RS66261B1 - Postupci za određivanje razlika u aktivnosti alfa-4 integrina uspostavljanjem korelacije sa razlikama u nivoima svcam i/ili smadcam - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovde je opisan postupak praćenja promene u aktivnosti alfa-4 integrina kod pojedinca, uspostavljanjem korelacije između te aktivnosti i nivoa solubilnog molekula, gde je taj solubilni molekul vaskularni ćelijski adhezioni molekul (sVCAM) i/ili solubilni mukozni adresinski ćelijski adhezioni molekul (sMAdCAM).

OSNOV PRONALASKA

[0002] Na zapaljenski odgovor vaskularizovanih tkiva na infekciju ili povredu utiče adhezija leukocita na endotelne ćelije krvnih sudova i njihova infiltracija u okolna tkiva. Prilikom normalnog zapaljenskog odgovora, leukociti koji se infiltriraju, oslobađaju toksične medijatore, fagocitiraju otpatke i mrtve ćelije, i igraju ulogu pri obnavljanju tkiva i u imunskom odgovoru. Međutim, kod patološkog zapaljenja, leukociti koji se infiltriraju imaju prenaglašen odgovor i mogu da uzrokuju ozbiljno ili fatalno oštećenje. Integrini pripadaju familiji površinskih glikoproteina koji su uključeni u ćelijsku adheziju, migraciju i aktivaciju imunskih ćelija. Leukociti u cirkulaciji eksprimiraju integrin alfa-4 koji obrazuje heterodimerne receptore u sadejstvu sa integrinskom subjedinicom, bilo beta-1 ili beta-7. Kako dimeri alfa-4 beta-1 (α4β1, ili vrlo kasni antigen-4 (VLA-4)), tako i dimeri alfa-4 beta-7 (α4β7), igraju ulogu u migraciji leukocita kroz vaskularni endotel i doprinose aktivaciji i preživljavanju ćelija u parenhimu.

[0003] Alfa-4 beta-1 dimer vezuje se za vaskularni ćelijski adhezioni molekul-1 (VCAM-1), koga eksprimira vaskularni endotel na mnogim mestima hroničnog zapaljenja. Alfa-4 beta-7 dimer interaguje sa mukoznim adhezionim ćelijskim molekulom adresinom (MAdCAM-1) i posreduje pri migraciji limfocita u creva.

[0004] Adhezioni molekuli kao što su alfa-4 integrini, predstavljaju potencijalne ciljne molekule za lečenje patološkog i hroničnog zapaljenja. Antizapaljenski potencijal inhibitora alfa-4 integrina testiran je i in vitro i in vivo u životinjskim modelima. In vitro eksperimenti pokazuju da inhibitori alfa-4 integrina blokiraju vezivanje limfocita za aktivirane endotelne ćelije. Eksperimenti u kojima je testiran efekat inhibitora alfa-4 integrina u životinjskim modelima kod kojih je veštački indukovano stanje koje simulira multiplu sklerozu (MS), eksperimentalni autoimunski encefalomijelitis (EAE), pokazali su da inhibitori anti alfa-4 integrina sprečavaju zapaljenje mozga i posledičnu paralizu kod životinja. Slično tome, pokazano je da inhibitori alfa-4 integrina štite od intestinalnog zapaljenja u životinjskim modelima zapaljenskih bolesti creva (IBD). Zajedno, ovi eksperimenti identifikuju inhibitore alfa-4 integrina kao potencijalno korisna terapeutska sredstva za bolesti povezane sa patološkim i hroničnim zapaljenjem, kao što su MS i IBD.

[0005] Međutim, efikasan i pouzdan način za proučavanje farmakokinetike i farmakodinamike sredstava koja inhibiraju alfa-4 integrin, ne postoji. Trenutno dostupni postupci uobičajeno uključuju (1) merenje zasićenja receptora i modulatorno smanjenje receptora u uzorcima sveže krvi pomoću protočne citometrije, ili (2) prebrojavanje limfocita u sveže sakupljenim uzorcima krvi. Oba postupka se oslanjaju na analizu svežih uzoraka istog dana, što može da bude nepogodno prilikom analize kliničkih uzoraka. Pored toga, za ove postupke se ne smatra da predstavljaju naročito senzitivnu meru funkcionalne inhibicije alfa-4 integrina. Nedavno, kod Millonig et al., J. Neuroimmunol. 227: 190-194 (2010) je izneto zapažanje da kod MS pacijenata, 4 nedelje nakon primene natalizumaba, dolazi do statistički značajnog smanjenja solubilnog VCAM-1 (sVCAM). Natalizumab je humanizovano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za α-lanac alfa-4 integrina. Millonig et al. su zaključili da je nivo sVCAM dostigao stabilno stanje nivoa inhibicije četiri nedelje nakon prve primene natalizumaba. Iako su Millonig et al. izneli pretpostavku da bi sVCAM mogao da bude oruđe za praćenje efikasnosti lečenja, Millonig et al. priznali su i da i dalje ostaje da se rasvetli, kako klinička korist uočene korelacije, tako i njen biološki značaj.

[0006] Štaviše, Oppermann et al., J. Neurologija 257: S.220 (2010) je pokazao smanjenje četiri solubilana molekula adhezije (sICAM-1, -2, -3 i sVCAM-1) tokom tretmana natalizumabom. WO 2011/137418 otkriva smanjenje nivoa sVCAM-1 i sMAdCAM-1 u mišijoj plazmi nakon inhibicije alfa-4 beta-1 i alfa-4 beta-7 integrina sa jedinjenjem formule (I) i ELN 476063.

[0007] U skladu sa tim, u ovoj oblasti i dalje postoji potreba da se razviju efikasniji i precizniji postupci, npr. identifikacija i upotreba pouzdanog biomarkera, kako bi se procenile farmakokinetika i farmakodinamika inhibitora α4 integrina, koji može da se primenjuje za lečenje različitih zapaljenskih i autoimunskih bolesti.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

[0008] Inhibicija aktivnosti alfa-4 integrina, bilo antitelima ili malim molekulima, u korelaciji je sa smanjenjem nivoa sVCAM i/ili sMAdCAM u telesnim tečnostima. Smanjenje nivoa sVCAM i/ili sMAdCAM je dozno zavisno i može da se uoči u okviru vremena merenog danima ili čak satima. Pored toga, korelacija između inhibicije alfa-4 integrina i smanjenih nivoa sVCAM i/ili sMAdCAM uočava se kod zdravih pojedinaca, baš kao i kod obolelih, i stoga ne zavisi od stanja bolesti. U skladu sa tim, sVCAM i/ili sMAdCAM mogu da se koriste kao farmakodinamički biomarkeri za biološku aktivnost sredstva kao što je antitelo ili lek koji modulira aktivnost alfa-4 integrina. Farmakodinamički i farmakokinetički parametri modulatora alfa-4 integrina mogu, tako, da se odrede, imajući u vidu in vivo biološku aktivnost modulatora, bez potencijalnog ometanja inaktivnim metabolitima modulatora, na primer. Bolja karakterizacija ovih parametara omogući će, na primer, tačnije režime doziranja za modulatore alfa-4 integrina, što može maksimalno da redukuje potencijalno štetne sporedne efekte.

[0009] Shodno tome, pronalazak se odnosi na in vitro postupak određivanja razlike u aktivnosti alfa-4 integrina kod osobe sa autoimunom bolešću, koji obuhvata:

a) merenje solubilnog molekula u prvom biološkom uzorku telesne tečnosti odabrane iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma i plazme i dobijenim od pojedinca neposredno pre primene inhibitora alfa-4 integrina;

b) merenje solubilnog molekula u drugom biološkom uzorku, pri čemu je drugi biološki uzorak odabran iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma i plazme i dobijen je od pojedinca u roku od trideset i jednog dana nakon primene inhibitora alfa-4 integrina;

c) određivanje da li postoji smanjenje nivoa solubilnog molekula između prvog i drugog biološkog uzorka, pri čemu je smanjenje u korelaciji sa smanjenjem aktivnosti alfa-4 integrina kod pojedinca, čime se utvrđuje da li postoji razlika u aktivnosti alfa-4 integrina kod pojedinca nakon primene inhibitora alfa-4 integrina u poređenju sa stanjem pre primene inhibitora alfa-4 integrina;

gde je solubilni molekul sVCAM i/ili sMAdCAM, i gde je autoimuna bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od multiple skleroze (MS), meningitisa, encefalitisa, zapaljenske bolesti creva, reumatoidnog artritisa (RA), astme, ateroskleroze, nefritisa, atopijskog dermatitisa, psorijaze, eritemskog lupusa i epilepsije.

[0010] Drugi biološki uzorak može da se dobije, na primer, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ili 31 dan nakon što je pojedinac tretiran inhibitorom alfa-4 integrina. U jednom primeru izvođenja, drugi biološki uzorak se dobija od pojedinca jedan dan nakon primene inhibitora alfa-4 integrina.

[0011] Postupak može dalje da obuhvata detektovanje smanjenja nivoa solubilnog molekula u drugom biološkom uzorku u poređenju sa prvim biološkim uzorkom, i pripisivanje navedenog smanjenja smanjenju aktivnosti alfa-4 integrina kod pojedinca nakon primene inhibitora alfa-4 integrina, u poređenju sa stanjem pre primene inhibitora alfa-4 integrina. Osim toga, postupak može dalje da obuhvata utvrđivanje da li je potrebno prilagođavanje u lečenju pojedinca, pri čemu odsustvo smanjenja ili smanjenje koje nije statistički značajno (p > 0,05) u nivoima solubilnog molekula u prvom i drugom biološkom uzorku ukazuje na neefikasan odgovor na inhibitor alfa-4 integrina koji zahteva prilagođavanje lečenja kod pojedinca. Opciono, postupak može dalje da obuhvata detekciju odsustva smanjenja ili detekciju smanjenja koje nije statistički značajno (p > 0,05), u nivou solubilnog molekula u drugom biološkom uzorku u poređenju sa prvim biološkim uzorkom, i zaključak da je prilagođavanje tretmana kod pojedinca potrebno. Prilagođavanje lečenja može da obuhvata zamenu inhibitora drugim inhibitorom alfa-4 integrina ili povećanje doze inhibitora alfa-4 integrina.

[0012] U jednom aspektu, aktivnost alfa-4 integrina može da bude aktivnost alfa-4 beta-1 integrina, i solubilni molekul je sVCAM. U drugom aspektu, aktivnost alfa-4 integrina je aktivnost alfa-4 beta-7 integrina, pri čemu je solubilni molekul sMAdCAM.

[0013] Osoba kod koje je primenjen inhibitor alfa-4 integrina ima autoimunu bolest odabranu iz grupe koja se sastoji od multiple skleroze (MS), meningitisa, encefalitisa, zapaljenske bolesti creva, reumatoidnog artritisa (RA), astme, ateroskleroze, nefritisa, atopijskog dermatitisa, psorijaze, eritemskog lupusa i epilepsije. Inhibitor alfa-4 integrina može da bude antitelo. Prvi i/ili drugi biološki uzorak je telesna tečnost odabrana iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma i plazme. Prvi i/ili drugi biološki uzorak može da bude u obliku zamrznute plazme ili seruma. Solubilni molekul u biološkim uzorcima može da se meri postupkom odabranim iz grupe koja se sastoji od enzimskih imunosorbentnih testova (ELISA), radioimunoloških testova (RIA), Western blotinga i testova za detekciju proteina na bazi mikro-zrnaca.

[0014] Takođe je obezbeđena in vitro upotreba sVCAM i/ili sMAdCAM kao farmakodinamičkih biomarkera za aktivnost (i) alfa-4 integrina ili (ii) modulatora aktivnosti alfa-4 integrina. Aktivnost alfa-4 integrina može da bude aktivnost alfa-4 beta-1 integrina, a farmakodinamički biomarker može da bude sVCAM ili aktivnost alfa-4 integrina može da bude aktivnost alfa-4 beta-7 integrina, a farmakodinamički biomarker može da bude sMAdCAM. Modulator aktivnosti alfa-4 integrina može da bude inhibitor alfa-4 integrina, na primer, antitelo. In vitro upotreba sVCAM i/ili sMAdCAM kao farmakodinamičkih biomarkera za aktivnost može da bude od koristi kod pojedinca koji se leči modulatorom aktivnosti alfa-4 integrina. Pojedinac može da ima bolest ili poremećaj povezan sa patološkim ili hroničnim zapaljenjem. Bolest ili poremećaj povezan sa patološkim ili hroničnim zapaljenjem može da se odabere iz grupe koja se sastoji od multiple skleroze (MS), meningitisa, encefalitisa, zapaljenske bolesti creva, reumatoidnog artritisa (RA), astme, akutnog juvenilnog dijabetesa, AIDS demencije, ateroskleroze, nefritisa, retinitisa, atopijskog dermatitisa, psorijaze, ishemije miokarda, hroničnog prostatitisa, komplikacija srpaste anemije, eritemskog lupusa i akutnog oštećenja pluća posredovanog leukocitima.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0015] Prateći crteži su inkorporirani u specifikaciju i obezbeđuju neograničavajuću ilustraciju različitih primera izvođenja. Na crtežima:

SL. 1 prikazuje primere inhibitora alfa-4 integrina (jedinjenja A-D) koji su korišćeni u primerima.

SL. 2 prikazuje smanjene nivoe sVCAM u različitim modelima bolesti kod pacova tretiranih inhibitorima alfa-4 integrina čiji su molekuli mali. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u primeru 1.

SL. 3 prikazuje smanjene nivoe sVCAM kod normalnih pacova tretiranih inhibitorima alfa-4 integrina čiji su molekuli mali. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u primeru 2. SL. 4 prikazuje smanjene nivoe sVCAM kod normalnih miševa tretiranih inhibitorima alfa-4 integrina, čiji su molekuli mali. Čini se da tretman normalnih miševa inhibitorima alfa-4 integrina ne utiče na nivo solubilnog unutarćelijskog adhezivnog molekula (sICAM). Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u primeru 3.

SL. 5 prikazuje da efekat inhibitora alfa-4 integrina na smanjenje količine sVCAM zavisi od doze i da je u korelaciji sa drugim markerima inhibicije alfa-4 integrina. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u primeru 4.

SL. 6 prikazuje smanjene nivoe sVCAM kod miševa tretiranih inhibitornim antitelom alfa-4 integrina. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u primeru 5.

SL. 7 prikazuje smanjene nivoe sVCAM kod miševa tretiranih nepegilovanim inhibitorom alfa-4 integrina, čiji je molekul mali. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u primeru 6.

SL. 8 prikazuje da efekti inhibicije alfa-4 integrina na nivoe sVCAM zavise od doze i da se gube kada nivoi alfa-4 integrina u plazmi opadaju. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u primeru 7.

SL. 9 prikazuje da inhibicija alfa-4 integrina dovodi do smanjenja sMAdCAM kod nekoliko mišijih modela kolitisa. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u primeru 8.

SL. 10 prikazuje da inhibicija alfa-4 integrina inhibitorom čiji je molekul mali, dovodi do smanjenja količine sMAdCAM kod normalnih miševa. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u primeru 9.

SL. 11 prikazuje da inhibicija alfa-4 integrina inhibitornim antitelom dovodi do smanjenja količine sMAdCAM kod normalnih miševa. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u primeru 10.

SL. 12 prikazuje da smanjenje količine sMAdCAM inhibitorima alfa-4 integrina zavisi od doze, da je reverzibilno i da je u korelaciji sa in vitro selektivnošću inhibitora alfa-4 integrina za alfa-4 beta-7 integrinski heterodimer. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u primeru 11.

SL. 13 prikazuje selektivno smanjenje količine sVCAM selektivnim vezivanjem inhibitora alfa-4 integrina za alfa-4 beta-1 integrinski heterodimer. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u primeru 11.

SL. 14 prikazuje korelaciju između nivoa sVCAM/sMAdCAM i nivoa alfa-4 integrinskog antitela kod miševa. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u primeru 12.

DETALJAN OPIS

1. Definicije

[0016] „Pojedinac", kako se ovde koristi, može da bude bilo koja od sisarskih životinja (npr. pripitomljene životinje), uključujući čoveka, psa, mačku, stoku, konja, kozu, prase, svinju, ovcu, majmuna, pacova i miša. Pojedinac može da bude čovek.

[0017] Izraz „patološko i hronično zapaljenje", kako se ovde koristi, odnosi se na neodgovarajue zapaljenje povezano sa poremećajima koji uključuju, ali nisu ograničeni na, astmu, aterosklerozu, AIDS demenciju, dijabetes, zapaljensku bolest creva, reumatoidni artritis, odbacivanje transplanta, bolest kalem protiv domaćina, multiplu sklerozu (posebno kod MS koja uključuje dalju demijelinizaciju), na primer, primarnu progresivnu multiplu sklerozu (PPMS), sekundarnu progresivnu multiplu sklerozu (SPMS), recidivno-remitentnu multiplu sklerozu (RRMS) i progresivnu recidivnu multiplu sklerozu (PRMS), metastazu tumora, nefritis, atopijski dermatitis, psorijazu, ishemiju miokarda, hronični prostatitis, komplikacije srpaste anemije, eritemski lupus i akutno oštećenje pluća posredovano leukocitima. Ovakvo zapaljenje karakteriše pojačani odgovor inflamatornih ćelija, uključujući infiltrirane leukocite. Vremenom, ovakvo patološko zapaljenje često dovodi do oštećenja tkiva u predelu neodgovarajuće upale.

[0018] Izraz „aktivnost alfa-4 integrina", kako se ovde koristi, odnosi se na dostupnu količinu alfa-4 integrina, uključujući i alfa-4 beta-1 i alfa-4 beta-7 dimere, prezentovane na površini ćelije leukocita. Aktivnost alfa-4 integrina može da se odredi pomoću bilo koje metode poznate u stanju tehnike. Na primer, aktivnost alfa-4 integrina može da se proceni direktno pomoću citometrije, upotrebom florescentno obeleženog antitela specifičnog za alfa-4 integrine.Videti, npr. SAD patent br. 7,807,167. Alternativno, aktivnost alfa-4 integrina može indirektno da se proceni merenjem infiltracije leukocita u uzorcima tkiva.Videti, npr. SAD patent br. 7,435,802; videti takođe Krumbholz et al., Neurology 71: 1350-1354 (2008).

[0019] Izraz "biološki uzorak", kako se ovde koristi, odnosi se na biološki materijal od pojedinca. Biološki uzorak može da bude, u smislu neograničavajućeg primera, tkivo, ćelija, puna krv, serum, telesne tečnosti, plazmatična tečnost, uzorak autoptičkog tkiva (npr. mozak, koža, limfni čvor, kičmena moždina), gajene ćelije ili supernatanti dobijeni od gajenih ćelija. Upotrebljeni biološki uzorak variraće u zavisnosti od formata testa, postupka detekcije i prirode uzorka koji se testira. Postupci za pripremu bioloških uzoraka su dobro poznati u stanju tehnike i mogu lako da se prilagode tako da se dobije biološki uzorak koji je kompatibilan sa postupkom koji se koristi.

[0020] Izraz „telesna tečnost" koji se ovde koristi, uključuje tečnosti koje se nalaze kod pojedinaca. One uključuju tečnosti koje se izbacuju iz tela ekskrecijom ili sekrecijom, kao i tečnosti koje normalno ne podležu ni ekskreciji ni sekreciji. Ove tečnosti uključuju, kao neograničavajuće primere, vodeni humor, krv, serum, intersticijsku tečnost, limfu, sluz, pleuralnu tečnost, pljuvačku, plazmu, urin, spermu, suze, sinovijalnu tečnost, tečnost iz rana i/ili cerebrospinalnu tečnost. U predmetnim primerima izvođenja koristi se krv, uključujući krvni serum i krvnu plazmu.

[0021] Izrazi "posebno se vezuje" ili "specifično vezuje" kao što se ovde koristi, znači da jedan član specifičnog vezujućeg para neće pokazati bilo kakvo statistički značajno vezivanje za molekule, osim za svog specifičnog partnera za vezivanje. Partner za vezivanje može da pokaže najmanje 1000 puta veći afinitet vezivanja (mereno kao prividna konstanta asocijacije) za svog specifičnog partnera u vezivanju u odnosu na nespecifičnog vezujućeg partnera. Na primer, za antitela koja se vezuju za alfa-4 integrin sa afinitetom vezivanja od 10<7>mola/L ili više, obično 10<8>mola/l ili više, kaže se da se specifično vezuju za alfa-4 integrin.

[0022] Izraz "dijagnostički kit", kako se ovde koristi, uobičajeno uključuje sistem za detekciju sa različitim paketima dijagnostičkih antitela i/ili reagenasa koji su neophodni za kvantitativnu i/ili kvalitativnu procenu biomarkera. Kitovi obično sadrže uputstva za upotrebu reagenasa i/ili dijagnostičkih antitela. Antitela, kao i bilo koji reagens, mogu da budu obezbeđena u obliku tečnosti, praška, tablete ili suspenzije. Antitela i/ili reagensi mogu da budu obezbeđeni u odvojenim pakovanjima pogodnim za odvojenu primenu.

[0023] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje koje uobičajeno imaju za stručnjaka u oblasti. Mora se napomenuti da kako se ovde koriste, oblici jednine imenica uključuju i odnosne pojmove u množini, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca na „antitelo" uključuje mnoštvo takvih antitela, a upućivanje na „doziranje" uključuje referencu na jednu ili više doza i njihovih ekvivalenta poznatih stručnjacima u oblasti, i tako dalje.

2. Inhibitori alfa-4 integrina

[0024] U predmetnim primerima izvođenja mogu da se koriste različiti tipovi inhibitora alfa-4 integrina koji imaju sposobnost da se vežu za i inhibiraju aktivnost alfa-4 integrina. Mnogi takvi inhibitori su identifikovani i okarakterisani, a reprezentativni primeri su opisani u daljem tekstu. S obzirom na ovde prikazana saznanja, u okviru veštine stručnjaka u oblasti je da identifikuje druge inhibitore alfa-4 integrina koji će biti u stanju da inhibiraju dimere koji sadrže alfa-4 integrin na način koji biološki oponaša ili je sličan specifičnim opisanim inhibitorima. Takvi inhibitori i njihove kombinacije mogu da se primenjuju hronično.

2.1. Antitela ili imunološki aktivni fragmenti

[0025] Inhibitori alfa-4 integrina mogu da budu antitela ili njihovi imunološki aktivni fragmenti koji se selektivno vezuju za alfa-4 integrin ili za dimer koji sadrži alfa-4, kao što je alfa-4 beta-1 ili alfa-4 beta-7. Reprezentativna alfa-4 integrinska antitela su poznata u stanju tehnike, uključujući, na primer, (1) natalizumab, prikazan u SAD patentima br. 5,168,062, 5,385,839, 5,730,978, 5,840,299, 6,033,665 i 6,602,503, (2) CD49d antitela koja proizvodi firma Biolegend (San Diego, CA); i (3) PS/2 koji predstavlja pacovsko anti-mišije antitelo na alfa-4 (PS/2 hibridom može da se nabavi od ATCC (Rockville, MD)). Neograničavajući primeri alfa-4 integrinskih antitela uključuju antitela prikazana u SAD patentima br.5,565,332, 5,733,743, 5,837, 242, 5,858,657, 5,871,734, 5,871,907, 5,872,215, 5,885,793, 5,888,507, 5,932,214, 5,969,108, 6,140,471, 6,172,197, 6,180,336, 6,225,447 i 7,176,184.

[0026] U jednom primeru izvođenja, inhibitor alfa-4 integrina može da bude monoklonsko antitelo. Antitelo može da bude hemijski modifikovano, npr. pegilacijom. Osim toga, druga antitela mogu da se identifikuju pomoću tehnika dostupnih u ovoj oblasti. Na primer, antitela koja su u stanju da se specifično vezuju za alfa-4 integrin, mogu da se proizvedu upotrebom tehnologije prikaza na površini faga. Zatim mogu da se izoluju fragmenti antitela koji se selektivno vezuju za alfa-4 integrin ili dimer koji sadrži alfa-4 integrin. Primeri postupaka za proizvodnju takvih antitela putem prikaza na površini faga, prikazani su, na primer, u SAD patentu br.6,225,447.

[0027] Monoklonska antitela takođe mogu da se proizvedu upotrebom uobičajenih hibridoma metoda. Ove metode se široko primenjuju za proizvodnju hibridnih ćelijskih linija koje luče visoke nivoe monoklonskih antitela protiv brojnih specifičnih antigena, a takođe mogu da se koriste za proizvodnju monoklonskih antitela koja su sposobna da se specifično vezuju za alfa-4 integrine. Na primer, miševi (npr. Balb/c miševi) mogu da se imunizuju antigenim epitopom alfa-4 integrina, posredstvom intraperitonealne injekcije. Nakon što je prošlo dovoljno vremena da bi se omogućio imuni odgovor, miševi su žrtvovani, a ćelije slezine dobijene i fuzionisane sa ćelijama mijeloma, koristeći tehnike dobro poznate u ovoj oblasti. Dobijene fuzionisane ćelije, hibridomi, zatim se gaje u selektivnom medijumu, a ćelije koje preživljavaju se gaje u takvom medijumu koristeći ograničavajuće uslove razblaženja. Posle kloniranja i ponovnog kloniranja, hibridomi se mogu izolovati u cilju sekrecije antitela (na primer, klase IgG ili IgM ili potklase IgG1), koja se selektivno vezuju za ciljni alfa-4 integrin ili dimer koji sadrži alfa-4 integrin. Da bi se proizvela sredstva specifična za ljudsku upotrebu, izolovana monoklonska antitela mogu zatim da se koriste za proizvodnju himernih i humanizovanih antitela.

[0028] Antitela koja mogu da se koriste kao inhibitori alfa-integrina uključuju, ali nisu ograničena na, poliklonska, monoklonska, multispecifična, humana, humanizovana ili himerna antitela, antitela sa jednim lancem (npr., scFv), Fab fragmente, F (ab ') fragmente, fragmente dobijene iz Fab ekspresione biblioteke, anti-idiotipska (anti-Id) antitela (uključujući, npr. anti-Id antitela na antitela prema predmetnim primerima izvođenja) i fragmente koji vezuju epitope bilo koje od navedenih vrsta. Antitela su obično fragmenti humanih antitela koji vezuju antigene, koji uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab 'i F (ab')2, Fd, jednolančana Fvs (scFv), jednolančana antitela, disulfidnom vezom povezani Fvs (sdFv), kao i fragmenti koji sadrže ili VL ili VH domen. Fragmenti antitela koji se vezuju za antigen, uključujući jednolančana antitela, mogu da sadrže varijabilni region(e) sam ili u kombinaciji sa celinom ili delom sledećih kategorija: zglobnog regiona, CH1, CH2 i CH3 domena. Takođe su uključeni fragmenti koji se vezuju za antigen,a koji mogu da sadrže bilo koju kombinaciju varijabilnog(ih) regiona sa zglobnim regionom, CH1, CH2 i CH3 domenima. Antitela mogu da budu poreklom od bilo koje životinje, uključujući ptice i sisare. Obično, antitela su humana, glodarska (npr. mišija i pacovska), magareće, ovčija, majmunska, zečija, kozija, zamoračka, svinjska, kamilja, konjska ili pileća (ili druga ptičija). Kako se ovde koristi, "humana" antitela uključuju antitela koja imaju aminokiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina i uključuju antitela izolovana iz biblioteke humanog imunoglobulina ili od životinja transgenih za jedan ili više humanih imunoglobulina i koje ne eksprimiraju endogene imunoglobuline, kao što je opisano, na primer u SAD patentu br.

5,939,598.

[0029] Himerna i humanizovana antitela mogu da se proizvedu iz ne-humanih antitela i mogu da imaju isti ili sličan afinitet vezivanja kao i antitelo iz koga su proizvedena. Tehnike za proizvodnju himernih antitela (Morrison et al., 1984 Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81: 6851; Neuberger et al., 1984 Nature 312: 604; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452) uključuju splajsing gena, npr. molekula antitela miša odgovarajuće antigenske specifičnosti, sa genima molekula humanog antitela, koje ima odgovarajuću biološku aktivnost. Na primer, nukleinska kiselina koja kodira varijabilni (V) region mišijeg monoklonskog antitela može da se spoji sa nukleinskom kiselinom koja kodira humani konstantni (C) region, npr. IgG1 ili IgG4. Dobijeno antitelo predstavlja, dakle, hibrid različitih vrsta, uglavnom sa antigen-vezujućim domenom ne-humanog antitela i C, ili efektorskim, domenom humanog antitela ili antitela primata.

[0030] Humanizovana antitela su antitela sa varijabilnim regionima primarno dobijenim od humanog antitela (tj. akceptorskog antitela), ali koja imaju regione koji određuju komplementarnost, a koji su u osnovi dobijeni od ne-humanog antitela (donorskog antitela). Videti, npr. Queen et al., Proc. Nat'l. Acad.Sci USA 86: 10029-10033 (1989); WO 90/07861, SAD patente br. 7,435,802, 6,054,297; 5,693,761; 5,585,089; 5,530,101; i 5,224,539. Konstantni region ili regioni ovih antitela su u principu takođe dobijeni od humanog antitela. Humani varijabilni domeni su obično izabrani od humanih antitela sa sekvencama koje pokazuju visoku homologiju sa željenim ne-humanim domenima koji se vezuju za varijabilne regione. Varijabilni ostaci teškog i lakog lanca mogu da se izvedu iz istog antitela ili iz različitog humanog antitela. Pored toga, sekvence mogu da se izaberu kao konsenzus nekoliko humanih antitela, kao što je opisano u WO 92/22653.

[0031] „Primatizovano<TM>antitelo" je rekombinantno antitelo koje sadrži varijabilne sekvence ili antigen-vezujuće delove primata i sekvence humanog konstantnog domena.Videti, npr. Newman, Bio/Technology, 1992, 10: 1455-60. Primatizacija antitela dovodi do obrazovanja antitela koja sadrže majmunske varijabilne domene i humane konstantne sekvence.Videti, npr. SAD patent br.

6,113,898. Ovom tehnikom se antitela modifikuju tako da se nakon primene kod ljudi ne dođe do njihovog odbacivanja zbog toga što imaju antigena svojstva. Ova tehnika se oslanja na imunizaciju majmuna cinomolgus ljudskim antigenima ili receptorima. Ova tehnika je razvijena kako bi se kreirala monoklonska antitela visokog afiniteta usmerena na površinske antigene ljudskih ćelija.

[0032] Specifične aminokiseline u okviru humanog varijabilnog regiona biraju se za supstituciju na osnovu predviđene konformacije i antigen-vezujućih svojstava. Ovo može da se odredi pomoću tehnika kao što su računarsko modelovanje, predviđanje ponašanja i vezujućih svojstava aminokiselina na određenim lokacijama u okviru varijabilnog regiona i posmatranja efekata supstitucije. Na primer, kada je aminokiselina različita u ne-humanom varijabilnom regionu i humanom varijabilnom regionu, humani varijabilni region može da se promeni tako da odražava amino kiselinski sastav ne-humanog varijabilnog regiona. U specifičnom primeru izvođenja, antitela koja se koriste u hroničnom režimu doziranja predstavljaju humanizovana antitela koja su prikazana u SAD patentu br. 5,840,299. U drugom primeru izvođenja, transgeni miševi koji sadrže humane gene za antitela mogu da se imunizuju antigenom strukturom alfa-4 integrina, a tehnologija hibridoma može da se koristi kako bi se obrazovala humana antitela koja se selektivno vezuju za alfa-4 integrin.

[0033] Himerna, humana, primatizovana i/ili humanizovana antitela mogu da se proizvedu upotrebom rekombinantne ekspresije, npr. ekspresije u humanim hibridomima (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)), u ćelijama mijeloma ili u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO). Alternativno, sekvence koje kodiraju antitela mogu da se inkorporiraju u transgene za uvođenje u genom transgene životinje i da se naknadno eksprimiraju u mleku transgene životinje. Videti npr. SAD patent br. 6,197,946. Pogodni transgeni uključuju transgene koji imaju promotor i/ili enhenser specifičnog gena iz mlečne žlezde, na primer kazeina ili β-laktoglobulina.

2.2. Mali molekuli

[0034] Mali molekuli mogu da obuhvataju jedinjenja koja imaju molekulsku težinu veću od 50 i manju od oko 4, 000 daltona. Alternativno, ova jedinjenja mogu da imaju kovalentno vezane polimerne lance polietilen glikola (tj. da budu pegilovana) kako bi se dobila različita poboljšana svojstva jedinjenja, na primer, produženi poluživot, poboljšano prodiranje u tkivo i poboljšana solubilanost. Pegilovani konjugati mogu tako da imaju molekulsku masu oko 40 kilodaltona (kDa). Inhibitori alfa-4 integrina mogu da sadrže funkcionalne grupe neophodne za strukturnu interakciju sa proteinima, posebno za obrazovanje vodoničnih veza, i mogu da uključuju aminsku, karbonilnu, hidroksilnu ili karboksilnu grupu, obično najmanje dve funkcionalne hemijske grupe. Inhibitori alfa-4 integrina često sadrže ciklične ugljenične ili heterociklične strukture i/ili aromatične ili poliaromatične strukture supstituisane jednom ili više prethodno u tekstu opisanih funkcionalnih grupa. Inhibitori integrina alfa-4 mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na: peptide, saharide, masne kiseline, steroide, purine, pirimidine, derivate, strukturne analoge ili njihove kombinacije. Neograničavajući primeri alfa-4 integrinskih inhibitora opisani su, na primer, u SAD patentima br.5,998,447 (heterocikli), 6,034,238 (heterociklična jedinjenja), 6,331,552 (supstituisani imidazolidin), 6,399,643 (spiroimidazolidinski derivati), 6,423,712 (2,4-substituisani imidazolidinski derivati), 6,514,952 (hidantoinski derivati), 6,521,654 (substituted imidazolidinski derivati), 6,667,331 (nepeptidilna jedinjenja), 6,667,334 (imidazolidinski derivati), 6,668,527 (nepeptidilna jedinjenja), 6,680,333 (imidazolidinski derivati), 6,756,378, 6,759,424 (imidazolidinski derivati), 6,838,439 (heterociti), 6,903,128 (nepeptidilna jedinjenja), 6,962,937 (imidazolidinski derivati), 7,179,819 i 7,196,112. Nekoliko reprezentativnih alfa-4 integrinskih inhibitora malog molekula prikazano je na SL.1.

2.3. Anti-alfa-4 integrinski peptidi

[0035] Neki peptidi su u stanju da se vežu za alfa-4 integrin ili za dimer koji sadrži alfa-4 subjedinicu. Uključeni su peptidi koji su u osnovi homologi sa regionom vanćelijskog matriksa ili prirodnim ligandom jednog ili više specifičnih ciljnih alfa-4 integrinskih receptora. Na primer, za hroničnu inhibiciju alfa-4 beta-1 receptora mogu da se koriste peptidi koji sadrže bar deo fibronektinskog IIICS regiona (npr., peptidi koji sadrže bar deo CS-1 peptidne sekvence ili sekvence koja je u osnovi homologa sa CS-1 sekvencom) tako što se vežu za receptor i inhibira aktivnost integrina koji sadrži alfa-4.Videti, npr. SAD patent br.7,238,668.

3. Upotreba inhibitora alfa-4 integrina za lečenje bolesti povezanih sa patološkim ili hroničnim zapaljenjem

[0036] Inhibitori alfa-4 integrina mogu da se koriste za lečenje različitih bolesti povezanih sa patološkim ili hroničnim zapaljenjem, na taj način što se blokiraju interakcije zavisne od alfa-4. Interakcija zavisna od alfa-4, sa VCAM-1 ligandom na endotelnim ćelijama, predstavlja rani događaj u mnogim zapaljenskim reakcijama, uključujući i zapaljenske reakcije u centralnom nervnom sistemu. Neželjene bolesti i stanja nastala kao posledica zapaljenja i koja imaju akutna i/ili hronična klinička pogoršanja uključuju multiplu sklerozu (Yednock et al., 1992 Nature 356: 63; Baron et al., 1993 J. Exp. Med. 177: 57), meningitis, encefalitis, moždani udar, druge cerebralne traume, zapaljenska bolest creva (IBD), uključujući ulcerozni kolitis i Kronovu bolest (CD) (Hamann et al., 1994 J. Immunol.152: 3238; Podolsky et al., 1993 J. Clin. Invest.92: 372), reumatoidni artritis (van Dinther-Janssen et al., 1991 J. Immunol. 147: 4207; van Dinther-Janssen et al., 1993 Annals Rheumatic Diseases 52: 672; Elices et al., 1994 J. Clin. Invest. 93: 405; Postigo et al., 1992 J. Clin. Invest.89: 1445), astmu (Mulligan et al., 1993 J. Immunol. 150: 2407) i akutni juvenilni dijabetes (tipa 1) (Yang et al., 1993 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 10494; Burkly et al., 1994 Diabetes 43: 529; Baron et al., 1994 J. Clin. Invest. 93: 1700), AIDS-indukovanu demenciju (Sasseville et al., 1994 Am. J. Path.144: 27); aterosklerozu (Cybulsky et al., 1991 Science 251: 788-91, Li et al., 1993 Arterioscler. 13: 197), nefritis (Rabb et al., 1995 Springer Semin. Immunopathol. 16: 417-25), retinitis, atopijski dermatitis, psorijazu, ishemiju miokarda, hronični prostatitis, komplikacije srpaste anemije, eritemski lupus i akutno oštećenje pluća posredovano leukocitima, kakvo se javlja kod adultnog respiratornog distres sindroma.

[0037] Zapaljenska bolest creva je zbirni termin za dve slične bolesti koje se nazivaju Kronova bolest (CD) i ulcerozni kolitis. CD je idiopatska, hronična ulcerokonstriktivna zapaljenska bolest koju karakteriše oštro razgraničeno i tipično transmuralno zahvatanje svih slojeva crevnog zida granulomatoznom zapaljenskom reakcijom. Bilo koji segment gastrointestinalnog trakta, od usta do anusa, može da bude uključen, mada bolest najčešće pogađa završni deo ileuma i/ili debelo crevo. Ulcerozni kolitis je zapaljenski odgovor ograničen uglavnom na mukozu i submukozu debelog creva. Limfociti i makrofagi su brojni u lezijama zapaljenske bolesti creva i mogu da doprinose zapaljenskim oštećenjima.

[0038] Astma je bolest koju karakteriše pojačana reakcija traheobronhijalnog stabla na razne stimuluse koji potenciraju paroksizmalno suženje bronhijalnih disajnih puteva. Stimulusi uzrokuju oslobađanje različitih medijatora upale iz mastocita obloženih sa IgE, uključujući histamin, eozinofilne i neutrofilne hemotaktičke faktore, leukotriene, prostaglandin i faktor aktivacije trombocita. Oslobađanjem ovih faktora regrutuju se bazofili, eozinofili i neutrofili, koji izazivaju zapaljenska oštećenja.

[0039] Ateroskleroza je bolest arterija (npr. koronarne, karotidne, aorte i ilijačne arterije). Osnovna lezija, aterom, sastoji se od uzdignute fokusirane plake unutar intime, koja ima jezgro od lipida i pokrovni fibrozni omotač. Ateromi ometaju arterijski protok krvi i dovode do slabljenja pogođenih arterija. Infarkti miokarda i cerebruma glavna su posledica ove bolesti. Makrofagi i leukociti se regrutuju u aterome i doprinose zapaljenskom oštećenju.

[0040] Reumatoidni artritis je hronična, recidivna zapaljenska bolest koja prevashodno izaziva oštećenje i uništavanje zglobova. Reumatoidni artritis obično prvo pogađa male zglobove šaka i stopala, ali potom može da uključi ručne zglobove, laktove, gležnjeve i kolena. Artritis nastaje kao posledica interakcije sinovijalnih ćelija sa leukocitima koji se iz cirkulacije infiltriraju u sinovijalnu sluznicu zglobova.Videti npr. Paul, Immunology 3rd ed., Raven Press, 1993.

[0041] Inhibitori alfa-4 integrina mogu da se koriste u lečenju odbacivanja organa ili transplantata. Tokom poslednjih godina došlo je do značajnog poboljšanja efikasnosti hirurških tehnika transplantacije tkiva i organa poput kože, bubrega, jetre, srca, pluća, pankreasa i koštane srži. Glavni problem koji se izdvaja je možda nedostatak zadovoljavajućih sredstava za indukciju imunotolerancije na presađeni alograft ili organ kod primaoca. Kada se alogene ćelije ili organi transplantiraju u domaćina (tj. davalac i primalac su različite jedinke iste vrste), imunološki sistem domaćina verovatno će uspostaviti imunski odgovor na strane antigene u transplantatu (bolest domaćin-prema-kalemu) što dovodi do uništenja presađenog tkiva. CD8+ ćelije, CD4+ ćelije i monociti su uključeni u odbacivanje tkiva transplantata. Antitela usmerena na alfa-4 integrin su korisna, između ostalog, za blokiranje imunskih odgovora izazvanih aloantigenima kod primaoca, čime se sprečava da te ćelije učestvuju u uništavanju presađenog tkiva ili organa.Videti, npr. Paul et al., 1996 Transplant International 9: 420-425; Georczinsky et al., 1996. Immunol. 87: 573-580); Georcyznski et al., 1995 Transplant. Immunol. 3: 55-61; Yang et al., 1995 Transplantation 60: 71-76; i Anderson et al., 1994 APMIS 102: 23-27. Srodna upotreba inhibitora alfa-4 integrina je modulacija imunskog odgovora koji je uključen u bolest "kalem protiv domaćina" (GVHD). Videti, npr. Schlegel et al., J. Immunol. 155: 3856-3865 (1995). GVHD je potencijalno smrtonosna bolest koja se javlja kada se imunološki kompetentne ćelije prebace na alogenog primaoca. U ovoj situaciji, imunokompetentne ćelije davaoca mogu da napadnu tkiva kod primaoca. Tkiva kože, epiteli creva i jetre, česta su meta, i mogu da budu uništeni tokom GVHD bolesti. Bolest predstavlja posebno ozbiljan problem kada je u pitanju transplantacija imunološkog tkiva, kao što je transplantacija koštane srži; ali manje ozbiljna GVHD bolest je zabeležena i u drugim slučajevima, uključujući transplantaciju srca i jetre. Inhibitori integrina alfa-4 koriste se, između ostalog, da blokiraju aktivaciju T-ćelija donora, čime ometaju njihovu sposobnost da liziraju ciljne ćelije kod domaćina.

[0042] Inhibitori integrina alfa-4 mogu da budu od koristi u inhibiranju metastaza tumora. Za nekoliko tumorskih ćelija objavljeno je da eksprimiraju alfa-4 integrin, a zabeleženo je i da antitela na alfa-4 integrin blokiraju adheziju tih ćelija na endotelne ćelije.Videti, npr. Steinback et al., 1995 Urol. Res. 23: 175-83; Orosz et al., 1995 Int. J. Cancer 60: 867-71; Freedman et al., 1994 Leuk Lymphoma 13: 47-52; and Okahara et al., 1994 Cancer Res. 54: 3233-6.

[0043] Inhibitori alfa-4 integrina mogu da budu od koristi u lečenju multiple skleroze. Multipla skleroza (MS) je progresivna neurološka autoimunska bolest koja, prema procenama, pogađa oko 250 000 do 350 000 ljudi u Sjedinjenim Državama. Smatra se da je multipla skleroza rezultat specifične autoimunske reakcije u kojoj određeni leukociti napadaju mijelin i pokreću njegovo uništavanje, izolacionog omotača koji prekriva nervna vlakna. U životinjskom modelu multiple skleroze je pokazano da mišija monoklonska antitela usmerena protiv alfa-4 beta-1 integrina blokiraju adheziju leukocita na endotel i tako sprečavaju upalu centralnog nervnog sistema i posledičnu paralizu kod životinja. Pojava MS može da bude dramatična ili tako blaga da pacijent i ne potraži lekarsku pomoć. Najčešći simptomi uključuju slabost jednog ili više udova, zamagljivanje vida zbog optičkog neuritisa, senzorne poremećaje, diplopiju i ataksiju. Tok bolesti može da se stratifikuje u tri opšte kategorije: (1) recidivna MS, (2) hronična progresivna MS i (3) neaktivna MS. Recidivnu MS karakterišu napadi neurološke disfunkcije koji se ponavljaju. MS napadi se uglavnom razvijaju danima do nedeljama i može ih pratiti potpuni, delimični ili nikakav oporavak. Oporavak od napada obično se dešava u roku od nekoliko nedelja do nekoliko meseci nakon vrhunca simptoma, premda oporavak retko može da se nastavi i tokom 2 ili više godina. Hronična progresivna MS rezultira postepenim progresivnim pogoršanjem bez perioda stabilizacije ili remisije. Ovaj oblik se razvija kod pacijenata sa prethodnom istorijom recidivne MS, mada 20% pacijenata ne može da se seti recidiva. Dok je tok bolesti progresivan, takođe može da dođe do akutnih recidiva. Treći oblik je neaktivna MS. Neaktivna MS se karakteriše fiksiranim neurološkim deficitima promenljive veličine. Najveći broj pacijenata sa neaktivnom MS ima raniju istoriju recidivne MS. Tok MS takođe zavisi od starosti pacijenta. Na primer, povoljni prognostički faktori uključuju rani početak (isključujući detinjstvo), tok sa recidivima i malu zaostalu invalidnost 5 godina nakon početka. Suprotno tome, loša prognoza je povezana je sa pojavim bolesti u starijem dobu početka (tj., sa 40 ili više godina) i progresivnim tokom. Ove varijable su međusobno zavisne, jer hronična progresivna MS ima tendenciju da počne u kasnijoj dobi od recidivne MS. Invalidnost od hronične progresivne MS je obično posledica progresivne paraplegije ili kvadriplegije kod pojedinačnih pacijenata.

[0044] Inhibitori alfa-4 integrina mogu da se koriste sa efikasnim količinama drugih terapeutskih sredstava protiv akutnog i hroničnog zapaljenja. Takva sredstva uključuju i druge antagoniste adhezionih molekula (npr., druge integrine, selektine i članove superfamilije imunoglobulina (Ig)). Videti, npr. Videti npr. Springer, 1990 Nature 346: 425-433; Osborn, 1990 Cell 62: 3; Hynes, 1992 Cell 9: 11. Ostala anti-zapaljenska sredstva koja mogu da se koriste u kombinaciji sa alfa-4 inhibitorima integrina uključuju antitela i druge antagoniste citokina, kao što su interleukini IL-1 do IL-13, faktori tumorske nekroze α i β, interferoni α, β i γ, tumorski faktor rasta beta (TGF-β), faktor stimulacije kolonija (CSF) i granulocitno-monocitni faktor stimulacije kolonija (GM-CSF). Ostala anti-zapaljenska sredstva mogu takođe da sadrže antitela i druge antagoniste hemokina kao što su MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, egzotaksin i IL-8. Ostala anti-zapaljenska sredstva mogu dalje da uključuju NSAIDS lekove, steroide i ostale inhibitore zapaljenja čiji su molekuli mali.

4. Upotreba inhibitora alfa-4 integrina u cilju lečenja autoimunskih bolesti

[0045] Inhibitori alfa-4 integrina takođe mogu da se koriste za lečenje različitih autoimunskih bolesti. Ovde autoimunska bolest predstavlja bolest ili poremećaj koji nastaje zbog, i usmeren je protiv, sopstvenog tkiva pojedinca, ili njihov ko-segregat ili ispoljavanje, ili iz njih nastalo stanje. Primeri autoimunskih bolesti ili poremećaja uključuju, ali nisu ograničeni na, artritis (reumatoidni artritis kao što je akutni artritis, hronični reumatoidni artritis, giht ili artritis usled gihta, akutni artritis usled gihta, akutni imunološki artritis, hronični zapaljenski artritis, degenerativni artritis, artritis indukovan kolagenom tipa II, infektivni artritis, artritis usled Lajmske bolesti, proliferativni artritis, psorijazni artritis, Stilova bolest, vertebralni artritis i juvenilni reumatoidni artritis, osteoartritis, progredirajući hronični artritis, deformišući artritis, primarni hronični poliartritis, reaktivni artritis i ankilozirajući spondilitis), zapaljenske hiperproliferativne bolesti kože, psorijazu, kao što je psorijaza plaka, gutatna psorijaza, pustularna psorijaza i nokatna psorijaza, atopiju uključujući atopijske bolesti kao što je polenska groznica i Jovov sindrom, dermatitis, uključujući kontaktni dermatitis, hronični kontaktni dermatitis, eksfolijativni dermatitis, alergijski dermatitis, alergijski kontaktni dermatitis, herpetiformni dermatitis, numularni dermatitis, seboreični dermatitis, nespecifični dermatitis, primarni nadražajni kontaktni dermatitis i atopijski dermatitis, X vezani sindrom povišenog IgM, alergijske intraokularne zapaljenske bolesti, urtikariju, kao što su hronična alergijska urtikarija i hronična idiopatska urtikarija, uključujući hroničnu autoimunsku urtikariju, miozitis, polimiozitis/dermatomiozitis, juvenilni dermatomiozitis, toksičnu epidermalnu nekrolizu, sklerodermu (uključujući sistemsku sklerodermu), sklerozu poput sistemske skleroze, multiplu sklerozu (MS) kao što su spino-optička MS, primarna progresivna MS (PPMS) i recidivna remisijska MS (RRMS), progresivnu sistemsku sklerozu, aterosklerozu, arteriosklerozu, diseminiranu sklerozu, ataksijsku sklerozu, optički neuromijelitis (NMO), zapaljensku bolest creva (IBD) (na primer, Kronovu bolest, autoimunske gastrointestinalne bolesti, kolitis kao što je ulcerozni kolitis, kolitis ulceroza, mikroskopski kolitis, kolagenozni kolitis, polipozni kolitis, nekrotizujući enterokolitis i transmuralni kolitis i autoimunsku zapaljensku bolest creva), zapaljenje creva, gangrenoznu piodermu, nodozni eritem, primarni sklerozni holangitis, respiratorni distres sindrom, uključujući respiratorni distres sindrom kod odraslih ili akutni respiratorni distres sindrom (ARDS), meningitis, zapaljenje cele ili dela uvee, iritis, horoiditis, autoimunski hematološki poremećaj, reumatoidni spondilitis, reumatoidni sinovitis, nasledni angioedem, oštećenje kranijalnog nerva kao kod meningitisa, gestacijski herpes, gestacijski pemfigoid, pruritus skrotuma, autoimuno prevremeno otkazivanje jajnika, iznenadni gubitak sluha usled autoimunskog stanja, IgE-posredovane bolesti kao što su anafilaksija i alergijski i atopijski rinitis, encefalitis kao što je Rasmusenov encefalitis i limbički i/ili moždani encefalitis, uveitis, kao što su prednji uveitis, akutni prednji uveitis, granulomatozni uveitis, negranulomatozni uveitis, fakoantigeni uveitis, zadnji uveitis, autoimunski uveitis, glomerulonefritis (GN) sa i bez nefrotičkog sindroma, kao što su hronični ili akutni glomerulonefritis, kao što je primarni GN, imunski posredovan GN, membranski GN (membranska nefropatija), idiopatski membranski GN ili idiopatska membranska nefropatija, membranoproliferativni ili membranski proliferativni GN (MPGN), uključujući tip I i tip II, i rapidono-progresivni GN, proliferativni nefritis, autoimunski poliglandularni endokrini sindrom, balanitis, uključujući Zoonovu bolest, balanopostitis, prstenasti centrifugalni eritem, pepeljastu dermatozu, multiformni eritem, prstenasti zrnasti tumor, lišaj sa sitnim bubuljicama, sklerozni i atrofični lišaj, običan hronični lišaj, trnoviti lišaj, lihen planus, lamelarnu ihtiozu, epidermolitičku hiperkeratozu, premalignu keratozu, gangrenoznu piodermu, alergijska stanja i odgovore, alergijsku reakciju, ekcem, uključujući alergijski ili atopijski ekcem, asteatotični ekcem, dishidrotski ekcem, i vezikularni palmoplantarni ekcem, astmu, kao što je astma bronhijale, bronhijalna astma i autoimunska astma, stanja koja uključuju infiltraciju T ćelija i hronične zapaljenske odgovore, imunske reakcije protiv stranih antigena kao što su fetalne A-B-O krvne grupe tokom trudnoće, hroničnu plućnu zapaljensku bolest, autoimunski miokarditis, deficijenciju leukocitne adhezije, lupus, uključujući nefrotički lupus, cerebralni lupus, pedijatrijski lupus, ne-bubrežni lupus, van-bubrežni lupus, diskoidni lupus i diskoidni eritemski lupus, alopecijski lupus, sistemski eritemski lupus (SLE) kao što je kožni SLE ili subakutni kožni SLE, sindrom neonatalnog lupusa (NLE) i diseminovani eritemski lupus, juvenilni (tip I) dijabetes melitus, uključujući pedijatrijski insulin-zavisni dijabetes melitus (IDDM), adultni dijabetes melitus (dijabetes tipa II), autoimuni dijabetes, idiopatski diabetes insipidus, dijabetesnu retinopatiju, dijabetesnu nefropatiju, dijabetesni poremećaj velikih arterija, imunske odgovore u vezi sa akutnom i odloženom hipersenzitivnošću koja je posredovana citokinima i T limfocitima, tuberkulozu, sarkoidozu, uključujući limfomatoidnu granulomatozu, Vegenerovu granulomatozu, agranulocitozu, vaskulitise, uključujući vaskulitis, vaskulitis velikih krvnih sudova (uključujući reumatsku polimijalgiju i arteritis gigantskih ćelija (Takajasuov)), vaskulitis srednjih krvnih sudova (uključujući Kavasakijevu bolest i nodozni poliarteritis/nodozni periarteritis), mikroskopski poliarteritis, imunovaskulitis, CNS vaskulitis, kožni vaskulitis, hipersenzibilni vaskulitis, nekrotizujući vaskulitis, kao što je sistemski nekrotizujući vaskulitis, i ANCA povezan vaskulitis, kao što je Čarg-Štrausov vaskulitis ili sindrom (CSS) i ANCA povezan vaskulitis malih krvnih sudova, temporalni arteritis, aplastičnu anemiju, autoimunu aplastičnu anemiju, Kumbsovu pozitivnu anemiju, Blekfan-Dajmondovu anemiju, hemolitičku anemiju ili imunsku hemolitičku anemiju uključujući autoimunsku hemolitičku anemiju (AIHA), pernicioznu anemiju (anemija pernicioza), Adisonovu bolest, čistu anemiju ili aplaziju crvenih krvnih zrnaca (PRCA), deficit faktora VIII, hemofiliju A, autoimunu neutropeniju, pancitopeniju, leukopeniju, bolesti koje uključuju leukocitnu dijapedezu, zapaljenske poremećaje CNS, sindrom višestrukog oštećenja organa kao što su sekundarna oštećenja usled septikemije, traume ili krvarenja, bolesti posredovane kompleksima antigen-antitelo, antiglomerulusna bolest bazalne membrane, anti-fosfolipidni sindrom, alergijski neuritis, Behčetovu bolest/sindrom, Kastelmanov sindrom, Gudpaščerov sindrom, Rejnoov sindrom, Sjegrenov sindrom, Stivens-Džonsonov sidrom, pemfigoid kao što je plikoviti pemfigoid i kožni pemfigoid, plikovnjaču (uključujući običnu plikovnjaču, listastu plikovnjaču, oboljenje mukozne membrane slično plikovnjači i eritematoznu plikovnjaču), autoimunske poliendokrinopatije, Rajterovu bolest ili sindrom, termičke povrede, preeklampsiju, poremećaj imunskog kompleksa kao što je nefritis imunskog kompleksa, antitelima posredovani nefritis, polineuropatije, hroničnu neuropatiju kao što su IgM polineuropatije ili IgM-posredovana neuropatija, trombocitopeniju (kakvu razvijaju pacijenti sa infarktom miokarda, na primer), uključujući trombotičku trombocitopenijsku purpuru (TTP), post-transfuzionu purpuru (PTP), heparinsku trombocitopeniju i autoimunski ili imunski posredovanu trombocitopeniju, kao što je idiopatska trombocitopenijska purpura (ITP), uključujući hroničnu ili akutnu ITP, skleritis kao što je idiopatski kerato-skleritis, episkleritis, autoimunske bolesti testisa i jajnika uključujući autoimunsko zapaljenje testisa i jajnika, primarni hipotireoidizam, hipoparatireoidizam, autoimunske endokrine bolesti uključujući tiroiditis kao što je autoimunski tiroiditis, Hašimotova bolest, hronični tiroiditis (Hašimotov tiroiditis) ili subakutni tiroiditis, autoimunsku tiroidnu bolest, idiopatski hipotiroidizam, Grejvsovu bolest, poliglandularne sindrome kao što su autoimunski poliglandularni sindromi (ili poliglandularni endokrinopatski sindromi), paraneoplastične sindrome, uključujući neurološke paraneoplastične sindrome kao što je Lambert-Itonov mijastenički sindrom ili Iton-Lambertov sindrom, sindrom ukočenog čoveka ili ukočene osobe, encefalomijelitis kao što je alergijski encefalomijelitis ili encefalomijelitis alergika i eksperimentalni alergijski encefalomijelitis (EAE), mijastenija gravis kao što je mijastenija gravis u vezi sa timomom, cerebelarna degeneracija, neuromiotonija, opsoklonus ili opsoklonus mioklonus sindrom (OMS), i senzornu neuropatiju, multifokalnu motornu neuropatiju, Šihanov sindrom, autoimunski hepatitis, hronični hepatitis, lupoidni hepatitis, hepatitis gigantskih ćelija, hronični aktivni hepatitis ili autoimunski hronični aktivni hepatitis, limfoidni intersticijski pneumonitis (LIP), konstriktivni bronhiolitis (netransplantacioni) naprema NSIP, Gijen-Bareov sindrom, Bergerovu bolest (IgA nefropatija), idiopatsku IgA nefropatiju, linearnu IgA dermatozu, akutnu febrilnu neutrofilnu dermatozu, subkornealnu pustularnu dermatozu, prolaznu akantolitičku dermatozu, cirozu kao što su primarna bilijarna ciroza i pneumociroza, autoimunski enteropatski sindrom, celijakiju ili celijačnu bolest, celijačni spru (glutensku enteropatiju) ili celijačnu bolest, refraktorni spru, idiopatski spru, krioglobulinemiju, amiotrofičnu lateralnu sklerozu (ALS; Lu Gerigova bolest), koronarnu arterijsku bolest, autoimunsku bolest uha kao što je autoimunska bolest unutrašnjeg uha (AIED), autoimunski gubitak sluha, polihondritis kao što je refraktorni ili recidivni ili recidivirajući polihondritis, plućnu alveolarnu proteinozu, Koganov sindrom/nesifilistični intersticijski keratitis, Belovu paralizu, Svitovu bolest/sindrom, autoimunsku rozaceu, bol u vezi sa zosterom, amiloidozu, nekanceroznu limfocitozu, primarnu limfocitozu, koja uključuje monoklonsku B-ćelijsku limfocitozu (npr., benignu monoklonsku gamopatiju i monoklonsku gamopatiju neutvrđenog značaja (MGUS), perifernu neuropatiju, paraneoplastični sindrom, kanalopatije kao što su epilepsija, migrena, aritmija, mišićni poremećaji, gluvoća, slepilo, periodična paraliza i kanalopatije u CNS, autizam, zapaljensku miopatiju, fokalnu ili segmentalnu ili fokalno-segmentalnu glomerulosklerozu (FSGS), endokrinu oftalmopatiju, uveoretinitis, horioretinitis, autoimunski hepatološki poremećaj, fibromijalgiju, multiple endocrine failure, Šmitov sindrom, adrenalitis, gastričnu atrofiju, presenilnu demenciju, demijelinizujuće bolesti kao što su autoimunske demijelinizujuće bolesti i hronične zapaljenske polineuropatije, Dreslerov sindrom, alopeciju areatu, totalnu alopeciju, CREST sindrom (kalcinoza, Rejnoov fenomen, poremećena pokretljivost jednjaka, sklerodaktilija i teleangiektazija), mušku i žensku autoimunsku neplodnost, npr. usled prisustva antitela protiv spermatozoida, bolest mešanog vezivnog tkiva, Šagasovu bolest, reumatsku groznicu, ponovljene pobačaje, farmerska pluća, multiformni eritem, post-kardiotomijski sindrom, Kušingov sindrom, hipersenzitivnost pluća usled ptičijih antigena, alergijski granulomatozni angiitis, benigni limfocitni angiitis, Alportov sindrom, alveolitis kao što je alergijski alveolitis i fibrozirajući alveolitis, intersticijsku plućnu bolest, transfuzionu reakciju, lepru, malariju, parazitske bolesti kao što su leišmanioza, kipanosomijaza, šizostomijaza, askarijaza, aspergiloza, Samterov sindrom, Kaplanov sindrom, dengu, endokarditis, endomiokardijalnu fibrozu, difuznu intersticijsku plućnu fibrozu, intersticijsku plućnu fibrozu, idiopatsku plućnu fibrozu, cističnu fibrozu, endoftalmitis, erythema elevatum et diutinum, fetalnu eritroblastozu, eozinofilni faciitis, Šulmanov sindrom, Feltijev sindrom, flarijazu, ciklitis kao što je hronični ciklitis, heterohronični ciklitis, iridociklitis (akutni ili hronični), ili Fuksov ciklitis, Henoh-Šenlajnovu purpuru, infekciju humanim virusom imunodeficijencije (HIV), SCID, stečeni sindrom imunodeficijencije (AIDS), infekciju ehovirusom, sepsu, endotoksemiju, pankreatitis, tiroksikozu, infekciju parvovirusom, infekciju virusom rubele, post-vakcinacijske sindrome, kongenitalnu infekciju rubelom, infekciju Epštajn-Bar virusom, zauške, Evansov sindrom, autoimunsku gonadalnu insuficijenciju, Sidenhajmovu horeu, post-streptokokalni nefritis, Birgerovu bolest, tirotoksikozu, dorzalnu usahnulost, horioiditis, polimijalgiju gigantskih ćelija, hronični hipersenzitivni pneumonitis, suvo oko, epidemijski keratokonjuktivitis, idiopatski nefritički sindrom, preoteinurijska nefropatija, benigno familijalno i ishemijsko-reperfuzijsko oštećenje, reperfuziju transplanat organa, retinalnu autoimunost, zapaljenje zglobova, bronhitis, hroničnu opstruktivnu bolest disajnih puteva/pluća, silikozu, afte, aftozni stomatitis, arteriosklerotične poremećaje, aspermiogenezu, autoimunsku hemolizu, Bekovu bolest, krioglobulinemiju, Dipitrenovu kontrakturu, fakoanafilaktičku endoftalmiju, alergijski enteritis, nodozni leprozni eritem, idiopatsku facijalnu paralizu, sindrom hroničnog umora, reumatsku groznicu, Haman-Rič bolest, senzoneuralni gubitak sluha, paroksizmalnu hemoglobinuriju, hipogonadizam, regionalni ileitis, leukopeniju, infektivnu mononukleozu, traverzni mijelitis, primarni idiopatski miksedem, nefrozu, simpatičku oftalmiju, granulomatozno zapaljenje testisa, pankreatitis, akutni poliradikuloneuritis, gangrenoznu piodermu, Kervenov tireoiditis, stečenu atrofiju slezine, nemaligni timom, vitiligo, sindrom toksičnog šoka, trovanje hranom, stanja koja uključuju infiltraciju T ćelija, deficijenciju leukocitne adhezije, imunske odgovore u vezi sa akutnom i odloženom hipersenzitivnošću koja je posredovana citokinima i T-limfocitima, bolesti koje uključuju leukocitnu dijapedezu, sindrom oštećenja multiplih organa, bolesti posredovane kompleksom antigen-antitelo, antiglomerulusnu bolest bazalne membrane, alergijski neuritis, autoimunske poliendokrinopatije, zapaljenje jajnika, primarni miksedem, autoimunski atrofični gastritis, simpatetičku oftalmiju, reumatske bolesti, bolest mešanog vezivnog tkiva, nefrotski sindrom, inzulitis, poliendokrinu insuficijenciju, autoimunski poliglandularni sindrom tipa I, adultni idiopatski hipoparatireoidizam (AOIH), kardiomiopatiju kao što je dilatirana kardiomiopatija, stečenu buloznu epidermolizu (EBA), hemohromatozu, miokarditis, nefrotski sindrom, primarni sklerozni holangitis, purulentni ili nepurulentni sinuzitis, akutni ili hronični sinuzitis, etmoid, frontalni, maksilarni ili sfenoidni sinuzitis, poremećaj u vezi sa eozinofilima kao što je eozinofilija, plućna infiltraciona eozinofilija, eozinofilijski-mijalgijski sindrom, Loflerov sindrom, hroničnu eozinofilnu pneumoniju, tropsku plučnu eozinofiliju, bronhopneumonijsku aspergilozu, aspergilome ili granulome koji sadrže eozinofile, anafilaksu, seronegativni spondiloartritis, poliendokrinu autoimunska bolest, sklerozni holangitis, skleru, episkleru, hroničnu mukozno-kožnu kandidijazu, Brutonov sindrom, prolaznu dečiju hipogamaglobulinemiju, Viskot-Oldrič sindrom, sindrom ataksije teleangiektazije, angiektazu, autoimunske poremećaje u vezi sa kolagenom bolešću, reumatizam, neurološku bolest, limfoadenitis, smanjenje odgovora krvnog pritiska, poremećaj vaskularne funkcije, povredu tkiva, kardiovaskularnu ishemiju, hiperalgeziju, bubrežnu ishemiju, cerebralnu ishemiju i bolest koja prati vaskularizaciju, alergijske hipersenzitivne poremećaje, glomerulonefritidi, reperfuzijsku bolest, ishemijsko reperfuzijski poremećaj, reperfuzijsku bolest miokarda ili drugih tkiva, limfomatozni traheobronhitis, zapaljenske dermatoze, dermatoze sa akutnim zapaljenskim komponentama, insuficijenciju multiplih organa, bulozne bolesti, bubrežnu kortikalnu nekrozu, akutni purulentni meningitis ili druge zapaljenske poremećaje centralnog nervnog sistema, okularne i orbitalne zapaljenske poremećaje, sindrome povezane sa transfuzijom granulocita, toksičnost indukovanu citokinima, narkolepsiju, akutno teško zapaljenje, hronično uporno zapaljenje, pijelitis, endoarterijsku hiperplaziju, peptidni ulkus, valvulitis i endometriozu.

5. Upotreba inhibitora alfa-4 integrina za lečenje kancera

[0046] Inhibitori alfa-4 integrina takođe mogu da se koriste za lečenje kancera.Videti, npr. objavljenu SAD patentnu prijavu br. 20090312353. Izraz kancer podrazumeva kolekciju malignih oboljenja gde se svaki kancer svakog organa sastoji od brojnih podskupova. Uobičajeno, u trenutku kada se postavlja dijagnoza kancera, „kancer" se zapravo sastoji od više subpopulacija ćelija sa različitim genetskim, biohemijskim, imunološkim i biološkim karakteristikama.

[0047] Vrste kancera koje se leče inhibitorom alfa-4 integrina mogu da budu one vrste koje prikazuju alfa-4 integrine ili njihove ligande (na primer, ligandi alfa-4 integrina uključuju VCAM-1 i/ili MAdCAM-1). Reprezentativni kanceri uključuju, ali nisu ograničeni na, hematološke malignitete, akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), akutnu mijelogenu leukemiju (AML), hroničnu mijelogenu leukemiju (CML), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL) i multipli mijelom (MM). Leukemije mogu da budu limfoblastne ili mijelogene. Limfoblastna (ili limfocitna) leukemija pogađa limfocite. Mijelogena leukemija pogađa mijelocite.

[0048] Limfocitne neoplastične bolesti može da karakteriše obimna ekspanzija jednog klona B-ćelija, što može da se detektuje merenjem prekomerno proizvedenih antitela, gde se merenje sprovodi testom elektroforeze serumskih proteina ili protočnom citometrijom periferne krvi. Za takvu ekspanziju se kaže da je „monoklonska", a monoklonska antitela koja proizvodi takva grupa B-ćelija mogu da izazovu bolesti poput amiloidoze i lupusa, ili mogu da ukazuju na osnovni malignitet. Koncept klonalnosti usko je povezan sa malignošću, na primer pri dijagnostifikovanju limfomatoidnih lezija kože. Ekspanzija određenog klona imunskih B-ćelija klinički lekari obično tumače kao dokaz neograničenog rasta ćelija, što je odlika kancera. Limfoidna leukemija (ili limfocitna leukemija) je vrsta leukemije koja pogađa limfoidno tkivo. Ove leukemije obično se dele prema stadijumu sazrevanja na kome je klonska (neoplastična) limfoidna populacija zaustavljena u sazrevanju (tj. akutna limfoblastna leukemija ili hronična limfoblastna leukemija).

[0049] Akutna limfoblastna leukemija (ALL), poznata i kao akutna limfocitna leukemija, predstavlja oblik leukemije belih krvnih zrnaca. Maligna, nezrela bela krvna zrnca se kontinuirano umnožavaju i prekomerno produkuju u koštanoj srži. Kao rezultat toga, normalne ćelije se istiskuju iz koštane srži i metastaziraju u druge organe. „Akutno" se odnosi na nediferencirano, nezrelo stanje limfocita u cirkulaciji i na brzo napredovanje bolesti, koja, ukoliko se ne leči, može da dovede do smrti u roku od nekoliko nedelja do nekoliko meseci.

[0050] Hronična limfoblastna leukemija (CLL; poznata i kao hronična limfoidna leukemija), pogađa B ćelije. B ćelije normalno nastaju u koštanoj srži i razvijaju se u limfnim čvorovima. U CLL je DNK B ćelija oštećena, pa se ćelije više ne bore protiv infekcije. Međutim, B ćelije nastavljaju da rastu i svojom brojnošću istiskuju zdrave krvne ćelije. Stoga CLL odlikuje poremećena neoplastična proliferacija B ćelija.

[0051] Kod najvećeg broja ljudi dijagnoza se postavlja u odsustvu simptoma, kao rezultat rutinskog ispitivanja krvi koje pokazuje veliki broj belih krvnih zrnaca. Međutim, kako napreduje, CLL dovodi do otečenosti limfnih čvorova, slezine i jetre, a na kraju i do anemije i infekcije. Rani CLL se ne leči, a kasni CLL se leči hemoterapijom i monoklonskim antitelima. Vreme preživljavanja varira od 5 do više od 25 godina.

[0052] Akutna mijelogena leukemija (AML), poznata i kao akutna mijeloidna leukemija, predstavlja kancer mijeloidne linije belih krvnih zrnaca, koji se karakteriše brzom proliferacijom poremećenih ćelija koje se nagomilavaju u koštanoj srži i ometaju proizvodnju normalnih krvnih ćelija. Simptomi AML nastaju usled zamene normalne koštane srži leukemijskim ćelijama, što dovodi do smanjenja broja crvenih krvnih zrnaca, trombocita i normalnih belih krvnih zrnaca. Ovi simptomi uključuju umor, kratak dah, lako nastajanje modrica i krvarenja, kao i povećan rizik od infekcije. Budući da je akutna leukemija, AML brzo napreduje i uobičajeno dovodi do smrtnog ishoda u roku od nekoliko nedelja ili nekoliko meseci, ukoliko se ne leči.

[0053] Akutna mijelogena leukemija (AML) je potencijalno izlečiva bolest; ali se generalno samo mali broj pacijenata izleči trenutno dostupnom terapijom. AML u početku može da se leči hemoterapijom koja ima za cilj da indukuje remisiju. Neki pacijenti mogu dodatno da prime transplant hematopoeznih matičnih ćelija.

[0054] Hronična mijelogena leukemija (CML) je oblik leukemije koji se karakteriše pojačanim i neregulisanim rastom pretežno mijeloidnih ćelija u koštanoj srži i nagomilavanjem ovih ćelija u krvi. CML predstavlja klonalni poremećaj matičnih ćelija koštane srži koji dovodi do proliferacije zrelih granulocita (neutrofila, eozinofila i bazofila) i njihovih prekursora. Istorijski, ona je lečena hemoterapijom, interferonom i transplantacijom koštane srži.

[0055] Multipli mijelom (MM) je maligna proliferacija plazma ćelija koja obično nastaje u koštanoj srži i uključuje skelet. MM prezentuje klinička svojstva koja mogu da se pripišu tome koja su konkretna mesta uključena i koji su konkretni poremećaji u stvaranju proteina plazme u pitanju. Ovo stanje obično karakterišu brojna difuzna žarišta ili nodularna nagomilavanja poremećenih ili malignih ćelija plazme u srži različitih kostiju (posebno lobanje), što izaziva otekline na kostima koje se mogu napipati, a povremeno i na mestima van skeleta. Pri radiološkom pregledu, lezije na kostima mogu da imaju karakterističan „šupalj" izgled.

[0056] Ćelije uključene u mijelom obično proizvode poremećene proteine i/ili dovode do poremećenih nivoa proteina u serumu i urinu. MM se obično razvija od monoklonske gamopatije neutvrđenog značaja (MGUS) preko indolentnog multiplog mijeloma (SMM) do multiplog mijeloma (MM). Simptomi ovih stanja mogu da uključuju hiperkalcemiju, bubrežnu insuficijenciju, umor, anemiju, bol u kostima, spontane prelome, povećanu učestalost ili trajanje infekcije ili neuobičajenu boju ili miris urina. „M-pik" se odnosi na monoklonski pik koji se tipično vizualizuje kao uska traka na elektroforetskom gelu ili neuobičajeni luk u imunoelektroforezi. On predstavlja proliferaciju homogenog imunoglobulina koga proizvode ćelije jednog klona koje potiču iz jedne zajedničke ćelije, npr. monoklonskog imunoglobulina koji se karakteriše teškim lancem jedne klase i potklase i lakim lancem jednog tipa (koji se takođe naziva M-protein, monoklonski protein i, u širem smislu, paraprotein).

6. VCAM-posredovane bolesti koje imaju povišene nivoe sVCAM

[0057] VCAM-posredovane bolesti uključuju sve bolesti posredovane VCAM molekulom. Videti, npr. WO 2010/053316. Neograničavajući primeri VCAM-posredovanih bolesti uključuju kancere, alergijske odgovore, aterosklerozu, kardiovaskularne bolesti, HIV (humani virus imunodeficijencije, AIDS), artritis, pneumoniju, hiperholesterolemiju, sepsu, dermatitis, psorijazu, Kronovu bolest, cističnu fibrozu, post transplantaciono kasno i hronično odbacivanje čvrstih organa, odbacivanje transplanta ćelija ili ostrvaca, multiplu sklerozu, sistemski eritemski lupus, Grejvsovu bolest, trombotičku bolest, zapaljenske bolesti creva, autoimunski dijabetes, dijabetesnu retinopatiju, rinitis, ishemijsko-reperfuzijsko oštećenje, post-angioplastičnu restenozu, osteomijelitis, prehladu, bolest izazvanu virusom gripa, hroničnu opstruktivnu bolest pluća (COPD), glomerulonefritis, Grejvsovu bolest, gastrointestinalne alergije, bolest srpastih ćelija i konjuktivitis.

[0058] Pored toga, nivoi sVCAM povišeni su kod različitih bolesti i poremećaja.Videti, npr. WO 2009/141786. Neograničavajući primeri ovih bolesti i poremećaja kod kojih su nivoi sVCAM povišeni, uključuju bolest srpastih ćelija (SCD), multipli mijelom, kardiovaskularnu bolest (aterosklerozu), infarkt miokarda, kolorektalni kancer, Hočkinovu bolest, bolest koronarnih arterija, ateroskleroznu aortnu ili torakalnu bolest, rak dojke, infekciju denga virusom, hemoragičnu groznicu, idiopatsku plućnu fibrozu, akutni respiratorni distres sindrom, bubrežnu funkciju kod pacijenata sa bolešću srpastih ćelija (albuminuriju), preeklampsiju, eklampsiju, alergijski kontaktni dermatitis, mijelom, ne-Hočkinov limfom, Hočkinov limfom, rak jajnika, rak bubrega, rak bešike, gastrointestinalni kancer, proliferativnu vitreoretinopatiju, dijabetesnu retinopatiju, endometriozu, sistemski eritemski lupus (SLE), akutnu mijeloidnu leukemiju, hipertrigliceridemiju, transplantaciju srca, plućnu sarkoidozu, moždani udar, bolest koronarnih arterija, aterosklerozu, dijabetes tipa II, kardiopulmonarni bajpas, sepsu, hroničnu insuficijenciju bubrega, bubrežni alograft, Grejvsovu bolest, trombozu dubokih vena i alergijski rinokonjunktivitis (alergijski rinitis).

7. MAdCAM kao ciljni molekul za lečenje zapaljenskih bolesti

[0059] Mukozni ćelijski adhezivni molekul adresin (MAdCAM) je član imunoglobulinske superfamilije receptora za ćelijsku adheziju. Iako MAdCAM igra fiziološku ulogu u imunološkom nadzoru creva, čini se da u uslovima hronične upale gastrointestinalnog trakta olakšava prekomernu ekstravazaciju limfocita kod zapaljenske bolesti creva. Na životinjskim modelima je pokazano da antitela koja inhibiraju vezivanje α4β7-pozitivnih limfocita za MAdCAM smanjuju regrutovanje limfocita, ekstravazaciju tkiva, zapaljenje i težinu bolesti. Smatra se da su antitela protiv MAdCAM ili kompozicija koja ih sadrži, korisni u lečenju različitih zapaljenskih bolesti.Videti, npr.objavljenu SAD patentnu prijavu br. 2009/0238820. Neograničavajuće zapaljenske bolesti koje mogu da se leče anti-MAdCAM antitelom uključuju Kronovu bolest, ulcerozni kolitis, divertikulitis, gastritis, bolest jetre, primarnu bilijarnu sklerozu, sklerozni holangitis, peritonitis, zapaljenje slepog creva, bilijarnu bolest, akutni transverzni mijelitis, alergijski dermatitis (npr. alergijska koža, alergijski ekcem, kožna atopija, atopijski ekcem, atopijski dermatitis, kožno zapaljenje, zapaljenski ekcem, zapaljenski dermatitis, iritaciju kože usled ujeda buva, vojni dermatitis, vojni ekcem, iritaciju kože kućnom prašinom), ankilozirajući spondilitis (Rajterov sindrom), astmu, zapaljenje disajnih puteva, aterosklerozu, arteriosklerozu, bilijarnu atreziju, upalu mokraćne bešike, karcinom dojke, kardiovaskularna zapaljenja (npr. vaskulitis, reumatske promene nabora nokta, čirevi na nogama, polimiozitis, hronično vaskularno zapaljenje, perikarditis, hronična opstruktivna bolest pluća), hronični pankreatitis, perineuralno zapaljenje, kolitis (uključujući amebni kolitis, infektivni kolitis, bakterijski kolitis, Kronov kolitis, ishemijski kolitis, ulcerozni kolitis, idiopatski proktokolitis, zapaljensku bolest creva, psuodomembranski kolitis), vaskularne poremećaje kolagena (reumatoidni artritis, sistemski eritemski lupus, progresivnu sistemsku sklerozu, bolest mešanog vezivnog tkiva, dijabetes melitus), Kronovu bolest (regionalni enteritis, granulomatozni ileitis, ileokolitis, zapaljenje sistema za varenje), demijelinizirajuću bolest (uključujući mijelitis, multiplu sklerozu, diseminiranu sklerozu, akutni diseminirani encefalomijelitis, perivensku demijelinizaciju, deficijenciju vitamina B12, Gijen-Bareov sindrom, retrovirus povezan sa MS), dermatomiozitis, divertikulitis, eksudativne dijareje, gastritis, granulomatozni hepatitis, granulomatozno zapaljenje, holecistitis, insulin-zavisni dijabetes melitus, zapaljenske bolesti jetre (fibrozu jetre, primarnu bilijarnu cirozu, hepatitis, sklerozni holangitis), upalu pluća (idiopatsku plućnu fibrozu, eozinofilni granulom pluća, plućnu histiocitozu X, peribronhiolarno zapaljenje, akutni bronhitis), limfogranulomu venereum, maligni melanom, bolest usta/zuba (uključujući gingivitis, periodontalnu bolest), mukozitis, upalu mišićno-skeletnog sistema (miozitis), nealkoholni steatohepatitis (nealkoholna bolest masne jetre), okularna i orbitalna zapaljenja (uključujući uveitis, optički neuritis, perifernu reumatoidnu ulceraciju, periferno zapaljenje rožnjače), osteoartritis, osteomijelitis, faringealno zapaljenje, poliartritis, proktitis, psorijazu, radijacione povrede, sarkoidozu, neuropatiju srpastih ćelija, površinski tromboflebitis, sindrom sistemskog zapaljenskog odgovora, tiroiditis, sistemski eritemski lupus, bolest kalem protiv domaćina, akutne opekotine, Behčetov sindrom i Sjegrenov sindrom.

8. Detekcija sVCAM i/ili sMAdCAM

[0060] sVCAM i/ili sMAdCAM mogu da se detektuju u biološkim uzorcima.Videti, npr. Leung et al., Immunol. Cell Biol.82: 400-409 (2004). Biološki uzorak uobičajeno može da bude telesna tečnost dobijena od pojedinca, na primer, krv, serum, sperma, urin, cerebrospinalna tečnost ili pljuvačka. Tečnost može da bude uzorak bez ćelija; međutim, uključivanje ćelija u uzorak telesne tečnosti ne sprečava detekciju i/ili kvantifikaciju sVCAM i/ili sMAdCAM. U konkretnim primerima izvođenja, tečnost može da bude serum ili plazma. sVCAM i/ili sMAdCAM mogu da se detektuju, na primer, pomoću dijagnostičkog kita.

[0061] Poznate su brojne tehnike za detekciju i kvantifikaciju proteina ili fragmenata proteina, u kojima se koriste imunološke tehnike. Primeri postupaka za detekciju proteinskih antigena u biološkim uzorcima, uključujući postupke u kojima se koriste trake za potapanje ili drugi imobilisani uređaji za ispitivanje, prikazani su, na primer, u sledećim patentima: SAD patenti br.

5,965, 356 (serološki test za tip Herpes simplex virusa); 6,114, 179 (postupak i kit testa za detekciju antigena i/ili antitela); i 6,057,097 (marker za patološka stanja koja obuhvataju autoimunsku reakciju i/ili zapaljensku bolest). Ovi postupci mogli bi lako da se prilagode za detekciju sVCAM i/ili sMAdCAM.

[0062] Kao primer može da se navede Western blot analiza koja može da se koristi za detekciju i kvantifikaciju sVCAM i/ili sMAdCAM u uzorku telesne tečnosti. U tipičnom Western blotu, proteini se elektroforetski razdvajaju na akrilamidnom gelu, zatim se prenose na membranu i detektuju pomoću jednog ili više antitela. Detekcija antitela može da bude direktna ili indirektna. U cilju direktne vizuelizacije sVCAM ili sMAdCAM proteina antitelima, blotovana membrana se inkubira sa obeleženim sredstvom koje specifično vezuje sVCAM ili sMAdCAM, na primer, sa sVCAM ili sMAdCAM antitelom koje je konjugovano sa alkalnom fosfatazom ili peroksidazom rena. Za indirektnu vizuelizaciju sVCAM ili sMAdCAM proteina antitelima, blotovana membrana se najpre inkubira s nekonjugovanim antitelom specifičnim za sVCAM ili sMAdCAM (primarno antitelo), a zatim sa obeleženim antitelom (sekundarno antitelo) koje prepoznaje primarno antitelo. Na primer, sekundarna antitela za indirektnu detekciju primarnih antitela često su konjugovana sa komponentom koja može da se detektuje, kao što je peroksidaza rena, alkalna fosfataza ili radioaktivni ili fluorescentni obeleživači.

[0063] Alternativno, sendvič ELISA test može da se koristi za otkrivanje i kvantifikaciju sVCAM i/ili sMAdCAM. Tipični sendvič ELISA format uključuje specifično imobilisano antitelo za hvatanje, uzorak, obeleženo antitelo za detekciju, hromogene i rastvor za zaustavljanje reakcije. Antigen će se vezati za imobilisano antitelo za hvatanje i na taj način može da ga detektuje jedno ili više antitela. Tehnika detekcije antitela koja se koristi sa ELISA testom može da bude direktna ili indirektna. Za direktnu vizuelizaciju sVCAM ili sMAdCAM proteina antitelima, anti-sVCAM ili anti-sMAdCAM antitelo je vezano za supstrat, supstrat se inkubira sa uzorkom telesne tečnosti, a supstrat se zatim inkubira sa drugim anti-sVCAM ili antisMAdCAM antitelom koje je konjugovano enzimom, na primer, antitelo protiv sVCAM ili antitelo protiv sMAdCAM konjugovano sa alkalnom fosfatazom ili peroksidazom rena. Za indirektnu vizuelizaciju sVCAM ili sMAdCAM proteina antitelima, anti-sVCAM antitelo ili anti-sMAdCAM antitelo je vezano za supstrat, a supstrat se inkubira sa uzorkom telesne tečnosti. Supstrat se zatim inkubira sa nekonjugovanim sVCAM specifičnim antitelom ili sMAdCAM specifičnim antitelom (primarno antitelo) i zatim sa antitelom za koje je vezan enzim (sekundarno antitelo), a koje prepoznaje primarno antitelo. Sekundarna antitela za indirektnu detekciju primarnih antitela često su konjugovana sa peroksidazom rena ili alkalnom fosfatazom. Zatim se dodaje rastvor supstrata, na koji enzim deluje i izaziva promenu boje. Intenzitet promene boje je proporcionalan količini antigena u originalnom uzorku. Primarna i sekundarna antitela se takođe mogu povezati sa radioaktivnim ili fluorescentnim obeleživačima. Intenzitet radioaktivnog ili fluorescentnog obeležavanja srazmeran je količini antigena koji je prisutan u originalnom uzorku.

[0064] Opciono, test detekcije proteina na bazi mikro-zrnaca (koji se naziva i test sa mikrosferma ili test sa zrncima, na bazi protoka) može da se koristi za detekciju sVCAM i/ili sMAdCAM u biološkim uzorcima, kao što je uzorak seruma od pojedinca. Ova tehnologija, predstavljena sistemima koje je razvila kompanije Luminex Corporation (Austin, TX) i drugim sistemima koje je razvila kompanija Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ), omogućava obradu vrlo male količine uzorka, obično 20 μl, za detekciju proteina, kao što su sVCAM i/ili sMAdCAM. Jedan aspekt ovog testa zasnovan je na kuplovanju antitela za hvatanje sa mikrosferama koje sadrže određene količine, na primer, crvene boje i infracrvene boje. Posle inkubacije mikrosfera sa uzorkom, sekundarnim antitelom za detekciju kuplovanim sa biotinom i streptavidinom koji je kuplovan sa fikoeritrinom, kuglice se analiziraju protočnim citometrom ili drugim protočnim sistemima za detekciju fluorescencije. Jedan laser detektuje zrnca, a drugi detektuje intenzitet fikoeritrina koji je vezan za ta zrnca (tehničke beleške su dostupne kod kompanije Luminex Corp., recimo na njihovoj veb stranici ili u njihovom katalogu).

PRIMERI

[0065] Sledeći primeri su dati kako bi se prikazali i dodatno ilustrovali određeni reprezentativni primeri izvođenja i aspekti predmetnog pronalaska i ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće za njegov obim.

Materijali i metode

Inhibitori alfa-4 integrina

[0066] Primeri inhibitora alfa-4 integrina (jedinjenja A-D), prikazani su na SL.1.

Kvantifikacija koncentracije jedinjenja A u plazmi

[0067] Jedinjenje A je mereno upotrebom LC/MS/MS postupka. Nakon dodavanja internog standarda, uzorci plazme (antikoagulans: litijum heparin) su ekstrahovani taloženjem proteina (acetonitril sa 0,1% mravlje kiseline). Nakon isparavanja filtriranog supernatanta do suva i rekonstitucije, ekstrakti su analizirani pomoću LC-API/MS/MS. MRM (višestruko praćenje reakcije) tranzicije za jedinjenje A i IS bili su m/z 257/114 i 270/91, redom. Donja granica kvantifikacije bila je 20 ng/mL.

Broj limfocita u krvi

[0068] Limfociti su kvantifikovani iz uzoraka cele krvi prikupljenih u epruvetama koje sadrže antikoagulans EDTA putem hematološkog analizatora Cell-Dyn 3700 (Abbott Diagnostics). Detekcija / kvantifikacija ekspresije alfa-4 integrina

[0069] Cela krv je sakupljana u epruvete u kojima se nalazio antikoagulans litijum heparin. Uzorci su obojeni anti-mišijim CD49d (alfa-4 integrin) antitelom obeleženim sa AlexaFluor647 (Biolegend, San Diego, CA) tokom 30 minuta. Crvena krvna zrnca su lizirana (FACS rastvor za liziranje, BD Biosciences, San Jose, CA) i uzorci su isprani dva puta u PBS koji sadrži 5% fetalnog goveđeg seruma. Upotrebom protočnog citometra BD FACScan analizirani su pomeraji geometrijske sredine intenziteta fluorescencije kod obojenih ćelija.

Primer 1 - Količina sVCAM u različitim pacovskim modelima bolesti je smanjena tokom inhibicije alfa-4 integrina (inhibitorima čiji su molekuli mali)

[0070] Inhibicija alfa-4 integrina dovela je do smanjenja sVCAM kod tri modela zapaljenske bolesti kod pacova. Jedinjenja A i C su pegilovani inhibitori alfa-4 integrina, čiji su molekuli mali. Jedinjenje B je nepegilovani inhibitor alfa-4 integrina, čiji su molekuli mali. Sve uzorke seruma analizila je firma Rules Based Medicine, Inc (Austin, TX) pomoću RodentMAP testa, multipleksiranog imunološkog testa na bazi zrnaca, na Luminex instrumentu (Luminex Corporation, Austin, TX), kako bi se odredile količine sVCAM u serumu pacova. Statistički podaci su izvedeni sa jednosmernom ANOVA.

[0071] Rezultati su predstavljeni na SL. 2. Kao što je prikazano na SL. 2A, Lewis pacovima je intradermalno ubrizgan homogenat bele mase kičmene moždine i mozga u kompletnom Frojndovom adjuvansu i potkožno su tretirani ciklosporinom A (2 mg/kg, svaki drugi dan) tokom 20 dana kako bi bio indukovan hronični eksperimentalni autoimunski encefalomijelitis. Na dan 30 nakon indukcije, pacovi su tretirani vehikulumom (fosfatom puferovani fiziološki rastvor, PBS) ili sa 10 mg/kg jedinjenja C, na svaka 3 dana. Na dan 40 nakon indukcije, uzorci seruma su sakupljeni i analiziran je sadržaj sVCAM u njima.

[0072] Kao što je prikazano na SL. 2B, Sprague-Dawley pacovima je intrarektalno ubačena 2,4,6-trinitrobenzen sulfonska kiselina (TNBS), kako bi se indukovao kolitis, ili samo etanol kao kontrola. Na dan 1 i 4 nakon ubacivanja TNBS, pacovima je potkožno data doza od 10 mg/kg jedinjenja C. Petog dana uzorci seruma su sakupljeni i analiziran je sadržaj sVCAM u njima.

[0073] Kao što je prikazano na SL. 2C i 2D, pacovi koji nose humani transgen HLA.B27 spontano razvijaju simptome zapaljenske bolesti creva kako stare. HLA.B27 transgeni pacovi stari 16-20 nedelja su potkožno tretirani jedinjenjem C (10 mg/kg svaka 3 dana), jedinjenjem A (10 mg/kg svakih 5 dana), jedinjenjem B (100 mg/kg dva puta dnevno) ili vehikulumom (PBS). Serum je uzorkovan nakon 20 (SL. 2C) ili 5 (SL. 2D) dana lečenja, i procenjeni su nivoi sVCAM. Inhibicija alfa-4 integrina u svakom ispitivanom modelu zapaljenske bolesti dovela je do statistički značajnog smanjenja nivoa sVCAM u serumu (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).

Primer 2 - Inhibicija alfa-4 integrina kod normalnih miševa dovodi do smanjene količine sVCAM (inhibitorima čiji su molekuli mali)

[0074] Kako bi se ispitalo da li inhibicija alfa-4 integrina reguliše nivoe sVCAM u odsustvu bolesti, normalnim (tj. neobolelim) pacovima ubrizgavani su alfa-4 inhibitori i mereni su nivoi sVCAM. Sprague Dawley pacovima su potkožno ubrizgane jedna doza jedinjenja A od 10 mg/kg (SL. 3A), jedna doza jedinjenja C od 10 mg/kg (SL.3B) ili doza od 100 mg/kg jedinjenja B dva puta dnevno tokom četiri dana (SL. 3C). Kao što je prikazano na SL. 3A i 3B, uzorci seruma sakupljeni su 2. i 11. dana nakon injekcije. Kao što je prikazano na SL. 3C, uzorci seruma su sakupljeni 2 sata, 12 sati i 11 dana nakon poslednje injekcije. Svi uzorci seruma analizirani su putem multipleksiranog imunološkog testa na bazi zrnaca, RodentMAP, na Luminex instrumentu, kako bi se odredile količine sVCAM u serumu pacova. Statistički podaci su izvedeni sa jednosmernom ANOVA. Sva tri inhibitora alfa-4 integrina smanjila su ekspresiju sVCAM kod normalnih pacova (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).

Primer 3 - Inhibicija alfa-4 integrina specifično smanjuje količinu sVCAM kod normalnih miševa (inhibitorima čiji su molekuli mali)

[0075] Da bi se utvrdilo da li je inhibicija alfa-4 integrin rezultirala specifičnom redukcijom solubilanog oblika njegovog liganda (tj. sVCAM), a ne solubilnim oblikom adhezivnog molekula koji nije alfa-4 integrin ligand (tj. ICAM -1) testirani su normalni miševi za modulaciju obe adhezijske molekule posle tretmana alfa-4 inhibitorom integrina. Balb/c miševima data je jedna potkožna injekcija Jedinjenja A (1 mg/kg ili 10 mg/kg) ili vehikuluma (PBS). Uzorci plazme uzeti su u 8 sati, 2 dana, 4 dana i 8 dana nakon doze. Uzorci plazme su analizirani ELISA solubilnim VCAM-1 i solubilnim ICAM-1 koristeći komercijalno dostupne komplete (R&D Systems, Minneapolis, MN) (n = 4 miša/grupi/vremenskoj tački). Kao što je prikazano na SL.4, čini se da je efekat inhibicije alfa-4 integrin specifičan za solubilni oblik svog liganda (sVCAM), a ne za solubilni oblik adhezivnog molekula koji nije ligand za alfa-4 integrin (sICAM).

Primer 4 - Efekat inhibitora alfa-4 integrina na smanjenje količine sVCAM zavisi od doze i u korelaciji je sa drugim markerima inhibicije alfa-4 integrina

[0076] Inhibicija alfa-4 integrina dovodi kako do povećanja broja cirkulišućih limfocita, tako i do smanjenja ekspresije alfa-4 integrina na površini leukocita u cirkulaciji. Ispitivana je korelacija nivoa sVCAM sa ekspresijom alfa-4 integrina i brojem limfocita u krvi nakon delovanja inhibitora alfa-4 integrina, kao i zavisnost svakog parametra od doze. Kao što je prikazano na SL. 5A-C, Balb/c miševima je potkožno davana doza od 0,1, 1 ili 10 mg/kg jedinjenja A ili vehikuluma(PBS). Dva dana nakon davanja doze, životinje su eutanazirane i uzeta je krv radi analize nivoa sVCAM, ekspresije alfa-4 integrina na površini leukocita i broja limfocita u krvi. Sadržaj sVCAM u uzorcima plazme analiziran je upotrebom ELISA testa (R&D Systems, Minneapolis, MN) (SL.5A) Alikvot cele krvi od istih životinja, obojen je anti-mišijim CD49d (alfa-4 integrin) antitelom obeleženim sa AlexaFluor647 (Biolegend, San Diego, CA), crvene krvna zrnca su lizirana (FACS rastvor za liziranje, BD Biosciences, San Jose, CA) i u njima su upotrebom BD FACScan protočnog citometra analizirani pomeraji srednjeg intenziteta fluorescencije (SL. 5B). U uzorcima cele krvi od istih životinja, analiziran je broj limfocita upotrebom Cell Dyn Hematology analizatora (Abbott Diagnostics, Illinois) (SL. 5C) Za određivanje statističke značajnosti korišćena je jednosmerna ANOVA analiza. Kao što je prikazano na SL.5D-F, C57BL/6 miševima je potkožno davana doza od 0,5, 1 ili 3 mg/kg jedinjenja C ili vehikuluma. Krv je uzeta na 4 sata i 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14 i 21 dan nakon davanja doze. Nivoi VCAM molekula solubilnog u plazmi (SL. 5D) i ekspresija alfa-4 integrina na leukocitima u krvi (SL. 5E) je analizirana kao što je opisano prethodno u tekstu. Odgovarajući nivoi u životinjama koje su tretirane vehikulumom (PBS) i od kojih su uzorci uzeti na dan 2 posle davanja doze, označeni su isprekidanim linijama. SL. 5F prikazuje korelaciju između ekspresije sVCAM i alfa-4 integrina na osnovu pojedinačnih životinja, u vremenskim tačkama od dana 1-21 (n = 4 miša/grupi/vremenskoj tački). Pokazano je da smanjenje ekspresije sVCAM molekula pomoću inhibitora alfa-4 integrina zavisi od doze i da je u dobroj korelaciji i sa ekspresijom alfa-4 integrina na površini leukocita, kao i sa brojem limfocita u krvi (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).

Primer 5 - Količina solubilnog VCAM takođe se smanjuje upotrebom antitela koje je inhibitor alfa-4 integrina

[0077] Da bi se pokazalo da efekat inhibicije alfa-4 integrina na nivoe sVCAM nije jedinstven za inhibitore alfa-4 integrina čiji su molekuli mali, ispitivana je sposobnost inhibitornog antitela za alfa-4 integrin da modulira nivoe sVCAM. Kao što je prikazano na SL. 6A, Balb/c miševima data je jednokratna intraperitonealna doza od 10 mg/kg pacovskog anti-mišijeg alfa-4 integrinskog antitela (klon PS/2) ili pacovsko IgG2b antitelo za izotipsku kontrolu. Uzorci krvi su uzeti pre davanja doze (netretirane životinje) i 2., 4. i 7. dana posle davanja doze i pomoću ELISA testa je analiziran nivo solubilnog VCAM u njima. Doza od 10 mg/kg PS/2, ali ne i izotipske kontrole, izazvala je trajno smanjenje sVCAM u plazmi. Kao što je prikazano na SL.

6B, sledeća studija je sprovedena kako da bi se procenila zavisnost od doze i vremena smanjenja sVCAM pomoću inhibitornog antitela za alfa-4 integrin. C57BL/6 miševi su tretirani intraperitonealno dozom PS/2 od 0,5, 1, 3 ili 10 mg/kg ili dozom pacovskog antitela IgG2b za izotipsku kontrolu od 10 mg/kg. Uzorci plazme prikupljeni su 4 sata i 1, 2, 4, 7, 10, 14 i 21 dan nakon davanja doze i analiziran je nivo sVCAM u njima. Podaci koji su prikazani na SL. 6 pokazuju da smanjenje sVCAM zavisi od doze PS/2 i da se nivoi sVCAM vremenom vraćaju na ranije vrednosti. Isprekidane linije prikazuju pojedinačne nivoe sVCAM na dan 2 kod miševa koji su tretirani antitelom za kontrolu izotipa (n = 4 miša/grupi/vremenskoj tački).

Primer 6 - sVCAM nivoi se snižavaju pomoću nepegilovanog inhibitora alfa-4 integrina, čiji je molekul mali. Sam PEG ne utiče na nivoe sVCAM.

[0078] Da bi se pokazalo da efekat inhibicije alfa-4 integrina na nivoe sVCAM nije ograničen na pegilovane inhibitore čiji su molekuli mali, kao ni da ih izaziva sam PEG, normalnim miševima je data doza jedinjenja D (nepegilovani inhibitor alfa-4 integrina) i PEG okosnica na kojoj je izgrađeno jedinjenje A. Balb/c miševima davana je jedna potkožna doza vehikuluma (PBS), jedna potkožna doza jedinjenja A (10 mg/kg), jedna potkožna doza PEG okosnice na kojoj je izgrađeno jedinjenje A (10 mg/kg) ili 5 potkožnih doza jedinjenja D (50 mg/kg), svakih 12 sati. Dva dana nakon ubrizgavanja jedinjenja A i PEG, i 4 sata nakon poslednje injekcije jedinjenja D, uzet je uzorak krvi. sVCAM je meren ELISA testom (R&D Systems) (SL. 7A) a limfociti u krvi su kvantifikovani pomoću analizatora Cell-Dyn Hematology (Abbott Diagnostics) (SL. 7B). Statističke analize su sprovedene pomoću jednosmerne ANOVA analize i označene su statistički značajne razlike u poređenju sa životinjama koje su tretirane vehikulumom. I jedinjenje A i jedinjenje D, ali ne i PEG, bili su u stanju da izazovu povećan broj limfocita u krvi i da smanje prisustvo sVCAM u plazmi (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p <0,001).

Primer 7 - Efekti inhibicije alfa-4 integrina na nivoe solubilnog VCAM zavise od doze i gube se kada nivoi inhibitora alfa-4 integrina u plazmi opadaju.

[0079] Da bi se utvrdilo da li je regulacija sVCAM inhibitorima alfa-4 integrina u vezi sa nivoom leka u cirkulaciji i da li je efekat na sVCAM reverzibilan, ovi parametri su mereni tokom perioda od tri nedelje nakon davanja doze normalnim miševima. C57BL/6 miševima je potkožno data jedna doza jedinjenja A od 0,5, 1 ili 3 mg/kg ili vehikulum (PBS). Krv je uzorkovana četiri sata i 1, 2, 3, 4, 10, 14 i 21 dan nakon davanja doze i nivoi sVCAM u plazmi su analizirani pomoću ELISA testa (isprekidane linije označavaju kontrolne nivoe vehikuluma na dan 2) (SL.

8A) i nivoe Jedinjenja A u plazmi pomoću LC/MS/MS metode (SL. 8B). Granica detekcije za Jedinjenje A pri upotrebi ove metode je 10 ng/ml. Nivoi sVCAM i jedinjenja A dobijeni na dane 1-21 prikazani su na bazi pojedinačnih miševa kako bi se prikazala korelacija (SL. 8C). Nivoi sVCAM pokazali su dobru korelaciju sa nivoom leka u cirkulaciji i vratili su se na osnovnu vrednost kada nivoi leka nisu više mogli da se detektuju u plazmi (* p <0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).

Primer 8 - Količina sMAdCAM se smanjuje kada je alfa-4 integrin inhibiran u mišijim modelima kolitisa

[0080] Jedinjenje C predstavlja pegilovani inhibitor, čiji je molekul mali, kako alfa-4 beta-1 integrina, tako i alfa-4 beta-7 integrina. PS/2 je pacovsko anti-mišije antitelo koje blokira alfa-4 integrin. Oba ova inhibitora alfa-4 integrina primenjeni su kod miševa sa indukovanim oblicima kolitisa. Nivo sMAdCAM u uzorcima seruma je testiran ELISA testom (R&D Systems, Minneapolis, MN). U prvom mišijem modelu kolitisa, CD45RBhi CD4+ ćelije su izolovane iz Balb/c slezina putem sortiranja ćelija aktiviranog magnetnim zrncima za CD4+ ćelije (kit za izolaciju nepromenjenih CD4+ ćelija, Miltenyi Biotec) nakon čega je usledilo sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom kako bi se izdvojile CD45RBhi ćelije. CD4+ CD45RBhi ćelije su ubrizgavane intraperitonealno u SCID miševe. Simptomi kolitisa počeli su da se pojavljuju nedelju dana nakon transfera ćelija. Osam nedelja nakon transfera, životinje su tretirane ili vehikulumom (PBS) ili jedinjenjem C (10 mg/kg), na svaka 3 dana, tokom perioda od 15 dana. U tom trenutku su životinje žrtvovane i uzorci seruma su analizirani na sMAdCAM. Rezultati su predstavljeni na SL. 9A. Prikazani su statistički podaci na osnovu poređenja sa grupom CD45RBhi transfer vehikulum. Transfer ćelija značajno je povećao količinu cirkulišućeg sMAdCAM. Podaci prikazani na SL. 9A pokazuju da je tretman jedinjenjem C statistički značajno smanjio nivoe sMAdCAM.

[0081] U drugom modelu miša, hronični kolitis je indukovan kod Balb/c miševa primenom 4% dekstran sulfat natrijuma (DSS) u njihovoj vodi za piće tokom 7 dana, nakon čega su 7 dana pili vodu iz slavine. Ovaj ciklus je ponovljen četiri puta. Miševi su pokazali simptome kolitisa tokom svakog ciklusa DSS. Na dan 56, miševi su ušli u hronično stanje bolesti i otpočelo je lečenje bilo vehikulumom (PBS) ili jedinjenjem C (10 mg/kg), svaka 3 dana tokom 15 dana. U tom trenutku su životinje žrtvovane i u uzorcima seruma je analiziran sadržaj sMAdCAM. Rezultati su predstavljeni na SL. 9B. Prikazani su statistički podaci na osnovu poređenja sa nivoima sMAdCAM u naivnim miševima. Podaci prikazani na SL.9B ukazuju na to da (1) DSS indukuje statistički značajno povećanje količine sMAdCAM u serumu, i (2) lečenje jedinjenjem C statistički značajno smanjuje nivoe sMAdCAM.

[0082] U trećem modelu miša, kod Balb/c miševa je primenjen 3% DSS u vodi za piće tokom 5 dana kako bi se indukovao akutni kolitis. Na dan 6, voda je zamenjena vodom iz slavine i životinjama je data doza jedinjenja C (10 mg/kg svaka 3 dana) ili PS/2 (10mg/kg svakih 5 dana). Serum je sakupljen na dan 14 i u uzorcima je analiziran sadržaj sMAdCAM. Rezultati su predstavljeni na SL. 9C. U obe tretirane grupe, nivo sMAdCAM bio je ispod granice kvantifikacije (BQL) testa (SL. 9C). Ovi eksperimenti pokazuju da inhibicija alfa-4 integrina u mišijim modelima kolitisa dovodi do statistički značajnog smanjenja nivoa sMAdCAM (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001).

Primer 9 - Količina sMAdCAM se smanjuje kod normalnih miševa kada je alfa-4 integrin inhibiran inhibitorom čiji je molekul mali

[0083] Jedinjenje D je inhibitor alfa-4 integrina čiji je molekul mali i čija je sposobnost da smanji nivo sMAdCAM u plazmi normalnih miševa ispitivana. Kod Balb/c miševa je potkožno primenjivano 50 mg/kg jedinjenja D ili vehikuluma (PBS), na svakih 12 sati. Četiri sata nakon 5. doze, uzet je uzorak plazme i prisustvo sMAdCAM u njemu je analizirano ELISA testom. Rezultati koji su prikazani na SL. 10, pokazuju da tretman jedinjenjem D dovodi do statistički značajnog smanjenja sMAdCAM u plazmi (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).

Primer 10 - Antitelo koje je inhibitor alfa-4 integrina takođe dovodi do smanjenja sMAdCAM usled modulacije kod normalnih miševa

[0084] Da bi se testiralo da li inhibitorsko antitelo za alfa-4 integrin može da modulira nivoe sMAdCAM, da bi se testirala zavisnost od doze i izmerila sposobnost nivoa sMAdCAM da se oporave nakon inhibicije alfa-4 integrina, PS/2 je primenjen intraperitonealno na miševima C57BL/6 sa 0,5, 1, 3 i 10 mg/kg i plazma je uzorkovana četiri sata i 1, 2, 4, 7, 10, 14 i 21 dana nakon davanja doze. Kao kontrola, pacovsko antitelo IgG2b za izotipsku kontrolu dato je intraperitonealno u dozi od 10 mg/kg, a plazma je uzorkovana na dan 2. Nivoi sMAdCAM u uzorcima plazme mereni su ELISA testom (SL. 11) Isprekidane linije označavaju nivo sMAdCAM koji je prisutan u 4 miša tretirana izotipskom kontrolnom na dan dva (n = 4 miša/grupi/vremenskoj tački; LLOQ = donja granica kvantifikacije ELISA testa). Podaci prikazani na SL. 4 pokazuju da inhibitorsko antitelo za alfa-4 integrin dozno zavisno modulira nivoe sMAdCAM.

Primer 11 - Smanjenje sMAdCAM inhibitorima alfa-4 integrina zavisi od doze, reverzibilno je, i u korelaciji sa in vitro selektivnošću inhibitora alfa-4 integrina za integrinski heterodimer α4β7

[0085] Alfa-4 integrin obrazuje heterodimere bilo sa beta-1 ili beta-7 integrinima. MAdCAM je ligand za alfa-4 beta-7 (α4β7) dok je VCAM ligand za alfa-4 beta-1 (α4β1). Inhibitori alfa-4 integrina mogu da prikažu različitu selektivnost za α4β7 i α4β1. Da bi se testiralo da li je in vitro selektivnost alfa-4 inhibitora za α4β7 u korelaciji sa in vivo smanjenjem sMAdCAM, izvedeni su eksperimenti u kojima su upotrebljena dva inhibitora alfa-4 integrina koji prikazuju različitu selektivnost za α4β7. I jedinjenje C i jedinjenje A predstavljaju pegilovane inhibitore alfa-4 integrina čiji su molekuli mali.

[0086] SL.12A prikazuje in vitro selektivnost ovih jedinjenja za α4β1 i α4β7. Indukcija epitopa specifičnih za α4β1 i α4β7merena je pomoću sledećeg testa. Limfociti izolovani iz ljudske krvi gradijentom fikola, inkubirani su sa titriranim jedinjenjem A ili jedinjenjem C u PBS sa 5% FBS i sa, ili 10 mg/ml 2G3 (ligandom indukovano anti-beta-7 antitelo) ili 15/7 (ligandom indukovano anti-beta-1 antitelo). Posle inkubacije sa PE-konjugovanim anti-mišijim IgG sekundarnim antitelom, indukcija epitopa je merena protočnom citometrijom. Podaci su izraženi kao % vezivanja. Podaci koji su prikazani na SL. 12A ukazuju na to da (1) se jedinjenje C vezuje za integrine α4β1 i α4β7 sa jednakom potencijom; i (2) je vezivanje jedinjenje A 100 puta selektivnije za α4β1 u odnosu na α4β7.

[0087] Da bi se istražilo da li se in vitro selektivnost prevodi u diferencijalno smanjenje sMAdCAM in vivo, jedinjenje A i jedinjenje C su potkožno primenjeni na C57BL/6 pri 0,1, 0,3, 0,5, 1 i 3 mg/kg.48 sati nakon davanja doze sakupljena je plazma i sMAdCAM je kvantitativno određen. Rezultati su predstavljeni na SL. 12B. Jedinjenje C deluje na smanjenje sMAdCAM snažnije od jedinjenja A, što sugeriše da selektivnost za α4β7 posreduje pri delovanju na solubilni oblik njegovog liganda. Značajnost je izračunata jednosmernom ANOVA analizom i upoređena sa vehikulumom kao kontrolom (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001, n = 4 miša/grupi, ND = nije urađeno).

[0088] Da bi se izmerio odnos doza/vreme za smanjenje sMAdCAM usled inhibicije α4β7, potkožno su primenjene doze i jedinjenja A (SL. 12C) i jedinjenja C (SL. 12D) kod C57BL/6 miševa pri 0,5, 1 i 3 mg/kg, a plazma je prikupljena 4 sata i 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14 i 21 dan nakon davanja doze. Isprekidane linije označavaju nivo sMAdCAM u životinjama tretiranim vehikulumom na dan 2 (n = 4 miša/grupa/vremenskoj tački). Kao što je prikazano na SL. 12D, jedinjenje C, opšti inhibitor alfa-4 integrina, smanjio je sMAdCAM u većoj meri nego jedinjenje A koje je selektivni inhibitor za α4β1. Ovo sugeriše da je inhibicija α4β7 neophodna kako bi se proizvelo smanjenje sMAdCAM. Pored toga, nivoi MAdCAM vremenom se oporavljaju do početnih nivoa.

[0089] Kao što je prikazano na SL. 12E i 12F, sVCAM je meren u uzorcima uzetim od istih životinja koje su korišćene kao što je prethodno opisano, pomoću ELISA testa (R&D Systems). Isprekidane linije označavaju nivo sVCAM u životinjama tretiranim vehikulumom na dan 2 (n = 4 miša/grupi/vremenskoj tački). I jedinjenje A i jedinjenje C imali su u sličnoj meri snažno delovanje na smanjenje sVCAM u uzorcima plazme, ukazujući na sličnu selektivnost ovih jedinjenja za α4β1 koji je VCAM ligand. Sveukupno, ovi podaci ukazuju na to da se in vitro selektivnost za α4β7 ili α4β1 ogleda in vivo u smanjenju sMAdCAM ili sVCAM, redom.

[0090] Selektivnost jedinjenja A koja je prethodno razmatrana, dodatno je verifikovana kod ljudi. U tom cilju je kod četrdeset i jednog pojedinca oralno primenjeno jedinjenje A u koncentraciji od 0,5 mg/kg. Puna krv je sakupljana u različitim vremenskim tačkama nakon davanja doze (do 28 dana nakon davanja doze). Nivoi, kako sVCAM, tako i sMAdCAM su kvantifikovani ELISA testom kao što je prethodno u tekstu opisano. Poznato je da jedinjenje A blokira vezivanje 9F10 za alfa-4 integrine. Nivoi ekspresije α4β1 i α4β7 određeni su merenjem srednjeg intenziteta fluorohroma (MFI) belih krvnih zrnaca inkubiranih sa fluorescentno obeleženim 9F10 (mišijim anti-humanim alfa-4 integrinskim antitelom). Takođe je poznato da jedinjenje A, nakon vezivanja za integrinske receptore, indukuje ekspresiju specifičnih epitopa vezujućih mesta koja se indukuju ligandima, na β1 i β7 subjedinicama, koje su prepoznaju mišija monoklonska antitela 15/7 i 2G3 (kao što je prethodno u tekstu opisano). Nivoi zasićenja α4β1 i α4β7 su određeni upotrebom fluorescentno obeleženih 15/7 i 2G3 antitela, i izračunati na sledeći način:

Podaci su prikazani na SL. 13. SL. 13A pokazuje da primena jedinjenja A kod ljudi dovodi do izraženog smanjenja nivoa ekspresije α4β1 već od dana 1 nakon davanja doze pa do najmanje 14 dana nakon davanja doze. Nivoi α4β1 vraćaju se na bazni nivo oko 7 dana nakon davanja doze. SL. 13B pokazuje da α4β1 postaje zasićen oko dva dana nakon primene jedinjenja A, a zasićenost traje najmanje još 13 dana (15 dana nakon davanja doze). Nivo zasićenosti α4β7, međutim, značajno opada 8 dana nakon primene. Kao što je prikazano na SL. 13C, nivoi sVCAM značajno se smanjuju 1 dan nakon primene, i počinju da se vraćaju na osnovnu vrednost (od pre primene) 14 dana nakon primene. Nivoi sMAdCAM, međutim, ostaju blizu osnovnog nivoa čak i 28 dana nakon primene. Ovi podaci su u skladu sa prethodno iznetim zapažanjem dobijenim in vitro, da se jedinjenje A selektivnije vezuje za α4β1 nego za α4β7.

Primer 12 - Korelacija između nivoa inhibitora alfa-4 integrina i nivoa sVCAM/sMAdCAM kod miševa

[0091] Kod trideset i osam (38) miševa (C57BL/6) intraperitonealno je primenjeno, u različitim količinama, PS/2 (anti-alfa-4 integrinsko antitelo). Uzorci plazme prikupljeni su u različitim vremenskim tačkama nakon davanja doze. Nivoi sVCAM, sMAdCAM i PS/2 u uzorcima plazme, analizirani su ELISA postupcima koji su opisani u primerima u prethodnom tekstu. Nivoi sVCAM i sMAdCAM (% prosečne vrednosti za vehikulum) prikazani su na grafiku nasuprot koncentracija PS/2, kao što je prikazano na SL. 14. Rezultati ukazuju na snažne negativne linearne korelacije, kako za sVCAM (r = -0,61; p < 0,0001) tako i za sMAdCAM (r = -0,42; p < 0.0041), naime, što je viša koncentracija anti-alfa-4 integrinskog antitela (što odgovara višem nivou inhibicije alfa-4 integrina), to je niži nivo sVCAM ili sMAdCAM.

[0092] Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu obezbeđuju postupak za praćenje promene aktivnosti alfa-4 integrina kod pojedinca posmatranjem korelacije sa solubilnim vaskularnim ćelijskim adhezivnim molekulom (sVCAM) i/ili solubilnim mukoznim adresinskim ćelijskim adhezivnim molekulom (sMAdCAM).

[0093] Na primer, primeri izvođenja predmetnog prikaza (1) obezbeđuju in vitro postupak za određivanje razlike u aktivnosti alfa-4 integrina kod pojedinca sa autoimunom bolešću, koji obuhvata: a) merenje solubilnog molekula u prvom biološkom uzorku telesne tečnosti, dobijenom od pojedinca neposredno pre primene inhibitora alfa-4 integrina; b) merenje solubilnog molekula u drugom biološkom uzorku telesne tečnosti odabrane iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma i plazme i koji je dobijen od pojedinca u roku od trideset i jednog dana nakon primene inhibitora alfa-4 integrina; i c) utvrđivanje da li postoji smanjenje nivoa solubilnog molekula između prvog i drugog biološkog uzorka, pri čemu je smanjenje u korelaciji sa padom alfa-4 integrinske aktivnosti kod pojedinca, čime se utvrđuje da li postoji razlika u aktivnost alfa-4 integrina kod pojedinca nakon primene inhibitora alfa-4 integrina u poređenju sa situacijom pre primene inhibitora alfa-4 integrina, i gde je solubilni molekul sVCAM i/ili sMAdCAM i pri čemu je autoimuna bolest odabrana iz grupe koja je sastoji od multiple skleroze (MS), meningitisa, encefalitisa, zapaljenske bolesti creva, reumatoidnog artritisa (RA), astme, ateroskleroze, nefritisa, atopijskog dermatitisa, psorijaze, eritemskog lupusa i epilepsije.

[0094] (2) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju postupak prema prethodno navedenoj stavki (1), koji dodatno obuhvata detekciju smanjenja u nivoima solubilnog molekula u drugom biološkom uzorku u poređenju sa prvim biološkim uzorkom, i pripisivanje navedenog smanjenja smanjenju aktivnosti alfa-4 integrina kod pojedinca, nakon primene inhibitora alfa-4 integrina u poređenju sa stanjem pre primene inhibitora alfa-4 integrina.

[0095] (3) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju postupak prema prethodno navedenoj stavki (1) ili (2), pri čemu aktivnost alfa-4 integrina predstavlja aktivnost alfa-4 beta-1 integrina, i gde je solubilni molekul sVCAM.

[0096] (4) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju postupak prema prethodno navedenoj stavki (1) ili (2), pri čemu aktivnost alfa-4 integrina predstavlja aktivnost alfa-4 beta-7 integrina, i gde je solubilni molekul sMAdCAM.

[0097] (7) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju postupak prema bilo kojoj od prethodnih stavki (1)-(6), pri čemu je inhibitor alfa-4 integrina antitelo.

[0098] (8) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju postupak prema bilo kojoj od prethodnih stavki (1)-(7), pri čemu je prvi i/ili drugi biološki uzorak odabran iz grupe koja se sastoji od telesne tečnosti odabrane iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma i plazme.

[0099] (10) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju postupak prema prethodno navedenoj stavki (8), pri čemu je prvi i/ili drugi biološki uzorak u obliku zamrznute plazme ili seruma.

[0100] (11) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju postupak prema bilo kojoj od prethodnih stavki (1)-(10), pri čemu je drugi biološki uzorak dobijen od pojedinca jedan dan nakon primene inhibitora alfa-4 integrina.

[0101] (12) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju postupak prema bilo kojoj od prethodnih stavki (1)-(11), pri čemu se solubilni molekul meri postupkom odabranim iz grupe koja se sastoji od enzimskih imunosorbentnih testova (ELISA), radioimunotestova (RIA), Western blotinga i testa za detekciju proteina, na bazi zrnaca.

[0102] (13) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju postupak prema bilo kojoj od prethodnih stavki (1)-(12), koji dodatno obuhvata utvrđivanje da li je kod pojedinca neophodno prilagođavanje lečenja, gde odsustvo smanjenja ili smanjenje bez statističke značajnosti (p > 0.05) u nivoima solubilnog molekula od prvog do drugog biološkog uzorka, ukazuje na neefikasan odgovor na inhibitor alfa-4 integrina, koji zahteva prilagođavanje lečenja kod tog pojedinca.

[0103] (14) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju postupak prema prethodno navedenoj stavki (13), koji dodatno obuhvata detekciju odsustva smanjenja, ili detekciju smanjenja bez statističke značajnosti (p > 0.05), nivoa solubilnog molekula u drugom biološkom uzorku u poređenju sa prvim biološkim uzorkom, i zaključak da je prilagođavanje lečenja neophodno kod pojedinca.

[0104] (15) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju postupak prema prethodno navedenoj stavki (13) ili (14), pri čemu prilagođavanje lečenja obuhvata promenu inhibitora alfa-4 integrina koji se koristi ili povećanje doze inhibitora alfa-4 integrina.

[0105] (16) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju in vitro upotrebu sVCAM i/ili sMAdCAM kao farmakodinamičkih biomarkera za aktivnost (i) alfa-4 integrina ili (ii) modulatora aktivnosti alfa-4 integrina.

[0106] (17) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju upotrebu prema prethodno navedenoj stavki (16), koja obuhvata in vitro upotrebu sVCAM i/ili sMAdCAM kao farmakodinamičkih biomarkera za navedenu aktivnost kod pojedinca koji se leči modulatorom aktivnosti alfa-4 integrina.

[0107] (18) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju upotrebu prema prethodno navedenoj stavki (17), pri čemu je modulator inhibitor alfa-4 integrina.

[0108] (19) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju upotrebu prema prethodnoj stavki (17), pri čemu pojedinac ima bolest ili stanje povezano sa patološkim ili hroničnim zapaljenjem, opciono izabrano iz grupe koja se sastoji od multiple skleroze (MS), meningitisa, encefalitisa, zapaljenske bolesti creva, reumatoidnog artritisa (RA), astme, akutnog juvenilnog dijabetesa, AIDS demencije, ateroskleroze, nefritisa, retinitisa, atopijskog dermatitisa, psorijaze, ishemije miokarda, hroničnog prostatitisa, komplikacija srpaste anemije, eritemskog lupusa i akutnog oštećenja pluća posredovanog leukocitima.

[0109] (20) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju upotrebu prema bilo kojoj od prethodnih stavki (16)-(19), pri čemu aktivnost alfa-4 integrina predstavlja aktivnost alfa-4 beta-1 integrina, i gde je farmakodinamički biomarker sVCAM.

[0110] (21) Primeri izvođenja prema predmetnom prikazu takođe obezbeđuju upotrebu prema bilo kojoj od prethodnih stavki (16)-(19), pri čemu aktivnost alfa-4 integrina predstavlja aktivnost alfa-4 beta-7 integrina, i gde je farmakodinamički biomarker sMAdCAM.

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. In vitro postupak određivanja razlike u aktivnosti alfa-4 integrina kod pojedinca sa autoimunom bolešću, koji obuhvata:

a) merenje solubilnog molekula u prvom biološkom uzorku telesne tečnosti odabrane iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma i plazme i dobijenim od pojedinca neposredno pre primene inhibitora alfa-4 integrina;

b) merenje solubilnog molekula u drugom biološkom uzorku, pri čemu je drugi biološki uzorak telesne tečnosti odabran iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma i plazme i dobijen je od pojedinca u roku od trideset i jednog dana nakon primene inhibitora alfa-4 integrina; i c) određivanje da li postoji smanjenje nivoa solubilnog molekula u drugom, u odnosu na prvi biološki uzorak, pri čemu je smanjenje u korelaciji sa smanjenjem aktivnosti alfa-4 integrina kod pojedinca, čime se utvrđuje da li postoji razlika između aktivnosti alfa-4 integrina kod pojedinca nakon primene inhibitora alfa-4 integrina u poređenju sa stanjem pre primene inhibitora alfa-4 integrina,

gde je solubilni molekul sVCAM i/ili sMAdCAM, i gde je autoimuna bolest odabrana iz grupe koja se sastoji od multiple skleroze (MS), meningitisa, encefalitisa, zapaljenske bolesti creva, reumatoidnog artritisa (RA), astme, ateroskleroze, nefritisa, atopijskog dermatitisa, psorijaze, eritemskog lupusa i epilepsije.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, koji dalje obuhvata detektovanje smanjenja nivoa solubilnog molekula u drugom biološkom uzorku u poređenju sa prvim biološkim uzorkom, i pripisivanje navedenog smanjenja smanjenju aktivnosti alfa-4 integrina kod pojedinca nakon primene inhibitora alfa-4 integrina, u poređenju sa stanjem pre primene inhibitora alfa-4 integrina, poželjno, pri čemu aktivnost alfa-4 integrina predstavlja aktivnost alfa-4 beta-1 integrina, i gde je solubilni molekul sVCAM; ili, pri čemu aktivnost alfa-4 integrina predstavlja aktivnost alfa-4 beta-7 integrina, i gde je solubilni molekul sMAdCAM.

3. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je inhibitor alfa-4 integrina antitelo.

4. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je prvi i/ili drugi biološki uzorak u obliku zamrznute plazme ili seruma.

5. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se biološki uzorak dobija od pojedinca jedan dan nakon primene inhibitora alfa-4 integrina.

6. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se solubilni molekul meri postupkom odabranim iz grupe koja se sastoji od enzimskih imunosorbentnih testova (ELISA), radioimunotestova (RIA), Western blotinga i testa za detekciju proteina na bazi zrnaca.

7. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji dalje obuhvata određivanje da li je potrebno prilagođavanje lečenja pojedinca, pri čemu odsustvo smanjenja, ili smanjenje koje nije statistički značajno (p > 0.05), nivoa solubilnog molekula u drugom, u odnosu na prvi biološki uzorak, ukazuje na neefikasan odgovor na inhibitor alfa-4 integrina, što zahteva prilagođavanje lečenja kod pojedinca.

8. Postupak prema patentnom zahtevu 7, koji dalje da obuhvata detektovanje odsustva smanjenja, ili detektovanje smanjenja koje nije statistički značajno (p > 0.05), nivoa solubilnog molekula u drugom biološkom uzorku, u poređenju s prvim biološkim uzorkom, i zaključak da je prilagođavanje lečenja kod pojedinca neophodno.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 6 ili patentnom zahtevu 7, naznačen time što prilagođavanje lečenja sadrži zamenu inhibitora drugim inhibitorom alfa-4 integrina ili povećanje doze inhibitora alfa-4 integrina.

10. In vitro upotreba sVCAM i/ili sMAdCAM kao farmakodinamičkih biomarkera za aktivnost (i) alfa-4 integrina ili (ii) modulatora aktivnosti alfa-4 integrina.

11. Upotreba prema patentnom zahtevu 10, koja obuhvata in vitro upotrebu sVCAM i/ili sMAdCAM kao farmakodinamičkih biomarkera za navedenu aktivnost kod pojedinca koji se leči modulatorom aktivnosti alfa-4 integrina, poželjno, pri čemu je modulator inhibitor alfa-4 integrina.

12. Upotreba prema patentnom zahtevu 11, naznačena time što pojedinac ima bolest ili stanje povezano sa patološkim ili hroničnim zapaljenjem, izborno izabrano iz grupe koja se sastoji od multiple skleroze (MS), meningitisa, encefalitisa, zapaljenske bolesti creva, reumatoidnog artritisa (RA), astme, akutnog juvenilnog dijabetesa, AIDS demencije, ateroskleroze, nefritisa, retinitisa, atopijskog dermatitisa, psorijaze, ishemije miokarda, hroničnog prostatitisa, komplikacija srpaste anemije, eritemskog lupusa i akutnog oštećenja pluća posredovanog leukocitima.

13. Upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva 10 ili 11, naznačena time što aktivnost alfa-4 integrina predstavlja aktivnost alfa-4 beta-1 integrina i pri čemu je farmakodinamički biomarker sVCAM; ili pri čemu aktivnost alfa-4 integrina predstavlja aktivnost alfa-4 beta-7 integrina i pri čemu je farmakodinamički biomarker sMAdCAM.