RU2043116C1 - Peptide of apo-b receptor responsible for binding low density lipoprotein - Google Patents
Peptide of apo-b receptor responsible for binding low density lipoprotein Download PDFInfo
- Publication number
- RU2043116C1 RU2043116C1 RU94014228A RU94014228A RU2043116C1 RU 2043116 C1 RU2043116 C1 RU 2043116C1 RU 94014228 A RU94014228 A RU 94014228A RU 94014228 A RU94014228 A RU 94014228A RU 2043116 C1 RU2043116 C1 RU 2043116C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- binding
- peptide
- ldl
- low density
- receptor
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 title claims description 32
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 title claims description 32
- 108010027006 Apolipoproteins B Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000018616 Apolipoproteins B Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 13
- 101150102415 Apob gene Proteins 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 12
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 abstract description 7
- -1 polypropylene Polymers 0.000 abstract description 7
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 abstract description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 108010031480 Artificial Receptors Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 abstract description 2
- 101001064302 Homo sapiens Lipase member I Proteins 0.000 abstract 1
- 102100030659 Lipase member I Human genes 0.000 abstract 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 9
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 description 1
- 102000015404 Amino Acid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010025177 Amino Acid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710095342 Apolipoprotein B Proteins 0.000 description 1
- 108010008150 Apolipoprotein B-100 Proteins 0.000 description 1
- 102100040202 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 description 1
- 102000006991 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 235000010205 Cola acuminata Nutrition 0.000 description 1
- 244000228088 Cola acuminata Species 0.000 description 1
- 235000015438 Cola nitida Nutrition 0.000 description 1
- 101100216294 Danio rerio apoeb gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000889953 Homo sapiens Apolipoprotein B-100 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N Ser-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000538 pentafluorophenyl group Chemical group FC1=C(F)C(F)=C(*)C(F)=C1F 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и медицинской технике и может быть использовано для синтеза пептидов с целью применения их либо для создания сорбента для избирательного связывания ЛПНП, либо для создания моделей искусственного рецептора путем гидрофобизации аффинного пептида и введения его в клеточные мембраны. Выбор относительно коротких фрагментов рецептора, ответственных за связывание ЛПНП, позволит смоделировать функцию рецептора, выяснить какие аминокислотные остатки ответственны за максимальное связывание. Экспериментальная модель рецептора, полученная путем введения гидрофобизированного фрагмента рецептора в клеточные мембраны, позволит как увеличить ЛПНП связывающую способность клеточных поверхностей, так и провести поиск соединений, блокирующих связывание. The invention relates to medicine and medical equipment and can be used for the synthesis of peptides with the aim of using them either to create a sorbent for the selective binding of LDL, or to create artificial receptor models by hydrophobization of the affinity peptide and its introduction into cell membranes. The choice of relatively short receptor fragments responsible for LDL binding will allow us to simulate the function of the receptor and find out which amino acid residues are responsible for maximum binding. An experimental model of the receptor obtained by introducing a hydrophobized fragment of the receptor into cell membranes will allow both to increase the LDL binding capacity of cell surfaces and to search for compounds that block binding.
Изучение путей возникновения и лечения атеросклероза и связанных с ним заболеваний продолжает оставаться актуальной проблемой современной медицины. Ведущая роль в возникновении атеросклероза отводится нарушениям липидного обмена. К числу наиболее тяжелых форм заболевания относится наследственная (или семейная) гиперхолестеринемия (ГХС). The study of the occurrence and treatment of atherosclerosis and related diseases continues to be an urgent problem in modern medicine. The leading role in the occurrence of atherosclerosis is given to lipid metabolism disorders. The most severe forms of the disease include hereditary (or familial) hypercholesterolemia (HCS).
Липопротеины низкой плотности (ЛПНП) являются главными носителями холестерина в плазме. Повышенное содержание ЛПНП является одним из основных факторов риска развития атеросклероза. Уровень ЛПНП в крови в значительной степени зависит от функционирования специализированных белков-рецепторов, располагающихся на поверхности клеток. Активность ЛПНП-рецепторов регулируется потребностями клеток в холестерине. Частица ЛПНП содержит в своем составе крупную белковую молекулу, называемую апопротеином В (апоВ). Именно апоВ узнается рецептором и обеспечивает связывание частицы ЛПНП с клеткой. Low density lipoproteins (LDL) are the main carriers of plasma cholesterol. Elevated LDL is one of the main risk factors for developing atherosclerosis. The level of LDL in the blood largely depends on the functioning of specialized receptor proteins located on the surface of the cells. The activity of LDL receptors is regulated by the needs of cells for cholesterol. An LDL particle contains a large protein molecule called apoprotein B (apoB). It is apoB that is recognized by the receptor and ensures the binding of the LDL particle to the cell.
Из литературных данных известно, что рецептор ЛПНП представляет собой трансмембранный гликопротеид с множественными цистеин-обогащенными повторами, снабжает клетки млекопитающих холестерином путем связывания и поглощения холестерин-обогащенных липопротеинов плазмы. 10 цистеин-обогащенных повторов во внеклеточном домене рецептора ЛНП разделяются на два класса. Кластер из семи цистеин-обогащенных повторов, расположенный около NН2-конца (остатки 1-292), образует связывающий центр для липопротеинов. Каждый из этих повторов содержит шесть цистеинов и характеризуется наличием консервативной последовательности отрицательно заряженных аминокислот около СООН-конца. Эти повторы, пронумерованные 1-7, являются на 40-50% идентичными по последовательности. Роль цистеин-обогащенных повторов в рецепторе ЛПНП и других белках начинает проясняться благодаря сочетанию биохимических, генетических и молекулярных подходов. На сегодняшний день считается, что одной общей функциональной характеристикой этих повторов является их способность опосредовать белок-белковые взаимодействия. Для рецептора ЛПНП было показано, что семь повторов на NН2-конце связывают два различных белка, апопротеин В-100 (апоВ-100) и апоЕ. АпоВ-100, гликопротеин из 4536 аминокислот, является единственным апопротеином ЛПНП. Связывание ЛПНП с рецептором, очевидно, включает ионное взаимодействие между кислыми аминокислотными остатками в повторах и кластерами основных аминокислот в аро В. Удаление первых пяти повторов уничтожало связывание апоВ. Различные точечные мутации в повторе 5 заметно сокращали связывание апоВ. Очевидно, что повторы NН2-конца играют разную функциональную роль в связывании лигандов. Были произведены систематические серии мутаций, предназначенных для уничтожения функционирования каждого повтора: 1) каждый из семи повторов в лиганде-связывающем домене рецептора ЛПНП удалялся индивидуально; 2) консервативный остаток изолейцина в каждом из повторов замещался аспарагиновой кислотой; 3) консервативная аспарагиновая кислота в каждом повторе замещалась тирозином. Результаты исследования указывают на важную роль повторов 3-7 в связывании ЛПНП.From literature data it is known that the LDL receptor is a transmembrane glycoprotein with multiple cysteine-enriched repeats, supplies mammalian cells with cholesterol by binding and absorption of cholesterol-enriched plasma lipoproteins. 10 cysteine-enriched repeats in the extracellular domain of the LDL receptor are divided into two classes. A cluster of seven cysteine-enriched repeats located near the NH 2 end (residues 1-292) forms a binding center for lipoproteins. Each of these repeats contains six cysteines and is characterized by the presence of a conserved sequence of negatively charged amino acids near the COOH end. These repeats, numbered 1-7, are 40-50% identical in sequence. The role of cysteine-enriched repeats in the LDL receptor and other proteins is becoming clearer through a combination of biochemical, genetic, and molecular approaches. To date, it is believed that one common functional characteristic of these repeats is their ability to mediate protein-protein interactions. For the LDL receptor, it was shown that seven repeats at the NH 2 end bind two different proteins, apoprotein B-100 (apoB-100) and apoE. ApoB-100, a glycoprotein of 4,536 amino acids, is the only LDL apoprotein. The binding of LDL to the receptor obviously involves an ionic interaction between acidic amino acid residues in the repeats and clusters of basic amino acids in apo B. Removal of the first five repeats destroyed the binding of apoB. Various point mutations in
Анализ первичной структуры рецепторов ЛПНП из различных источников позволил определить консервативные участки последовательности и выявить отдельные аминокислотные остатки и фрагменты структуры, играющие существенную роль в связывании апо В. Наиболее важными из них являются помимо последовательностей, окружающих остатки цистеина, IIе-189 и Аsр-206. Интересным примером одного из этих уникальных остатков является глутаминовая кислота, следующая после последовательности Ser-Asр-Glu (SDE). Это создает ряд из трех отрицательно заряженных аминокислот (DЕЕ), следующих после консервативного серина, в то время как все другие повторы имеют только два (DЕ). Возможно, дополнительный отрицательно заряженный остаток в данном стратегическом положении вносит вклад в важное значение повтора 5. На основании анализа литературных данных нами был выбран фрагмент последовательности повтора 5, включающий аминокислотные остатки 187-212 для проведения работы по поиску минимального фрагмента ЛПНП-рецетора, обладающего лиганд-связывающей активностью. Analysis of the primary structure of LDL receptors from various sources made it possible to determine conserved portions of the sequence and identify individual amino acid residues and structural fragments that play a significant role in binding of apo B. The most important of them are, in addition to the sequences surrounding cysteine, IIe-189 and Asp-206 residues. An interesting example of one of these unique residues is glutamic acid, following the Ser-Asp-Glu (SDE) sequence. This creates a series of three negatively charged amino acids (DEE) following the conserved serine, while all other repeats have only two (DE). Perhaps an additional negatively charged residue in this strategic position contributes to the importance of
Сущность изобретения заключается в том, что методом Рin technology на полипропиленовых иглах были синтезированы 70 коротких перекрывающихся пептидных последовательностей с помощью передвижения "рамки" из 4,5,6,7 и 8 аминокислотных остатков вдоль последовательности фрагмента рецептора из 26 аминокислот. Связывание полученных пептидов с ЛПНП было проверено методом ЕLISA, который показал, что пептид N15 (гексапептид (201-206), гептапептид (201-207) и октапептид (201-208)) обладает высокой апо-В-связывающей активностью к ЛПНП. Наибольшую активность имеет октапептид 201-208. Более короткие тетра- и пентапептиды были не эффективны в связывании. The essence of the invention lies in the fact that, using the PIN technology method, 70 short overlapping peptide sequences were synthesized on polypropylene needles by moving a “frame” of 4,5,6,7 and 8 amino acid residues along the sequence of a 26 amino acid receptor fragment. The binding of the obtained peptides to LDL was checked by ELISA, which showed that the peptide N15 (hexapeptide (201-206), heptapeptide (201-207) and octapeptide (201-208)) has high apo-B binding activity to LDL. The highest activity is octapeptide 201-208. Shorter tetra- and pentapeptides were not effective in binding.
Таким образом, техническим результатом изобретения является синтез методом Рin technology пептидов, ответственных за связывание лигандов в апоВ-рецепторе. Thus, the technical result of the invention is the synthesis by the PIN technology of the peptides responsible for the binding of ligands in the apoB receptor.
Другим техническим результатом является определение минимальных функционально важных лиганд-связывающих участков апоВ рецептора, что позволит осуществить синтез пептидов, моделирующих его функцию. Another technical result is the determination of the minimum functionally important ligand-binding sites of the apoB receptor, which will allow the synthesis of peptides that model its function.
Синтез пептидов. Аминокислотная последовательность исследуемого пептидного фрагмента (187-212) в лиганд-связывающем домене апоВ-рецептора человека показана на рис.1. Октапептиды, последовательность которых получена движением рамки из восьми аминокислотных остатков вдоль последовательности исследуемого фрагмента, были синтезированы известным методом Рin technology. Перекрывающиеся пептиды обозначены номерами от 1 до 19 (фиг.1). Пептидные фрагменты, связанные с иглами, были синтезированы из пентафторфениловых эфиров Fmoc-аминокислот. Полипропиленовые головки закрепляли на ножках в планшет для иммуноферментного анализа, состоящий из 96-ти лунок. Активированные эфиры Fmoc-аминокислот, программа для проведения синтеза и обработки данных анализа фирмы Cambridge Research Biochemicals. Каждый пептид присоединен к полипропиленовой иголке с С-конца, количество каждого синтезированного пептида ≈20 нмолей.The synthesis of peptides. The amino acid sequence of the studied peptide fragment (187-212) in the ligand-binding domain of the human apoB receptor is shown in Fig. 1. Octapeptides, the sequence of which was obtained by moving a frame of eight amino acid residues along the sequence of the studied fragment, were synthesized by the well-known method of Pin technology. Overlapping peptides are indicated by numbers from 1 to 19 (FIG. 1). Peptide fragments associated with needles were synthesized from pentafluorophenyl esters of F moc amino acids. Polypropylene heads were fixed on legs in an enzyme-linked immunosorbent assay plate consisting of 96 wells. Activated esters of F moc amino acids, a program for the synthesis and processing of analysis data from Cambridge Research Biochemicals. Each peptide is attached to a polypropylene needle from the C-terminus, the amount of each synthesized peptide is ≈20 nmol.
На фиг.1 приведена аминокислотная последовательность пептидного фрагмента ЛПНП-рецептора, ответственного за связывание апоВ. Figure 1 shows the amino acid sequence of the peptide fragment of the LDL receptor responsible for the binding of apoB.
Анализ связывания пептидов с ЛПНП. Analysis of peptide binding to LDL.
Липопротеины низкой плотности (d=1,019-1,063) выделяли из плазмы крови доноров, содержащей 1 мМ ЭДТА и 0,01% азид натрия, методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности (40000 rрm, 20 ч, 14оС, в Вeckman 40.3 роторе).Low density lipoproteins (d = 1,019-1,063) was isolated from the plasma of donors of blood containing 1 mM EDTA and 0.01% sodium azide, ultracentrifugation, density gradient method (
Для количественного определения аполипопротеина В использовали иммунотурбидиметрический тест (Bоehringer Маnnheim). To quantify apolipoprotein B, an immunoturbidimetric test (Boehringer Mannheim) was used.
Связывание с липопротеинами низкой плотности пептидов, присоединенных к полипропиленовым подложкам, на которых проходил синтез, исследовались иммуноферментным известным методом. Головки полипропиленовых иголок, на которых присоединены синтетические пептиды, инкубировали при 25оС в течение 1 ч с фосфатным буфером, содержащим 1% бычий сывороточный альбумин, для того, чтобы блокировать неспецифическое связывание. Затем головки инкубировались с ЛПНП или плазмой человека, разбавленными тем же буфером, в течение 1 часа при 37оС, после чего отмывались 4х10 мин фосфатным буфером, содержащим 0,05% Твин 20 при 25оС. Отмытые таким образом иглы инкубировали при 37оС в течение 1 с антителами барана к апо В-100 человека, конъюгированными с пероксидазой из хрена (предоставлены лабораторией иммунохимии КНЦ). Иглы вновь отмывались как описано выше. Связавшиеся антитела обнаруживали реакцией с 200 мкл свежеприготовленного раствора субстрата (АВТS) в течение 15-20 мин. Последующее развитие сине-зеленой окраски измерялось при 405 нм с помощью прибора Мultiscan Рlus. Полученные значения двух параллельных определений для каждого пептида усреднялись. Для того, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание, анализ проводился при ненасыщающих концентрациях ЛПНП (2х10-10 М) с использованием промывания 1% раствором гепарина после связывания лиганда иголками.The binding of low density lipoproteins to peptides attached to the polypropylene substrates on which the synthesis took place was studied by the enzyme immunoassay method. Bits polypropylene needles, which are attached to the synthetic peptides were incubated at 25 ° C for 1 hour with PBS containing 1% bovine serum albumin to block nonspecific binding. Then head or LDL incubated with human plasma diluted with the same buffer for 1 hour at 37 ° C, then washed 4x10 minutes with phosphate buffer containing 0.05%
Для удаления связанных антител с полипропиленовых головок перед повторным анализом иглы обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин водным раствором, содержащим 1% додецилсульфат натрия, 0,1% 2-меркаптоэтанол и 0,1 М фосфат натрия, рН 7,2, предварительно нагретым до 60оС. Затем иголки последовательно промывали кипящей водой, кипящим метанолом и высушивали на воздухе.Before removing the bound antibodies from the polypropylene heads, the needles were sonicated for 30 minutes with an aqueous solution containing 1% sodium dodecyl sulfate, 0.1% 2-mercaptoethanol and 0.1 M sodium phosphate, pH 7.2, pre-heated to 60 before ultrasonic analysis. about C. Then the needles were washed successively with boiling water, boiling methanol and dried in air.
На фиг. 2 представлены результаты анализа иммуноферментным методом связывания ЛПНП из плазмы крови человека синтезированными октапептидами, где А405 оптическая плотность при 405 нм; концентрация ЛПНП в плазме крови человека 2х1010 М. Как видно из представленных данных пептид N 15 СКDКSDEE обладает наибольшей связывающей активностью. Аналогичные результаты получены для очищенных ЛПНП.In FIG. 2 presents the results of an enzyme-linked immunosorbent assay for binding LDL from human blood plasma to synthesized octapeptides, where A is 405 optical density at 405 nm; the concentration of LDL in human blood plasma is 2x10 10 M. As can be seen from the data presented, the peptide N 15 SKDKSDEE has the highest binding activity. Similar results were obtained for purified LDL.
На фиг.3 представлен выбор минимального фрагмента, производного от пептида N 15 (201-208), обладающего ЛПНП-связывающей активностью, где А405 оптическая плотность при 405 нм; концентрация ЛПНП в плазме крови человека 2х10-10 М.Figure 3 presents the selection of the minimum fragment derived from peptide N 15 (201-208) with LDL-binding activity, where A 405 optical density at 405 nm; the concentration of LDL in human blood plasma is 2x10 -10 M.
Для определения минимальной ЛПНП-связывающей последовательности были синтезированы 4-, 5-, 6- и 7-членные пептиды, производные от пептида N 15, и проведен иммуноферментный анализ связывания ЛПНП, результаты которого представлены на фиг.3. Четырех- и пятичленные пептиды проявляют очень незначительную связывающую способность, в то время как шести-, семи- и восьмичленные пептиды обладают высокой связывающей активностью по отношению к ЛПНП. Октапептид СКDКSDEE обнаруживает наиболее высокое сродство к лиганду по сравнению с гекса- и гептапептидами (фиг.3). To determine the minimum LDL binding sequence, 4-, 5-, 6-, and 7-membered peptides derived from peptide N 15 were synthesized and an enzyme-linked immunosorbent assay was performed for LDL binding, the results of which are presented in FIG. 3. Four- and five-membered peptides exhibit very little binding ability, while six-, seven- and eight-membered peptides have high binding activity against LDL. The octapeptide SKDKSDEE exhibits the highest affinity for the ligand compared to hexa and heptapeptides (figure 3).
Таким образом, наши исследования позволили определить пептид структуры Сys-Lys-Аsр-Lys-Ser-Asр-Glu-Glu, обладающий высокой связывающей активностью по отношению к ЛПНП. Thus, our studies allowed us to determine a peptide of the structure Cys-Lys-Asp-Lys-Ser-Asp-Glu-Glu, which has high binding activity against LDL.
Claims (3)
CKDKSDEE.1. ApoB receptor peptide responsible for the binding of low density lipoproteins having the following amino acid sequence
CKDKSDEE.
CKDKSDE.2. ApoB receptor peptide responsible for binding of low density lipoproteins having the following amino acid sequence
CKDKSDE.
CKDKSD.3. The apoB receptor peptide responsible for the binding of low density lipoproteins having the following amino acid sequence
CKDKSD.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94014228A RU2043116C1 (en) | 1994-05-04 | 1994-05-04 | Peptide of apo-b receptor responsible for binding low density lipoprotein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94014228A RU2043116C1 (en) | 1994-05-04 | 1994-05-04 | Peptide of apo-b receptor responsible for binding low density lipoprotein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2043116C1 true RU2043116C1 (en) | 1995-09-10 |
| RU94014228A RU94014228A (en) | 1996-10-27 |
Family
ID=20154910
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94014228A RU2043116C1 (en) | 1994-05-04 | 1994-05-04 | Peptide of apo-b receptor responsible for binding low density lipoprotein |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2043116C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2215747C2 (en) * | 1997-09-29 | 2003-11-10 | Жан-Луи ДАССЕ | Agonists of apolipoprotein a-i and their using for treatment of dyslipidemia-mediated diseases |
| RU2222545C2 (en) * | 1997-09-29 | 2004-01-27 | Жан-Луи ДАССЕ | Gene-therapeutic methods for administration of apolipoprotein a-1 agonists and their using in treatment of dyslipidemic disorders |
-
1994
- 1994-05-04 RU RU94014228A patent/RU2043116C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ann. Rev. Cell. Biol. 1985, 1, с.1-39. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2215747C2 (en) * | 1997-09-29 | 2003-11-10 | Жан-Луи ДАССЕ | Agonists of apolipoprotein a-i and their using for treatment of dyslipidemia-mediated diseases |
| RU2222545C2 (en) * | 1997-09-29 | 2004-01-27 | Жан-Луи ДАССЕ | Gene-therapeutic methods for administration of apolipoprotein a-1 agonists and their using in treatment of dyslipidemic disorders |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU94014228A (en) | 1996-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Curtiss et al. | Plasma apolipoproteins AI, AII, B, CI, and E are glucosylated in hyperglycemic diabetic subjects | |
| Zannis et al. | Characterization of the major apolipoproteins secreted by two human hepatoma cell lines | |
| Kaiser et al. | Secondary structures of proteins and peptides in amphiphilic environments.(A review). | |
| Weisgraber et al. | Human apolipoprotein B-100 heparin-binding sites. | |
| Avila et al. | Apoprotein E suppresses phytohemagglutinin-activated phospholipid turnover in peripheral blood mononuclear cells. | |
| Strickland et al. | Sequence identity between the alpha 2-macroglobulin receptor and low density lipoprotein receptor-related protein suggests that this molecule is a multifunctional receptor. | |
| Scanu | Structural studies on serum lipoproteins | |
| Borgström et al. | Pancreatic colipase: chemistry and physiology. | |
| Horwitz et al. | Interaction of plasma membrane fibronectin receptor with talin—a transmembrane linkage | |
| Muresan et al. | Plus-end motors override minus-end motors during transport of squid axon vesicles on microtubules. | |
| Koike et al. | Epitopes on β2-GPI recognized by anticardiolipin antibodies | |
| EP1216707B1 (en) | Process for screening ligand molecules that specifically bind to the NEP binding site for the QHNPR pentapeptide | |
| Page et al. | Topography of lactose permease from Escherichia coli. | |
| Garreau et al. | Hemorphins inhibit angiotensin IV binding and interact with aminopeptidase N | |
| US7018803B2 (en) | Inhibitors of collagen assembly | |
| Swaney et al. | Effect of apolipoprotein CI peptides on the apolipoprotein E content and receptor-binding properties of beta-migrating very low density lipoproteins. | |
| Soutar et al. | The characterization of lipoproteins in the high density fraction obtained from patients with familial lecithin: cholesterol acyltransferase deficiency and their interaction with cultured human fibroblasts. | |
| RU2043116C1 (en) | Peptide of apo-b receptor responsible for binding low density lipoprotein | |
| Schlattner et al. | A quantitative approach to membrane binding of human ubiquitous mitochondrial creatine kinase using surface plasmon resonance | |
| Bengtsson et al. | Protein components of very low density lipoproteins from hen's egg yolk | |
| Bertina et al. | A genetic variant of factor IX with decreased capacity for Ca2+ binding | |
| Goldstein et al. | Familial hypercholesterolemia: a genetic receptor disease | |
| Klaerke | Purification and characterization of epithelial Ca2+-activated K+ channels | |
| Lauer et al. | Amino acid sequence of the region of beta 2-glycoprotein 1 (gp1) which mediates binding of autoantibodies to the cardiolipin-gp1 complex in humans | |
| Krebs et al. | A novel angiotensin analog with subnanomolar affinity for angiotensin-converting enzyme |