихся предшественников. A known method of producing non-radioactive probes, based on the reaction of expansion of a single-stranded break in DNA using enzymes (nick translation) [1] The method includes the following steps: introducing into the DNA matrix of single-stranded discharges using the enzyme DNAse 1; thermal inactivation of the enzyme DNase 1; polymerization of deoxynucleoside triphosphates on a DNA matrix using DNA polymerase 1, wherein one of the precursors is radiolabeled and the second carries a non-radioactive label; radioactive label control of the polymerization process; purification of labeled DNA from enzymes and unincluded precursors.

Недостатками способа являются использование ферментов и дорогостоящих предшественников, необходимость контролирования процедуры полимеризации, малое количество одновременно обрабатываемой ДНК (не более 5 мкг), чувствительность ферментов к качеству ДНК-матрицы, возможность мечения лишь двуцепочечных дезоксиполинуклеотидов. The disadvantages of the method are the use of enzymes and expensive precursors, the need to control the polymerization procedure, a small amount of simultaneously processed DNA (not more than 5 μg), the sensitivity of the enzymes to the quality of the DNA matrix, the possibility of labeling only double-stranded deoxypolinucleotides.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения нерадиоактивных зондов, основанный на реакции двуцепочечной ДНК с дигидразидом янтарной кислоты [2] включающий следующие стадии: тепловую денатурацию ДНК при 95^оС в течение 5 мин; инкубацию денатурированной ДНК с равным объемом дигидразида янтарной кислоты pH 5 при 95^оС в течение 15-60 мин; выделение модифицированной ДНК гель-фильтрацией на Sephadex G-50; концентрирование образца; мечение модифицированной ДНК N-гидроксисукцинимидным эфиром D-биотинил-ε-аминокапроновой кислоты; очистку меченой ДНК от неприсоединившегося биотина на Sephadex G-50.Closest to the proposed method is a method for producing non-radioactive probes, based on the reaction of double-stranded DNA with succinic acid dihydrazide [2] comprising the following stages: thermal denaturation of the DNA at 95 ^about C for 5 min; incubation of denatured DNA with an equal volume of succinic acid dihydrazide pH 5 at 95 ^about C for 15-60 minutes; isolation of modified DNA by gel filtration on a Sephadex G-50; sample concentration; labeling of the modified DNA with N-hydroxysuccinimide ester of D-biotinyl-ε-aminocaproic acid; purification of labeled DNA from non-aligned biotin on a Sephadex G-50.

Недостаток данного способа жесткие условия модификации ДНК (длительная инкубация при 95^оС, pH 5), приводящие к падению качества зонда. При чувствительности в гибридизации 20 пг резко сужается область применения таких зондов. Описано применение данного способа для мечения лишь двуцепочечных дезоксиполинуклеотидов.The disadvantage of this method of DNA modification stringent conditions (prolonged incubation at 95 ° ^C, pH 5) leading to a drop in the quality of the probe. With a sensitivity of 20 pg in hybridization, the scope of such probes is sharply narrowed. The application of this method for labeling only double-stranded deoxypolinucleotides is described.

Технической задачей изобретения является повышение качества целевого продукта (увеличение чувствительности при выявлении зонда, расширение круга модифицируемых НК (одно- и двуцепочечные поли- и олигонуклеотиды, дезокси- и рибо- производные), увеличение стабильности получающегося продукта). An object of the invention is to improve the quality of the target product (increasing sensitivity in detecting a probe, expanding the range of modified NKs (single and double-stranded poly and oligonucleotides, deoxy and ribo derivatives), increasing the stability of the resulting product).

Поставленная задача достигается тем, что в качестве переаминирующего агента используют соединение общей формулы R₁-S-R₂, где R₁ производное гидроксиламина, реагирующее с цитозином в составе НК; S спейсер; R₂ амино- или аминооксигруппа, реагирующая с активированными производными сигнальных соединений, а процесс переаминирования проводят при pH 3,2-4,5 при 60-90^оС в течение 1-12 мин. В качестве переаминирующего агента преимущественно используют 4-аминооксибутиламин, где спейсер S представляет собой тетраметиленовый мостик, позволяющий устранить стерические затруднения между ДНК-дуплексом и R₂.The problem is achieved in that as a transaminating agent, a compound of the general formula R ₁ -SR _{2 is used} , where R ₁ is a hydroxylamine derivative that reacts with cytosine in the composition of NK; S spacer; R ₂ amino or aminooxy group, reacts with activated derivatives of the signaling connections, and transamination process is carried out at pH 3,2-4,5 at 60-90 ^{° C} for 1-12 min. As the transaminating agent, 4-aminooxybutylamine is predominantly used, where the spacer S is a tetramethylene bridge, which eliminates steric hindrances between the DNA duplex and R ₂ .

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. The essence of the proposed method is as follows.

Раствор НК 1 мг/мл в воде или в буфере, не содержащем производных аминов и карбоновых кислот, смешивают с равным объемом водного раствора 4-аминооксибутиламина дигидрохлорида, pH которого педварительно оттитровывают до 3,75 при 80^оС раствором гидроксида лития;
компоненты смеси перемешивают и смесь инкубируют при 80^оС 5 мин;
модифицированную НК выделяют гельфильтрацией на Sephadex G-25 при элюции 50 мМ бикарбонатом натрия;
НК осаждают из смеси добавлением хлорида натрия до 0,1 М и этилового спирта до 67% с последующим центрифугированием при 12000 g 10 мин;
осадок растворяют в 0,1 М бикарбонате натрия и добавляют затем N-гидроксисукцинимидный эфир D-биотинил-ε-аминокапроновой кислоты до 5 мМ. Инкубируют смесь при 37^оС 30 мин;
биотинилированную НК очищают гельфильтрацией на Sepjadex G-25 при элюции 50 мМ бикарбонатом натрия.A solution of NK 1 mg / ml in water or in a buffer containing no derivatives of amines and carboxylic acids, mixed with an equal volume of an aqueous solution of 4-aminooksibutilamina dihydrochloride, pH is titrated pedvaritelno to 3.75 at 80 ° ^C with a solution of lithium hydroxide;
the components of the mixture are mixed and the mixture is incubated at 80 ^about 5 minutes;
modified NK is isolated by gel filtration on Sephadex G-25 with elution with 50 mM sodium bicarbonate;
NK are precipitated from the mixture by adding sodium chloride to 0.1 M and ethyl alcohol to 67%, followed by centrifugation at 12000 g for 10 min;
the precipitate was dissolved in 0.1 M sodium bicarbonate and then D-biotinyl-ε-aminocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester was added to 5 mM. Incubate the mixture at 37 ° C. ^for 30 minutes;
biotinylated NK is purified by gel filtration on Sepjadex G-25 with elution with 50 mM sodium bicarbonate.

Зонд можно использовать сразу, либо хранить по крайней мере 1 год без потери качества при (-20)^оС в 50 мМ бикарбонате натрия.The probe can be used immediately or stored at least one year without loss of quality at (-20) ^{° C} in 50 mM sodium bicarbonate.

Чувствительность гибридизации при использовании зондов, полученных предлагаемым способом, составляет 0,3 пг по гомологической плазмиде, что позволяет выявлять уникальные гены при блот-гибридизации НК. The sensitivity of hybridization using probes obtained by the proposed method is 0.3 pg by homologous plasmid, which allows the identification of unique genes during blot hybridization of NK.

Существенным отличием предлагаемого способа по сравнению с прототипом является то, что в качестве переаминирующего реагента используют соединения общей формулы R₁-S-R₂ и процесс проводят в оптимальном режиме, а именно в среде с pH 3,2-4,5 при 60-90^оС в течение 1-12 мин, что позволяет повысить качество зонда и расширить его функциональные возможности т.е. возможность метить весь спектр НК (одно- и двуцепочечные поли- и олигонуклеотиды, дезокси- и рибопроизводные). Кроме того, способ позволяет вводить в НК широкий круг сигнальных соединений: биотин, различные флуорохромы и гаптены.Essential difference of the proposed method compared to the prior art is that as pereaminiruyuschego reagent is a compound of the general formula R ₁ -SR ₂ and the process is carried out in the optimal mode, namely, in an environment with pH 3,2-4,5 at ^about 60-90 C for 1-12 minutes, which allows to improve the quality of the probe and expand its functionality i.e. the ability to label the entire spectrum of NK (single and double stranded poly and oligonucleotides, deoxy and ribo derivatives). In addition, the method allows you to enter into the NK a wide range of signal compounds: biotin, various fluorochromes and haptens.

Использование запредельных значений режима проведения процесса переаминирования не позволяет получать зонды высокого качества. Например, при pH реакционной смеси более 4,5 происходит падение скорости модификации. При инкубировании смеси менее 1 мин, не достигается необходимой степени модификации, а более 12 мин происходит падение скорости модификации. При инкубировании смеси менее 1 мин не достигается необходимой степени модификации, а более 12 мин происходит накопление побочного продукта реакции, что снижает качество целевого продукта. При инкубировании смеси при температуре выше 90^оС уменьшается полимерность зондов и соответственно их чувствительность, а при 60^оС падает скорость модификации.The use of transcendental values of the mode of the transamination process does not allow to obtain high-quality probes. For example, when the pH of the reaction mixture is more than 4.5, a decrease in the rate of modification occurs. When the mixture is incubated for less than 1 min, the necessary degree of modification is not achieved, and for more than 12 minutes the rate of modification decreases. When the mixture is incubated for less than 1 min, the necessary degree of modification is not achieved, and more than 12 min, the by-product of the reaction accumulates, which reduces the quality of the target product. By incubating the mixture at a temperature above 90 ^{° C.} Polymerization probes decreases and accordingly the sensitivity, and at 60 ° ^C falls modification speed.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет по сравнению с прототипом получить дополнительный технический результат, заключающийся в сокращении количества стадий мечения, увеличении чувствительности гибридизации, повышении устойчивости продукта, а также позволяет расширить круг модифицируемых полимеров. Thus, the use of the proposed method allows, in comparison with the prototype, to obtain an additional technical result, which consists in reducing the number of stages of labeling, increasing the sensitivity of hybridization, increasing the stability of the product, and also allows you to expand the range of modified polymers.

П р и м е р 1. 50 мкл раствора НК в концентрации 1 мкг/мкл в воде или в буфере, не содержащем производных аминов и производных карбоновых кислот, смешивают с 50 мкл 2 М водного раствора 4 -аминооксибутиламина дигидрохлорида, pH которого предварительно оттитровывали до 3,75 при 80^оС раствором 4,0 М гидроксида лития. Компоненты смеси перемешивают и смесь инкубируют при 80^оС 5 мин. Модифицированную НК выделяют гель-фильтрацией на Sephadex G-50 (20x0,5 см) при элюции 0,2 мл/мин 50 мМ бикарбонатом натрия. За выходом фракций следят по поглощению на 260 нм и на 230 нм. НК осаждают из первой фракции добавлением хлорида натрия до 0,1 М и этилового спирта до 67% с последующим центрифугированием при 12000 g 10 мин. Осадок растворяют в 0,1 М бикарбонате натрия и добавляют затем N-гидроксисукцинимидный эфир D-биотинил-ε- аминокапроновой кислоты до 5 мМ. Инкубируют смесь при 37^оС 30 мин. Биотинилированную НК очищают гель-фильтрацией на Sephadex G-50 в аналогичных условиях.PRI me R 1. 50 μl of a solution of NA in a concentration of 1 μg / μl in water or in a buffer that does not contain derivatives of amines and derivatives of carboxylic acids, is mixed with 50 μl of a 2 M aqueous solution of 4-aminooxybutylamine dihydrochloride, the pH of which was previously titrated to 3.75 at 80 ° ^C with a solution of 4.0 M lithium hydroxide. The components of the mixture are mixed and the mixture is incubated at 80 ° C. ^for 5 minutes. Modified NK is isolated by gel filtration on Sephadex G-50 (20x0.5 cm) with elution with 0.2 ml / min of 50 mM sodium bicarbonate. The yield of fractions is monitored by absorbance at 260 nm and 230 nm. NK are precipitated from the first fraction by adding sodium chloride up to 0.1 M and ethyl alcohol up to 67%, followed by centrifugation at 12000 g for 10 minutes. The precipitate was dissolved in 0.1 M sodium bicarbonate and then D-biotinyl-ε-aminocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester was added to 5 mM. Incubate the mixture at 37 ° C. ^for 30 minutes. Biotinylated NK was purified by gel filtration on a Sephadex G-50 under similar conditions.

Проверку качества модифицированной НК осуществляют в реакции гибридизации, осуществляемой по приводимой ниже методике. The quality control of the modified NK is carried out in a hybridization reaction, carried out according to the following procedure.

ДНК-мишень денатурируют нагреванием в 10 мМ трис-HCl, 0,5 мМ этилендиаминотетраацетате натрия (ТЕ) в течение 5 мин при 98^оС, добавляют NaCl до 1 М и наносят на нитроцеллюлозные мембраны. ДНК иммобилизуют освещением ультрафиолетом [3] Биотинилированный НК-зонд денатурируют нагреванием в ТЕ в течение 5 мин при 98^оС и вносят в раствор, содержащий 0,6 М NaCl, 50% формамида, 0,02% поливинилпирролидона, 0,02% фиколла 400, 0,02% бычьего сывороточного альбумина, 0,5% Tween 20, 40 мМ фосфата натрия pH 7. Гибридизацию фильтра с иммобилизованной ДНК проводят в течение 16 ч при 37^оС, после которой фильтр отмывают 3 раза по 10 мин при 37^оС в 0,5 М NaCl, 50%-ном формамиде, 0,4%-ном SDS, 33 мМ фосфате натрия, pH 7. Затем фильтр инкубируют при перемешивании в 0,2% -ном казеине, 50 мМ трис-HCl pH 7, 0,15 М NaCl, 5 мМ MgCl₂, 0,2%-ной Tween 20 40 мин при 23^оС. Конъюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза разводят в 2000 раз в 50 мМ трис-HCl pH 7, 0,15 M NaCl, 5 мМ MgCl₂ и инкубируют фильтр в этом растворе 20 мин при 23^оС. От несвязавшегося конъюгата фильтр отмывают с перемешиванием по 10 мин при 23^оС в четырех сменах 0,15 М NaCl, 50 мМ трис-HCl pH 7, 5 мМ MgCl₂, 0,2% Tween 20. Фильтр споласкивают 0,15 М NaCl, 50 мМ трис-НСl pH 9,4; 5 мМ МgCl₂ и затем проявляют в течение 16 ч в растворе такого же состава, но с добавлением 0,33 мг/мл NBT, 0,165 мг/мл ВСIP. По окончании проявления фильтр споласкивают водой и высушивают на воздухе.The target DNA was denatured by heating in 10 mM Tris-HCl, 0,5 mM sodium ethylenediaminotetraacetates (TE) for 5 min at 98 ^{° C,} added to 1 M NaCl and applied to a nitrocellulose membrane. DNA was immobilized by ultraviolet light [3] NK biotinylated probe was denatured by heating in TE for 5 minutes at 98 ^{° C} and applied to a solution containing 0.6 M NaCl, 50% formamide, 0.02% polyvinylpyrrolidone, 0.02% Ficoll 400, 0.02% bovine serum albumin, 0,5% Tween 20, 40 mM sodium phosphate pH 7. Hybridization of the filter with the immobilized DNA is carried out for 16 hours at 37 ^C, after which the filter for 10 min washed 3 times at 37 ^about in 0.5 M NaCl, 50% formamide, 0.4% SDS, 33 mm sodium phosphate, pH 7. Then the filter is incubated with stirring in 0.2% casein, 50 mm Tris- HCl pH 7, 0.15 M NaCl, 5 mM MgCl _2, 0.2% strength Tween 20 for 40 minutes at 23 ° ^C. The conjugate streptavidin-alkaline phosphatase diluted 2000-fold in 50 mM Tris-HCl pH 7, 0, 15 M NaCl, 5 mM MgCl ₂ and incubated filter in this solution for 20 minutes at 23 ° ^C. unbound conjugate is washed from the filter by stirring for 10 minutes at 23 ^{° C} in four changes of 0.15 M NaCl, 50 mM tris-HCl pH 7.5 mM MgCl ₂ , 0.2% Tween 20. Rinse the filter with 0.15 M NaCl, 50 mM Tris-Hcl pH 9.4; 5 mM MgCl ₂ and then develop for 16 hours in a solution of the same composition, but with the addition of 0.33 mg / ml NBT, 0.165 mg / ml BCIP. At the end of the development, the filter is rinsed with water and dried in air.

Способ поясняется фиг.1 и 2. Гибридизация плазмидного ДНК-зонда, биотинилированного в соответствии с примером 1, не дает сигнала с 1 нг контрольной эукариотической ДНК, а чувствительность гибридизации составляет 0,3 мг гомологичной плазмиды. The method is illustrated in figures 1 and 2. Hybridization of a plasmid DNA probe biotinylated in accordance with example 1 does not give a signal with 1 ng of control eukaryotic DNA, and the hybridization sensitivity is 0.3 mg of a homologous plasmid.

Получающаяся чувствительность позволяет выявлять уникальный ген при блот-гибридизации. The resulting sensitivity allows the identification of a unique gene during blot hybridization.

Косвенными критериями качества получающегося зонда служат также форма кинетики модификации НК и полимерность продукта, определяемая электрофорезом в денатурирующих условиях. Indirect quality criteria of the resulting probe are also the form of the kinetics of NK modification and the product polymerization determined by electrophoresis under denaturing conditions.

П р и м е р 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что pH реагента доводят до 5,0. На фиг.1 приведен график зависимости скорости модификации плазмидной ДНК в концентрации 0,5 мкг/мкл от pH среды. Концентрация 4-аминооксибутиламина 0,5 М, температура модификации 80^оС. По вертикальной оси процент модифицированных оснований, по горизонтальной оси pH реакционной среды при 80^оС.PRI me R 2. The method is carried out analogously to example 1 except that the pH of the reagent is adjusted to 5.0. Figure 1 shows a graph of the rate of modification of plasmid DNA at a concentration of 0.5 μg / μl from the pH of the medium. The concentration of 4-aminooxybutylamine 0.5 M, the modification temperature of 80 ^about C. On the vertical axis, the percentage of modified bases, on the horizontal axis of the pH of the reaction medium at 80 ^about C.

П р и м е р 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что смесь НК и реагента инкубируют при 98^оС. При этом наблюдают уменьшение полимерности ДНК-зондов, меченных 12 мин в соответствии с примером 3 в зависимости от температуры модификации (полимерность зондов проверяли электрофорезом в 2%-ном щелочном агарозном геле).PRI me R 3. The method is carried out analogously to example 1 except that the mixture of NK and the reagent is incubated at 98 ^about C. In this case, a decrease in the polymerization of DNA probes labeled 12 minutes in accordance with example 3 depending on the modification temperature (the polymerization of the probes was checked by electrophoresis in a 2% alkaline agarose gel).

П р и м е р 4. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что инкубируют смесь НК и реагента 15 мин. На фиг.2 приведена кинематика модификации ДНК 4-аминооксибутиламином в соответствии с примером 1. По вертикальной оси процент модифицированных оснований ДНК, по горизонтальной оси время реакции в минутах. Видно изменение линейного характера кинетики модификации из-за исчезновения целевого продукта реакции при времени модификации 6 мин и накопления побочного продукта реакции при времени модификации более 12 мин. PRI me R 4. The method is carried out analogously to example 1 except that the mixture of NK and the reagent is incubated for 15 minutes Figure 2 shows the kinematics of DNA modification with 4-aminooxybutylamine in accordance with example 1. On the vertical axis, the percentage of modified DNA bases, on the horizontal axis, the reaction time in minutes. One can see a change in the linear nature of the kinetics of modification due to the disappearance of the target reaction product at a modification time of 6 minutes and the accumulation of a reaction by-product at a modification time of more than 12 minutes.

П р и м е р 5. 50 мкл раствора ДНК в концентрации 1 мкг/мкл в воде или в буфере, не содержащем производных аминов и производных карбоновых кислот, смешивают с 50 мкл 0,8 М водного раствора дигидрохлорида дигидразида адипиновой кислоты pH 3,9 (R₁-R₂-карбонилгидразид, S-пентаметилен). Компоненты смеси перемешивают и смесь инкубируют при 80^оС 10 мин. Модифицированную НК выделяют гель-фильтрацией на Sephadex G-25 (20х0,5 см) при элюции 0,2 мл/мин водой. За выходом фракций следят по поглощению на 260 и 230 нм. Элюат концентрируют бутан-1-олом, спирт экстрагируют серным эфиром, эфир удаляют под вакуумом. Добавляют фосфат натрия pH 7 до 0,1 М и N-гидроксисукцинимидный эфир D-биотинил-ε-аминокапроновой кислоты до 5 мМ. Инкубируют смесь при 60^оС 5 ч. Для присоединения красителя добавляют флуоресцеинизотиоцианат до 1 г/л и 0,1 М бикарбонат натрия и инкубируют при 37^оС 3 ч. Биотинилированную или/и флуорохромированную ДНК очищают гель-фильтрацией на Sephafex G-25 как описано ранее.PRI me R 5. 50 μl of a DNA solution at a concentration of 1 μg / μl in water or in a buffer that does not contain derivatives of amines and derivatives of carboxylic acids, mixed with 50 μl of a 0.8 M aqueous solution of adipic acid dihydrochloride pH 3, 9 (R ₁ -R ₂ -carbonyl hydrazide, S-pentamethylene). The components of the mixture are mixed and the mixture is incubated at 80 ° C. ^for 10 minutes. Modified NK is isolated by gel filtration on Sephadex G-25 (20x0.5 cm) with elution with 0.2 ml / min of water. The yield of fractions is monitored by absorbance at 260 and 230 nm. The eluate was concentrated with butan-1-ol, the alcohol was extracted with sulfuric ether, the ether was removed in vacuo. Sodium phosphate pH 7 to 0.1 M and D-biotinyl-ε-aminocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester up to 5 mM are added. The mixture was incubated at 60 ° ^C for 5 hours. To attach fluorescein dye is added to 1 g / l and 0.1 M sodium bicarbonate and incubated at ³⁷ for Sephafex G-25 gel filtration purified C. for 3 hours. The biotinylated and / or DNA fluorohromirovannuyu as described earlier.

Проверку качества модифицированной НК осуществляют в реакции гибридизации, осуществляемой по методике, приведенной в примере 1. Гибридизация плазмидного ДНК-зонда, биотинилированного в соответствии с примером 5, дает чувствительность около 20 пг по гомологичной плазмиде. The quality control of the modified NK is carried out in a hybridization reaction carried out according to the procedure described in Example 1. Hybridization of a plasmid DNA probe biotinylated in accordance with Example 5 gives a sensitivity of about 20 pg by homologous plasmid.

Дигидразид адипиновой кислоты присоединяется со скоростью, сравнимой со скоростью присоединения 4-аминооксибутиламина. Степень модификации определяют по отношению поглощений на 485 нм и 260 нм флуоресцентного производного ДНК. Полимерность продукта, определяемая электрофорезом в 2%-ном агарозном геле, также показывает пригодность модифицированной ДНК для гибридизации. Adipic acid dihydrazide binds at a rate comparable to that of 4-aminooxybutylamine. The degree of modification is determined by the ratio of absorbances at 485 nm and 260 nm of the fluorescent derivative of DNA. Product polymerization, determined by 2% agarose gel electrophoresis, also shows the suitability of the modified DNA for hybridization.

П р и м е р 6. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что используют для переаминирования на первой стадии 1,4-ди(аминоокси)бутан. Зонды, модифицированные и 4-аминооксибутиламином, и 1,4-ди(аминоокси)-бутаном, имеют одинаковую чувствительность. На фильтрах нанесена ДНК в количестве: 1 100 пг; 2 31,6 пг; 3 10 пг; 4 3,16 пг; 5 1 пг; 6 0,316 пг. PRI me R 6. The method is carried out analogously to example 1 except that 1,4-di (aminooxy) butane is used for the transamination in the first stage. Probes modified with both 4-aminooxybutylamine and 1,4-di (aminooxy) -butane have the same sensitivity. DNA was applied on the filters in an amount of: 1 100 pg; 2 31.6 pg; 3 10 pg; 4 3.16 pg; 5 1 pg; 6 0.316 pg.

Claims

1. METHOD FOR PRODUCING A NON-RADIOACTIVE TEST PROBE FOR DETERMINING NUCLEOTIDE SEQUENCES, Including incubation of a nucleic acid in a buffer solution containing a transaminating reagent, isolation and concentration of a modified nucleic acid, labeling it with a suitable signal compound, and purifying it from the impurity general formula
R ₁ SR ₂ ,
where R ₁ is a hydroxylamine derivative that reacts with cytosine in a nucleic acid;
S spacer;
R _{2 is a} chemical moiety that reacts with an activated derivative of a signal compound,
and the process of transamination is carried out at a pH of 3.2 to 4.5 and a temperature of 60 - 90 ^o C for 1 to 12 minutes

2. The method according to claim 1, characterized in that 4-aminooxybutylamine is used as the transaminating agent.