RU2046138C1 - Штамм вируса иммунодефицита человека i типа, используемый для приготовления диагностических тест-систем - Google Patents
Штамм вируса иммунодефицита человека i типа, используемый для приготовления диагностических тест-систем Download PDFInfo
- Publication number
- RU2046138C1 RU2046138C1 SU5057382A RU2046138C1 RU 2046138 C1 RU2046138 C1 RU 2046138C1 SU 5057382 A SU5057382 A SU 5057382A RU 2046138 C1 RU2046138 C1 RU 2046138C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- hiv
- гкв
- cell culture
- antigene
- Prior art date
Links
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 title claims abstract description 35
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 abstract description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 23
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 21
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 7
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 abstract description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 abstract 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 22
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 4
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001738 isopycnic centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Использование: в вирусологии, медицине. Сущность изобретения: Штамм ВИЧ 1 ГКВ 4046 выделен в 1988 г. из мононуклеарных клеток периферической крови инфицированного ВИЧ 1 мужчины 40 лет с симптоматикой лимфоаденопатии (до применения химиотерапии). Наиболее чувствительной культурой клеток для данного штамма вируса является перевиваемая лимфоидная культура клеток МТ 4. По данным иммуноферментного анализа содержание антигена в культуральной жидкости на 4-е сутки культивирования составляет 1:512 1:1028. Штамм может стабильно пассироваться на перевиваемой культуре клеток МТ 4, инфицированной штаммом ГКВ -4046, проведено 55 пассажей. Средний титр штамма ГКВ 4046 в культуре клеток МТ 4 составляет 10-7-10-8 на 3 4-е сутки культивирования. Штамм ГКВ 4046 характеризуется высоким уровнем накопления антигена на различных клеточных культурах Н 9, Hut 78 и пригодностью для получения препаративных количеств очищенного вирусного антигена. Продемонстрирована пригодность полученного антигена для производства коммерческой тест-системы для диагностики ВИЧ-инфекции. Электрофоретический профиль вирусных белков штамма ГКВ 4046, наработанного на культуре клеток МТ 4, соответствует белковому спектру ВИЧ 1. Первичная структура V1-, V2- и V3-областей гена ENV штамма ГКВ 4046 отличается от известных штаммов ВИЧ 1. 3 табл. 5 ил.
Description
Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии и может найти применение при изготовлении различных тест-систем, предназначенных для диагностики вируса иммунодефицита человека 1-типа (ВИЧ-1).
К настоящему времени в лабораториях мира выделены десятки вариантов ВИЧ, отличающихся не только организацией генома, но и своими биологическими свойствами. В нашей стране выдано авторское свидетельство на штамм ВИЧ-1Zmb (ГКВ-878), выделенный в Белорусском НИИ эпидемиологии и микробиологии г. Минска. В производстве вирусного антигена также использовалась хронически инфицированная ВИЧ-1, перевиваемая моноцитарная линия клеток человека (ГКВ-4005). Тем не менее задача выделения высокопродуктивного штамма ВИЧ-1 остается актуальной, поскольку природные вирусные белки до настоящего времени используются в качестве основного компонента диагностических тест-систем, применяемых как для скрининга сывороток, так и для верификации диагноза.
Фирмы "Du Pont", "Аbbott" в США используют для тест-систем природный высокоочищенный антиген ВИЧ-1, получаемый при культивировании продуктивного штамма ВИЧ-1 (Н9/НТLV-IIIВ), депонированного в Американской коллекции АТСС под N СР18543. Этот штамм получен путем инфицирования предварительно отселектированных высокочувствительных к ВИЧ-1 клеток НТ концентрированной культуральной жидкостью, собранной после культивирования Т-лимфоцитов, полученных от больного СПИД. Н9/HТLV-IIIВ-штамм клеток, хронически инфицированный ВИЧ-1, может в течение длительного времени продуцировать вирус, но при снижении пролиферации клеток необходимо подсевать неинфицированные клетки. При культивировани и этого штамма существует риск вытеснения из культуры инфицированных ВИЧ-1 неинфицированными. Это требует постоянного контроля соотношении инфицированных и неинфицированных клеток в культуре.
Целью изобретения является получение отечественного штамма, пригодного для изготовления диагностических тест-систем. Цель достигается путем получения нового штамма ВИЧ-1, отличающегося от описанных ранее.
Получение штамма.
Штамм ВИЧ-1 N 1 (Л-88) выделен в 1988 году из мононуклеарных клеток периферической крови инфицированного ВИЧ-1 мужчины 40 лет с симптоматикой лимфоаденопатии (до применения химиотерапии). Клинический материал получен на базе клиники ЦНИИ эпидемиологии г. Москвы (инфекционная больница N 2), изоляция штамма проведена в отделе культивирования и диагностики ретровирусов НПО "Вектор". Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР г. Москвы под номером ГКВ-4046 (удостоверение о депонировании от 08.02.91 N 68-12/206).
При получении данного штамма использованы методы сокультивирования первичной культуры лимфоцитов, выделенной из периферической крови инфицированного ВИЧ-1 человека по известному методу, и первичной культуры лимфоцитов, выделенной из периферической крови здорового донора, а также сокультивирования перевиваемой лимфоидной культуры клеток МТ-4 с первичной культурой лимфоцитов, выделенной из периферической крови инфицированного ВИЧ-1 человека.
После подтверждения вирусной продукции в сокультиватах по данным иммуноферментного анализа, непрямой иммунофлюоресценции, определения активности обратной транскриптазы и электронной микроскопии полученный материал исследовали путем заражения перевиваемых лимфоидных культур клеток МТ-4, Н-9, Hut-78, в которых также отмечалась вируспродукция, подтвержденная вышеназванными методами. На хранение заложены образцы на 14,27,34 пассажах.
Морфология штамма ГКВ-4046.
Штамм ГКВ-4046 относится к семейству ретровирусов, подсемейству лентивирусов, имеет характерный для ВИЧ морфогенез, обусловленный почкованием вирусных частиц через клеточную мембрану, размер зрелых вирусных частиц 110-120 нм с конусовидным нуклеоидом.
Свойства штамма.
По данным непрямой иммунофлюоресценции процент вируссодержащих клеток в популяции (при одноцикловом заражении) МТ-4 на 3-4-е cутки составляет 60-100% при жизнеспособности 60-45% в линии Н-9 на 4-5-е cутки 30-50% при жизнеспособности 54% в линии Hut-78 на 3-4-е cутки 50-75% при жизнеспособности клеток 60-56%
Специфичность ВИЧ-1 продукции в культурах лимфоидных линий клеток МТ-4, Н-9, Hut-78, инфицированных штаммов ГКВ-4046, подтверждена данными иммуноблота и электронной микроскопии.
Специфичность ВИЧ-1 продукции в культурах лимфоидных линий клеток МТ-4, Н-9, Hut-78, инфицированных штаммов ГКВ-4046, подтверждена данными иммуноблота и электронной микроскопии.
Наиболее чувствительной культурой клеток для данного штамма вируса является перевиваемая лимфоидная культура клеток МТ-4. Так, по данным иммуноферментного анализа содержание антигена в культуральной жидкости на 4-е cутки культивирования составляет 1:512 1:1028.
Электрофоретический профиль вирусных белков штамма ГКВ-4046, наработанного на культуре клеток МТ-4, соответствует белковому спектру ВИЧ-1. Плотность вирусных частиц в градиенте сахарозы 1,16-1,18 г/см3, культуральная жидкость и препараты очищенного вируса проявляют активность обратной транскриптазы в присутствии ионов Mg++, cинтетической матрицы poli (rА) и праймера оligo (dТ). На перевиваемой культуре клеток МТ-4, инфицированной штаммом ГКВ-4046, проведено 55 пассажей (с периодическими заморозками).
В отличие от штамма ГКВ-878, где накопление до 10-8 происходит на 7-е cутки культивирования, средний титр штамма ГКВ-4046 в культуре клеток МТ-4 cоставляет 10-7-10-8 на 3-4-е cутки культивирования. В сравнении с хронически инфицированной ВИЧ-1 культурой клеток ГКВ-4005 штамм ГКВ-4046 также отличается более высоким уровнем накопления антигена на различных клеточных культурах и пригодностью для получения препаративных количеств очищенного вирусного антигена (табл.1).
Первичная структура V1-, V2 и V3-областей гена ЕNV штамма ГКВ-4046 отличается от известных ранее штаммов ВИЧ-1 (фиг. 1 и 2). Условия хранения: температура жидкого азота.
Штамм ГКВ-4046 может использоваться для получения вирусного антигена, пригодного для использования в диагностических тест-системах.
Положительный эффект достигается благодаря следующим свойствам полученного штамма вируса: штамм вируса обеспечивает высокий и стабильный уровень вируспродукции, обеспечивает получение высокоочищенного вирусного антигена в препаративных количествах, не требует постоянного культивирования клеток-продуцентов и может храниться в течение длительного времени в замороженном состоянии.
На фиг.1 приведено сравнение первичных структур гипервариабельных районов VI и V2 гена ЕNV изолята ВИЧ-1 ГКВ-4046; на фиг.2 сравнение первичных структур гипервариабельного района V3 гена ЕNV изолята ВИЧ-1 ГКВ-4046; на фиг.3 сравнение чувствительности и специфичности тест-систем на основе вирусного лизата фирмы "Du Pоnt" 
и штамма ГКВ-4046 
панель сывороток составлена из двух негативных (NN 1,2), девяти ложнопозитивных (NN 4-12) и 29-ти позитивных сывороток (NN 13-41); на фиг.4 сравнение чувствительности тест-систем на основе вирусного лизата фирмы "Du Pоnt" 
и штамма ГКВ-4046 
на фиг.5 показано связывание антител эталонных анти-ВИЧ-1-сывороток с белками вируса иммунодефицита человека 1-типа ГКВ-4046.
Приведенные примеры раскрывают сущность изобретения.
П р и м е р 1. Определение накопления вируса в различных клеточных культурах.
Клетки МТ-4 в концентрации 1,9-2,1˙106 мл инфицируют штаммом ГКВ-4046 с множественностью 10-30 инфекционных вирусных частиц на клетку. Адсорбцию проводят при 37оС в течение 1 ч. После этого клетки разводят культуральной средой (RPMI 1640 c 10% сыворотки плода коров) до конечной концентрации 0,9-1,1˙106 мл и культивируют роллерно-суспензионным способом при скорости вращения 1 об/мин и температуре 37оС.
По данным непрямой иммунофлюоресценции максимум вируспродукции (70-100% инфицированных клеток при жизнеспособности 45-80%) достигает на 3-4-е сутки после заражения в отличие от культуры клеток МТ-4, зараженной инокулятом из ГКВ-4005 или ГКВ-878, в которой максимум вируспродуцирующих клеток (60-75%) наблюдается лишь на 6-7-е сутки культивирования. По данным иммуноферментного анализа (тест-системы "Вектор" и "Аbbоtt") содержание антигена в клеточной фракции МТ-4, инфицированной штамм ГКВ-4046, на 3-и cутки культивирования при раститровке обнаруживаются в разведении осадка из 1 мл суспензии 1:512 (в отличие от прототипа, где содержание антигена обнаруживается в разведении 1: 128 на 5-е cутки при тех же условиях культивирования и тестирования). По данным электронной микроскопии в образцах культуры клеток МТ-4, инфицированной ВИЧ-1, обнаружен высокий уровень вирусной продукции: продуцируют вирус 80-90% клеток, представленных на ультратонком срезе. Вирусные частицы имеют характерную для ВИЧ-1 морфологическую структуру: округлую форму, диаметр 100-130 нм, конусовидную сердцевину. Внутреннее пространство вириона, окружающее нуклеоид, содержит материал низкой электронной плотности (его плотность существенно ниже плотности нуклеоида).
При инфицировании клеточных линий Н-9, Hut-78 штаммом ГКВ-4046 при тех же условиях, что и для клеток МТ-4, по данным непрямой иммунофлюоресценции процент вируссодержащих клеток составляет для линии Н-9 на 4-5-е cутки 30-50% при жизнеспособности 54% и для линии Hut-78 на 3-4-е cутки 50-75% при жизнеспособности клеток 60-56%
П р и м е р 2. Определение первичной структуры провирусной ДНК.
П р и м е р 2. Определение первичной структуры провирусной ДНК.
Для получения фрагментов провирусной ДНК изолята ВИЧ-1 применяют цепную полимеразную реакцию (ЦПР). Были выбраны гипервариабельные районы V1, V2, V3 гена ЕNV, в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях которых зарегистрированы значительные межштаммовые вариации. Использованные праймеры содержат на своих 5-концах сайты узнавания для рестриктаз BamHI, PstI и BglII, HindIII, обеспечивающие возможность эффективного клонирования амплифицированных фрагментов. В качестве вектора для клонирования используют плазмиду pMТL21, содержащую протяженный полилинкер и позволяющую проводить высокоэффективную селекцию рекомбинантных клонов.
Для проведения ЦПР используют набор "Амплификация" производства НПО "Ферментас" и пары праймеров:
для района V1-V2
5/ GAGGATCCAATCAGTTTATGGGATC 3/ и 5/ GGCTGCAGGTCAAAGGATACCTTTGGAC 3/,
для района V3
5/ AТAGATCTGTAGCAATTAACTGTACAAGGCC 3/ и 5/ AATCAAGCTTACTAATATTACAATGTGCTTG 3/.
для района V1-V2
5/ GAGGATCCAATCAGTTTATGGGATC 3/ и 5/ GGCTGCAGGTCAAAGGATACCTTTGGAC 3/,
для района V3
5/ AТAGATCTGTAGCAATTAACTGTACAAGGCC 3/ и 5/ AATCAAGCTTACTAATATTACAATGTGCTTG 3/.
ДНК из культуры клеток выделяют по известной методике с дочисткой изопикническим центрифугированием в градиенте плотности СsCl/ЕtBr. Клонирование амплифицированных фрагментов проводят по BamHI-PstI- и BglII-HindIII-сайтам соответственно в векторе рMТL21. После электропорации клеток Е.coli и отбора рекомбинантных клонов плазмидную ДНК выделяют методом Бирнбойма-Доли. Первичную структуру проклонированных фрагментов определяют методом Сэнгера с использованием набора "Сиквенс II" производства НПО "Ферментас". Обработку полученных данных проводят с помощью программных пакетов "PC/Gene" (Intelligenetics), "Dnasis" и "Prosis" (Pharmacia-LKB).
Результаты секвенирования двух независимых клонов, полученных после амплификации и клонирования района V1-V2, представлены на фиг.1. При сравнении полученных структур с данными литературы обнаружено, что структуры проклонированных фрагментов отличаются от ранее описанных. По сравнению со штаммом ВН10 в клоне 9.6 содержатся две точечные замены (в положении 113 замена А на G и в положении 180 замена С на G), приводящие к заменам аминокислот Lys на Glu и Pro на Alа соответственно.
Клон 9.5 содержит 14 точечных замен по сравнению с ВН10:
С на Т в положении 30, Т на С в положении 45,
G на А в положении 57, G на А в положении 69,
G на A в положении 93, G на A в положении 95,
G на А в положении 101, G на А в положении 117,
G на А в положении 119, С на Т в положении 133,
С на Т в положении 137, С на Т в положении 143,
G на А в положении 164, С на G в положении 180, приводящих к восьми заменам аминокислот:
Prо на Ser в положении 10, Asp на Asn в положении 19,
Asp на Asn в положении 23, Gly на Arg в положении 31,
Met на Ile в положении 33, Glu на Lys в положении 39,
Ser на Phe в положении 44, Pro на Alа в положении 60.
С на Т в положении 30, Т на С в положении 45,
G на А в положении 57, G на А в положении 69,
G на A в положении 93, G на A в положении 95,
G на А в положении 101, G на А в положении 117,
G на А в положении 119, С на Т в положении 133,
С на Т в положении 137, С на Т в положении 143,
G на А в положении 164, С на G в положении 180, приводящих к восьми заменам аминокислот:
Prо на Ser в положении 10, Asp на Asn в положении 19,
Asp на Asn в положении 23, Gly на Arg в положении 31,
Met на Ile в положении 33, Glu на Lys в положении 39,
Ser на Phe в положении 44, Pro на Alа в положении 60.
Результаты секвенирования района V3 в клонах 9.4 и 9.19 представлены на фиг. 2. Оба клона содержат замены GТ на АА в положении 50 и 51, приводящие к аминокислотной замене Ser на Lуs; А на G в положении 66, не приводящая к аминокислотной замене. Кроме того, в структуре клона 9.4 имеется замена С на А, которая приводит к аминокислотной замене Аsn на Lys.
Полученные данные показывают, что изолят ВИЧ-1 ГКВ-4046 является оригинальным штаммом ВИЧ-1.
П р и м е р 3. Получение препарата очищенного вируса.
Для очистки используют культуральную жидкость на 4-е cутки после инфицирования клеток МТ-4 штаммом ГКВ-4046 с множественностью 10-30 инфекционных вирусных частиц на клетку. Посевная концентрация клеток составляет 0,9 1,1˙106 мл. Очистку проводят по стандартной методике в линейном градиенте сахарозы 0-60% при 70000 g, длительность центрифугирования 18 ч.
Выход вируса составляет около 20% от общего содержания вирусного антигена в культуральной жидкости (табл.2). Электрофоретический профиль вирусных белков штамма ГКВ-4046 соответствует белковому спектру ВИЧ-1.
Полученные результаты демонстрируют пригодность штамма ГКВ-4046 для полученного очищенного вирусного антигена в препаративных количествах.
П р и м е р 4. Пригодность антигена для диагностических тест-систем.
Для определения пригодности штамма ГКВ-4046 в диагностических тест-системах проводят оценку чувствительности и специфичности диагностикума, изготовленного с использованием лизата вирусных белков (получение описано в примере 3). Чувствительность диагностикума оценивают на нескольких панелях серопозитивных к ВИЧ-1 сывороток, а также по сравнительному определению титров эталонных анти-ВИЧ-1-сывороток. Специфичность системы определяют на панели донорских сывороток, не содержащих антител к ВИЧ.
Для сравнения используют вирусный лизат фирмы "Du Pоnt" (фиг.3). Сорбцию лизатов на планшеты из полистирола проводят в разведении 1:1000 в 0,05 М карбонатном буфере рН 9,6. Полученные данные показывают, что тест-система на основе вирусного лизата из предлагаемого штамма по чувствительности (100%) и специфичности (100%) не уступает антигену фирмы "Du Pont". Данные по сравнению чувствительности антигена, полученного при использовании штамма ГКВ-4046, c антигеном фирмы "Du Pont" представлены на фиг.4. Оценка чувствительности двух антигенов в коммерческой тест-системе "Антиген" (использовали все компоненты набора, кроме планшет) была проведена на микропанели из пяти референс сывороток в разведении 1:400 (разведение антигена 2 и антигена Du Pont при сорбции 1:1000).
При сравнении с тест-системой "Антиген" (изготовленной на вирусном лизате фирмы "Du Pоnt") c использованием стандартной панели ГИСКа установлено, что вирусный лизат, приготовленный на основе этого штамма, позволяет получить тест-систему с аналогичной чувствительностью и специфичностью (табл.3). Это демонстрирует пригодность полученного антигена для производства коммерческой тест-системы.
Также проведена оценка пригодности антигена, полученного при культивировании штамма ГКВ-4046, для изготовления тест-системы иммуноблот. Полоски с иммобилизованными белками вирусного лизата получают по традиционной схеме, включающей разделение вирусных белков электрофорезом в 13%-ном полиакриламидном геле и перенос их на нитроцеллюлозную мембрану. Исследование проводят с использованием панели аттестованных на наличие антител к ВИЧ-1 положительных сывороток. Отмечено полное совпадение картины распределения специфически окрашенных зон (фиг.5) с паспортными данными эталонных анти-ВИЧ-1-сывороток.
Claims (1)
- Штамм вируса иммунодефицита человека I типа ГКВ 4046, используемый для приготовления диагностических тест-систем.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5057382 RU2046138C1 (ru) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | Штамм вируса иммунодефицита человека i типа, используемый для приготовления диагностических тест-систем |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5057382 RU2046138C1 (ru) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | Штамм вируса иммунодефицита человека i типа, используемый для приготовления диагностических тест-систем |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2046138C1 true RU2046138C1 (ru) | 1995-10-20 |
Family
ID=21610925
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU5057382 RU2046138C1 (ru) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | Штамм вируса иммунодефицита человека i типа, используемый для приготовления диагностических тест-систем |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2046138C1 (ru) |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2415931C1 (ru) * | 2010-01-11 | 2011-04-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм 02_ag.ru.09ru2204 вируса иммунодефицита человека 1 типа рекомбинантного субтипа 02_ag, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2420573C1 (ru) * | 2010-01-11 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм a1.ru.09ru2225 вируса иммунодефицита человека 1 типа субтипа а, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2420572C1 (ru) * | 2010-01-11 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм а1.ru.09ru2065 вируса иммунодефицита человека 1 типа субтипа а, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2420574C1 (ru) * | 2010-01-18 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм 02_ag.ru.09ru3124 вируса иммунодефицита человека 1 типа рекомбинантного субтипа 02_ag, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2420575C1 (ru) * | 2010-01-18 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм a1.ru.09ru2240 вируса иммунодефицита человека 1 типа субтипа а, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2420576C1 (ru) * | 2010-01-18 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм 02_ag.ru.09ru2383 вируса иммунодефицита человека 1 типа рекомбинантного субтипа 02_ag, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2421515C1 (ru) * | 2010-01-11 | 2011-06-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм 02_ag.ru.09ru2273 вируса иммунодефицита человека 1 типа рекомбинантного субтипа 02_ag, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2421517C1 (ru) * | 2010-01-18 | 2011-06-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм 02_ag.ru.09ru2308 вируса иммунодефицита человека 1 типа рекомбинантного субтипа 02_ag, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2421516C1 (ru) * | 2010-01-18 | 2011-06-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм a1.ru.09ru2255 вируса иммунодефицита человека 1 типа субтипа а, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2421518C1 (ru) * | 2010-01-18 | 2011-06-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм 02_ag.ru.09ru2410 вируса иммунодефицита человека 1 типа рекомбинантного субтипа 02_ag, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2457244C1 (ru) * | 2011-01-20 | 2012-07-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Штамм hominis immunodeficiti virus (hiv-1) вич-1/россия/(316ru) для приготовления диагностических, профилактических препаратов и для оценки противовирусной активности различных соединений |
| RU2513692C1 (ru) * | 2012-09-18 | 2014-04-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) | Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив710 субтипа а резистентный к антиретровирусным препаратам для диагностических и вакцинных препаратов |
| RU2513693C1 (ru) * | 2012-09-18 | 2014-04-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии наук медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) | Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив742 субтипа а для диагностических и вакцинных препаратов |
| EA034813B1 (ru) * | 2016-06-08 | 2020-03-24 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова) | Штамм вируса иммунодефицита человека i-го типа ив748 субтипа а для диагностических и вакцинных препаратов |
-
1992
- 1992-07-31 RU SU5057382 patent/RU2046138C1/ru active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Popovic M., Sarngadharan M.G., Real E., Gallo R.E. Detection, isolation and continuos production of cytopathic retroviruses HTLVIII from pateint with AIDS and pre-AIDS. Science, 1984, v.224, p.497 - 500. * |
| Авторское свидетельство СССР N 1703686, кл. C 12N 7/00, опублик. 1992. * |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2421515C1 (ru) * | 2010-01-11 | 2011-06-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм 02_ag.ru.09ru2273 вируса иммунодефицита человека 1 типа рекомбинантного субтипа 02_ag, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2420573C1 (ru) * | 2010-01-11 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм a1.ru.09ru2225 вируса иммунодефицита человека 1 типа субтипа а, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2420572C1 (ru) * | 2010-01-11 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм а1.ru.09ru2065 вируса иммунодефицита человека 1 типа субтипа а, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2415931C1 (ru) * | 2010-01-11 | 2011-04-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм 02_ag.ru.09ru2204 вируса иммунодефицита человека 1 типа рекомбинантного субтипа 02_ag, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2420574C1 (ru) * | 2010-01-18 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм 02_ag.ru.09ru3124 вируса иммунодефицита человека 1 типа рекомбинантного субтипа 02_ag, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2420576C1 (ru) * | 2010-01-18 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм 02_ag.ru.09ru2383 вируса иммунодефицита человека 1 типа рекомбинантного субтипа 02_ag, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2420575C1 (ru) * | 2010-01-18 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм a1.ru.09ru2240 вируса иммунодефицита человека 1 типа субтипа а, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2421517C1 (ru) * | 2010-01-18 | 2011-06-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм 02_ag.ru.09ru2308 вируса иммунодефицита человека 1 типа рекомбинантного субтипа 02_ag, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2421516C1 (ru) * | 2010-01-18 | 2011-06-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм a1.ru.09ru2255 вируса иммунодефицита человека 1 типа субтипа а, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2421518C1 (ru) * | 2010-01-18 | 2011-06-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм 02_ag.ru.09ru2410 вируса иммунодефицита человека 1 типа рекомбинантного субтипа 02_ag, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
| RU2457244C1 (ru) * | 2011-01-20 | 2012-07-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Штамм hominis immunodeficiti virus (hiv-1) вич-1/россия/(316ru) для приготовления диагностических, профилактических препаратов и для оценки противовирусной активности различных соединений |
| RU2513692C1 (ru) * | 2012-09-18 | 2014-04-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) | Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив710 субтипа а резистентный к антиретровирусным препаратам для диагностических и вакцинных препаратов |
| RU2513693C1 (ru) * | 2012-09-18 | 2014-04-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии наук медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) | Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив742 субтипа а для диагностических и вакцинных препаратов |
| EA034813B1 (ru) * | 2016-06-08 | 2020-03-24 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова) | Штамм вируса иммунодефицита человека i-го типа ив748 субтипа а для диагностических и вакцинных препаратов |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2046138C1 (ru) | Штамм вируса иммунодефицита человека i типа, используемый для приготовления диагностических тест-систем | |
| Kikuta et al. | Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease | |
| US4798797A (en) | Retrovirus associated with lymphadenopathies and adapted to continuous lines of lymphoblastoid B cells, capable of producing retrovirus continuously and process for their production | |
| US5030718A (en) | Retrovirus capable of causing AIDS, antigens obtained from this retrovirus and corresponding antibodies and their application for diagnostic purposes | |
| AU597654B2 (en) | A cell line producing aids viral antigens without producing infectious virus particles | |
| US4716102A (en) | Purified AIDS-associated virus ARV-2 | |
| US5066782A (en) | Retrovirus capable of causing AIDS, means and method for detecting it in vitro | |
| US20020042045A1 (en) | METHODS FOR THE DETECTION OF HTLV-II ANTIBODIES EMPLOYIING NOVEL HTLV-II nra ENVELOPE PEPTIDES | |
| JPS61173782A (ja) | リンパ節疾患症候群および／または後天性免疫不全症候群に関連する組換えウイルスタンパク質 | |
| WO1986005816A1 (en) | Type-specific papillomavirus dna sequences and peptides | |
| US5550052A (en) | Hybrid cell line formed between T4 lymphocytes and tumoral lymphoid type cells | |
| US7341731B2 (en) | HIV-2 antigen compositions | |
| US5830641A (en) | In vitro diagnostic assays for the detection of HIV-1 or HIV-2 employing viral-specific antigens and antibodies | |
| JP3271666B2 (ja) | Ｈｔｌｖ―ｉ、ｈｔｌｖ―ｉｉ又は関連レトロウイルスに対する抗体間の識別、新規ペプチド、抗体の検出及び免疫アッセイキット | |
| US6627395B1 (en) | Methods for the propagation, isolation, identification, and preparation of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) | |
| US6531574B1 (en) | T-lymphotrophic virus | |
| US5268265A (en) | Immunological complex comprising an antigen of Simian Immunodeficiency Virus (SIV) and an antibody against human immunodeficiency virus type 2 (HIV 2), and method and kit for detecting antibodies to HIV-2 reactive with antigens of SIV | |
| US7122188B1 (en) | Antibodies which bind with proteins of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), and immune complexes comprising proteins of HIV-1 | |
| US6428952B1 (en) | Methods and kits employing LAV antigens for the detection of HIV-1-specific antibodies | |
| Tanaka et al. | A simple method for overproduction and purification of p24 gag protein of human immunodeficiency virus type 1 | |
| EP0453563A1 (en) | Diagnostic proteins to test for more than one antibody | |
| CA1340403C (en) | Human b lymphotropic virus (hblv) isolation and products | |
| RU2441666C1 (ru) | Комплексный антиген вируса кори, используемый в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для диагностики антител к вирусу кори | |
| AU590382B2 (en) | Plasmid and phage clones of human t-cell lymphotropic virus type iii | |
| US5063053A (en) | Isolation and purification of the R18 antigen of HTLV-III |