RU1776691C

RU1776691C - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, - продуцент моноклональных антител против J @ Е человека

Info

Publication number: RU1776691C
Application number: SU914932011A
Authority: RU
Inventors: Владимир Борисович Климович; Марина Платоновна Самойлович; Валентина Борисовна Гервазиева; Ирина Юрьевна Крутецкая; Инна Геннадиевна Овсянникова; Светлана Федоровна Пашкова; Татьяна Борисовна Полищук
Original assignee: Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт
Priority date: 1991-03-25
Filing date: 1991-03-25
Publication date: 1992-11-23

Abstract

Использование: биотехнологи , медицина . Сущность изобретени : штамм получают гибридизацией спленоцитов инбредных мышей SJLAT. иммунизированных миеломным IgE, с клетками миеломы 653.А. Клетки штамма поддерживают в культуре в среде ДМЕМ, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скога, или перевивают на мышах-гибридах F1 (SjL/Jlx BALB/c). Обратный титр МКА в культураль- ных жидкост х составл ет 1-21 тыс., а в асцитах - 100-600 тыс. Моноклональные антитела (МКА) относ тс к lgG2a. При иммобилизации на твердой фазе МКА могут использоватьс в паре с другими IgE - специфичными мечеными антителами в двухде- терминантном иммунометрическом тесте определени содержани IgE. МКА сохран ют антиген-распознающую способность при присоединении ферментной метки и пригодны в качестве меченого реагента дл определени концентрации IgE в двухцент- ровом методе иммуноанализа. Штамм обозначен РИ-8Е/5Д4 и депонирован под номером ВСКК (П) 403Д.

Description

Изобретение относитс к биотехнологии и предназначено дл производства мо- ноклональных антител (МКАТ) против эпсилон-цепи иммуноглобулина Е (IgE), которые используютс в иммунохимической диагностике аллергических заболеваний человека .

Содержание IgE в крови человека в 10-50 тыс ч раз меньше уровн иммуноглобулинов других классов (IgA, IgG, IgM). Селективность и чувствительность современных методов вы влени аллерген-специфических lgE-анти- тел (аллергосорбентный тест) или определени общего содержани IgE (двухде- терминантный иммунометрический тест) обеспечиваютс реализацией принципа твердофазного иммуно-анализа, согласно

которому IgE, содержащийс в исследуемом образце, св зываетс иммобилизованным на твердой фазе аллергеном или МКАТ, направленными к одной из антигенных детерминант эпсилон-цепи, после чего сформированный на твердой фазе иммунный комплекс вы вл етс с помощью вторых МКАТ, несущих ферментную, изотопную или флуоресцентную метку 1.

В св зи с этим МКАТ, предназначенные дл использовани в аллергодиагностиче- ских методах твердофазного иммуноанализа , подвергаютс отбору по критерию сохранени функциональной активности при иммобилизации на твердой фазе и кова- лентном св зывании с маркерными молекулами . Кроме того, при этом отбирают МКАТ,

XI

ч о о

специфичные к антигенным участкам эпсилон-цепи , которые,во-первых,не маскируютс при формировании комплекса аллерген-lcE. а во-вторых пространственно удалены друг от друга, что исключает конкуренцию между ними за св зывание IgE при постановке двухдетерминантного иммуно- метрического теста. Перспективными дл практического применени считаютс МКАТ, обладающие одним или несколькими из перечисленных свойств.

Известны гибридомные штаммы 2, 3. 4, вырабатывающие МКАТ против IgE человека (табл. 1).

В числе аналогов описано семейство гибридомных клонов 15, при получении которых реализованы упом нутые выше принципы отбора продуцентов (ПРОТОТИП). Гибридомы получены на основе миеломной линии РЗХ63, Ад8.653 и лимфоцитов мышей линии BALB/c, иммунизированныхмиелом- ным IgE человека. 5 штаммов этого семейства продуцируют МКАТ, относ щиес к lgG1, продукты двух других штаммов относ тс к gG2a. Среди описываемых штаммов большинство продуцирует МКАТ, которые взаимодействуют как с гомогенным (мие- ломным), так и с поликлональным IgE человека , что дает основани считать их специфичными в отношении константной области эпсилон-цепи. Продукты 2-х штаммов сохран ют антиген-св зывающую активность при иммобилизации на твердой фазе. МКАТ, способных вы вл ть аллерген- специфические lgE-антитела или служить основой меченого реагента дл двухдетерминантного определени концентрации IgE, среди продуктов данного семейства гибридом не описано.

Недостаток известных гибридом, в том числе и прототипа, состоит в том, что дл их получени в качестве родительских клеток использованы миеломные клеточные линии с низкой автономностью роста, требующие дл размножени ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Высока зависимость от ростовых факторов ограничивает возможности эксплуатации таких гибридом в качестве производственных штаммов, особенно при использовании метода массового культивировани в ферментерах, а также может служить причиной их недостаточной стабильности.

Цель насто щего изобретени состо ла в получении гибридомного штамма, который:

1) не требует дл размножени ростовых факторов эмбриональной сыворотки;

2) синтезирует МКАТ. пригодные дл определени концентрации IgE в сыворотке крови человека.

Достижение поставленной цели было обеспечено:

1)использованием при получении гибридом клеток миеломного штамма 653.А (ВСКК(П) N 7 D, а.с. № 1381982), размножение которого не требует ростовых факторов

0 эмбриональной сыворотки;

2)отбором среди полученных гибридом штамма E/5D4, синтезирующего МКАТ, которые сохран ют антиген-св зывающую активность при иммобилизации на твердой

5 фазе и при присоединении ферментной метки .

Описываемый штамм E/5D4 подобно ПРОТОТИПУ синтезирует МКАТ, специфичные к константной области IgE человека и

0 способные в адсорбированном на твердой фазе состо нии извлекать IgE из раствора. В отличие от ПРОТОТИПА штамм E/5D4 получен на основе миеломной клеточной линии 653.А и не требует дл размно5 жени ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Синтезируемые штаммом E/5D4 МКАТ обладают свойством, наличие которого у прототипа неизвестно: в виде коныогата с ферментом они позхвол ют оп0 редел ть общее содержание IgE с помощью двухдетерминантного иммунометрического теста. Кроме перечисленного, штамм отличаетс от ПРОТОТИПА генотипом животных-доноров иммунных лимфоцитов

5 (мыши линии SJL/J).

Совокупность описанных свойств позвол ет рассматривать предлагаемый гиб- ридомный штамм РИ-8-Е/504, как объект, обладающий существенными отличи ми от

0 прототипа.

Штамм депонирован в ВСКК(П) под номером 403Д.

Справка о депонировании прилагаетс . Штамму присвоено авторское наимено5 вание РИ-8-Е/5Д4.

Получение гибридомного штамма. Донорами иммунных лимфоцитов служили сыши-масцы линии SJL/J, которых иммунизировали дважды с интервалом в 1

0 неделю подкожно препаратом миеломного 1дЕ/Ц40мкг) в полном адъювантеФрейнда, на 11 и 12 дни после этого давали бустер-иммунизации внутрибрюшинно по 10 мкг IgE в физиологическом растворе. Спленоциты

5 дл сли ни получали через 24 часа после последней бустер-иммунизации от мышей, у которых титр анти- дЕ-антител превышал 1:20000. Партнерами дл гибридизации служили клетки миеломного штамма 653.А, выращенные на питательной среде.

содержащей модифицированную Дюльбек- ко среду Игла (90%) и сыворотку крупного рогатого скота (10%). Дл сли ни использовали 100 млн клеток селезенки и 50 млн клеток миеломы. Смесь клеток обрабатыва- ли раствором полиэтилен гликол (50%) с молекул рной массой 1000. Дл выращивани гибридов использовали питающий слой из перитонеальных макрофагов мышей и питательную среду указанного выше соста- ва, содержащую в 100 мл (мкг): аминопте- рин-10, гипоксантин-500 и тимидин-500.

Отбор и тестирование культуральных надосадков проводили трижды с 11 по 28 дни после сли ни . Вы вление МКАТ, спе- цифичных к константной области эпсилон- цепи вели с помощью твердофазного иммуноферментного анализа аналогично известному способу 3, 5, использу в каче- стве антигенов миеломные IgE, препараты IgG, IgM, а также легкие цепи иммуноглобулинов человека каппа- и л мбда-типов (табл. 2).

Из 480 первичных культур 12 синтези- ровали антитела, св зывающие с lgE/L-им- муногеном. Среди них одна культура продуцировала антитела, направленные к легкой цепи каппа-типа.

Продукты синтеза 5 культур св зыва- лисье lgE/L-иммуногеном, но не реагировали с миеломным lg.E/Ю. Наконец, 6 культур синтезировали антитела, взаимодействующие как с IgE/L, так и с lgE/Ю. Эти 6 культур , обозначенные как семейство гибридом РЙ-8, были подвергнуты дальнейшему изучению .

Гибридомы клонировали 2-4 раза методом лимитирующих разведений на питающем слое из перитонеальных макрофагов мышей. Клоны, которые при двух последовательных клонировани х с плотностью посева , равной 1 клетке на 1 или 2 лунки, давали более 95% субклонов, синтезирующих анти- дЕ-антитела, переводили в мае- совую культуру. Выращенные в культуре клетки внутрибрюшинно прививали гисто- совместимым мышам (по 5 млн клеток на мышь), которым за 7-18 дней до этого также внутрибрюшинно был введен пристан (по 0,5 мл).

От мышей с растущими опухол ми на 14-21 дни получали асцитические жидкости. МКА из асцитов адсорбировали на твердой фазе и исследовали их способность св зы- вать IgE из раствора. Замен растворы IgE на образцы сыворотки крови здоровых людей и больных аллергией, вы вл ли МКАТ, которые св зывают поликлональный сывороточный IgE, т.е. специфичны к константным эпитопам эпсилон-цепи. Были

отобраны 5 клонов-продуцентов МКАТ, удовлетвор ющих критери м селекции.

МКАТ, специфичные к константным эпитопам IgE, исследовали на способность сохран ть иммунологическую активность при присоединении ферментной метки, Дл этого МКАТ из асцитических жидкостей выдел ли осаждением сульфатом аммони 6 и методом периодатного окислени к ним присоедин ли фермент - пероксидазу хрена 7. Иммунологическую активность пол- ученных конъюгатов исследовали в твердофазном иммуноанализе, адсорбиру на твёрдой фазе миеломный IgE. Продукты п ти клонов после присоединени ферментной метки сохран ли антиген-св зываю- щую активность.

Подбор МКАТ дл двухдетерминатного иммунометрического теста определени IgE проводили, испытыва поочередно адсорбированные на твердой фазе МКАТ в сочетании с мечеными пероксидазой МКАТ в качестве вы вл ющих реагентов (табл. 3). Найдено несколько сочетаний иммобилизованных и меченых МКАТ, позвол ющих определ ть IgE в сыворотке крови. Оптимальный результат был получен при иммобилизации на твердой фазе МКАТ клона 5Д4 и вы влении фиксированного IgE с помощью меченых пероксидазой МКАТ клона 4Ф4. Удовлетворительный результат был получен также при использовании конъюга- та, приготовленного на основе МКАТ Е/5Д4.

Таким образом, в результате ступенчатого отбора был получен штамм Е/5Д4, который обладает необходимой совокупностью свойств, т.е. способностью расти на среде, не содержащей эмбриональной сыворотки, и продуцировать МКАТ, пригодные дл двухдетерминантного имму- нометрического метода определени содержани IgE в качестве меченого реагента или в качестве иммобилизованного антитела , извлекающего IgE из раствора.

Характеристика штамма.

Штамм Е/5Д4 принадлежит к семейству гибридом РИ-8.

1)С момента получени из родительских клеток штамм прошел 28 пассажей в культуре, включа 4 цикла клонировани методом лимитирующих разведений на питающем слое из макрофагов мышей.

2)Стандартными услови ми культивировани вл ютс следующие: питательна среда состоит из среды Игла в оригинальной прописи или в модификации Дюльбекко (90%) и сыворотки крупного рогатого скота (10%). Клетки выращивают при +37°С в герметично закрытых флаконах или в открытой

системе - в планшетах, чашках Петри или флаконах в атмосфере с 7.5% углекислоты в воздухе при 100% влажности.

3)Оптимальна посевна доза составл ет 200 тыс клеток в 1 мл среды. Дл поддержани клеток в пролиферирующем состо нии их рассевают 2 раза в неделю с коэффициентом 1:4 - 1:5 при использовании стандартного состава ростовой среды. Клетки сохран ют способность к пролиферации при снижении содержани сыворотки до 2,5%, при этом кратность рассева составл ет 1:2. Максимальна плотность культуры с сохранением жизнеспособности 1,2-1,4 млн клеток в 1 мл.

4)Культура описываемого штамма представл ет взвесь одиночных округлых прозрачных клеток, встречаютс агрегаты из 4-х или более клеток, которые легко суспендируютс пипетированием.

5)Культура штамма Е/5Д4, посто нно выращиваема без антибиотиков, не содержит бактерий, грибов, дрожжей и микоплаз- мы.

6)Клетки штамма перевивают в виде асцитических или солидных опухолей (в зависимости от способа прививки) на гисто- совместимыхмышах-гибридах F1(SJL/JxBALB/c). При внутрибрюшинной прививке 5 млн клеток животным в возрасте 1,5-3 мес ца, предобработанным за 7-18 дней до этого внутрибрюшинным введением пристана, асцит развиваетс в течение 14-21 дн . От одной мыши получают при первой пункции 4-10 мл, суммарно в результате повторных пункций от одного животного получают 7-26 мл асцита.

7)Маркерные признаки штамма:

а)штамм синтезирует МКАТ против IgE человека. Антитела вы вл ютс в культу- ральной жидкости при поддержании клеток in vitro и в сыворотке или в асцитической жидкости при прививке животным;

б)штамм обладает онкогенностью, котора выражаетс в росте солидных или асцитических опухолей у гистосовместимых мышей-гибридов F1(SJL/JxBALB/c) при прививке им клеток гибридом

8)Характеристика МКАТ. продуцируемых штаммом гибридомы Е/5Д4. Клетки гибридомы продуцируют МКАТ субкласса lgG2a. Антитела специфичны к константной области эпсилон-цепи IgE человека. Специфичность МКАТ может быть проверена в твердофазном иммуноферментном анализе с помощью IgE, адсорбированного на твердой фазе. МКАТ св зываютс с белком А стафилококка, что может быть использовано при их очистке. При адсорбции на твердои фазе МКАТ способны св зывать сывороточный IgE и могут использоватьс в качестве захватывающих антител в системе двухдетерминантного иммуноанализа(в паре с мечеными lgE-специфичными антителами ) или при афинном извлечении IgE из сывороточных препаратов. МКАТ Е/5Д4, сохран антиген-распознающие свойства после присоединени ферментной метки,

могут также служить вы вл ющим реагентом в двухдетерминантном иммуноанализе. Антитела специфичны в отношении эпитопа на IgE, который не экспрессируетс при образовании комплекса IgE с антигеном (аллергеном ), и не могут использоватьс дл вы влени фракции специфического IgE в аллергосорбентном тесте.

9)Продуцируемый штаммом иммуног- лобулин вы вл етс в культуральной среде

при культивировании клеток. Обратный титр МКАТ в переросших культурах при выращивании клеток в стандартных услови х составл ет 1000-21000. Такой же титр может

быть получен при снижении содержани сыворотки в ростовой среде с 10% до 1,2%. При росте гибридомных клеток в мышах обратный титр МКАТ в асцитической жидкости составл ет 100000-600000. Среднее содержание иммуноглобулина в асците составл ет 8 мг/мл.

10)Стабильность продукции МКАТ оценивали при пассировании клеток на мышах в течение 7 пассажей. За этот период клетки

сохран ли исходную продуктивность. В культуре сохранение уровн МКАТ прослежено в течение 24 пассажей.

11)Услови криоконсервации. Криосре- да состоит из 45% среды Игла, 45% сыворотки крови крупного рогатого скота и 10% диметилсульфоксида. Ампулы, содержащие 1-10 млн клеток в криосреде помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1,5 см и выдерживают в нем при -70С в

течение суток, затем хран т при -70С или перенос т в жидкий азот. Дл размораживани клеток ампулы извлекают из низкотемпературного хранилища и на 3 минуты погруж-ж в воду с температурой МО С.

Затем центрифугируют 3 мин при 1000 об/мин, убирают надосадок, а клетки суспендируют в ростовой среде и рассевают в платы при концентрации 500 тыс клеток в 1 мл. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составл ет 60-70% поданным пробы с 0,5% трипановым синим. Через 1 сутки клетки повторно рассевают с концентрацией 200 тыс клеток в 1 мл ростовой среды.

МАТЕРИАЛЫ, ПОЯСНЯЮЩИЕ СУЩНОСТЬ ПРЕДЛАГАЕМОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ Схема 1. Вы вление IgE с помощью двухде- терминантного иммунометрического теста. Схема 2. Вы вление аллерген-специфиче- ского Ig E с помощью аллерго-сорбентноготеста. Таблица 1. Гибридомные штаммы-продуценты МКАТ против IgE человека. Таблица 2. Результат тестировани специфичности антител, продуцируемых первич- ными культурами гибридом. Таблица 3. Вы вление IgE с помощью двух- детерминантного твердофазного иммуно- ферментного анализа.

Таблица 4. Титры МКАТ, продуцируемых клетками штамма 8Е/5Д4 при выращивании в среде с низким содержанием сыворотки .

Таблица 5, Титры МКАТ, продуцируемых клетками штамма Е/5Д4, в культуральной среде и в асцитической жидкости. Таблица 6. Содержание IgE в образцах сыворотки крови человека, определенное в двухсайтовом иммуноанализе с помощью иммобилизованных МКАТ Е/5Д4,

Таблица 7. Вы вление IgE в образцах сыворотки крови в двухсайтовом иммуноанализе с помощью меченых МКАТ Е/5Д4. Фиг. 1. Калибровочна крива дл определени содержани IgE в сыворотке крови человека в двухдетерминантном иммуно- метрическом тесте с помощью иммобилизованных МКАТ Е/5Д4.

Фиг. 2. Калиибровочна крива дл определени содержани IgE в сыворотке крови человека в двухдетерминантном иммуно- метрическом тесте с помощью меченых МКАТЕ/5Д4.

Примеры получени и использовани МКАТ, синтезируемых штаммом Е/5Д4.

I. Выращивание культуры гибридомы дл последующей поививки мышам.

Посевным материалом служат гибри- домные клетки, хран щиес в жидком азоте. Дл размораживани пробирку, содержа- щую 5 млн клеток, извлекают из сосуда с жидким азотом, погружают на 3 минуты в воду с температурой +40 С, после полного оттаивани пробирку центрифугируют 3 минуты при 1000 об/мин, удал ют надосадок, клетки ресуспендируют в 10 мл ростовой среды (модифицированна Дюльбекко среда Игла-90%, сыворотка крупного рогатого скота-10%) и помещают в культуральный флакон (объем 25 мл). Флакон помещают в инкубатор с температурой +37 С, 100% влажности и 7,5% углекислоты в воздухе, Через сутки провод т визуальный контроль состо ни клеток с помощью инвертированного микроскопа и к содержимому флакона

прибавл ют 15 мл ростовой среды. На 4 сутки после размораживани клетки пересевают в разведении 1:5 и перенос т во флакон объемом 250 мл. Через 2 суток берут пробу дл подсчета клеток - в 1 мл суспензии содержитс 800 тыс гибридомных клеток . Суммарное содержание клеток в культуре 100 млн, что составл ет 20 прививочных доз. Клетки осаждают центрифугированием (1000 об/мин, 20 мин), суспензируют в среде Хенкса и ввод т по 5 млн в объеме 2 мл внутрибрюшинно мышам- межлинейным гибридам F1(SJL/JxBALB/c), получившим за 11 дней до прививки внутри- брюшинную инъекцию пристана.

II.Получение гибридомных асцитиче- ских жидкостей и выделение из них глобули- новой фракции, содержащей МКАТ.

Накопление асцита в брюшной полости мышей начинаетс на 11-й день после прививки клеток гибридомы. На 14-й день провод т первую пункцию. При этом получают от каждых 10 мышей 45-50 мл асцита. На 17 день повторно пунктируют оставшихс в живых мышей и получают еще 40-45 мл асцита . К 20-му дню остаетс около 50% привитых сышей. В результате третьей пункции получают 10-15 мл асцита. Общее количество асцита, получаемое от 10 мышей, составл ет 105-110 мл.

После образовани фибринового сгустка и отделени его от клеточной массы с помощью центрифугировани из 110 мл асцита получают 100мл надосадочной жидкости , из которой выдел ют глобулиновую фракцию. Дл этого к жидкости приливают по капл м в услови х непрерывного перемешивани равный объем насыщенного раствора сульфата аммони с рН-7,0. Осадок отдел ют центрифугированием (6000 об/мин, 15 мин), надосадок отбрасывают, а осадок раствор ют в дистиллированной воде , довод объем раствора до исходного. Процедуру высаливани повтор ют, полученный осадок суспендируют в половинном объеме полунасыщенного сульфата аммони и в таком виде хран т при +4С.

III.Получение содержащих МКАТ куль- туральных жидкостей при выращивании клеток гибридом на среде с низким содержанием сыворотки.

Источником клеток служит гибридом- ный штамм, хран щийс в жидком азоте. Клетки размораживают и высевают как описано в примере 1, Через сутки контролируют состо ние клеток с помощью инвертированного микроскопа и определ ют их содержание в культуре с помощью камеры Гор ева. Суспензи содержит 400 тыс клеток в 1 мл. При первом пересеве к 10 мл культуры добаол ют 10мл ростовой среды, содержащей 10% сыворотки. Через 1 сутки культуру раздел ют на 2 части: первую оставл ют без пересевов до перероста дл определени титра МКАТ. Ко второй прибавл ют 10 мл бессывороточной среды, в результате концентраци сыворотки снижаетс до 5%. Через 2 суток взвесь клеток, выросших на среде с 5% сыворотки, раздел ют на 3 части . Первую оставл ют без рассева до перероста дл определени титра МКАТ. Вторую часть четырехкратно пересевают на среде с 5% сыворотки (каждые 3 дн с коэффициентом 1:4) и затем оставл ют до перероста дл определени титра МКАТ. Третью часть пересевают с одновременным снижением концентрации сыворотки до 1,5%. На 3 сутки культуру раздел ют на 2 части: первую оставл ют до перероста, во второй содержание сыворотки снижают до 1.25% и спуст 6 дней из нее берут пробу дл определени титра МКАТ. Данные определени титров МКАТ на всех стади х процесса приведены в таблице 4.

IV. Определение титра мышиных антител против IgE человека.

Источником мышиных антител против IgE служат:

а)сыворотка крови мышей, иммунизированных IgE человека,

б)культуральна жидкость от растущих гиб- ридомных клеток,

в)асцитическа жидкость мышей с растущими гибридомными опухол ми,

г)глобулинова фракци содержащих МКАТ асцитических жидкостей.

Титр антител против IgE человека определ ют с помощью твердофазного иммуно- ферментного анализа. Реакцию провод т в 4 этапа. На всех этапах дл промывани и разбавлени реагентов используют раствор , содержащий 0,85% хлористого натри , 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,4 и 0,05% твина-20.

На первом этапе на твердую фазу адсорбируют антиген. Дл этого в чейки планшетов дл иммуноанализа внос т по 100 мкл раствора, содержащего 10 мкг IgE/L в 1 мл карбонзт-бикарбонатного буфера (0.01 М, рН-9,5). Инкубируют не менее 10 часов при +4С. Удал ют антиген из чеек и однократно промывают.

На втором этапе в лунках планшетов готов т серийные разведени исследуемых образцов объем по 100 мкл, инкубируют 1 час при +37 С, лунки освобождают от проб и трижды промывают.

На третьем этапе к св занным на твердой фазе мышиным антителам присоедин ют меченые пероксидэзой кроличьи

антитела против иммуноглобулинов мышей. 8 лунки внос т по 100 мкл рабочего разведени коньюгата, инкубируют 45 мин при +37 С, удал ют конъюгат и 5-кратно промывают .

На последнем этапе с помощью цветной реакции вы вл ют активность перокси- дазы, св завшейс с твердой фазой. В лунки внос т по 100 мкл субстратной смеси (1 мг

0 орто-фенилендиамина и 2 мкл 33% перекиси водорода в 10 мл« 0,05 М цитратного буфера с рН-4,7), инкубируют 30 минут при комнатной температуре в темноте и затем реакцию останавливают добавлением 50

5 мкл 2Н серной кислоты. Оптическую плотность проб регистрируют на фотометре Мультискан-МС при длине волны 492 нм. Результаты представлены в таблице 5.

V, Использование иммобилизованных

0 на твердой фазе МКАТ Е/5Д4 дл количественного определени содержани IgE в сыворотке крови человека

Концентрацию IgE в сыворотке крови определ ют с помощью двухдетерминант5 ного твердофазного иммуноанализа, Адсорбированные на твердой фазе МКАТ 8У/5Д4 служат дл захвата антигена из образца. Дл вы влени IgE, включенного на твердой фазе в иммунный комплекс, используют ме0 ченые ферментом специфичные к IgE поли- клональные антитела, изготовл емые НПО АЛЛЕРГЕН (г. Ставрополь), или монокло- нальные антитела, например, МКАТ продуцируемые клоном РИ-8-Е/4Ф4. Реакцию

5 провод т в полистироловых планшетах фирмы NUNC. Дл разбавлени реагентов и отмывани планшетов используют раствор того же состава, что в примере IV.

На первом этапе в лунки планшета вно0 с т раствор МКАТ Е/5Д4, содержащий 5 мкг белка в 1 мл 0,01 М карбонат-бикарбонатно- го буфера. рН-9,5. Инкубируют в течение ночи при +4С, раствор удал ют и лунки однократно промывают.

5 На втором этапе в лунки внос т образцы исследуемых сывороток и растворы с известным содержанием IgE, предназначенные дл построени калибровочной кривой (калибраторы фирмы Pharmacia). Инкубируют

0 при +37 С 1 час, образцы удал ют и лунки трехкратно промывают.

На третьем этапе в лунки внос т рабочее разведение конъюгата, инкубируют 1 час при +37 С, раствор удал ют, планшет

5 промывают п тикратно.

На четвертом этапе в лунки внос т субстратную смесь дл вы влени активности пероксидазы. Состав смеси приведен в примере IV. Инкубируют 30 минут в темноте при комнатной температуре, реакцию останавливают серной кислотой и измер ют оптическую плотность проб при длине волны 492 нм (по примеру IV). На основании полученных данных стро т калибровочную кривую. По оси абсцисс откладывают концентрацию IgE в МЕ/мл, по оси ординат - оптическую плотность проб {фиг. 1). Пользу сь калибровочной кривой и учитыва коэффициент раз- ведени исследуемых сывороток, определ ют содержание в них IgE (таблица 6).

VI. Использование МКАТ Е/5Д4 в качестве меченого реагента дл количественного определени содержани IgE в сыворотке крови человека.

Концентрацию IgE в сыворотке крови определ ют с помощью двухсайтового варианта твердофазного иммуноанализа. Адсорбированные на твердой фазе lgE-специфические антитела служат дл захвата антигена из образца. Дл вы влени IgE, включенного на твердой фазе в иммунный комплекс используют меченые перок- сидазой МКАТ 8Е/5Д4. Реакцию провод т в полистироловых планшетах фирмы NUNC. Дл разбавлени реагентов и отмывани планшетов от несв завшихс компонентов используют раствор того же состава, что в примере IV.

На первом этапе в лунки планшета внос т раствор МКАТ-8Е/4Ф4, содержащий 5 мкг белка в 1 мл 0,01 М карбонат-бикарбо- натного буфера, рН-9,5. Инкубируют в течение ночи при +4С, затем раствор удал ют и лунки однократно промывают.

На втором этапе разведени исследуемых сывороток и растворы с известным содержанием IgE, предназначенные дл построени калибровочной кривой (калибраторы фирмы Pharmacia) внос т в лунки планшетов, инкубируют при +37 С 1 час, затем лунки освобождают от раствора и промывают трехкратно.

На третьем этапе рабочее разведение коньюгата МКАТ 8Е/5Д4 с пероксидазой внос т в лунки, инкубируют 1 час при+37С, раствор удал ют, планшет промывают 5 раз.

На четвертом этапе в лунки внос т субстратную смесь дл вы влени активности пероксидазы. Состав смеси приведен в примере IV. Инкубируют 30 минут в темноте при комнатной температуре, затем останавливают реакцию добавлением серной кислоты и измер ют оптическую плотность проб при длине волны 492 нм (по примеру IV). На

основании полученных данных стро т калибровочную кривую. По оси абсцисс (лога- рифмическа шкала) откладывают концентрацию IgE в МЕ/мл, а по оси ординат - оптическую плотность соответствующих проб (фиг. 2). Пользу сь калибровочной кривой и учитыва коэффициент разведени исследуемых сывороток, определ ют содержание в них IgE (таблица 7).

Технико-экономическа эффективность изобретени .

Преимущество предлагаемого гибри- домного штамма РИ-8-Е/5Д4 определ етс тем, что дл поддержани его в культуре не

требуютс ростовые факторы эмбриональной сыворотки. Поскольку примен ема в работе с полученным штаммом сыворотка крупного рогатого скота в 50-100 раз дешевле эмбриональной сыворотки, затраты при

наработке МКАТ в услови х культивировани и при наращивании клеточной массы дл прививки животным существенно снижаютс .

Преимущества МКАТ, продуцируемых

предложенным штаммом, в сравнении с по- ликлональными антителами состо т, во- первых, в том, что дл получени каждой новой партии антител не требуетс повторени цикла иммунизации и расхода очищенного IgE человека,, который из-за редкой встречаемости больных с lgE-продуцирую- щей миеловой чрезвычайно малодоступен. Во-вторых, иммунохимические тесты, основанные на применении МКАТ против IgE,

обладают абсолютной специфичностью, тогда как специфичность поликлональных сывороток может варьировать в широких пределах.

К преимуществам описываемого штамма относитс то, что синтезируемые им МКАТ, иммобилизованные на твердой фазе, могут в сочетании с мечеными lgE-специ- фичными моно- или поликлональными антителами обеспечивать определение общего

IgE в сыворотке крови человека. МКАТ, продуцируемые штаммом, сохран ют антиген- распознающую способность при присоединении ферментной метки и могут также служить вы вл ющим реагентом при

Claims

определении IgE методом двухдетерминан- тного твердофазного иммуноанализа. Формула изобретени Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК (П) №

403Д - продуцент моноклональных антител против IgE человека.

Таблица 1

Гибридомные штамма-продуценты МКА.Т ПРОТИВ IgE человека

№

Характеристика штаммов .

продуцентов ЩЩшифр штамма партнеры в сли нии

шелома

лимфоциты

1. H4.4ES, NSI R4. ЕС10.

Balb/c

нкг/1

НЕЗ НЕ4УЗ

РЗхбЗ Ва1Ь/с Ag8.653

3. HI-BL- РЗхбЗ A/J IgE/1-10 Ag8.653

4, IgE/11-l Р3х853 Balb/0

применени

Биб- лш- гра- фи

Шлуколичвствввный одноступенчатый двухсай- товьй ишлуноферментный тест вщвленкк общэго IgE

Твердофазный аллергосор- бентный радиоиммуноана- Л113 дл вы влени аллер- гвнсшцифического IgE Количественное определение обшэго IgE в радио- или иммунофершнтном анализе

Определение обшрго IgE с помощью двухсайтово- го иммутюфермвнтного анализа

Результат тестировани специфичности антител, продуцируемых первичными культурами гибридом.

Примечани : + антитела св зываютс с антигеном

- отсутствие реакции между антителами и антигеном

Вы вление igE с помен ю двухдетерминантного твердофазного шмуноферментного анализа.

Примечание. Определение IgE проводилось в пуле иэ 13 сывороток от аллергических больных. Разведение образца 1:10.

Таблица .

Таблица 3

Титры ШАТ, продуцируемых клетками штамма 8Е/5Д4 .при выращивании в низкосывороточной среде.

Примечание. В таблице представлены средние и предельные ( в скобках) значени обратных титров, полученные дл 6-9 отдельных культур.

Таблица 5

Титры МШ, продуцируемых клетками шташа Е/5Д4 в культуральной среде и в асцитической жидкости.

Примэчан э.1 В таблице представлены средние показатели обратных титров МШ, полученные при анализе 4-6 образцов.

Таблица 4

21

Содержание IgE в образцах сыворотки крови Человека, определенное в двухсайтовом иммуноанализе с помощью иммобилизованных МКАТ Е/5Д4.

NN образца

Оптическа плотность

0,955 0,775 1,190 0,681 1,166 0,600 0,884 0,998

Примечание. Определение содержани IgE в сыворотке проведено с помощью калибровочной кривой, ФЯГ. 1.

Таблица 7

Вы вление IgE в образцах сыворотки крови в двухсайтовом иммуноанализе с помощью меченых МШ Е/5Д4.

Примечание. Определение содержани ItfE в МЕ/мд в сыворотках проведено с помощью калибровочной кривой, представленной на ФИГ. 2.

1776691

22

Таблица 6

Количество IgE -ME/MI

42 18 103 21 92 10 28 50

Ветвление UE с помощью двухдвтериинант ого пкму оютричвского теста.

NN I Сущность этапа анализа втвла

ЯшюОш аашп URAT-I

Про вление реакции - вы в- ленив метки, фиксированной на фазе.

Примечание после каждого из указанных этапов

производитс отшвание от компонентов, не св завшихс с твердой фазой.

Вы вление аллерген-специфичного IgE с помощью аллергосорбентного теста.

NN этапа

Сущность этапа анализа

1. Иммобилизаци аллергена твердой фаза.

Инкубаци с сывороткой, тестируемой на присутствие. IgE-антител. Формирование иммунных комплексов сывороточных антител с аллергеном.

Инкубаци с МКАТ против IjE, мечеными ферментом или изотопом . Формирование иммунного комплекса UKAT И 1еЕ, св занного с аллергеном.

4. Вы вление ферментной или изотопной метки, св занной из твердой фазе.

Примечание. После каждого из указанных этап-Vпроизводитс отмывание от компонентов, не св завшихс с твердой фазой.

Схеиатическое изображение

V V V

Схема 2.

Схематическое изображение

ММ

OD/«2 m

г.ъл

.в

IB

вкг. 1

Штамп гиврид чх культивируемы кгеток животных Ша msculus L., (BCMflV No 403Д). используемый дм получени ионбхлоаалышх

антител против юыу огловуво Е чвдоавка. Ось абсцисс - концентраци IgE в UE/ita, ос ординат - оптичвсчка плотность при диве вол и «2 ни.

01/492 ш 2.8-1

8.85В 18B

U

U/il

S8 18В