[go: up one dir, main page]

RS66364B1 - Ćelije modifikovane himerinim antigenskim receptorima za lečenje kancera koji eksprimiraju cldn6 - Google Patents

Ćelije modifikovane himerinim antigenskim receptorima za lečenje kancera koji eksprimiraju cldn6

Info

Publication number
RS66364B1
RS66364B1 RS20250008A RSP20250008A RS66364B1 RS 66364 B1 RS66364 B1 RS 66364B1 RS 20250008 A RS20250008 A RS 20250008A RS P20250008 A RSP20250008 A RS P20250008A RS 66364 B1 RS66364 B1 RS 66364B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
cell
car
cldn6
antigen
Prior art date
Application number
RS20250008A
Other languages
English (en)
Inventor
Ugur Sahin
Petra Oehm
Benjamin Rengstl
Katharina Reinhard
Kristina Michel
Original Assignee
Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh filed Critical Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh
Publication of RS66364B1 publication Critical patent/RS66364B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4264—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/867—Retroviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
OSNOVA
[0001] Imunoterapija na bazi adoptivnog ćelijskog transfera (ACT) može biti široko definisana kao oblik pasivne imunizacije sa prethodno senzibilisanim T ćelijama koje su prenete na neimune primaoce ili na autolognog domaćina nakon ex vivo proširenja od niskih prekursorskih frekvenci do klinički relevantnih brojeva ćelija. Upotreba pristupa genetskog inženjeringa za inseriranje antigen-ciljanih receptora definisane specifičnosti u T ćelije je u velikoj meri proširila potencijalne mogućnosti ACT. Himerni antigenski receptori (CAR) su tip receptora ciljanog na antigen koji je sastavljen od intracelularnih T ćelijskih signalnih domena fuzionisanih sa ekstracelularnim domenima za vezivanje antigena, najčešće jednolančanih varijabilnih fragmenata (scFvs) iz monoklonskih antitela. CAR direktno prepoznaju antigene ćelijske površine, nezavisno od MHC-posredovane prezentacije.
[0002] Pokušaji lečenja kancera upotrebom genetski modifikovanih T ćelija za ciljanje antigena eksprimiranih na tumorskim ćelijama kroz ekspresiju CAR su naišli na veoma ograničen uspeh. Uprkos značajnim odgovorima kod pacijenata sa malignitetima B ćelija, uspešni klinički odgovori nakon ciljnog delovanja na solidne tumore upotrebom CAR T ćelija sa različitim specifičnostima su mnogo ograničeniji. CAR T ćelijska terapija solidnih tumora suočava se sa brojnim izazovima. To uključuje fizičke barijere, imunosupresivno tumorsko mikrookruženje i što je najvažnije nedostatak zaista specifičnih i bezbednih tumorskih ciljnih mesta.
[0003] Stoga, postoji hitna potreba u tehnici za efikasnim kompozicijama i postupcima za lečenje kancera upotrebom CAR. Ovaj pronalazak se bavi ovom potrebom.
[0004] Da bismo implementirali terapiju zasnovanu na CAR za lečenje solidnih kancera, izabrali smo onkofetalni antigen CLDN6 (klaudin 6) koji ima sve karakteristike idealnog ciljnog mesta za terapiju zasnovanu na CAR. CLDN6 je tetraspin membranski protein koji je uključen u formiranje primitivnih čvrstih spojeva tokom organogeneze i stoga je eksprimiran isključivo na značajnim nivoima tokom razvoja fetusa i odsutan je u zdravim tkivima odraslih, ali je visoko eksprimiran u različitim vrstama kancera sa visokim medicinskim potrebama, uključujući kancere jajnika, endometrijuma, testisa i pluća.
[0005] CLDN6 ima vanćelijske petlje koje su takve da predstavljaju ciljno mesto koje se terapeutski modulira lekovima i nivoi ćelijske površine su dovoljno visoki da omoguće prepoznavanje od strane CAR T ćelija. Pored toga, ekspresija CLDN6 korelira sa progresijom bolesti jer se može detektovati sa većom učestalošću u metastatskim lezijama i dediferenciranim ćelijama što ukazuje na ulogu u onkogenim procesima. Bezbednost ciljnog delovanja na CLDN6 je sugerisana kliničkim ispitivanjem faze I/II upotrebom anti-CLDN6 monoklonskog antitela IMAB027 kod pacijenata sa uznapredovalim karcinomom jajnika (OVAR, NCT02054351), gde nisu otkriveni neželjeni događaji povezani sa IMAB027.
[0006] Na osnovu rezultata naših in vitro i in vivo eksperimenata smo odabrali drugu generaciju CAR sa 4-1BB domenom (CLDN6-CAR-CD8h-BBz) kao vodećom strukturom za pretklinička i klinička ispitivanja. Mogli bismo pokazati visoko specifično i osetljivo prepoznavanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju CLDN6, kao i visok potencijal za preživljavanje i ponavljajuću stimulaciju CAR T ćelija.
[0007] Dalje smo procenili in vivo antitumorski potencijal CLDN6-CAR upotrebom modela ksenotransplantata karcinoma jajnika i mogli bi pokazati da je adaptivni transfer T ćelija transdukovanih sa CLDN6-CAR rezultirao potpunim iskorenjivanjem uznapredovalih tumora. Pored toga, ovi rezultati se mogu reprodukovati sa kriokonzerviranim CAR T ćelijama koje su generisane u GMP postrojenju.
[0008] Kao što se moglo pokazati u prošlosti, da je klinički ishod terapije CAR T ćelijama u pozitivnoj korelaciji sa postojanošću infuziranih CAR T ćelija u telu (Robbins et al. (2004) J Immunol. 173(12):7125-30, Huang et al. (2005) 28(3):258-67), kombinovali smo terapiju CLDN6-CAR sa našim inovativnim CAR in-vivo konceptom proširenja upotrebom iRNK formulisanu lipozomom koja kodira CAR antigen (WO 2016/180778).
[0009] Konačno, mogli bismo pokazati u različitim modelima tumora da kombinacija adoptivno prenetih CAR T ćelija zajedno sa RNK(LIP)-baziranim vakcinama ubrzava tekuće antitumorske odgovore i takođe može da povrati antitumoralnu efikasnost nedovoljnih doza CAR T ćelija.
[0010] WO 2015/150327 otkriva klaudin-6-specifične imunoreceptore (T ćelijske receptore i veštačke T ćelijske receptore (himerni antigenski receptori; CAR)) i T ćelijske epitope koji su korisni za imunoterapiju.
[0011] WO 2016/180467 otkriva postupke i sredstva za poboljšanje efekta T ćelija konstruisanih da eksprimiraju himerne antigenske receptore (CAR).
[0012] WO 2016/150400 otkriva imune efektorske ćelije i postupak pripreme i primenu ciljanog CLDN6 za lečenje tumorskih ćelija.
KRATAK OPIS
[0013] Ovaj pronalazak, koji je definisan u patentnim zahtevima, obezbeđuje molekul himernog antigenskog receptora (CAR) specifičan za CLDN6, pri čemu CAR molekul sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira CAR molekul pronalaska. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina je DNK ili RNK.
[0014] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema pronalasku. U jednom primeru izvođenja, vektor je izabran iz grupe koja se sastoji od DNK vektora, RNK vektora, plazmida, lentivirusnog vektora, adenovirusnog vektora i retrovirusnog vektora. U jednom primeru izvođenja, vektor dalje sadrži promotor. U jednom primeru izvođenja, promotor je izabran od EF-1 promotora, CMV IE genskog promotora, EF-1α promotora, promotora ubikvitina C ili promotora fosfoglicerat kinaze (PGK).
[0015] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje imunu efektornu ćeliju, koja je T ćelija i poželjno humana T ćelija, koja sadrži:
CAR molekul pronalaska;
nukleinsku kiselinu pronalaska; ili
vektor pronalaska.
[0016] U jednom primeru izvođenja, T ćelija je genetski modifikovana da eksprimira CAR. U jednom primeru izvođenja, T ćelija je citotoksični T limfocit (CTL). U jednom primeru izvođenja, imuna efektorska ćelija je CD8+ T ćelija. U jednom primeru izvođenja, imuna efektorska ćelija je humana ćelija.
[0017] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje populaciju imunih efektorskih ćelija koje sadrže višestruke imune efektorske ćelije pronalaska.
[0018] U jednom primeru izvođenja imune efektorske ćelije pronalaska ili populacije imunoloških efektorskih ćelija pronalaska, ćelije nemaju ekspresiju ili imaju nisku ekspresiju funkcionalnog TCR ili funkcionalnog HLA.
[0019] Imune efektorske ćelije ili populacija imunih efektorskih ćelija prema pronalasku mogu biti autologne ili alogene za subjekta.
[0020] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje jedan ex vivo postupak pripreme imune efektorske ćelije pronalaska ili populacije imunih efektorskih ćelija pronalaska, koji sadrži uvođenje nukleinske kiseline pronalaska ili vektora pronalaska u imunu efektorsku ćeliju, pod uslovima takvim da je ekesprimiran CAR molekul prema pronalasku.
[0021] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje imunu efektorsku ćeliju pronalaska ili populaciju imunih efektorskih ćelija pronalaska za upotrebu kao lek, naime u postupku lečenja subjekta koji ima bolest povezanu sa ekspresijom CLDN6, koji sadrži obezbeđivanje subjektu efikasne količine imunih efektorskih ćelija pronalaska ili populacije imunih efektorskih ćelija pronalaska. U jednom primeru izvođenja, bolest je kancer.
[0022] U jednom primeru izvođenja, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera jajnika, kancera pluća, kancera želuca, kancera dojke, kancera jetre, kancera pankreasa, kancera kože, melanoma, kancera glave i vrata, sarkoma, kancera žučnih kanala, kancera bubrežnih ćelija i kancera mokraćne bešike.
Dodatni tehnički detalji
[0023] Imuna efektorska ćelija pronalaska ili populacija imunih efektorskih ćelija pronalaska može se koristiti za obezbeđivanje antitumorskog imuniteta kod subjekta obezbeđivanjem subjektu efikasne količine imune efektorske ćelije pronalaska ili populacije imunoloških efektorskih ćelija pronalaska. Obezbeđivanje ćelija može se izvršiti generisanjem ex vivo ćelija ili populacije ćelija pronalaska i njihovom primenom na subjekta; ili generisanjem navedenih ćelija ili populacije ćelija u subjektu.
[0024] Postupak može dalje da sadrži primenu sredstva koje povećava efikasnost imunih efektorskih ćelija pronalaska ili populacije imunih efektorskih ćelija pronalaska. Na primer, pomenuto sredstvo se može izabrati od jednog ili više od:
inhibitora protein fosfataze;
inhibitora kinaze;
citokina;
inhibitora imunog inhibitornog molekula; ili
sredstva koje smanjuje nivo ili aktivnost TREG ćelije.
[0025] Kada se koristi u medicinske svrhe, imuna efektorska ćelija pronalaska ili populacija imunih efektorskih ćelija pronalaska može biti u kontaktu sa srodnim molekulom antigena koji se vezuje za domen vezivanja antigena CLDN6. Navedeni srodni molekul antigena može biti izabran iz grupe koja se sastoji od CLDN6 ili njegovog fragmenta, ili varijante CLDN6 ili fragmenta CLDN6. Kontaktiranje ćelija sa srodnim antigenom može se izvesti pod takvim uslovima da dođe do ekspanzije i/ili aktivacije imune efektorske ćelije pronalaska ili populacije imunih efektorskih ćelija pronalaska. Korak dovođenja u kontakt imune efektorske ćelije pronalaska ili populacije imunih efektorskih ćelija pronalaska sa srodnim molekulom antigena može se obaviti in vivo ili ex vivo.
[0026] Srodni molekul antigena ili nukleinska kiselina koja ga kodira može se primeniti na subjekta. Nukleinska kiselina koja kodira srodni molekul antigena može biti eksprimirana u ćelijama subjekta da bi se obezbedio srodni molekul antigena, posebno na površini ćelije. Nukleinska kiselina koja kodira srodni molekul antigena je prolazno eksprimirana u ćelijama subjekta. Nukleinska kiselina koja kodira srodni molekul antigena može biti RNK.
[0027] Imuna efektorska ćelija pronalaska ili populacija imunih efektorskih ćelija pronalaska i/ili srodni molekul antigena ili nukleinska kiselina koja ih kodira mogu se primenjivati sistemski.
[0028] Posle sistemske primene nukleinske kiseline koja kodira srodni molekul antigena, može doći do ekspresije nukleinske kiseline koja kodira srodni molekul antigena u slezini. Posle sistemske primene nukleinske kiseline koja kodira srodni molekul antigena, može doći do ekspresije nukleinske kiseline koja kodira srodni molekul antigena u ćelijama koje prezentuju antigen, poželjno profesionalnim ćelijama koje prezentuju antigen.
[0029] Ćelije koje prezentuju antigen mogu biti dendritske ćelije, makrofagi ili B ćelije. U nekim slučajevima, nakon sistemske primene nukleinske kiseline koja kodira srodni molekul antigena, u plućima i/ili jetri se ne javlja ili se u suštini ne javlja ekspresija nukleinske kiseline koja kodira srodni molekul antigena. U nekim slučajevima, nakon sistemske primene nukleinske kiseline koja kodira srodni molekul antigena, ekspresija nukleinske kiseline koja kodira srodni molekul antigena u slezini je najmanje 5 puta veća od ekspresije u plućima.
[0030] Nukleinska kiselina koja kodira srodni molekul antigena može biti formulisana u vehikulumu za isporuku. U jednom primeru izvođenja, vehikulum za isporuku sadrži čestice. Vehikulum za isporuku može da sadrži najmanje jedan lipid. U nekim slučajevima, najmanje jedan lipid sadrži najmanje jedan katjonski lipid. U nekim slučajevima, lipid formira kompleks sa i/ili inkapsulira nukleinsku kiselinu koja kodira srodni molekul antigena.
[0031] U nekim slučajevima, lipid je sadržan u vezikuli koja inkapsulira nukleinsku kiselinu koja kodira srodni molekul antigena. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina koja kodira srodni molekul antigena je formulisana u lipozomima.
KRATAK OPIS CRTEŽA
Slika 1: Generisanje i karakterizacija različitih CLDN6-CAR.
A) Četiri različita CAR koja ciljaju CLDN6 su dizajnirana i generisana na osnovu varijabilnih domena teškog (VH) i lakog (VL) lanca CLDN6-specifičnog antitela IMAB206-C46S. IgG1ΔFc: humani IgG1 zglobni-CH2-CH3 Fc domen sa mutiranim IgG Fcγ receptorskim (FcγR) vezujućim mestima da bi se sprečila aktivacija urođenim imunim ćelijama koje eksprimiraju FcγR (Hombach A. et al., (2010) Gene Therapy 17, 1206-1213); CD28ΔLck: CD28 transmembranski i citoplazmatični domen sa delecijom u Lck vezujućem ostatku CD28 endodomena čime se poništava indukcija IL-2 nakon angažovanja CAR da bi se sprečila neželjena ekspanzija Treg ćelija na mestu tumora (Kofler D.M. et al., (2011) Molecular Therapy 19 (4), 760-767); 4-1BB: 4-1BB kostimulatorni endodomen; CD3ζ: CD3ζ signalni domen; CD3ζ*: CD3ζ sa mutacijom Q14→K; CD8α: humani CD8α zglobni domen. B) Funkcionalno testiranje različitih CLDN6-CAR u testu tumorskog PA1-SC12-A2-eGFP sferoida. Liza tumorskih sferoida je analizirana na osnovu ekspresije eGFP nakon 24 h kokulture (E:T = 10:1) upotrebom IncuCyte<®>sistema za snimanje živih ćelija. Slike bunarčića su skenirane sa 4x sočivima objektiva na početku ko-kulture (0h) i 24h nakon toga i predstavljaju ubijanje sferoida tumora tehničkih triplikata.
Slika 2: CAR-posredovano prepoznavanje i liza ciljnih ćelija koje eksprimiraju CLDN6.
A) CLDN6-CAR-BBz površinska ekspresija je analizirana na transdukovanim T ćelijama nakon bojenja sa fluorohrom-konjugovanim IMAB206-idiotip-specifičnim antitelom. Netransdukovane T ćelije su služile kao negativna kontrola. Ćelije su zatvorene na pojedinačnim CD4<+>ili CD8<+>limfocitima. Navedeni brojevi predstavljaju učestalost roditeljske populacije (u %). B) CLDN6 površinska ekspresija na Colo699-N ćelijama transfektovanim titriranim količinama CLDN6-RNK analizirana je protočnom citometrijom. C) Specifična liza RNK-transfektovanih Colo699-N ćelija pomoću CLDN6-CAR-BBz transdukovanih T ćelija je analizirana posle 12 h ko-kulture sa E:T odnosom od 20:1 upotrebom xCELLigence uređaja. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost±SD tehničkih triplikata.
Slika 3: Specifična CLDN6-CAR-posredovana liza tumorskih ćelijskih linija koje eksprimiraju CLDN6.
CLDN6-CAR-BBz transdukovane humane T ćelije su analizirane protočnom citometrijom i zajedno kultivisane sa panelom CLDN6-pozitivnih i -negativnih humanih tumorskih ćelijskih linija različitog porekla. A) Ekspresija površine CAR je procenjena protočnom citometrijom pre nego što je započeta kokultura. Navedeni brojevi predstavljaju učestalost roditeljske populacije (u %). B) upotrebom odnosa E:T od 10:1. C) Specifična liza je analizirana upotrebom xCELLligence sistema nakon 12 h ko-kulture prema formuli % lize = (CI eGFP -CI efektora)/CI eGFP *100; CI: ćelijski indeks. Podaci predstavljaju srednju vrednost ±SD tehničkih triplikata D) CLDN6 površinska ekspresija na tumorskim ćelijskim linijama je analizirana protočnom citometrijom nakon bojenja CLDN6-specifičnim antitelom. Prikazan je procenat roditeljske populacije. E) Relativni nivoi ekspresije CLDN6 iRNK u linijama tumorskih ćelija korišćenih u (A-D) kako je procenjeno pomoću qRT-PCR izračunati su nakon normalizacije na gen za održavanje HPRT1. Trake predstavljaju srednju vrednost ± SD tehničkih triplikata.
Slika 4: Proliferacija zavisna od doze posredovana preko CLDN6-CAR-BBz kao odgovor na ciljne ćelije koje eksprimiraju CLDN6.
CAR-transdukovane T ćelije su obeležene sa CFSE i zajedno kultivisane sa autolognim DC transfektovanim titriranim količinama CLDN6-RNK lipopleksa (RNK(LIP)). Proliferacija je analizirana na osnovu CFSE nakon 5 dana ko-kulture i bojenja sa fluorohrom-konjugovanim antitelima protiv CD4, CD8 i CAR. A) Ekspresija površine CAR je procenjena protočnom citometrijom pre nego što je započeta kokultura. Navedeni brojevi predstavljaju učestalost roditeljske populacije (u %). B) Ekspresija CLDN6 na površini transfektovanih DC je procenjena protočnom citometrijom upotrebom fluorohrom-konjugovanog CLDN6-specifičnog antitela. C) Specifična proliferacija je analizirana protočnom citometrijom na osnovu razblaženja CFSE boje za proliferaciju. Trake pokazuju procenat proliferišućih CD8<+>i CD4<+>T ćelija koje eksprimiraju CAR.
Slika 5: Anti-tumorska aktivnost CLDN6-CAR-BBz transdukovane T ćelije u modelu tumora ksenotransplantata uznapredovalog kancera jajnika (OV90).
5×10<6>OV90-SC12 tumorske ćelije su subkutano transplantirane 25 dana pre prenosa adoptivnih ćelija (ACT) pojedinačne doze od 1×10<7>i.v. primenjenih CLDN6-CAR-BBz ili eGFP transdukovanih humanih T ćelija (n=10/grupi). U ovom trenutku tretmana T ćelijama, miševi su već imali uznapredovali tumor od 170 mm<3>u proseku. Zapremina tumora je određivana tri puta nedeljno pomoću kalipera i izračunata prema formuli V = 1⁄2 (dužina × širina<2>) sa maksimalnom dužinom i širinom tumora. Životinje su žrtvovane kada je zapremina tumora prešla 1500 mm<3>ili kada je tumor ulcerisan. A) Šematski prikaz sprovedenog eksperimenta sa mišem. B) Ekspresija transgena (GFP ili CAR) transdukovanih humanih CD4<+>i CD8<+>T ćelija je analizirana protočnom citometrijom na dan ACT. Navedeni brojevi predstavljaju učestalost roditeljske populacije (u %). C) Prikazane su srednje zapremine tumora u životinjama tretiranim sa CLDN6-CAR-BBz i eGFP-T ćelijama nakon ACT (označeno isprekidanom linijom) do 44. dana. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM svih miševa/grupi. D) Perzistentnost T ćelija i površinska ekspresija CAR analizirani su u perifernoj krvi 3 nedelje nakon ACT pomoću protočne citometrije. Prikazane su reprezentativne tačkice. Brojevi su ukazivali na učestalost roditeljskih populacija.
Slika 6: Ponavljajuća eliminacija tumorskih sferoida 7-dnevnim i 10-dnevnim kultivisanim CLDN6-CAR T ćelijama.
CLDN6-CAR-transdukovane T ćelije generisane u roku od 7 i 10 dana, respektivno, procenjene su na njihov potencijal da ponavljajuće ubijaju sferoide tumora koji eksprimiraju CLDN6 i eGFP, kao što je procenjeno snimanjem živih ćelija. A) CAR površinska ekspresija 7-dnevnih i 10-dnevnih kultivisanih CLDN6-CAR T ćelija je analizirana na transdukovanim T ćelijama nakon bojenja sa fluorohrom-konjugovanim antitelom specifičnim za IMAB206-idiotip. Netransdukovane T ćelije su služile kao negativna kontrola. Ćelije su zatvorene na pojedinačnim CD4<+>ili CD8<+>limfocitima. Navedeni brojevi predstavljaju učestalost roditeljske populacije (u %). B) Funkcionalno testiranje 7-dnevnih i 10-dnevnih kultivisanih CLDN6-CAR T ćelija obavljeno je korišćenjem PA1-SC12-A2-eGFP testa tumorskog sferoida. Liza tumorskih sferoida je analizirana na osnovu ekspresije eGFP pomoću IncuCyte<®>sistema za snimanje živih ćelija u ukupnom vremenskom periodu od 10 dana. Posle 5 dana dodat je novi sferoid tumora. Vrednosti predstavljaju integrisane intenzitete zelenog objekta tehničke tri kopije kao srednja vrednost±SD.
Slika 7: Antitumorska efikasnost GMP-proizvedenih CLDN6-CAR T ćelija
5×10<6>OV90-SC12 tumorske ćelije su subkutano translantirane 35 dana pre usvajanja pojedinačne doze ili 1×10<7>CLDN6-CAR-BBz ili netransdukovanih humanih T ćelija i.v. (n=12/grupi). Korišćeni proizvodi T ćelija proizvedeni su u GMP postrojenju u bilo kom standardu (deset dana in vitro kultivacije) ili u skraćenom postupku proizvodnje (sakupljeni već posle sedam dana). Netransdukovane T ćelije, koje su tretirane na isti način kao i transdukovane T ćelije, korišćene su kao negativna kontrola. Navedeni proizvodi T ćelija su odmrznuti, isprani sa PBS i direktno ubrizgani u miševe, koji su već imali uznapredovali tumor od 160 mm<3>u proseku. Zapremina tumora je određivana tri puta nedeljno pomoću kalipera i izračunata prema formuli V = 1⁄2 (dužina × širina<2>) sa maksimalnom dužinom i širinom tumora. Životinje su žrtvovane kada je zapremina tumora prešla 1500 mm<3>ili kada je tumor ulcerisan. A) Šematski prikaz sprovedenog eksperimenta sa mišem. B) Površinska ekspresija CAR na transdukovanim humanim CD4<+>i CD8<+>T ćelijama je analizirana protočnom citometrijom na dan ACT. Navedeni brojevi predstavljaju učestalost roditeljske populacije (u %). C) Prikazane su zapremine tumora u CLDN6-CAR-BBz i životinjama tretiranim kontrolnim T ćelijama do 57.
dana. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM svih miševa/grupi. D) Perzistentnost T ćelija i površinska ekspresija CAR analizirani su u perifernoj krvi 2 nedelje nakon ACT pomoću protočne citometrije. Prikazane su reprezentativne tačke. Brojevi su ukazivali na učestalost roditeljskih populacija.
Slika 8: In vivo proširenje preko RNK(LIP)dovodi do poboljšane perzistentnosti CLDN6-CAR-BBz T ćelija
2.5 Gy ozračeni (XRAD320) C57BL/6BrdCrHsd-Tyr<c>miševi (n = 2-3/grupi) su i.v. translantirani sa 5 × 10<6>CLDN6-CAR-BBz-Luc-GFP transdukovanih C57Bl/6-Thy1.1<+>T ćelija. 8 dana nakon ACT, miševi su primili hCLDN6 ili Oval (ctrl RNK) koji kodiraju iRNK lipopleks vakcinaciju (RNK(LIP); 20 µg, i.v.) što je praćeno i.p. primenom nukleozidommodifikovane RNK koja kodira mišji albumin (1 µg/iRNK/mišu). Vakcinacija je ponovljena 15., 22., 50. i 85. dana. Urađeno je sekvencijalno bioluminiscenciono snimanje da bi se pratila ekspanzija i perzistencija na dan 1 (osnovna linija) do 92. dana nakon ACT. A) Šematski prikaz sprovedenog eksperimenta sa mišem. B) Primer bioluminiscentnog snimanja miševa u bočnom položaju u naznačenom vremenskom trenutku nakon ACT i tretmana sa antigenom RNK(LIP). Slike koje nisu u boji predstavljaju intenzitet svetlosti (crna, najmanje intenzivna; bela do tamno siva, najintenzivnija) koja je postavljena preko referentnih slika u nijansama sive. C) Kvantitativno određivanje bioluminiscencije tokom i nakon krugova proširenja sa CLDN6-RNK(LIP)/ctrl-RNK(LIP)u prisustvu naznačenih nukleozid-modifikovanih citokinskih RNK je prikazano (srednja vrednost /- s.e.m.). Sive, vertikalne linije označavaju vremensku tačku RNK(LIP)vakcinacije. ACT: adoptivni transfer T ćelija, TBI: zračenje celog tela, BLI: bioluminiscentno snimanje, Luc: efikasna luciferaza svica, BBz: 4-1BB; z: CD3zeta.
Slika 9: Poboljšana antitumorska aktivnost in vivo proširenih CLDN6-CAR-BBz T ćelija 5×10<5>CT26 tumorskih ćelija je subkutano translantirano u Balb/c miševe 20 dana pre zračenja ukupnog tela od 4 Gy i 26 dana pre ACT jedne doze od 1×10<6>CLDN6-CAR-BBz ili ctrl-CAR-BBz transdukovanih Balb/c-Thy1.1+ T ćelija i.v. (n=10/grupi). U vremenskoj tački tretmana T ćelijama, miševi su imali ustanovljene tumore od pribl.80 mm<3>u proseku. Zapremina tumora je određivana tri puta nedeljno pomoću kalipera i izračunata prema formuli V = 1⁄2 (dužina × širina<2>) sa maksimalnom dužinom i širinom tumora. A) Šematski prikaz sprovedenog eksperimenta sa mišem. B) Prikazane su srednje zapremine tumora u CLDN6-CAR-BBz i ctrl-CAR-BBz-T ćelijama tretiranim životinjama do 40. dana. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM svih miševa/grupi. ACT je označen kao isprekidana linija i RNK(LIP)tretman kao siva linija.
Slika 10: Ponovo uspostavljena antitumorska efikasnost niske doze in vivo proširene CLDN6-CAR T ćelije
5×10<6>OV90-SC12 tumorskih ćelija je subkutano translantirano 30 dana pre ACT jedne doze, bilo male doze (1×10<5>) ili visoke doze (1×10<6>) CLDN6-CAR-BBz ili 1×10<7>netransdukovanih humanih T ćelija i.v. (n=9/grupi). Korišćeni proizvodi T ćelija proizvedeni su u skladu sa skraćenim postupkom transdukcije (sakupljeni već nakon 7 dana) u GMP postrojenju. Netransdukovane T ćelije, koje su tretirane na isti način kao i transdukovane T ćelije, korišćene su kao negativna kontrola. Navedeni proizvodi T ćelija su odmrznuti, isprani sa PBS i direktno injektirani u miševe koji nose tumor. Pored toga, miševi koji su primili nisku dozu CAR T ćelija su dalje vakcinisani sa 20 µg RNK(LIP)koji kodiraju CLDN6 ili kontrolni antigen kako je naznačeno. Zapremina tumora je određivana tri puta nedeljno pomoću kalipera i izračunata prema formuli V = 1⁄2 (dužina × širina<2>) sa maksimalnom dužinom i širinom tumora. Životinje su žrtvovane kada je zapremina tumora prešla 1500 mm<3>ili kada je tumor ulcerisan. A) Šematski prikaz sprovedenog eksperimenta sa mišem. B) Površinska ekspresija CAR na transdukovanim humanim CD4<+>i CD8<+>T ćelijama je analizirana protočnom citometrijom na dan adoptivnog transfera. Navedeni brojevi predstavljaju učestalost roditeljske populacije (u %). C) Krive rasta tumora kod životinja tretiranih različitim dozama CLDN6-CAR-BBz /-RNK(LIP)ili kontrolne T ćelije. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM svih miševa/grupe. ACT je označen kao isprekidana linija i RNK(LIP)tretman kao sive linije. D) Perzistentnost T ćelija i površinska ekspresija CAR analizirani su u perifernoj krvi 2.5 nedelje nakon ACT pomoću protočne citometrije. Prikazane su reprezentativne tačke. Brojevi su ukazivali na učestalost roditeljskih populacija.
DETALJNO OTKRIĆE
[0033] Ovo otkriće daje učenja koja u nekim aspektima prevazilaze pronalazak kao takav koji je definisan isključivo priloženim patentnim zahtevima. Učenja su data da bi se stvarni pronalazak stavio u širi tehnički kontekst i da bi se ilustrovali mogući srodni tehnički razvoji. Takve dodatne tehničke informacije koje ne spadaju u obim priloženih patentnih zahteva nisu deo pronalaska. Posebno, termini "primer izvođenja" i "aspekt" ne treba da se tumače kao da se nužno odnose na primer izvođenja pronalaska, osim ako dotični "primer izvođenja" ili "aspekt" ne spadaju u obim patentnih zahteva.
Opšta učenja
[0034] Otkriće se odnosi na kompozicije i postupke za lečenje kancera uključujući, ali ne ograničavajući se na solidne tumore. Ovo otkriće se odnosi na strategiju adoptivnog ćelijskog transfera ćelija kao što su T ćelije transdukovane da eksprimiraju CAR. CAR su molekuli koji kombinuju specifičnost za željeni antigen (npr. tumorski antigen) koji je poželjno baziran na antitelu sa intracelularnim domenom koji aktivira receptor T ćelija da bi se stvorio himerni protein koji pokazuje specifičnu ćelijsku imunološku aktivnost (npr. imunološka aktivnost tumorske ćelije). Poželjno, ćelija može biti genetski modifikovana da stabilno eksprimira CAR na svojoj površini, dajući novu specifičnost antigena koja je nezavisna od MHC. Ovo otkriće se generalno odnosi na T ćelije genetski modifikovane da stabilno eksprimiraju željeni CAR. T ćelije koje eksprimiraju CAR se ovde nazivaju CAR T ćelije ili CAR-modifikovane T ćelije.
[0035] CAR ovog otkrića kombinuje domen za vezivanje CLDN6 antigena, poželjno domen specifičnog antitela, i intracelularni domen koji sadrži 4-1BB kostimulatorni domen i domen CD3-zeta lanca u jedan himerni protein. U jednom primeru izvođenja, CAR ovog otkrića sadrži ekstracelularni domen koji sadrži domen za vezivanje antigena CLDN6, transmembranski domen i intracelularni domen koji sadrži 4-1BB kostimulatorni domen i domen CD3-zeta lanca. U jednom primeru izvođenja, transmembranski domen nije prirodno povezan sa jednim od domena u CAR. U jednom primeru izvođenja, transmembranski domen je prirodno povezan sa jednim od domena u CAR. U jednom primeru izvođenja, transmembranski domen je modifikovan supstitucijom aminokiselina da bi se izbeglo vezivanje takvih domena za transmembranske domene istih ili različitih proteina površinske membrane da bi se minimizirale interakcije sa drugim članovima receptorskog kompleksa. Poželjno, transmembranski domen je poreklom iz CD8α.
[0036] Otkriće dalje pruža CAR T ćelije i postupke njihove upotrebe za adoptivnu terapiju. U jednom primeru izvođenja, CAR T ćelije iz ovog otkrića mogu se generisati uvođenjem retrovirusnog kao što je lentivirusni vektor koji sadrži željeni CAR, na primer CAR koji sadrži anti-CLDN6, CD8α zglobni i transmembranski domen, i 4-1BB i CD3zeta signalne domene, u ćelije. Poželjno je da su CAR T ćelije iz ovog otkrića sposobne da se repliciraju vivo što rezultira dugotrajnom perzistentnošću koja može dovesti do trajne kontrole tumora.
[0037] U jednom primeru izvođenja, otkriće se odnosi na primenu genetski modifikovane T ćelije koja eksprimira željeni CAR za lečenje pacijenata koji boluju od kancera ili su u riziku od kancera. Poželjno, autologne ćelije se koriste u tretmanu. U jednom primeru izvođenja, autologni PBMC se sakupljaju od pacijenta kome je potreban tretman i T ćelije se aktiviraju i proširuju korišćenjem postupaka koje su ovde opisani i poznati u tehnici, a zatim se ponovo infuziraju i pacijenta.
[0038] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se generalno odnosi na lečenje pacijenta koji ima ili je u riziku od razvoja kancera koji eksprimira CLDN6. Otkriće uključuje upotrebu T ćelija koje eksprimiraju anti-CLDN6-CAR uključujući i CD3-zeta i 4-1BB kostimulatorni domen. CAR T ćelije iz ovog otkrića mogu da podlegnu snažnom in vivo T ćelijskom proširenju, posebno ako su u kontaktu sa njihovim srodnim antigenom, i mogu da opstanu na visokim nivoima tokom dužeg vremenskog perioda. U nekim slučajevima, CAR T ćelije iz otkrića infuzirane u pacijenta mogu eliminisati ćelije kancera in vivo kod pacijenata.
Definicije
[0039] Iako je sadašnje otkriće detaljno opisano u daljem tekstu, treba razumeti da ovo otkriće nije ograničeno na posebne metodologije, protokole i reagense koji su ovde opisani, jer oni mogu da variraju. Takođe treba razumeti da se ovde korišćena terminologija koristi samo za opisivanje određenih primera izvođenja i nije namenjena da ograniči obim sadašnjeg otkrića koji će biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde korišćeni imaju ista značenja kao što ih uobičajeno razume prosečan stručnjak u tehnici.
[0040 ] U nastavku će biti opisani elementi iz predmetnog otkrića. Ovi elementi su navedeni sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, treba razumeti da oni mogu biti kombinovati na bilo koji način i u bilo kojem broju da bi se kreirale dodatni primeri izvođenja. Različite opisane primere i poželjne primere izvođenja ne treba tumačiti tako da ograničavaju sadašnje otkriće samo na eksplicitno opisane primere izvođenja. Ovaj opis treba shvatiti da podržava i obuhvata primere izvođenja koji kombinuju eksplicitno opisane primere izvođenja sa bilo kojim brojem otkrivenih i/ili poželjnih elemenata. Osim toga, bilo koje permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati otkrivenim putem opisa sadašnje prijave, osim ukoliko nije drugačije naznačeno kontekstom.
[0041] Osim ako nisu drugačije definisani, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju isto značenje koje obično razume stručnjak u oblasti na koju se otkriće odnosi. Iako se bilo koji postupak i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi za testiranje ovog otkrića, ovde su opisani poželjni materijali i postupci. U opisivanju i traženju ovog otkrića, koristiće se sledeća terminologija.
[0042] U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč "sadrže", i varijacije kao što su "sadrži" i "koji sadrži", biće shvaćene da znače uključenje navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne i isključenje bilo kog drugog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, iako u nekim primerima izvođenja mogu biti isključeni takvi drugi članovi, celi brojevi ili korak ili članovi grupe, celi brojevi ili koraci, tj., predmet se sastoji od uključenja navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka.
[0043] Članovi "a" i "an" se ovde koriste da upućuju na jedan ili više od jednog (tj., na najmanje jedan) gramatičkog objekta člana. Na primer, "element" označava jedan element ili više od jednog elementa.
[0044] "Oko" kako se ovde koristi kada se odnosi na merljivu vrednost kao što je količina, vremensko trajanje i slično, podrazumeva varijacije od ±20% ili ±10%, poželjnije ±5%, još poželjnije ±1% i još poželjnije ±0.1% od navedene vrednosti.
[0045] Termin "antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na molekul imunoglobulina koji se vezuje, poželjno specifično vezuje za antigen. Antitela mogu biti intaktni imunoglobulini poreklom iz prirodnih izvora ili iz rekombinantnih izvora i mogu biti imunoreaktivni delovi ili fragmenti intaktnih imunoglobulina. Antitela su tipično tetrameri molekula imunoglobulina. Antitela u ovom otkriću mogu postojati u različitim oblicima uključujući, na primer, poliklonska antitela, monoklonska antitela, Fv, Fab i F(ab)2, kao i jednolančana antitela i humanizovana antitela (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, in: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
[0046] Antitela eksprimirana od strane B ćelija se ponekad nazivaju BCR (receptor B ćelija) ili antigenski receptor. Pet članova uključenih u ovu klasu proteina su IgA, IgG, IgM, IgD i IgE. IgA je primarno antitelo koje je prisutno u telesnim izlučevinama, kao što su pljuvačka, suze, majčino mleko, gastrointestinalni sekreti i sekreti sluzi respiratornog i genitourinarnog trakta. IgG je najčešće cirkulišuće antitelo. IgM je glavni imunoglobulin proizveden u primarnom imunološkom odgovoru kod većine ispitanika. To je najefikasniji imunoglobulin u aglutinaciji, fiksaciji komplementa i drugim odgovorima antitela, a važan je u odbrani od bakterija i virusa. IgD je imunoglobulin koji nema poznatu funkciju antitela, ali može služiti kao receptor antigena. IgE je imunoglobulin koji posreduje u neposrednoj hipersenzitivnosti izazivajući oslobađanje medijatora iz mastocita i bazofila nakon izlaganja alergenu.
[0047] Termin "fragment antitela" se odnosi na deo intaktnog antitela i tipično sadrži varijabilne regione koji određuju antigene intaktnog antitela.
[0048] Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente, linearna antitela, scFv antitela i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.
[0049] "Teški lanac antitela", kako se ovde koristi, odnosi se na veći od dva tipa polipeptidnih lanaca prisutnih u molekulima antitela u njihovim prirodnim konformacijama.
[0050] "Laki lanac antitela", kako se ovde koristi, odnosi se na manji od dva tipa polipeptidnih lanaca prisutnih u molekulima antitela u njihovim prirodnim konformacijama, κ i λ laki lanci se odnose na dva glavna izotipa lakog lanca antitela.
[0051] Termin "antigen" ili "Ag" kako se ovde koristi je definisan kao molekul koji izaziva imuni odgovor. Ovaj imuni odgovor može uključivati ili proizvodnju antitela, ili aktivaciju specifičnih imunološki kompetentnih ćelija, ili oba. Stručnjak će razumeti da bilo koji makromolekul, uključujući praktično sve proteine ili peptide, može poslužiti kao antigen. Pored toga, antigeni mogu biti prirodni ili rekombinantni antigeni.
[0052] U kontekstu sadašnjeg otkrića, termin "tumorski antigen" se odnosi na antigene koji su uobičajeni za specifične hiperproliferativne poremećaje kao što je kancer.
[0053] Klaudini su integralni membranski proteini lokalizovani unutar uskih spojeva epitela i endotela. Klaudini su predviđeni da imaju četiri transmembranska segmenta sa dve ekstracelularne petlje i N- i C-krajeve koji se nalaze u citoplazmi. Prva ekstracelularna petlja, nazvana EC1 ili ECL1, sastoji se u proseku od 53 aminokiselina, a druga ekstracelularna petlja, nazvana EC2 ili ECL2, sastoji se od oko 24 aminokiselina. Klaudinska (CLDN) familija transmembranskih proteina igra kritičnu ulogu u održavanju epitelijalnih i endotelijalnih uskih veza i takođe, može igrati ulogu u održavanju citoskeleta i u ćelijskoj signalizaciji.
[0054 ] Klaudin 6 (CLDN6) je onkofetalni gen eksprimiran u mišjim i humanim matičnim ćelijama, kao i embrioidna tela koja su posvećena sudbini epitelnih ćelija (Turksen, K. et al. (2001) Dev Dyn 222, 292-300; Anderson WJ. et al. (2008) Dev Dyn 237, 504-12; Turksen K. et al. (2002) Development, 129, 1775-84; Assou S. et al. (2007) Stem Cells 25, 961-73). Kao antigen povezan sa tumorom, može biti klasifikovan kao antigen diferencijacije usled njegove ekspresije tokom ranog stadijuma epidermalne morfogeneze, gde je to ključno za epidermalnu diferencijaciju i formiranje barijere. Dodatno ekspresija je zapažena u epitelnim tkivima ili neonatalnom normalnom epitelnom tkivu jezika, kože, želuca i dojke (Abuazza G. et al. (2006), Am J Physiol Renal Physiol 291, 1132-1141; Troy T.C. et al. (2007), Molecular Biotechnology 36, 166-74; Zhao L. et al. (2008), Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 294, 1856-1862).
Osim toga, sopstveni podaci takođe otkrivaju nisku ili veoma nisku ekspresiju CLDN6 u humanoj placenti, mokraćnoj bešici, endometrijumu, prostati i perifernom nervu i čestu prekomernu ekspresiju CLDN6 kod različitih vrsta kancera. Pokazano je da je CLDN6 prekomerno eksprimiran kod tumora, uključujući pedijatrijske tumore mozga, želudačne adenokarcinome i tumore germinativnih ćelija, kao i visceralne karcinome, kao što su karcinomi jajnika. Takođe je pokazano da prekomerna ekspresija CLDN6 u ćelijama karcinoma želuca dovodi do povećane invazivnosti, migracije i proliferacije, što ukazuje na to da je CLDN6 marker za lošu prognozu i može imati potencijalnu ulogu u održavanju malignog fenotipa. Dodatno, pokazano je da CLDN6 funkcioniše kao supresor kancera putem inhibicije ćelijske proliferacije i indukcije apoptoze u ćelijskim linijama kancera dojke.
[0055] Nađeno je da je CLDN6 eksprimiran, na primer, kod kancera jajnika, kancera pluća, kancera želuca, kancera dojke, kancera jetre, kancera pankreasa, kancera kože, melanoma, karcinoma vrata i glave, sarkoma, karcinoma žučnih kanala, kancera bubrežnih ćelija i kancera mokraćne bešike. CLDN6 je naročito poželjno ciljno mesto za prevenciju i/ili lečenje kancera jajnika, posebno adenokarcinoma jajnika i teratokarcinoma jajnika, kancera pluća, uključujući sitnoćelijski karcinom pluća (SCLC) i ne-sitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), posebno karcinom pluća skvamoznih ćelija i adenokarcinom, kancera želuca, kancera dojke, karcinoma jetre, kancera pankreasa, kancera kože, posebno karcinoma bazalnih ćelija i karcinoma skvamoznih ćelija, malignog melanoma, kancera glave i vrata, posebno malignog pleomorfnog adenoma, sarkoma, posebno sinovijalnog sarkoma i karcinosarkoma, karcinoma žučnih kanala, kancera mokraćne bešike, naročito karcinoma prelazne ćelije i papilarnog karcinoma, kancera bubrega, posebno karcinoma bubrežnih ćelija, uključujući karcinom svetlih ćelija bubrežnih ćelija i papilarni karcinom bubrežnih ćelija, kancera debelog creva, kancera tankog creva, uključujući kancer ileuma, posebno adenokarcinom tankog creva i adenokarcinom ileuma, testikularnog embrionalnog karcinoma, placentnog horiokarcinoma, kancera grlića materice, kancera testisa, posebno seminoma testisa, teratoma testisa i embrionskog kancera testisa, kancera materice, tumora germinativnih ćelija, kao što je teratokarcinom ili embrionalni karcinom, naročito tumora germinativnih ćelija testisa i njihovih metastatskih oblika. U jednom primeru izvođenja, bolest kancer povezana sa ekspresijom CLDN6 je izabrana iz grupe koja se sastoji od kancera jajnika, kancera pluća, metastatskog kancera jajnika i metastatskog kancera pluća. Poželjno, kancer jajnika je karcinom ili adenokarcinom. Poželjno, kancer pluća je karcinom ili adenokarcinom, a poželjno je karcinom bronhiola, kao što je bronhiolarni karcinom ili bronhiolarni adenokarcinom.
[0056] Termin "CLDN6" se poželjno odnosi na humani CLDN6, a posebno na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 iz listinga sekvenci ili varijante pomenute aminokiselinske sekvence. Prva ekstracelularna petlja CLDN6 poželjno sadrži aminokiseline 28 do 80, poželjnije aminokiseline 28 do 76 iz aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 1 ili aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 2. Druga ekstracelularna petlja CLDN6 poželjno sadrži aminokiseline 138 do 160, poželjno aminokiseline 141 do 159, još poželjnije aminokiseline 145 do 157 iz aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 1 ili aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO : 2. Pomenute prva i druga ekstracelularna petlja poželjno, formiraju ekstracelularni deo CLDN6.
[0057] Termin „eksprimiran na površini ćelije“ ili „povezan sa površinom ćelije“ znači da je molekul kao što je CLDN6 povezan sa plazma membranom ćelije i lociran na njoj, pri čemu je najmanje deo molekula okrenut vanćelijskom prostoru pomenute ćelije i dostupan je sa spoljašnje strane navedene ćelije, na primer, pomoću antitela smeštenih van ćelije. U ovom kontekstu, deo je poželjno najmanje 4, poželjno najmanje 8, poželjno najmanje 12, poželjnije najmanje 20 aminokiselina. Vezivanje može biti direktno ili indirektno. Na primer, vezivanje može biti putem jednog ili više transmembranskih domena, jednog ili više lipidnih sidara, ili interakcije sa bilo kojim drugim proteinom, lipidima, saharidom ili drugom strukturom koja se može naći na spoljašnjem letku plazma membrane ćelija. Na primer, molekul povezan sa površinom ćelije može biti transmembranski protein koji ima ekstracelularni deo ili može biti protein povezan sa površinom ćelije interakcijom sa drugim proteinom koji je transmembranski protein.
[0058] "Ćelijska površina" ili "površina ćelije" se koristi u skladu sa svojim normalnim značenjem u tehnici, i na taj način uključuje spoljašnjost ćelije koja je dostupna za vezivanje pomoću proteina i drugih molekula.
[0059] „Ćelijski posredovan imunitet“, „ćelijski imunitet“, „ćelijski imuni odgovor“ ili slični termini označavaju ćelijski odgovor usmeren na ćelije koje karakteriše ekspresija antigena, posebno karakterisana prezentacijom antigena klase I ili klase II MHC. Ćelijski odgovor se odnosi na ćelije koje se nazivaju T ćelije ili T limfociti koji deluju ili kao "pomagači" ili "ubice". Pomoćne T ćelije (takođe nazvane CD4<+>T ćelije) igraju centralnu ulogu regulacijom imunološkog odgovora i ćelije ubice (koji se takođe nazivaju citotoksične T ćelije, citolitičke T ćelije, CD8<+>T ćelije ili CTL) ubijaju bolesne ćelije kao što su ćelije kancera, sprečavajući proizvodnju više obolelih ćelija.
[0060] Termin "epitop" se odnosi na antigenu determinantu u molekulu kao što je antigen, tj. na deo ili fragment molekula, koji je prepoznat, tj. vezan, imunim sistemom, na primer, koji je prepoznat od strane antitela ili CAR. Na primer, epitopi su posebna, trodimenzionalna mesta na antigenu, koja su prepoznata od strane imunog sistema. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prvi, ali ne i za drugi, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Poželjno, epitop je sposoban da izazove imuni odgovor protiv antigena ili ćelije koja eksprimira antigen. Poželjno, termin se odnosi na imunogeni deo antigena. Epitop proteina kao što je tumorski antigen poželjno sadrži kontinuirani ili diskontinualni deo pomenutog proteina i poželjno je između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 aminokiselina u dužinu, na primer, epitop može biti poželjno 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 aminokiselina u dužinu.
[0061] "Obrada antigena" se odnosi na degradaciju antigena u proizvode obrade, koji su fragmenti navedenog antigena (npr., degradacija proteina u peptide) i vezivanje jednog ili više ovih fragmenata (npr., preko vezivanja) sa MHC molekulima za prezentaciju od strane ćelija, poželjno antigen prezentujućih ćelija za specifične T ćelije.
[0062 ] Ćelija koja predstavlja antigen (APC) je ćelija koja ispoljava antigen u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) na njenoj površini. T ćelije mogu da prepoznaju ovaj kompleks upotrebom njihovog T ćelijskog receptora (TCR). Antigenprezentujuće ćelije obrađuju antigene i prezentuju ih T ćelijama. Prema otkriću, termin „antigen-prezentujuće ćelije“ obuhvata profesionalne antigen-prezentujuće ćelije i neprofesionalne antigen-prezentujuće ćelije.
[0063 ] Profesionalne antigen-prezentujuće ćelije su veoma efikasne u internalizaciji antigena, bilo fagocitozom ili endocitozom posredovanom receptorom i zatim ispoljavanjem fragmenta antigena, vezanog za MHC molekul klase II, na njihovoj membrani. T ćelija prepoznaje i stupa u interakciju sa kompleksom molekula MHC klase II antigena na membrani ćelije koja predstavlja antigen. Dodatni ko-stimulativni signal je zatim proizveden od strane antigenprezentujuće ćelije, što dovodi do aktivacije T ćelije. Ekspresija ko-stimulativnih molekula je karakteristika koja određuje profesionalne antigen-prezentujuće ćelije. Glavni tipovi profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija su dendritske ćelije, koje imaju najširi raspon prezentacije antigena i verovatno su najvažnije antigen-prezentujuće ćelije, makrofage, B-ćelije i određene aktivirane epitelne ćelije.
[0064] Termin "makrofag" se odnosi na podgrupu fagocitnih ćelija proizvedenih diferencijacijom monocita. Makrofagi koji se aktiviraju inflamacijom, imuni citokini ili mikrobiološki proizvodi nespecifično gutaju i ubijaju strane patogene unutar makrofaga hidrolitičkim i oksidativnim napadom koji rezultira degradacijom patogena. Peptidi iz degradiranih proteina se prikazuju na površini ćelije makrofaga gde ih T ćelije mogu prepoznati i mogu direktno da interaguju sa antitelima na površini B ćelije, što rezultira aktivacijom T i B ćelija i daljom stimulacijom imunološkog odgovora. Makrofagi pripadaju klasi ćelija koje prezentuju antigen. U jednom primeru izvođenja, makrofagi su makrofagi slezine.
[0065] Termin "dendritska ćelija" (DC) se odnosi na drugi podtip fagocitnih ćelija koji pripadaju klasi ćelija koje prezentuju antigen. U jednom primeru izvođenja, dendritske ćelije su poreklom iz hematopoetskih progenitornih ćelija koštane srži. Ove progenitorske ćelije se u početku transformišu u nezrele dendritske ćelije. Ove nezrele ćelije karakteriše visoka fagocitna aktivnost i nizak potencijal aktivacije T ćelija. Nezrele dendritske ćelije neprestano uzorkuju okolno okruženje za patogene kao što su virusi i bakterije. Jednom kada dođu u kontakt sa prisutnim antigenom, aktiviraju se u zrele dendritske ćelije i počinju da migriraju u slezinu ili u limfni čvor. Nezrele dendritske ćelije fagocitiraju patogene i razgrađuju njihove proteine na male komade i nakon sazrevanja prezentuju te fragmente na svojoj ćelijskoj površini koristeći MHC molekule. Istovremeno, oni pojačavaju receptore na ćelijskoj površini koji deluju kao koreceptori u aktivaciji T ćelija, kao što su CD80, CD86 i CD40, značajno povećavajući njihovu sposobnost da aktiviraju T ćelije. Oni takođe regulišu CCR7, hemotaktički receptor koji indukuje dendritsku ćeliju da putuje kroz krvotok do slezine ili kroz limfni sistem do limfnog čvora. Ovde one deluju kao ćelije koje prezentuju antigen i aktiviraju pomoćne T ćelije i T ćelije ubice, kao i B ćelije tako što im prezentuju antigene, zajedno sa kostimulativnim signalima koji nisu specifični za antigen. Dakle, dendritske ćelije mogu aktivno da indukuju imuni odgovor vezan za T ćelije ili B ćelije. U jednom primeru izvođenja, dendritske ćelije su dendritske ćelije slezine.
[0066] Prema otkriću, termin "CAR" (ili "himerni antigenski receptor") se odnosi na veštački receptor koji sadrži jedan molekul ili kompleks molekula koji prepoznaje, tj. vezuje se za ciljnu strukturu (npr. antigen) na ciljnoj ćeliji kao što je ćelija kancera (npr. vezivanjem antigen vezujućeg domena za antigen eksprimiran na površini ciljne ćelija) i može dati specifičnost imunoj efektorskoj ćeliji kao što je T ćelija koja eksprimira pomenuti CAR na površini ćelije. Poželjno, prepoznavanje ciljne strukture od strane CAR rezultira aktivacijom imune efektorske ćelije koja eksprimira navedeni CAR. CAR može da sadrži jednu ili više proteinskih jedinica, pri čemu pomenute proteinske jedinice sadrže jedan ili više domena kao što su ovde opisani. Termin "CAR" ne uključuje T ćelijske receptore.
[0067] Adoptivna ćelijska transfer terapija sa CAR-konstruisanim T-ćelijama koje eksprimiraju himerne antigenske receptore je obećavajući anti-kancerski terapeutik, kao što su CAR-modifikovane T ćelije, mogu biti konstruisane tako da ciljno deluju zapravo na bilo koji tumorski antigen. Na primer, pacijentove T ćelije mogu biti genetski konstruisane (genetski modifikovane) tako da eksprimiraju CAR specifično usmerene ka antigenima na tumorskim ćelijama pacijenta, a zatim infuzirane nazad u pacijenta.
[0068] Termin "anti-tumorski" kako se ovde koristi, odnosi se na biološki efekat koji se može manifestovati smanjenjem zapremine tumora, smanjenjem broja tumorskih ćelija, smanjenjem broja metastaza, prevencijom pojave tumora na prvom mestu, produženjem životnog veka ili ublažavanjem različitih fizioloških simptoma povezanih sa kanceroznim stanjem.
[0069] Kako se ovde koristi, termin "autologan" se odnosi na bilo koji materijal koji potiče od iste individue kojoj se kasnije ponovo uvodi.
[0070] "Alogeni" se odnosi na transplantat koji potiče od različite životinje iste vrste,
[0071] "Ksenogen" se odnosi na transplantat dobijen od životinje druge vrste.
[0072] Termin "singeneični" se koristi da opiše bilo šta što je izvedeno od individua ili tkiva koji imaju identične genotipove, tj. identičnih blizanaca ili životinja istog urođenog soja, ili njihovih tkiva.
[0073] Termin "kancer" kako se ovde koristi je definisan kao bolest koju karakteriše brz i nekontrolisan rast aberantnih ćelija. Ćelije kancera se mogu širiti lokalno ili kroz krvotok i limfni sistem u druge delove tela. Primeri različitih kancera uključuju, ali nisu ograničeni na, kancer dojke, kancer prostate, kancer jajnika, kancer grlića materice, kancer kože, kancer pankreasa, kolorektalni kancer, kancer bubrega, kancer jetre, kancer mozga, limfom, leukemiju, kancer pluća i slično.
[0074] Kako se ovde koriste, termini "peptid", "polipeptid" i "protein" se koriste naizmenično i odnose se na jedinjenje koje se sastoji od aminokiselinskih ostataka kovalentno povezanih peptidnim vezama. Protein ili peptid mora da sadrži najmanje dve aminokiseline i nema ograničenja na maksimalan broj aminokiselina koje mogu da sadrže sekvencu proteina ili peptida. Polipeptidi obuhvataju bilo koji peptid ili protein koji sadrži dve ili više aminokiselina povezanih jednu sa drugom peptidnim vezama. Kako se ovde koristi, termin se odnosi na oba kratka lanca, koji se u struci takođe obično pominju kao peptidi, oligopeptidi i oligomeri, na primer, i na duže lance, koji se generalno u struci nazivaju proteini, od kojih postoje mnogo vrsta. "Polipeptidi" obuhvataju, na primer, biološki aktivne fragmente, suštinski homologne polipeptide, oligopeptide, homodimere, heterodimere, varijante polipeptida, modifikovane polipeptide, derivate, analoge, fuzione proteine, između ostalog. Polipeptidi uključuju prirodne peptide, rekombinantne peptide, sintetičke peptide ili njihovu kombinaciju.
[0075] Termin "polinukleotid" kako se ovde koristi je definisan kao lanac nukleotida. Pored toga, nukleinske kiseline su polimeri nukleotida. Dakle, nukleinske kiseline i polinukleotidi kako se ovde koriste su zamenljivi. Stručnjak u ovoj oblasti ima opšte znanje da su nukleinske kiseline polinukleotidi, koji se mogu hidrolizovati u monomerne "nukleotide". Monomerni nukleotidi mogu biti hidrolizovani u nukleozide. Kao što se ovde koristi, polinukleotidi uključuju, ali nisu ograničeni na, sve sekvence nukleinskih kiselina koje se dobijaju na bilo koji način dostupan u struci, uključujući, bez ograničenja, rekombinantne načine, tj. kloniranje sekvenci nukleinskih kiselina iz rekombinantne biblioteke ili ćelijskog genoma, upotrebom obične tehnologije kloniranja i PCR<™>, i slično, i sintetičkim sredstvima. Termin "polinukleotid" kako se ovde koristi treba široko tumačiti i uključuje DNK i RNK, uključujući modifikovanu DNK i RNK.
[0076] U ovom otkriću, termin "RNK" se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji uključuje ostatke ribonukleotida. U poželjnim primerima izvođenja, RNK sadrži sve ili većinu ribonukleotidnih ostataka. Kako se ovde koristi, "ribonukleotid" se odnosi na nukleotid sa hidroksilnom grupom na 2'-poziciji β-D-ribofuranozil grupe. RNK obuhvata bez ograničenja, dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK kao što je delimično prečišćena RNK, suštinski čista RNK, sintetička RNK, rekombinantno proizvedena RNK, kao i modifikovanu RNK koja se razlikuje od RNK koja se javlja u prirodi adicijom, delecijom, supstitucijom i/ili promenom jednog ili više nukleotida. Takve promene se mogu odnositi na adiciju nenukleotidnog materijala unutrašnjim nukleotidima RNK ili kraju(krajevima) RNK. Ovde se takođe razmatra da nukleotidi u RNK mogu biti nestandardni nukleotidi, kao što su hemijski sintetisani nukleotidi ili deoksinukleotidi. Za sadašnje otkriće, ove izmenjene RNK se smatraju analozima RNK koja se javlja u prirodi.
[0077] U određenim primerima izvođenja ovog otkrića, RNK je informaciona RNK (iRNK) koja se odnosi na RNK transkript koji kodira peptid ili protein. Kao što je utvrđeno u tehnici, iRNK generalno sadrži 5' netranslatirani region (5'-UTR), region koji kodira peptid i 3' netranslirani region (3'-UTR). U nekim primerima izvođenja, RNK se proizvodi pomoću in vitro transkripcije ili hemijske sinteze. U jednom primeru izvođenja, iRNK se proizvodi pomoću in vitro transkripcije upotrebom DNK šablona gde se DNK odnosi na nukleinsku kiselinu koja sadrži deoksiribonukleotide.
[0078] U jednom primeru izvođenja, RNK je in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK) i može se dobiti pomoću in vitro transkripcije odgovarajućeg DNK šablona. Promotor za kontrolu transkripcije može biti bilo koji promotor za bilo koju RNK polimerazu. DNK šablon za in vitro transkripciju se može dobiti kloniranjem nukleinske kiseline, posebno cDNK, i njenim uvođenjem u odgovarajući vektor za in vitro transkripciju. cDNK se može dobiti reverznom transkripcijom RNK.
[0079] U jednom primeru izvođenja, RNK može imati modifikovane ribonukleotide. Primeri modifikovanih ribonukleotida uključuju, bez ograničenja, 5-metilcitidin, pseudouridin i/ili 1-metil-pseudouridin.
[0080] U nekim primerima izvođenja, RNK prema ovom pronalasku sadrži 5'-kapu. U jednom primeru izvođenja, RNK prema ovom pronalasku nema neograničene 5'-trifosfate. U jednom primeru izvođenja, RNK može biti modifikovana analogom 5'-kapa. Termin "5'-kapa" se odnosi na strukturu koja se nalazi na 5'-kraju molekula iRNK i generalno se sastoji od guanozin nukleotida povezanog sa iRNK preko 5' do 5' trifosfatne veze. U jednom primeru izvođenja, ovaj guanozin je metilovan na poziciji 7. Obezbeđivanje RNK sa 5'-kapom ili analogom 5'-kape može se postići pomoću in vitro transkripcije, u kojoj se 5'-kapa ko-transkripciono eksprimira u RNK lanac, ili može biti vezana za RNK post-transkripciono upotrebom enzima za postavljanje kape.
[0081] U nekim primerima izvođenja, RNK prema ovom pronalasku sadrži 5'-UTR i/ili 3'-UTR. Termin "netranslirani region" ili "UTR" odnosi se na region u molekulu DNK koji je transkribovan, ali nije translatiran u aminokiselinsku sekvencu, ili na odgovarajući region u molekulu RNK, kao što je molekul iRNK. Netranslatirani region (UTR) može biti prisutan 5' (ushodno) od otvorenog okvira čitanja (5'-UTR) i/ili 3' (nishodno) od otvorenog okvira čitanja (3'-UTR). 5'-UTR, ako je prisutan, nalazi se na 5' kraju, ushodno od početnog kodona regiona koji kodira protein. 5'-UTR je nishodno od 5'-kapa (ako postoji), npr. direktno pored 5'-kapa.
3'-UTR, ako je prisutan, nalazi se na 3' kraju, nishodno od terminacionog kodona regiona koji kodira protein, ali termin "3'-UTR" poželjno ne uključuje poli(A) rep. Dakle, 3'-UTR je ushodno od poli(A) sekvence (ako je prisutna), npr. direktno pored poli(A) sekvence.
[0082] U nekim primerima izvođenja, RNK prema ovom pronalasku sadrži 3'-poli(A) sekvencu. Termin "poli(A) sekvenca" odnosi se na sekvencu adenil (A) ostataka koja se tipično nalazi na 3'-kraju molekula RNK. Prema otkriću, u jednom aspektu, poli(A) sekvenca sadrži najmanje oko 20, najmanje oko 40, najmanje oko 80, ili najmanje oko 100, i do oko 500, do oko 400, do oko 300, do oko 200, ili do oko 150 A nukleotida, a posebno oko 120 A nukleotida.
[0083] „Kodiranje“ se odnosi na inherentno svojstvo specifičnih sekvenci nukleotida u polinukleotidu, kao što je gen, cDNK ili iRNK, da služe kao šabloni za sintezu drugih polimera i makromolekula u biološkim procesima koji imaju ili definisanu sekvencu nukleotida (tj. rRNK, tRNK i iRNK) ili definisanu aminokiselinsku sekvencu i biološka svojstva koja iz toga proizilaze. Dakle, gen kodira protein ako transkripcija i translacija iRNK koja odgovara tom genu proizvodi protein u ćeliji ili drugom biološkom sistemu. Oba, kodirajući lanac, čija je nukleotidna sekvenca identična iRNK sekvenci i obično je navedena u listi sekvenci, i nekodirajući lanac, koji se koristi kao šablon za transkripciju gena ili cDNK, mogu se označiti tako da kodiraju protein ili drugi proizvod tog gena ili cDNK.
[0084] Kako se ovde koristi, "endogeni" se odnosi na bilo koji materijal iz ili proizveden unutar organizma, ćelije, tkiva ili sistema.
[0085] Kako se ovde koristi, termin "egzogeni" se odnosi na bilo koji materijal unet iz ili proizveden izvan organizma, ćelije, tkiva ili sistema.
[0086] Termin "ekspresija" kako se ovde koristi je definisan kao transkripcija i/ili translacija određene nukleotidne sekvence.
[0087] "Ekspresioni vektor" se odnosi na vektor koji sadrži rekombinantni polinukleotid koji sadrži sekvence za kontrolu ekspresije koje su operativno povezane sa nukleotidnom sekvencom koja se eksprimira. Ekspresioni vektor sadrži dovoljno cis-delujućih elemenata za ekspresiju; druge elemente za ekspresiju može obezbediti ćelija domaćin ili u in vitro ekspresionom sistemu. Ekspresioni vektori obuhvataju sve one poznate u tehnici, kao što su kozmidi, plazmidi (npr. goli ili sadržani u lipozomima) i virusi (npr. lentivirusi, retrovirusi, adenovirusi i adeno-asocirani virusi) koji uključuju rekombinantni polinukleotid.
[0088] "Homologno" se odnosi na sličnost sekvence ili identičnost sekvence između dva polipeptida ili između dva molekula nukleinske kiseline. Kada poziciju u obe dve upoređene sekvence zauzima ista baza ili aminokiselinska monomerna podjedinica, na primer, ako poziciju u svakom od dva molekula DNK zauzima adenin, onda su molekuli homologni na toj poziciji. Procenat homologije između dve sekvence je funkcija broja podudarnih ili homolognih pozicija koje dele dve sekvence podeljen sa brojem upoređenih pozicija X 100. Na primer, ako je 6 od 10 pozicija u dve sekvence podudarno ili homologno tada su dve sekvence 60% homologne. Generalno, poređenje se pravi kada su dve sekvence poravnate da bi se dobila maksimalna homologija. Homologne sekvence pokazuju prema pronalasku najmanje 40%, posebno najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% i poželjno najmanje 95%, najmanje 98 ili na najmanje 99% identičnosti aminokiselinskih ili nukleotidnih ostataka.
[0089] "Fragment", u odnosu na aminokiselinsku sekvencu (peptid ili protein), odnosi se na deo aminokiselinske sekvence, tj. sekvencu koja predstavlja aminokiselinsku sekvencu skraćenu na N-kraju i/ili C-kraju. Fragment skraćen na C-kraju (N-terminalni fragment) se može dobiti npr. translacijom skraćenog otvorenog okvira za čitanje kome nedostaje 3'-kraj otvorenog okvira čitanja. Fragment skraćen na N-kraju (C-terminalni fragment) se može dobiti npr. translacijom skraćenog otvorenog okvira za čitanje kome nedostaje 5'-kraj otvorenog okvira čitanja, sve dok skraćeni otvoreni okvir čitanja sadrži početni kodon koji služi za iniciranje translacije. Fragment aminokiselinske sekvence sadrži npr. najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% aminokiselinskih ostataka iz aminokiselinske sekvence. Fragment aminokiselinske sekvence poželjno sadrži najmanje 6, posebno najmanje 8, najmanje 12, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 50 ili najmanje 100 uzastopnih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence.
[0090] Pod "varijantom" ili "varijantnim proteinom" ili "varijantnim polipeptidom" ovde se podrazumeva protein koji se razlikuje od roditeljskog proteina na osnovu najmanje jedne aminokiselinske modifikacije. Roditeljski polipeptid može biti prirodni polipeptid ili polipeptid divljeg tipa (WT), ili može biti modifikovana verzija polipeptida divljeg tipa. Poželjno, varijantni polipeptid ima najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju u poređenju sa roditeljskim polipeptidom, npr. od 1 do oko 20 aminokiselinskih modifikacija, a poželjno od 1 do oko 10 ili od 1 do oko 5 aminokiselinskih modifikacija u poređenju sa roditeljskim.
[0091] Pod "roditeljskim polipeptidom", "roditeljskim proteinom", "prekursorskim polipeptidom" ili "prekursorskim proteinom", kako se ovde koriste, podrazumeva se nemodifikovani polipeptid koji je naknadno modifikovan da bi se stvorila varijanta. Roditeljski polipeptid može biti polipeptid divljeg tipa, ili varijanta ili konstruisana verzija polipeptida divljeg tipa.
[0092] Pod "divljim tipom" ili "WT" ili "nativnim" ovde se podrazumeva aminokiselinska sekvenca koja se nalazi u prirodi, uključujući alelne varijacije. Protein ili polipeptid divljeg tipa ima aminokiselinsku sekvencu koja nije namerno modifikovana.
[0093] Za potrebe ovog otkrića, "varijante" aminokiselinske sekvence (peptida, proteina ili polipeptida) sadrže aminokiselinske insercione varijante, aminokiselinske adicione varijante, aminokiselinske delecione varijante i/ili aminokiselinske supstitucione varijante. Termin "varijanta" uključuje sve mutante, splajs varijante, posttranslaciono modifikovane varijante, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrsta i homologe vrsta, posebno one koji se javljaju u prirodi.
[0094] Aminokiselinske insercione varijante obuhvataju insercije pojedinačnih ili dve ili više aminokiselina u određenu aminokiselinsku sekvencu. U slučaju da varijante aminokiselinske sekvence imaju inserciju, jedan ili više aminokiselinskih ostataka su inserirani na određeno mesto u aminokiselinskoj sekvenci, mada je moguća i slučajna insercija sa odgovarajućim skriningom dobijenog proizvoda. Aminokiselinske adicione varijante sadrže amino i/ili karboksi-terminalne fuzije jedne ili više aminokiselina, kao što su 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više aminokiselina. Aminokiselinske delecione varijante su karakterisane uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence, kao što je uklanjanje 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ili više aminokiselina. Delecije mogu biti u bilo kom položaju proteina. Aminokiselinske delecione varijante koje sadrže deleciju na N-terminalnom i/ili C-terminalnom kraju proteina su takođe označene kao varijante sa N-terminalnim i/ili C-terminalnim skraćenjem. Aminokiselinske supstitucione varijante su karakterisane najmanje jednim ostatkom u sekvenci koji je uklonjen i drugim ostatkom koji je inseriran na njegovo mesto. Prednost je data modifikacijama koje su na položajima u aminokiselinskoj sekvenci koji nisu konzervirani između homolognih proteina ili peptida i/ili zamenama aminokiselina sa drugim koje imaju slična svojstva. Poželjno, aminokiselinske promene u varijantama peptida i proteina su konzervativne aminokiselinske promene, tj., supstitucije slično naelektrisanih ili nenaelektrisanih aminokiselina. Konzervativna promena aminokiselina podrazumeva supstituciju jedne od familije aminokiselina koje su povezane u njihovim bočnim lancima. Prirodne aminokiseline su generalno podeljene u četiri familije: kisele (aspartat, glutamat), bazne (lizin, arginin, histidin), nepolarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan) i nenaelektrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin) aminokiseline. Fenilalanin, triptofan i tirozin su ponekad zajednički klasifikovane kao aromatične aminokiseline. U jednom primeru izvođenja, konzervativne supstitucije aminokiselina uključuju supstitucije u okviru sledećih grupa:
glicin, alanin;
valin, izoleucin, leucin;
asparaginska kiselina, glutaminska kiselina;
asparagin, glutamin;
serin, treonin;
lizin, arginin; i
fenilalanin, tirozin.
[0095] Poželjno, stepen sličnosti, poželjno identičnost između date aminokiselinske sekvence i aminokiselinske sekvence koja je varijanta pomenute date aminokiselinske sekvence će biti najmanje oko 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99%. Stepen sličnosti ili identičnosti je dat poželjno za izvestan aminokiselinski region koji je najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90% ili oko 100% od ukupne dužine referentne aminokiselinske sekvence. Na primer, ako se referentna aminokiselinska sekvenca sastoji od 200 aminokiselina, stepen sličnosti ili identičnosti je dat poželjno za najmanje oko 20, najmanje oko 40, najmanje oko 60, najmanje oko 80, najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 180, ili oko 200 aminokiselina, poželjno kontinuiranih aminokiselina. U poželjnim primerima izvođenja, stepen sličnosti ili identičnosti je dat za celokupnu dužinu referentne aminokiselinske sekvence. Poravnanje za određivanje sličnosti sekvenci, poželjno identičnost sekvenci može se izvršiti pomoću poznatih alata, poželjno koristeći najbolje poravnanje sekvenci, na primer, korišćenjem Align, koristeći standardne postavke, poželjno EMBOSS:: needle, Matriks: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.
[0096] "Sličnost sekvence" označava procenat aminokiselina koje su ili identične ili koje predstavljaju konzervativne supstitucije aminokiselina. "Identičnost sekvence" između dve aminokiselinske sekvence označava procenat aminokiselina koje su identične između sekvenci.
[0097] Termin "procenat identičnosti" je određen da označi procenat aminokiselinskih ostataka koji su identični između dve sekvence koje treba da se uporede, dobijene posle najboljeg poravnanja, ovaj procenat je čisto statistički i razlike između dve sekvence se distribuiraju slučajno i preko njihove celokupne dužine. Poređenja sekvenci između dve aminokiselinske sekvence se konvencionalno izvode upoređivanjem ovih sekvenci nakon što su ih optimalno poravnale, pri čemu se pomenuto poređenje sprovodi po segmentima ili "prozorima poređenja" kako bi se identifikovale i uporedile lokalne oblasti sličnosti sekvenci. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može biti proizvedeno, osim ručno, pomoću algoritma lokalne homologije od Smitha i Watermana, 1981, Ads App. Math. 2, 482, pomoću algoritma lokalne homologije od Neddlemana i Wunscha, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, metodom pretraživanja sličnosti od Pearson i Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili pomoću kompjuterskih programa koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics Softvare Package. Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis).
[0098] Procenat identičnosti se izračunava određivanjem broja identičnih položaja između dve sekvence koje se porede, deljenjem ovog broja sa brojem upoređenih položaja i množenjem dobijenog rezultata sa 100, tako da se dobije procenat identičnosti između ove dve sekvence.
[0099] Termin "funkcionalna varijanta", kako se ovde koristi, odnosi se na varijantni molekul ili sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je izmenjena sa jednom ili više aminokiselina u poređenju sa sekvencom aminokiselina roditeljskog molekula ili sekvence i koja je još uvek sposobna ispunjavanje jedne ili više funkcija roditeljskog molekula ili sekvence, npr. vezivanje za ciljni molekul ili doprinos vezivanju za ciljni molekul. U jednom primeru izvođenja, funkcionalna varijanta ili sama ili u kombinaciji sa drugim elementima je u kompeticiji za vezivanje za ciljni molekul sa roditeljskim molekulom ili sekvencom. Drugim rečima, modifikacije u aminokiselinskoj sekvenci roditeljskog molekula ili sekvenci ne utiču značajno ili menjaju karakteristike vezivanja molekula ili sekvence. U različitim primerima izvođenja, vezivanje funkcionalne varijante može biti smanjeno, ali i dalje značajno prisutno, npr. vezivanje funkcionalne varijante može biti najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% roditeljskog molekula ili sekvence. Međutim, u drugim primerima izvođenja, vezivanje funkcionalne varijante može biti poboljšano u poređenju sa roditeljskim molekulom ili sekvencom.
[0100] Aminokiselinska sekvenca (peptid, protein ili polipeptid) "poreklom od" označene aminokiselinske sekvence (peptida, proteina ili polipeptida) odnosi se na poreklo prve sekvence aminokiselina. Poželjno, aminokiselinska sekvenca koja je poreklom od određene aminokiselinske sekvence ima aminokiselinsku sekvencu koja je identična, suštinski identična ili homologna toj određenoj sekvenci ili njenom fragmentu. Aminokiselinske sekvence poreklom od određene sekvence aminokiselina mogu biti varijante te određene sekvence ili njen fragment.
[0101] Kako se ovde koristi, "materijal sa uputstvima" ili "uputstva" uključuju publikaciju, snimak, dijagram ili bilo koji drugi medij izražavanja koji se može koristiti za saopštavanje korisnosti kompozicija i postupka otkrića. Materijal sa uputstvima kompleta otkrića može, na primer, biti pričvršćen za kontejner koji sadrži kompozicije iz otkrića ili se isporučuje zajedno sa kontejnerom koji sadrži kompozicije. Alternativno, materijal sa uputstvima može biti isporučen odvojeno od kontejnera sa namerom da se materijal sa uputstvima i kompozicije koriste zajedno od strane primaoca.
[0102] „Izolovan“ znači izmenjen ili uklonjen iz prirodnog stanja. Na primer, nukleinska kiselina ili peptid koji je prirodno prisutan u živoj životinji nije „izolovan“, ali je ista nukleinska kiselina ili peptid delimično ili potpuno odvojen od koegzistirajućih materijala svog prirodnog stanja „izolovan“. Izolovana nukleinska kiselina ili protein mogu postojati u suštinski prečišćenom obliku, ili mogu postojati u ne-nativnom okruženju kao što je, na primer, ćelija domaćina.
[0103] U kontekstu ovog otkrića, korišćene su sledeće skraćenice za uobičajene baze nukleinskih kiselina. "A" se odnosi na adenozin, "C" se odnosi na citozin, "G" se odnosi na guanozin, "T" se odnosi na timidin i "U" se odnosi na uridin.
[0104] "Lentivirus" kako se ovde koristi odnosi se na rod porodice Retroviridae. Lentivirusi su jedinstveni među retrovirusima po tome što su u stanju da inficiraju ćelije koje se ne dele; mogu da isporuče značajnu količinu genetskih informacija u DNK ćelije domaćina, tako da su jedna od najefikasnijih metoda vektora za isporuku gena. HIV, SIV i FIV su svi primeri lentivirusa. Vektori poreklom iz lentivirusa nude sredstva za postizanje značajnih nivoa transfera gena in vivo.
[0105] Termin "operabilno povezan" odnosi se na funkcionalnu vezu između regulatorne sekvence i heterologne sekvence nukleinske kiseline koja rezultira ekspresijom ove poslednje. Na primer, prva sekvenca nukleinske kiseline je operativno povezana sa drugom sekvencom nukleinske kiseline kada je prva sekvenca nukleinske kiseline postavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, promotor je operativno vezan za kodirajuću sekvencu ako promotor utiče na transkripciju ili ekspresiju kodirajuće sekvence. Generalno, operativno povezane DNK sekvence su susedne i, gde je potrebno da se spoje dva regiona kodiranja proteina, u istom okviru čitanja.
[0106] Termin "prekomerno eksprimiran" tumorski antigen ili "prekomerna ekspresija" tumorskog antigena ima za cilj da ukaže na abnormalni nivo ekspresije tumorskog antigena u ćeliji iz područja bolesti kao što je solidni tumor unutar specifičnog tkiva ili organa pacijenta u odnosu na nivo ekspresije u normalnoj ćeliji iz tog tkiva ili organa.
[0107] Termin "promotor" kako se ovde koristi je definisan kao DNK sekvenca koju prepoznaje sintetička mašina ćelije, ili uvedena sintetička mašina, potrebna za iniciranje specifične transkripcije polinukleotidne sekvence.
[0108] Kako se ovde koristi, termin "promotor/regulatorna sekvenca" označava sekvencu nukleinske kiseline koja je potrebna za ekspresiju genskog proizvoda koji je operativno povezan sa promotorom/regulatornom sekvencom. U nekim slučajevima, ova sekvenca može biti sekvenca promotora jezgra, au drugim slučajevima, ova sekvenca može takođe uključiti sekvencu pojačivača i druge regulatorne elemente koji su potrebni za ekspresiju genskog proizvoda. Promotor/regulatorna sekvenca može, na primer, biti ona koja eksprimira genski proizvod na tkivno specifičan način.
[0109] "Konstitutivni" promotor je nukleotidna sekvenca koja, kada je operativno povezana sa polinukleotidom koji kodira ili specificira proizvod gena, uzrokuje da se genski proizvod proizvodi u ćeliji pod većinom ili svim fiziološkim uslovima ćelije.
[0110] "Inducibilni" promotor je nukleotidna sekvenca koja, kada je operativno povezana sa polinukleotidom koji kodira ili specificira genski proizvod, uzrokuje da se genski proizvod proizvodi u ćeliji u suštini samo kada je induktor koji odgovara promotoru prisutan u ćeliji.
[0111] Promotor "specifičan za tkivo" je nukleotidna sekvenca koja, kada je operativno povezana sa polinukleotidom koji kodira ili specificira genom, uzrokuje da se genski proizvod proizvodi u ćeliji u suštini samo ako je ćelija ćelija tipa tkiva koji odgovara promotoru.
[0112] Pod pojmom "specifično se vezuje", kako se ovde koristi, podrazumeva se molekul kao što je antitelo ili CAR koji prepoznaje specifičan antigen, ali suštinski ne prepoznaje ili ne vezuje druge molekule u uzorku ili kod subjekta. Na primer, antitelo koje se specifično vezuje za antigen jedne vrste može se takođe vezati za taj antigen jedne ili više drugih vrsta. Ali, takva reaktivnost među vrstama sama po sebi ne menja klasifikaciju antitela kao specifičnog. U drugom primeru, antitelo koje se specifično vezuje za antigen takođe može da se veže za različite alelne oblike antigena. Međutim, takva unakrsna reaktivnost sama po sebi ne menja klasifikaciju antitela kao specifičnog. U nekim slučajevima, termini "specifična veza" ili "specifično vezivanje" mogu se koristiti u vezi sa interakcijom antitela, proteina ili peptida sa drugom hemijskom vrstom, što znači da interakcija zavisi od prisustva određene strukture (npr. antigenske determinante ili epitopa) na hemijskoj vrsti; na primer, antitelo prepoznaje i vezuje se za specifičnu strukturu proteina, a ne za proteine uopšte. Ako je antitelo specifično za epitop „A“, prisustvo molekula koji sadrži epitop A (ili slobodnog, neobeleženog A), u reakciji koja sadrži obeleženo „A“ i antitelo, smanjiće količinu obeleženog A vezanog za antitelo. Termin "transfektovan" ili "transformisan" ili "transdukovan" kako se ovde koristi odnosi se na proces kojim se egzogena nukleinska kiselina prenosi ili uvodi u ćeliju domaćina. "Transfektovana" ili "transformisana" ili "transdukovana" ćelija je ona koja je transfektovana, transformisana ili transdukovana egzogenom nukleinskom kiselinom. Ćelija uključuje primarnu ćeliju subjekta i njeno potomstvo.
[0113] Termin "pod kontrolom transkripcije" ili "operativno povezan" kako se ovde koristi znači da je promotor na ispravnoj lokaciji i orijentaciji u odnosu na polinukleotid da kontroliše inicijaciju transkripcije pomoću RNK polimeraze i ekspresiju polinukleotida.
[0114] "Vektor" je kompozicija materije koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu i koja se može koristiti za isporuku izolovane nukleinske kiseline u unutrašnjost ćelije. Brojni vektori su poznati u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja, linearne polinukleotide, polinukleotide povezane sa jonskim ili amfifilnim jedinjenjima, plazmide i viruse. Dakle, termin "vektor" uključuje plazmid koji se autonomno replicira ili virus. Termin takođe treba da se tumači tako da uključuje ne-plazmidna i nevirusna jedinjenja koja olakšavaju transfer nukleinske kiseline u ćelije, kao što su, na primer, polilizinska jedinjenja, lipozomi i slično. Primeri virusnih vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, adenovirusne vektore, adeno-povezane virusne vektore, retrovirusne vektore i slično.
Tehnički detalji
[0115] Ovo otkriće obezbeđuje kompozicije i postupke za lečenje kancera između ostalih bolesti. Kancer može biti solidni tumor, primarni ili metastazirajući tumor. U jednom primeru izvođenja, kancer je kancer koji eksprimuje CLDN6. U jednom primeru izvođenja, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera jajnika, posebno adenokarcinoma jajnika i teratokarcinoma jajnika, kancera pluća, uključujući sitnoćelijski kancer pluća (SCLC) i nesitnoćelijskih kancer pluća (NSCLC), posebno karcinom skvamoznih ćelija pluća i adenokarcinom, kancera želuca, kancera dojke, kancera jetre, kancera pankreasa, kancera kože, posebno karcinoma bazalnih ćelija i karcinoma skvamoznih ćelija, malignog melanoma, kancera glave i vrata, posebno malignog pleomorfnog adenoma, sarkoma, posebno sinovijalnog sarkoma i karcinosarkoma, kancera žučnih kanala, kancera mokraćne bešike, posebno karcinoma prelaznih ćelija i papilarnog karcinoma, kancera bubrega, posebno karcinoma bubrežnih ćelija uključujući karcinom svetlih bubrežnih ćelija i papilarnog karcinoma bubrežnih ćelija, kancera debelog creva, kancera tankog creva, uključujući kancer ileuma, posebno adenokarcinom tankog creva i adenokarcinom ileuma, testikularnog embrionalnog karcinoma, placentalnog horiokarcnoma, cervikalnog kancera, testikularnog kancera, posebno testikularnog seminoma, testikularnog teratoma i embrionalnog testikularnog kancera, kancera materice, tumora germinativnih ćelija kao što su teratokarcinom ili embrionalni karcinom, posebno tumori germinativnih ćelija testisa i njihovi metastatski oblici. U jednom primeru izvođenja, bolest kancer povezana sa ekspresijom CLDN6 je izabrana iz grupe koja se sastoji od kancera jajnika, kancera pluća, metastatskog kancera jajnika i metastatskog kancera pluća. Poželjno, kancer jajnika je karcinom ili adenokarcinom. Poželjno, kancer pluća je karcinom ili adenokarcinom, a poželjno je bronhiolarni kancer kao što je bronhiolarni karcinom ili bronhiolarni adenokarcinom.
[0116] Ovo otkriće obezbeđuje himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži ekstracelularni i intracelularni domen. Ekstracelularni domen sadrži ciljno-specifičan vezujući element koji se inače naziva grupa ili domen koji vezuje antigen. Intracelularni domen ili na drugi način citoplazmatični domen sadrži 4-1BB kostimulatorni signalni region i deo CD3-zeta lanca. Kostimulacioni signalni region 4-1BB se odnosi na deo CAR koji sadrži intracelularni domen kostimulatornog molekula 4-1BB. Kostimulatorni molekuli su molekuli na površini ćelije koji nisu receptori za antigene ili njihovi ligandi koji su potrebni za efikasan odgovor limfocita na antigen.
[0117] Između ekstracelularnog domena i transmembranskog domena CAR, ili između citoplazmatičnog domena i transmembranskog domena CAR, može biti ugrađen spejser domen ili region. U primerima izvođenja, spejser domen obezbeđuje fleksibilnost domena za vezivanje antigena. Kako se ovde koristi, termin "spejser domen" generalno označava bilo koji oligo- ili polipeptid koji funkcioniše da povezuje transmembranski domen sa, bilo ekstracelularnim domenom ili citoplazmatičnim domenom u polipeptidnom lancu. Spejser domen može da sadrži do 300 aminokiselina, poželjno 10 do 100 aminokiselina i najpoželjnije 25 do 50 aminokiselina. U primerima izvođenja, spejser domen ima oko 10 do 300 aminokiselina, oko 10 do 200 aminokiselina, oko 10 do 175 aminokiselina, oko 10 do 150 aminokiselina, oko 10 do 125 aminokiselina, oko 10 do 100 aminokiselina, 10 do 75 aminokiselina, oko 10 do 50 aminokiselina, oko 10 do 40 aminokiselina, oko 10 do 30 aminokiselina, oko 10 do 20 aminokiselina ili oko 10 do 15 aminokiselina, uključujući bilo koji ceo broj između krajnjih tačaka bilo kog od navedenih opsega. U nekim primerima izvođenja, spejser domen je poreklom iz zglobnog regiona molekula sličnog imunoglobulinu. U primerima izvođenja, spejser domen sadrži ceo ili deo zglobnog regiona od humanog IgG1, humanog IgG2, humanog IgG3 ili humanog IgG4, i može da sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija. U nekim primerima izvođenja, spejser domen je poreklom iz sekvence zglobnog regiona CD8α.
[0118] U jednom primeru izvođenja, otkriće obezbeđuje ćeliju (npr. T ćeliju) konstruisanu da eksprimira CAR, pri čemu CAR-konstruisana ćelija pokazuje antitumorsko svojstvo. CAR prema otkriću kada je eksprimiran u ćeliji je u stanju da preusmeri prepoznavanje antigena na osnovu specifičnosti CAR vezivanja za antigen. U jednom primeru izvođenja, CLDN6 je eksprimiran na ćelijama tipova kancera koji su ovde otkriveni. CAR-konstruisana ćelija kada je vezana za svoj srodni antigen, utiče na tumorsku ćeliju tako da tumorska ćelija ne uspeva da raste, podstiče se da umre, ili je na neki drugi način pogođena tako da se opterećenje tumorom kod pacijenta smanjuje ili eliminiše.
[0119] Prema otkriću, vezujuća grupa CLDN6 antigena je fuzionisan preko zglobnog domena poreklom iz CD8α sa intracelularnim domenima koji sadrže kombinaciju 4-1BB (CD137) signalnog domena i CD3-zeta signalnog domena. Uključivanje 4-1BB (CD137) signalnog domena značajno povećava antitumorsku aktivnost i in vivo postojanost CAR T ćelija u poređenju sa inače identičnim CAR T ćelijama koje nisu konstruisane da eksprimiraju 4-1BB (CD137) (Milone M.C. et al., (2009) Molecular Therapy 17 (8), 1453-1464).
Grupa koja vezuje antigen
[0120] CAR ovog otkrića sadrži ciljno-specifičan vezujući element koji se inače naziva grupa koja se vezuje za antigen ili domen koji se vezuje za antigen koji je generalno deo ekstracelularnog domena CAR. Domen koji se vezuje za antigen prepoznaje ligand koji deluje kao marker ćelijske površine na ciljnim ćelijama povezanim sa određenim bolesnim stanjem. Specifično, CAR ovog otkrića cilja tumorski antigen CLDN6 na tumorskoj ćeliji.
[0121] U jednom primeru izvođenja, CLDN6 vezujući domen u CAR iz otkrića se specifično vezuje za CLDN6. U jednom primeru izvođenja, CLDN6 za koji se vezuje CLDN6 vezujući domen u CAR iz otkrića je eksprimiran u ćeliji kancera. U jednom primeru izvođenja, CLDN6 je eksprimiran na površini ćelije kancera. U jednom primeru izvođenja, CLDN6 vezujući domen se vezuje za ekstracelularni domen ili za epitop u ekstracelularnom domenu CLDN6. U jednom primeru izvođenja, CLDN6 vezujući domen se vezuje za prirodne epitope CLDN6 prisutne na površini živih ćelija. U jednom primeru izvođenja, CLDN6 vezujući domen se vezuje za prvu vanćelijsku petlju CLDN6, poželjno aminokiselinske pozicije 28 do 76 CLDN6, ili drugu vanćelijsku petlju CLDN6, poželjno aminokiselinske pozicije 141 do 159 CLDN6. U određenim primerima izvođenja, CLDN6 vezujući domen se vezuje za epitop na CLDN6 koji nije prisutan na CLDN9. Poželjno, CLDN6 vezujući domen se vezuje za epitop na CLDN6 koji nije prisutan na CLDN4 i/ili CLDN3. Najpoželjnije, CLDN6 vezujući domen se vezuje za epitop na CLDN6 koji nije prisutan na CLDN proteinu osim CLDN6. CLDN6 vezujući domen poželjno se vezuje za CLDN6, ali ne i za CLDN9 i poželjno se ne vezuje za CLDN4 i/ili CLDN3. Poželjno, CLDN6 vezujući domen je specifičan za CLDN6. Poželjno, CLDN6 vezujući domen se vezuje za CLDN6 eksprimiran na površini ćelije.
[0122] U jednom primeru izvođenja otkrića, domen koji se vezuje za antigen CLDN6 sadrži varijabilni region teškog lanca imunoglobulina (VH) sa specifičnošću za CLDN6 i varijabilni region lakog lanca imunoglobulina (VL) sa specifičnošću za CLDN6. U jednom primeru izvođenja, pomenuti varijabilni region teškog lanca (VH) i odgovarajući varijabilni region lakog lanca (VL) su povezani preko peptidnog linkera, poželjno peptidnog linkera koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (GGGGS)3.
[0123] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 5, 7 i 9 ili njihove funkcionalne varijante.
[0124] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 23 i 24 ili njihove funkcionalne varijante.
[0125] U jednom primeru izvođenja, vezujuća domen za CLDN6 sadrži:
(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: x ili njenu funkcionalnu varijantu, i
(ii) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: x+1 ili njenu funkcionalnu varijantu;
pri čemu je x izabran od 3, 5, 7 i 9.
[0126] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži:
(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 5, 7 i 9 ili njihove funkcionalne varijante, i (ii) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 23 i 24 ili njihove funkcionalne varijante.
[0127] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži:
(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 ili njenu funkcionalnu varijantu, i
(ii) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili njenu funkcionalnu varijantu.
[0128] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži:
(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 ili njenu funkcionalnu varijantu, i
(ii) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 ili njenu funkcionalnu varijantu.
[0129] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži:
(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 ili njenu funkcionalnu varijantu, i
(ii) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24 ili njenu funkcionalnu varijantu.
[0130] U određenim poželjnim primerima izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranih od sledećih mogućnosti (i) do (xi):
(i) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 3 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalne varijante i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 4 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalne varijante,
(ii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu SEQ ID NO: 5 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalne varijante i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 6 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalne varijante,
(iii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 7 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalne varijante i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 8 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalne varijante,
(iv) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 9 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalne varijante i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 10 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalne varijante,
(v) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 5 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalne varijante i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 4 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalne varijante,
(vi) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 5 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalne varijante i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 23 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalne varijante,
(vii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 5 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalne varijante i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 24 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalnu varijantu.
[0131] U posebno poželjnom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži sledeću kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL): VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 5 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalne varijante i VL sadrži sekvencu aminokiselina predstavljenu sa SEQ ID NO: 24 ili njenom funkcionalnom varijantom, ili fragment aminokiselinske sekvence ili funkcionalnu varijantu.
[0132] Termin "fragment" se odnosi, naročito, na jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDR), poželjno najmanje na varijabilni region CDR3, varijabilni region teškog lanca (VH) i/ili varijabilni region lakog lanca (VL). U jednom primeru izvođenja je pomenuto da je jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDR regiona) izabrano iz grupe regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3. U posebno poželjnom primeru izvođenja, termin "fragment" se odnosi na regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL).
[0133] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 koji sadrži jedan ili više CDR regiona, grupu CDR regiona ili kombinaciju grupa CDR regiona, kao što su ovde opisani, sadrži pomenute CDR regione zajedno sa njihovim ubačenim okvirnim regionima. Poželjno, deo će takođe uključiti najmanje oko 50% bilo jednog ili oba od prvog i četvrtog okvirnog regiona, 50% koji je 50% C-terminalni od prvog okvirnog regiona i 50% N-terminalni od četvrtog okvirnog regiona. Konstrukcija vezujućih domena napravljenih tehnikama rekombinantne DNK može rezultirati uvođenjem ostataka N- ili C-terminusa u varijabilne regione kodirane od strane linkera uvedenim da olakšaju kloniranje ili druge korake manipulacije, uključujući uvođenje linkera za vezivanje varijabilnih regiona ili vezivanje varijabilnih regiona za dalje proteinske sekvence uključujući sekvence kao što su ovde opisane.
[0134] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen koji sadrži jedan ili više CDR regiona, grupu CDR regiona ili kombinaciju grupa CDR regiona, kao što su ovde opisani, sadrži pomenute CDR regione u okviru humanog antitela.
[0135] U jednom primeru izvođenja vezujući domen za CLDN6 sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) opisane ovde, npr. varijabilni region lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 5, 7 i 9 ili njene funkcionalne varijante.
[0136] U jednom primeru izvođenja vezujući domen za CLDN6 sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL) opisane ovde, npr. varijabilni region lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 23 i 24 ili njihove funkcionalne varijante.
[0137] U jednom primeru izvođenja vezujući domen za CLDN6 sadrži:
(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) kombinacije varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) opisanih ovde, npr. kombinacije u kojoj VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 5 ili njenom funkcionalnom varijantom i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljena sa SEQ ID NO: 6 ili njenom funkcionalnom varijantom, i (ii) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL) kombinacije varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) opisanih ovde.
[0138] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži:
(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) od SEQ ID NO: x, ili njene funkcionalne varijante, i
(ii) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL) od SEQ ID NO: x+1, ili njene funkcionalne varijante;
pri čemu je x izabran od 3, 5, 7 i 9.
[0139] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži:
(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) od SEQ ID NO: 5, ili njene funkcionalne varijante, i
(ii) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL) od SEQ ID NO: 6, ili njene funkcionalne varijante.
[0140] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži:
(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) od SEQ ID NO: 5, ili njene funkcionalne varijante, i
(ii) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL) od SEQ ID NO: 4, ili njene funkcionalne varijante.
[0141] Termin "najmanje jedna, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence" poželjno se odnosi na najmanje CDR3 sekvencu, izborno u kombinaciji sa CDR1 sekvencom i/ili CDR2 sekvencom.
[0142] CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 5, 7 i 9 poželjno uključuje aminokiseline 26 do 33 sekvenci prikazanih u SEQ ID NOs: 3, 5, 7 i 9, respektivno. CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 5, 7 i 9 poželjno uključuje aminokiseline 51 do 58 sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 3, 5, 7 i 9, respektivno. CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 5, 7 i 9 poželjno uključuje aminokiseline 97 do 106 sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 3, 5, 7 i 9, respektivno.
[0143] CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 23 i 24 poželjno uključuje aminokiseline 27 do 31 sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 23 i 24, respektivno. CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 23 i 24 poželjno uključuje aminokiseline 49 do 51 od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 23 i 24, respektivno. CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 23 i 24 poželjno uključuje aminokiseline 88 do 97 sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 4, 6 , 8, 10, 23 i 24, respektivno.
[0144] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR3 sekvencu Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, pri čemu Xaa1 je bilo koja aminokiselina, poželjno aromatična aminokiselina, poželjnije Phe ili Tyr, najpoželjnije Tyr, Xaa2 je bilo koja aminokiselina, poželjno aromatična aminokiselina, poželjnije Phe ili Tyr, najpoželjnije Tyr i Xaa3 je bilo koja aminokiselina, poželjno Leu ili Phe, poželjnije Leu. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR3 sekvencu Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 ili Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, pri čemu su Xaa1, Xaa2 i Xaa3 kao što su gore definisani. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR3 sekvencu Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, pri čemu su Xaa1, Xaa2 i Xaa3 kao što su gore definisani. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR3 sekvencu Ala Arg Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp Tyr, pri čemu su Xaa1, Xaa2 i Xaa3 kao što su gore definisani. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 prema prethodnim primerima izvođenja sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR1 sekvencu prema SEQ ID NO: 16 ili njenu funkcionalnu varijantu i/ili CDR2 sekvencu prema SEQ ID NO: 17 ili njenu funkcionalnu varijantu.
[0145] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR3 sekvencu Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro, gde je Xaa1 bilo koja aminokiselina, poželjno Ser ili Asn, najpoželjnije Ser, Xaa2 je bilo koja aminokiselina, poželjno Tyr, Ser, Ile, Asn ili Thr, poželjnije Tyr, Ser ili Asn, najpoželjnije Asn, i Xaa3 je bilo koja aminokiselina, poželjno Ser ili Tyr, poželjnije Tyr. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR3 sekvencu Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro, gde su Xaa1, Xaa2 i Xaa3 kao što su gore definisani. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR3 sekvencu Gln Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro Trp Thr, pri čemu su Xaa1, Xaa2 i Xaa3 kao što su gore definisani. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 prema prethodnim primerima izvođenja sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR1 sekvencu prema SEQ ID NO: 21 ili njenu funkcionalnu varijantu i/ili CDR2 sekvencu prema SEQ ID NO : 22 ili njenu funkcionalnu varijantu.
[0146] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 sadrži:
(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR3 sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp i Ala Arg Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp Tyr, gde je Xaa1 bilo koja aminokiselina, poželjno aromatična aminokiselina, poželjnije Phe ili Tyr, najpoželjnije Tyr, Xaa2 je bilo koja aminokiselina, poželjno aromatična aminokiselina, poželjnije Phe ili Tyr, najpoželjnije Tyr, i Xaa3 je bilo koja aminokiselina, poželjno Leu ili Phe, poželjnije Leu, i
(ii) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR3 sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro, Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro, Gln Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro Trp Thr, gde je Xaa1 aminokiselina, poželjno Ser ili Asn, najpoželjnije Ser, Xaa2 je bilo koja aminokiselina, poželjno Tyr, Ser, Ile, Asn ili Thr, poželjnije Tyr, Ser ili Asn, najpoželjnije Asn i Xaa3 je bilo koja aminokiselina, poželjno Ser ili Tyr, poželjnije Tyr.
[0147] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 prema prethodnim primerima izvođenja sadrži (i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR1 sekvencu prema SEQ ID NO: 16 ili njenu funkcionalnu varijantu i/ili CDR2 sekvencu prema SEQ ID NO: 17 ili njenu funkcionalnu varijantu i/ili (ii) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR1 sekvencu prema SEQ ID NO: 21 ili njenu funkcionalnu varijantu i/ili CDR2 sekvencu prema SEQ ID NO: 22 ili njenu funkcionalnu varijantu.
[0148] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 je u kompeticiji za vezivanje CLDN6 sa vezujućim domenom za CLDN6 opisanog gore i/ili ima specifičnost za CLDN6 vezujućeg domena za CLDN6 opisanog gore. U ovom i drugom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 može biti visoko homologan vezujućem domenu za CLDN6 opisanog gore. Smatra se da poželjni vezujući domen za CLDN6 ima CDR regione ili identične ili visoko homologne sa CDR regionima vezujućeg domena za CLDN6 opisanog gore. Pod "visoko homolognim" se smatra da se od 1 do 5, poželjno od 1 do 4, kao što je 1 do 3 ili 1 ili 2 supstitucije, može napraviti u svakom CDR regionu.
[0149] Termin "u kompeticiji" se odnosi na kompeticiju između dva vezujuća molekula za vezivanje za ciljni antigen. Ako dva vezujuća molekula ne blokiraju jedan drugog za vezivanje za ciljni antigen, takvi vezujući molekuli nisu u kompeticiji i to je indikacija da se pomenuti vezujući molekuli ne vezuju za isti deo, tj. epitop, ciljnog antigena. Stručnjacima iz date oblasti tehnike je dobro poznato kako da se testira kompeticija vezujućih molekula kao što su antitela za vezivanje za ciljni antigen. Primer takvog postupka je takozvani test unakrsne kompeticije, koji može npr. se izvodi kao ELISA ili protočnom citometrijom. Na primer, test zasnovan na ELISA može se izvesti tako što se bunarčići ELISA ploče oblažu jednim od antitela; dodavanjem kompetitivnog antitela i His-označenog antigena/ciljnog mesta i otkrivanjem da li je dodato antitelo inhibiralo vezivanje His-označenog antigena za obloženo antitelo, npr. dodavanjem biotinilovanog anti-His antitela, praćenog Streptavidin-poli-HRP, i dalje razvijanjem reakcije sa ABTS i merenjem apsorbancije na 405 nm. Na primer, test protočne citometrije se može izvesti inkubacijom ćelija koje eksprimiraju antigen/ciljno mesto sa viškom neobeleženog antitela, inkubiranjem ćelija sa suboptimalnom koncentracijom biotinom obeleženog antitela, nakon čega sledi inkubacija sa fluorescentno obeleženim streptavidinom i analiziranje pomoću protočne citometrije.
[0150] Dva vezujuća molekula imaju „istu specifičnost“ ako se vezuju za isti antigen i za isti epitop. Da li molekul koji treba da se testira prepoznaje isti epitop kao određeni vezujući molekul, tj. da li se vezujući molekuli vezuju za isti epitop, može se testirati različitim postupcima poznatim stručnjaku, npr. na osnovu kompeticije vezujućih molekula kao što su antitela za isti epitop. Kompeticija između vezujućih molekula može se otkriti testom unakrsnog blokiranja. Na primer, kompetitivni ELISA test se može koristiti kao test unakrsnog blokiranja. Na primer, ciljni antigen se može obložiti na bunarčiće mikrotitarske ploče i može se dodati antitelo koje se vezuje za antigen i kandidat kompetitivno test antitelo. Količina antitela za vezivanje antigena vezanog za antigen u bunarčiću indirektno korelira sa sposobnošću vezivanja kandidata kompetitivnog test antitela koje je sa njim u kompeticiji za vezivanje za isti epitop. Specifično, što je veći afinitet kandidata kompetitivnog test antitela za isti epitop, to je manja količina antitela za vezivanje antigena vezanog za bunarčić obložen antigenom. Količina antitela za vezivanje antigena vezanog za bunarčić može se meriti obeležavanjem antitela detektabilnim ili merljivim supstancama za obeležavanje.
[0151] Poželjno, grupa koja se vezuje za antigen u CAR pronalaska je anti-CLDN6 scFV, pri čemu anti-CLDN6 scFV poželjno sadrži sekvencu datu u SEQ ID NO: 35 ili njenu funkcionalnu varijantu.
Transmembranski domen
[0152] CAR ovog otkrića je dizajniran da sadrži transmembranski domen koji je fuzionisan sa ekstracelularnim domenom CAR. U jednom primeru izvođenja, transmembranski domen nije prirodno povezan sa jednim od domena u CAR. U jednom primeru izvođenja, transmembranski domen je prirodno povezan sa jednim od domena u CAR. U jednom primeru izvođenja, transmembranski domen je modifikovan aminokiselinskom supstitucijom da bi se izbeglo vezivanje takvih domena za transmembranske domene istih ili različitih proteina površinske membrane da bi se minimizirale interakcije sa drugim članovima receptorskog kompleksa. Transmembranski domen može biti izveden ili iz prirodnog ili iz sintetičkog izvora. Tamo gde je izvor prirodan, domen može biti izveden iz bilo kog membranskog ili transmembranskog proteina. Transmembranski regioni od posebne upotrebe u ovom otkriću mogu biti izvedeni iz (tj. sadrže najmanje transmembranski region(e) alfa, beta ili zeta lanca T ćelijskog receptora, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Alternativno, transmembranski domen može biti sintetički, u kom slučaju će sadržati pretežno hidrofobne ostatke kao što su leucin i valin. Poželjno je da se triplet fenilalanina, triptofana i valina nalazi na svakom kraju sintetičkog transmembranskog domena.
[0153] Poželjno, transmembranski domen u CAR pronalaska je CD8α transmembranski domen. U jednom primeru izvođenja, CD8α transmembranski domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 ili njenu funkcionalnu varijantu.
[0154] U nekim slučajevima, CAR ovog otkrića sadrži CD8α zglobni domen koji formira vezu između transmembranskog domena i ekstracelularnog domena. U jednom primeru izvođenja, CD8α zglobni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 ili njenu funkcionalnu varijantu.
Citoplazmatični domen
[0155] Citoplazmatični domen ili na drugi način intracelularni signalni domen CAR prema pronalasku je odgovoran za aktivaciju najmanje jedne od normalnih efektorskih funkcija imune ćelije u koju je CAR smešten. Termin "efektorska funkcija" se odnosi na specijalizovanu funkciju ćelije. Efektorska funkcija T ćelije, na primer, može biti citolitička aktivnost ili pomoćna aktivnost uključujući lučenje citokina. Stoga se termin "intracelularni signalni domen" odnosi na deo proteina koji transdukuje signal efektorske funkcije i usmerava ćeliju da obavlja specijalizovanu funkciju. Iako se obično može koristiti ceo intracelularni signalni domen, u mnogim slučajevima nije neophodno koristiti ceo lanac. U meri u kojoj se koristi skraćeni deo intracelularnog signalnog domena, takav skraćeni deo može da se koristi umesto neoštećenog lanca sve dok transdukuje signal efektorske funkcije. Pojam intracelularnog signalnog domena stoga podrazumeva bilo koji skraćeni deo intracelularnog signalnog domena dovoljan da transdukuje signal efektorske funkcije.
[0156] Poznato je da signali generisani samo preko TCR nisu dovoljni za potpunu aktivaciju T ćelije i da je takođe potreban sekundarni ili kostimulativni signal. Dakle, može se reći da je aktivacija T ćelija posredovana sa dve različite klase citoplazmatične signalne sekvence: one koje iniciraju primarnu aktivaciju zavisnu od antigena preko TCR (primarne citoplazmatične signalne sekvence) i one koje deluju na antigen nezavisan način da obezbede sekundarni ili kostimulativni signal (sekundarne citoplazmatične signalne sekvence).
[0157] CAR ovog otkrića sadrži primarnu citoplazmatičnu signalnu sekvencu poreklom iz CD3-zeta. Dalje, citoplazmatični domen CAR prema pronalasku je dizajniran tako da sadrži CD3-zeta signalni domen kombinovan sa kostimulatornim signalnim regionom izvedenim iz 4-1BB.
[0158] Termin "4-1BB" se odnosi na protein membranskog receptora koji se takođe naziva CD137, koji je član superfamilije receptora faktora nekroze tumora (TNFR) eksprimirane na površini aktiviranih T ćelija kao tip pomoćnog molekula.4-1BB ima molekulsku težinu od 55 kDa i nalazi se kao homodimer.
[0159] T ćelijski površinski glikoprotein CD3-zeta lanac takođe poznat kao T ćelijski receptor T3 zeta lanac ili CD247 je protein koji je kod ljudi kodiran CD247 genom. T ćelijski receptor zeta (ζ), zajedno sa T ćelijskim receptorom alfa/beta i gama/delta heterodimerima i CD3-gama, - delta i -epsilonom, formira T ćelijski receptor-CD3 kompleks. Zeta lanac igra važnu ulogu u povezivanju prepoznavanja antigena sa nekoliko intracelularnih puteva transdukcije signala. Niska ekspresija antigena dovodi do oslabljenog imunološkog odgovora.
[0160] Citoplazmatične signalne sekvence unutar citoplazmatičnog signalnog dela CAR iz pronalaska mogu biti povezane jedna sa drugom u nasumičnom ili određenom redosledu. Izborno, kratak oligo- ili polipeptidni linker, poželjno između 2 i 10 aminokiselina dužine može da formira vezu. Dublet glicin-serin obezbeđuje posebno pogodan linker.
[0161] Prema tome, citoplazmatični domen u CAR pronalaska je dizajniran da sadrži signalni domen CD3-zeta i signalni domen 4-1BB. U jednom primeru izvođenja, citoplazmatični domen u CAR pronalaska je dizajniran da sadrži signalni domen 4-1BB i signalni domen CD3-zeta, pri čemu signalni domen 4-1BB sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO : 30 ili njegovu funkcionalnu varijantu i signalni domen CD3-zeta sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31 ili njegovu funkcionalnu varijantu.
[0162] U jednom primeru izvođenja, CAR prema pronalasku sadrži signalni peptid koji usmerava nastali protein u endoplazmatični retikulum. U jednom primeru izvođenja, signalni peptid prethodi domenu za vezivanje antigena. U jednom primeru izvođenja, signalni peptid je poreklom iz imunoglobulina kao što je IgG. U jednom primeru izvođenja, signalni peptid sadrži sekvencu prema SEQ ID NO: 25 ili njenu funkcionalnu varijantu.
[0163] U jednom primeru izvođenja, CAR ovog otkrića sadrži sledeće elemente u sledećem redosledu: NH2 - CLDN6 antigen vezujući domen - transmembranski domen - 4-1BB kostimulatorni domen - CD3-zeta signalni domen - COOH.
[0164] U jednom primeru izvođenja, CAR ovog otkrića sadrži sledeće elemente u sledećem redosledu: NH2 - CLDN6 antigen vezujući domen - CD8α zglob - CD8α transmembranski domen - 4-1BB kostimulatorni domen - CD3-zeta signalni domen - COOH.
[0165] U jednom primeru izvođenja, CAR ovog otkrića sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36 ili njenu funkcionalnu varijantu.
Vektori
[0166] Ovo otkriće obuhvata konstrukt nukleinske kiseline kao što je DNK konstrukt koji sadrži sekvence koje kodiraju CAR ovog otkrića.
[0167] Ovo otkriće takođe obezbeđuje vektore u koje je umetnuta DNK ovog otkrića. Vektori poreklom iz retrovirusa kao što je lentivirus su pogodni alati za postizanje dugotrajnog transfera gena jer omogućavaju dugotrajnu, stabilnu integraciju transgena i njegovo razmnožavanje u ćerkama ćelijama. Lentivirusni vektori imaju dodatnu prednost u odnosu na vektore izvedene iz onko-retrovirusa kao što su virusi mišje leukemije u tome što mogu da transduciraju ćelije koje se ne razmnožavaju, kao što su hepatociti. Oni takođe imaju dodatnu prednost niske imunogenosti.
[0168] Ukratko, ekspresija prirodnih ili sintetičkih nukleinskih kiselina koje kodiraju CAR se obično postiže operativnim povezivanjem nukleinske kiseline koja kodira CAR polipeptid ili njegove delove sa promotorom, i inkorporiranjem konstrukta u ekspresioni vektor. Vektori mogu biti pogodni za replikaciju i integraciju kod eukariota. Tipični vektori za kloniranje sadrže terminatore transkripcije i translacije, inicijacijske sekvence i promotore korisne za regulaciju ekspresije željene sekvence nukleinske kiseline.
[0169] Nukleinska kiselina prema pronalasku može biti klonirana u brojne tipove vektora. Na primer, nukleinska kiselina može biti klonirana u vektor koji uključuje, ali nije ograničen na plazmid, fagemid, derivat faga, životinjski virus i kozmid ili transpozon. Vektori od posebnog interesa uključuju vektore ekspresije, vektore replikacije, vektore generisanja sonde i vektore sekvenciranja. Dalje, ekspresioni vektor se može obezbediti ćeliji u obliku virusnog vektora. Tehnologija virusnih vektora je dobro poznata u tehnici i opisana je, na primer, u Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), i u drugim priručnicima za virologiju i molekularnu biologiju. Virusi, koji su korisni kao vektori, uključuju, ali nisu ograničeni na, retroviruse, adenoviruse, adeno-povezane viruse, herpes viruse i lentiviruse. Generalno, odgovarajući vektor sadrži funkcionalno poreklo replikacije u najmanje jednom organizmu, promotorsku sekvencu, pogodna mesta restrikcione endonukleaze i jedan ili više selektivnih markera (npr. WO 01/96584; WO 01/29058; i SAD, Pat. br.6,326,193).
[0170] Brojni sistemi zasnovani na virusima su razvijeni za transfer gena u ćelije sisara. Na primer, retrovirusi pružaju pogodnu platformu za sisteme za isporuku gena. Izabrani gen može biti inseriran u vektor i upakovan u retrovirusne čestice upotrebom tehnika poznatih u tehnici. Rekombinantni virus se zatim može izolovati i isporučiti u ćelije subjekta in vivo ili ex vivo. Brojni retrovirusni sistemi su poznati u tehnici. U nekim primerima izvođenja koriste se adenovirusni vektori. Brojni adenovirusni vektori su poznati u tehnici. U jednom primeru izvođenja, koriste se lentivirusni vektori.
[0171] Dodatni promotorski elementi, na primer, pojačivači, regulišu učestalost inicijacije transkripcije. Tipično, oni se nalaze u regionu 30-110 bp ushodno od početnog mesta, iako se nedavno pokazalo da brojni promotori takođe sadrže funkcionalne elemente nishodno od početnog mesta. Razmak između promotorskih elemenata je često fleksibilan, tako da je funkcija promotora očuvana kada su elementi obrnuti ili pomereni jedan u odnosu na drugi. U promotoru timidin kinaze (tk), razmak između elemenata promotora može se povećati na 50 bp pre nego što aktivnost počne da opada. U zavisnosti od promotora, čini se da pojedinačni elementi mogu funkcionisati bilo kooperativno ili nezavisno da bi aktivirali transkripciju. Jedan primer pogodnog promotora je sekvenca promotora neposrednog ranog citomegalovirusa (CMV). Ova promotorska sekvenca je jaka konstitutivna promotorska sekvenca sposobna da pokrene visoke nivoe ekspresije bilo koje polinukleotidne sekvence koja je operativno povezana sa njom. Drugi primer pogodnog promotora je elongacioni faktor rasta-1α (EF-1α). Međutim, mogu se koristiti i druge konstitutivne promotorske sekvence, uključujući, ali ne ograničavajući se na, rani promotor virusa majmuna 40 (SV40), virus tumora dojke miša (MMTV), promotor dugog terminalnog ponovka (LTR) virusa humane imunodeficijencije (HIV), MoMuLV promotor, promotor virusa leukemije ptica, neposredni rani promotor Epstein-Barr virusa, promotor virusa Rous sarkoma, kao i promotori humanog gena kao što su, ali bez ograničenja, promotor aktina, promotor miozina, promotor hemoglobina i promotor kreatin kinaze. Pored toga, otkriće ne bi trebalo da bude ograničeno na upotrebu konstitutivnih promotora, inducibilni promotori su takođe razmatrani kao deo otkrića. Upotreba inducibilnog promotora obezbeđuje molekularni prekidač sposoban da uključi ekspresiju polinukleotidne sekvence sa kojom je on operativno povezan kada je takva ekspresija poželjna, ili da isključi ekspresiju kada ekspresija nije poželjna. Primeri inducibilnih promotora uključuju, ali nisu ograničeni na promotor metalotionina, promotor glukokortikoida, promotor progesterona i promotor tetraciklina.
[0172] Da bi se procenila ekspresija CAR polipeptida ili njegovih delova, ekspresioni vektor koji se uvodi u ćeliju takođe može sadržati ili selektabilni markerski gen ili reporter gen ili oba da bi se olakšala identifikacija i selekcija eksprimirajućih ćelija iz populacije ćelija za koju je traženo da bude transficirana ili inficirana putem virusnih vektora. U drugim aspektima, selektabilni marker može da se nosi na odvojenom delu DNK i da se koristi u postupku kotransfekcije. I selektivni markeri i reporterski geni mogu biti okruženi odgovarajućim regulatornim sekvencama da bi se omogućila ekspresija u ćelijama domaćina. Korisni selektivni markeri uključuju, na primer, gene otpornosti na antibiotike, kao što su neo i slično.
[0173] Reporter geni se koriste za identifikaciju potencijalno transficiranih ćelija i za procenu funkcionalnosti regulatornih sekvenci. Generalno, reporter gen je gen koji nije prisutan ili nije eksprimiran u organizmu ili tkivu primaoca i koji kodira polipeptid čija se ekspresija manifestuje nekim lako uočljivim svojstvom, na primer, enzimskom aktivnošću. Ekspresija reporter gena se ispituje u pogodno vreme nakon što je DNK uvedena u ćelije primaoca. Pogodni reporterski geni mogu uključivati gene koji kodiraju luciferazu, beta-galaktozidazu, hloramfenikol acetil transferazu, izlučenu alkalnu fosfatazu ili gen za zeleni fluorescentni protein. Pogodni ekspresioni sistemi su dobro poznati i mogu se pripremiti upotrebom poznatih tehnika ili dobiti komercijalno.
[0174] Postupci uvođenja i ekspresije gena u ćeliju su poznati u tehnici. U kontekstu ekspresionog vektora, vektor se može lako uvesti u ćeliju domaćina, npr., ćeliju sisara, bakterije, kvasca ili insekata, bilo kojim postupkom u tehnici. Na primer, ekspresioni vektor se može preneti u ćeliju domaćina fizičkim, hemijskim ili biološkim sredstvima.
[0175] Fizički postupci za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina uključuju precipitaciju kalcijum fosfata, lipofekciju, bombardovanje česticama, mikroinjekciju, elektroporaciju i slično. Poželjan postupak za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina je transfekcija kalcijum fosfatom.
[0176] Biološki postupci za uvođenje polinukleotida od interesa u ćeliju domaćina uključuju upotrebu DNK i RNK vektora. Virusni vektori, a posebno retrovirusni, postali su najčešće korišćeni postupak za ubacivanje gena u ćelije sisara, na primer, humane ćelije. Drugi virusni vektori mogu biti izvedeni iz lentivirusa, poksvirusa, herpes simpleks virusa I, adenovirusa i adeno-povezanih virusa i slično.
[0177] Hemijska sredstva za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina uključuju sisteme koloidne disperzije, kao što su kompleksi makromolekula, nanokapsule, mikrosfere, kuglice i sistemi na bazi lipida, uključujući emulzije ulje u vodi, micele, mešane micele i lipozome. Primer koloidnog sistema za upotrebu kao vehikulum za isporuku in vitro i in vivo je lipozom (npr. veštačka membranska vezikula).
Ćelije
[0178] Ćelije koje se koriste u vezi sa CAR sistemom ovog otkrića i u koje se mogu uvesti nukleinske kiseline (DNK ili RNK) koje kodiraju CAR sistem iz ovog otkrića uključuju bilo koju ćeliju sa litičkim potencijalom, posebno limfoidne ćelije, i poželjno su T ćelije, posebno citotoksične limfocite, poželjno izabrane od citotoksičnih T ćelija, prirodnih ćelija ubica (NK) i limfokin-aktiviranih ćelija ubica (LAK). Nakon aktivacije, svaki od ovih citotoksičnih limfocita pokreće uništavanje ciljnih ćelija. Na primer, citotoksične T ćelije pokreću uništavanje ciljnih ćelija na jedan ili oba od sledećih načina. Prvo, nakon aktivacije T ćelije oslobađaju citotoksine kao što su perforin, granzimi i granulizin. Perforin i granulizin stvaraju pore u ciljnoj ćeliji, a granzimi ulaze u ćeliju i pokreću kaskadu kaspaze u citoplazmi koja indukuje apoptozu (programiranu ćelijsku smrt) ćelije. Drugo, apoptoza se može indukovati interakcijom Fas-Fas liganda između T ćelija i ciljnih ćelija. Citotoksični limfociti će poželjno biti autologne ćelije, iako se mogu koristiti heterologne ćelije ili alogene ćelije.
[0179] Termini "T ćelija" i "T limfocit" se ovde koriste naizmenično i uključuju T pomoćne ćelije (CD4+ T ćelije) i citotoksične T ćelije (CTL, CD8+ T ćelije) koje sadrže citolitičke T ćelije. Termin "antigen-specifična T ćelija" ili slični termini se odnose na T ćeliju koja prepoznaje antigen na koji je T ćelija usmerena i poželjno vrši efektorske funkcije T ćelija. Smatra se da su T ćelije specifične za antigen ako ćelije ubijaju ciljne ćelije koje eksprimiraju antigen. Specifičnost T ćelija može da se proceni upotrebom bilo koje od niza standardnih tehnika, na primer, u okviru testa oslobađanja hroma ili testa proliferacije. Alternativno, može se meriti sinteza limfokina (kao što je interferon-γ).
[0180] Kako se ovde koristi, termin "NK ćelija" ili "prirodna ćelija ubica" odnosi se na podskup limfocita periferne krvi definisane ekspresijom CD56 ili CD16 i odsustvom receptora T ćelija (CD3). Kao što je ovde predviđeno, NK ćelija se takođe može razlikovati od matične ćelije ili progenitorske ćelije.
[0181] Termin "efektorske funkcije" u kontekstu ovog otkrića uključuje sve funkcije posredovane komponentama imunog sistema koje rezultiraju, na primer, ubijanjem obolelih ćelija kao što su tumorske ćelije, ili inhibicijom rasta tumora i/ili inhibicijom razvoja tumora, uključujući inhibiciju diseminacije tumora i metastaza. Poželjno, efektorske funkcije u kontekstu ovog otkrića su efektorske funkcije posredovane T ćelijama. Takve funkcije obuhvataju u slučaju T ćelije pomoćnice (CD4<+>T ćelija) oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8<+>limfocita (CTL) i/ili B ćelija, a u slučaju CTL eliminaciju ćelija, tj. ćelija koje karakteriše ekspresija antigena, na primer, putem apoptoze ili lize ćelija posredovane perforinom, proizvodnju citokina kao što je IFN-γ i TNF-α, i specifično citolitičko ubijanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju antigen.
[0182] Termin "imuna efektorska ćelija" ili "imunoreaktivna ćelija" u kontekstu ovog otkrića odnosi se na ćeliju koja vrši efektorske funkcije tokom imune reakcije. "Imuna efektorska ćelija" poželjno je sposobna da veže antigen kao što je antigen eksprimiran na površini ćelije i posreduje u imunološkom odgovoru. Na primer, imune efektorske ćelije sadrže T ćelije (citotoksične T ćelije, pomoćne T ćelije, T ćelije koje se infiltriraju u tumor), B ćelije, prirodne ćelije ubice, neutrofile, makrofage i dendritske ćelije. Poželjno, u kontekstu ovog otkrića, "imune efektorske ćelije" su T ćelije, poželjno CD4<+>i/ili CD8<+>T ćelije. Prema pronalasku, termin "imune efektorske ćelije" takođe uključuje ćeliju koja može sazreti u imunu ćeliju (kao što je T ćelija, posebno T pomoćna ćelija, ili citolitička T ćelija) uz odgovarajuću stimulaciju. Imune efektorske ćelije sadrže CD34<+>hematopoetske matične ćelije, nezrele i zrele T ćelije i nezrele i zrele B ćelije. Diferencijacija prekursora T ćelija u citolitičku T ćeliju, kada je izložena antigenu, slična je klonalnoj selekciji imunog sistema.
[0183] Poželjno, "imuna efektorska ćelija" prepoznaje antigen sa određenim stepenom specifičnosti, posebno ako je prisutan na površini obolelih ćelija kao što su ćelije kancera. Poželjno, navedeno prepoznavanje omogućava ćeliji koja prepoznaje antigen da bude responsivna ili reaktivna. Ako je ćelija pomoćna T ćelija (CD4<+>T ćelija) takva reakcija ili reaktivnost može uključivati oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8<+>limfocita (CTL) i/ili B ćelija. Ako je ćelija CTL, takva reakcija ili reaktivnost može uključiti eliminaciju ćelija, tj. ćelija koje karakteriše ekspresija antigena, na primer, putem apoptoze ili lize ćelija posredovane perforinom.
[0184] Prema otkriću, CTL responsivnost može uključivati stalni protok kalcijuma, deobu ćelija, proizvodnju citokina kao što su IFN-γ i TNF-α, pojačanu regulaciju aktivacionih markera kao što su CD44 i CD69, i specifično citolitičko ubijanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju antigen. CTL responsivnost se takođe može odrediti upotrebom veštačkog reportera koji tačno ukazuje na CTL responsivnost. Takvi CTL koji prepoznaju antigen i koji reaguju ili reaktivni se takođe nazivaju "antigen-responsivni CTL" ovde.
[0185] "Limfoidna ćelija" je ćelija koja, izborno, nakon odgovarajuće modifikacije, npr. nakon prenosa CAR, sposobna je da proizvede imuni odgovor kao što je ćelijski imuni odgovor, ili prekursorska ćelija takve ćelije, i uključuje limfocite, poželjno T limfocite, limfoblaste i plazma ćelije. Limfoidna ćelija može biti imuna efektorska ćelija kao što je ovde opisana. Poželjna limfoidna ćelija je T ćelija koja se može modifikovati da eksprimira CAR na površini ćelije. U jednom primeru izvođenja, limfoidnoj ćeliji nedostaje endogena ekspresija T ćelijskog receptora.
[0186] Termini "T ćelija" i "T limfocit" se ovde koriste naizmenično i uključuju T pomoćne ćelije (CD4+ T ćelije) i citotoksične T ćelije (CTL, CD8+ T ćelije) koje sadrže citolitičke T ćelije.
[0187 ] T ćelije pripadaju grupi belih krvnih zrnaca poznatih kao limfociti i igraju centralnu ulogu u ćelijski posredovanom imunitetu. Oni se mogu razlikovati od drugih tipova limfocita, kao što su B ćelije i prirodne ćelije ubice, prisustvom posebnog receptora na njihovoj površini ćelije koji se naziva T ćelijski receptor (TCR). Timus je glavni organ odgovoran za sazrevanje T ćelija. Otkriveno je nekoliko različitih podgrupa T ćelija, svaka sa posebnom funkcijom.
[0188 ] T pomoćne ćelije pomažu drugim belim krvnim zrncima u imunološkim procesima, uključujući sazrevanje B ćelija u plazma ćelije i aktiviranje citotoksičnih T ćelija i makrofaga, između ostalih funkcija. Ove ćelije su takođe poznate kao CD4+ T ćelije jer one eksprimiraju CD4 protein na svojoj površini. T pomoćne ćelije postaju aktivne kada su predstavljene sa peptidnim antigenima pomoću MHC molekula klase II koji su eksprimirani na površini ćelija koje prezentuju antigen (APC). Jednom aktivirani, oni se brzo dele i izlučuju male proteine koji se nazivaju citokini koji regulišu ili pomažu aktivni imuni odgovor.
[0189 ] Citotoksične T ćelije uništavaju virusno inficirane ćelije i tumorske ćelije, a takođe su uključene u odbacivanju transplantata. Ove ćelije su takođe poznate kao CD8+ T ćelije pošto eksprimiraju CD8 glikoprotein na svojoj površini. Ove ćelije prepoznaju njihova ciljna mesta vezivanjem za antigen povezan sa MHC klasom I, koji je prisutan na površini skoro svake ćelije tela.
[0190 ] Većina T ćelija ima T ćelijski receptor (TCR) koji postoji kao kompleks nekoliko proteina. Aktuelni T ćelijski receptor je sastavljen od dva odvojena peptidna lanca, koji su proizvedeni iz nezavisnih T-ćelijskih receptorskih alfa i beta (TCR α i TCR�) gena i nazivaju se α- i β- TCR lancima. γδ T ćelije (gama delta T ćelije) predstavljaju malu podgrupu T ćelija koje poseduju poseban T ćelijski receptor (TCR) na svojoj površini. Međutim, u γδ T ćelijama, TCR je napravljen od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T ćelija je mnogo ređa (2% od ukupnih T ćelija) nego αβ T ćelije.
[0191] Sve T ćelije potiču od hematopoetskih matičnih ćelija u koštanoj srži. Hematopoetski progenitori izvedeni iz hematopoetskih matičnih ćelija naseljavaju timus i proširuju se ćelijskom podelom kako bi generisali veliku populaciju nezrelih timocita. Najraniji timociti ne eksprimiraju ni CD4 ni CD8, pa su stoga klasifikovane kao dvostruko negativne (CD4- CD8-) ćelije. Kako napreduju njihovim razvojem, oni postaju dvostruko pozitivni timociti (CD4+ CD8+), i na kraju sazrevaju u pojedinačno-pozitivne (CD4+CD8- ili CD4-CD8+) timocite koji se zatim oslobađaju iz timusa u periferna tkiva.
[0192] T ćelije generalno, mogu biti pripremljene in vitro ili ex vivo, upotrebom standardnih postupaka. Na primer, T ćelije mogu biti izolovane iz koštane srži, periferne krvi ili frakcija koštane srži ili periferne krvi sisara, kao što je pacijent, upotrebom komercijalno dostupnog sistema za razdvajanje ćelija. Alternativno, T ćelije mogu biti poreklom iz srodnih ili nesrodnih ljudi, ne-humanih životinja, ćelijskih linija ili kultura. Uzorak koji sadrži T ćelije mogu, na primer, biti mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).
[0193] T ćelije koje se koriste u skladu sa pronalaskom mogu da eksprimiraju endogeni T ćelijski receptor ili može im nedostaje ekspresija endogenog T ćelijskog receptora.
[0194] Termin "CAR usmeren na antigen" odnosi se na CAR koji kada je prisutan na imunoj efektorskoj ćeliji kao što je T ćelija prepoznaje antigen kao što je na površini ćelija koje prezentuju antigen ili obolele ćelije kao što su ćelije kancera, tako da imuna efektorska ćelija je stimulisana, pripremljena i/ili proširena ili vrši efektorske funkcije imunih efektorskih ćelija kao što su gore opisane.
Izvori T ćelija
[0195] Pre proširenja i genetske modifikacije T ćelija prema pronalasku, izvor T ćelija se dobija od subjekta. T ćelije se mogu dobiti iz brojnih izvora, uključujući mononuklearne ćelije periferne krvi, koštanu srž, tkivo limfnih čvorova, krv pupčane vrpce, tkivo timusa, tkivo sa mesta infekcije, ascite, pleuralni izliv, tkivo slezine i tumore. U određenim primerima izvođenja ovog otkrića, može se koristiti bilo koji broj T ćelijskih linija dostupnih u tehnici. U određenim primerima izvođenja ovog otkrića, T ćelije se mogu dobiti iz jedinice krvi sakupljene od subjekta upotrebom bilo kog broja tehnika poznatih kvalifikovanom stručnjaku, kao što je Ficoll<™>odvajanje. U jednom poželjnom primeru izvođenja, ćelije iz cirkulišuće krvi individue se dobijaju aferezom. Proizvod afereze obično sadrži limfocite, uključujući T ćelije, monocite, granulocite, B ćelije, druga bela krvna zrnca sa jedrom, crvena krvna zrnca i trombocite. U jednom primeru izvođenja, ćelije sakupljene aferezom mogu biti isprane da bi se uklonila frakcija plazme i da bi se ćelije postavile u odgovarajući pufer ili medijum za naredne korake obrade. U jednom primeru izvođenja otkrića, ćelije su isprane fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS). U alternativnom primeru izvođenja, rastvoru za pranje nedostaje kalcijum i može nedostajati magnezijum ili mogu nedostajati mnogi ako ne i svi dvovalentni katjoni. Opet, iznenađujuće, početni koraci aktivacije u odsustvu kalcijuma dovode do povećane aktivacije. Kako bi stručnjaci iz date oblasti tehnike lako razumeli da se korak ispiranja može postići postupcima poznatim stručnjacima, kao što je upotrebom poluautomatske "protočne" centrifuge (na primer, Cobe 2991 cell processor, Baxter CytoMate, ili Haemonetics Cell Saver 5) prema uputstvima proizvođača. Nakon pranja, ćelije se mogu resuspendovati u različitim biokompatibilnim puferima, kao što je, na primer, PBS bez Ca<2+>, bez Mg<2+>, PlasmaLyte A ili drugi fiziološki rastvor sa ili bez pufera. Alternativno, neželjene komponente uzorka afereze mogu biti uklonjene i ćelije direktno resuspendovane u medijumu za kulturu.
[0196] U drugom primeru izvođenja, T ćelije su izolovane iz limfocita periferne krvi lizom crvenih krvnih zrnaca i deplecijom monocita, na primer, centrifugiranjem kroz PERCOLL<™>gradijent ili centrifugalnim elutriranjem sa suprotnim tokom. Specifična subpopulacija T ćelija, kao što su CD3<+>, CD28<+>, CD4<+>, CD8<+>, CD45RA<+>i CD45RO<+>T ćelije, mogu se dalje izolovati tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. Na primer, u jednom primeru izvođenja, T ćelije su izolovane inkubacijom sa anti-CD3/anti-CD28 (tj., 3x28)-konjugovanim kuglicama, kao što je DYNABEADS<®>M-450 CD3/CD28 T, tokom vremenskog perioda dovoljnog za pozitivnu selekciju željenih T ćelija. U jednom primeru izvođenja, vremenski period se kreće od 30 minuta do 36 sati ili duže. Stručnjak će prepoznati da se višestruki krugovi selekcije takođe mogu koristiti u kontekstu ovog otkrića.
[0197] Obogaćivanje populacije T ćelija negativnom selekcijom može se postići kombinacijom antitela usmerenih na površinske markere jedinstvene za negativno selekcionisane ćelije. Jedan postupak je sortiranje i/ili selekcija ćelija putem negativne magnetne imunoadherencije ili protočne citometrije koja koristi koktel monoklonskih antitela usmerenih na markere ćelijske površine prisutne na negativno selekcionisanim ćelijama. Na primer, da se obogati za CD4<+>ćelije negativnom selekcijom, koktel monoklonskih antitela tipično uključuje antitela na CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR i CD8. U određenim primerima izvođenja, može biti poželjno da se obogate za ili pozitivno selektuju za regulatorne T ćelije koje tipično eksprimiraju CD4<+>, CD25<+>, CD62L<hi>, GITR<+>i FoxP3<+>. Alternativno, u određenim primerima izvođenja, T regulatorne ćelije su osiromašene anti-CD25 konjugovanim kuglicama ili drugim sličnim postupkom selekcije.
[0198] Mogu se koristiti različiti postupci za uvođenje CAR konstrukata u T ćelije, uključujući transfekciju DNK koja nije na bazi virusa, sisteme zasnovane na transpozonu, sisteme zasnovane na virusima i sisteme zasnovane na RNK. Transfekcija DNK koja nije virusna ima nizak rizik od insercione mutageneze. Sistemi zasnovani na transpozonima mogu integrisati transgene efikasnije od plazmida koji ne sadrže element za integrisanje. Sistemi zasnovani na virusu, uključuju upotrebu γ-retrovirusa i lentivirusnih vektora. γ-Retrovirusi se relativno lako proizvode, efikasno i trajno transdukuju T ćelije, i preliminarno su dokazani bezbednim sa stanovišta integracije u primarnim humanim T ćelijama. Lentivirusni vektori takođe, efikasno i trajno transdukuju T ćelije, ali su skuplji za proizvodnju. Oni su takođe potencijalno sigurniji od sistema zasnovanih na retrovirusu. T ćelije ili progenitori T ćelija mogu biti transfektovani ex vivo ili in vivo sa nukleinskom kiselinom koja kodira CAR da bi se obezbedile T ćelije genetski modifikovane da eksprimiraju CAR.
[0199] Mogu se proizvoditi CAR T ćelije in vivo, i stoga skoro trenutno, upotrebom nanočestice ciljane na T ćelije. Na primer, nanočestice zasnovane na poli(P-amino estru) mogu biti spojene sa anti-CD3e f(ab) fragmentima radi vezivanja za CD3 na T ćelijama. Nakon vezivanja za T ćelije, ove nanočestice se endocitozuju. Njihov sadržaj, na primer plazmidna DNK koja kodira antitumorski antigen CAR, može biti usmerena na jedro T ćelije zbog uključivanja peptida koji sadrže sekvence povezane sa mikrotubulama (MTAS) i signale jedarne lokalizacije (NLS). Uključivanje transpozona sa obrnutim ponavljanjima (IR) koji okružuju kasetu za ekspresiju CAR gena i odvojenog plazmida koji kodira hiperaktivnu transpozazu, može omogućiti efikasnu integraciju CAR vektora u hromozome. Takav sistem koji omogućava in vivo proizvodnju CAR T ćelija nakon infuzije nanočestica je opisan u Smith et al. (2017) Nat. Nanotechnol. 12:813-820.
[0200] Druga mogućnost je upotreba postupka CRISPR/Cas9 da se namerno postavila CAR kodirajuća sekvenca na određenom lokusu. Na primer, postojeći T ćelijski receptori (TCR) mogu biti ugašeni, dok se CAR ubacuje i stavlja pod dinamičku regulatornu kontrolu endogenog promotora koji bi inače umanjio TCR ekspresiju; videti, npr. Eyquem et al. (2017) Priroda 543:113-117.
[0201] U jednom primeru izvođenja svih aspekata otkrića, T ćelije genetski modifikovane da eksprimiraju CAR su stabilno ili prolazno transfektovane nukleinskom kiselinom koja kodira CAR. Dakle, nukleinska kiselina koja kodira CAR je integrisana ili nije integrisana u genom T ćelija.
[0202] U jednom primeru izvođenja svih aspekata otkrića, T ćelije ili T ćelijski progenitori su od subjekta koji se leči. U jednom primeru izvođenja svih aspekata otkrića, T ćelije ili T ćelijski progenitori su od subjekta koji je različit od subjekta koji se leči.
[0203] U jednom primeru izvođenja svih aspekata otkrića, T ćelije mogu biti autologne, alogene ili singene za subjekta koji se leči. T ćelije mogu biti genetski modifikovane in vitro za ekspresiju himernog antigenskog receptora (CAR).
[0204] U jednom primeru izvođenja svih aspekata otkrića, T ćelije genetski modifikovane da eksprimiraju CAR su inaktivirane za ekspresiju endogenog T ćelijskog receptora i/ili endogenog HLA.
Aktivacija i proširenje T ćelija
[0205] Bez obzira da li pre ili posle genetske modifikacije T ćelija za ekspresiju željenog CAR, T ćelije se mogu aktivirati i proširiti generalno upotrebom postupaka poznatih u tehnici.
[0206] Generalno, T ćelije prema pronalasku se proširuju kontaktom sa površinom na koju je pričvršćeno sredstvo koje stimuliše signal povezan sa CD3/TCR kompleksom i ligand koji stimuliše kostimulativni molekul na površini T ćelija. Posebno, populacije T ćelija mogu biti stimulisane kako je ovde opisano, kao što je kontakt sa anti-CD3 antitelom, ili njegovim fragmentom koji se vezuje za antigen, ili anti-CD2 antitelom imobilisanim na površini, ili kontaktom sa aktivatorom protein kinaze C (npr. briostatin) u kombinaciji sa kalcijum jonoforom. Za kostimulaciju pomoćnog molekula na površini T ćelija koristi se ligand koji vezuje pomoćni molekul. Na primer, populacija T ćelija može biti u kontaktu sa anti-CD3 antitelom i anti-CD28 antitelom, pod uslovima odgovarajućim za stimulisanje proliferacije T ćelija.
[0207] U određenim primerima izvođenja, primarni stimulativni signal i ko-stimulativni signal za T ćeliju mogu biti obezbeđeni različitim protokolima. Na primer, sredstva koja obezbeđuju svaki signal mogu biti u rastvoru ili spojena na površinu. Kada su spojeni na površinu, sredstva mogu biti spojena na istu površinu (tj. u "cis" formaciji) ili na odvojene površine (tj. u "trans" formaciji). Alternativno, jedno sredstvo može biti spojeno na površinu, a drugo u rastvoru. U jednom primeru izvođenja, sredstvo koje obezbeđuje kostimulativni signal je vezano za površinu ćelije, a sredstvo koje obezbeđuje primarni aktivacioni signal je u rastvoru ili spojeno sa površinom. U određenim primerima izvođenja, oba sredstva mogu biti u rastvoru.
[0208] U jednom primeru izvođenja, dva sredstva su imobilizovana na kuglice, bilo na istoj kuglici, tj., "cis", ili na posebnim kuglicama, tj., "trans". Na primer, sredstvo koji obezbeđuje primarni aktivacioni signal je antitelo na CD3 ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, a sredstvo koje obezbeđuje ko-stimulativni signal je antitelo na CD28 ili njegov fragment koji se vezuje za antigen; a oba sredstva su koimobilizovana na istu kuglicu. U jednom primeru izvođenja, odnos CD3:CD28 antitela vezanog za kuglice kreće se od 100:1 do 1:100.
[0209] Odnosi čestica prema ćelijama od 1:500 do 500:1 mogu se koristiti za stimulaciju T ćelija ili drugih ciljnih ćelija. Kao što stručnjaci iz date oblasti tehnike mogu lako da uvide, odnos čestica prema ćelijama može zavisiti od veličine čestica u odnosu na ciljnu ćeliju. Na primer, male kuglice mogu da vežu samo nekoliko ćelija, dok veće kuglice mogu da vežu mnoge. U određenim primerima izvođenja odnos ćelija prema česticama se kreće od 1:100 do 100:1, a u dodatnim primerima izvođenja odnos sadrži 1:9 do 9:1.
[0210] Uslovi prikladni za kulturu T ćelija uključuju odgovarajući medijum (npr. Minimalni esencijalni medijum ili RPMI medijum 1640 ili X-vivo 15, (Lonza)) koji može sadržati faktore neophodne za proliferaciju i vijabilnost, uključujući serum (npr., fetalni goveđi ili humani serum), interleukin-2 (IL-2), insulin, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ i TNF-α ili bilo koje druge aditive za rast ćelija koji su poznati verziranom stručnjaku. Drugi aditivi za rast ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, surfaktant, plazmanat i redukciona sredstva kao što su N-acetil-cistein i 2-merkaptoetanol. Ciljne ćelije se održavaju u uslovima neophodnim za održavanje rasta, na primer, odgovarajuća temperatura (npr.37 °C) i atmosfera (npr. vazduh plus 5% CO2).
Terapeutska primena
[0211] Ovo otkriće obuhvata ćeliju (npr. T ćeliju) koja sadrži CAR molekul iz otkrića, npr., transdukovanu sa retrovirusnim kao što je lentivirusni vektor (LV) koji kodira CAR iz otkrića. Stoga, u nekim slučajevima, transdukovana T ćelija može da izazove odgovor T ćelija posredovan preko CAR.
[0212] Otkriće obezbeđuje upotrebu CAR za preusmeravanje specifičnosti primarne T ćelije na tumorski antigen CLDN6. Prema tome, ovo otkriće takođe obezbeđuje postupak za stimulaciju imunog odgovora posredovanog T ćelijama na ciljnu ćelijsku populaciju ili tkivo kod sisara koji sadrži korak primene na sisara T ćelije koja eksprimira CAR prema pronalasku, pri čemu CAR sadrži vezujući deo koji specifično interaguje sa CLDN6 kao unapred određenim ciljnim mestom.
[0213] U jednom primeru izvođenja, ovo otkriće uključuje tip ćelijske terapije gde su T ćelije genetski modifikovane da eksprimiraju CAR iz otkrića i CAR T ćelija se infuzira primaocu kome je to potrebno. Infuzirana ćelija je u stanju da ubije ćelije tumora u primaocu. Za razliku od terapija antitelima, CAR T ćelije su u stanju da se repliciraju in vivo što rezultira dugotrajnom perzistentnošću koja može dovesti do trajne kontrole tumora.
[0214] U jednom primeru izvođenja, CAR T ćelije iz ovog otkrića mogu biti otporne in vivo Proširenje T ćelija i može trajati duže vreme. U sledećem primeru izvođenja, CAR T ćelije prema pronalasku evoluiraju u specifične memorijske T ćelije koje se mogu ponovo aktivirati da inhibiraju bilo koje dodatno formiranje ili rast tumora.
[0215] Kanceri koji se mogu lečiti uključuju tumore koji nisu vaskularizovani, ili još uvek nisu značajno vaskularizovani, kao i vaskularizovani tumori. Kanceri mogu uključivati solidne tumore. Tipovi kancera koji se leče sa CAR iz otkrića uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, blastom i sarkom, i određenu leukemiju ili limfoidne malignitete, benigne i maligne tumore i malignitete, npr. sarkome, karcinome i melanome. Tumori/kanceri odraslih i pedijatrijski tumori/kanceri su takođe uključeni.
[0216] Solidni tumori su abnormalne mase tkiva koje obično ne sadrže ciste ili tečna područja. Solidni tumori mogu biti benigni ili maligni. Različiti tipovi solidnih tumora su imenovani prema tipu ćelija koje ih formiraju (kao što su sarkomi, karcinomi i limfomi). Primeri solidnih tumora, kao što su sarkomi i karcinomi, uključuju fibrosarkom, miksosarkom, liposarkom, hondrosarkom, osteosarkom i druge sarkome, sinoviom, mezoteliom, Ewing-ov tumor, leiomiosarkom, rabdomiosarkom, karcinom debelog creva, limfoidni malignitet, kancer pankreasa, kancer dojke, kancere pluća, kancer jajnika, kancer prostate, hepatoćelijski karcinom, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, adenokarcinom, karcinom znojnih žlezda, medularni karcinom štitne žlezde, papilarni karcinom štitne žlezde, feohromocitomi, karcinom lojnih žlezda, papilarni karcinom, papilarne adenokarcinome, medularni karcinom, bronhogeni karcinom, karcinom bubrežnih ćelija, hepatom, karcinom žučnog kanala, horiokarcinom, Wilms-ov tumor, cervikalni kancer, testiklularni tumor, seminom, karcinom bešike, melanom i tumore CNS-a (kao što je gliom (kao što je gliom moždanog stabla i mešani gliomi), glioblastom (takođe poznat kao glioblastoma multiforme), astrocitom, limfom CNS-a, germinom, meduloblastom, švanom, kraniofariogiom, ependimom, pineaiom, hemangioblastom, akustični neurom, oligodendrogliom, menangiom, neuroblastom, retinoblastom i metastaze u mozgu).
[0217] U jednom primeru izvođenja, kanceri koji se mogu lečiti su kanceri koji eksprimiraju CLDN6 kao što su oni koji su ovde opisani.
[0218] U jednom primeru izvođenja otkrića, ćelije su izolovane iz sisara (poželjno čoveka) i genetski modifikovane (tj. transdukovane ili transfektovane in vitro) sa vektorom koji eksprimira CAR koji je ovde otkriven. CAR-modifikovana ćelija može da se primeni na sisarskog primaoca da bi se obezbedila terapeutska korist. Sisarski primalac može biti čovek i CAR-modifikovana ćelija može biti autologna u odnosu na primaoca. Alternativno, ćelije mogu biti alogene, singene ili ksenogene u odnosu na primaoca.
[0219] CAR-modifikovane ćelije prema ovom pronalasku mogu se primenjivati ili same, ili u kombinaciji sa drugim komponentama kao što su IL-2 ili drugi citokini ili ćelijske populacije. U jednom primeru izvođenja, CAR-modifikovane ćelije prema ovom pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa srodnim molekulom antigena, ili nukleinskom kiselinom, posebno RNK, koja kodira srodni molekul antigena. Srodni molekul antigena može biti CLDN6, rekombinantni CLDN6, CLDN6 fragment ili varijanta bilo kog od prethodno navedenih. U jednom primeru izvođenja se primenjuje nukleinska kiselina, posebno RNK, koja kodira srodni molekul antigena (npr. CLDN6, rekombinantni CLDN6, CLDN6 fragment ili varijantu bilo kog od prethodno navedenih). Poželjno, nukleinska kiselina koja kodira srodni molekul antigena je eksprimirana u ćelijama subjekta na koga se primenjuju CAR-modifikovane ćelije ovog otkrića i nukleinska kiselina koja kodira srodni molekul antigena da bi se obezbedio srodni molekul antigena za vezivanje pomoću vezujućeg domena CAR antigena. U jednom primeru izvođenja, ekspresija srodnog molekula vezujućeg domena CAR antigena je na površini ćelije. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira srodni molekul antigena je prolazno eksprimirana u ćelijama subjekta. U jednom primeru izvođenja, nukleinsko kodiranje za srodni molekul antigena je RNK. Poželjno, kontakt CAR-modifikovanih ćelija prema ovom otkriću sa srodnim molekulom antigena rezultira proširenjem i/ili aktivacijom ćelija.
[0220] Peptidni i proteinski antigeni pogodni za upotrebu u skladu sa otkrićem tipično obuhvataju peptid ili protein koji sadrži epitop za koji se vezuje vezujući domen CLDN6 antigena CAR iz otkrića. Peptid ili protein ili epitop mogu biti poreklom iz CLDN6. Na primer, peptidni ili proteinski antigen ili epitop sadržan u peptidu ili proteinskom antigenu može biti CLDN6 ili fragment ili varijanta CLDN6.
[0221] Peptidni i proteinski antigen koji se daju subjektu u skladu sa otkrićem (bilo primenom peptidnog i proteinskog antigena ili nukleinske kiseline, posebno RNK, koja kodira peptid i proteinski antigen), tj. antigen vakcine, poželjno rezultira stimulacijom, prajmovanjem i/ili proširenjem CAR-modifikovanih ćelija kod subjekta na koga se primenjuju CAR-modifikovane ćelije i antigen ili nukleinske kiseline. Pomenute stimulisane, prajmovane i/ili proširene CAR-modifikovane ćelije su poželjno usmerene protiv ciljnog antigena CLDN6, posebno ciljnog antigena koji eksprimiraju obolele ćelije, tkiva i/ili organi, tj. antigena povezanog sa bolešću. Dakle, antigen vakcine može da sadrži antigen povezan sa bolešću, ili njegov fragment ili varijantu. U jednom aspektu, takav fragment ili varijanta je imunološki ekvivalentan antigenu povezanom sa bolešću. U kontekstu ovog otkrića, termin "fragment antigena" ili "varijanta antigena" označava sredstvo koje dovodi do stimulacije, prajminga i/ili proširenja CAR-modifikovanih ćelija koje stimulisane, prajmingovane i/ili proširene CAR-modifikovane ćelije ciljaju na antigen povezan sa bolešću, posebno kada se eksprimiraju na površini obolelih ćelija, tkiva i/ili organa. Dakle, antigen vakcine koji se primenjuje u skladu sa otkrićem može odgovarati ili može sadržati antigen povezan sa bolešću, može odgovarati ili može sadržati fragment antigena povezanog sa bolešću ili može odgovarati ili može sadržati antigen koji je homologan sa antigenom povezanim sa bolešću ili njegov fragment. Ako antigen vakcine primenjen u skladu sa otkrićem sadrži fragment antigena povezanog sa bolešću ili aminokiselinsku sekvencu koja je homologna fragmentu antigena povezanog sa bolešću, pomenuti fragment ili aminokiselinska sekvenca može sadržati epitop antigena povezanog sa bolešću ili sekvencu koja je homologna epitopu antigena povezanog sa bolešću, pri čemu se CAR-modifikovane ćelije vezuju za pomenuti epitop. Prema tome, prema otkriću, antigen može da sadrži imunogeni fragment antigena povezanog sa bolešću ili aminokiselinsku sekvencu koja je homologna imunogenom fragmentu antigena povezanog sa bolešću. "Imunogeni fragment antigena" prema pronalasku se prvenstveno odnosi na fragment antigena koji je sposoban da stimuliše, za prajming i/ili da proširi CAR-modifikovane ćelije. Poželjno je da antigen vakcine (slično antigenu povezanom sa bolešću) obezbeđuje relevantni epitop za vezivanje preko vezujućeg domena CLDN6 antigena koji je prisutan u CAR CAR-modifikovanih ćelija. Takođe je poželjno da se antigen vakcine (slično antigenu povezanom sa bolešću) eksprimira na površini ćelije kao što je ćelija koja prezentuje antigen tako da obezbedi relevantni epitop za vezivanje od strane CAR. Antigen vakcine prema pronalasku može biti rekombinantni antigen.
[0222] Termin "imunološki ekvivalentan" znači da imunološki ekvivalentan molekul kao što je imunološki ekvivalentna aminokiselinska sekvenca pokazuje ista ili suštinski ista imunološka svojstva i/ili ispoljava iste ili suštinski iste imunološke efekte, npr. u odnosu na tip imunološkog efekta. U kontekstu ovog otkrića, termin "imunološki ekvivalentan" se poželjno koristi u odnosu na imunološke efekte ili svojstva antigena ili varijante antigena. Na primer, aminokiselinska sekvenca je imunološki ekvivalentna referentnoj aminokiselinskoj sekvenci, npr. CLDN6, ako navedena aminokiselinska sekvenca kada je izložena CAR-modifikovanim ćelijama koje se vezuju za referentnu aminokiselinsku sekvencu ili ćelijama koje eksprimiraju referentnu aminokiselinsku sekvencu indukuje imunu reakciju koja ima specifičnost reagovanja sa referentnom aminokiselinskom sekvencom, posebno stimulaciju, prajming i/ili ekspanziju CAR-modifikovane ćelije. Dakle, molekul koji je imunološki ekvivalentan antigenu pokazuje ista ili suštinski ista svojstva i/ili ispoljava iste ili suštinski iste efekte u pogledu stimulacije, prajminga i/ili ekspanzije CAR-modifikovanih ćelija kao antigen na koji su CAR-modifikovane ćelije usmerene.
[0223] "Aktivacija" ili "stimulacija", kako se ovde koristi, odnosi se na stanje T ćelije koja je bila dovoljno stimulisana da izazove detektabilnu ćelijsku proliferaciju. Aktivacija takođe može biti povezana sa indukovanom proizvodnjom citokina i efektorskim funkcijama koje se mogu detektovati. Termin "aktivirane T ćelije" odnosi se, između ostalog, na T ćelije koje prolaze kroz ćelijsku deobu.
[0224] Termin "prajming" se odnosi na proces u kome T ćelija ima svoj prvi kontakt sa svojim specifičnim antigenom i izaziva diferencijaciju u efektorske T ćelije.
[0225] Termin "klonalno proširenje" ili "proširenje" odnosi se na proces u kojem se umnožava određeni entitet. U kontekstu ovog otkrića, termin se poželjno koristi u kontekstu imunološkog odgovora u kome su limfociti stimulisani antigenom, proliferišu, a specifični limfocit koji prepoznaje navedeni antigen se pojačava. Poželjno, klonalno proširenje dovodi do diferencijacije limfocita.
[0226] Posebno je poželjno prema otkriću da se srodni antigen primenjuje u obliku RNK koja kodira antigen. Nakon primene RNK, najmanje deo RNK se isporučuje u ciljnu ćeliju. U jednom primeru izvođenja, najmanje deo RNK se isporučuje u citosol ciljne ćelije. U jednom primeru izvođenja, RNK se translatira od strane ciljne ćelije da bi se proizveo kodirani peptid ili protein. Neki primeri izvođenja uključuju ciljanu isporuku RNK u određena tkiva. U jednom primeru izvođenja, isporuka uključuje ciljanje na limfni sistem, posebno na sekundarne limfoidne organe, tačnije na slezinu. U jednom primeru izvođenja, ciljna ćelija je ćelija slezine. U jednom primeru izvođenja, ciljna ćelija je ćelija koja prezentuje antigen, kao što je profesionalna ćelija koja prezentuje antigen u slezini. U jednom primeru izvođenja, ciljna ćelija je dendritska ćelija u slezini.
[0227] "Limfni sistem" je deo cirkulatornog sistema i važan deo imunog sistema, koji sadrži mrežu limfnih sudova koji nose limfu. Limfni sistem se sastoji od limfnih organa, provodne mreže limfnih sudova i cirkulišuće limfe. Primarni ili centralni limfoidni organi stvaraju limfocite iz nezrelih progenitorskih ćelija. Timus i koštana srž čine primarne limfoidne organe. Sekundarni ili periferni limfoidni organi, koji uključuju limfne čvorove i slezinu, održavaju zrele naivne limfocite i iniciraju adaptivni imuni odgovor. RNK se može isporučiti u slezinu pomoću takozvanih formulacija lipopleksa, u kojima je RNK vezana za lipozome koji sadrže katjonski lipid i izborno dodatni ili pomoćni lipid da bi se formirale formulacije nanočestica koje se mogu injektirati. Lipozomi se mogu dobiti ubrizgavanjem rastvora lipida u etanolu u vodu ili odgovarajuću vodenu fazu. Čestice RNK lipopleksa se mogu pripremiti mešanjem lipozoma sa RNK. RNK lipopleks čestice koje ciljanu slezinu su opisane u WO 2013/143683, koji je ovde uključen kao referenca. Utvrđeno je da čestice RNK lipopleksa koje imaju neto negativno naelektrisanje mogu da se koriste za preferencijalno ciljanje tkiva slezine ili ćelija slezine kao što su ćelije koje prezentuju antigen, posebno dendritske ćelije. Shodno tome, nakon primene čestica RNK lipopleksa, dolazi do akumulacije RNK i/ili ekspresije RNK u slezini. Prema tome, čestice RNK lipopleksa prema pronalasku mogu da se koriste za ekspresiju RNK u slezini. U jednom primeru izvođenja, nakon primene čestica RNK lipopleksa, ne dolazi do ili u suštini nema akumulacije RNK i/ili ekspresije RNK u plućima i/ili jetri. U jednom primeru izvođenja, nakon primene čestica RNK lipopleksa, dolazi do akumulacije RNK i/ili ekspresije RNK u ćelijama koje predstavljaju antigen, kao što su profesionalne ćelije koje prezentuju antigen u slezini. Prema tome, čestice RNK lipopleksa prema pronalasku mogu da se koriste za ekspresiju RNK u takvim ćelijama koje prezentuju antigen. U jednom primeru izvođenja, ćelije koje prezentuju antigen su dendritske ćelije i/ili makrofagi.
[0228] U kontekstu ovog otkrića, termin "čestica RNK lipopleksa" se odnosi na česticu koja sadrži lipid, posebno katjonski lipid, i RNK. Elektrostatičke interakcije između pozitivno naelektrisanih lipozoma i negativno naelektrisanih RNK dovode do kompleksiranja i spontanog formiranja čestica RNK lipopleksa. Pozitivno naelektrisani lipozomi mogu se generalno sintetisati upotrebom katjonskog lipida, kao što je DOTMA, i dodatnih lipida, kao što je DOPE. U jednom primeru izvođenja, RNK lipopleksna čestica je nanočestica.
[0229] Kako se ovde koristi, "katjonski lipid" se odnosi na lipid koji ima neto pozitivno naelektrisanje. Katjonski lipidi vezuju negativno naelektrisanu RNK elektrostatičkom interakcijom za lipidni matriks. Generalno, katjonski lipidi poseduju lipofilni deo, kao što je sterol, acil ili diacil lanac, a glavna grupa lipida obično nosi pozitivno naelektrisanje. Primeri katjonskih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na 1,2-di-O-oktadecenil-3-trimetilamonijum propan (DOTMA), dimetildioktadecilamonijum (DDAB); 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum propan (DOTAP); 1,2-dioleoil-3-dimetilamonijum-propan (DODAP); 1,2-diaciloksi-3-dimetilamonijum propani; 1,2-dialkiloksi-3-dimetilamonijum propani; dioktadecildimetil amonijum hlorid (DODAC), 2,3-di(tetradekoksi)propil-(2-hidroksietil)-dimetilazanijum (DMRIE), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfoholin (DMEPC), 1,2-dimirstoil-3-trimetilamonijum propan (DMTAP), 1,2-dioleiloksipropil-3-dimetil-hidroksietil amonijum bromid (DORIE) i 2,3-dioleoiloksi-N-[2(spermin karboksamid)etil]-N,N-dimetil-I-propanamijum trifluoroacetat (DOSPA). Poželjni su DOTMA, DOTAP, DODAC i DOSPA. U specifičnim primerima izvođenja, katjonski lipid je DOTMA i/ili DOTAP.
[0230] Dodatni lipid se može ugraditi da bi se podesio ukupni odnos pozitivnog i negativnog naelektrisanja i fizička stabilnost čestica RNK lipopleksa. U određenim primerima izvođenja, dodatni lipid je neutralni lipid. Kako se ovde koristi, "neutralni lipid" se odnosi na lipid koji ima neto naelektrisanje od nule. Primeri neutralnih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na, 1,2-di-(9Z-oktadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DOPC), diacilfosfatidil holin, diacilfosfatidil etanol amin, ceramid, sfingoemijelin, cefalin, holesterol i cerebrozid. U specifičnim primerima izvođenja, dodatni lipid je DOPE, holesterol i/ili DOPC.
[0231] U određenim primerima izvođenja, čestice RNK lipopleksa uključuju i katjonski lipid i dodatni lipid. U jednom primeru izvođenja, katjonski lipid je DOTMA, a dodatni lipid je DOPE.
[0232] U nekim primerima izvođenja, molarni odnos najmanje jednog katjonskog lipida prema najmanje jednom dodatnom lipidu je od oko 10:0 do oko 1:9, oko 4:1 do oko 1:2, ili oko 3:1 do oko 1:1. U specifičnim primerima izvođenja, molarni odnos može biti oko 3:1, oko 2.75:1, oko 2.5:1, oko 2.25:1, oko 2:1, oko 1.75:1, oko 1.5:1, oko 1.25:1, ili oko 1:1. U jednom primeru izvođenja, molarni odnos najmanje jednog katjonskog lipida prema najmanje jednom dodatnom lipidu je oko 2:1.
[0233] Čestice RNK lipopleksa koje su ovde opisane imaju prosečan prečnik koji se u jednom primeru izvođenja kreće od oko 200 nm do oko 1000 nm, od oko 200 nm do oko 800 nm, od oko 250 do oko 700 nm, od oko 400 do oko 600 nm, od 300 nm do oko 500 nm, ili od oko 350 nm do oko 400 nm. U specifičnim primerima izvođenja, čestice RNK lipopleksa imaju prosečni prečnik od oko 200 nm, oko 225 nm, oko 250 nm, oko 275 nm, oko 300 nm, oko 325 nm, oko 350 nm, oko 375 nm, oko 400 nm, oko 425 nm, oko 450 nm, oko 475 nm, oko 500 nm, oko 525 nm, oko 550 nm, oko 575 nm, oko 600 nm, oko 625 nm, oko 650 nm, oko 700 nm, oko 725 nm, oko 750 nm, oko 775 nm, oko 800 nm, oko 825 nm, oko 850 nm, oko 875 nm, oko 900 nm, oko 925 nm, oko 950 nm, oko 975 nm, ili oko 1000 nm. U jednom primeru izvođenja, čestice RNK lipopleksa imaju prosečan prečnik koji se kreće od oko 250 nm do oko 700 nm. U sledećem primeru izvođenja, čestice RNK lipopleksa imaju prosečan prečnik koji se kreće od oko 300 nm do oko 500 nm. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, čestice RNK lipopleksa imaju prosečni prečnik od oko 400 nm.
[0234] Električno naelektrisanje čestica RNK lipopleksa prema ovom pronalasku je zbir električnih naelektrisanja prisutnih u najmanje jednom katjonskom lipidu i električnih naelektrisanja prisutnih u RNK. Odnos naelektrisanja je odnos pozitivnih naelektrisanja prisutnih u najmanje jednom katjonskom lipidu i negativnih naelektrisanja prisutnih u RNK. Odnos naelektrisanja pozitivnih naelektrisanja prisutnih u najmanje jednom katjonskom lipidu i negativnih naelektrisanja prisutnih u RNK izračunava se sledećom jednačinom: odnos naelektrisanja=[(koncentracija katjonskog lipida (mol)) * (ukupan broj pozitivnih naelektrisanja u katjonskom lipidu)] / [(koncentracija RNK (mol)) * (ukupan broj negativnih naelektrisanja u RNK)].
[0235] Ovde opisane čestice RNK lipopleksa koje ciljaju slezinu pri fiziološkom pH poželjno imaju neto negativno naelektrisanje kao što je odnos naelektrisanja pozitivnih i negativnih naelektrisanja od oko 1.9:2 do oko 1:2. U specifičnim primerima izvođenja, odnos naelektrisanja pozitivnih i negativnih naelektrisanja u RNK lipopleks česticama pri fiziološkom pH je oko 1.9:2.0, oko 1.8:2.0, oko 1.7:2.0, oko 1.6:2.0, oko 1.5:2.0, oko 1.4: 2.0, oko 1.3:2.0, oko 1.2:2.0, oko 1.1:2.0 ili oko 1:2.0.
[0236] CAR-modifikovane ćelije i dodatna sredstva koja su ovde opisana mogu se primenjivati u farmaceutskim kompozicijama ili lekovima za terapeutske ili profilaktičke tretmane i mogu se primenjivati u obliku bilo koje pogodne farmaceutske kompozicije.
[0237] Termin "farmaceutska kompozicija" se odnosi na formulaciju koja sadrži terapeutski efikasno sredstvo, poželjno zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, razblaživačima i/ili ekscipijensima. Navedena farmaceutska kompozicija je korisna za lečenje, prevenciju ili smanjenje ozbiljnosti bolesti ili poremećaja primenom pomenute farmaceutske kompozicije na subjekta. Farmaceutska kompozicija je takođe poznata u tehnici kao farmaceutska formulacija.
[0238] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu da sadrže jedan ili više pomoćnih sredstava ili se mogu primeniti sa jednim ili više pomoćnih sredstava. Termin "ađuvans" se odnosi na jedinjenje koje produžava, pojačava ili ubrzava imuni odgovor. Ađuvansi sadrže heterogenu grupu jedinjenja kao što su uljane emulzije (npr. Freund-ovi ađuvansi), mineralna jedinjenja (kao što je stipsa), bakterijski proizvodi (kao što je toksin Bordetella pertussis) ili imunostimulišući kompleksi. Primeri ađuvanasa uključuju, bez ograničenja, LPS, GP96, CpG oligodeoksinukleotide, faktore rasta i ciktokine, kao što su monokini, limfokini, interleukini, hemokini. Hemokini mogu biti IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL12, IFNα, IFNγ, GM-CSF, LT-a. Dodatni poznati ađuvansi su aluminijum hidroksid, Freund-ov ađuvans ili ulje kao što je Montanide<®>ISA51. Drugi pogodni ađuvansi za upotrebu u ovom pronalasku uključuju lipopeptide, kao što je Pam3Cys.
[0239] Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku se generalno primenjuju u "farmaceutski efikasnoj količini" i u "farmaceutski prihvatljivom preparatu".
[0240] Termin "farmaceutski prihvatljiv" se odnosi na netoksičnost materijala koji nije u interakciji sa dejstvom aktivne komponente farmaceutske kompozicije.
[0241] Termin "farmaceutski efikasna količina" ili "terapeutski efikasna količina" odnosi se na količinu kojom se postiže željena reakcija ili željeni efekat pojedinačno ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju lečenja određene bolesti, poželjno je da se željena reakcija odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo uključuje usporavanje napredovanja bolesti i, posebno, prekid ili preokretanje napredovanja bolesti. Željena reakcija u lečenju bolesti takođe može biti odlaganje početka ili prevencija početka navedene bolesti ili navedenog stanja. Efikasna količina ovde opisanih kompozicija zavisiće od stanja koje se leči, težine bolesti, individualnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanje lečenja, tip prateće terapije (ako postoji), specifičan put primene i slične faktore. Shodno tome, doze koje se primenjuju ovde opisanih kompozicija mogu zavisiti od različitih takvih parametara. U slučaju da je reakcija kod pacijenta nedovoljna sa početnom dozom, mogu se koristiti veće doze (ili efektivno veće doze koje se postižu drugačijim, lokalizovanijim putem primene).
[0242] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu da sadrže soli, pufere, konzervanse i izborno druga terapeutska sredstva. U jednom primeru izvođenja, farmaceutske kompozicije ovog pronalaska sadrže jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača i/ili ekscipijenasa.
[0243] Pogodni konzervansi za upotrebu u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska uključuju, bez ograničenja, benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.
[0244] Termin "ekscipijens" kako se ovde koristi, odnosi se na supstancu koja može biti prisutna u farmaceutskoj kompoziciji prema ovom pronalasku, ali nije aktivni sastojak. Primeri ekscipijenasa, bez ograničenja, uključuju nosače, vezujuća sredstva, razblaživače, lubrikante, zgušnjivače, površinski aktivna sredstva, konzervanse, stabilizatore, emulgatore, pufere, sredstva za poboljšanje ukusa ili boje.
[0245] Termin "razblaživač" odnosi se na sredstvo za razblaživanje i/ili razređivanje. Pored toga, termin "razblaživač" uključuje bilo koji ili više fluida, tečnosti ili čvrste suspenzije i/ili medijuma za mešanje. Primeri pogodnih razblaživača uključuju etanol, glicerol i vodu.
[0246] Termin "nosač" se odnosi na komponentu koja može biti prirodna, sintetička, organska, neorganska u kojoj je aktivna komponenta kombinovana da bi se olakšala, poboljšala ili omogućila primena farmaceutske kompozicije. Nosač kako se ovde koristi može biti jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih punilaca, razblaživača ili supstanci za kapsuliranje, koje su pogodne za primenu na subjekta. Pogodni nosači uključuju, bez ograničenja, sterilnu vodu, Ringer, Ringer laktat, sterilni rastvor natrijum hlorida, izotonični fiziološki rastvor, polialkilen glikole, hidrogenizovane naftalene i, posebno, biokompatibilne laktidne polimere, laktid/glikolid kopolimere ili polipoksietilen/polioksi-propilen kopolimere. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska uključuje izotonični fiziološki rastvor.
[0247] Farmaceutski prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili razblaživači za terapeutsku upotrebu su dobro poznati u farmaceutskoj struci i opisani su, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985).
[0248] Farmaceutski nosači, ekscipijensi ili razblaživači mogu se birati s obzirom na nameravani način primene i standardnu farmaceutsku praksu.
[0249] U jednom primeru izvođenja, ovde opisane farmaceutske kompozicije mogu se primenjivati intravenski, intraarterijski, subkutano, intradermalno ili intramuskularno. U određenim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je formulisana za lokalnu ili sistemsku primenu. Sistemska primena može uključivati enteralnu primenu, koja uključuje apsorpciju kroz gastrointestinalni trakt, ili parenteralnu primenu. Kako se ovde koristi, "parenteralna primena" se odnosi na primenu na bilo koji način osim kroz gastrointestinalni trakt, kao što je intravenska injekcija. U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutske kompozicije su formulisane za sistemsku primenu. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, sistemska primena je intravenskom primenom. Kompozicije se mogu injektirati direktno u tumor ili limfni čvor.
[0250] Termin "ko-primena" kako se ovde koristi označava postupak pomoću koga se različita jedinjenja ili kompozicije primenjuju na istog pacijenta. Na primer, CAR-modifikovane ćelije i ovde opisani antigen ili nukleinska kiselina koja ga kodira mogu se primenjivati istovremeno, u suštini u isto vreme, ili uzastopno. Ako se primena odvija uzastopno, CAR-modifikovane ćelije mogu se primenjivati pre ili posle primene antigena ili nukleinske kiseline koja ga kodira.
Ako se primena odvija istovremeno, CAR-modifikovane ćelije i antigen ili nukleinska kiselina koja ga kodira ne moraju da se primenjuju u okviru iste kompozicije. CAR-modifikovane ćelije i antigen ili nukleinska kiselina koja ga kodira mogu se primenjivati jednom ili više puta, a broj primena svake komponente može biti isti ili različit. Pored toga, CAR-modifikovane ćelije i antigen ili nukleinska kiselina koji ga kodira ne moraju da se primenjuju na istom mestu.
[0251] Termin "bolest" se odnosi na abnormalno stanje koje utiče na telo pojedinca. Bolest se često tumači kao medicinsko stanje povezano sa specifičnim simptomima i znacima. Bolest može biti uzrokovana faktorima koji potiču iz spoljašnjeg izvora, kao što su infektivne bolesti, ili može biti uzrokovana unutrašnjim disfunkcijama, kao što su autoimune bolesti. Kod ljudi se "bolest" često koristi u širem smislu za označavanje bilo kog stanja koje uzrokuje bol, disfunkciju, distres, socijalne probleme ili smrt pojedinca koji boluje, ili sličnih problema za one koji su u kontaktu sa pojedincem. U ovom širem smislu, ponekad uključuje povrede, invaliditet, poremećaje, sindrome, infekcije, izolovane simptome, devijantna ponašanja i netipične varijacije strukture i funkcije, dok se u drugim kontekstima i za druge svrhe mogu smatrati prepoznatljivim kategorijama. Bolesti obično pogađaju pojedince ne samo fizički, već i emocionalno, jer kontaktiranje i život sa mnogim bolestima može promeniti nečije stavove o životu i nečiju ličnost.
[0252] U sadašnjem kontekstu, termin "tretman", "lečenje" ili "terapeutska intervencija" odnosi se na upravljanje i negu subjekta u svrhu borbe protiv stanja kao što je bolest ili poremećaj. Termin ima za cilj da obuhvati pun spektar tretmana za dato stanje od kojeg subjekt pati, kao što je primena terapeutski efikasnog jedinjenja za ublažavanje simptoma ili komplikacija, za odlaganje progresije bolesti, poremećaja ili stanja, za ublažavanje ili olakšanje simptoma i komplikacija, i/ili za izlečenje ili eliminaciju bolesti, poremećaja ili stanja, kao i za preveciju stanja, pri čemu se prevencija treba shvatiti kao upravljanje i briga o pojedincu u svrhu borbe protiv bolesti, stanja ili poremećaja i uključuje primenu aktivnih jedinjenja radi sprečavanja pojave simptoma ili komplikacija.
[0253] Termin "terapeutski tretman" se odnosi na bilo koji tretman koji poboljšava zdravstveni status i/ili produžava (povećava) životni vek individue. Navedeno lečenje može eliminisati bolest kod individue, zaustaviti ili usporiti razvoj bolesti kod individue, inhibirati ili usporiti razvoj bolesti kod individue, smanjiti učestalost ili ozbiljnost simptoma kod individue, i/ili smanjiti recidiv kod individue koja trenutno ima ili je prethodno imala bolest.
[0254] Termini "profilaktički tretman" ili "preventivni tretman" se odnose na bilo koji tretman koji je namenjen da spreči pojavu bolesti kod individue. Termini "profilaktički tretman" ili "preventivni tretman" su ovde korišćeni naizmenično.
[0255] Termini "individua" i "subjekat" su ovde korišćeni naizmenično. Oni se odnose na čoveka ili drugog sisara (npr. miš, pacov, zec, pas, mačka, stoka, svinja, ovca, konj ili primat) koji mogu biti pogođeni ili su podložni bolesti ili poremećaju (npr., kancer), ali mogu ili ne moraju imati bolest ili poremećaj. U mnogim primerima izvođenja, individua je ljudsko biće. Ukoliko nije drugačije navedeno, termini "individua" i "subjekat" ne označavaju određenu starost, i stoga obuhvataju odrasle, starije osobe, decu i novorođenčad. U primerima izvođenja sadašnjeg otkrića, "individua" ili "subjekat" je "pacijent".
[0256] Termin "pacijent" označava individuu ili subjekta za lečenje, naročito obolele individue ili subjekta.
[0257] Kombinovane strategije u lečenju kancera mogu biti poželjne zbog rezultirajućeg sinergističkog efekta, koji može biti znatno jači od uticaja monoterapeutskog pristupa. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija se primenjuje sa imunoterapeutskim sredstvom. Kako se ovde koristi, "imunoterapeutsko sredstvo" se odnosi na bilo koje sredstvo koje može biti uključeno u aktiviranje specifičnog imunološkog odgovora i/ili imunološke efektorske funkcije. Ovo otkriće razmatra upotrebu antitela kao imunoterapeutskog sredstva. Bez želje da budu vezana za teoriju, antitela su sposobna da postignu terapeutski efekat protiv ćelija kancera kroz različite mehanizme, uključujući indukovanje apoptoze, blokiranje komponenti puteva transdukcije signala ili inhibiranje proliferacije tumorskih ćelija. U određenim primerima izvođenja, antitelo je monoklonsko antitelo.
[0258] Monoklonsko antitelo može indukovati ćelijsku smrt putem citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela (ADCC) ili vezati proteine komplementa, što dovodi do direktne ćelijske toksičnosti, poznate kao citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC). Neograničavajući primeri antitela protiv kancera i potencijalnih ciljnih mesta antitela (u zagradama) koji se mogu koristiti u kombinaciji sa ovim otkrićem uključuju: abagovomab (CA-125), abciksimab (CD41), adekatumumab (EpCAM), afutuzumab (CD20), alacizumab pegol (VEGFR2), altumomab pentetat (CEA), amatuksimab (MORAb-009), anatumomab mafenatoks (TAG-72), apolizumab (HLA-DR), arcitumomab (CEA), atezolizumab (PD-L1), bavituksimab (fosfatidilserin), bektumomab (CD22), belimumab (BAFF), bevacizumab (VEGF-A), bivatuzumab mertanzin (CD44 v6), blinatumomab (CD 19), brentuksimab vedotin (CD30 TNFRSF8), kantuzumab mertanzin (mucin CanAg), kantuzumab ravtanzin (MUC1), kapromab pendetid (ćelije karcinoma prostate), karlumab (CNT0888), catumaksomab (EpCAM, CD3), cetuksimab (EGFR), citatuzumab bogatoks (EpCAM), ciksutumumab (IGF-1 receptor), klaudiksimab (klaudin), klivatuzumab tetraksetan (MUC1), konatumumab (TRAIL-R2), dacetuzumab (CD40), dalotuzumab (receptor faktopra rasta I sličnog insulinu), denosumab (RANKL), detumomab (ćelija B-limfoma), drozitumab (DR5), ekromeksimab (GD3 gangliozid), edrecklomab (EpCAM), elotuzumab (SLAMF7), enavatuzumab (PDL192), ensituksimab (NPC-1C), epratuzumab (CD22), ertumaksomab (HER2/neu, CD3), etaracizumab (integrin ανβ3), farletuzumab (folatni receptor 1), FBTA05 (CD20), fiklatuzumab (SCH 900105), figitumumab (IGF-1 receptor), flanvotumab (glikoprotein 75), frezolimumab (TGF-β), galiksimab (CD80), ganitumab (IGF-I), gemtuzumab ozogamicin (CD33), gevokizumab (ILIβ), girentuksimab (karbonska anhidraza 9 (CA-IX)), glembatumumab vedotin (GPNMB), ibritumomab tiuksetan (CD20), ikrukumab (VEGFR-1), igovoma (CA-125), indatuksimab ravtanzin (SDC1), intetumumab (CD51), inotuzumab ozogamicin (CD22), ipilimumab (CD 152), iratumumab (CD30), labetuzumab (CEA), leksatumumab (TRAIL-R2), libivirumab (površinski antigen protiv hepatitisa B), lintuzumab (CD33), lorvotuzumab mertanzin (CD56), lukatumumab (CD40), lumiliksimab (CD23), mapatumumab (TRAIL-R1), matuzumab (EGFR), mepolizumab (IL5), milatuzumab (CD74), mitumomab (GD3 gangliozid), mogamulizumab (CCR4), moksetumomab pasudotoks (CD22), nacolomab tafenatoks (C242 antigen), naptumomab estafenatoks (5T4), namatumab (RON), necitumumab (EGFR), nimotuzumab (EGFR), nivolumab (IgG4), ofatumumab (CD20), olaratumab (PDGF-R a), onartuzumab (receptorna kinaza humanog faktora raspršivanja), oportuzumab monatoks (EpCAM), oregovomab (CA-125), okselumab (OX-40), panitumumab (EGFR), patritumab (HER3), pemtumoma (MUC1), pertuzuma (HER2/neu), pintumomab (antigen adenokarcinoma), pritumumab (vimentin), rakotumomab (N-glikolilneuraminska kiselina), radretumab (fibronektin ekstra domen-B), rafivirumab (glikoprotein virusa besnila), ramucirumab (VEGFR2), rilotumumab (HGF), rituksimab (CD20), robatumumab (IGF-1 receptor), samalizumab (CD200), sibrotuzumab (FAP), siltuksimab (IL6), tabalumab (BAFF), takatuzumab tetraksetan (alfa-fetoprotein), taplitumomab paptoks (CD 19), tenatumomab (tenascin C), teprotumumab (CD221), ticilimumab (CTLA-4), tigatuzumab (TRAIL-R2), TNX-650 (IL13), tositumomab (CD20), trastuzumab (HER2/neu), TRBS07 (GD2), tremelimumab (CTLA-4), tukotuzumab celmoleukin (EpCAM), ublituksimab (MS4A1), urelumab (4-1BB), volociksimab (integrin α5β1), votumumab (tumorski antigen CTAA 16.88), zalutumumab (EGFR) i zanolimumab (CD4).
[0259] Citiranje dokumenata i studija na koje se ovde poziva nije zamišljeno kao priznanje da je bilo šta od prethodnog relevantno u prethodnom stanju tehnike. Sve izjave u vezi sa sadržajem ovih dokumenata zasnovane su na informacijama dostupnim podnosiocima zahteva i ne predstavljaju nikakvo priznanje o ispravnosti sadržaja ovih dokumenata.
PRIMERI
[0260] Otkriće je dalje detaljno opisano pozivanjem na sledeće eksperimentalne primere. Ovi primeri su dati samo u svrhu ilustracije.
[0261] Bez daljeg opisa, veruje se da stručnjak iz date oblasti tehnike može, koristeći prethodni opis i sledeće ilustrativne primere, da napravi i upotrebi jedinjenja iz ovog otkrića i primeni postupke za koje se traži zaštita. Sledeći radni primeri stoga posebno ukazuju na poželjne primere izvođenja ovog otkrića i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje obima pronalaska definisanog u patentnim zahtevima.
Primer 1: Materijali i metode
[0262] Tehnike i metode koje se ovde koriste su ovde opisane ili se sprovode na način poznat sam po sebi i kako je opisano, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Sve metode, uključujući upotrebu kompleta i reagensa, sprovode se u skladu sa informacijama proizvođača osim ako nije posebno naznačeno.
Konstrukt CAR
[0263] Gama-retrovirusni samoinaktivirajući (SIN) vektor pES.12-6 je korišćen za stabilnu prekomernu ekspresiju CLDN6-CAR-BBz u humanim T ćelijama pod kontrolom unutrašnjeg eukariotskog promotora, kratke verzije promotora humanog elongacionog faktora 1-alfa (EFS - 213/+31). Vektorska kičma sadrži MLV sekvence divljeg tipa R- i U5-regiona na 5' i 3'-LTR, kao i region pakovanja (psi i psi+). Elementi pojačivača u U3-regiji 3'-LTR su eliminisani (uključujući CAAT-Box) i TATA-Box sekvenca je mutirana da bi se sprečilo pokretanje transkripcije. Skraćena verzija post-transkripcionog regulatornog elementa (PRE) virusa Woodchuck hepatitisa (WHV) se koristi za sprečavanje ekspresije neželjenih virusnih proteina.
[0264] CLDN6-CAR-BBz sadrži signalni peptid humanog IgG, jednolančani Fv-fragment antitela IMAB206 specifičnog za CLDN6 (Ganimed Pharmaceuticals) sa (G4S)3linkerom između teškog (VH) i lakog (VL) lanca koji sadrži supstituciju cisteina u serin na poziciji 46 VL(pozicija 45 VLprikazana na listi sekvenci). Fragment scFv je fuzionisan sa humanim CD8α zglobnim i transmembranskim regionom, a zatim humanim 4-1BB i humanim CD3zeta (Q14K) signalnim delovima.
Ćelijske linije i reagensi
[0265] Humana ćelijska linija teratoma PA-1-SC12_A0201_luc_gfp koja eksprimira CLDN6 je kultivisana u medijumu MEM-GlutaMAX sa dodatkom 10% (v/v) FCS (Biochrom), 1 mM natrijum piruvat (Gibco), 1 mM MEM rastvor neesencijalnih aminokiselina (Gibco) i 2% (v/v) rastvor natrijum bikarbonata (Gibco). Ćelijska linija prekomerno eksprimira HLA-A*0201, luciferazu i GFP.
[0266] Ćelijska linija karcinoma jajnika OV-90-SC12 je kultivisana u 41.5% (v/v) MCDB 105 medijumu (Sigma-Aldrich), 41.5% (v/v) medijumu 199 (Sigma Aldrich) dopunjenom sa 15% (v/v) FCS i 2% (v/v) 7.5% rastvora natrijum bikarbonata.
[0267] Medijum za kulturu ćelijske linije humanog melanoma SK-MEL-37 se sastoji od 90% DMEM GlutaMAX<™>(Gibco) dopunjen sa 10% (v/v) FCS.
[0268] Medijum za kulturu MDA-MB-231 se sastoji od 88% (v/v) RPMI 1640 GlutaMAX<™>(Gibco) i dopunjen je sa 10% FCS, 1 mM natrijum piruvatom, 1 mM MEM rastvorom neesencijalnih aminokiselina.
[0269] Ćelijska linija humanog adenokarcinoma 23132-87 i ćelijska linija humanog melanoma MEL-526 kultivisana je u 90% (v/v) RPMI 1640 GlutaMAX<™>(Gibco) dopunjen sa 10% (v/v) toplotno inaktivirani FCS.
[0270] Podloga za kulturu HEK-293 se sastojala od 90% (v/v) Eagle-ovog minimalnog esencijalnog medijuma (EMEM) (ATCC) i 10% (v/v) FCS.
[0271] SKOV-3 je kultivisan u 90% (v/v) McCoy-evom 5A medijumu (ATCC) dopunjenim sa 10% (v/v) FCS.
[0272] Humana ćelijska linija jajnika NIH-OVCAR-3 kultivisana je u 80% (v/v) RPMI 1640 GlutaMAX<™>
[0273] (Gibco, kat-br. 61870) dopunjen sa 20% (v/v) FCS i 0.1% (v/v) insulina (Sigma-Aldrich).
[0274] Humane tumorske ćelijske linije LCLC-103H, COLO-699-N, JAR i NEC-8 kultivisane su u 90% (v/v) RPMI 1640 GlutaMAX<™>(Gibco) dopunjenim sa 10% (v/v) FCS.
[0275] Sejanje i/ili cepanje ćelijskih linija je vršeno svaka 2 ili 3 dana.
Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i dendritske ćelije (DC)
[0276] PBMC su izolovane pomoću Ficoll<®>-Hypaque (1.077 g/mL Amersham Biosciences) centrifugiranjem sa gradijentom gustine iz „buffy coats“. Monociti su obogaćeni anti-CD14 mikrokuglicama (Miltenyi Biotec). Nezrele DC (iDC) su diferencirane po kulturi u DC medijumu koji se sastoji od RPMI 1640 GlutaMAX<™>, 100 U/mL penicilina, 100 µg/mL streptomicina, 1 mM natrijum piruvata, neesencijalne aminokiseline i 5% (v/v) toplotno inaktivirani humani AB serum (svi iz Invitrogena, Karlsrue, Germany) dopunjen sa 1000 U/mL h GM-CSF (Essex, Lucerne, Switzerland) i 1000 U/mL h IL-4 (Strathmann Biotech, Hamburg, Germany).
Transdukcija T ćelija
[0277] T ćelije su obogaćene iz PBMC magnetnom separacijom CD3<+>/CD28<high+>T ćelija upotrebom Dynabeads<®>humanog T-ekspandera CD3/CD28 CTS. Ćelije su inkubirane sa kuglicama do CD3<+>odnosa T ćelija od tri prema jedan i odvojene pomoću CTS DynaMag magneta. Obogaćene T ćelije su uzgajane u medijumu X-VIVO 15 sa dodatkom 5% (v/v) humanog seruma u prisustvu 450 U/mL rh IL-7 i 50 U/mL rh IL-15 (oba iz Miltenyi Biotec). Tri dana kasnije CD3/CD28 kuglice su uklonjene pomoću magneta i prethodno aktivirane T ćelije su transducirane retrovirusnim vektorima u prisustvu Protransduzin<®>-A u konačnoj koncentraciji od 25 µg/mL. Ćelije su proširene do 7. ili 10. dana u kompletnom medijumu kulture i direktno su korišćene za procenu površinske ekspresije CAR, fenotipa T ćelija i efektorskih funkcija ili su bile krio-konzervirane.
Protočne citometrijske analize in vitro kultivisanih ćelija
[0278] Ekspresija ćelijske površine transdukovanih CAR je analizirana upotrebom idiotipspecifičnog antitela konjugovanog sa Alexa-Fluor-647 (Ganimed Pharmaceuticals) koje prepoznaje scFν fragment sadržan u svim CLDN6-CAR konstrukcijama. Površinska ekspresija CLDN6 na ciljnim ćelijama je analizirana bojenjem sa Alexa-Fluor647-konjugovanim CLDN6-specifičnim antitelom IMAB027 (Ganimed Pharmaceuticals). Merenje protočne citometrije je izvedeno na FACSCanto<™>II protočnim citometrom upotrebom FACSDiva<™>softvera (BD Biosciences) i analiza je izvršena pomoću FlowJo<™>V10 (treestar inc.).
Kvantitativni PCR u realnom vremenu (qRT-PCR)
[0279] Ukupna RNK je izolovana iz naznačenih ćelijskih linija upotrebom RNeasy<®>Mini kompleta (QIAGEN). Za reverznu transkripciju RNK u cilju dobijanja cDNK za qRT-PCR, PrimeScript<™>RT komplet reagensa sa gDNK gumicom (TAKARA) je korišćen počevši od 1 µg ukupne RNK. Kvantitativni PCR u realnom vremenu je izveden upotrebom QuantiTect SYBR<®>zelenog PCR kompleta (QIAGEN) sa sledećim prajmerima (5'-3'): CLDN6-for: CTT ATC TCC TTC GCA GTG CAG, CLDN6-rev: AAG GAG GGC GAT GAC ACA GAG, HPRT1-for: TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA, HPRT1-rev: GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT (temperatura žarenja: 62°C).
xCELLigence test citotoksičnosti
[0280] Za procenu citotoksičnosti posredovane CAR korišćen je sistem qCELLigence (OMNI Life Science). Merenja impedanse ćelijskog indeksa (CI) su obavljena prema uputstvima dobavljača. Optimalna gustina ćelija koja rezultira eksponencijalnom krivom rasta određena je za svaku ćelijsku liniju tumora. Ciljne ćelije su zasejane u koncentracijama od 2-10<4>ćelija po bunarčiću u E-ploči 96 PET (ACEA Biosciences Inc.). Posle 24 h različiti broj T ćelija transdukovanih sa CAR dodat je u konačnoj zapremini od 200 µL i praćen svakih 30 minuta tokom perioda do 48 h pomoću qCELLigence sistema.
[0281] Procenat specifične lize je izračunat na sledeći način:
(CI Lmin– CIuzorka)/CI Lminx 100
[0282] Standardna devijacija je izračunata na sledeći način:
100 X (CIuzorka/ CI Lmin) x {√ [(STDEV CIuzorka/CIuzorka)<2>+ (STDEV CI Lmin/CI Lmin)<2>]}
[0283] Maksimalni ćelijski indeks koji odgovara minimalnoj lizi (Lmin) je procenjen nakon inkubacije ciljnih ćelija sa efektorskim T ćelijama koje eksprimiraju kontrolni antigen (npr. eGFP, kontrolni-CAR).
CFSE (karboksifluorescein sukcinimidil estar) test proliferacije
[0284] Da bi se odredio procenat proliferirajućih T ćelija nakon antigen-specifične stimulacije, T ćelije koje eksprimiraju CAR su obeležene sa 1.6 µM fluorescentne boje karboksifluorescein diacetat sukcinimidil estra (CFSE) tokom 10 minuta na 37 °C (zaštićeno od svetlosti). Da bi se uklonila bilo kakva slobodna boja, čisti FCS je dodat ćelijama i inkubiran još 5 minuta. Ćelije su isprane, resuspendovane u medijumu kulture i kokultivisane sa ciljnim ćelijama upotrebom različitih odnosa efektora i cilja (E:T) u ukupnoj zapremini od 200 µL DC medijuma u pločama sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Posle 5 dana ko-kulture, ćelije su obojene fluorohromkonjugovanim antitelima usmerenim npr. protiv CD4, CD8 i CAR. Procenat proliferirajućih T ćelija je analiziran protočnom citometrijom na osnovu progresivnog prepolovljenja fluorescencije CFSE unutar ćerki ćelija nakon ćelijskih podela upotrebom BD FACSCanto<™>II protočnog citometra (Becton Dickinson).
Sferoidni test (IncuCyte<®>)
[0285] Sferoidi tumora su generisani kultivisanjem 1×10<4>PA1-SC12-A2-eGFP ćelija po bunarčiću u MEM-GlutaMAX medijumu dopunjenim sa 10% (v/v) FCS, 1% (v/v) Na-Piruvatom, 1% (v/v) MEM NEAA i 2% (v/v) Na-bikarbonatom u Corning<®>Costar<®>Ultra-Low Attachment ploči sa 96 bunarčića sa okruglim dnom u trajanju od 48 h nakon centrifugiranja. Dodate su CAR T ćelije (1×10<5>/bunarčiću) i sferoidi tumora koji eksprimiraju eGFP su snimljeni pri 4-strukom uvećanju i vremenu ekspozicije od 300 ms da bi se otkrila zelena fluorescencija u sistemu za snimanje u živom sadržaju IncuCyte Zoom (Essen Bioscience) na 37 °C, pet % CO2. Slike su dobijane svakog sata tokom 10 dana. Podaci su analizirani upotrebom softvera za analizu IncuCyte da bi se otkrio i kvantitativno odredio ukupni intenzitet zelenog objekta (GCU × µm<2>/slici). Proseci broja zelenih objekata sa SD u svakoj vremenskoj tački su nacrtani upotrebom softvera za analizu IncuCyte.
Generisanje in vitro transkribovane (IVT) iRNK
[0286] In vitro transkripcije iRNK koje kodiraju antigen bile su zasnovane na plazmidnim kičmama pST1-T7-GG-hAg-MCS-2hBg-A30LA70 i izvedenim DNK konstruktima. Ovi plazmidni konstrukti sadrže pored ORF pune dužine 5' humani α-globin, dva serijska 3' humana β-globina UTR i poli(A) rep od 100 nukleotida, sa linkerom posle 70 nukleotida. iRNK koje kodiraju antigen su generisane pomoću in vitro transkripcija kako su opisali Holtkamp S. et al. (2006) Blood 108(13):4009-17. In vitro transkripcija svih opisanih iRNK konstrukata je izvršena u BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH.
Generisanje lipozomalno formulisanog antigena koji kodira IVT RNK (RNK(LIP)) i in vitro transfekcija dendritskih ćelija
[0287] Kompleksiranje antigena koji kodira IVT RNK sa lipozomima je prethodno opisano u Kranz et al (2016) Nature 534(7607):396-401. Korišćen je odnos naelektrisanja od 1.3 prema 2 katjonske DOTMA i RNK. Pored DOTMA, lipidna frakcija sadrži pomoćni lipid DOPE u molarnom odnosu 2:1 DOTMA po DOPE.
Eksperimentalne tehnike na životinjama
Životinje
[0288] Od devet do 21 nedelje stare ženke miševa sa imunodeficijencijom NOD.Cg-Prkdc<scid>/l2rg<tm1Wjl>/SzJ (NSG) su korišćene za in vivo studije. Parovi za uzgoj su nabavljeni od Jackson laboratorije (Bar Harbour, ME, SAD) i uzgajani u objektu za životinje BioNTech AG, Nemačka. C57BL/6BrdCrHsd-Tyr<c>miševi su kupljeni od Envigo Labs. Tokom eksperimenata su korišćene životinje koje su odgovarale starosti (8-10 nedelja) i polu (muški ili ženski). Kongeni CS7BI/6-Thy1.1 miševi su uzgajani u objektu za životinje BioNTech AG, Nemačka. Svi eksperimenti su izvedeni u uslovima bez specifičnih patogena (SPF) i prema nemačkim propisima za eksperimentisanje na životinjama.
Transplantacija tumorskih ćelija
[0289] 5×10^6 OV90-SC12 ili 5×10^5 CT26 tumorskih ćelija je subkutano ubrizgano (u 100 µL PBS) u desni bok leđa miševa. Praćenje rasta tumora i izračunavanje zapremine su određeni pomoću kalipera i ubačeni u formulu V = 1⁄2 (dužina × širina<2>). Pre adoptivnog transfera humanih CAR-konstruisanih T ćelija, oni koji nose tumor su stratifikovani upotrebom Danielsovog XL Toolbox dodatka za Microsoft Excel da bi se postigla ogromna distribucija zapremine tumora između različitih grupa tretmana.
Adoptivni ćelijski transfer (ACT) humanih T ćelija
[0290] Različite količine ukupnih humanih T ćelija transdukovanih gama-retrovirusom (broj i učestalost T ćelija koje eksprimiraju CAR ili GFP transgen su naznačene na odgovarajućim slikama) intravenski su ubrizgane u retrobularni pleksus u 200 µL PBS. U zavisnosti od eksperimentalnog okruženja, bilo koje transdukovane T ćelije su direktno korišćene posle in vitro postupka aktivacije i transdukcije ili kriokonzervirane transdukovane T ćelije su odmrznute i direktno prebačene nakon 2 puta ispiranja sa PBS u miševe, respektivno. Vijabilnost svakog T ćelijskog proizvoda korišćenog u eksperimentu bila je >90%.
Praćenje humanih CAR T ćelija in vivo u krvi
[0291] U naznačenim vremenskim tačkama 50 µL periferne krvi je izvučeno iz retro-orbitalne vene i sakupljeno u epruvete koje sadrže heparin (Sarstedt). Crvena krvna zrnca su lizirana upotrebom BD FACS rastvora za liziranje (BD). Ekspresija CAR na površini prenetih humanih T ćelija je analizirana upotrebom hCD45-PE-Cy7 (HI30, BD), hCD4-APC-Cy7 (OKT4, BioLegend), hCD8-BV421 (RPA-T8, BD) i Alexa-Fluor 647- konjugovano idiotip-specifično antitelo (Ganymed Pharmaceuticals). Mrtve ćelije su izdvojene iz analize upotrebom 7-AAD (Beckmann Coulter). Merenje protočne citometrije je izvedeno na FACSCanto<™>II protočnom citometru upotrebom FACSDiva<™>softvera (BD Biosciences) i analiza je izvršena pomoću FlowJo<®>V10 (Treestar inc.).
Manipulacija retrovirusnim genom i priprema CAR T ćelija za adoptivni transfer T ćelija
[0292] Splenociti bilo naivnog C57BI/6-Thy1.1+ ili Balb/c-Thy1.1+ su izolovani i prethodno aktivirani pomoću Dynabeads<™>mišjeg T-aktivatora CD3/CD28 u odnosu kuglica prema T ćelijama od 1:1 (Invitrogen) u prisustvu 5 ng/mL rekombinantnog humanog (rh) IL-7 i 5 ng/mL rh IL-15 (Miltenyi Biotec). Za transdukciju mišjih ćelija, MLV-E-pseudotipovani retrovirusni supernatanti su stavljeni na RetroNectin (2 µg/cm<2>)-obložene kulturom bez tkiva tretirane ploče sa bunarčićima prema uputstvu proizvođača (Takara Bio Inc., Otsu, Japan), sa 3 ponovljena ciklusa punjenja virusa i centrifugiranja (1300 xg, 15 °C, 15 min) za pojačano vezivanje.24h nakon pre-aktivacije, 0.5-0.6×10<6>ćelija/cm<2>je istaloženo centrifugiranjem (300 x g, 37 °C, 1 h) na bunarčiće obložene virusnim česticama. Posle kultivacije preko noći, ponovljena je transdukcija sa taloženjem putem centrifurianja sa pločama obloženim svežim virusnim česticama. 72h nakon pre-aktivacije, Dynabeads<™>mišji T-aktivator CD3/CD28 je uklonjen iz kulture i ćelije su proširene u prisustvu 5 ng/mL rh IL-7 i 5 ng/mL rh IL-15. Nakon čišćenja fikolom, ćelije su dva puta isprane sa PBS da bi se uklonili serumski proteini i zatim su pripremljene za adoptivni ćelijski transfer (ACT). Retrovirusni vektori zasnovani na pES12.6 koji sadrže CLDN6-CAR-BBz kodiraju takođe pojačanu luciferazu svica (effLuc; Rabinovich et al.BA, PNAS (2008) PNAS 105(38):14342-6) i eGFP (pojačani protein zelene fluorescencije) reporter gen, koji je eksprimiran odvojeno upotrebom 2A-splajs elemenata (Szymczak et al. AL, Nature Biotechnology, (2004) Nat Biotechnol.22(5):589-94) su korišćeni za transdukciju.
Adoptivni prenos mišjih T ćelija i RNK(LIP)vakcinacija
[0293] Gama-retrovirusno transdukovane CAR kongene Thyi1.1<+>T ćelije su intravenski (i.v.) prebačene u celo telo ozračeno (XRAD320) C57BL/6BrdCrHsd-Tyr<c>ili BALB/c donorskih miševa, respektivno. Nakon toga, miševi su intravenski (i.v.) vakcinisani sa F12:RNK odnosom od 1.3 : 2 RNK koja kodira antigen(LIP)u različitim vremenskim tačkama nakon ACT. CAR in vivo ekspanzija je analizirana putem bioluminiscencije celog tela, a antitumorska efikasnost je analizirana praćenjem tumora.
In vivo snimanje luciferaze (BLI)
[0294] Ekspanzija i raspodela CAR-effLuc-GFP transdukovanih T ćelija je procenjena pomoću in vivo bioluminiscentnog snimanja pomoću IVIS Lumina sistema za snimanje (Caliper Life Sciences). Ukratko, ubrizgan je vodeni rastvor D-luciferina (80 mg/kg telesne težine; Perkin Elmer) i.p. u naznačenim vremenskim tačkama nakon adaptivnog transfera transdukovanih T ćelija. 5 minuta nakon toga, emitovani fotoni su kvantitativno određeni (vreme integracije od 1 min, bining 8). In vivo bioluminiscencija u regionima od interesa (ROI) je kvantitativno određena kao ukupni fluks (fotona/sek) upotrebom IVIS Living Image 4.0 softvera. Intenzitet prenete svetlosti koja potiče od ćelija koje eksprimiraju luciferazu unutar životinje predstavljen je kao slika u sivim tonovima, gde je crna boja najmanje intenzivna, a bela do tamno siva najintenzivniji signal bioluminiscencije. Referentne slike miševa u nijansama sive su dobijene pod LED slabom osvetljenju. Slike su postavljene pomoću softvera Living Image 4.0.
Statistička analiza i prikaz podataka
[0295] Svi rezultati su predstavljeni srednjom vrednošću /- SD tehničkih ponovaka ili srednjom vrednošću /- SEM bioloških ponovaka. Broj ponovljenih uzoraka je naveden u opisu slike za svaki eksperiment. Nespareni dvostrani studentov t-test je korišćen za poređenje površine ispod krive (AUC) dve grupe. Sve statističke analize su obavljene upotrebom GraphPad PRISM 6.04. *** P ≤ 0.001, **** P ≤ 0.0001.
Primer 2: Generisanje i in vitro karakterizacija CAR specifičnih za CLDN6
[0296] Za selekciju strukture elektroda generisali smo različite CAR kičme koje sve dele isti scFv fragment poreklom iz CLDN6-specifičnog antitela IMAB206-C46S, ali se razlikuju po svojim zglobnim i kostimulatornim domenima (Slika 1A). Kako se pokazalo da kostimulacija 4-1BB povećava postojanost i antitumorsku efikasnost CAR T ćelija, uključili smo 2. i 3. generaciju CAR kičmi koje sadrže 4-1BB endodomen. Alternativno ili kao dodatak modifikovani CD28 domen (Kofler D.M. et al., (2011) Molecular Therapy 19 (4), 760-767) je ugrađen za koji je poznato da isporučuje CD28 posredovanu kostimulaciju na konstruisanu T ćeliju u odsustvu agonističkih CD28 liganada kao što su B7.1 i B7.2. Fragmenti scFv su spojeni sa 4-1BB ili CD28 kostimulatornim domenima bilo preko modifikovanog IgG Fc (Hombach A. et al., (2010) Gene Therapy 17, 1206-1213) ili zglobnog regiona CD8α.
[0297] Različiti CLDN6-CAR su opsežno okarakterisani in vitro zbog njihovog potencijala da osetljivo i specifično prepoznaju i ubiju tumorske ćelije koje eksprimiraju CLDN6. Između ostalih eksperimenata, izveden je test tumorskog sferoida upotrebom CAR-transdukovanih T ćelija u kombinaciji sa eGFP koji eksprimiraju PA1 tumorske sferoide. Zaista, ubrzana liza tumorskih sferoida koji eksprimiraju CLDN6 pomoću 4-1BB koji sadrže CAR u poređenju sa CAR koji nosi CD28 domen mogla bi se otkriti pomoću IncuCyte<®>snimanja u realnom vremenu (slika 1B).
[0298] Na osnovu rezimea rezultata različitih studija funkcionalne karakterizacije izabrali smo CLDN6-CAR-CD8h-BBz kao vodeću strukturu za pretklinička i klinička ispitivanja jer smo mogli da pokažemo visoko specifično i osetljivo prepoznavanje CLDN6, kao i visok potencijal za preživljavanje i ponovljivu stimulaciju konstruisanih CAR T ćelija. Važno je da je ova CAR kičma već uspešno korišćena u nekoliko ispitivanja CD19-CAR T ćelija. Za stabilnu integraciju našeg CLDN6-CAR u genom T ćelija izabrali smo γ-retrovirusni samoinaktivirajući (SIN) vektor pES12.6 za stabilnu integraciju terapeutskog CLDN6-CAR u genom T ćelija (Loew et al., Gene Therapy (2010) 17, 272-280).
Primer 3: Osetljivost CLDN6-CAR-BBz
[0299] Da bi se detaljnije analizirala osetljivost CAR posredovanog prepoznavanja, sproveden je eksperiment titracije CLDN6-RNK. U tom cilju, CLDN6-negativna ćelijska linija karcinoma pluća Colo699-N je transfektovana sa titriranim količinama CLDN6-RNK, CLDN6-CAR posredovana liza ciljnih ćelija je procenjena xCELLigence testom citotoksičnosti. Ekspresija površine CLDN6-CAR na transdukovanim T ćelijama (Slika 2A) i nivoi ekspresije CLDN6 proteina na transfektovanim Colo699-N ćelijama (Slika 2B) procenjeni su protočnom citometrijom nakon bojenja sa CLDN6-CAR- i CLDN6-specifičnim antitelima. Specifično ubijanje CLDN6-RNK-transficiranih ciljnih ćelija od strane T ćelija koje eksprimiraju CLDN6-CAR može se primetiti u zavisnosti od doze CLDN6-RNK koja se koristi za transfekciju Colo699-N ćelija u korelaciji sa brojem CLDN6 molekula na površini ciljne ćelije kako je procenjeno protočnom citometrijom (slika 2C). CAR T ćelije su čak posredovale u lizi, ako je veoma mali broj CLDN6 molekula bio eksprimiran na površini ciljne ćelije nakon transfekcije od samo 0.01 µg CLDN6-RNK, koje je bilo teško detektovati protočnom citometrijom.
Primer 4: Bezbednost CLDN6-CAR-BBz
[0300] Da bi se procenila bezbednost CLDN6-CAR-BBz, izvršen je skrining test ćelijske linije. U tom cilju CLDN6-CAR-BBz-transdukovane T ćelije (Slika 3A) su kultivisane sa panelom CLDN6-pozitivnih i CLDN6-negativnih tumorskih ćelijskih linija različitog porekla tkiva (Slika 3B) i prepoznavanje i liza ciljnih ćelija je analizirana pomoću xCELLigence testa citotoksičnosti (Slika 3C). Paralelno, nivo ekspresije CLDN6-iRNK i proteina u ciljnim ćelijskim linijama je procenjen pomoću qRT-PCR i protočne citometrije, respektivno (Slika 3D, E). Moglo bi se pokazati da je prepoznavanje i liza ciljnih ćelijskih linija u strogoj korelaciji sa nivoima ekspresije CLDN6 iRNK i proteina.
Primer 5: Proliferacija CAR T ćelija
[0301] Suštinski preduslov za antitumorsku efikasnost T ćelija konstruisanih sa CLDN6-CAR-BBz je njihova sposobnost da se razmnožavaju i opstaju u pacijentu. Da bi se analiziralo, da li CLDN6-CAR T ćelije efikasno proliferišu kao odgovor na CLDN6 ektopično eksprimiran u iDC, izveden je CFSE-baziran in vitro test kokulture. CLDN6-CAR-transdukovane T ćelije su obeležene sa CFSE i zajedno kultivisane sa autolognim iDC transfektovanim sa titriranim količinama RNK lipopleksa (RNA(LIP)) koji kodira ili CLDN6 ili kontrolni antigen. Površinska ekspresija CLDN6-CAR na T ćelijama i CLDN6 na ciljnim ćelijama verifikovana je protočnom citometrijom (Slika 4A, B). Posle pet dana ko-kulture, antigen-specifična proliferacija CD4+ i CD8+ T ćelija obeleženih sa CFSE koje eksprmiraju CAR je analizirana protočnom citometrijom (slika 4C).
[0302] CLDN6-CAR posredovana proliferacija zavisna od doze koja korelira sa količinom transfektovane CLDN6-RNK(LIP), dok bi se mogla posmatrati samo pozadinska proliferacija, ako su iDC transfektovani sa kontrolnom RNK(LIP). Ovi podaci potvrđuju da je efikasno antigen-specifično proširenje CLDN6-CAR-BBz T ćelija indukovano nakon antigen-specifične stimulacije.
Primer 6: In vivo antitumorska efikasnost CLDN6-CAR-BBz
[0303] Nakon što je CAR-posredovana antigen-specifična indukcija efektorskih funkcija in vitro, ispitivan je terapeutski potencijal humanih CLDN6-CAR-BBz T ćelija in vivo u naprednom modelu tumora ksenotransplantata. U toj meri, imunodeficijentnim NOD.Cg-NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) miševima su subkutano translatirane ćelije humanog karcinoma jajnika koje endogeno eksprimiraju CLDN6 (OV90). NSG miševi koji nose tumor OV90 su zatim tretirani jednom dozom od 1 × 10<7>CLDN6-CAR ili eGFP transdukovanih T ćelija (približno 5×10<8>T ćelija/kg) primenjenih i.v. (Slika 5 A). CLDN6-CAR je eksprimiran na oko 16-18% humanih CD4<+>i CD8<+>T ćelija (slika 5B). Treba napomenuti da je adoptivni transfer CLDN6-CAR T ćelija doveo do potpune regresije velikih tumora sa prosečnom zapreminom tumora od 170 mm<3>na dan adoptivnog transfera, dok se u kontrolnoj grupi nije mogao primetiti antitumorski efekat (Slika 5C). Ovaj značajan antitumorski efekat korelirao je sa postojanošću CLDN6-CAR-BBz T ćelija u perifernoj krvi tretiranih miševa (Slika 5D).
Primer 7: In vitro funkcionalnost kratkotrajnih i dugotrajnih kultivisanih CAR T ćelija
[0304] Pošto je ponovljiva proizvodnja visokokvalitetnih proizvoda CAR T ćelija kliničkog kvaliteta preduslov za kliničko testiranje, GMP proizvodni postupak je optimizovan da bi se postigla visoka efikasnost transdukcije i dovoljan broj i kvalitet T ćelija koje eksprimiraju CLDN6-CAR. Postupak transdukcije je takođe pojednostavljen smanjenjem broja transdukcija sa dve na jednu i skraćenjem ex vivo vremena kultivacije od 10 do 7 dana. Pokazalo se da T ćelije kultivisane u kratkom vremenskom periodu pokazuju poboljšanu efikasnost u poređenju sa dugotrajno proširenim, iscrpljenim T ćelijama (PMID: 30030295). Shodno tome, skraćenje vremena kultivacije ne samo da štedi vreme i troškove, već što je najvažnije treba da dovede do povećanog potencijala konstruisanih T ćelija da se prošire i opstanu u pacijentu.
[0305] Da bi se uporedila in vitro antitumorska efikasnost kratkotrajnih (7 dana) i dugotrajnih (10 dana) kultivisanih CLDN6-CAR-BBz T ćelija, sproveden je dugotrajni sferoidni eksperiment. Procena površinske ekspresije CAR pomoću protočne citometrije otkrila je skoro uporedive nivoe ekspresije CAR, dok je učestalost CAR-pozitivnih T ćelija bila nešto niža u uzorku T ćelija kultivisanih 7 dana (Slika 6A). Da bi se analizirao potencijal za ponavljajuće ubijanje, CAR T ćelije su zajedno kultivisane sa CLDN6 i eGFP koji eksprimiraju PA1-SC12-A2-eGFP tumorske sferoide, a ubijanje tumorskih sferoida je praćeno u realnom vremenu na osnovu eGFP signala pomoću IncuCyte<®>sistema. Nakon potpune eradikacije tumorskog sferoida, dodat je novi tumorski sferoid (Slika 6B). Moglo bi se pokazati da kratkotrajno kultivisane CAR T ćelije imaju uporediv potencijal za ponovljeno ubijanje kao i dugotrajno kultivisane T ćelije.
Primer 8: In vivo funkcionalnost odmrznutih GMP-proizvedenih CAR T ćelija
[0306] Pošto postupak GMP transdukcije namenjen kliničkoj upotrebi generiše kriokonzervirani CAR T ćelijski proizvod, bilo je od suštinskog značaja da se potvrdi antitumorski potencijal odmrznutih CLDN6-CAR-BBz T ćelija konstruisanih u GMP postrojenju. Pored toga, kako bi se konačni GMP proizvodni postupak mogao skratiti (sakupljanje 7. umjesto 10. dana), ova modifikacija u konačnom protokolu je morala biti procenjena sprovođenjem in vivo studija. Što je najvažnije, odmrznute humane CLDN6-CAR-BBz T ćelije pokazale su značajnu antitumorsku efikasnost uporedivu sa sveže generisanim CAR T ćelijama i eliminisale uznapredovale tumore sa prosečnom zapreminom tumora od 160 mm<3>u modelu ksenotransplantata karcinoma jajnika (Slika 7A). Pored toga, CAR T ćelije sakupljene 7. ili 10. dana koje su pokazale sličnu površinsku ekspresiju CAR (Slika 7B) upoređene su u pogledu njihove antitumorske efikasnosti u ovom eksperimentu (Slika 7C). U korelaciji sa rezultatima dugotrajnog eksperimenta sa tumorskim sferoidom, oba proizvoda CAR T ćelija su posredovala u potpunom odbacivanju tumora sa uporedivom kinetikom. Antitumorski odgovori oba proizvoda bili su u korelaciji sa postojanošću CLDN6-CAR-BBz T ćelija u perifernoj krvi dve nedelje nakon adoptivnog transfera (Slika 7D).
Primer 9: Povećana postojanost CLDN6-CAR-BBz transdukovanih T ćelija
[0307] Klinički uspeh adoptivno prenete tumor reaktivne T ćelijske terapije je takođe u pozitivnoj korelaciji sa postojanošću tih ćelija in vivo (Robbins et al. (2004) J Immunol.
173(12):7125-30, Huang et al. (2005) 28(3):258-67). Zbog toga smo analizirali da li in situ izloženost antigenu može poboljšati postojanost CLDN6-CAR-BBz T ćelija in vivo. Pošto model ksenotransplantata nije dovoljan za proučavanje dugoročne postojanosti CAR T ćelija zbog bolesti transplantata protiv domaćina humanih T ćelija na mišja tkiva, kao i nedostatka konkurentskih endogenih imunih ćelija, studije perzistentnosti CLDN6-CAR-BBz T ćelija su sprovedene u mišjem singenom modelu miša. Zbog toga su mišje T ćelije koje koeksprimiraju luciferazu CLDN6-CAR-BBz CAR transdukovane u blago iritirane (2.5 Gy) miševe, nakon čega je usledila ponovljena primena RNK(LIP)koji kodiraju ili CLDN6 ili kontrolni antigen i proširenje populacije CAR T ćelija je praćeno sekvencijalno bioluminiscentnim imidžingom (Slika 8 A).
[0308] CLDN6-CAR-BBz T ćelije su sposobne da opstanu (preko 3 meseca) in vivo nakon ponovljene vakcinacije lipozomalno formulisanim CAR antigenom in vivo. CART ćelije nestaju tokom vremena u kontrolnoj grupi, dok antigen specifične restimulisane CAR T ćelije proliferišu nakon svakog RNK(LIP)tretmana, čak i nakon pauze tretmana od 3-4 nedelje nakon ciklusa pojačavanja od 3° i 4° (Slika 8 B i C). Ovi podaci pokazuju da BioNTech-ova RNK(LIP)tehnologija podržava adekvatnu aktivaciju i proliferaciju T ćelija CLDN6-CAR-BBz pružanjem prirodne kostimulacije in situ, što takođe dovodi do povećane postojanosti proširenih CLDN6-CAR-BBz T ćelija in vivo.
Primer 10: Poboljšana antitumorska aktivnost in vivo proširenih CLDN6-CAR-BBz T ćelija
[0309] Nakon što je CAR-posredovano antigen-specifično proširenje i perzistencija demonstrirana, postavilo se pitanje da li in vivo-proširene CLDN6-CAR-BBz T ćelije takođe pokazuju povećan antitumorski potencijal u poređenju sa ne-proširenim parnjacima. U tu svrhu Balb/c miševi inokulisani sa ćelijskom linijom karcinoma debelog creva CT26 koja eksprimira CLDN6<dim>su tretirane umerenom dozom od 1×10<6>CLDN6-CAR-BBz ili Control-CAR-BBz transdukovanih mišjih T ćelija (3-4×10<5>T ćelija koje eksprimiraju CAR). Posle i.v. primene CAR T ćelija, miševi su primili dodatnu vakcinaciju sa 20 µg RNK(LIP)koja kodira CLDN6 pune dužine ili kontrolni antigen pune dužine (Slika 9A). Nije primećen antitumorski efekat kod životinja tretiranih Control-CAR-BBz tretiranih sa CLDN6-RNK(LIP)i samo blaga regresija tumora se mogla postići kada su miševi tretirani umerenom dozom CLDN6-CAR-BBz T ćelija u kombinaciji sa nerelevantnom ctrl RNK(LIP). Međutim, miševi koji su primili kombinaciju umerene doze CAR T ćelija zajedno sa CLDN6-RNK(LIP)vakcinacijom za postizanje in vivo proširenja CLDN6-CAR-BBz T ćelija pokazala je značajno pojačanu regresiju tumora (Slika 9B).
Primer 11: Vraćena antitumorska efikasnost male doze in vivo proširenih CAR T ćelija
[0310] Pored potencijala in vivo proširenja CAR T ćelija na bazi RNK(LIP)radi poboljšanja tekućeg antitumorskog odgovora, takođe bi se moglo pokazati da je ova tehnologija dobro prilagođena za obnavljanje antitumorskog potencijala nedovoljne doze CAR T ćelija. Miševi koji nose tumor tretirani su 10 puta manjom dozom CAR T ćelija nego što je potrebna za odbacivanje tumora (Slika 10A). Dok je rast tumora primećen kod miševa tretiranih kontrolnom RNK(LIP), sve životinje su pokazale odbacivanje tumora koje su primile RNK(LIP)koja kodira CAR antigen nakon inicijalne transplantacije (Slika 10C). Shodno tome, učestalost transplantiranih CAR T ćelija u perifernoj krvi bila je značajno veća nakon vakcinacije (Slika 10D). Kompenzacija nedovoljne doze CAR T ćelija nakon transplantacije dodatnim tretmanom sa RNK(LIP)da bi se postiglo in vivo proširenje može biti veoma korisna za najmanje dva različita scenarija: 1) slab prinos proizvoda CAR T ćelija proizvedenih od GMP (npr. zbog niskog broja limfocita u početnoj aferezi ili drugih razloga na koje se ne može uticati) ili 2) izbegavanje SAE smanjenjem početne doze CAR T ćelija (naročito ako je poznato da potrebni CAR izaziva toksičnost ili u slučaju prve studije eskalacije doze kod ljudi).

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Molekul himernog antigenskog receptora (CAR) specifičan za CLDN6, naznačen time što CAR molekul sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36.
2. Nukleinska kiselina koja kodira CAR molekul prema patentnom zahtevu 1.
3. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 2, koja je DNK ili RNK.
4. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 2 ili 3.
5. Vektor prema patentnom zahtevu 4, naznačen time što je vektor izabran iz grupe koja se sastoji od DNK vektora, RNK vektora, plazmida, lentivirusnog vektora, adenovirusnog vektora i retrovirusnog vektora.
6. Vektor prema patentnom zahtevu 4 ili 5, koji dalje sadrži promotor.
7. Vektor prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je promotor izabran od promotora EF-1, promotora CMV IE gena, promotora EF-1α, promotora ubikvitina C ili promotora fosfoglicerat kinaze (PGK).
8. Imuna efektorska ćelija, koja sadrži:
molekul CAR prema patentnom zahtevu 1;
nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 2 ili 3; ili
vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 7,
pri čemu imuna efektorska ćelija je T ćelija, poželjno humana T ćelija.
9. Imuna efektorska ćelija prema patentnom zahtevu 8, koja je CD8+ T ćelija.
10. Populacija imunih efektorskih ćelija koja sadrži višestruke imunološke efektorske ćelije prema patentnom zahtevu 8 ili 9.
11. Imuna efektorska ćelija prema patentnom zahtevu 8 ili 9 ili populacija imunih efektorskih ćelija prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što ćelije nemaju ekspresiju ili imaju nisku ekspresiju funkcionalnog TCR ili funkcionalnog HLA.
12. Ex vivo postupak pripreme imune efektorske ćelije ili populacije imunih efektorskih ćelija kao što su definisane u bilo kom od patentnih zahteva 8 do 11, koji sadrži uvođenje nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 2 ili 3 ili vektora prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 7 u imunu efektorsku ćeliju, pod uslovima takvim da se eksprimira molekul CAR.
13. Imuna efektorska ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 8, 9 ili 11, ili populacija imunih efektorskih ćelija prema patentnom zahtevu 10 ili 11 za upotrebu kao lek, naime za lečenje bolesti povezane sa ekspresijom CLDN6.
14. Imuna efektorska ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 8, 9 ili 11, ili populacija imunih efektorskih ćelija prema patentnom zahtevu 10 ili 11 za upotrebu u postupku lečenja kancera povezanog sa ekspresijom CLDN6, poželjno pri čemu je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od kancera jajnika, kancera pluća, kancera želuca, kancera dojke, kancera jetre, kancera pankreasa, kancera kože, melanoma, kancera glave i vrata, sarkoma, kancera žučnih kanala, kancera bubrežnih ćelija i kancera mokraćne bešike.
RS20250008A 2019-02-08 2020-02-05 Ćelije modifikovane himerinim antigenskim receptorima za lečenje kancera koji eksprimiraju cldn6 RS66364B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP2019053156 2019-02-08
EP20702482.9A EP3920939B1 (en) 2019-02-08 2020-02-05 Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6-expressing cancers
PCT/EP2020/052867 WO2020161186A1 (en) 2019-02-08 2020-02-05 Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6-expressing cancers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66364B1 true RS66364B1 (sr) 2025-01-31

Family

ID=69374312

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250008A RS66364B1 (sr) 2019-02-08 2020-02-05 Ćelije modifikovane himerinim antigenskim receptorima za lečenje kancera koji eksprimiraju cldn6

Country Status (26)

Country Link
US (1) US20220184119A1 (sr)
EP (2) EP4501351A3 (sr)
JP (2) JP7663500B2 (sr)
KR (1) KR20210124237A (sr)
CN (1) CN113727720A (sr)
AU (1) AU2020217868A1 (sr)
BR (1) BR112021015429A2 (sr)
CA (1) CA3129140A1 (sr)
CL (1) CL2021002067A1 (sr)
CO (1) CO2021010347A2 (sr)
CU (1) CU20210067A7 (sr)
DK (1) DK3920939T3 (sr)
ES (1) ES3002958T3 (sr)
FI (1) FI3920939T3 (sr)
HR (1) HRP20250016T1 (sr)
HU (1) HUE070174T2 (sr)
IL (1) IL285122A (sr)
LT (1) LT3920939T (sr)
MX (1) MX2021009507A (sr)
PL (1) PL3920939T3 (sr)
PT (1) PT3920939T (sr)
RS (1) RS66364B1 (sr)
SG (1) SG11202108339TA (sr)
SI (1) SI3920939T1 (sr)
SM (1) SMT202500012T1 (sr)
WO (1) WO2020161186A1 (sr)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021129927A1 (en) * 2019-12-23 2021-07-01 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Treatment with immune effector cells engineered to express an antigen receptor
WO2024046572A1 (en) * 2022-09-01 2024-03-07 BioNTech SE Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6 expressing cancer
JP2024545154A (ja) * 2021-12-09 2024-12-05 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア Ｃｌｄｎ６発現がんの処置のためのキメラ抗原受容体改変細胞
CN114478802B (zh) * 2022-01-28 2023-05-26 郑州大学 一种嵌合抗原受体及其应用
CN114410588B (zh) * 2022-01-29 2022-11-04 西安电子科技大学 一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用
CN119654342B (zh) * 2022-07-28 2025-07-18 乐普创一生物科技（上海）有限公司 抗MerTK抗体及其用途
WO2024022512A1 (en) * 2022-07-29 2024-02-01 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Claudin-6 binding moieties and uses thereof
CN120225555A (zh) * 2022-10-25 2025-06-27 恺兴生命科技(上海)有限公司 抗体及其应用
WO2025184170A1 (en) 2024-02-27 2025-09-04 Overt Bio, Inc. Methods and compositions for improving t cell function in an immunosuppressive environment

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003516124A (ja) 1999-10-15 2003-05-13 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 標的とした遺伝的干渉の手段としてのｒｎａ干渉経路遺伝子
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
WO2015090230A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
SI3126381T2 (sl) * 2014-04-01 2022-05-31 Biontech Cell&Gene Therapies Gmbh Claudin-6-specifični imunoreceptorji in t-celični epitopi
MA40921A (fr) * 2014-11-05 2017-09-12 Abbvie Stemcentrx Llc Récepteurs antigéniques chimériques anti-cldn et procédés d'utilisation
CN106146666B (zh) * 2015-03-26 2019-09-06 科济生物医药（上海）有限公司 靶向cldn6的免疫效应细胞及其制备方法和应用
WO2016180467A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Enhancing the effect of car-engineered t cells by means of nucleic acid vaccination
CA3076337A1 (en) * 2017-09-19 2019-03-28 Massachusetts Institute Of Technology Compositions for chimeric antigen receptor t cell therapy and uses thereof
CN109206524B (zh) * 2018-09-25 2022-04-05 山东兴瑞生物科技有限公司 抗Claudin18A2嵌合抗原受体、其修饰的T细胞及T细胞制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
IL285122A (en) 2021-09-30
ES3002958T3 (en) 2025-03-10
CA3129140A1 (en) 2020-08-13
KR20210124237A (ko) 2021-10-14
BR112021015429A2 (pt) 2021-10-05
CN113727720A (zh) 2021-11-30
CU20210067A7 (es) 2022-03-07
AU2020217868A1 (en) 2021-08-12
PT3920939T (pt) 2025-01-08
US20220184119A1 (en) 2022-06-16
CO2021010347A2 (es) 2022-01-17
FI3920939T3 (fi) 2025-01-03
SMT202500012T1 (it) 2025-03-12
CL2021002067A1 (es) 2022-03-11
HRP20250016T1 (hr) 2025-03-14
JP2025060882A (ja) 2025-04-10
EP4501351A3 (en) 2025-05-07
EP3920939A1 (en) 2021-12-15
EP3920939B1 (en) 2024-11-13
JP2022520059A (ja) 2022-03-28
HUE070174T2 (hu) 2025-05-28
MX2021009507A (es) 2021-09-08
JP7663500B2 (ja) 2025-04-16
LT3920939T (lt) 2025-01-10
SG11202108339TA (en) 2021-08-30
PL3920939T3 (pl) 2025-02-17
EP4501351A2 (en) 2025-02-05
WO2020161186A1 (en) 2020-08-13
SI3920939T1 (sl) 2025-03-31
DK3920939T3 (da) 2025-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3920939B1 (en) Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6-expressing cancers
JP7648530B2 (ja) Ｃａｒ操作されたｔ細胞およびサイトカインを含む治療
JP7775078B2 (ja) 免疫エフェクタ細胞の特異的活性化のためのインターロイキン２受容体（ｉｌ２ｒ）およびインターロイキン２（ｉｌ２）バリアント
US20230000962A1 (en) Treatment involving immune effector cells genetically modified to express antigen receptors
RU2826058C2 (ru) Модифицированные клетки с химерным антигеновым рецептором для лечения рака, экспрессирующего CLDN6
US20250025505A1 (en) Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6 expressing cancer
HK40122808A (en) Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6-expressing cancers
HK40068564A (en) Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6-expressing cancers
HK40068564B (en) Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6-expressing cancers
WO2024046572A1 (en) Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6 expressing cancer
RU2832154C2 (ru) Варианты рецептора интерлейкина-2 (il2r) и интерлейкина-2 (il2) для специфической активации иммунных эффекторных клеток
HK40065151A (en) Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6-expressing cancers