[go: up one dir, main page]

RS66106B1 - Kompozicije i postupci za lečenje homocistinurije - Google Patents

Kompozicije i postupci za lečenje homocistinurije

Info

Publication number
RS66106B1
RS66106B1 RS20241229A RSP20241229A RS66106B1 RS 66106 B1 RS66106 B1 RS 66106B1 RS 20241229 A RS20241229 A RS 20241229A RS P20241229 A RSP20241229 A RS P20241229A RS 66106 B1 RS66106 B1 RS 66106B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
htcbs
peg
mice
levels
hours
Prior art date
Application number
RS20241229A
Other languages
English (en)
Inventor
Jan P Kraus
Tomas Majtan
Erez Bublil
Original Assignee
Univ Colorado Regents
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US14/935,690 external-priority patent/US9675678B2/en
Application filed by Univ Colorado Regents filed Critical Univ Colorado Regents
Publication of RS66106B1 publication Critical patent/RS66106B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/205—Amine addition salts of organic acids; Inner quaternary ammonium salts, e.g. betaine, carnitine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A61K31/385—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom having two or more sulfur atoms in the same ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01022—Cystathionine beta-synthase (4.2.1.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se uopšteno odnosi na enzimsku zamensku terapiju (ERT) upotrebom mutanta C15S humane skraćene CBS (htCBS) da bi se značajno smanjile koncentracije homocisteina (Hcy) u serumu, i da bi se povratili nivoi njegovih nishodnih metabolita kao što su cistationin i cistein. Dalje, ERT sa htCBS mutantom C15S se koristi za lečenje homocistinurije.
OSNOV PRONALASKA
[0002] Cistationin beta-sintaza (CBS) je prvi enzim na putu transsulfuracije, koji katalizuje kondenzaciju serina i homocisteina (Hcy) u cistationin, koji se zatim hidrolizuje do cisteina putem cistationin gama-lijaze (CGL). U biologiji sistema, robusnost biološkog sistema je definisana kao njegova mogućnost da ispravno funkcioniše u slučaju poremećaja, a redundancija elemenata u sistemu je jedan od mehanizama kojima se postiže robusnost (Kitano, H. 2004, Nature Reviews Genetics, 5:826-837). Međutim, čini se da sistemu biološke transsulfuracije u velikoj meri nedostaje redundantnost komponenti, što ovaj sistem čini sklonim ka mutacionim poremećajima. Na primer, enzim CBS je jedina komponenta koja može da preradi homocistein u cistationin. Ograničena redundantnost sistema delimično postoji u obliku homocisteina, pri čemu prvi metabolit koji se uliva u put, može alternativno da se pretvori u metionin kroz put remetilacije, čime se ublažava opterećenje homocisteinom. Pored toga, cistein, nishodni proizvod, može da se dobije direktno putem ishrane. Bez obzira na to, ovi putevi su ograničeni u svojim mogućnostima održavanja normalnih nivoa metabolita, a nedostatak CBS funkcije ima štetne posledice za humane pacijente ukoliko se ne leči. Inaktivacija CBS dovodi do homocistinurije sa nedostatkom cistationin beta-sintaze (CBSDH), čiji je uobičajeni naziv klasična homocistinurija.
[0003] Postoje ograničene terapijske opcije za lečenje CBSDH, a trenutne opcije za lečenje smanjuju homocistein ali nemaju tendenciju da normalizuju cistationin (Cth) ili cistein (Cys) i samim tim ove opcije lečenja mogu biti neadekvatne za obezbeđivanje opcija robusnog i efikasnog lečenja. Stoga, ostaje potreba u tehnici za efikasnijim strategijama lečenja pojedinaca sa homocistinurijom.
[0004] Ovaj pronalazak se bavi ovom potrebom obezbeđivanjem kompozicija za lečenje CBSDH.
KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA
[0005] Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.
[0006] Ovo otkriće obezbeđuje kompoziciju koja sadrži izolovani mutantni polipeptid humane skraćene cistationin beta sintaze (htCBS) konjugovan sa PEG grupom, pri čemu izolovani mutantni polipeptid htCBS sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 sa izmenom cisteina na aminokiselinskom položaju koji odgovara položaju 15 u SEQ ID NO:3 u serin i ne sadrži N-terminalni prvi metioninski ostatak koji odgovara SEQ ID NO:3, i PEGilovan je sa ME-200GS; za upotrebu u postupku za lečenje homocistinurije kod humanog subjekta, gde se PEGilovani mutantni polipeptid htCBS primenjuje najmanje jednom nedeljno tokom najmanje šest nedelja u dozi između 0.33 i 10 mg/kg.
[0007] Dalji aspekti pronalaska su dati u zahtevima.
[0008] U nekim primerima izvođenja, mutantni polipeptid htCBS može da se primeni u dozi između 5 i 7.5 mg/kg i može da se primeni najmanje dva puta nedeljno. Dalje, htCBS ili mutantni polipeptid htCBS može da se daje zajedno sa betainom ili drugim poznatim CBSDH terapijama.
[0009] Količina metabolita kao što su, ali bez ograničenja, cistationin i cistein, kod subjekta može da se poveća nakon primene. Količina cistationina može da se poveća na 0.005 -0.35 µM. Količina cisteina može biti povećana na iznad 140 µM (npr. između 200 µM do 400 µM).
[0010] Količina metabolita kao što su, ali bez ograničenja, homocistein, metionin S -adenozil homocistein i S-adenozil metionin kod subjekta može da bude smanjena nakon primene. Količina homocisteina može biti smanjena na manje od 100 µM (npr. oko 10 µM). Količina metionina može biti smanjena na manje od 50 µM (npr. oko 30 µM). Količina S-adenozil homocisteina može biti smanjena na manje od 0.14 µM (npr. oko 0.015 µM).
[0011] Bolest jetre kod subjekta može da se leči nakon primene.
[0012] U nekim primerima izvođenja, kompozicija se primenjuje u dozi od oko 0.4 mg/kg.
[0013] Osteoporoza, alopecija, proređena kosa ili defekti oka mogu da se leče nakon primene.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0014]
SL. 1A-1B prikazuju zadržavanje enzima u plazmi i in vivo. SL. 1A prikazuje da se retenciono vreme enzima u plazmi održava čime se ukazuje na to ja brzi gubitak dejstva in vivo rezultat klirensa. SL. 1B prikazuje da je retenciono vreme enzima in vivo poboljšano za PEGilovanu htCBS. Miš br. 1 i Miš br. 2 na SL. 1B su takođe opisani kao na SL. 1B u međunarodnoj patentnoj objavi br. WO2014120770.
SL. 2 prikazuje da ponovljeno davanje ne-PEGilovane htCBS ne dovodi do promena u nivoima homocisteina ili cisteina kod HO miševa.
SL. 3 prikazuje tok vremena PEGilacije sa izabranim linearnim 20kDa PEG molekulom označenim kao ME200MAB.
SL. 4A-4D prikazuju da dugotrajna ponovljena injekcija PEGilovane htCBS značajno utiče na nivoe homocisteina, cistationina i cisteina u plazmi i tkivu.
SL. 5A-5H ilustruju da PEGilovana mutantna htCBS (takođe označena kao PEGC15S) i PEGilovana htCBS sprečavaju agregaciju proteina, obrazuju uglavnom dimere i ispoljavaju reproducibilan obrazac PEGilacije. SL. 5A je takođe opisana kao SL. 5A u međunarodnoj patentnoj objavi br. WO2014120770. SL. 5B je takođe opisana kao SL. 5B u međunarodnoj patentnoj objavi br. WO2014120770. SL. 5C je takođe opisana kao SL. 5C u međunarodnoj patentnoj objavi br. WO2014120770. SL. 5F je takođe opisana kao SL. 6A u međunarodnoj patentnoj objavi br. WO2014120770. SL. 5G je takođe opisana kao deo SL. 7A i SL. 7B u međunarodnoj patentnoj objavi br. WO2014120770. SL. 5H je takođe opisana kao SL.6C u međunarodnoj patentnoj objavi br. WO2014120770.
SL. 6A-6C prikazuju efekat PEGilovane mutantne htCBS (takođe označena kao PEGC15S) na homocistein i njegove metabolite 1, 4 i 24 sata posle injekcije.
SL. 7A-7B prikazuju da lečenje PEGilovanom mutantnom htCBS (takođe označena kao PEGC15S) i betainom sinergistički smanjuje i održava nivoe homocisteina niskim kod HO miševa i njihov efekat na nivoe cistationina.
SL. 8A-8B prikazuju da primena PEGilovane mutantne htCBS (takođe označena kao PEGC15S) spašava potpune CBS nokaut miševe od rane letalnosti i ublažava patologiju jetre. SL. 9A-9B prikazuju profile različitih PEGilovanih vrsta za PEGilovanu C15S sa maleimidnim PEG molekulom (ME-200MA0B ili ME-400MA) ili NHS estarskim PEG molekulom (ME-200GS).
SL. 10A-10E prikazuju specifičnu aktivnost i nivoe metabolita u plazmi i aktivnost CBS nakon jedne supkutane (SC) injekcije 20NHS PEG-htCBS C15S (htCBS C15S PEGilovana sa ME-200GS PEG) ili 400MA PEG-htCBS C15S (htCBS C15S PEGilovana sa ME-400MA PEG) date HO miševima.
SL. 11A-11C prikazuju promene u stopama preživljavanja i nivoima metabolita kod KO miševa nakon davanja C15S PEGilovane ili sa ME-200GS, ME-200MA0B ili ME-400MA. SL. 12A-12E prikazuje potpuno sprečavanje i odlaganje početka alopecije facijalne regije u grupama I278T -/- homozigotnih miševa kojima je kontinuirano davan C15S PEGilovan ili sa ME-200MA0B, ME-400MA ili ME-200GS.
SL. 13A-13B prikazuje ublaženu bolest jetre kod 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih KO miševa u poređenju sa PBS-lečenim KO miševima i zdravom kontrolom.
SL. 14A-14B prikazuju uzorke jetre na SL. 13A-13B posmatrane elektronskom mikroskopijom.
SL. 15A-15D prikazuje efekte kontinuiranog davanja 20NHS PEG-htCBS C15S kod HO miševa na aktivnost CBS i metabolite sumpornih aminokiselina u plazmi pomoću različitih modela ALZET<®>osmotskih pumpi.
SL. 16A-16G prikazuju rezultate ispitivanja dvoenergetske rendgenske apsorpciometrije (DEXA ili DXA) kontinuirane dugotrajne primene 20NHS PEG-htCBS C15S kod KO miševa.
SL. 17A-17F prikazuju rezultate dvoenergetske rendgenske apsorpciometrije (DEXA ili DXA) kontinuirane dugotrajne primene 20NHS PEG-htCBS C15S kod I278T miševa.
SL. 18A-18B prikazuju koncentracije izabranih metabolita jetre analiziranih pomoću NMR metabolomike kod I278T miševa nakon kontinuirane dugotrajne primene 20NHS PEG -htCBS C15S i u poređenju sa zdravim heterozigotnim i obolelim homozigotnim kontrolama. SL. 19A-19E prikazuju efekte davanja 20NHS PEG-htCBS C15S na defekte oka kod I278T miševa.
SL. 20A-20D prikazuju nivoe metabolita u plazmi kod I278T miševa koji su lečeni sa 20NHS PEG-htCBS i držani ili na redovnoj dijeti ili na dijeti sa ograničenim unosom metabolita. SL. 21A-21B prikazuju specifičnu aktivnost 20NHS-htCBS C15S kod mužjaka i ženki pacova nakon IV ili SC bolus doze od 4 (IV), 8 (SC), i 24 (SC) mg/kg. SL. 21C prikazuje specifičnu aktivnost 20NHS PEG-htCBS C15S nakon inicijalne injekcije i pri ravnotežnim nivoima za pojedinačne Sprague Dawley pacove divljeg tipa koji primaju ukupno 9 injekcija u dozi od 8 mg/kg.
SL. 22A-22B prikazuju koncentraciju Cth u plazmi i specifičnu aktivnost 20NHS PEG-htCBS C15S kod makaki majmuna (Macaca fascicularis) nakon jedne IV ili SC injekcije u dozi od 2 ili 6 mg/kg.
SL. 23A-23B specifična aktivnost i nivoi cistationina (Cth) u plazmi kod makaki majmuna divljeg tipa (Macaca fascicularis) nakon višestrukih SC primena doze od 1, 3, ili 10 mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S.
SL. 24A-24G prikazuje rezultate alometrijskog skaliranja za procenu efikasnosti doze 20NHS PEG-htCBS kod ljudi baziranog na rezultatima za ovde date modele miševa, pacova, i majmuna.
DETALJAN OPIS
[0015] Ovde su date kompozicije za upotrebu u lečenju homocistinurije sa nedostatkom cistationin beta-sintaze (CBSDH).
[0016] Inaktivacija CBS dovodi do homocistinurije sa nedostatkom cistationin beta-sintaze (CBSDH), koja se češće naziva klasična homocistinurija. CBSDH je autozomno -recesivni poremećaj okarakterisan značajno povišenim nivoima ukupnog homocisteina (tHcy) i metionina u plazmi, i u velikoj meri sniženih koncentracija cistationina i cisteina; to je najčešći nedostatak povezan sa aminokiselinama koje sadrže sumpor. Ukoliko se ne leči, CBSDH dovodi do bolesti, poremećaja i/ili stanja kod niza različitih organskih sistema i ozbiljnih fenotipskih promena. Neograničavajući primeri bolesti, poremećaja i/ili stanja kod CBSDH uključuju mentalnu retardaciju, psihijatrijske poremećaje, probleme sa centralnim nervnim sistemom uključujući napade, kardiovaskularnu bolest sa predispozicijom za tromboembolijske komplikacije koje dovode do visoke stope mortaliteta kod nelečenih i delimično lečenih osoba, i niz poremećaja vezivnog tkiva koji pogađaju očni sistem (npr. progresivna miopija i dislokacija sočiva, ektopija sočiva), i skeletni sistem (npr. marfanoidni habitus, osteoporoza, skolioza, slaba svetla kosa i krhka, tanka koža).
[0017] Postoji funkcionalna trihotomija u prirodi patogenih mutacija povezanih sa CBSDH. Jedna grupa mutacija je klasifikovana kao ona koja „reaguje na piridoksin“, kod koje funkcija enzima CBS može da bude delimično obnovljena terapijom visokim dozama vitamina B6. Ovo lečenje može da bude efikasno, ali ne ublažava uvek patološke događaje kod ovih osoba, a neki od događaja se tokom vremena javljaju čak i kod ovih osoba. U kliničkom okruženju „reagovanje na vitamin B6“ je definisano kao 20% relativnog pada Hcy koji se javlja 24 sata nakon što je osobi data oralna doza od 100-500mg B6, što znači da osoba koja reaguje na B6 i dalje može da ima abnormalno visoke nivoe homocisteina. Druga grupa funkcionalnih mutacija je predstavljena „C-terminalnim CBS mutantima“ kojima nedostaje mogućnost reagovanja na post-translacionu ushodnu regulaciju S-adenozilmetioninom. Pojedincima sa ovom klasom mutacija obično nedostaju aspekti fenotipa mentalne retardacije i vezivnih tkiva. Ova klasa je detektovana nakon merenja nivoa Hcy u plazmi nakon idiopatskog trombotičkog događaja pre 40 godina života (Maclean et al., 2002, Hum. Mutat. 19:641 -55). Poslednja grupa CBSDH mutacija je „klasična homocistinurija“, koja predstavlja najozbiljniji oblik ove bolesti. Kod ove poslednje dve grupe pojedinaca izolovana terapija vitaminom B6ne snižava efektivno nivoe Hcy u serumu. Ove mutacione grupe mogu da pokazuju fenotipske razlike, ali mogu slično da se leče.
[0018] Najčešći mutirani alel CBS je 833T>C (I278T), koji je povezan sa homocistinurijom koja reaguje na piridoksin. Samim tim, računa se da osobe koje reaguju na B6čine približno polovinu populacije pacijenata sa homocistinuirijom (Barber and Spaeth, 1969; Mudd et al., 1985). Od ovih pojedinaca koji reaguju na B6, međutim, mnogi su samo delimični responderi, što zajedno sa pojedincima koji ne reaguju na B6, dovodi do potrebe za dodatnim terapijskim opcijama. Na žalost, takve terapijske opcije su trenutno ograničene na smanjenje unosa metionina praćenjem striktne niskoproteinske dijete sa dodatkom cisteina (sada esencijalnim) i smanjenjem koncentracije homocisteina upotrebom betaina (N,N,N-trimetilglicin), pri čemu je davalac metila u mogućnosti da remetiluje homocistein nazad u metionin. Stoga, enzimska zamenska terapija (ERT) koja koristi CBS (npr. ovde opisana PEGilovana mutantna htCBS) može da bude najbolja terapija i za pacijente koji delimično reaguju na B6i za one koji ne reaguju na isti.
[0019] Kao rezultat disfunkcije CBS, nivoi homocisteina (Hcy) su dramatično izmenjeni kod pacijenata sa CBSDH. Kod zdravih pojedinaca, ukupni nivoi Hcy su u opsegu od ~5-15 µM (Stabler etal., 2002, Metabolism, 51:981-988), pri čemu je 98% u obliku disulfida ili je vezano za proteine. Samo 2% tHcy postoji u obliku slobodnog (nevezanog za protein) redukovanog homocisteina, koji može da služi kao supstrat za CBS (Mansoor et al., 1992, Anal. Biochem. 200:218-229; Mudd et al., 2000, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20:1704-1706). Ova ravnoteža je dramatično izmenjena kod pacijenata sa CBSDH, sa slobodnim redukovanim homocisteinom koji dostiže 10-25% vrednosti tHcy koje su primećene kod ovih pacijenata (do -400 µM) (Mansoor et al., 1993, Metabolism, 42:1481-1485).
[0020] Viši nivoi tHcy (npr. više od 54 puta veći od nivoa divljeg tipa) takođe mogu da uzrokuju bolesti, poremećaje i/ili stanja kao što su, ali bez ograničenja na, alopecija facijalne regije kod miševa, osteoporoza i smanjenje srednjeg preživljavanja. Kao neograničavajući primer, modeli miševa koji su imali najmanje 54 puta veći tHcy u poređenju sa divljim tipom pokazali su nekoliko bolesti, poremećaja i/ili stanja, uključujući alopeciju facijalne regije, osteoporozu i smanjenje srednjeg preživljavanja. Međutim nisu primećeni takvi znaci kod miševa koji su imali nivoe tHcy oko 30 puta veće od normalnih vrednosti i stoga povećanje homocisteina može biti patogeno samo iznad nivoa praga (Gupta et al., 2009, FASEB J.
23:883-893). U multicentričnoj studiji praćenja CBSDH kod ljudi, zaključeno je da iako razne kombinacije lečenja nisu uspele da uspostave normalne nivoe homocisteina kod pacijenata sa CBSDH, i kod pacijenata koji nisu B6responderi nivoi homocisteina su ostali 3-5 puta viši od gornje granice kod normalne populacije, rizik od tromboembolizma kod ovih pacijenata je značajno smanjen (Yap et al., 2001, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.21, 2080 -2085). Zajedno, ovi podaci ukazuju na to da za poboljšanje kliničke manifestacije CBSDH, za lečenje bolesti može da bude dovoljno nepotpuno smanjenje tHcy, ukoliko je ispod nivoa praga.
[0021] Dok dijeta sa malim unosom metionina može biti efikasna u uspostavljanju i održavanju nekih metaboličkih kontrolnih nivoa homocisteina kod pacijenata, njegov efekat može bit zaustavljen nedostatkom dijetetske usklađenosti naročito kod pacijenata kod kojih je dijagnoza kasnije uspostavljena, što dovodi do istovremenog povećanja homocisteina praćenog razvojem simptoma, posebno kod dece (Walter et al., 1998, Eur. J. Pediatr. 157 Suppl 2, S71-76). Nedostatak dijetetske usklađenosti uzrokuje povećan Hcy u serumu, ponovno javljanje komplikacija u vaskularnom i vezivnom tkivu uključujući fatalne i onesposobljavajuće događaje, i rizik od ozbiljnih neželjenih dejstava kao što je cerebralni edem (od prekomerne koncentracije Met u serumu) ili ozbiljnija pothranjenost (od nedostatka esencijalnih aminokiselina). Najefikasnija terapijska strategija je povećanje aktivnosti enzima, kao što je očigledno kada se piridoksin primenjuje kod homocistinurije koja reaguje na vitamin B6. Ova strategija nije primenjiva kod pojedinaca koji ne reaguju na vitamin B6usled statusa mutacije. Betain može da pomogne u postizanju metaboličke kontrole kod pacijenata sa nižom komplijansom i njegova kombinacija sa dijetom može da predstavlja najbolje dostupno lečenje. Međutim, trenutne terapije za pacijente koji nisu responderi na B6ne povećavaju cistationin, a suplementacija cisteinom može da bude opravdana za održavanje odgovarajućih nivoa. Povećana aktivnost enzima kod ovih pojedinaca samim tim može da zavisi od isporuke egzogenog enzima, tj. enzimske zamenske terapije (ERT).
[0022] Značajni dokazi ukazuju na moguću funkciju za cistationin nezavisnu od njegove uloge intermedijera u transsulfuraciji. Pozitivna uloga cistationina je sugerisana studijama određenog transgenog mišjeg modela homocistinurije sa nedostatkom CBS. U ovom modelu klasične homocistinurije, mišji gen cbs je inaktiviran, i on preživljava na ekspresiji niskog nivoa humanog CBS transgena pod kontrolom humanog CBS promotora; samim tim, označen je kao „isključivo humani“ (HO). HO miš ispoljava ozbiljna povećanja n ivoa Hcy, metionina, S-adenozilmetionina i S-adenozilhomocisteina i u plazmi i u tkivu, i istovremeno smanjenje nivoa cisteina u plazmi i u jetri. Međutim, za razliku od prethodnih CBS nokaut modela klasične homocistinurije (takođe poznatim kao CBS nokaut miševi (KO) koji pate od ozbiljnog zaostatka u rastu i hepatopatije i većina ugiba tokom tri nedelje nakon okota, čak i dok su majke na betainu (Maclean etal., 2010b. Mol. Genet. Metab. 101, 153 -162)), koji pate od ozbiljnog zaostatka u rastu i hepatopatije, dovode do hepatičke steatoze, fibroze i neonatalne smrti unutar tri nedelje nakon okota čak i ako su majke na betainu, HO miševi ispoljavaju blagu hepatopatiju i približno 90% HO miševa živi najmanje 6 meseci (Maclean et al., 2012, J. Biol. Chem. 287, 31994-32005). Određivanja krvarenja iz repa ukazuju da su HO miševi u hiperkoagulativnom stanju koje se značajno poboljšava lečenjem betainom na način koji rekapitulira bolest kakva se javlja kod ljudi (Maclean etal., 2010b. Mol. Genet. Metab. 101, 153-162). HO miševi imaju visoke nivoe tHcy, ali pate samo od manjih posledica. Razlike u nivoima metabolita ova dva mišja modela su male il i ne postoje, izuzev nivoa cistationina, koji je značajno povišen kod HO miševa (~10 µM) u odnosu na KO (~1 µM). Samim tim se došlo do zaključka da cistationin može da ima zaštitne efekte protiv sakupljanja masti u jetri i bubrezima, povrede tkiva i smrti apoptotskih ćelija indukovane produženim stresom endoplazmatskog retikuluma.
[0023] Cistationin može da ispoljava zaštitne efekte kod mišjeg modela povrede jetre indukovane acetaminofenom time što služi kao cisteinski prolek. Upotreba jedinjenja D,1 -2-amino-4-pentinoične kiseline koja inaktivira CGL u eksperimentima za indukovanje hipercistationemije blokiranjem pretvaranja cistationina u cistein zajedno sa zapažanjem da cistationin ispoljava značajne zaštitne efekte kod ćelija a23 koje ne mogu da pretvore ovo jedinjenje u cistein, ukazuje na to da primećeni zaštitni efekti nisu rezultat toga što cistationin deluje kao prekursor za sintezu cisteina.
[0024] Cistationin može da bude važan za normalno funkcionisanje mozga. Moguće je da se cistationin specifično akumulira u normalnom mozgu sisara da bi služio kao agens za citoprotekciju i da prekid njegove sinteze može da doprinese mentalnoj retardaciji kod homocistinurije povećavanjem osetljivosti neuronskih tkiva na toksični insult povišenog Hcy i/ili njegovih derivata (Maclean et al., 2012, J. Biol. Chem. 287, 31994-32005). Postoje značajne regionalne razlike u koncentracijama cistationina u mozgu, i koncentracija u beloj masi je veća nego u sivoj masi, što ukazuje na moguću ulogu u mijelinaciji. Cistationin je nađen u višim nivoima u okcipitalnim režnjevima mozga ljudi i majmuna nego u celom mozgu nižih životinjskih vrsta, a ukazano je na to da je uloga cistationina važnija u mozgu primata nego u mozgu glodara (Volpe and Laster, 1972, Biol. Neonate 20, 385-403).
[0025] Brojni neposredni dokazi idu u prilog mogućim fiziološkim ulogama cistationina ili njegovog derivata. U mozgu i centralnom nervnom sistemu (CNS) primata, javlja se disbalans između nivoa relativne aktivnosti CBS i CGL što dovodi do akumulacije cistationina. Slično tome, tokom embrionalnog razvoja, CBS se eksprimira u više tkiva, kao što su srce i pluća, koja ne eksprimiraju detektabilnu CBS u adultnim tkivima. Opseg podataka ukazuje na to da se CGL ne eksprimira tokom ranog razvoja sisara. U uzorcima ljudske jetre na primer, aktivnost CGL je detektovana samo u postnatalnom tkivu, dok je aktivnost u fetalnom, prevremenom i terminskom neonatalnom tkivu jetre suštinski nedetektabilna. Zajedno uzevši, ovi rezultati ukazuju na to da se u određenim fazama razvoja i u adultnim nervnim tkivima CBS eksprimira specifično za proizvodnju cistationina , za razliku od njegove uloge kao intermedijera u sintezi cisteina (Maclean et al., 2012, J. Biol. Chem. 287, 31994-32005). Uzevši u obzir da se rigorozna kontrola nad cistationin γ-lijazom (CGL) i ekspresijom CBS javlja tokom razvoja sisara, ova opažanja zajedno ukazuju na moguću zaštitnu ulogu cistationina, pored toga što predstavlja prekursor cisteina.
[0026] Biosintezu cisteina iz cistationina katalizuje CGL. Cistationin je prisutan unutar ćelija, i veruje se da ne postoji kao protein plazme. Shodno tome, veruje se da cistationin proizveden nakon injekcije ovde opisanog PEGilovanog mutantnog enzima htCBS može takođe da služi i kao intracelularni supstrat za CGL. Pored toga, moguće je da smanjeni nivoi tHcy mogu da spreče stvaranje cistein-homocisteinskih adukata (koji mogu brzo da se izbace urinom), čime se stvaraju viši nivoi slobodnog cisteina u plazmi (Gupta et al., 2014, FASEB J. 28:781-790).
[0027] Različiti aspekti ovog pronalaska će sada biti potpunije opisani u nastavku.
ENZIM CBS
[0028] Gen CBS se nalazi na humanom hromozomu 21 na q22.3 (Skovby et al., Hum. Genet.
65:291-294 (1984); Munke et al., Am. J. Hum. Genet. 42:550-559 (1988)). Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humanu CBS i aminokiselinska sekvenca koju kodira su dostupne putem GenBank pristupnog br. L19501, a ove sekvence su takođe otkrivene u SAD patentu br. 5,523,225. Sekvenca nukleinske kiseline genomske DNK koja kodira CBS takođe je javno dostupna putem baza podataka sekvenci kao što je GenBank i na internet stran ici Univerziteta Kolorado-Denver (Kraus laboratorija).
[0029] Bez želje za vezivanjem za teoriju, protein kodiran genom CBS deluje kao homotetramer da bi katalizovao konverziju homocisteina u cistationin, pri čemu je to prva faza u putu transsulfuracije. Kodirani protein alosterički je aktiviran S -adenozil-metioninom i koristi piridoksal fosfat kao kofaktor. Za ovaj gen je pronađeno više alternativno splajsovanih varijanti transkripta.
[0030] CBS upravlja jednosmernim tokom sumpora od metionina do cisteina dejstvujući na preseku puteva transmetilacije, transsulfuracije i remetilacije. On katalizuje reakciju zamene na β poziciji u kojoj se serin kondenzuje s homocisteinom na način zavisan od pi ridoksal 5'-fosfata (PLP), kako bi nastao cistationin (Miles and Kraus, 2004, J. Biol. Chem. 279:29871 -29874). Cistationin se zatim može pretvoriti u cistein pomoću cistationin gama lijaze (CGL). Stoga je pravilna funkcija enzima CBS kritična za regulaciju metabolizma cisteina i metionina (Mudd et al., 2001, „Disorders of Transsulfuration.“ In the Metabolic and molecular bases of inherited disease. C.R. Scriver, A.L. Beudet, W.S. Sly, V. D., C. B., K.K. W., and V. B., eds. (New York: McGraw-Hill), pp. 2007-2056), i samim tim, kompromitovana aktivnost CBS ili njen nedostatak, dovodi do biohem ijskih i kliničkih manifestacija homocistinurije sa nedostatkom CBS (CBSDH).
[0031] Inaktivacija CBS dovodi do homocistinurije sa nedostatkom cistationin beta-sintaze (CBSDH), koja se češće naziva klasična homocistinurija. Klasičnu homocistinuriju prvi su opisali Carson i Neill 1962. godine (Carson and Neill, 1962. Arch. Dis. Child 37:505-513) i prepoznata je kao najčešća urođena greška metabolizma sumpornih aminokiselina. Osnovni uzrok homocistinurije, nedostatak enzima cistationin β-sintaze (CBS), otkriven je ubrzo nakon toga (Mudd et al., 1964, Science 143:1443-1445).
[0032] Misens mutacije predstavljaju najčešći uzrok nedostatka cistationin β -sintaze (CBS). Mnoge od ovih mutacija dovode do pogrešno savijenih proteina, koji nemaju biološku funkciju. Prisustvo hemijskih šaperona (npr. kao što su etanol, dimetilsulfoksid, ili trimetilamin-N-oksid) ponekad može da ublaži ili čak obnovi savijanje proteina i aktivnost mutantnih proteina. Osam mutantnih enzima CBS (P49L, P78R, A114V, R125Q, E176K, P422L, 1435T i S466L) je prečišćeno i okarakterisano, i mogli bi da ih spasu hemijski šaperoni poboljšavanjem savijanja proteina. Tetramerni mutantni enzimi koji su u potpunosti zasićeni hemom su imali iste ili veće specifične aktivnosti od CBS divljeg tipa. Merenja termičke stabilnosti su pokazala da prečišćeni mutanti imaju istu ili veću termostabilnost od CBS divljeg tipa. Odgovor na stimulaciju S-adenozil-L-metioninom ili termičku aktivaciju je varirao. Nedostatak odgovora R125Q i E176K na oba stimulansa je ukazivao da njihove specifične konformacije nisu bile sposobne da postignu aktivirano stanje. Povišeni nivoi molekulskih šaperona u sirovim ekstraktima, naročito DnaJ, su ukazivali na prilično indirektan efekat hemijskih pratilaca na savijanje CBS mutanata (Majtan, etal., 2010, J. Biol. Chem. 285(21): 15866-15873).
[0033] Stepen pogrešnog savijanja 27 CBS mutacija prethodno ispitanih kod E. coli ispitan je na sposobnost šaperona da spasu konformaciju ovih mutacija u uslovima koji su pogodniji za savijanje u sisarskim ćelijama CHO-K1. Ekspresija mutacija u ćelijama sisara je povećala medijanu aktivnosti 16 puta, a količinu tetramera 3.2 puta u poređenju sa ekspresijom u bakterijama. Nakon toga, ispitani su odgovori sedam izabranih mutacija na tri jedinjenja sa dejstvom poput šaperona. Aminooksisirćetna kiselina i 4-fenilbuterna kiselina su pokazale slab efekat. Nasuprot tome, hem arginat je suštinski povećao stvaranje tetramera mutantnog CBS proteina (do šest puta) i obnovio katalitičku aktivnost (do devet puta) kod pet od sedam mutacija (p.A114V, p.K102N, p.R125Q, p.R266K i p.R369C). Najveći efekat hem arginata je primećen kod mutacije p.R125Q koja ne reaguje na in vivo lečenje vitaminom B6. Štaviše, reagovanje p.R125Q mutacije na hem je potvrđeno u fibroblastima koji potiču od pacijenta homozigotnog za ovu genetsku varijantu. Na osnovu ovih podataka, predložena je posebna grupa CBS mutacija koje reaguju na hem i predviđa se da će džep za hem u CBS biti važan cilj za dizajniranje novih terapija za homocistinuriju (Melenovska, et a l., 2014, J. Inherit. Metab. Dis. 38(2)).
[0034] Biohemijski, CBSDH se karakteriše izuzetno povišenim nivoima homocisteina, metionina i S-adenozil-homocisteina u krvi (takođe poznatim kao „SAH“ ili „AdoHcy“), koji su praćeni niskim nivoima cisteina i cistationina. Neke od kliničkih manifestacija nelečen e homocistinurije uključuju tromboembolizam, probleme sa vezivnim tkivom kao što su dislociranje optičkih sočiva, marfanoidne karakteristike i osteoporoza, kognitivno oštećenje i duge znake (Kraus, J., and Kozich, V. (2001). „Cystathionine beta-synthase and its deficiency.“ In Homocysteine in health and disease. J.D. Carmel R, ed. (New York: Cambridge University Press), pp. 223-243; Mudd et al., 2001, „Disorders of Transsulfuration.“ In the Metabolic and molecular bases of inherited disease. C.R. Scriver, A.L. Beudet, W.S. Sly, V. D., C. B., K.K. W., and V. B., eds. (New York: McGraw-Hill), pp. 2007-2056).
[0035] Početni pokušaji lečenja homocistinurije koristili su ograničenja u ishrani kako bi se smanjio unos metionina, čime se izbegavalo nakupljanje toksičnog homocisteina (Komrower et al., 1966, Arch. Dis. Child 41:666-671). Kasnije je otkriveno da suplementacija prekursorom kofaktora PLP, piridoksinom (vitamin B6), ublažava kliničke manifestacije kod nešto manje od polovine pacijenata, a deo njih su samo delimični responderi (Barber and Spaeth, 1969. J. Pediatr. 75:463-478; Mudd etal., 1985, Am. J. Hum. Genet. 37:1-31). „B6responderi“ bi trebalo da uzimaju dodatni vitamin B6do kraja života. U mnogim slučajevima, čak i pacijenti koji u potpunosti reaguju na B6 zahtevaju blažu dijetu sa ograničenim unosom proteina kako bi mogli da postignu metaboličku kontrolu (Picker, J.D., and Levy, H.L. (2004). Homocystinuria Caused by Cystathionine Beta-Synthase Deficiency. In GeneReviews. R.A. Pagon, M.P. Adam, T.D. Bird, C.R. Dolan, C.T. Fong, and K. Stephens, eds. (Seattle (WA): University of Washington, Seattle). Preostali podskup, oni koji nisu responderi, su podvrgnuti izuzetno ograničenoj dijeti, kod koje je komplijansa mnogih pacijenata slaba (Walter et al., 1998, Eur. J. Pediatr. 157 Suppl 2, S71-76). Dijeta je kombinovana sa smešom aminokiselina bez metionina i obogaćenom cisteinom zajedno sa betainom, koji može da posluži kao donor metila za enzim betain-homocistein metiltransferazu (BHMT) da bi se proizveo dimetilglicin i metionin iz homocisteina (Finkelstein, 1990, J. Nutr. Biochem. 1:228-237). Glutation se sintetiše iz cisteina, i samim tim dodavanje cisteina može biti važno za smanjenje oksidativnog stresa. Većina pacijenata je takođe lečena trimetilglicinom, i normalnom dozom dodatka folne kiseline. Ovo poboljšava metaboličku kontrolu snižavanjem homocisteinskih nivoa, u odnosu na striktnu dijetu.
[0036] Betain (N,N,N-trimetilglicin) se koristi za smanjenje koncentracije homocisteina podsticanjem pretvaranja homocisteina ponovo u metionin, tj. povećanjem fluksa kroz put remetilacije nezavisno od derivata folata (koji je uglavnom aktivan u jetri i u bubrezima). Mali deo ponovo formiranog metionina se zatim postepeno uklanja ugradnjom u protein tela. Metionin koji nije pretvoren u protein pretvara se u S-adenozil-metionin koji se uključuje u ponovno obrazovanje homocisteina. Betain je samim tim najefikasniji ako je količina metionina koji treba ukloniti mala. Stoga lečenje uključuje i betain i dijetu sa malim unosom metionina. Kod klasične homocistinurije, nivo metionina u plazmi obično raste iznad normalnog opsega od 30 mikromolova/L a koncentracije bi trebalo da se prate jer se mogu postići potencijalno toksični nivoi (više od 400 mikromolova/L).
[0037] Dugo se tražila alternativna strategija lečenja za CBSDH da bi se osobama koje nisu responderi na B6i osobama koje su delimični responderi obezbedila terapija koja ublažava metaboličke abnormalnosti, smanjuje akumuliranje toksičnog homocisteina u krvotoku, i povećava nivoe cistationina i cisteina. Takve metaboličke promene mogu da dovedu do reverzije simptoma ili odlože početak simptoma CBSDH i omoguće grupi obolelih pojedinaca da uživaju u neograničenoj ili samo blago ograničenoj ishrani i da znača jno poboljšaju svoj kvalitet života. Da bi se ove beneficije obezbedile, terapija mora da poboljša ključni nedostatak koji je u osnovi ovog stanja, naime aberantne nivoe CBS i/ili funkciju. Shodno tome, sistemsko uvođenje CBS, u obliku enzimske zamenske terapije (ERT), bi trebalo da bude od koristi za pacijente obolele od homocistinurije.
[0038] Bez vezivanja za teoriju, veruje se da značajno smanjenje ekstracelularnog homocisteina usled primene CBS stvara koncentracioni gradijent koji pokreće fluks homocisteina od intra- u ekstracelularne prostore, gde primenjeni enzim može dalje da ga obradi, i samim tim ekstracelularni CBS može da služi kao homocisteinski „odvod“.
[0039] Struktura i način aktivacije nativne humane CBS, koja postoji kao tetramer sastavljen od četiri identična monomera, mogu da budu komplikovani za upotrebu u obliku ERT. Ovaj oblik enzima ima veliku tendenciju ka agregaciji, koja predstavlja veliko ograničenje za postupak prečišćavanja (Kraus and Rosenberg, 1983, Arch. Biochem. Biophys. 222:44 -52).
Pored toga, aktivacija CBS zahteva vezivanje S-adenozil-metionina (SAM) za C-terminalni rep, kako bi se ukinula autoinhibicija koju na enzim vrši njegov C -terminalni regulatorni region.
[0040] Data je (SEQ ID NO: 3) skraćena rekombinantna humana CBS (htCBS) u kojoj je C -terminalni regulatorni region uklonjen. htCBS je mutirana pri čemu je cistein na aminokiselinskom položaju 15 promenjen u serin (htCBS mutant ili C15S) (SEQ ID NO: 13). Mutantnom polipeptidu htCBS nedostaje N-terminalni prvi metioninski ostatak koji odgovara SEQ ID NO: 3.
[0041] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutantni enzim htCBS poboljšava farmakokinetička i farmakodinamička svojstva enzima in vivo. Terapijski proteini, za razliku od malih molekula, isporučuju se parenteralnim putevima, a na efikasnost lečenja u velikoj meri može da utiče njihova apsorpcija, raspodela, metabolizam i izlučivanje
[0042] („ADME“) (Vugmeyster etal., 2012, World Journal of Biological Chemistry 3:73-92). Jedinjenja velike molekulske mase, kao što su enzimi, imaju ograničenu sposobnost prodiranja u tkiva, i samim tim su uglavnom prisutna u plazmi dok se ne uklone iz krvotoka bar jednim mehanizmom.
[0043] U jednom primeru izvođenja, primena htCBS mutanta u ERT održava visoku aktivnost u plazmi tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da postigne stabilan i značajan efekat na metabolizam sumpornih aminokiselina. Pojačavanje efikasnosti ERT može da zahteva dodatne modifikacije na proteinu, kako bi s povećalo retenciono vreme in vivo. PEGilacija, dodavanje grupa poli-etilen-glikola (PEG) na površinu proteina, produžava retenciono vreme kod subjekta. Nađeno je da PEGilacija svodi na minimum proteolizu, imuni odgovor i antigenost, dok povećava stabilnost i veličinu proteina, i smanjuje renalno izlučivanje (Kang et al., 2009, Expert opinion on emerging drugs 14:363 -380).
[0044] Biosintezu cisteina iz cistationina katalizuje samo CGL. Cistationin je prisutan samo unutar ćelija, i ne postoji kao protein plazme. Shodno tome, veruje se da cistationin proizveden nakon injekcije ovde opisanog PEGilovanog mutantnog enzima htCBS može takođe da služi i kao intracelularni supstrat za CGL. Pored toga, a bez međusobnog isključivanja, takođe je moguće da sniženi nivoi tHcy mogu da spreče stvaranje adukata cisteina-homocisteina (koji mogu brzo da se izbace urinom), čime se stvaraju viši nivoi slobodnog cisteina u plazmi, kao što je nedavno objavljeno (Gupta et al., 2014, FASEB J.
28, 781-790). Normalizovanje nivoa cisteina bez suplementacije cisteinom predstavlja drugu potencijalnu prednost trenutno opisanog mutanta htCBS za ERT.
[0045] U jednom primeru izvođenja, normalizacija nivoa cisteina može da se prati nakon primene PEGilovanog mutantnog enzima htCBS. Pored promene u nivoima metabolita, drugi pozitivan efekat primene mutanta htCBS može da se predvidi kao značajan uticaj na bolest jetre i preživljavanje pacijenata obolelih od CBSDH.
PEGILOVANA htCBS ZA UPOTREBU U TERAPIJI
[0046] Postoje tri grupe patogenih mutacija povezanih sa CBSDH, (1) mutacije koje reaguju na piridoksin, (2) C-terminalni CBS mutant i (3) klasična homocistinurija.
[0047] Mutantni enzim htCBS može da bude PEGilovan postupkom koji je poznat u struci ili je ovde opisan. Mutantni polipeptid htCBS je PEGilovan sa ME-200GS. Na primer, konjugat mutantnog polipeptida htCBS i PEG predstavlja konjugat 20NHS PEG-htCBS C15S.
[0048] U jednom primeru izvođenja mogu da se leče subjekti sa mutacijama koje reaguju na piridioksin. PEGilovani mutant htCBS može da se koristi sam ili u kombinaciji sa trenutnim terapijama (npr. vitaminom B6 ili betainom) za lečenje subjekata sa mutacijama koje reaguju na piridioksin. Kao neograničavajući primer, PEGilovani mutant htCBS može da se koristi za ublažavanje ili redukovanje patoloških događaja kod subjekata sa mutacijama koje reaguju na piridoksin. Kao neograničavajući primer, PEGilovani mutant htCBS može da se koristi za lečenje subjekta sa mutacijama koje reaguju na piridoksin koji je delimični responeder na terapiju vitaminom B6. Kao još jedan neograničavajući primer, PEGilovani mutant htCBS može da se koristi za lečenje subjekta sa mutacijama koje reaguju na piridoksin koji nije responder terapiju vitaminom B6.
[0049] U jednom primeru izvođenja, mogu da se leče subjekti sa C-terminalnim CBS mutacijama. PEGilovani mutant htCBS može da se koristi sam ili u kombinaciji sa trenutnim terapijama (npr. vitaminom B6 ili betainom) za lečenje subjekata sa C-terminalnim CBS mutacijama. Kao neograničavajući primer, PEGilovani mutant htCBS može da se koristi za snižavanje nivoa Hcy u serumu kod subjekata sa C-terminalnim CBS mutacijama. Kao neograničavajući primer, PEGilovani mutant htCBS može da se koristi za lečenje subjekta sa C-terminalnim CBS mutacijama koji je delimični responder na terapiju vitaminom B6. Kao još jedan neograničavajući primer, PEGilovani mutant htCBS može da se koristi za lečenje subjekta sa C-terminalnim CBS mutacijama koji nije responder na terapiju vitaminom B6.
[0050] U jednom primeru izvođenja mogu da se leče subjekti sa klasičnom homocistinurijom. PEGilovani mutant htCBS može da se koristi sam ili u kombinaciji sa trenutnim terapijama (npr. vitaminom B6 ili betainom) za lečenje subjekata sa klasičnom homocistinurijom. Kao neograničavajući primer, PEGilovani mutant htCBS može da se koristi za smanjenje nivoa Hcy u serumu kod subjekata sa klasičnom homocistinurijom. Kao neograničavajući primer, PEGilovani mutant htCBS može da se koristi za lečenje subjek ta sa klasičnom homocistinurijom koji je delimični responder na terapiju vitaminom B6. Kao još jedan neograničavajući primer, PEGilovani mutant htCBS može da se koristi za lečenje subjekta sa klasičnom homocistinurijom koji nije responder na terapiju vitam inom B6.
[0051] U jednom primeru izvođenja, ovde opisane kompozicije mogu da redukuju simptom, bolest ili poremećaj povezan sa CBSDH. Ovaj simptom, bolest ili poremećaj može biti u sistemu organa ili ozbiljna fenotipska promena. Neograničavajući primeri bolesti, poremećaja i/ili stanja kod CBSDH uključuju mentalnu retardaciju, psihijatrijske poremećaje, probleme sa centralnim nervnim sistemom uključujući napade, kardiovaskularnu bolest sa predispozicijom za tromboembolijske komplikacije koje dovode do visoke stope mortaliteta kod nelečenih i delimično lečenih osoba, i niz poremećaja vezivnog tkiva koji pogađaju očni sistem (npr. progresivna miopija i dislokacija sočiva, ektopija sočiva), i skeletni sistem (npr. marfanoidni habitus, osteoporoza, skolioza, slaba svetla kosa i krhka, tanka koža).
[0052] U jednom primeru izvođenja, ovde opisane kompozicije mogu da leče bolest, poremećaj i/ili stanje kao što je, ali bez ograničenja, tromboembolizam, problemi sa vezivnim tkivima kao što je dislokacija optičkih sočiva, marfanoidne karakteristike, osteoporoza i kognitivno oštećenje.
[0053] U jednom primeru izvođenja, ovde opisani PEGilovani mutantni enzim htCBS može da smanji efekte i/ili da leči bolest jetre. Ta bolest jetre može biti kod subjekta sa CBSDH. Lečenje i/ili smanjenje efekata bolesti jetre samim tim može da poveća stopu preživ ljavanja pacijenata sa CBSDH. Kao neograničavajući primer, PEGilovani mutant htCBS može da smanji oštećenje parenhima jetre.
[0054] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS može da poveća nivo cistationina i leči ili smanji efekte bolesti ili povrede jetre.
[0055] U jednom primeru izvođenja, kompozicije mogu da ublaže manifestacije bolesti i metaboličke abnormalnosti koje karakterišu homocistinuriju. U nekim primerima izvođenja, PEGilovani mutantni enzim htCBS modulira toksične metabolite tokom najmanje 24 sata, najmanje 48 sati, ili najmanje 72 sata. U dodatnim primerima izvođenja, PEGilovani mutantni enzim htCBS ublažava manifestacije bolesti tokom najmanje 3 meseca, 6 meseci, 12 meseci, ili 24 meseca.
[0056] U jednom primeru izvođenja, ERT koji koristi PEGilovani mutantni enzim htCBS nudi efikasnu terapiju za pacijente sa CBSDH kako bi se omogućilo sprečavanje i lečenje i/ili poboljšanje simptoma homocistinurije, i ublažavanje potrebe za održavanjem takve dijete koja striktno isključuje proteine. Alternativno, subjektu se daje PEGilovana htCBS C15S, i subjekat je na dijeti koja isključuje protein ili na dijeti koja je sa ograničenim unosom Met.
[0057] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS može da se koristi za povećanje nivoa cistationina i za lečenje ili smanjenje efekata mentalne retardacije kod subjekata sa homocistinurijom. Količina cistationina može da se poveća u regionu ili oblasti mozga kao što je, ali bez ograničenja, siva masa i bela masa potiljačnih režnjeva.
[0058] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS može da se koristi za povećanje osetljivosti nervnih tkiva u mozgu subjekata sa homocistinurijom. Količina cistationina može da se poveća u regionu ili oblasti mozga kao što je, ali bez ograničenja, siva masa i bela masa potiljačnih režnjeva.
[0059] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS može da se koristi za produženje života subjekta sa CBSDH.
[0060] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS se koristi kao deo CBS enzimske zamenske terapije (ERT) za lečenje homocistinurije. Kod primene PEGilovanog mutanta htCBS uvođenje deficitarnog enzima u njegov prirodni intracelularni odeljak ne mora da bude neophodno.
[0061] U jednom primeru izvođenja, primena PEGilovanog mutanta htCBS smanjuje nivoe homocisteina za 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 52% 55%, 60%, 65%, 67%, 69%, 70%, 74%, 75%, 76%, 77%, 80%, 85%, 90%, 95% ili za više od 95%. Kao neograničavajući primer, smanjenje homocisteina može predstavljati smanjenje od oko 69%. Kao neograničavajući primer, smanjenje homocisteina može predstavljati smanjenje od oko 67%. Kao neograničavajući primer, smanjenje homocisteina može predstavljati smanjenje od oko 52%. Kao neograničavajući primer, smanjenje homocisteina može predstavljati smanjenje od oko 33%.
[0062] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS može da se primenjuje pre, posle ili istovremeno sa tradicionalnim lečenjem betainom. Kombinovana terapija može da dovede do sinergističkih efekata na nivoe homocisteina.
[0063] U jednom primeru izvođenja, primena PEGilovanog mutanta htCBS kod subjekta može da izmeni ekstra- i intracelularnu ravnotežu sumpornih aminokiselina.
[0064] U jednom primeru izvođenja, izmena ekstra- i intracelularne ravnoteže može biti smanjenje homocisteina u plazmi kao što je, ali bez ograničenja, smanjenje od oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 52% 55%, 60%, 65%, 67%, 69%, 70%, 74%, 75%, 76%, 77%, 80%, 85%, 90%, 95% ili više od 95%. Kao neograničavajući primer, smanjenje homocisteina u plazmi može biti smanjenje od oko 75%.
[0065] U jednom primeru izvođenja, izmena ekstra- i intracelularne ravnoteže može biti povećanje cistationina kao što je, ali bez ograničenja, povećanje od oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 1120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 310%, 320%, 330%, 340%, 350%, 360%, 370%, 380%, 390%, 400%, 410%, 420%, 430%, 440%, 450%, 460%, 470%, 480%, 490%, 500%, 510%, 520%, 530%, 540%, 550%, 560%, 570%, 580%, 590%, 600%, 610%, 620%, 630%, 640%, 650%, 660%, 670%, 680%, 690%, 700%, 710%, 720%, 730%, 740%, 750%, 760%, 770%, 780%, 790%, 800%, 810%, 820%, 830%, 840%, 850%, 860%, 870%, 880%, 890%, 900%, 910%, 920%, 930% 940%, 950%, 960%, 970%, 980%, 990%, 1000% ili više od 1000%. Kao neograničavajući primer, povećanje cistationina može biti oko 900%.
[0066] U jednom primeru izvođenja, izmena ekstra- i intracelularne ravnoteže može biti normalizacija koncentracija cisteina koja se odražava na poboljšanje histopatoloških promena u jetri i povećano preživljavanje.
[0067] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS može da smanji nivoe tHcy kod subjekta sa CBSDH. Nivoi tHcy mogu da se smanje do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2021, 22, 23, 24, 15, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 1-5, 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 2-5, 2-10, 2-20, 2-30, 2-40, 2-50, 3-5, 3-10, 3-20, 3-30, 3-40, 3-50, 4-6, 4-10, 4-20, 4-30, 4-40, 4-50, 5-7, 5-10, 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 6-8, 6-10, 6-20, 6-30, 6-40, 6-50, 7-10, 7-20, 7-30, 7-40, 7-50, 8-10, 8-20, 8-30, 8-40, 8-50, 9-10, 9-20, 9-30, 9-40, 9-50, 10-20, 10-30, 10-40, 10-50, 20-30, 20-40, 20-50, 30-40, 30-50 ili 40-50 puta u odnosu na nivo divljeg tipa. Kao neograničavajući primer, nivo tHCY je smanjen do oko 30 puta u odnosu na nivo divljeg tipa. Kao neograničavajući primer, nivo tHCY je smanjen do oko 3 -5 puta u odnosu na nivo divljeg tipa.
[0068] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS može da snizi nivoe tHcv, i time da leči ili smanji efekte bolesti, poremećaja i/ili stanja povezanih sa visokim nivoima tHCY (npr. više od 54 puta većim od nivoa divljeg tipa). Neograničavajući primeri bolesti, poremećaja i/ili stanja povezanih sa visokim nivoima tHCY uključuju alopeciju facijalne regije, osteoporozu, dislokaciju očnih sočiva i smanjenje srednje vrednosti preživljavanja.
[0069] U jednom primeru izvođenja, ovde opisani PEGilovani mutant htCBS može da normalizuje nivoe cisteina bez suplementacije cisteinom.
[0070] U jednom primeru izvođenja, ovde opisani PEGilovani mutant htCBS može da se koristi u kombinaciji sa betainom kako bi se smanjile koncentracije homocisteina kod subjekta. Homocistein može biti smanjen oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 52% 55%, 60%, 65%, 67%, 69%, 70%, 74%, 75%, 76%, 77%, 80%, 85%, 90%, 95% ili više od 95% kod subjekta upotrebom kombinovane terapije. Kao neograničavajući primer, homocistein može biti smanjen 77%. Kao neograničavajući primer, homocistein može biti smanjen 76%. Kao neograničavajući primer, homocistein može biti smanjen 74%. Kao neograničavajući primer, homocistein može biti smanjen 40%.
[0071] U jednom primeru izvođenja, ovde opisani PEGilovani mutant htCBS može da izazove promenu kao što je povećanje i/ili smanjenje nivoa metabolita.
[0072] U jednom primeru izvođenja, ovde opisani PEGilovani mutant htCBS može da izazove promenu kao što je povećanje nivoa metabolita. Kao neograničavajući primer, metabolit može biti cistationin i cistein koji mogu da budu povećani 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 52% 55%, 60%, 65%, 67%, 69%, 70%, 74%, 75%, 76%, 77%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 1120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 310%, 320%, 330%, 340%, 350%, 360%, 370%, 380%, 390%, 400%, 410%, 420%, 430%, 440%, 450%, 460%, 470%, 480%, 490%, 500%, 510%, 520%, 530%, 540%, 550%, 560%, 570%, 580%, 590%, 600%, 610%, 620%, 630%, 640%, 650%, 660%, 670%, 680%, 690%, 700%, 710%, 720%, 730%, 740%, 750%, 760%, 770%, 780%, 790%, 800%, 810%, 820%, 830%, 840%, 850%, 860%, 870%, 880%, 890%, 900%, 910%, 920%, 930%, 940%, 950%, 960%, 970%, 980%, 990%, 1000% ili više od 1000%. Kao neograničavajući primer, količina cistationina može biti povećana tako da bude iznad 0.008, 0.01, 0.015, 0.020, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, ili 0.35 µM ili cistationin može da se poveća tako da bude između 0.05 i 0.35 µM. Kao još jedan neograničavajući primer, količina cisteina može biti povećana tako da bude iznad 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400 ili cistein može da se poveća tako da bude između 200 µM i 400 µM.
[0073] U jednom primeru izvođenja, ovde opisani PEGilovani mutant htCBS može da izazove promenu kao što je smanjenje nivoa metabolita. Kao neograničavajući primer, metabolit može biti homocistein, metionin i S-adenozil homocistein koji mogu da budu smanjeni za 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 52% 55%, 60%, 65%, 67%, 69%, 70%, 74%, 75%, 76%, 77%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili 100%. Kao neograničavajući primer, količina homocisteina može biti smanjena tako da bude oko 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 ili 1 µM. Kao neograničavajući primer, količina metionina može biti smanjena tako da bude oko 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 ili 1 µM. Kao još jedan neograničavajući primer, količina S-adenozil homocisteina je smanjena tako da bude oko 0.15, 0.14, 0.13, 0.12, 0.11, 0.10, 0.095, 0.09, 0.085, 0.08, 0.075, 0.07, 0.065, 0.06, 0.055, 0.05, 0.045, 0.04, 0.035, 0.03, 0.025, 0.02, 0.015, 0.01, 0.009, 0.008, 0.007, 0.006, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002, 0.001 ili manje od 0.001 µM.
[0074] U jednom primeru izvođenja, ovde opisani PEGilovani mutant htCBS može da smanji nivoe homocisteina, metionin, S-adenozil-metionina i S-adenozil-homocisteina kod subjekta.
[0075] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS može da poveća nivoe cisteina i cistationina kod subjekta.
[0076] Mutant htCBS može da se proizvede korišćenjem postupka za rekombinantnu proizvodnju i prečišćavanje humane cistationin sintaze. Taj postupak uključuje korak kloniranja sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani enzim CBS ili njegovu skraćenu ili mutiranu varijantu u ekspresioni vektor. Kao neograničavajući primer, postupak može da bude kao što je definisano u međunarodnoj objavi WO2014120770.
PRIMENA I DOZIRANJE
[0077] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS može da se daje subjektu parenteralnom primenom.
[0078] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS može da se daje subjektu supkutanom (SC), intravenskom (IV) ili intraperitonealnom (IP) injekcijom. Kao neograničavajući primer, PEGilovani mutant htCBS može da se daje subjektu supkutano. Kao neograničavajući primer, PEGilovani mutant htCBS može da se daje subjektu intravenski. Kao neograničavajući primer, PEGilovani mutant htCBS može da se daje subjektu intraperitonealno. Kao neograničavajući primer, PEGilovani mutant htCBS može da se daje subjektu putem osmotske pumpe.
[0079] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS može da se daje subjektu najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više od 20 puta.
[0080] U jednom primeru izvođenja, davanje PEGilovanog mutanta htCBS može da se ponavlja svakog minuta, na 2 minuta, 3 minuta, 4 minuta, 5 minuta, šest 6, 7 minuta, 8 minuta, 9 minuta, 10 minuta, 15 minuta, 20 minuta, 25 minuta, 30 minuta, 35 minuta, 40 minuta, 45 minuta, 50 minuta, 55 minuta, na sat, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sati, 12 sati, 13 sati, 14 sati, 15 sati, 16 sati, 17 sati, 18 sati, 19 sati, 20 sati, 21 sat, 22 sata, 23 sata, dnevno, na 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, nedeljno, na dve nedelje, 3 nedelje, mesečno, 2 meseca, kvartalno, na 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, godišnje, na 13 meseci, 14 meseci, 15 meseci, 16 meseci, 17 meseci, ili 18 meseci.
[0081] U jednom primeru izvođenja, davanje PEGilovanog mutanta htCBS može da predstavlja serije doza u razmaku izraženom u minutima, satima, danima ili nedeljama. Broj doza u seriji može biti 2, 3, 4, 5 ili 6. Kao neograničavajući primer, subjektu se daju 3 doze sa 24 sata razmaka. Kao još jedan neograničavajući primer, subjektu se daje 5 doza sa 12 sati razmaka.
[0082] U jednom primeru izvođenja, davanje PEGilovanog mutanta htCBS može da prati raspored doziranja serije doza koji ima razmak između prve serije i druge serije doza. Razmak između doza može biti 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sati, 12 sati, 13 sati, 14 sati, 15 sati, 16 sati, 17 sati, 18 sati, 19 sati, 20 sati, 21 sat, 22 sata, 23 sata, dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, jedna nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje, mesec, 2 meseca, kvartal, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, 12 meseci, 13 meseci, 14 meseci, 15 meseci, 16 meseci, 17 meseci, ili 18 meseci. Broj doza u seriji može biti 2, 3, 4, 5 ili 6. Kao neograničavajući primer, subjektu može da se da prva serija od 5 doza sa 12 sati razmaka a zatim 14 dana nakon prve doze, subjektu se daje druga serija od 5 doza sa 12 sati razmaka. Kao još jedan neograničavajući primer, subjektu se daju dve serije doza tokom perioda od 8 nedelja gde prva serija predstavlja jednu dozu dva puta nedeljno tokom dve nedelje, a druga serija doza predstavlja tri puta nedeljno tokom 6 nedelja.
[0083] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS može da se daje najmanje jednom nakon što je subjektu dat betain. Vreme između davanja betaina i PEGilovane htCBS može biti 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sat i, 12 sati, 13 sati, 14 sati, 15 sati, 16 sati, 17 sati, 18 sati. 19 sati, 20 sati, 21 sati, 22 sati, 23 sati, dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje, mesec, 2 meseca, kvartal, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, 12 meseci, 13 meseci, 14 meseci, 15 meseci, 16 meseci, 17 meseci, ili 18 meseci. Kao neograničavajući primer, PEGilovana htCBS može da se daje 14 dana nakon što je subjektu dat betain. Kao još jedan neograničavajući primer, subjektu mogu da se daju dve doze nakon što je subjekt primio betain. PEGilovani mutant htCBS može da se daje 14 i 15 dana nakon davanja betaina.
[0084] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS može da se daje subjektu u kombinaciji sa betainom. Kombinacija može da se daje najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili više od 15 puta.
[0085] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutant htCBS može da se daje subjektu u kombinaciji sa betainom nakon što je subjekat inicijalno primao betain. Vreme između kombinovane terapije i originalnog davanja betaina može biti 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati , 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sati, 12 sati, 13 sati, 14 sati, 15 sati, 16 sati, 17 sati, 18 sati, 19 sati, 20 sati, 21 sat, 22 sata, 23 sata, dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje, mesec, 2 meseca, kvartal, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, 12 meseci, 13 meseci, 14 meseci, 15 meseci, 16 meseci, 17 meseci, ili 18 meseci. Kao neograničavajući primer, kombinacija može da se daje 14 dana nakon što je subjektu prvi put dat betain. Kao još jedan neograničavajući primer, subjektu mogu da se daju dve doze nakon što je subjekat prvi put primio betain. Kombinacija može da se daje 14 i 15 dana nakon davanja betaina.
[0086] U jednom primeru izvođenja, doza PEGilovanog mutanta htCBS koja se daje subjektu može biti između 5 i 8 mg/kg kao što je 5 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7 mg/kg, 7.5 mg/kg ili 8 mg/kg. U određenim primerima izvođenja, ta doza je izabrana iz opsega od oko 2 mg/kg do oko 24 mg/kg. Na primer, doza je oko 2 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 10 mg/kg, ili oko 24 mg/kg. U određenim primerima izvođenja, doza je izabrana iz opsega od oko 0.01 do oko 10 mg/kg. Na primer, doza je oko 0.4 mg/kg. U od ređenim primerima izvođenja, PEGilovani mutantni polipeptid htCBS se daje subjektu koji je na dijeti sa ograničenim unosom metionina. Alternativno, PEGilovani mutantni polipeptid htCBS se daje subjektu koji nije na dijeti sa ograničenim unosom metionina.
[0087] U jednom primeru izvođenja, PEGilovani mutantni polipeptid htCBS može da se daje zajedno sa drugim terapijskim agensom za lečenje CBSDH. Kako se ovde koristi, „primenjuje zajedno sa“ znači davanje dve ili više komponenti. Ove komponente za zajedničku primenu uključuju, ali nisu ograničene na betain ili vitamin B6. Zajednička primena se odnosi na davanje dve ili više komponenti simultano ili sa vremenskim razmakom između primena, kao što je 1 sekunda, 5 sekundi, 10 sekundi, 15 sekundi, 30 sekundi, 45 sekundi, 1 minut, 2 minuta, 3 minuta, 4 minuta, 5 minuta, 6 minuta, 7 minuta, 8 minuta, 9 minuta, 10 minuta, 11 minuta, 12 minuta, 13 minuta, 14 minuta, 15 minuta, 16 minuta, 17 minuta, 18 minuta, 19 minuta, 20 minuta, 21 minut, 22 minuta, 23 minuta, 24 minuta, 25 minuta, 26 minuta, 27 minuta, 28 minuta, 29 minuta, 30 minuta, 31 minut, 32 minuta, 33 minuta, 34 minuta, 35 minuta, 36 minuta, 37 minuta, 38 minuta, 39 minuta, 40 minuta, 41 minut, 42 minuta, 43 minuta, 44 minuta, 45 minuta, 46 minuta, 47 minuta, 48 minuta, 49 minuta, 50 minuta, 51 minut, 52 minuta, 53 minuta, 54 minuta, 55 minuta, 56 minuta, 57 minuta, 58 minuta, 59 minuta, 1 sat, 1.5 sati, 2 sata, 2.5 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sati, 12 sati, 13 sati, 14 sati, 15 sati, 16 sati, 17 sati, 18 sati, 19 sati, 20 sati, 21 sat, 22 sata, 23 sata, 1 dan, 1.5 dan, 2 dana, ili više od 3 dana.
DEFINICIJE
[0088] Kako se koriste u ovoj specifikaciji, oblici za jedninu „neki“, „jedan“ i „taj“ uključuju i referente u množini osim ukoliko kontekst ne nalaže drugačije. Tako, na primer, pozivanje na „polimer“ uključuje jedan polimer kao i dva ili više istih ili različi tih polimera, pozivanje na „ekscipijens“ uključuje jedan ekscipijens kao i dva ili više istih ili različitih ekscipijenasa, i tome slično.
[0089] Kada je dat opseg vrednosti, predviđeno je da je svaka vrednost koja pada između gornje i donje granice tog opsega i bilo koja druga navedena vrednost ili vrednost koja spada u navedeni opseg obuhvaćena ovim otkrićem i konkretno otkrivena. Na primer, ako je naveden opseg od 1 µm do 8 µm, predviđeno je da su 2 µm, 3 µm, 4 µm, 5 µm, 6 µm i 7 µm takođe eksplicitno otkriveni kao i opseg vrednosti većih od ili jednakih 1 µm i opseg vrednosti manjih od ili jednakih 8 µm.
[0090] „Kodirajuća sekvenca“ se odnosi na onaj deo nukleinske kiseline (npr. gen) koji kodira (i) iRNK koja se translatira u aminokiselinsku sekvencu proteina; ili (ii) funkcionalnu RNK, kao što je interferirajuća RNK ili antisens molekul.
[0091] „Rekombinantna“, kada se koristi uz pozivanje na, npr. ćeliju, nukleinsku kiselinu, polipeptid, ekspresionu kasetu ili vektor, se odnosi na materijal, ili materijal koji odgovara prirodnom ili nativnom obliku materijala, koji je modifikovan uvođenjem nove grupe ili promenom postojeće grupe, ili je identičan sa njima, ali proizveden ili dobijen od sintetičkih materijala. Na primer, rekombinantne ćelije eksprimiraju gene koji nisu pronađeni unutar nativnog (nerekombinantnog) oblika ćelije (tj. „egzogene nukleinske kiseline“) ili eksprimiraju nativne gene koji su na drugi način eksprimirani na drugačijem nivou, obično nedovoljno eksprimirani ili nisu eksprimirani uopšte.
[0092] Rekombinantne tehnike mogu da uključuju, npr. upotrebu rekombinantne nukleinske kiseline kao što je cDNK koja kodira protein ili antisens sekvencu, za umetanje u ekspresioni sistem, kao što je ekspresioni vektor; dobijeni konstrukt se uvodi u ćeliju, i ćelija eksprimira nukleinsku kiselinu, i protein, ukoliko je to moguće. Rekombinantne tehnike takođe obuhvataju ligaciju nukleinskih kiselina u kodirajuće ili promotorske sekvence iz različitih izvora u ekspresionu kasetu ili vektor za ekspresiju fuzionog proteina, konstitutivnu ekspresiju proteina, ili inducibilnu ekspresiju proteina.
[0093] Pojmovi „subjekt“, „pojedinac“ ili „pacijent“ se ovde naizmenično koriste i odnose se na čoveka.
[0094] „Povezan“ se odnosi na podudarnost sa razvojem ili manifestacijom bolesti, stanjem ili fenotipom. Povezanost može da bude posledica, ali bez ograničenja, gena odgovornih za esencijalne funkcije čija promena može da pruži osnovu za niz bolesti i stanja, on ih koja su deo puta koji je uključen u konkretnu bolest, stanje ili fenotip i onih koja indirektno doprinose manifestaciji bolesti, stanja ili fenotipa.
[0095] „Fiziološki uslovi“ ili „fiziološki rastvor“ se odnosi na vodeno okruženje sa jonskom jačinom, pH i temperaturom koje su suštinski slične uslovima u intaktnoj ćeliji sisara ili u prostoru tkiva ili organa živog sisara. Obično, fiziološki uslovi obuhvataju vodeni rastvor sa oko 150 mM NaCl, pH 6.5-7.6 i temperaturom od približno 22-37 stepeni C. Generalno, fiziološki uslovi su pogodni uslovi vezivanja za međumolekulsko udruživanje bioloških makromolekula. Na primer, fiziološki uslovi od 150 mM NaCl, pH 7.4, na 37 stepeni C su generalno pogodni.
[0096] „Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili nosač“ se odnosi na ekscipijens koji opciono može biti uključen u kompozicije ovog pronalaska i koji ne uzrokuje značajne neželjene toksikološke efekte po pacijenta. Konkretno, u ovom slučaju, odnosi se na ekscipi jens koji se može uneti u telo subjekta zajedno sa aktivnim jedinjenjem (ovde PEGilovana htCBS) bez značajnih toksikoloških neželjenih efekata po subjekta.
[0097] Pojam „ekscipijens“ ili „vehikulum“ kako se ovde koristi označava bilo koju supstancu, koja sama po sebi nije terapijski agens, koja se koristi kao nosač za isporuku terapijskog agensa i pogodna je za davanje subjektu, npr. sisaru ili se dodaje farmaceutskoj kompoziciji kako bi se poboljšalo rukovanje ili svojstva čuvanja ili da bi se omogućilo ili olakšalo formiranje dozne jedinice kompozicije u diskretni oblik kao što je kapsula ili tableta pogodna za oralnu primenu. Ekscipijensi i vehikulumi uključuju takve materijale poznate u tehnici, npr. bilo koja tečnost, gel, rastvarač, tečni razblaživač, solubilizator, ili slično, koji je netoksičan i koji ne stupa u interakciju sa drugim komponentama kompozicije na štetan način. Primena može da znači oralnu primenu, inhalaciju, enteralnu primenu, davanje sa hranom ili inokulaciju intravenskom injekcijom. Ekscipijensi mogu da uključuju standardne farmaceutske ekscipijense, a takođe mogu da uključuju bilo koje komponente koje mogu da se koriste za pripremu hrane i pića za ljudsku i/ili životinjsku ishranu, hranu za životinje ili formulacije mamaca ili druge namirnice.
[0098] „Permeant“, „lek“ ili „farmakološki aktivni agens“ ili bilo koji drugi sličan pojam označava bilo koji hemijski ili biološki materijal ili jedinjenje, uključujući peptide, pogodne za primenu postupcima prethodno poznatim u tehnici i/ili postupcima kojima se podučava u ovom otkriću, koji indukuje željeni biološki ili farmakološki efekat, koji može da uključuje, ali bez ograničenja (1) posedovanje profilaktičkog efekta na organizam i sprečavanje neželjenog biološkog efekta kao što je sprečavanje infekcije, (2) ublažavanje stanja uzrokovanog bolešću, na primer, ublažavanje bola ili upale nastale kao rezultat bolesti, i/ili (3) ublažavanje, smanjenje, ili potpuno eliminisanje bolesti iz organizma. Efekat može biti lokalni, kao što je obezbeđivanje lokalnog anestetskog efekta ili može biti sistemski. Ovo otkriće se ne odnosi na nove permeante ili nove klase aktivnih agenasa. Ono je radije ograničeno na način isporuke agenasa ili permeanata koji postoje u stanju tehnike ili koji kasnije mogu biti prepoznati kao aktivni agensi i koji su pogodni za isporuku prema ovom otkriću.
[0099] Pojam „oko“, konkretno u odnosu na datu količinu, obuhvata devijacije od plus ili minus pet procenata.
[0100] „Opcioni“ ili „opciono“ znači da naknadno opisana okolnost može, ali ne mora da bude prisutna ili da se javi, tako da opis uključuje slučajeve gde je ta okolnost prisutna ili se javlja i slučajeve gde nije prisutna ili se ne javlja.
[0101] „Suštinski odsutna“ ili „koja suštinski ne sadrži“ određenu karakteristiku ili entitet znači gotovo potpuno ili kompletno odsustvo karakteristike ili entiteta. Na primer, za subjekat kojem se daje PEGilovana htCBS, suštinsko odsustvo neželjenog dejstava koje može da se primeti znači da takvo neželjeno dejstvo ili ne može da se detektuje, ili se javlja samo u zanemarljivom stepenu, npr. do obima ili učestalosti koja je smanjena za oko 50% ili više u odnosu na učestalost ili intenzitet istog neželjenog dejstva primećenog kod nelečenog pacijenta.
[0102] Pojmovi „farmakološki efikasna količina“ ili „terapijski efikasna količina“ u vezi sa ovom kompozicijom odnose se na netoksičnu, ali količinu aktivnog agensa (ili kompozicije koja sadrži taj aktivni agens) dovoljnu da obezbedi željeni nivo u krvotoku ili na mestu delovanja (npr. intracelularno) kod subjekta koji se leči, i/ili da obezbedi fiziološki, biofizički, biohemijski, farmakološki ili terapijski odgovor, kao što je ublažavanje manifestacija homocistinurije. Tačna količina koja je potrebna će varirati od subjekta do subjekta, i zavisiće od brojnih faktora, kao što je aktivni agens, aktivnost kompozicije, uređaj za isporuku koji se koristi, fizičke karakteristike kompozicije, predviđena upotreba kod pacijenta (tj. broj doza koje se dnevno primenjuju), kao i pitanja vezana za pacijenta, kao što je vrsta, uzrast i opšte stanje subjekta, ozbiljnost stanja koje se leči, dodatni lekovi koje subjekt uzima, način davanja, i tome slično. Ove faktore i razmatranja stručnjak lako može da odredi na osnovu ovde obezbeđenih informacija. Odgovarajuću „efikasnu“ količinu u bilo kom pojedinačnom slučaju stručnjak može da odredi rutinskim eksperimentisanjem, na osnovu ovde obezbeđenih informacija.
[0103] Pojam „biološka aktivnost“ se odnosi na bilo koju biološku aktivnost koju stručnjaci obično pripisuju nukleinskoj kiselini ili proteinu. Primeri bioloških aktivnosti su enzimska aktivnost, sposobnost dimerizacije, savijanja ili vezivanja za drugi protein ili molekul nukleinske kiseline, itd.
[0104] Pojam „nukleinska kiselina“ može da označava RNK oblik ili DNK oblik, i uključuje informacionu RNK, sintetičku RNK i DNK, cDNK i genomsku DNK. DNK može da bude dvolančana ili jednolančana, a ako je jednolančana može da predstavlja kodirajući ili nekodirajući (antisens, komplementarni) lanac.
[0105] Kako se ovde koristi, „varijanta“ je nukleinska kiselina, protein ili polipeptid koji nije identičan sa, ali ima značajnu homologiju (na primer, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) dužinom cele sekvence nuk leinske kiseline ili aminokiselinske sekvence divljeg tipa, kao što je prikazano kroz primere sekvenci u javnim bazama podataka o sekvencama, kao što je GenBank. Kako se ovde koristi, „protein, polipeptid ili njegov peptidni fragment“ označavaju protein pune dužine ili njegov deo sa aminokiselinskom sekvencom koja obično ima dužinu od najmanje 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselina, mada se i dipeptidi, tripeptidi i tetrapeptidi takođe uzimaju u razmatranje i obuhvaćeni su ovim otkrićem.
[0106] Kako se ovde koristi, „mutant“ predstavlja mutirani protein dizajniran ili konstruisan tako da se izmene svojstva ili funkcije koje se odnose na glikozilaciju, stabilizaciju proteina i/ili vezivanje liganda.
[0107] Kako se ovde koriste, pojmovi „nativan“ ili „divljeg tipa“ u vezi sa datom ćelijom, polipeptidom, nukleinskom kiselinom, osobinom ili fenotipom, se odnose na oblik u kojem se oni obično nalaze u prirodi.
[0108] Kako se ovde koriste, pojmovi „protein“, „polipeptid“ „oligopeptid“ i „peptid“ imaju svoje konvencionalno značenje i koriste se naizmenično da bi se označio polimer od najmanje dve aminokiseline kovalentno povezane amidnom vezom, nezavisno od dužine ili post-translacione modifikacije (npr. glikozilacija, fosforilacija, lipidacija, miristilacija, ubikvitinacija, itd.). Dalje, ovde opisani polipeptidi nisu ograničeni na konkretnu dužinu. U ovu definiciju su uključene D- i L-aminokiseline i smeše D- i L-aminokiselina. Ovaj pojam takođe ne upućuje niti isključuje post-ekspresione modifikacije polipeptida, na primer, glikozilacije, acetilacije, fosforilacije i slično, kao i druge modifikacije poznate u tehnici, i one koje se javljaju prirodno i one koje se ne javljaju. Polipeptid može biti ceo protein, ili njegova podsekvenca. Polipeptidi takođe mogu da se odnose na aminokiselinske podsekvence koje obuhvataju epitope, tj. antigene determinante koje su suštinski odgovorne za imunogena svojstva polipeptida i koje mogu da pobude imuni odgovor.
[0109] „Položaj koji odgovara“ se odnosi na položaj od značaja (tj. broj baze ili broj ostatka) u molekulu nukleinske kiseline ili proteinu u odnosu na položaj u drugom referentnom molekulu nukleinske kiseline ili proteinu. Odgovarajući položaji mogu biti određeni poređenjem i poravnanjem sekvenci kako bi se maksimalno uvećao broj uparenih nukleotida ili ostataka, na primer, tako da je identičnost između sekvenci veća od 90%, veća od 95%, veća od 96%, veća od 97%, veća od 98% ili veća od 99%. Položaju od značaja se zatim dodeljuje broj u referentnom molekulu nukleinske kiseline. Na primer, ukoliko se u genu X javi određeni polimorfizam na nukleotidu 2073 iz SEQ ID No. X, radi identifikovanja odgovarajućeg nukleotida u drugom alelu ili izolatu, te sekvence se poravnavaju, a zatim se identifikuje položaj koji je u ravni sa 2073. Pošto razni aleli mogu biti različitih dužina, položaj koji označava 2073 možda neće biti nukleotid 2073, već je to položaj koji „odgovara“ položaju u referentnoj sekvenci.
[0110] „Procenat identičnosti sekvence“ i „procenat homologije“ se ovde naizmenično koriste da bi se označila poređenja među polinukleotidima i polipeptidima, i određuju se poređenjem dve optimalno poravnate sekvence preko komparativnog prozora, pri čemu deo polinukleotidne ili polipeptidne sekvence u komparativnom prozoru može da sadrži adicije ili delecije (tj. praznine) u odnosu na referentnu sekvencu (koja ne sadrži adicije ili delecije) za optimalno poravnanje te dve sekvence. Procenat može da se izračuna određivanjem broja položaja na kojima se javljaju identična baza nukleinske kiseline ili aminokiselinski ostatak u obe sekvence da bi se dobio broj podudarnih položaja, deljenjem broja podudarnih položaja sa ukupnim brojem položaja u komparativnom prozoru i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti sekvenci. Alternativno, procenat može da se izračuna određivanjem broja položaja na kojima se identična baza nukleinske kiseline ili aminokiselinski ostatak javljaju kod obe sekvence ili je baza nukleinske kiseline ili aminokiselinski ostatak poravnat sa prazninom, kako bi se dobio broj podudarnih položaja, pri čemu se broj podudarnih položaja deli sa ukupnim brojem položaja u komparativnom prozoru i rezultat množi sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti sekvenci. Stručnjaci će znati da postoji mnogo uspostavljenih algoritama koji su dostupni za poravnanje dve sekvence. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može da se izvede, npr. pomoću algoritma pretraživanja lokalne homologije Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algoritma za poravnanje regiona homologije Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol.
48:443 (1970), metode pretraživanja sličnosti Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), kompjuterizovanim primenama ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u GCG Wisconsin Software Package), ili vizuelnim inspektovanjem (videti uopšteno, Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)). Primeri algoritama koji su pogodni za određivanje procentualne identičnosti sekvenci i sličnosti sekvenci su BLAST i BLAST 2.0 algoritmi, koji su opisani u Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 i Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 3389-3402, redom. Softver za izvođenje BLAST analiza je javno dostupan putem sajta Nacionalnog centra za biotehnološke informacije. Ovaj algoritam uključuje prvo identifikaciju parova sekvenci sa visokim rezultatom sličnosti (HSP) identifikovanjem kratkih reči dužine W u traženoj sekvenci, koje ili odgovaraju ili zadovoljavaju neku pozitivnu vrednost praga T kada se poravnaju sa rečju iste dužine u sekvenci baze podataka. T se odnosi na vrednost praga susedne reči (Altschul et al, supra). Ovi početni pogoci susednih reči delju kao „seme“ za započinjanje pretraga da se pronađu duži HSP koji ih zadrže. Pogoci reči se zatim proširuju u oba smera duž svake sekvence sve dok kumulativni rezultat poravnanja može da se poveća. Kumulativni rezultati se izračunavaju korišćenjem, za nukleotidne sekvence, parametara M (rezultat nagrade za par podudarnih ostataka; uvek >0) i N (kazneni rezultat za nepodudarne ostatke; uvek <0). Za aminokiselinske sekvence, matrica za bodovanje se koristi za izračunavanje kumulativnog rezultata. Produženje pogodaka reči u svakom pravcu se zaustavlja kada: kumulativni rezultat poravnanja padne za količinu X od svoje maksimalne postignute vrednosti; kumulativni rezultat dospe do nule ili ispod, zbog akumulacije jednog ili više poravnanja ostataka sa negativnim bodovanjem; ili je dostignut kraj bilo koje sekvence. Parametri BLAST algoritma W, T i X određuju osetljivost i brzinu poravnanja. Program BLASTN (za nukleotidne sekvence) koristi kao podrazumevane veličine dužinu reči (W) od 11, očekivanje (E) od 10, M=5, N=-4, i poređenje oba standarda. Za aminokiselinske sekvence, program BLASTP koristi kao početne vrednosti dužinu reči (W) od 3, očekivanje (E) od 10 , i BLOSUM62 matricu za bodovanje (videti Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).
[0111] Dok su gorepomenuti algoritmi i programi pogodni za određivanje poravnanja sekvenci i % identičnosti sekvence, u svrhe ovog otkrića, određivanje % identičnosti sekvenci će se obično izvoditi upotrebom BESTFIT ili GAP programa u paketu GCG Wisconsin Software (Accelrys, Madison WI), pomoću datih početnih parametara.
[0112] Pojam „NH2 terminalne modifikacije“ može da se koristi da bi se označili ovde opisani peptidi. Terminalni deo peptidnih jedinjenja ovog pronalaska koji odgovara amino -kraju, ukoliko je prisutan, može da bude u „slobodnom“ obliku (npr. H2N-), ili alternativno može da bude acilovan grupom formule R<2>C(O)- ili R<2>S(O)2-, pri čemu je R<2>kao što je prethodno definisano. U jednom primeru izvođenja, R<2>je izabran iz grupe koja se sastoji od (C1-C6) alkila, (C5-C10) arila, (C6-C16) arilalkila, 5-10-članog heteroarila ili 6-16-članog heteroarilalkila.
[0113] U još jednom primeru izvođenja, amino-kraj može da bude „blokiran“ blokirajućom grupom konstruisanom da dodeli jedinjenju specifična svojstva, kao što je mala antigenost. Neograničavajući primeri takvih blokirajućih grupa uključuju polimere polialkilenoks ida kao što je polietilenglikol (PEG). Razni polimeri korisni za dodeljivanje jedinjenjima, a posebno peptidima i proteinima, konkretnih svojstava su poznati u tehnici, kao i hemijske reakcije pogodne za vezivanje takvih polimera za jedinjenja. Konkretni neograničavajući primeri mogu da se pronađu u SAD patentima br. 5,643,575; 5,730,990; 5,902,588; 5,919,455; 6,113,906; 6,153,655; i 6,177,087.
[0114] Pojam „modifikacije karboksi-kraja“ može da se koristi vezano za ovde opisane peptide. Terminalni deo peptidnih jedinjenja koji odgovara C-kraju, ukoliko je prisutan, može da bude u obliku nederivatizovane karboksilne grupe, ili kao slobodna kiselina ili kao so, kao što je so natrijuma, kalijuma, magnezijuma ili druge soli neorganskog ili organskog jona, ili može da bude u obliku derivatizovanog karboksila, kao što je estar, tioestar ili amid. Takvi derivatizovani oblici jedinjenja mogu da se pripreme reakcijom jedinjenja koje ima karboksilni kraj sa odgovarajućim alkoholom, tiolom ili aminom. Pogodni alkoholi, tioli ili amini uključuju, primera radi a bez ograničenja, alkohole formule R<2>OH, tiole formule R<2>SH i amine formule R<2>NH2, R<2>R<2>NH ili NH3, gde je svako R<2>nezavisno od drugih, kao što je prethodno definisano.
[0115] Pojam „L ili D oblik aminokiselina“ može da se koristi u vezi sa ovde opisanim peptidom. Kao što će to stručnjaci prepoznati, razni X“ ostaci koji obuhvataju jedinjenja ovog pronalaska mogu biti ili u L- ili D-konfiguraciji oko svojih Cαugljenika. U jednom primeru izvođenja, svi Cαugljenici određenog jedinjenja su u istoj konfiguraciji. U nekim primerima izvođenja pronalaska, jedinjenja sadrže specifične hiralnosti oko jednog ili više Cαugljenika i/ili uključuju nepeptidne veze na specifičnim lokacijama kako bi se jedinjenju dodelila specifična svojstva. Na primer, dobro je poznato da su peptidi sastavljeni u celosti ili delimično od D-aminokiselinska otporniji na proteaze u odnosu na njihove odgovarajuće L-peptidne parove. Stoga, u jednom primeru izvođenja, jedinjenja predstavljaju peptide sastavljene u celosti ili delimično od D-aminokiselina. Alternativno, jedinjenja koja imaju dobru stabilnost pri dejstvu proteaza mogu da obuhvataju peptidne analoge koji uključuju peptidne veze obrnutog polariteta na specifičnim položajima. Na primer, jedinjenja stabilna pri dejstvu proteaza sličnih triptiku uključuju peptidne analoge koji imaju peptidne veze obrnutog polariteta pre svakog L-Arg ili L-Lys ostatka; jedinjenja koja su stabilna pri dejstvu proteaza sličnih himotripsinu uključuju peptidne analoge koji imaju peptidne veze obrnutog polariteta pre svakog malog i srednjeg L-alifatičnog ostatka ili L-nepolarnog ostatka. U još jednom primeru izvođenja, jedinjenja koja su stabilna pri dejstvu proteaza uključuju peptidne analoge sastavljene u celosti od peptidnih veza obrnutog polariteta. Drugi primeri izvođenja koji su stabilni pod dejstvom proteaza biće očigledni stručnjacima u ovoj oblasti. Ovde su opisani dodatni specifični primeri izvođenja jedinjenja.
[0116] Kako se ovde koristi, pojam „dugotrajna primena“ se odnosi na primenu mutanta htCBS konjugovanog sa PEG grupom tokom vremenskog perioda od 6 nedelja ili duže.
[0117] Kako se ovde koristi, pojam „kontinuirana primena“ se odnosi na ponovljenu primenu mutanta htCBS konjugovanog sa PEG grupom tokom trajanja studije putem SC injekcije ili implantirane osmotske pumpe.
[0118] Kako se ovde koristi, pojam „I278T“, „I278T homozigotni“, ili „I278T -/homozigotni“ miševi se odnosi na mišji model kod kojeg je endogeni mišji gen cbs inaktivisan i humani transgen CBS koji ima najčešću mutaciju u CBS alelu, 833T>C (I278T), koja je povezana sa homocistinurijom, umetnut kao cDNK klon pod kontrolom cinkinducibilnog promotora na plazmidu integrisanom u mišji genom.
PRIMERI
[0119] Sledeći primeri su ilustrativne prirode i ni na koji način nisu predviđeni da budu ograničavajući.
Primer 1. Eksperimentalne procedure
A. Konstrukcija sekvenciono-optimizovane, skraćene humane CBS u PET29A(+) vektoru [0120] Kao što je prethodno opisano u međunarodnoj objavi br. WO2014120770, kodirajuća sekvenca pune dužine (551 aa) humane CBS je optimizovana za bakterijsku ekspresiju i klonirana u vektor pUC57 nakon digestije restrikcionim enzimom EcoRV, pomoću GenScript SAD Inc (NJ, SAD). Sekvenca CBS je zatim amplifikovana PCR tehnikom pomoću prajmera A1 i A2 da bi se generisala sekvenca koja kodira skraćeni enzim (aa 1-413). Proizvod PCR je zatim digestiran restrikcionim enzimima NcoI i XhoI, i ligiran u vektor pET-28a(+)koji je digestiran istim enzimima. Kloniranje u optimalno NcoI mesto pET-28a(+) dovodi do mutacije G u C u odnosu na CBS sekvencu divljeg tipa. Komplet za mutagenezu usmerenu na mesto (Stratagene, CA, SAD) koji koristi prajmere B1 i B2, korišćen je za ponovno generisanje sekvence divljeg tipa (htCBS). Ista strategija je korišćena za generisanje mutanta C15S (mutacija T u A; htCBSC15) upotrebom prajmera C1 i C2. Sve sekvence su verifikovane sekvenciranjem. Ekspresiju skraćene CBS kontroliše ushodni promotor T7 u vektoru pET-28a(+), što zahteva transformaciju u bakterije DE3 i indukciju putem IPTG. Tabela 1 opisuje prajmere i njihove identifikatore sekvenci.
Tabela 1. Prajmeri
B. Ekspresija i prečišćavanje
[0121] Vektor pET-28a(+), koji nosi sekvencu koja kodira skraćenu humanu CBS, je transformisan u bakterije DE3, tj. E. Coli BL-21 (DE3) ili HMS174(DE3), i bakterije iz klonova rezistentnih na kanamicin su uzgajane u 5 ml podloge Luria-Bertani (LB), sa 30 µg/ml kanamicina, tokom noći na 37 °C na rotacionom šejkeru pri 275 o/min. Jedan ml prekonoćne kulture je dodat u 100 ml podloge Terrific Broth (TB) sa 30 ug/ml kanamicina i uzgajana je tokom noći. Zatim je 10 ml toga dodato u 1 litar TB podloge koja sadrži 0.001% tiamin-HCl pH 8.0, 0.0025% piridoksin-HCl pH 8.0, 0.3 mM δ-ALA pH 8.0, 150 µM ferihlorida, 30 ug/ml kanamicina. Kultura je zatim uzgajana na 30°C na rotacionom šejkeru pri 275 o/min dok OD600nije dostigla vrednost od -0.6-0.7, i ekspresija proteina je indukovana dodavanjem 1 mM IPTG. Fermentacija je zatim nastavljena dodatnih 16 sati. Ćelije su sakupljene 10-minutnim centrifugiranjem na 6000 RCF na 4°C, oprane ledenim 0.9% NaCl, ponovo centrifugirane kako je gore opisano, i zamrznute na -80°C. Zatim su dodata 4.45 ml pufera za lizu (20 mM NaH2PO4, pH=7.2, 40 mM NaCl, 0.1 mM PLP) po 1 gramu peleta u ćelijski pelet i ovaj poslednji je homogenizovan u Dounce homogenizatoru i obrađen lizozimom (2 mg/ml finalno), inkubiran tokom 1 sata na 4°C na platformi koja se ljulja, sonifikovan kako bi se smanjio viskozitet, i centrifugiran na 53000 RCF. Supernatant, koji obuhvata rastvorljivu frakciju se zatim čuva na -80°C. Lizat je obrađen putem višefaznog hromatografskog postupka. Sam postupak se sastoji od anjonske izmenjivačke kolone za vezivanje (DEAE sefaroza-FF), praćene afinitetnom kolonom. Ovim se postiže čistoća od približno 90%. Konačna čistoća od > 99% se postiže upotrebom jednog ili dva koraka završnog hromatografskog prečišćavanja. Finalni eluat iz kolone je dijafiltriran u PBS.
C. Test za enzimsku aktivnost
[0122] Aktivnost CBS je određena radioizotopskim testom sa C<14>-obeleženim serinom kao supstratom. Deset µl (ukupno 490 ng) čiste htCBS u puferu za razblaženje (0.1 M Tris -HCl pH=8.6, 1 mM DTT, 10 µM PLP, 0.5 mg/ml BSA) ili 10 µl plazme je dodato u 85 µl reakcione smeše koja sadrži 0.1 M Tris-HCl pH=8.6, 10 mM L-serina, 0.5 mM PLP, 0.5 mg/ml BSA i 0.3 µCi (za čist enzim) ili 0.45 µCi (za plazmu) L-[C<14>(U)]-serina. Uzorci su inkubirani 5 minuta na 37 °C i reakcija je započeta dodavanjem 5 µl 0.2 M Hcy (10 mM finalna koncentracija). Nakon 30 minuta inkubacije na 37 °C, 20 µl alikvota smeše za ispitivanje je naneto na papir stepena 3 CHR Whatman (NJ, SAD). Pokretanje testa i uzorkovanje rezultujuće smeše su raspoređeni tako da je vreme svake reakcije bilo 30 minuta. Za izolovanje radioaktivnog proizvoda (Cth) iz obeleženog supstrata (Ser) korišćena je silazna hromatografija na papiru. C<14>-cistationin koji se formirao u reakciji je odvojen od C<14>-serina silaznom hromatografijom na papiru tokom noći u smeši 2-propanol/mravlja kiselina/H2O (75 : 5.7 : 18.9 zapr./zapr.). Radioaktivnost u oblasti markera cistationina (detektovanog bojenjem trake sa markerom ninhidrinom) je određena rezanjem hromatograma u trake koje su uronjene u 5 ml scintilacionog koktela Opti -fluor (PerkinElmer, MA, SAD) i brojane u scintilacionom brojaču Beckman LS-3801. Uzorak bez enzima je korišćen kao slepa proba radi praćenja pozadinske radioaktivnosti koja je zatim oduzeta od svakog uzorka. Za čist enzim, specifične vrednosti aktivnosti su izražene kao enzimske jedinice (količina enzima koji prozvodi 1 µmol cistationina/sat) po mg CBS, a za uzorke plazme kao jedinice po µl plazme. U farmakokinetičkim studijama (PK), ovo je označeno kao: mU/µl plazme.
D. Test aktivnosti na gelu
[0123] Uzorci proteina su razdvojeni pomoću nativne Page analize (Bio-Rad, CA, SAD). Gel je zatim inkubiran 15-30 minuta u rastvoru za bojenje (100 mM Tris-HCl pH=8, 20 mM L-cistein, 50 mM 2-merkaptoetanol, 0.1 mM PLP i 0.2 olovonitrat). Reakcija je zaustavljena uranjanjem gela u 7% sirćetnu kiselinu.
E. Određivanje koncentracija metabolita
[0124] Metaboliti u plazmi, homocistein, cistationin i cistein su određeni masenom spektrometrijom-tečnom hromatografijom sa razblaženjem stabilnog izotopa kao što je prethodno opisano u (Allen et al., 1993, Metabolism, 42: 1448-1460). Merenja ukupnog homocisteina nevezanog za protein i drugih aminotiola kao i aminokiselina u tkivu su izvedena kao što je opisano u (Maclean et al., 2010b. Mol. Genet. Metab. 101, 153 -162). Metaboliti su određeni masenom spektrometrijom-tečnom hromatografijom sa razblaženjem stabilnog izotopa.
F. PEGilacija
[0125] Molekuli polietilenglikola su nabavljeni od NOF korporacije (Tokyo, Japan). PEGilacija je izvedena prema uputstvima proizvođača. Na primer, kuplovanje PEG derivata maleimida sa SH grupama htCBS (5 mg/ml) je izvedeno u 100 mM fosfatnom puferu pH=6.5 tokom noći na 4 °C. Molarni odnos između PEG molekula i CBS proteina je bio 10 : 1 ili 5 : 1.
[0126] Alternativno, PEGilacija je postignuta konjugacijom 20kDa NHS-estra PEG (ME-200GS) sa htCBS C15S (skraćena humana CBS sa mutacijom C15S). Protokol u nastavku daje opis postupka PEGilacije.
[0127] Izmenjen je pufer u hromatografski prečišćenoj htCBS C15S i formulisana je u 100mM natrijum fosfatnom puferu pH 7.2 i koncentrovana do najmanje 10 mg/ml. Alikvot enzima je skladišten na -80 °C, i otapan na 37/42 °C u vodenom kupatilu uz povremeno mešanje. Alikvot enzima je centrifugiran kako bi se uklonila nastala pena, ukoliko se stvorila, i čuvan na ledu do upotrebe.
[0128] Molarni odnos PEGilacije je bio 1 : 10 (po subjedinici htCBS C15S), koji se prevodi u 431 mg ME-200GS na 100 mg htCBS C15S. Izračunata količina proteina, vode i 2x pufera (potrebno samo ako je koncentracija enzima veća od 10 mg/ml) je pomešana u sterilnoj falkon epruveti od 50 ml koja ne sadrži endotoksin. Na primer, za PEGilaciju 200 mg htCBS C15S od 20 mg/ml je bilo potrebno 10 ml proteina, 12 ml sterilne vode i 10 ml 100mM pufera Na-P pH7.2. Epruveta je ukupno sadržala zapreminu od 32 ml i čuvana je na ledu. U odvojenoj epruveti, 862 mg ME-200GS PEG je rastvoreno u sterilnoj vodi ili DMSO mešanjem, vorteksovanjem ili opciono zagrevanjem na 37/42 °C u vodenom kupatilu na kratko. PEG se brzo rastvorio u bistar, veoma viskozan rastvor. Razblaženi enzim je brzo prenet u epruvetu koja sadrži rastvoreni PEG ili presipanjem ili pipetiranjem. Epruveta je čvrsto zatvorena i odmah vorteksovana 10-15 sekundi da bi se napravila homogena smeša. Epruveta je inkubirana na sobnoj temperaturi na platformi koja se ljulja tokom 4-6 sati ili na 4 °C tokom noći.
G. Čuvanje enzima
[0129] PEGilovana htCBS C15S je formulisana upotrebom PBS pH7.4 i koncentrovana do približno najmanje 5 mg/ml, i obično do koncentracije između 10 i 25 mg/ml. Enzim je skladišten na -80 °C u (1.2 ml) alikvotima. Za svaki dozirajući dan, svež rastvor enzima za jednokratnu upotrebu je pripremljen razblaživanjem u PBS do finalne koncentracije 1 mg/ml. Sav rastvor koji je preostao nakon završetka doziranja je odbacivan.
H. Procedure na životinjama
[0130] Sve procedure na životinjama su odobrene od strane IACUC Univerziteta Kolorado -Denver, koji je ustanova akreditovana od strane AAALAC (#00235), potvrđena od strane Službe javnog zdravlja (#A 3269-01) i licencirana od strane USDA (#84-R-0059). C576BL/6J i CBS nokaut (KO) miševi su dobijeni iz Jackson laboratorije (ME, SAD). U laboratoriji su prethodno generisani „isključivo humani“ (HO) miševi (Maclean et al., 2010b. Mol. Genet. Metab. 101, 153-162). Životinje su držane na standardnoj ekstrudiranoj ishrani 2918 (Harlan, CA, SAD) sa neograničenim pristupom hrani i vodi.
[0131] Reprezentativni mladunci su rutinski analizirani na homozignotost. Lanceta za jednokratnu upotrebu za submandibularno krvarenje je korišćena za uzimanje krvi u Capiject T-MLHG litijum-heparinske (12.5 IU) epruvete sa gelom (Terumo Medical Corporation, NJ, SAD). Epruvete su zatim centrifugirane na 1200G tokom 10 min, nakon čega je usledilo sakupljanje plazme u epruvete od 1.5 ml i čuvanje na -80 °C.
[0132] Genotipizacija: Reprezentativni mladunci su rutinski analizirani na homozigotnost pomoću qPCR. Biopsije repova su urađene pomoću kompleta DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, Hilden, Nemačka). Kvalitet DNK je praćen pomoću NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, DE, SAD). Uzorci DNK od 20 ng su testirani singlpleks reakcijom u triplikatu upotrebom smeše Gene Expression master mix (artikal #4369016) proizvođača Applied Biosystems (CA, SAD). Amplifikacija je izvedena pomoću uređaja 7500 Fast Instrument proizvođača Applied Biosystems postupkom standardne krive. Referentni testovi za broj kopija Tert (artikal #4458366) ili Tfrc (artikal #4458368) kompanije Applied Biosystems su korišćeni kao homozigotni kalibrator za jednu kopiju. Za detekciju Neo gena korišćen je test Mr00299300 kompanije Applied Biosistems.
[0133] Pacovi Sprague Dawley divljeg tipa su smešteni u kavezima i držani u uslovima neograničenog pristupa hrani i vodi.
[0134] Makaki majmuni divljeg tipa (Macaca fascicularis) su smešteni u obore sa neograničenim pristupom hrani i vodi razdvojeni prema polu. Dvanaestočasovni ciklusi svetlosti/mraka, temperatura i vlažnost su kontinuirano praćeni i kontrolisani. Svakodnevno je obezbeđivano dodatno obogaćivanje sredine auditivno , u smislu prirodnih pozadinskih zvukova i vizuelno, u smislu video snimaka prirode. Svi majmuni su pregledani po pitanju opšteg zdravlja pre ispitivanja.
I. Uzimanje uzoraka
[0135] Nakon injektovanja PEGilovanog oblika htCBS, kao što je 20NHS PEG-htCBS C15S, krv je uzeta u raznim vremenskim tačkama u Capiject T-MLHG litijum-heparinske epruvete (12.5 IU) sa gelom (Terumo Medical Corporation, NJ, SAD) iz submandibularne vene svesnih životinja u studiji pomoću lanceta za jednokratnu upotrebu dizajniranih za submandibularno uzorkovanje. Plazma je uzeta iz uzoraka krvi nakon centrifuge na 1200G tokom 10 minuta i čuvana na -80 °C u epruvetama od 1.5 mL.
J. Farmakokinetika
[0136] Farmakokinetički (PK) parametri su izračunati korišćenjem nekompartmentnog modela razlaganja krive koji razlaže krivu u niz eksponencijalnih članova koji odgovaraju fazama apsorpcije, distribucije i eliminacije koje se javljaju tokom vremenskog toka postojanja enzima u krvi. Pristup razlaganja krive pretpostavlja da faze dispozicije leka prate prividnu kinetiku prvog reda, o čemu svedoči linearnost u završnom delu semi -log dijagrama. Ovi proračuni su napravljeni korišćenjem programa za modelovanje pod nazivom PK Solutions 2.0 (Summit Solutions, Montrose, CO) korišćenjem srednje aktivnosti enzima plazme za svaki put primene. Bioraspoloživost je izračunata deljenjem površine ispod krive (AUC) za SC ili IP put sa AUC primećenim posle IV primene.
K. Priprema uzoraka za mapiranje NHS PEGilacije
[0137] Svaki uzorak (300 µg), uključujući ne-PEGilovanu CBS kontrolu, je razblažen HPLC vodom (ThermoFisher) do 80 µL. Uzorak je zatim pomešan u odnosu 1 : 1 (zapr./zapr.) sa 0.24 M CAPS puferom (Sigma) pH 11.5 i inkubiran na 37 °C tokom 22 sata kako bi se uklonili PEG. De-PEGilovani uzorak je prebačen na Amicon Ultra 30K centrifugalni filter (Millipore) i dodato je 320 µL 8M guanidin HCl rastvora (Sigma). Filter je centrifugiran na 13.000 o/min tokom 10 minuta. Ovaj postupak je ponovljen dva puta da bi se u uzorcima izmenio pufer u 8M guanidin HCl i uklonio preostali slobodni PEG.
[0138] Uzorak je kombinovan sa 1M Tris HCl (pH 7.5) do konačne koncentracije od 100 mM Tris. Uzorak je redukovan sa 10 mM DTT (Sigma) na 56 °C tokom 45 minuta i ohlađen. Jodoacetamid je dodat do finalne koncentracije od 30 mM i uzorci su inkubirani u mraku na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Uzorak je zatim razblažen sa 50 mM rastvora Tris (pH 7.5) da bi se postigla koncentracija guanidina od 1 M. Redukovani/alkilovani uzorci su korišćeni za digestiju Asp-N endopeptidazom.
[0139] Dva µg Asp-N su dodata u 100 µg redukovanog i alkilovanog uzorka (odnos enzim : protein = 1 : 50 (tež. : tež.)). Digestija je izvedena tokom noći na 37 °C.
L. Priprema uzoraka za histopatološku analizu
[0140] KO miševi kojima je injektovan PBS ili su lečeni PEGilovanim htCBS konjugatom, kao što je 20NHS PEG-htCBS C15S, žrtvovani su 17-19. dana i uzorci jetre su obrađeni za histološku analizu optičkom mikroskopijom. Histološka procena je obavljena sa zaslepljivanjem. Jetre su uklonjene i fiksirane tokom 24 sata 4% paraformaldehidom u PBS (pH 7.4). Blokovi tkiva za histologiju su isečeni, dehidrirani serijom etanola, a zatim acetonom, smešom acetona i ksilena i ksilenom, zatim su ugrađeni u parafin. Paralelno, mali blokovi tkiva (oko 4 mm × 2 mm) fiksirani paraformaldehidom su brzo zamrznuti u petroletru ohlađenom suvim ledom i čuvani na -50 °C za detekciju apolarnih lipida. Parafinski isečci debljine 4 µm su deparafinizovani u ksilenu i nakon koraka izopropil alkohola rehidrirani etanolom (96%, 70%, 60%). Isečci tkiva su obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E) da bi se procenile histopatološke promene. Za detekciju fibroze obavljeno je Massonovo trohromno bojenje. Steatoza je verifikovana pomoću Oil Red O bojenja za detekciju apolarnih lipida u fiksiranim-zamrznutim isečcima debljine 10 µm isečenim kriomikrotomom Leica (CM 1850). Preseci su pregledani i fotografisani svetlosnim mikroskopom Nikon (E800) opremljenim digitalnim fotoaparatom Olympus (DP70).
[0141] Za elektronsku mikroskopiju, jedna trećina svake jetre je obrađena za elektronsku mikroskopiju isecanjem na parčad debljine 1-2 mm i uronjena nakon fiksacije u 3% glutaraldehid. Uzorci su zatim ugrađeni u smešu Epon-Araldite, dvostruko obojeni i pregledani pomoću elektronskog mikroskopa JEOL 1200 pri uvećanju od 3000x.
M. Dvoenergetska rendgenska apsorptiometrija (DEXA)
[0142] Skener PIXImusII DEXA (GE Lunar Medical Systems) posebno dizajniran za skeniranje malih životinja kao što su miševi je korišćen za DEXA analizu. Ovaj uređaj je omogućio brzo i efikasno određivanje kompozicije tela (masa bez masnog tkiva, masa masnog tkiva i gustina kostiju) miša terminalnih procedura ekstrakcije tkiva. Miševi su izgladnjivani 4 sata pre DEXA merenja kako bi se uklonila hrana iz gastrointestinalnog trakta. Miševi su zatim anestezirani pomoću IP bolus injekcije od 60 mg/kg ketamina i 15 mg/kg ksilazina i stavljeni na stalak DEXA uređaja. Nakon završenog merenja (3∼5 minuta), miševi su uklonjeni iz DEXA uređaja i korišćeni u terminalnim procedurama, kao što su ekstrakcije tkiva.
N. Priprema uzoraka oka za posmatranje mikroskopom
[0143] Miševi su podvrgnuti perfuzionoj fiksaciji 4% paraformaldehidom u 1× PBS pH 7.4 (4% PFA) da bi se sačuvali zidovi očne jabučice. Oči su pažljivo hirurški uklonjene, uronjene u 4% PFA i pažljivo je napravljen mali otvor u zadnjem delu očne jabučice ispod optičkog nerva kako bi se omogućilo da fiksativ prodre u unutrašnjost oka i fiksira strukture tokom noći na 4 °C. Uzorci su oprani 3 puta pomoću filtriranog 1× PBS pH 7.4. Nakon pranja, posteriorni deo očne jabučice je pažljivo seciran do nivoa cilijarnog epitela kako bi se izložila cilijarna zona. Uzorak je stavljen u 8% rastvor BSA za blokiranje tokom 2 sata uz mućkanje. Nakon blokiranja, u uzorak su dodata antitela MAGP1 (Sigma) razblažena 1 : 50 u 4% BSA i čuvana na 4 °C tokom noći. Sledećeg dana, uzorak je opran 6 puta pomoću 1x PBS pH 7.4, i uzorku su dodata sekundarna antitela Alexa 488 (1 : 200, Invitrogen) i inkubirana 2 sata na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Uzorak je opran 6 puta i kontrastno obojen metil zelenom (nuklearno bojenje) tokom 15 minuta.
[0144] Rastvor koji sadrži 4% agaroze se zagreva, sipan u poklopljenu staklenu Petri posudu, i ostavljen se da se stvrdne na sobnoj temperaturi. Stvrdnuti gel je služio kao komora za snimanje oka. U gelu je napravljena mala rupa koja služi kao sigurnosna komora za oko. Da bi se posmatrala cilijarna zona, komora je napunjena sa 1x PBS, i obojeni uzorak oka je stavljen u otvor sa posteriornom površinom sočiva koja je dodirivala sloj gela. Trodimenzionalne slike su generisane korišćenjem invertnog konfokalnog mikroskopa LSM 510 pri uvećanju od 10x i zumu od 0.7x.
Primer 2. Retenciono vreme htCBS
A. Nemodifikovana htCBS ispoljava kratko retenciono vreme u cirkulaciji
[0145] Na farmakokinetička svojstva farmakološki aktivne supstance koja se daje u cirkulaciju u velikoj meri utiču prirodni mehanizmi ADME. Brzi klirens injektovanog molekula može u velikoj meri da utiče na efikasnost lečenja i stoga su poželjni duži poluživoti u cirkulaciji koji mogu da se prevedu u manje učestalo davanje ili manje doze koje zauzvrat svode neželjena dejstva na minimum. Da bi se odredila farmakokinetika htCBS u cirkulaciji plazme, pojedinačna doza od 5 mg/kg je ubrizgana supkutano (SC) , intravenski (IV) ili intraperitonealno (IP) C57BL/6J miševima. Davanje htCBS IV ili IP putem je ispoljilo najviše vrednosti specifične aktivnosti tokom prva 4 sata posle injekcije (primećeni najviši nivoi u plazmi do 123 i 76 mU/µL, tim redom; tabela 2 prikazuje vrednosti površine ispod krive (AUC)). Farmakokinetički parametri izračunati iz uzoraka plazme (Tabela 2) pokazuju da je poluživot htCBS iznosio 2.7 sati, što ukazuje na to da bi nakon približno 6 poluživota (manje od 20 sati) nivoi htCBS trebalo da budu nedetektabilni.
[0146] Bioraspoloživost htCBS je iznosila 50% za SC puteve primene što sugeriše da SC isporuka može da bude klinička opcija za ovaj terapijski pristup. Duži prividni poluživot za SC i IP (Tabela 2) može da se objasni fazom spore apsorpcije koja se javlja tokom faze eliminacije čime se produžava srednje vreme rezidentnosti i prividni poluživot, mada je za ovu svrhu bio poželjan mnogo duži poluživot i zbog toga su ispitani PEGilovani derivati htCBS.
Tabela 2. Farmakokinetički parametri
[0147] Brzi pad aktivnosti htCBS in vivo može da se pripiše olakšanom klirensu iz cirkulacije i takođe može da se pripiše gubitku enzimske aktivnosti kada se htCBS uvede u okruženje u cirkulaciji. Da bi se ovo poslednje ispitalo, htCBS je inkubirana in vitro u mišjoj plazmi divljeg tipa ili HO miševa na 37<0>C do 96 sati, pri čemu je aktivnost merena na svaka 24 sata. Kao što je prikazano na SL. 1A, nije zabeležen značajan gubitak aktivnosti do 72 sata inkubacije u plazmi bilo kog mišjeg modela. Blagi gubitak aktivnosti od 25% je zabeležen nakon 96 sati inkubacije. Dalje, kao što je prikazano na SL. 1B, western blot (WB) analize plazme iz životinja koje su primile SC injekciju, su otkrile da količina htCBS opada u funkciji vremena, pa stoga klirens objašnjava brzi gubitak aktivnosti htCBS u cirkulaciji, a ne gubitak aktivnosti u plazmi.
B. PEGilacija htCBS poboljšava poluživot u plazmi in vivo
[0148] Da bi se odredio uticaj molekula PEG na farmakokinetiku CBS, htCBS je PEGilovana linearnim PEG male molekulske mase (2 kDa), i razgranatim PEG sa četiri kraka velike molekulske mase (40 kDa) (označenim sa ME020MA i GL4-400MA, redom). Kao što je prikazano u tabeli 3, PEGilacija nije uticala na specifičnu aktivnost enzima. Tabala 3 prikazuje rezultate Coomassie-obojene SDS-PAGE PEGilovane i ne-PEGilovane htCBS sa odgovarajućim vrednostima specifične aktivnosti koje pokazuju da PEGilacija ne utiče na aktivnost enzima. Miševima je SC injektovana ME200MA- ili GL4-400MA-PEGilovana htCBS u poređenju sa ne-PEGilovanom htCBS, kao što je opisano u A (n=4-5).
Tabela 3. Aktivnost
[0149] Doza od 5 mg/kg telesne mase (BW) PEGilovane htCBS (PEGhtCBS) je data C57BL/6J miševima SC i IV putem, a aktivnost CBS je praćena u različitim vremenskim tačkama. Dva eksperimentalna kraka (n=5 svaki) su korišćena za svaki način primene injekcije. Krv je uzimana nakon injekcije iz grupe 1 na 0, 1, 8 i 24 sata, a iz grupe 2 na 1, 4, 10 i 48 sati.
[0150] Kao što je prikazano na SL. 1B (donji panel) za GL4-400MA PEGhtCBS, aktivnost u plazmi je značajno produžena kod PEGilovanog proteina u odnosu na ne -PEGilovani član para. Kao što je prikazano u tabeli 4, poluživot je porastao sa 2.7 sati za ne -PEGilovanu htCBS na 16.7 i 30.4 sati sa ME020MA i GL4-400MA PEGilacijom, redom.
Tabela 4. Rezultati farmakokinetičkog modelovanja
[0151] Ovo znači da bi vreme izlaganja nakon pojedinačne doze bilo 5 do 10 puta duže za PEGilovane oblike. Pored toga, bioraspoloživost nakon SC primene je bila u opsegu od 50 do 80% sugerišući da bi SC put primene bio pogodan za klinička ispitivanja.
Primer 3. Primena htCBS i nivoi homocisteina, cistationina i cisteina u serumu.
[0152] Krajnji cilj upotrebe htCBS za CBSDH je smanjenje toksičnog opterećenja tHcy, kako bi se povećali nivoi cistationina i cisteina. Za ove promene se očekuje da spreče, dovedu do reverzije ili odlože početak simptoma CBSDH. Istraživanja homocistinurije su, međutim, dugo bila ometana nedostatkom pogodnog životinjskog modela. Miševi kod kojih je mišji gen potpuno inaktiviran ugibaju tokom 2-3 nedelje nakon okota. HO („isključivo humani“) miševi su različiti od drugih nokaut miševa po tome što, pored toga što imaju mišji gen koji je potpuno inaktiviran, eksprimiraju niske nivoe humanog gena, što im omogućava preživljavanje do odraslog doba (Maclean et al., 2010b. Mol. Genet. Metab. 101, 153 -162). HO miševi ispoljavaju ozbiljne poraste Hcy, metionina, S-adenozilmetionina i S-adenozilhomocisteina i zajedno sa istovremenim opadanjem nivoa cisteina u plazmi i jetri. Shodno tome, ovi miševi ispoljavaju karakteristike koje u nekoliko aspekata, rekapituliraju bolest onako kako se ona javlja kod ljudi.
A. Primena htCBS ne poboljšava koncentracije tHcy i cistationina
[0153] HO miševi kojima je davana ne-PEGilovana htCBS u dozi od 5mg/kg tokom 5 uzastopnih dana 1. i 3. nedelje (10 dana između setova lečenja) nisu pokazali promenu u nivoima homocisteina u serumu. SL. 2 prikazuje srednje nivoe homocisteina i cistationina kod HO miševa. Ovaj nedostatak metaboličke modulacije ne-PEGilovanom htCBS dalje potvrđuje neophodnost modifikovanja htCBS kovalentnim vezivanjem molekula polietilenglikola.
[0154] Nekoliko različitih hemijskih struktura PEG je opisano u međunarodnoj objavi br. WO2014120770, (videti tabelu 5) i podaci ukazuju da CBS koja je PEGilovana sa PEG manjim od 20 kDa pokazuje brži gubitak aktivnosti u plazmi od CBS sa PEG veće molekulske mase. Iz tog razloga, linearni 20 kDa PEG označen sa ME200MA0B je izabran za dalje analize. SL.3 predstavlja Coomassie-obojenu SDS-PAGE koja prikazuje vremenski tok PEGilacije htCBS sa ME200MA0B. Reakcija PEGilacije je započeta dodavanjem PEG, a uzorci su uzimani iz epruveta u naznačenim vremenskim tačkama radi analize.
Tabela 5. Procena PEG hemije
B. Ponovljena primena PEGhtCBS poboljšava koncentracije tHcy i cistationina i obnavlja normalne nivoe cisteina.
[0155] Dugoročni efekat primene PEGhtCBS se prati pomoću HO miševa. Enzim PEGhtCBS je primenjen kod 8 HO miševa u dozi od 7.5 mg/kg, dva puta nedeljno (ponedeljak i četvrtak) tokom prve dve nedelje, a zatim tri puta nedeljno (ponedeljak, sreda i petak) tokom 6 nedelja. Uzorci krvi su uzimani 24 sata (utorak) i 72 sata (ponedeljak) nakon injekcije (SL. 4A-4C). Na SL. 4A je prikazano da se tHcy u plazmi smanjuje sa 212 µM u vremenskoj tački 0 do proseka u opsegu od 62-103 µM 24 sata nakon injekcija, i nalazi se u opsegu od 141-189 µM 72 sata posle poslednje nedeljne injekcije. Od 28. dana pa na dalje, vrednosti 72 sata nakon injekcije bile su značajno niže od vrednosti u vremenskoj tački 0 (P≤ 0.02). Pozitivan uticaj je takođe postojao i na nivoe cistationina i cisteina. Cistationin se povećao sa 6 µM na čak 30 µM a cistein je konstantno bio iznad 200 µM 24 sata posle injekcije (SL. 4C). Zanimljivo je da su od 24. dana, fluktuacije koncentracije cisteina bile mnogo manje izražene u odnosu na prve tri nedelje lečenja. Pored analize nivoa metabolita u plazmi, uzorci tkiva jetre, bubrega i mozga injektovanih miševa su takođe analizirani da bi se odredili i nivoi homocisteina koji nije vezan za protein (slobodni i oblici povezani disulfidom). Kao što je prikazano na SL. 4D, kod životinja koje su dugotrajno primale injekcije, pokazano je smanjenje od 44%, 63% i 47% za tkivo jetre, bubrega i mozga, redom. Stoga, dugotrajno ponavljana injekcija PEGhtCBS značajno utiče na nivoe homocisteina, cistationina i cisteina u plazmi.
Primer 4. Mutant htCBS (C15S) pokazuje poželjne obrasce agregacije i PEGilacije
A. C15S mutirana htCBS ne ispoljava agregaciju i pokazuje uniformni obrazac PEGilacije [0156] Iako je prethodno izveštavano da je enzim htCBS manje sklon agregaciji u odnosu na protein pune dužine (Frank et al., 2006, Biochemistry 45:11021-11029), on i dalje obrazuje tetramere i veće agregate. Ovo može da stimuliše imunske odbrambene mehanizme i da dovede do npr. taloženja amiloida (D'Souza etal., 2014, „Amyloid: the international journal of experimental and clinical investigation. The official journal of the International Society of Amyloidosis“ 21 :71-75), ali takođe i da utiče na prečišćavanje, rukovanje i konzistentnost. SL. 5A (prethodno otkrivena kao Sl. 5A u WO2014120770) prikazuje Coomassie-obojenu nativnu-PAGE koja pokazuje da su različite šarže htCBS ispoljile različite odnose dimera/tetramera, sa različitim stepenima većih agregata. SL. 5B (prethodno otkrivena kao Sl. 5B u WO2014120770) predstavlja ispitivanje aktivnosti na gelu koje pokazuje da ovi agregati ispoljavaju aktivnost CBS. SL.5C (prethodno otkrivena kao Sl. 5C u WO2014120770) prikazuje da agregacija uzrokuje nekonzistentne proizvode PEGilacije. PEGilacija je rezultovala u dve različite trake, koje, pretpostavlja se, reflektuju različite stepene PEGilacije budući da agregacija može da deluje tako da maskira dostupna mesta za PEGilaciju. Shodno tome, usled izraženije agregacije šarže 28 (SL. 5A) njena PEGilacija je dovela do izraženije niže trake, tj. manje PEGilovane, na SDS-PAGE (SL. 5C), dok je PEGilacija šarže 112, koja je obuhvatala i tetramere i dimere (SL. 5A), dovela do izraženije gornje trake u odnosu na šaržu 28 (SL.5C). SL. 5D prikazuje Coomassie-obojen nativni gel, koji ukazuje da je inkubacija obe šarže enzima sa redukcionim agensom tris(2-karboksietil)fosfinom (TCEP) pretvorila većinu tetramera i većih agregata u dimerni oblik. Ovi podaci ukazuju da agregacijom upravljaju cisteini izloženi na površini htCBS. Stoga, smatra se da tretman sa TCEP takođe dovodi do intenzivnije PEGilacije, budući da se više dimera stvara od oblika veće molekulske mase, čime se otvara put izlaganju dodatnih mesta za PEGilaciju na površini htCBS. Zapravo, kao što je prikazano na SL. 5E odnos između gornje/donje trake PEGilacije na Coomassie-obojenoj SDS-PAGE je značajno pomeren prema gornjoj traci nakon tretmana sa TCEP u odnosu na PEGilaciju u odsustvu TCEP.
Shodno tome, smatra se da agregacijom htCBS upravlja, bar delimično, stvaranje intramolekulskih disulfidnih mostova. Stoga, C15 je mutiran u serin, čime se stvara C15S mutant htCBS; za C15 je prethodno pokazano da je najreaktivniji cistein na površini CBS (Frank et al., 2006, Biochemistry 45:11021-11029). SL. 5F (prethodno otkrivena kao Sl.6A u WO2014120770) prikazuje Coomassie-obojeni nativni gel, na kome su za htCBS primećene dve glavne trake (dimeri i tetrameri), dok C15S mutant htCBS ispoljava jednu traku, na koju, kako je očekivano, ne utiče tretman sa TCEP. Ovom zapažanju dalje ide u prilog HPLC ekskluziona hromatografija prema veličini (HPLC-SEC). Preparati CBS su razdvojeni na koloni za isključivanje po veličini Yarra SEC-3000, 300*7.8 mm (Phenomenex, CA, SAD). Kolona je kalibrisana i analiza se odvijala u 100 mM natrijumfosfatu pH=6.8, pri brzini protoka od 1 ml/min na sobnoj temperaturi. HPLC-SEC analiza, SL. 5G (prethodno otkrivena kao deo SL. 7A i SL.7B u WO2014120770), prikazuje razlike u htCBS C15S (Sl. 5G, levi panel) i odnosa dimer/tetramer htCBS (SL. 5G, desni panel). Pojedinačni pik za dimerni C15S mutant htCBS je eluiran na 8.62 min dok je glavni pik za htCBS eluiran na 7.9 min, što odgovara tetrameru. SL. 4H prikazuje Coomassie -obojeni SDS-PAGE gel koji prikazuje reproduktivnost PEGilacije htCBS C15S između različitih šarži i poređenja sa htCBS. Odsustvo agregata u C15S htCBS je dovelo do konzistentnijeg obrasca PEGilacije između različitih šarži sa gotovo isključivo jednom PEGilovanom trakom koja se pojavljuje na SDS-PAGE. Direktno poređenje između PEGhtCBS i PEGC15S i in vivo i in vitro nije pokazalo razliku u učinku.
[0157] Efekat PEGC15S na metabolite je takođe ispitan 1, 4 i 24 sata posle injekcije (SL.
6A-SL.6C). Izmereni su nivoi tHcy (SL. 6A), cistationina (SL. 6B) i cisteina (SL. 6C) kod HO miševa kojima je injektovano 7.5 mg/kg PEGC15S ili PBS (n=5) 1, 4 i 24 sata pos le injekcije. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ±SEM i svaka vremenska tačka se poredi među dve grupe pomoću neuparenog Studentovog t testa. *p=0.05, **p ≤ 0.01 i ***p ≤ 0.001. Efekat na tHcy i cistein je primećen samo 24 sata posle injekcije (SL. 6A i SL. 6C), međutim značajan porast cistationina je primećen već posle 1 i 4 sata nakon injekcije (SL.
6B).
Primer 5. PEGC15S i betain funkcionišu sinergistički in vivo
[0158] Da bi se procenio efekat betaina i kombinovane terapije, terapije betainom, PEGC15S i kombinacijom betain+PEGC15S su izvedene i upoređeni su metaboliti puta transsulfuracije.
[0159] Grupe koje su primale betain i betain+PEGC15S su tretirane 2% betainom u pijaćoj vodi tokom 18 dana eksperimenta, a poslednjoj grupi je 14. i 15. dana injektovano 7.5mg/kg PEGC15S. Grupa tretirana samo sa PEGC15S je dobijala običnu vodu i primila je injekcije takođe 14. i 15. dana. Kao što je prikazano na SL. 7A, 14 dana tretmana betainom je dovelo do smanjenja tHcy od 29% i 32% kod grupa tretiranih betainom. Grupa tretirana samo betainom je održavala ove nivoe tHcy do 18. dana. Injekcija PEGC15S pri osnovnom tretmanu betainom je dovela do izraženijeg smanjenja od 74%, 77%, 76% i 40%, 15, 16, 17. i 18. dana, redom. Tretman samo sa PEGC15S je doveo do smanjenja od 69%, 67%, 52% i 33% 15, 16, 17. i 18. dana, redom. Prema ovim podacima, injekcija PEGC15S sa ili bez tretmana betainom je daleko superiornija od tretmana samo betainom. Pored toga, kombinacija betain+PEGC15S je bila superiornija u odnosu na tretman samo sa PEGC15S. Kao što je prikazano na SL.7B, razlika između ove dve grupe je postala statistički značajna 48 sati posle druge injekcije (17. dana). Samim tim, kombinacija PEGC15S sa betainom omogućava održavanje nižih nivoa tHcy tokom produženog vremenskog perioda.
[0160] Tretman samo betainom nije doveo do povećanja cistationina tokom 18 dana eksperimenta. Naprotiv, povećanje je primećeno kod dve grupe koje su tretirane sa PEGC15S (sa ili bez betaina). Zanimljivo je da je kombinacija PEGC15S sa betainom, koja je dovela do povećanja počevši od 16. dana pa na dalje, bila značajno manja nego u grupi koja je bila na terapiji samo sa PEGC15S. Ovo je zbog činjenice da je tretman samo sa PEGC15S takođe kanalisao homocistein u kondenzaciju sa serinom da bi se obrazovao cista tionin. Kombinacija sa betainom kanališe nešto dostupnog homocisteina kroz put remetilacije da bi se proizveo metionin, a samim tim manje homocisteina može da bude dostupno PEGC15S za pretvaranje u cistationin.
Primer 6. PEGC15S spašava KO miševe od rane smrti i ublažava bolest jetre
A. Smanjenje rane smrti
[0161] Većina kompletnih CBS-nokaut miševa (KO) ugiba u roku od 2-3 nedelje nakon okota. Grafički je prikazana Kaplan-Mejerova kriva preživljavanja KO miševa kojima je dva puta nedeljno injektovan PEGC15S nasuprot miševa kojima je ubrizgavan PBS. Miševi su držani na vodi sa betainom do 21. dana, i ispitana je mogućnost injektovanog enzima da spasi KO mladunce. KO mladuncima je dva puta nedeljno injektovan PEGC15S ili PBS. Svi miševi su bili na betainu u pijaćoj vodi do 21. dana (dana odvikavanja). Kao što je prikazano na SL.8A, 21. dana, samo 18% miševa je preživelo u grupi kojoj je ubrizgavan PBS, nasuprot 93% onih kojima je injektovan enzim. Nijedna životinja kojoj je injektovan PBS nije preživela do 24. dana, dok je 86% preživljavanja zabeleženo za grupu kojoj je injektovan enzim. Od 24. dana pa na dalje, broj životinja kojima je injektovan enzim je takođe počeo da opada, sa 45% preživljavanja 29. dana i 33% 35. dana, mada je primećeno da upotreba različitog molekula PEG i dozni režim u velikoj meri utiču na rezultate kao što je prikazano u dodatnim primerima u nastavku (npr. SL. 11A i 11C).
B. Bolest jetre
[0162] Ranije je pokazano da KO miševi pate od ozbiljnog oštećenja jetre (Maclean et al., 2010a, Mol. Genet. Metab 101, 163-171; Watanabe et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92:1585-1589). Produženo preživljavanje KO miševa, samim tim može biti u korelaciji sa poboljšanjem bolesti jetre nakon CBS lečenja. Shodno tome, urađene su histološke analize isečaka jetre životinja kojima je ubrizgavan PEGC15S tokom 35 dana. Životinje su žrtvovane 36. dana, a uzorci jetre su obrađeni za histološku analizu optičkom mikroskopijom. Životinje kojima je ubrizgavan PBS nisu preživele do 35. dana, ali su uzorci jetre dve životinje uzeti neposredno nakon uginuća i obrađeni. Eksperimenti su izvedeni sa zaslepljivanjem. Jetre su uklonjene i fiksirane tokom 24 sata 4% paraformaldehidom u PBS (pH 7.4). Izrezani su blokovi tkiva za histologiju, dehidrirani serijama etanola praćenih acetonom, smešom acetona i ksilena i ksilenom, a zatim uronjeni u parafin. Paralelno, mali blokovi tkiva (oko 4mm x 2mm) fiksirani paraformaldehidom su brzo zamrznuti u petroletru ohlađenom suvim ledom i čuvani na - 50 °C radi detekcije apolarnih lipida. Parafinski isečci debljine 4 µm su deparafinizovani u ksilenu i nakon koraka izopropil alkohola rehidrirani etanolom (96%, 70%, 60%). Isečci tkiva su obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E) da bi se procenile histopatološke promene. Za detekciju fibroze obavljeno je Massonovo trohromno bojenje. Steatoza je verifikovana pomoću Oil Red O bojenja za detekciju apolarnih lipida u fiksiranim-zamrznutim isečcima debljine 10µm isečenim kriomikrotomom Leica (CM 1850). Isečci su pregledani i fotografisani svetlosnim mikroskopom Nikon (E800) opremljenim digitalnim fotoaparatom Olympus (DP70).
[0163] SL. 8B prikazuje histologiju jetre dva KO miša kojima je ubrizgan PEGC15S žrtvovana 35. dana nasuprot jetri dve KO životinje kojima je ubrizgavan PBS koje su uginule 17. i 24. dana (bojenje hematoksilinom i eozinom). Prikazi manjeg uvećanja parenhima jetre (SL. 8B, leve kolone) prikazuju umerene promene sa blago nepravilnim pločama ćelija jetre i blagu do umerenu steatozu kod KO-1 i KO-2 kojima je injektovan PEGC15S nasuprot masivnim zonalnim nekrozama hepatocita (SL. 8B, KO-3, obeleženo vrhovima strelica) i difuznoj steatozi sa višestruko dispergovanim nekrozama (SL. 8B, KO-4, nekroze obeležene vrhovima strelica) kod KO kojima je injektovan PBS. Na umecima je prikazano specifično bojenje za apolarne lipide u citoplazmi hepatocita. Veća uvećanja (desne kolone) pokazuju prisustvo učestalih mitoza (obeleženih strelicama i prikazanih detaljno na umecima) i uvećanih pleomorfnih jedara sa izraženim jedarcima kod KO kojima je injektovan PEGC15S.
Veća uvećanja parenhima jetre kod KO kojima je injektovan PBS pokazuju konfluentne hepatocelularne nekroze sa sporadičnom zapaljenskom infiltracijom (SL. 8B, KO -3, obeleženo vrhovima strelica) ili višestruko dispergovane nekroze praćene izraženom resorptivnom zapaljenskom reakcijom (SL. 8B, KO-4, obeleženo vrhovima strelica). Preostali parenhim jetre pokazuje mikro i makrovezikularnu steatozu kod KO kojima je injektovan PBS. (PT = portalni trakt, CV = centralna vena).
[0164] Životinje kojima je injektovan PBS su razvile ozbiljnu hepatopatiju koju karakteriše izražena mikrovezikularna do makrovezikularna steatoza i značajna smrt hepatocita, sa minimalnom fibrozom ili bez fibroze. Višestruke mono ili oligo-ćelijske nekroze hepatocita dispergovane po režnju jetre praćene izraženom zapaljenskom resorptivnom reakcijom su pronađene kod jedne životinje, dok su u drugoj preovladavale masivne konfluentne nekroze hepatocita uglavnom u periportalnim zonama sa sporadičnim zapaljensk im infiltratom. Znaci regeneracije parenhima jetre su bili minimalni kod obe životinje. Dve životinje kojima je injektovan PEGC15S su pokazale umerene promene u jetri sa manjim znacima oštećenja parenhima, ali sa izraženom regeneracijom, i ispitivač je ispravno prepoznao da primaju terapiju. Promene koje ukazuju na regeneraciju parenhima jetre (blago nepravilan oblik režnja jetre, bazofilna citolazma hepatocita, učestale mitoze i binukleusni hepatociti, nuklearna pleomorfija i uvećanje sa izraženim jedarcima) su bili najuočljiviji znaci. Celokupna morfologija je bila konzistentna sa povišenom proliferacijom, transkripcijom i translacijom u hepatocitima. Pored toga, detektovane su retke fokalne nekroze hepatocita i blaga steatoza mikrovezikularnog tipa, a fibroza je bila minimalna.
Primer 7. Biohemijska karakterizacija 20NHS PEG-htCBS C15S
[0165] Biohemijske karakteristike 20NHS PEG-htCBS C15S su određene pre ispitivanja efekata in vivo primene molekula.
A. N-terminalno sekvenciranje i analiza intaktne mase
[0166] Pet šarži nemodifikovane htCBS C15S je analizirano pomoću N-terminalnog sekvenciranja. Dobijene sekvence su bile identične za sve šarže, i u poređenju sa referentnom sekvencom, svima im je nedostajao početni metioninski ostatak. Zapaženo je da je N -kraj u htCBS C15S PSETP, a ne MPSETP koji se nalazi u sekvenci divljeg tipa CBS.
[0167] Intaktna masa određena dekonvoluisanim masenim spektrima htCBS C15S potvrdila je rezultate N-terminalnog sekvenciranja identifikovanjem samo jednog glavnog pika na 45290 Da u pet šarži. Ova vrednost odgovara molekulskoj masi monomera htCBS C15S bez N-teminalnog metionina (teoretska molekulska masa: 45289.7 Da).
[0168] Poravnanje sekvenci je dalje izvedeno pomoću softvera Geneious 9.1.5 (besplatna verzija), korišćenjem Geneious tip poravnanja „Globalno poravnanje sa krajnjim prazninama“ i Cost Matrix Blosum62 za poređenje proteinskih sekvenci htCBS C15S kod ljudi, pacova, majmuna i miševa. Rezultati su potvrdili da N-kraj 20NHS PEG-htCBS C15S predstavlja PSETP, a ne MPSETP koji se nalazi u sekvenci divljeg tipa skraćene CBS kod ljudi, majmuna, pacova i miševa. Primećeno je da htCBS C15S deli 96% identičnosti sekvence, uključujući 1 prazninu (na start kodonu), sa skraćenom CBS majmuna. Sledeće razlike između sekvenci su primećene kod htCBS C15S koja se ovde koristi i kod skraćene CBS majmuna na osnovu UniProtKB/Swiss-Prot: Q58H57. Položaj aminokiseline (na osnovu poravnanja sekvenci) 18 R→L (htCBS C15S koja se ovde koristi→skraćena majmunska sekvenca), položaj 25 K→Q, položaj 32 S→L, položaj 34 E→G, položaj 69 A→V, položaj 71 A→E, položaj 90 V→I, položaj 133 D→A, položaj 157 A→T, položaj 242 Q→R, položaj 354 V→M i položaj 403 T→V.
[0169] Zapaženo je da htCBS C15S deli 84% identičnosti sekvence, uključujući 5 praznina (u sekvenci pacova), sa skraćenom CBS pacova. Sledeće razlike između sekvenci su primećene kod htCBS C15S koja se ovde koristi i skraćene CBS pacova na osnovu UniProtKB/Swiss-Prot: P32232. Položaj aminokiseline (na osnovu poravnanja sekvenci) 4 E→G (htCBS C15S koja se ovde koristi→skraćena sekvenca pacova), položaj 6 P→S, položaj 8 A→C, položaj 10 V→D, položaj 12 P→S, položaj 13 T→A, položaj 15 S→C, položaji 17-24 HRSGPHSA→QDLEVQPE, položaj 26 S→Q, položaj 32-34 SPE→ASG, položaj 38-42 AKEPL→R---V, položaj 45 R→S, položaj 48 A→T, položaji 60-62 ASE→MAD, položaj 66 H→Y, položaj 69 A→V, položaj 71 A→T, položaj 82 K→R, položaj 86 D→N, položaj 94 K→R, položaj 96 G→S, položaj 98-99 KF→NA, položaj 133 D→A, položaj 161 R→K, položaj 175 S→M, položaj 235 T→D, položaj 238 D→E, položaj 248 L→V, položaj 255 V→A, položaj 276 R→K, položaj 300 T→A, položaj 318 T→A, položaj 322 K→R, položaj 329-331 EEA→DDS, položaj 333 T→A, položaj 340 i 350 A→S, položaj 353-354 TV→AM, položaj 365 Q→K, položaj 383 T→S, položaj 389 R→K, položaj 397 L→M, položaj 401 D→-, položaj 403-404 TE→SV i položaj 406 K→R.
[0170] Zapaženo je da htCBS C15S deli 84% identičnosti sekvence, uključujući 5 praznina (u mišjoj sekvenci), sa skraćenom CBS pacova. Sledeće razlike između sekvenci su primećene od htCBS C15S koja se ovde koristi i skraćene mišje CBS na osnovu UniProtKB/Swiss-Prot: Q91W9. Položaj aminokiseline (na osnovu poravnanja sekvenci) 4 E→G (htCBS C15S koja se ovde koristi→skraćena mišja sekvenca) položaj 6 P→S, položaj 8 A→C, položaj 10 V→D, položaji 12-13 PT→SA, položaji 15-21 SPHRSGP→GFQHLDM, položaj 24 A→E, položaj 26-27 GS→RQ, položaji 32-34 SPE→PSG, položaji 37-42 EAKEPL→DR---V, položaj 48 A→T, položaji 59-62 PASE→AMAD, položaj 66 H→Y, položaji 69-71 APA→VLT, položaj 82 K→R, položaj 86 D→N, položaj 96 G→S, položaj 98-99 KF→NA, položaj 133 D→A, položaj 161 R→K, položaj 175 S→M, položaj 235 T→D, položaj 238 D→E, položaj 255 V→A, položaj 276 R→K, položaj 300 T→A, položaj 318 T→A, položaji 330-331 EA→DS, položaj 333 T→A, položaj 350 A→S, položaj 353-354 TV→AM, položaj 383 T→S, položaj 389 R→K, položaj 397 L→M, položaj 401 D→-, položaj 403-404 TE→SV, položaj 406 K→R i položaj 411 H→R.
[0171] Gornji rezultati prikazuju da sekvence pacova i miševa dele mnoge od istih razlika u poređenju sa htCBS C15S PEGilovanom sa 20NHS PEG-htCBS C15S koja se koristi u ovim primerima. Skraćena sekvenca kod majmuna je delila najveću sličnost sa sekvencom 20NHS PEG-htCBS C15S.
B. Mapiranje NHS estar PEGilacije PEGC15S
[0172] Mapirana su mesta PEGilacije tri serije 20NHS PEG-htCBS C15S: RC-6-67A (6.3 mg/ml), RC-6-67B (6.7 mg/ml) i RC-8-14 (3.8 mg/ml). Uzorci su de-PEGilovani u alkalijama, redukovani i alkilovani, digestirani Asp-N endopeptidazom i analizirani putem LC/UV/MS.
[0173] Reverzno-fazna hromatografija je izvedena za injekcionu količinu od 33 µg u mobilnoj fazi A od 0.1% TFA (ThermoFisher) u vodi i mobilnoj fazi B od 0.1% TFA (ThermoFisher) u acetonitrilu (Burdick and Jackson) sa kolonom XBridge BEH130 Cl8 3.5 µm, 4.6 x 150 mm (Waters) na temperaturi kolone od 60 °C. Tabela 6 prikazuje gradijent za tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC).
Tabela 6. HPLC gradijent
[0174] Maseni spektrometar ESI-QTOF (Agilent, model 6538) je podešen na 4GHz visoke rezolucije i režim pozitivnih jona sa opsegom MS skeniranja od 330 do 3200 m/z pre LC/UV/MS pomoću Agilent smeše za podešavanje kalibracije. Naponi su podešeni na sledeći način: fragmentor -250 V, lopatica -65 V i oktopol RF napon 750 V. Temperatura gasa je bila 350 °C. Sve mase su kalibrisane na ± 1 milioniti deo pre nego što je ispitivanje moglo da se nastavi. Tokom svih LC/MS/MS eksperimenata takođe je korišćena dinamička kalibracija ose mase putem kontinuirane infuzije referentnog standarda. Korišćeni su joni referentne mase: 922.009798.
[0175] Protein ne-PEGilovane htCBS C15S je obrađen paralelno sa kontrolom. Primećeno je da peptidna mapa pokriva 97.8% aminokiselinske sekvence za svaki od četiri uzorka, uključujući svih 30 lizinskih ostataka. Dvanaest peptida je identifikovano kao PEGilovani na osnovu masenih dodavanja 1-2 PEG linkera, a procenjuje se da je obim PEGilacije u opsegu od 4.5 do 5.5 PEG/CBS subjedinici za ove tri serije.
[0176] Uzorci su prvo de-PEGilovani pod uslovima (pH 11.5, 37 °C, 22 sata) optimizovanim u analizi zauzetosti mesta PEGilacije PEGilovane htCBS C15S putem LC/MS/MS. Nakon de-PEGilacije, na prethodno pegilovanim mestima ostaje linker formule: C5H6O3(monoizotopska molekulska masa od 114.0317 Da), koji može da se identifikuje peptidnim mapiranjem. De-PEGilovani uzorak je redukovan, alkilovan, digestiran Asp-N endopeptidazom i analiziran putem LC/UV/MS kako je prethodno opisano.
[0177] Obim PEGilacije je procenjen pomoću sledećeg proračuna: broj PEG po peptidu = (zastupljenost(1*linker) 2 x zastupljenost(2*linker)) / (zastupljenost(bez linkera) zastupljenost(1*linker) zastupljenost(2*linker)). Tabela 7 daje rezultate LC/UV/MS.
Tabela 7. Obim PEGilacije u tri uzorka meren procenjenim PEG/peptidom
[0178] Lizini 25, 30, 211, 247, 271 i 405-406 su nedvosmisleno identifikovani kao PEGilovani u izvesnom obimu u sve tri šarže 20NHS PEG-htCBS C15S. Svaka od tih grupa lizina 72 i 75; 82 i 83; 94, 97-98, i 102; 322 i 325; i 394 i 398 su unutar istog peptida, a ovde datom analizom nije moglo da se odredi koji lizin je PEGilovan u kom obimu.
[0179] Zapažena su i neka cepanja peptida koja nisu specifična za Asp-N endopeptidazu (N-terminalni Asp i Glu), na primer 107 A-K 119 i 333 A-K 348, koja mogu da se pripišu baznoj hidrolizi proteina tokom de-PEGilacije. Značajan procenat deamidacije je primećen za neke peptide, što takođe može da se pripiše alkalnim uslovima koji se koriste za reakciju de -PEGilacije.
Primer 8. Biohemijska karakterizacija maleimid PEGilacije
[0180] Sprovedena je SDS-PAGE i nativna gel PAGE analiza da bi se uporedila reproducibilnost obrazaca PEGilacije za htCBS konjugovan sa ME-400MA i ME-200GS. Rezultati su pokazali varijabilan odnos između diskretnih PEG-CBS vrsta i pokazali su nepotpunu PEGilaciju kada se koriste molekuli PEG maleimida ME-400MA. Varijabilni obimi PEGilacije za NHS estar PEG ME-200GS su napravili „razmaz“ velike molekulske mase nerazdvojivih PEGilovanih vrsta na SDS-PAGE (SL. 9A) i nativnim PAGE gelovima (SL. 9B).
[0181] Za razliku od PEGilacije htCBS C15S sa ME-200GS, zapaženo je da PEGilacija htCBS C15S sa ME-400MA daje tri definisane vrste kada se razdvaja na nativnom PAGE (SL. 9B). Za najtežu vrstu je primećeno da koeluira sa drugom vrstom u htCBS C15S PEGilovanoj sa ME-200GS. Tačan identitet najteže vrste nije utvrđen jer su relativno mala količina ove vrste u poređenju sa drugim vrstama i nedostatak razdvajanja onemogućili detaljnu farmakodinamičku (PD) karakterizaciju. Identifikovano je da druga vrsta nosi 1 PEG vezan za svaku subjedinicu u nativnom dimeru, inače poznata kao homoPEGilovana vrsta. Primećeno je da najlakša PEGilovana vrsta nosi samo 1 PEG po dimeru, inače poznata kao heteroPEGilovana ili hemiPEGilovana vrsta.
A. Mapiranje maleimid PEGilacije PEGC15S
[0182] Prvi korak mapiranja peptida bio je obračun svakog peptida koji sadrži cistein u dva uzorka htCBS C15S PEGilovane sa ME-400MA: RC-6-13 POOL1 i RC-6-13 POOL2. RC-6-13 POOL1 (BSL uzorak br. 1127) predstavlja homoPEGilovanu vrstu (najverovatnije PEGilovanu na istom ostatku). RC-6-13 POOL2 (BSL uzorak br. 1128) predstavlja hemiPEGilovanu vrstu, stoga je na SDS-PAGE primećeno da postoji približno jednak udeo PEGilovanih i nemodifikovanih traka. Ovaj primer je odredio mesto vezivanja ME-400MA, kada je najpristupačniji cistein (C15) zamenjen serinom.
[0183] Lys-C digestija je izvedena na referentnom proteinu (UnPEG RC-6-09 DIAFILTRATE) i simultano na dva PEGilovana proteina (RC-6-13 POOL1/RC-6-13 POOL2). Osam peptida koji sadrže cistein je identifikovano sa redukovane/alkilovane LC/MS peptidne mape. Sedam peptida koji sadrže cistein dalo je slične relativne zastupljenosti u sva tri uzorka kao što je prikazano u tabeli 8 u nastavku, što ukazuje na to da je za ovih 7 cisteinskih peptida malo verovatno da su PEGilovani.
[0184] Primećeno je da samo jedan peptid koji sadrži cistein ima značajno smanjenu relativnu zastupljenost u svakom od dva PEGilovana uzorka. Tabela 8 daje relativnu zastupljenost ne-PEGilovanih peptida u svakom uzorku.
Tabela 8. Relativna zastupljenost ne-PEGilovanih Lys-C peptida koji sadrže cys
[0185] Primećeno je da peptid 272-322 sadrži dva cisteinska ostatka. PEGilovani ostaci su uočeni na Cys272 i/ili Cys275 koji se nalazi na Lys-C peptidu 272-322. Da bi se dalje razlikovalo da li su Cys272 i/ili Cys275 PEGilovani, ta dva ostatka su razdvojena na različite peptide, referentni (UnPEG RC-6-09 DIAFILTRATE) i dva PEGilovana proteina (RC-6-13 POOL1/RC-6-13 POOL2) su tretirani reagensom 2-nitro-5-tio-cijanobenzojevom kiselinom (NTCB). Pošto NTCB dovodi do N-terminalnog cepanja na slobodne cisteinske ostatke, PEGilovani cistein ne formira cijanilovani krajnji proizvod i na taj način blokira cepanje.
[0186] Identifikovano je sedam peptida koji sadrže cistein iz C8 LC-MS peptidne mape tretirane sa NTCB. Pošto je efikasnost hemijske digestije bila relativno niska u poređenju sa enzimskom digestijom, ciljni peptidni pikovi su bili mali na hromatogramu, a primećene su i sporedne reakcije (rezultati nisu prikazani). Peptidni pikovi povezani sa cisteinom su locirani i kvantifikovani korišćenjem ručnog pretraživanja jona. U poređenju sa referentnim proteinom samo jedan peptid koji sadrži cistein je pokazao značajno smanjenje u uzorku RC-6-13 POOL1. Peptid, identifikovan kao ostaci 244-271, označava da je mesto 272 blokirano, smanjujući prinos za peptid 244-271. Dva peptida koja sadrže cistein su pokazala smanjenje relativne zastupljenosti za uzorak RC-6-13-POOL2; međutim, odnos između ova dva je blizak. Moguće je da su oba cisteina uključena u PEGilaciju ili da je zastupljenost pika previše niska da bi se izveo čvrst zaključak. Rezultati u tabeli 9 obezbeđuju dokaze da se PEGilacija nalazi na Cys272, mada Cys275 nije u potpunosti isključen kao mesto PEGilacije.
Tabela 9. Poređenje PEGilacije Cys272 i Cys275
Primer 9. Farmakokinetika i farmakodinamika 400MA PEG-htCBS C15S i 20NHS PEG-htCBS C15S kod HO miševa
[0187] Ovaj primer karakteriše i upoređuje svojstva farmakokinetike (PK) i farmakodinamike (PD) htCBS C15S PEGilovane ili linearnim NHS estrom-aktiviranim PEG (ME-200GS) od 20 kDa ili linearnim maleimidom-aktiviranim PEG (ME-400MA) od 40 kDa. Svaki od PEGC15S je prečišćen na DEAE sefarozi i puferi su izmenjeni pomoću filtracije tangencijalnim protokom (TFF) na kertridžu BioMax<®>100 u 1x sterilnom PBS.
[0188] htCBS C15S modifikovana sa ME-400MA (400MA PEG-htCBS C15S) je koncentrovana do 7mg/ml. HomoPEGilovana htCBS C15S modifikovana sa ME-400MA (pik 1) je koncentrovana do 4.3 mg/ml, a hemi/heteroPEGilovana htCBS C15S modifikovana sa ME-400MA (pik 2) je koncentrovana do 5.1 mg/ml. htCBS C15S modifikovana sa ME-200GS (20NHS PEG-htCBS C15S) je koncentrovana do 6 mg/ml.
[0189] Za 20NHS PEG-htCBS C15S, HO miševima je davana SQ doza od 5, 10 ili 15 mg/kg ili im je davana IV doza od 10 mg/kg. Za 400MA-htCBS C15S, HO miševi su primali pojedinačnu dozu od 10 mg/kg, bilo SC ili IV, jednog od tri oblika: (i) smeša svih vrsta, gde nije pokušano razdvajanje pojedinačnih oblika (smeša), (ii) homoPEGilovana vrsta (pik 1) i (iii) hetero/hemiPEGilovanih vrsta (pik 2).
[0190] I mužjaci i ženke HO miševa su korišćeni u ovom primeru, i u svakoj grupi su bila 3 do 4 miša. Dve grupe miševa označene kao „A“ i „B“ su korišćene za svaki način primene, kako bi se zapremina krvi uzeta od svakog miša svela na minimum. Kod SC primene, krv je uzimana u grupi A na 0.5, 3, 24 i 72 sata posle injekcije, a u grupi B na 1, 6, 48 i 96 sati posle injekcije. Kod IV primene, krv je uzimana u grupi A na 0.25, 1, 6 i 48 sati posle injekcije, a u grupi B na 0.5, 3, 24 i 72 sata posle injekcije.
A. Farmakokinetika
[0191] PK parametri izračunati iz krive vreme-aktivnost su prikazani u tabeli 10 za konjugat ME-200GS i u tabeli 11 za konjugat ME-400MA. Semilogaritamski dijagrami su bili linearni za intravenske grupe i samim tim je potvrđeno da su svi oblici enzima htCBS C 15S očišćeni iz plazme kinetikom prvog reda (podaci nisu prikazani).
[0192] Bioraspoloživost je izračunata deljenjem površine ispod krive (AUC) za SC ili IP način sa AUC zapaženom nakon IV primene. Tabela 10 obezbeđuje PK parametre nakon IV i SC primene 20NHS PEG-htCBS C15S.
Tabela 10. PK parametri za eksperimente izvedene za 20NHS PEG-htCBS C15S
[0193] Znak * označava da je vrednost modelovana za dozu od 10 mg/kg sa vremenskim intervalom između doza od 48 sati i poluživotom od 17.5 sati.
[0194] Za 20NHS PEG-htCBS C15S, površina ispod krive je bila 3062, 4788 i 5754 za doze od 5, 10 i 15 mg/kg, redom. Frakcija enzima htCBS C15S koja je dospela u sistemsku cirkulaciju nakon ekstravaskularnog (SC) doziranja je bila 82.6% u grupama sa SC dozom od 5 mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S ali je opala do 64.6% i 51.6% u grupama sa dozama od 10 i 15 mg/kg. Samim tim, povećanje je bilo manje nego dozno proporcionalno što se i odražava u proporciji porasta kod AUC, cmaxi bioraspoloživosti. Ove rezultate verovatno objašnjava blagi pad ukupne apsorpcije 20NHS PEG-htCBS C15S sa rastućom dozom.
[0195] Poluvreme eliminacije u IV doznoj grupu je bio 48 sati što znači da se polovina koncentracije leka u plazmi ukloni na svakih 48 sati. Podaci su bili u potpunosti linearni kada se grafički prikaže zavisnost koncentracije od vremena na logaritamskoj skali sa koeficijentima korelacije >0.98 što ukazuje da je ovo bliska procena poluvremena eliminacije za 20NHS PEG-htCBS C15S. Određivanja poluživota u grupama sa SC dozom su bila varijabilna i kretala se od 17.5 do 137 sati. Izvođenje ovih procena je otežano zbog spore faze dvofazne apsorpcije/raspodele. Izračunato je da je prosečno vreme cirkulisanja pojedinačnog molekula enzima (MRT) u opsegu između 44 i 194 sata za 20NHS PEG-htCBS C15S.
[0196] Vreme potrebno da bi se postiglo ravnotežno stanje (konstantni pikovi i najniže vrednosti) je modelovano iz skupa podataka za 10 mg/kg SC pod pretpostavkom da dozni interval iznosi 48 sati a da je poluživot 17.5 sati. Procenjeno je da vreme potrebno za postizanje apsolutnog ravnotežnog stanja iznosi 343 sata (tj. nakon oko 7 SC injekcija svaka 2 dana), ali promene u pikovima i najnižim koncentracijama u plazmi su bile veoma blizu nivoa ravnotežnog stanja za 144 sati. U ravnotežnom stanju, simulirano je da pik i najniža koncentracija iznose 162 i 85 mU/µL nakon doze od 10 mg/kg koja se daje SC jednom dnevno svaka dva dana. Međutim, veoma slični nivoi su postignuti 144 sata posle injekcija tj. nakon 3 SC primene PEGilovanog enzima svaka 2 dana.
[0197] Nivoi 400MA PEG-htCBS C15S u plazmi za pik 1 koji predstavlja PEGilovanu vrstu (2 PEG grupe po htCBSdimeru), pik 2 koji predstavlja hemiPEGilovanu vrstu (jedna PEG grupa po htCBS C15S dimeru) su upoređeni na SL. 10A. Ova smeša je predstavljena kao puna linija sa kvadratima koji označavaju tačke sakupljanja. Pik 1 je predstavljen isprekidanom linijom sa krugovima koji označavaju tačke sakupljanja, a pik 2 je predstavljen isprekidanom linijom sa rombovima koji označavaju tačke sakupljanja.
[0198] Tabela 11 daje PK parametre izračunate nakon SC i IV primene 10 mg/kg 400MA PEG-htCBS C15S.
Tabela 11. PK parametri za eksperimente sprovedene sa 400MA PEG-htCBS C15S
[0199] Izračunata bioraspoloživost za mešani 400MA PEG-htCBS C15S iznosi 55.2%. Tmaxje vreme cmax(početni vršni nivo u plazmi). Izračunato je da poluvreme eliminacije iznosi 39 sati iz IV skupa podataka. PK parametri nisu bili dramatično različiti od pojedinačne PEGilovane vrste označene kao pik 1 (hemiPEGilovan) i pik 2 (homoPEGilovan).
B. Poređenje ME-200GS i ME-400MA PEGilovanih oblika htCBS C15S
[0200] Nije primećeno da se PK parametri primetno razlikuju za dva PEGilovana ovde upoređena oblika htCBS C15S (ME-200GS i ME-400MA). Takođe je primećeno da su krive specifične aktivnosti u odnosu na vreme za 10 mg/kg IV i SC doze svakog enzima slične kao što je prikazano na Sl. 10B. Aktivnosti nakon IV doziranja su prikazane kao pune linije, a nakon SC doziranja su prikazane kao isprekidane linije. Krugovi (IV) i trouglovi (SC) predstavljaju vremena sakupljanja za miševe koji su primili 20NHS PEG -htCBS C15S, a rombovi (IV) i kvadrati (SC) predstavljaju vremena sakupljanja za miševe koji su primili 400MA-htCBS C 15S.
[0201] Međutim, profili metabolita prikazani na SL.10C prikazuju da je 20NHS PEG-htCBS C15S bio efikasniji u smislu normalizovanja nivoa homocisteina u plazmi (krugovi) i cisteina (kvadrati) nakon jedne SC doze od 10 mg/kg. Nivoi cistationina, predstavljeni trouglovima na grafikonu na SL. 10C, nisu se značajno razlikovali između dva konjugata. Generalno, odgovori prate nivoe u plazmi izmerene testom aktivnosti.
[0202] Primećeno je da se odgovor kod 20NHS PEG-htCBS C15S javlja brže i primećeno je da je produžen u odnosu na odgovor kod 400MA PEG-htCBS C15S. Primećeno je da oba PEGilovana enzima poboljšavaju nivoe Hcy i Cys u plazmi do otprilike iste mere tokom 6 sati nakon SC primene, a primećeno je da nivoi Hcy u plazmi ostaju sniženi do 72 sata nakon primene 20NHS PEG-htCBS C15S u poređenju sa postepenom normalizacijom od 24 sata i potpunim povratkom na nivoe pre injekcije na 72 sata nakon primene 400MA PEG-htCBS C15S. Sličan obrazac odražavaju nivoi Cys u plazmi za oba PEGilovana enzima.
[0203] Nije primećeno da povećano doziranje značajno poboljšava PD profil bilo kog oblika CBS što ukazuje na to da maksimalna efikasnost ovog enzima nije određena samo nivoima njegove koncentracije u plazmi, već da na to utiču faktori kao što je kinetika enzima, dostupnost supstrata i koncentracija.
[0204] Primećeno je da 20NHS PEG-htCBS C15S obezbeđuje najpovoljniji profil nakon SC primene u poređenju sa 400MA PEG-htCBS C15S. Konkretno, poluživot u cirkulaciji je bio 47 sati za 20NHS PEG-htCBS C15S u poređenju sa 39 sati (tj. 20% duži poluživot) za 400MA PEG-htCBS C15S, a bioraspoloživost nakon SC primene jednake količine (10 mg/kg) je bila 64.6% za 20NHS PEG-htCBS C15S u poređenju sa 55.2% za smešu (tj. 17% bolja raspoloživost).
C. Poređenje različitih doza 20NHS PEG-htCBS C15S
[0205] Generalno je primećeno da se PD odgovor javlja u direktnoj proporcionalnosti sa vršnim nivoima u plazmi i opada proporcionalno sa poluživotom. Međutim, primećeno je da se odnos doze u vršnim odgovorima približava maksimalnim nivoima od 5 mg/kg tako da doze od 10 ili 15 mg/kg dovode do malog povećanja vršne efikasnosti kao što je određeno i nivoima homocisteina i cistationina, kao što je prikazano na Sl.. 10D. Talasasti obrazac eliminacije je primećen u svakoj od faza eliminacije koji je bio isti na svakoj krivoj, tako da je aktivnost plazme dostigla najnižu vrednost za 48 sati, a zatim se oporavila (ili je bila slična) za 72 sata, da bi ponovo opala na 96 sati. Ovaj neobičan obrazac eliminacije primećen posle SC doziranja htCBS C15S može biti posledica klirensa dvofazne faze apsorpcije koja se sastoji od rane brze i sporije kasne faze apsorpcije.
[0206] Uočeno je da povećano doziranje 20NHS PEG-htCBS C15S pokazuje otprilike 2 puta veću aktivnost CBS u plazmi za dozu od 10 mg/kg u poređenju sa 5 mg/kg, ali ovo povećanje nije bilo linearno za dozu veću od 15 mg/kg, što je prikazano na SL. 10E. Postoji uočl jiva razlika između PD odgovora u grupama sa dozama od 10 i 15 mg/kg za svaki metabolit. Zapravo, primećeno je da mnoge vremenske tačke u grupi sa većom dozom proizvode odgovor koji je bio ispod onog u grupi sa dozom od 5 mg/kg. Ove razlike nisu objašnjene nižom bioraspoloživošću (smanjena apsorpcija po jediničnoj dozi) primećenom sa povećanjem doza 20NHS PEG-htCBS C15S. U zaključku, primećeno je da pojedinačna doza između 5 i 10 mg/kg daje maksimalan odgovor efikasnosti u modelu HO miša.
Primer 10. Farmakodinamika PEGC15S tokom dugotrajne primene kod HO miševa [0207] Ovaj primer ocenjuje i poredi farmakodinamičku efikasnost i potencijalne imunogene odgovore dugotrajno egzogeno primenjivane htCBS C15S PEGilovane ili sa ME-200MA0B, ME-200GS, GL4-400MA, ME-400MA, ili ME-050GS kod HO miševa. Kada su humani proteini konstruisani u mišji genom i eksprimirani kod neonatalnih životinja, kao što je to slučaj kod HO miša, imuni odgovori će najverovatnije imati kliničku relevantnost za humani odgovor. Videti, Guidance for Industry, Immunogenic assessment of therapeutic protein products, CEBR (August 2014). HO miševi eksprimiraju male količine humanog proteina CBS i vrlo verovatno su sličniji humanim pacijentima u smislu njihovog adaptivnog imunog odgovora na enzime PEG htCBS od miševa sa potpunom inaktivacijom gena ili miševa divljeg tipa.
[0208] U jednom skupu eksperimenata, procenjena je htCBS C15S PEGilovana sa ME-200MA0B, ME-200GS, GL4-400MA, ili ME-400MA. Za izvođenje ove studije korišćeno je šest grupa HO miševa: dve grupe su primale 200MA0B PEG-htCBS C15S (grupe 1 i 3), jedna grupa je primala 20NHS PEG-htCBS C 15S (grupa 4), jedna grupa je primala GL4-400MA PEG-htCBS C15S (grupa 5), a dve grupe su primale 400MA PEG-htCBS C15S (grupa 6 i 7). U ovim studijama su korišćeni i mužjaci i ženke HO miševa (ukupno n=6 do 8 miševa po grupi).
[0209] U grupi 1, miševi su primali 2 kruga od po 5 dnevnih supkutanih injekcija 200MA0B PEG-htCBS C15S 1, 2, 3, 4. i 5. dana (1. nedelja) i 15, 16, 17, 18. i 19. dana (3. nedelja). Doza za ovaj eksperiment je bila 5 mg/kg/dnevno. U ovaj eksperiment je bila uključena kontrolna grupa koja je primala slani rastvor (grupa 2). Sve druge grupe su primale 3 kruga od po 5 dnevnih supkutanih injekcija 1, 2, 3, 4. i 5. dana (1. nedelja); 15, 16, 17, 18. i 19. dana (3. nedelja); i 29, 30, 31, 32. i 33. dana (5. nedelja). Doza za ove eksperimente je bila 7.5 mg/kg/dnevno.
[0210] U odvojenom skupu eksperimenata, procenjena je htCBS C15S PEGilovana sa ME-200MA0B ili ME050GS. Dve grupe mužjaka i ženki HO miševa (1M/5Ž) su primale 3 kruga 5 dnevnih supkutanih injekcija 200MA0B PEG-htCBS C15S (grupa 8) ili 050GS PEG-htCBS (grupa 9) 1, 2, 3, 4. i 5. dana (1. nedelja); 15, 16, 17, 18. i 19. dana (3. nedelja); i 29, 30, 31, 32. i 33. dana (5. nedelja). Doza je iznosila 7.5 mg/kg/dnevno.
[0211] U svim skupovima eksperimenata, svaki 5-dnevni ciklus doziranja je praćen 10-dnevnim periodom „bez primene leka“. Krv je uzorkovana submandibularnom lancetom ponedeljkom, sredom, i petkom tokom nedelje doziranja (1, 3, i 5) i prvog dana (ponedeljak) svakog 10-dnevnog perioda bez primene leka. Svi postupci uzorkovanja krvi i supkutane injekcije su izvedeni u 15h da bi se izbegli artefakti usled dnevnih varijacija. Onih dana kada se izvodi i uzorkovanje krvi i davanje injekcija, krv je uzorkovana pre primene enzima.
[0212] Farmakodinamički odgovor kod HO miševa na svaki konjugat PEGilovane htCBS C15S je ocenjen za svaki krug doziranja kvantifikovanjem nivoa metabolita homocisteina, cistationina i cisteina u plazmi, koji su povezani sa putem transsulfuracije, kao početna vrednost i posle lečenja. Kvantifikacija je izvedena pomoću masene spektrometrije-tečne hromatografije sa razblaženjem stabilnog izotopa (LC/MS) kao što je opisano u primeru 1. Izračunata je maksimalna procentualna promena homocisteina, cistationina i cisteina u odnosu na početnu vrednosti za svaku nedelju doziranja.
[0213] ME-200MA0B: Sprovedene su tri nezavisne studije sa 200MA0B PEG-htCBS C15S (grupe 1, 3 i 8). U grupi 1, primećeno je da su nivoi Hcy u plazmi pali za 68% u odnosu na nivoe početne vrednosti tokom prve nedelje doziranja, ali je primećeno da su pali za samo 24% u odnosu na nivoe početne vrednosti tokom druge serije injekcija 200MA0B PEG -htCBS C15S tokom 3. nedelje sa 10-dnevnim periodom bez primene leka u međuvremenu (Tabela 12). Sličan pad efikasnosti sugerisan je oslabljenim porastom nivoa Cth i Cys tokom drugog kruga injekcija (Tabela 13 i Tabela 14). Druga studija (grupa 3) je sprovedena da bi se utvrdilo da li će oslabljena efikasnost biti primećena kod drugog skupa naivnih HO miševa. Primećeno je da su ukupni nivoi Hcy u grupi 3 pali na 82% ispod početne vrednosti tokom prvog kruga injekcija. Tokom drugog i trećeg kruga injekcija tokom 3. nedelje i 5. nedelje, primećeno je da nivoi Hcy padaju na samo 57%, odnosno 50% početnih vrednosti. Slično tome, primećeno je da dodatna serija 200MA0B PEG-htCBS C15S primenjenu na grupi 8 snižava nivoe Hcy u plazmi za 80% u odnosu na nivoe početne vrednosti u odnosu na nivoe početne vrednosti tokom prve nedelje doziranja, ali samo za 61% početne vrednosti tokom 3. nedelje doziranja. Tokom 5. nedelje doziranja, primećeno je da nivoi Hcy u plazmi opadaju na 50% početne vrednosti (Tabela 12). Na sličan pad efikasnosti je ukazivalo oslabljeno povećanje nivoa Cys tokom 3. nedelje i 5. nedelje davanja injekcija (Tabela 13 i Tabela 14), u odnosu na 1. nedelju. Sličan trend oslabljene efikasnosti je primećen u grupama 1, 3 i 8, iako je primećeno da je veličina oslabljenog odgovora dramatičnija u grupi 1 u poređenju sa grupama 3 i 8.
[0214] ME-200GS: Uočeno je da primena 20NHS PEG-htCBS C15S u eksperimentalnoj grupi 4 smanjuje nivoe Hcy u plazmi za 77% u odnosu na nivoe početne vrednosti u prvoj nedelji doziranja, 70% tokom treće nedelje doziranja i 66% tokom pete nedelje doziranja (Tabela 12). Slično opadanje efikasnosti je prikazano oslabljenim porastom nivoa Cth i Cys tokom treće i pete nedelje doziranja (Tabela 13 i Tabela 14) u odnosu na 1. nedelju. Međutim, za 20NHS PEG-htCBS C15S, pad efikasnosti primećen u 3. i 5. nedelji doz iranja je bio najmanji u poređenju sa drugim konjugatima PEG htCBS C15S i statistički nije značajan.
[0215] GL4-400MA: Primena GL4-400MA-htCBS C15S u grupi 5 je dovela do prosečnog pada od 75% u nivoima Hcy u plazmi u odnosu na nivoe početne vrednosti u prvoj nedelji doziranja, ali samo 41% tokom treće nedelje doziranja i 34% tokom 5. nedelje doziranja (Tabela 12). Slično opadanje efikasnosti je prikazano oslabljenim porastom nivoa Cth i Cys tokom 3. nedelje i 5. nedelje doziranja (Tabela 13 i Tabela 14) u odnosu na 1. nedelju.
[0216] ME-400MA: Dva nezavisna eksperimenta su izvedena sa 400MA PEG-htCBS C15S (grupa 6 i 7). U grupi 6, primećeno je da je procenat smanjenja nivoa Hcy bio 73% u poređenju sa nivoima početne vrednosti u 1. nedelji, a zatim je opao na 65% i 59% tokom 3. nedelje i 5. nedelje doziranja, redom. Veličina pada efikasnosti je bila dramatičnija u grupi 7, kao što je oslabljenim smanjenjem nivoa Hcy tokom tri kruga doziranja (Tabela 12). Slični trendovi oslabljene efikasnosti primećeni su u promenama nivoa Cth i Cys kod grupe 6 i grupe 7 (Tabela 13 i Tabela 14).
[0217] ME-050GS: Uočeno je da primena 050GS PEG-htCBS C15S u grupi 9 snižava nivoe Hcy u plazmi za 75% u odnosu na nivoe početne vrednosti u 1. nedelji doziranja, ali snižava samo za 59% u odnosu na nivoe početne vrednosti tokom 3. nedelje doziranja. Tokom 5. nedelje doziranja, uočeno je da nivoi Hcy u plazmi opadaju na 42% nivoa početne vrednosti (Tabela 12). Sličan pad efikasnosti je prikazan oslabljenim porastom nivoa Cth i Cys tokom 3. i 5. nedelje doziranja (Tabela 13 i Tabela 14) u odnosu na 1. nedelju.
[0218] Tabela 12, tabela 13 i tabela 14 prikazuju procentualne promene nivoa metabolita homocisteina, cistationina i cisteina u plazmi nakon svakog kruga supkutanih injekcija različitih oblika PEGilovane htCBS C15S. U ovim tabelama, početne vrednosti su predstavljene kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM) u µM, a promene su predstavljene kao srednja maksimalna procentualna promena od početne vrednosti za svaki 5-dnevni ciklus doziranja (1, 3. i 5. nedelja). n.d. znači „nije određeno“. Tabela 12 daje procentualnu promenu ukupnog homociestina nakon dugotrajnog lečenja sa PEGC15S.
Tabela 12. Promena u ukupnim nivoima Hcy nakon tretmana sa PEGC15S kod HO miševa
[0219] Tabela 13 daje procentualnu promenu cistationina nakon dugotrajnog lečenja sa PEGC15S.
Tabela 13. Promena u nivoima cistationa nakon tretmana sa PEGC15S kod HO miševa
[0220] Tabela 14 daje procentualnu promenu cisteina nakon dugotrajnog lečenja sa PEGC15S.
Tabela 14. Promena u nivoima cisteina nakon tretmana sa PEGC15S kod HO miševa
[0221] Rezultati ovih studija pokazuju smanjenje nivoa Hcy u plazmi u skladu sa povećanjem Cth i Cys u plazmi u svim grupama, ukazujući na normalizaciju metabolita kao odgovor na lečenje sa PEG-C15S. U svim grupama, maksimalna efikasnost je primećena tokom prve nedelje doziranja. Uočeno je da nivoi Hcy značajno opadaju (oko 68% do oko 82%) ispod početne vrednosti kod svih eksperimentalnih grupa, kao što je prikazano u tabeli 12. Vršno procentualno povećanje nivoa Cth i Cys je takođe bilo maksimalno tokom 1. nedelje, kao što je prikazano u tabeli 13 i tabeli 14. Veličina farmakodinamičkog odgovora je opala tokom naknadnih ciklusa injekcija PEG-C15S tokom 3. nedelje i dalje 5. nedelje. Sveukupno, najveći i najtrajniji farmakodinamički odgovor je uočen za 20NHS PEG-htCBS C15S.
[0222] Oslabljena efikasnost je uočena tokom drugog kruga doziranja PEGilovane htCBS C15S primenjenog tokom 3. nedelje doziranja za sve ispitivane konjugate sa izuzetkom 20NHS PEG-htCBS C15S. Dalje opadanje efikasnosti je primećeno tokom trećeg ciklusa doziranja izvedenog tokom 5. nedelje u odnosu na 3. nedelju. Iako se stvaranje antitela ne meri direktno u ovim studijama, ovaj spori pad efikasnosti nakon ponovljene primene predstavlja klasičnu indikaciju adaptivnog imuniteta. Stoga verovatno objašnjenje za slabljenje predstavlja imuni odgovor usmeren na htCBS C15S PEGilovanu sa ME-200MA0B, MA-400ME, GL4-400MA, ili ME-050GS.
[0223] Uočeno je da, od ispitanih konjugata, 20NHS PEG-htCBS C15S ima najrobusniju i dugoročnu efikasnost. Pretpostavlja se da je ME-200GS u stanju da efikasnije maskira imunogene epitope na htCBS C15S u poređenju sa drugim PEG. Samim tim je uočeno da je oblik 20NHS PEG-htCBS C15S najpotentniji i najmanje imunogeni oblik od različitih ispitanih konjugata PEGilovanih htCBS C15S.
Primer 11. htCBS C15S PEGilovana sa ME-200MA0B, ME-400MA, ili ME-200GS spašava KO miševe od rane smrti
[0224] Izvedena je studija preživljavanja u ovde opisanom modelu KO miševa radi poređenja efikasnosti sa raznim PEGilovanim konjugatima htCBS C15S.
A. Preživljavanje KO mladunaca do 21/35 dana
[0225] Kaplan-Mejerova kriva preživljavanja je grafički prikazana za KO miševe kojima je tri puta nedeljno ubrizgavano 7.5 mg/kg htCBS C15S PEGilovane sa ME-200MA0B (n=24), ME-400MA (n=31=13Ž 18M), ili ME-200GS (n=28=14Ž 14M), i grupu KO miševa (n=44) kojoj je ubrizgavan PBS kao kontrola. Majke koje doje su bile na betainskoj vodi, a nakon prestanka dojenja, mladuncima (21. dan) je davana obična voda bez betaina. Ispitivana je mogućnost ubrizganog enzima da spase KO mladunce.
[0226] Kao što je prikazano na SL.11A, 21. dana, preživelo je samo oko 20% miševa u grupi koja je primala injekcije PBS u odnosu na do oko 92% onih koji su primali injekcije 200MA0B PEG-htCBS C15S (C15S/ME-200MA) i oko 97% onih koji su primali injekcije 400MA PEG-htCBS C15 (C15S/400MA) ili 20NHS PEG-htCBS C15S (C15S/200GS). B. Nivoi metabolita nakon vikenda bez primene leka (najmanje koncentracije) i 24 sata nakon poslednje injekcije (pik)
[0227] Nivoi metabolita kod preživelih KO miševa starosti oko 4-5 nedelja su izmereni nakon vikenda bez primene leka (najniže koncentracije) i 24 sata nakon poslednje injekcije (pika) pomoću eksperimentalnog postupka datog u primeru 1.
[0228] Izmereni nivoi su upoređeni sa nivoima kod slično lečenih zdravih miševa KO /iz istog legla kao što je prikazano na SL. 11B. Nivoi Hcy u plazmi kod KO miševa tretiranih sa 400MA PEG-htCBS C15S su u opsegu 256±8 µM 72 sata nakon primanja doze (ME400MA) (stubić skroz levo za svaki metabolit) do 145±6 µM 24 sata nakon primanja doze (ME-400MA 24h) (stubić koji je drugi sa leve strane za svaki metabolit). Nivoi Hcy u plazmi kod KO miševa tretiranih sa 20NHS PEG-htCBS C15S su bili u opsegu 179±10 µM na 72 sata nakon primanja doze (ME-200GS) (treći stubić sa leve strane) do 96±8 µM 24 sati nakon primanja doze (ME-200GS 24h) (četvrti stubić sa leve strane). Samim tim, maksimalan odgovor za oba konjugata htCBS C15S je uočen 24 sata nakon primanja doze i uočeno je da opada 72 sata nakon primanja doze. Uočeno je da lečenje bilo kojim konjugatom značajno (p<0.001) smanjuje nivoe toksičnog Hcy u plazmi za oko polovinu. Nasuprot tome, primećeno je da su nivoi homocisteina u plazmi kod tretiranih zdravih heterozigotnih miševa iz istog legla oko 5 µM u obe vremenske tačke.
[0229] Uočeno je da su nivoi Cth u opsegu od 57 i 77 µM kod KO miševa tretiranih konjugatima htCBS C15S. Ovi nivoi u plazmi su približno 12-struko veći od onih uočenih kod netretiranih heterozigotnih miševa. Uočeno je da je razlika između pika i najnižih nivoa Cth u plazmi mala, što je dokaz da farmakodinamički efekat enzima na nivoe cistationine može da traje ispod 72 sata i/ili se Cth možda sporije uklanja iz plazme u poređenju sa drugim metabolitima gde su uočene veće razlike. Uočeno je da su nivoi Cys u plazmi 72 sata posle primene doze kod KO miševa koji su primili 400MA PEG-htCBS C15S, kao i 20NHS PEG-htCBS C15S značajno (p<0.001) sniženi na 83±4 i 106±6 µM u poređenju sa zdravim heterozigotnim miševima iz istog legla (151±6), redom. Primećeno je da se nivoi Cys u plazmi povećavaju kod tretiranih KO miševa 24 sata posle primene doze za oba konjugata što ukazuje na delimičnu normalizaciju cirkulišućih metabolita sumpora. Uočeno je da se nivoi Cys u plazmi povećavaju na 157±624 sata posle primene 400MA PEG-htCBS C15S i na 176±6 µM 24 sata posle primene 20NHS PEG-htCBS C15S. Nivoi metionina u plazmi su bili blago povišeni kod KO miševa u poređenju sa zdravim heterozigotnim kontrolama i nisu se menjali značajno između najnižih koncentracija i vršnih nivoa.
C. Životni vek nakon početnog ili kontinuiranog tretmana
[0230] Posle početnog tretmana dugog 35 dana (5 nedelja) da bi se sprečila neonatalna letalnost KO miševa, KO miševi tretirani sa 20NHS PEG-htCBS C15S podeljeni su u dve grupe. Jedna grupa (5W) je prestala da prima bilo kakav tretman osim početnog, dok je druga grupa (CONT) nastavila sa istim režimom do uzrasta od 120 dana (7.5 mg/kg, SC, 3x nedeljno).
[0231] Praćeno je preživljavanje ovih grupa KO mladunaca do 4 meseca starosti i grafički je prikazano na SL. 11C. Svi KO miševi kojima je kontinuirano davan 20NHS PEG -htCBS C15S (C15S/ME-200GS) su preživeli najmanje 119 dana kao što je prikazano na SL. 11C.
Prekid tretmana nakon prvih 35 dana je doveo do preživljavanja oko 85% životinja u uzrastu od 119 dana.
D. Ukupna masa i povećanje telesne mase KO miševa tretiranih sa CBS u odnosu na /-zdrave miševe
[0232] Ukupna masa i količina dobijene telesne mase KO miševa (mužjaci n=16 i ženke n=11) kojima je tri puta nedeljno davan 20NHS PEG-htCBS C15S u dozi od 7.5 mg/kg su određeni i upoređeni sa slično tretiranim /- zdravim miševima iz istog legla (mužjaci n=14 i ženke n=13). Ukupna masa i povećanje telesne mase su izmereni kod miševa nakon prestanka dojenja od 21. dana do 36. dana.
[0233] Uočeno je da heterozigotni mužjaci miševa imaju najveću ukupnu masu od 23-35. dana koja je u opsegu od oko 10.5 g do oko 18 g, mada su mužjaci KO miševa tretirani sa 20NHS PEG-htCBS C15S imali najveću ukupnu masu 21. dana (oko 10 g). Ženke KO miševa tretirane sa 20NHS PEG-htCBS C15S su imale najnižu ukupnu masu nakon 23. dana koja je u opsegu od oko 10 g do oko 14 g.
[0234] Zdravi mužjaci miševa (n=14) su takođe imali najveći porast telesne mase počevši od 23. dana koji je u opsegu od 2 g do oko 9.5 g. Veličina povećanja telesne mase kod mužjaka KO miševa tretiranih sa 20NHS PEG-htCBS C15S (n=16) i kod ženki KO miševa tretiranih sa 20NHS PEG-htCBS C15S (n=11) bila je značajno niža od veličine povećanja telesne mase kod obe kontrole grupe.
Primer 12. PEGilovana htCBS C15S odlaže, sprečava i dovodi do reverzije alopecije facijalne regije u mišjem modelu I278T
[0235] Uočeno je da I278T -/- homozigotni mišji model homocistinurije pokazuje specifične fenotipske osobine kao što je alopecija facijalne regije pored tipičnog profila metabolita, za razliku od drugih mišjih modela sa homocistinurijom. Alopecija facijalne regi je se definiše kao gubitak dlaka sa facijalne regije i glave. Početak alopecije facijalne regije je oko 90 dana (W12), obično se u potpunosti razvija oko 120 dana starosti (W17).
[0236] Pretpostavlja se da je alopecija facijalne regije povezana sa homocistinurijom i srodnim metaboličkim profilom; stoga bi primena enzimske zamenske terapije (ERT; PEG -CBS) trebalo da spase ovaj fenotip napredovanja, sprečavanjem/odlaganjem početka i/ili reverzijom već prouzrokovane štete.
A. Odlaganje početka alopecije facijalne regije
[0237] Miševi starosti 3 nedelje koji ne pokazuju nikakve znake alopecije facijalne regije su podeljeni u 2 grupe. Prva grupa (n=3 mužjaka) je primala injekcije od 7.5 mg/kg 200MA0B PEG-htCBS C15S tri puta nedeljno tokom perioda od 6 nedelja. Fizički izgled je zabeležen pre eksperimenta i praćen je na nedeljnom nivou, zatim na dve nedelje nakon 6 -nedeljnog režima primanja injekcija. Provereni su nivoi metabolita pre eksperimenta i 24 sata nakon poslednje injekcije, tj. nakon 6-nedeljnog režima primanja injekcija.
[0238] Uočeno je da je primena 200MA0B PEG-htCBS C15S tokom perioda od 6 nedelja od uzrasta od 3 nedelje odlaže početak alopecije facijalne regije, SL. 12A. Uočeno je da se I278T oboleli (-/-) i zdravi (+/-) miševi ne razlikuju u tom uzrastu, a -/- miševi nisu imali znake gubitka dlake sa facijalne regije. Nije primećeno da netretirani I278T / - zdravi heterozigotni miševi pate od gubitka dlaka na licu na 19 nedelja i primećen je samo blag gubitak dlake na 34 nedelje, za razliku od netretiranih I278T -/- obolelih homozigotnih miševa, za koje je uočeno da imaju u potpunosti razvijenu alopeciju facijalne regije do 38. nedelje. Obično, alopecija facijalne regije postaje očigledna na 12 nedelja i u potpunosti je razvijena do uzrasta od 17 nedelja.
[0239] Uočeno je da primena 200MA0B PEG-htCBS C15S tokom 6 nedelja (uzrast miševa tokom primanja injekcija je bila 4 nedelje – 10 nedelja) odlaže početak alopecije za otprilike isto vreme kao što je trajanje lečenja (6 nedelja) kao što su pokazali I278T -/- oboleli homozigotni miševi kod kojih je uočeno odsustvo znakova gubitka dlake facijalne regije u uzrastu od 4 meseca i prisustvo samo početnih znakova u uzrastu od 7 meseci. Ovi rezultati pružaju dokaz da je primena 200MA0B PEG-htCBS C15S tokom 6 nedelja odložila početak alopecije facijalne regije kod I278T miševa.
B. Potpuna prevencija razvoja alopecije facijalne regije
[0240] Druga grupa (n = 3; 2 mužjaka, 1 ženka) je kontinuirano primala injekcije od 7.5 mg/kg 200MA0B PEG-htCBS C15S koje se supkutano daju od 3 nedelje do 41 nedelje starosti. Telesna masa je inicijalno praćena na nedeljnom nivou. Fizički izgled je praćen pre eksperimenta i nedeljno ili na dve nedelje nakon početnog 6-nedeljnog režima primanja injekcija. Nivoi metabolita su provereni pre eksperimenta i 24 sata posle poslednje injekcije početnog 6-nedeljnog režima primanja injekcija, a zatim nedeljno ili na dve nedelje.
[0241] Primećeno je da kontinuirano davanje 200MA0B PEG-htCBS C15S I278T -/homozigotnim miševima u potpunosti sprečava početak i razvoj alopecije facijalne regije kod miševa praćenih u uzrastu od 19, 24, 31 i 35 nedelja, kao što je prikazano na SL. 12B. Fizički izgled tako tretiranih miševa liči na onaj koji se uobičajeno primećuje kod zdravih I278T /heterozigotnih miševa, i značajno se razlikuje od fizičkog izgleda net retiranih I278T-/- kontrola i I278T -/- homozigotnih miševa u uzrastu od 36 nedelja i starijim tretiranih tokom perioda od samo 6 nedelja.
[0242] Merenja metabolita na SL.12C pokazuju da je kontinuirano davanje 200MA0B PEG-htCBS C15S dovelo do značajnog smanjenja nivoa Hcy u odnosu na nivoe pre tretmana (oko 300 µM) i stabilizacije na nivoima od oko 100 µM ukupnog Hcy (srednja linija). Nivoi Cys (gornja linija) su normalizovani tretmanom (od oko 130 µM do oko 240 µM) i održavani sve vreme na nivoima od oko 230 µM.
C. Reverzija/normalizacija fenotipa kada se alopecija facijalne regije u potpunosti razvije [0243] I278T miševi, koji su bili stari najmanje 120 dana (17 nedelja) i koji su imali vidljivu, u potpunosti razvijenu alopeciju facijalne regije, su podeljeni u 2 grupe. Grupa A (n=6; 3 mužjaka i 3 ženke) je primala 3 puta nedeljno injekcije 400MA PEG-htCBS C15S, a grupa B (n = 4; 2 mužjaka, 2 ženke) je primala 3 puta nedeljno injekcije 20NHS PEG-htCBS C15S do navršene oko 1 godine. Nivoi metabolita su određeni pre početka tretmana i mereni tokom studije 24 sata nakon injekcije, a telesna masa i fizički izgled su inicijalno praćeni na nedeljnom nivou, a kasnije na dve nedelje.
[0244] Za reverziju alopecije facijalne regije kod I278T -/- homozigotnih miševa (inače poznatu kao normalizacija fenotipa), započet je tretman miševa koji već u potpunosti eksprimiraju fenotip alopecije facijalne regije. Starost životinja na početku studije kre tala se od 24 nedelje do 28 nedelja, što je iznad uobičajenog uzrasta za početak alopecije (120 dana ili 17 nedelja).
[0245] Kontinuirana primena bilo kog konjugata PEG-CBS 3 puta nedeljno je značajno ublažila alopeciju facijalne regije kao što je prikazano na SL.12D, mada je nije u potpunosti normalizovala u odnosu na nelečene neobolele I278T /- heterozigotne kontrole. Primećeno je da 20NHS PEG-htCBS C15S ima bolji učinak od 400MA PEG-htCBS C15S zato što su sve životinje tretirane sa 20NHS PEG-htCBS C15S reagovale na lečenje (4 od 4), dok je samo 5 od 6 životinja odreagovalo na lečenje sa 400MA PEG-htCBS C15S. Pored toga, subjektivno posmatranje miševa pokazuje da su debljina i sjaj dlake miševa bili bolji kod onih kojima je davan 20NHS PEG-htCBS C15S.
[0246] Dalje, merenja metabolita na SL. 12E pokazuju da, dok su oba molekula PEG-CBS bila efikasna, primećeno je da 20NHS PEG-htCBS C15S (Grupa B) smanjuje nivoe Hcy i povećava nivoe Cys značajnije od 400MA PEG-htCBS C15S (Grupa A).
D. Zaključci
[0247] Primena PEG-CBS bez obzira na PEG grupu je dovela do ublažavanja alopecije facijalne regije, što je fenotipska osobina tipična za netretirane I278T -/homozigotne miševe kao što je gore pomenuto. Primena ERT tokom 6 nedelja je dovela do odlaganja nastanka alopecije facijalne regije. Kontinuirana primena ERT kod miševa pre nastanka alopecije facijalne regije je u potpunosti sprečila njen razvoj i takve životinje se nisu razlikovale od neobolelih zdravih I278T /- heterozigotnih miševa. Kontinuirana primena ERT kod miševa sa već potpuno razvijenom alopecijom facijalne regije je dovela do značajnog poboljšanja njihovog fizičkog izgleda. U svim slučajevima, pozitivan efekat na alopeciju facijalne regije je praćen ili uzrokovan najmanje delimičnom (Hcy) ili potpunom (Cys) normalizacijom nivoa metabolita u plazmi.
Primer 13. 20NHS PEG-htCBS C15S ublažava bolest jetre kod KO miševa
[0248] Izvedena je histološka analiza isečaka jetre KO miševa kojima je supkutano (SC) ubrizgano 7.5 mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S ili PBS tri puta nedeljno od uzrasta od 2 dana i koji su eutanazirani u uzrastu od 17-19 dana, i upoređeni su sa jetrama /- zdravih kontrolnih miševa istog uzrasta.
A. Svetlosna mikroskopija
[0249] Životinje su žrtvovane 17-19. dana i uzorci jetre su obrađeni za histološku analizu optičkom mikroskopijom. Zapaženo je da parenhim jetre KO miševa kojima je ubrizgan PBS, kao što je prikazano na SL. 13A, ima blago nepravilan oblik režnjeva jetre sa umerenom do ozbiljnom steatozom, fokalnim hepatocelularnim nekrozama i resorptivnom zapaljenskom reakcijom, što je označeno strelicom. Uočeno je da parenhim jetre zdravih heterozigotnih miševa i KO miševa tretiranih sa 20NHS PEG-htCBS C15S, takođe prikazan na SL. 13A, ima pravilnu građu jetre i minimalnu anizokariozu.
[0250] Detaljniji prikaz koji se dobija većim uvećanjem identičnog isečaka jetre sa SL.13A dat je na SL. 13B sa umecima koji prikazuju Oil Red O bojenja za lipide. Uočeno je da KO miševi kojima je ubrizgan PBS imaju mikro- i makrovezikularnu steatozu, anizokariozu, fokalne nekroze hepatocita i resorptivnu zapaljensku reakciju. Ove karakteristike su istaknute strelicama. Zapaženo je da parenhim jetre KO miševa tretiranih sa 20NHS PEG -htCBS C15S ima minimalnu anizokariozu, što pokazuju jedra KO miševa tretiranih sa 20NHS PEG-htCBS C15S i zdravih heterozigotnih miševa, pri čemu i jedna i druga imaju pravilnu veličinu i oblik sa finim hromatinom i neupadljivim jedarcima. Diskretne lipidne kapljice primećene u citoplazmi hepatocita lečenih i zdravih miševa mogu da se detektuju bojenjem sa Oil Red O (videti umetke na SL. 13B).
B. Elektronska mikroskopija
[0251] Tkivo jetre zdravog heterozigotnog (+/-) miša, KO miša tretiranog sa PBS i KO miša tretiranog sa 400MA PEG-htCBS C15S je takođe posmatrano elektronskom mikroskopijom pri uvećanju od 3000x. Slike elektronske mikroskopije su prikazane na SL. 14A. Na SL.
14A, crne strelice označavaju hrapavi endoplazmatski retikulum (ER), a bele strelice označavaju mitohondriju (MT). Crne zvezdice označavaju citosolni glikogen, a dvostruke crne zvezdice označavaju jedra. Bele zvezdice označavaju lipidne kapljice.
[0252] Primećeno je da /- miš ima binukleusni hepatocit sa normalnim sastavom citoplazme i jedrima normalne morfologije. Uočeno je da su cisterne hrapavog ER tanke i uredno organizovane, a za MT je primećeno da ima normalnu veličinu i oblik. Primećeno je da su jedra pravilna i normohromatska sa neupadljivim jedarcima.
[0253] Primećeno je da KO miš tretiran sa PBS ima steatozu, povećan broj citoplazmatskih organela i nepravilno hiperhromatsko jedro hepatocita. Uočeno je da je citoplazma bogata organelama i da sadrži brojne lipidne kapljice (bele zvezdice) i edematoznu MT. Zapaženo je da jedro ima grubi hromatin, nepravilan obris i istaknuto jedarce.
[0254] Primećeno je da miš tretiran sa 400MA PEG-htCBS C15S ima normalan sastav citoplazme u hepatocitu i pravilno normohromatsko jedro. Kao i kod /miša, zapaženo je da su cisterne ER tanke i pravilno organizovane, pri čemu je MT normalnog oblika i veličine, a jedro je izgledalo normalno sa finim hromatinom.
[0255] Slike elektronske mikroskopije pri uvećanju od 8000x potvrđuju ove nalaze detaljnije, kao što je prikazano na SL. 14B. Na SL. 14B. crne strelice označavaju endoplazmatski retikulum (ER), a bele strelice označavaju mitohondrije (MT). Crne zvezdice označavaju citosolni glikogen. Primećeno je da miševi tretirani 400MA PEG-htCBS C15S i /- imaju tanke i normalno organizovane cisterne hrapavog ER i regularne MT. Zapaženo je da KO miš tretiran sa PBS ima veliki broj cisterni i vezikula. Primećeno je da cis terne ER imaju promenljiva povećanja širine. Uočeno je da su MT pleomorfne i uvećane sa neorganizovanim kristama.
C. Poređenje nivoa metabolita u plazmi i tkivima kod KO miševa, u uzrastu od 18 -19 dana [0256] Metaboliti u plazmi i tkivu su izmereni u grupama miševa divljeg tipa (kontrolnim), kod netretiranih homozigotnih -/- obolelih KO miševa i KO miševa tretiranih sa 400MA PEG-htCBS C15S. Tretirana grupa je primala supkutane injekcije 400MA PEG-htCBS C15S 3 puta nedeljno u dozi od 7.5 mg/kg od uzrasta od 2 dana. Plazma i tkiva su uzimani 24 sata nakon poslednje injekcije. Tabela 15 prikazuje nivoe Hcy, Cys, Cth i Met u plazmi.
Tabela 15. Nivoi metabolita u plazmi [µM ± SEM]
[0257] Tabela 16 prikazuje nivoe Hcy, Cys, Cth i Met u tkivu jetre.
Tabela 16. Nivoi metabolita u tkivu jetre [nmol/g ± SEM]
[0258] Tabela 17 prikazuje nivoe Hcy, Cys, Cth i Met u bubrežnom tkivu.
Tabela 17. Nivoi metabolita u tkivu bubrega [nmol/g ± SEM]
[0259] Tabela 18 prikazuje nivoe Cys, Cth i Met u moždanom tkivu.
Tabela 18. Nivoi metabolita u tkivu mozga [nmol/g ± SEM]
Primer 14. Efekti kontinuirane primene 20NHS PEG-htCBS C15S pomoću osmotske pumpe ALZET<®>kod HO miševa
[0260] Osmotske pumpe ALZET<®>obezbeđuje stabilnu, kontrolisanu isporuku 20NHS PEG-htCBS C15S tokom produženog vremenskog perioda kod novih i naivnih HO miševa. htCBS C15S PEGilovana sa ME-200GS se primenjuje upotrebom četiri različita modela mikroosmotskih pumpi ALZET<®>, koja kontinuirano raspodeljuje određenu zapreminu enzima na sat umesto ponovljenih supkutanih injekcija: model 1002 (0.25 µl/h), model 2002 (0.5 µl/h), model 2004 (0.25 µl/h) i model 2006 (0.15 µl/h).
[0261] Za ublažavanje bola, pre- i postoperativno, životinjama je davan TYLENOL<®>(2 mg/ml) u bocama za vodu da je piju po želji tokom 48 sati pre i posle hirurške intervencije za implantaciju pumpe ALZET<®>. Pored toga, životinje su primale 5 mg/kg karprofena supkutano svaka 24 sata, i tokom 48 sati postoperativno. Za anesteziju tokom hirurške intervencije, 5% izoflurana je primenjeno inhalacijom i održavano je na 2-3% tokom hirurške intervencije. Dok su miševi bili anestezirani, svakom od njih je u sterilnim uslovima u biološki bezbednoj laminarnoj komori implantirana osmotska pumpa ALZET<®>medicinskog kvaliteta. Pumpe su implantirane supkutano u oblasti opuštene kože na ventralnoj strani vrata. Pre implantiranja pumpe, miševi su obrijani a površina kože im je pripremljena primenom BETADINE<®>. Implantacija pumpe je zahtevala mali hirurški rez (5 mm) urađen sterilnim makazama. Rez je zatvoren kopčama za rane, koje su uklonjene nakon 1 nedelje kada je koža bila potpuno zalečena. Uzorci krvi su uzeti nakon 1, 3, 6, 9, 12, 15, 19 i 20 dana za pumpe model 1002 i 2002. Modeli 2004 i 2006 pumpe su bili hirurški uklonjeni na kraju označenog životnog veka pumpe (4 i 6 nedelja za model 2004, odnosno 2006). Uzimanje uzoraka krvi je samim tim prilagođeno za svaku pumpu: 1, 3 , 5, 12, 19, 26, 31, 32, 33. i 36. dana za model 2004 eksplantiran 30. dana studije i 1, 3, 5, 12, 19, 26, 33, 40, 45, 46, 47. i 50. dana za model 2006 eksplantiran 44. dana studije. Uzorci plazme su korišćeni za određivanje aktivnosti CBS u plazmi i merenje nivoa Hcy, Cth i Cys.
[0262] Enzim primenjen kod modela 1002 i 2002 je bio 20NHS PEG-htCBS C15S u koncentraciji od 21 µg/µl i sa specifičnom aktivnošću od 673.9+13.2 U/mg. U ovim eksperimentima, model 1002 je imao srednju brzinu pumpanja od 0.25+0.01 µl/h tokom perioda od 14 dana, a srednja vrednost zapremine punjenja je bila 110.7±6.5 µl. Brzina davanja enzima je bila 5.25 µg/h enzima, što je ekvivalentno 126 µg/dan ili oko 3.5 U/h, što je jednako 85 U/dnevno.
[0263] Model 2002 je imao srednju brzinu pumpanja od 0.48±0.02 µl/h tokom perioda od 14 dana, a srednja zapremina punjenja je bila 207±7 µl. Brzina davanja je bila 0.5 µg/h enzima, što je ekvivalentno 252 µg/dan ili oko 7 U/h, što je jednako 168 U/dan.
[0264] SL. 15A predstavlja grafikon na kojem su upoređeni nivoi Hcy i Cys u plazmi između HO miševa sa implantiranim modelom 1002 ili modelom 2002 osmotske pumpe ALZET<®>. Uočeno je preklapanje nivoa metabolita u plazmi obe grupe. SL. 15B predstavlja grafikon na kojem je upoređena specifična aktivnost 20NHS PEG-htCBS C15S u plazmi nakon kontinuirane primene pomoću modela 1002 ili modela 2002 osmotske pumpe ALZET<®>. Primećeno je da se aktivnost CBS u plazmi HO miševa kod kojih su implantirane pumpe modela 2002 otprilike udvostručila u poređenju sa miševima kojima je implantiran model 1002. Međutim, dvostruko veća aktivnost CBS u plazmi miševa kojima je implantirana pumpa modela 2002 je dovela do sličnog poboljšanja metabolita u plazmi kao što je bilo postignuto kod miševa kod kojih je implantirana pumpa modela 1002 i koji imaju otprilike polovinu aktivnosti CBS u plazmi u poređenju sa grupom sa modelom 2002.
[0265] Enzim primenjen pomoću modela 2004 i 2006 je bila ME-200GS PEGilovana htCBS C15S u koncentraciji od 18 µg/µl i sa specifičnom aktivnošću od 623.2+16.4 U/mg. Model 2004 je imao srednju brzinu pumpanja od 0.23+0.01 µl/h tokom period< od 28 dana a srednja zapremina punjenja je bila 237.7+4.6 µl. Brzina primene enzima je bila 4.5 µg/h enzima, što je ekvivalentno 108 µg/dan ili oko 2.8 U/h, što je ekvivalentno 67 U/dan. Model 2004 osmotske pumpe ALZET<®>je eksplantiran nakon 30 dana.
[0266] Model 2006 je imao srednju brzinu pumpanja od 0.15+0.01 µl/h tokom perioda od 42 dana, a srednja zapremina punjenja je bila 237.2+3.0 µl. Brzina primene enzima je bila 2.7 µg/h enzima, što je ekvivalentno 65 µg/dan ili oko 1.7 U/h, što je ekvivalentno 40 U/dan. Model 2006 osmotske pumpe AUZET<®>je eksplantiran nakon 44 dana.
[0267] SL. 15C i SL. 15D prikazuju grafikone na kojima su upoređeni nivoi metabolita i aktivnost CBS, redom, u plazmi miševa koji su primali 20NHS PEG-htCBS C15S pomoću modela 2004 ili modela 2006 osmotske pumpe ALZET<®>. Uprkos tome što model 2004 raspodeljuje 67% više enzima od modela 2006 pumpe, kod obe grupe miševa uočeno je da imaju slične profile metabolita u plazmi. Primećeno je da su nivoi Hcy u plazmi suštinski smanjeni kod miševa tretiranih sa 20NHS PEG-htCBS C15S, ali je došlo samo do umerenog povećanja nivoa Cys u plazmi.
Primer 15. Dugotrajna kontinuirana primena 20NHS PEG-htCBS C15S sprečava osteoporozu kod KO i I278T miševa
[0268] Analizirani su efekti dugotrajne kontinuirane primene 20NHS PEG-htCBS C15S kod KO i I278T miševa pomoću dvoenergetske rendgenske apsorpciometrije (DEXA) primenom protokola iz primera 1.
A. Mineralizacija kostiju i telesna kompozicija kod KO miševa
[0269] Mineralna gustina kostiju (BMD) i mineralni sadržaj kosti (BMC) su analizirani pomoću DEXA za tri grupe miševa: /- zdrave heterozigotne kontrole (n=4M+6Ž), obolele KO kontrole (n=5M+13Ž) i KO miševe tretirane sa 20NHS PEG-htCBS C15S (C15S/ME-200GS (n=6M+15Ž). Miševima tretiranim sa 20NHS PEG-htCBS C15S je davano 7.5 mg/kg supkutano (SC) tri puta nedeljno od 2. dana do oko 5 meseci. Svi -/- KO miševi su lečeni tokom početnih 5 nedelja (uzrasta od 2 do 35 dana) da bi se sprečila neonatalna letalnost.
[0270] SL. 16A, SL. 16B, SL. 16C, SL. 16D. i SL.16E predstavljaju grafikone na kojima je upoređena BMD (g/cm<2>), BMC (g), ukupna masa (g), telesna masa bez masnog tkiva (g) i sadržaj masti (%), redom, između tri grupe miševa. Tabela 19 daje P-vrednosti koje se koriste za određivanje značajnosti za razlike u tretiranoj grupi u poređenju sa dve kontrolne grupe.
Tabela 19. P-vrednosti za DEXA-određene parametre kod KO miševa
[0271] P-vrednost od 0.05 je postavljena kao prag za određivanje značajnosti. Tretirana grupa je imala značajno veću BMD od obe kontrolne grupe. Tretirana grupa je takođe imala značajno veći BMC, ukupnu masu, telesnu masu bez masnog tkiva i sadržaj masti od nokaut kontrole. Samim tim, lečenje KO miševa sa 20NHS PEG-htCBS C15S je u potpunosti sprečilo duboku osteoporozu i poboljšavalo je telesnu kompoziciju (ukupna masa, telesna masa bez masnog tkiva i sadržaj masti).
B. Metaboliti u plazmi kod KO miševa
[0272] Kod KO miševa tretiranih sa 20NHS PEG-htCBS C15S, nivoi Hcy, Cth i Cys u plazmi su mereni na dve nedelje tokom trajanja studije i prikazani su na SL. 16F. Uzorak krvi je prvo uzet 41. dana (ne predstavlja pravu vremensku tačku nula, već nivoe metabolita 72 sata nakon injekcije), a zatim počevši od 45. dana, uzorak je uziman na svake dve nedelje. Primećeno je da je nivo Hcy (srednja linija) opao sa oko 180 µM 45. dana na oko 90 µM 45. dana i ostao stabilan na ovim nivoima tokom studije. Nivo Cys (gornja linija) se normalizovao lečenjem sa manje od 100 µM, 45. dana na oko 200 µM 45. dana i ostao postojan tokom trajanja studije. Nivo Cth (donja linija) je oscilovao oko 50 µM tokom trajanja studije.
[0273] Metaboliti u plazmi su određeni upotrebom istih miševa/grupa kako je prethodno opisano. Nivoi krajnje tačke metabolita Hcy, Cth, Cys i Met su određeni 24 sata nakon poslednje injekcije date KO miševima tretiranim sa 20NHS PEG-htCBS C15S (desni stubić za svaki metabolit) i upoređeni sa netretiranim zdravim /- (levi stubić) i obolelim -/- KO miševima (srednji stubić), kao što je prikazano na SL. 16G. Tabela 20 daje P -vrednosti korišćene za određivanje značajnosti za razlike u nivoima metabolita u tret iranoj grupi u poređenju sa dve kontrolne grupe.
Tabela 20. P-vrednosti za promene nivoa metabolita kod KO miševa
[0274] P-vrednost od 0.01 je postavljena kao prag za određivanje značajnosti. Primećeno je da nivoi Hcy značajno opadaju, da se nivoi Cth značajno povećavaju, a nivoi Cys su normalizovani kod KO miševa koji su primali 20NHS PEG-htCBS C15S u poređenju sa netretiranim KO miševima. Primećeno je da su nivoi Met blago povišeni kod netretiranih KO miševa, ali se ne razlikuju značajno među grupama.
[0275] Stoga, primećeno je da dugotrajna kontinuirana primena 20NHS PEG-htCBS C15S kod KO miševa može značajno da poboljša nivoe Hcy, Cth i Cys u plazmi u odnosu na netretirane -/- KO miševe. Nivoi Cys u plazmi su normalizovani (tj. nisu značajno različiti od) na vrednost za zdrave /- miševe. Primećeno je da su podaci o metabolitima u korelaciji sa fenotipom utvrđenim pomoću DEXA.
C. Mineralizacija kostiju i telesna kompozicija kod I278T miševa
[0276] Mineralna gustina kostiju (BMD) i mineralni sadržaj kosti (BMC) su analizirani pomoću DEXA kod tri grupe I278T miševa: /- zdrave heterozigotne kontrole (n=10M+11Ž), -/- obolele homozigotne I278T kontrole (n=6M+8Ž) i I278T miševi tretirani sa 20NHS PEG-htCBS C15S (n=6M+6Ž). I278T miševi tretirani sa 20NHS PEG-htCBS C15S (C15S/ME-200GS) su primali doze od 7.5 mg/kg supkutano (SC) 3 puta nedeljno od uzrasta od 6 meseci do uzrasta od 13 meseci. SL.17A, SL. 17B, SL. 17C, SL.17D i SL.17E predstavljaju grafikone na kojima se upoređuju BMD (g/cm<2>), BMC (g), ukupna masa (g), telesna masa bez masnog tkiva (g) i sadržaj masti (%), redom, između tri grupe miševa. Tabela 21 daje P-vrednosti koje se koriste za određivanje značajnosti razlika u tretiranoj grupi u odnosu na kontrolne grupe.
Tabela 21. P-vrednosti za DEXA-određene parametre kod I278T miševa
[0277] P-vrednost od 0.05 je postavljena kao prag za određivanje značajnosti. Svi parametri određeni pomoću DEXA su značajno smanjeni kod obolelih I278T miševa u poređenju sa heterozigotnim miševima. Tretman I278T miševa sa 20NHS PEG-htCBS C15S je doveo do značajne korelacije svih parametara izuzev količine telesne mase bez masnog tkiva u poređenju sa netretiranim I278T miševima. Zapravo, primećeno je da vrednosti mineralizacije kostiju (BMD) ne mogu da se razlikuju između zdravih heterozigotnih kontrola i I278T miševa tretiranih sa 20NHS PEG-htCBS C15S. Samim tim, lečenje I278T miševa sa 20NHS PEG-htCBS C15S je takođe sprečilo duboku osteoporozu i poboljšalo telesnu kompoziciju (ukupnu masu, telesnu masu bez masnog tkiva i sadržaj masti).
D. Metaboliti u plazmi kod I278T miševa
[0278] Metaboliti u plazmi su određeni kod istih miševa/grupa kako je prethodno opisano i međusobno upoređeni. Nivoi metabolita Hcy, Cth, Cys i Met u plazmi su prikazani na SL.
17F. Levi stubić predstavlja nivo metabolita za /- zdrave kontrole, a srednji stubić predstavlja nivo metabolita za -/- obolele kontrole. Nivoi svakog metabolita kod miševa tretiranih sa 20NHS PEG-htCBS C15S su predstavljeni desnim stubićem. Tabela 22 daje P-vrednosti koje se koriste da bi se odredila značajnost razlika u nivoima metabolita u plazmi među /- zdravih kontrola, -/- obolelih kontrola i I278T miševa tretiranih sa 20NHS PEG-htCBS C15S.
Tabela 22: P-vrednosti promena metabolita u plazmi
[0279] P-vrednost od 0.01 je postavljena kao prag za određivanje značajnosti. Primećeno je da se nivoi Hcy značajno smanjuju, Cth značajno povećavaju, a nivoi Cis su značajno poboljšani, ali nisu normalizovani kod I278T miševa koji su primali 20NHS PEG -htCBS C15S u poređenju sa netretiranim obolelim I278T kontrolama. Nivoi Met su bili blago povišeni kod netretiranih obolelih I278T miševa, i kod I278T miševa nakon tretmana oni su značajno normalizovani na nivoe koji se javljaju kod /- heterozigotnih miševa.
[0280] Ovi rezultati su slični rezultatima u DEXA studiji sa KO miševima, osim što normalizacija nivoa Cys do /- nivoa nije bila uočena u tretiranoj I278T grupi. Stoga, kontinuirana dugotrajna primena 20NHS PEG-htCBS C15S kod I278T miševa je značajno poboljšala nivoe Hcy, Cth, Cys, kao i nivo Met u plazmi u poređenju sa netretiranim -/homozigotnim obolelim miševima. Zapaženo je da ovi podaci o metabolitima potvrđuju fenotip ocenjen putem DEXA.
[0281] Stoga, dugotrajna kontinuirana primena 20NHS PEG-htCBS C15S sprečava osteoporozu i poboljšava telesnu kompoziciju kod KO i kod I278T modela miševa, i efikasno poboljšavana nivoe metabolita koji su povezani sa homocistinurijom.
Primer 16. Kontinuirana dugotrajna primena 200MA0B PEG-htCBS C15S poboljšava metabolizam i funkciju jetre, smanjuje zapaljenje i normalizuje lipide u plazmi kod I278T miševa
[0282] Primećeno je da primena 200MA0B PEG-htCBS C15S kod I278T miševa poboljšava metabolizam glukoze u jetri, redoks status i potencijal metilacije kao i metabolizam lipida. Zapaženo je da je funkcija jetre neoštećena, a da su zapaljenski citokini i lipidi u plazmi normalizovani lečenjem.
A. Efekti dugotrajne primene 200MA0B PEG-htCBS C15S na funkciju jetre i metabolizam lipida kod I278T miševa
[0283] Biomarkeri u plazmi su izmereni kod I278T miševa nakon dugotrajnog tretmana sa 200MA0B PEG-htCBS C15S da bi se analizirala funkcija jetre, zapaljenje, i nivoi lipida u plazmi. Tri grupe I278T miševa su analizirane: /- zdrave heterozigotne kontrole (n=3), -/obolele homozigotne kontrole (n=3) i I278T miševi tretirani sa 200MA0B PEG-htCBS C15S (n=3). Miševi tretirani sa 200MA0B PEG-htCBS C15S su primali doze od 7.5 mg/kg supkutano (SC) 3 puta nedeljno od uzrasta od 6 meseci do 13 meseci. Enzimska aktivnost alanin aminotransferaze (ALT), aspartat aminotransferaze (AST) i alkalne fosfataze (ALP); koncentracije citokina IL-12 (p40), IL-12 (p20), IL-13, G-CSF, MCP-1 i TNF-α; i koncentracije lipida u plazmi (ukupni, HDL i LDL holesteroli i trigliceridi) su i zmerene u plazmi (rezultati nisu prikazani). Primećeno je da funkcija jetre nije oštećena jer su aktivnosti AST, ALT i ALP u plazmi bile unutar referentnog opsega. Zapaženo je da su zapaljenski citokini, naročito IL-12 (p40) i IL-13, povišeni kod netretiranih I278T miševa i normalizovani kod tretirane grupe. Panel lipida u plazmi prikazuje da su netretirani I278T miševi imali značajno viši ukupni, HDL i LDL holesterol, a u isto vreme suštinski snižene trigliceride u odnosu na zdrave /kontrole. Lipidni profil je u potpunosti normalizovan kod I278T miševa tretiranih sa 200MA0B PEG-htCBS C15S.
B. Efekti dugotrajne primene 200MA0B PEG-htCBS C15S na metabolizam jetre kod I278T miševa
[0284] Pored gore opisanih biomarkera, izvršena je metabolomika nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) za analizu tkiva jetre istih miševa da bi se ispitao efekat dugotrajnog tretmana sa 200MA0B PEG-htCBS C15S na I278T miševe. Metaboliti iz tkiva jetre su ekstrahovani u hidrofilne i lipofilne rastvarače i odvojeno kvantifikovani pomoću NMR.
[0285] Koncentracije glikogena, glukoze, glutationa (GSH), ukupnog glutationa, i metil -grupa u hidrofilnoj frakciji su prikazani na SL. 18A. Levi stubić predstavlja koncentracije kod /- zdravih kontrola, a srednji stubić predstavlja koncentracije kod -/obolelih kontrola. Koncentracije kod miševa tretiranih sa 20NHS PEG-htCBS C15S su predstavljene desnim stubićem. Za hidrofobnu frakciju, ukupne nezasićene masne kiseline (UFA), polinezasićene masne kiseline (PUFA), t-masne kiseline, (CH2)nlipidi i ukupni lipidi su prikazani na SL.
18B. Levi stubić predstavlja koncentracije kod /- zdravih kontrola, a srednji stubić predstavlja koncentracije kod -/- obolelih kontrola. Koncentracije kod miševa tretiranih sa 20NHS PEG-htCBS C15S su predstavljene desnim stubićem. Primećeno je da primena 200MA0B PEG-htCBS C15S kod I278T miševa poboljšava metabolizam glukoze u jetri, redoks status i potencijal metilacije, kao i metabolizam lipida.
Primer 17. Dugotrajan tretman sa 20NHS PEG-htCBS C15S ublažava defekte oka kod I278T miševa
[0286] Promene u nivoima metabolita u plazmi su izmerene kod I278T (+/-) zdravih heterozigotnih kontrolnih miševa, nelečenih -/- obolelih homozigotnih kontrolnih miševa i -/- homozigotnih I278T miševa tretiranih sa 20NHS PEG-htCBS C15S. Miševi tretirani sa 20NHS PEG-htCBS C15S (C15S/ME-200GS) su primali 7.5 mg/kg supkutano (SC) 3 puta nedeljno od uzrasta 2 dana do uzrasta od 4 meseca. Promene nivoa metabolita u plazmi od 6 nedelja do 4 meseca su prikazane na SL. 19A. Merenje nivoa je započelo od 72 sata nakon injekcije budući da su miševi bili na terapiji od uzrasta od 2 dana.
[0287] Kao što je bilo očekivano, netretirana homozigotna I278T kontrola je imala značajno povišen nivo Hcy i snižen nivo Cys u poređenju sa zdravim heterozigotnim kontrolama kao što je prikazano na SL. 19A. Nivo Hcy kod netretiranih homozigotnih I278T miševa je fluktuirao oko 400 µM do 440 µM tokom studije, što predstavlja dokaz kontinuirane akumulacije Hcy usled nedostatka funkcionalne CBS. Kod I278T miševa tretiranih sa 20NHS PEG-htCBS C15S, nivo Hcy se smanjio od 230 µM na oko 70 µM i ovaj nivo se održao tokom ostatka studije. Pored toga, aktivnost 20NHS PEG-htCBS C15S je dovela do akumulacije Cth u plazmi na oko 50 µM tokom studije i što je još važnije do normalizacije nivoa Cys u plazmi na oko 230 µM, koji se održavao tokom studije.
[0288] Oči I278T miševa su analizirane i upoređene između tri grupe. Zdrava heterozigotna kontrola i nelečena -/- obolela I278T kontrola su upoređene na SL. 19B i SL. 19C, redom, pri čemu je primećeno da netretirana homozigotna kontrola ima manja i tanja zonularna vlakna, koja se završavaju na ekvatoru sočiva tik iznad meridionalnih redova i nisu rasla na posteriornoj površini sočiva. U uzorcima uzetim od miševa tretiranih sa 20NHS PEG -htCBS C15S prikazanim na SL. 19D i SL. 19E, uočeno je obogaćivanje gustine zonularnih vlakana i znaci „ponovnog rasta“ zonularnih vlakana na posteriornoj površini sočiva. Ova zapažanja su dokaz da je dugotrajni tretman sa 20NHS PEG-htCBS C15S imao pozitivan efekat na defekte oka kod I278T homozigotnih miševa.
Primer 18. Kombinacija primene 20NHS PEG-htCBS C15S i dijete sa ograničenim unosom Met normalizuje nivoe Hcy kod I278T miševa
[0289] Studija ishrane je sprovedena na I278T miševima i analizirana je. Metaboliti u plazmi miševa starih 10 nedelja: /- I278T (kontrola), -/- I278T (negativna kontrola) i -/- miševi tretirani sa 20NHS PEG-htPBS (OT-58). Svaka grupa je dalje podeljena u podgrupe: jedna na redovnoj ishrani (8.2 g/kg Met TD.01084 dijeta voda sa cinkom) (REG) i jedna na dijeti sa ograničenim unosom metionina (0.5 g/kg Met TD.110591 dijeta voda sa betainom) (MRD). Lečenje je započeto u uzrastu od 5 nedelja.
[0290] SL. 20A prikazuje nivoe Hcy kod 6 grupa. Visoki nivoi Hcy (356 µM, što je u skladu sa gornjim eksperimentima sa I278T miševima) su primećeni kod -/miševa na REG dijeti. Primećeno je da je nivo Hcy znatno niži (51 µM) u tretiranoj grupi na REG dijeti. Rela tivno visok nivo Hcy (41 µM) je takođe primećen kod -/- miševa na MRD dijeti, koji je normalizovan tretmanom OT-58 (2 µM u odnosu na 4 µM kod /- miševa na MRD dijeti).
[0291] SL. 20B prikazuje nivoe Cth kod 6 grupa. Visok nivo Cth je primećen kod -/- miševa tretiranih sa OT-58 na obe dijete, 113 µM kod REG dijete, u odnosu na 10 µM kod MRD dijete, a nivo je bio viši kod miševa na REG dijeti usled dostupnosti supstrata. Sličan trend između REG i MRD dijete je primećen kod preostalih grupa, što se smatra dokazom da su visoki nivoi Cth (naročito kod -/- miševa na REG dijeti) rezultat dijete.
[0292] SL. 20C prikazuje nivoe Cys kod 6 grupa. Primećeno je da su nivoi Cys značajno smanjeni samo kod -/- miševa na REG dijeti, dok je primećeno da MRD dijeta i/ili tretman OT-58 normalizuju nivoe Cys u plazmi.
[0293] SL. 20D prikazuje nivoe Met kod 6 grupa. Primećeno je da su nivoi Met u plazmi visoki (1313 µM) kod -/- miševa na REG dijeti, što ranije nije primećeno kod I278T miševa na standardnoj ishrani. Ovako visok nivo Met je ranije primećen samo kod D17 -19 KO miševa koji nisu tretirani sa CBS. Visoki nivoi Met kod -/- I278T miševa na REG dijeti koji su primali injekcije PBS su verovatno bili rezultat većeg sadržaja Met u REG dijeti koja se koristila kao kontrolna ishrana u ovom eksperimentu u poređenju sa STD dije tom koju obezbeđuje ustanova za životinje.
[0294] Ipak, primećeno je da tretman sa OT-58 kod -/- miševa na REG dijeti značajno snižava nivo Met (201 µM na 66 µM), mada nivoi nisu normalizovani. Primećeno je da su nivoi Met kod miševa na MRD dijeti normalni ili niži od normalnog, pokazujući samo blagi efekat lečenja.
[0295] Stoga je primećeno da kombinacija dijete sa ograničenim unosom Met i primena 20NHS PEG-htCBS C15S normalizuju nivoe metabolita kod I278T miševa. Zajednička primena 20NHS PEG-htCBS C15S (OT-58) sa nerestriktivnom (ne samo olakšanom) ishranom kod subjekata sa homocistinurijom je dovela do smanjenja nivoa Hcy na 50 µM.
Primer 19: Farmakokinetika 20NHS PEG-htCBS C15S kod pacova
A. Farmakokinetika pojedinačne doze
[0296] Da bi se ocenila farmakokinetika 20NHS PEG-htCBS C15S kod pacova, pacovima Sprague Dawley divljeg tipa je ubrizgana pojedinačna doza 20NHS PEG-htCBS C15S intravaskularnim (IV) ili supkutanim (SC) putem. Tri odvojene PK studije pojedinačne doze su kombinovane korišćenjem identičnog ili veoma sličnog dizajna studije kao što je prikazano u tabeli 23. Dizajn treće (ponovljena doza) PK studije (grupe 7 -9) je prilagođen da omogući ekstrakciju podataka nakon prve doze, a time i njihovo kombinovanje sa PK studijom pojedinačne doze (grupe 1-6). Plazma je sakupljena u naznačenim vremenima kako je navedeno u tabeli 23 i analizirana na aktivnost CBS postupcima detaljno opisanim u primeru 1.
Tabela 23. Dizajn PK studije pojedinačne doze (grupe 1-6) i ponovljene doze (grupe 7-9) na pacovima Sprague Dawley korišćenjem 20NHS PEG-htCBS C15S
[0297] Specifična aktivnost 20NHS PEG-htCBS C15S kod mužjaka i ženki pacova nakon pojedinačne IV ili SC bolus doze od 4 (IV), 8 (SC) i 24 mg/kg (SC) je prikazana na SL. 21A i SL. 21B. Rezultati primene 20NHS PEG-htCBS C15S putem IV injekcije kod mužjaka i ženki pacova su se gotovo preklapali. Međutim, suštinske razlike su primećene između mužjaka i ženki nakon jedne primene 8 ili 24 mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S, SC putem.
PK parametri za oba i IV i SC put kod mužjaka i ženki izračunati na osnovu rezultata na SL.
21A (4 mg/kg IV) i SL. 21B (8 mg/kg i 24 mg/kg SC) su prikazani u tabeli 24. Bioraspoloživost 20NHS PEG-htCBS C15S iz SC kod pacova je izuzetno zavisila od pola, pri čemu su mužjaci apsorbovali manje (19-21%) od ženki (oko 36%) i bioraspoloživost je bila suštinski niža kod pacova u poređenju sa onim što je primećeno kod HO miševa (52 -83%).
Tabela 24. PK parametri 20NHS PEG-htCBS C15S kod pacova Sprague Dawley
B. Farmakokinetika ponovljene doze
[0298] Da bi se dalje procenili pacovi kao vrsta za izvođenje studija dugoročnog praćenja toksičnosti, farmakokinetika 20NHS PEG-htCBS C15S je određena u tri grupe pacova Sprague Dawley koji su primali ukupno 9 SC injekcija svakih 48 sati od 4 mg/kg (niska), 8 mg/kg (srednja), ili 24 mg/kg (visoka) 20NHS PEG-htCBS C15S. Dizajn studije je prikazan u tabeli 23. Eksperiment je izveden u trajanju od 24 dana. Plazma je sakupljena i analizirana na aktivnost CBS pomoću postupaka detaljno opisanih u primeru 1.
[0299] Specifične aktivnosti CBS za PK studiju ponovljene doze grafički prikazane u funkciji vremena su date u vidu primera srednje doze od 8 mg/kg, kao što je prikazano na SL. 21C (slični fenomeni su prikazani za grupe sa niskom (4mg/kg) kao i sa visokom dozom (24 mg/kg). Strelice označavaju injekciju. Nije primećena akumulacija aktivnosti CBS u plazmi, a suštinski pad pika aktivnosti CBS je primećen nakon prvih 6 injekcija. Primećeno je da je ova neočekivana nesposobnost pacova da postignu predviđene ravnotežne nivoe aktivnosti CBS u plazmi veća kod mužjaka nego kod ženki, najverovatnije zbog smanjene bioraspoloživosti (videti iznad PK podatke za pojedinačnu dozu). Značajno slabljenje aktivnosti CBS kod kasnijih primena 20NHS PEG-htCBS C15S je verovatno posledica imunološkog odgovora, što je bio dokaz da pacovi nisu pogodna vrsta za studije dugoročnog praćenja toksičnosti.
Primer 20. Farmakokinetika i farmakodinamika 20NHS PEG-htCBS C15S kod majmuna
[0300] Da bi se procenio model primata izuzev čoveka za studije dugoročnog praćenja toksičnosti i ocenila efikasna doza kod ljudi putem alometrijskog skaliranja, izvedene su farmakokinetičke i farmakodinamičke studije 20NHS PEG-htCBS C15S kod makaki majmuna divljeg tipa (Macaca fascicularis).
A. Farmakokinetika i farmakodinamika pojedinačne doze 20NHS PEG-htCBS C15S kod majmuna
[0301] U PK studiji pojedinačne doze, za izvođenje eksperimenata korišćene su tri eksperimentalne grupe od 4 (n=2M+2Ž) majmuna u svakoj. Prva grupa je primala 2 mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S putem IV injekcije. Krv je uzimana na 0, 0.083, 0.16, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 72, 120 i 192 sata posle IV injekcije. Druga i treća grupa su primale 2 mg/kg ili 6 mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S putem SC injekcije. Krv je uzimana na 0, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 192, 240 i 336 sati posle SC injekcije. Sakupljena plazma je analizirana na aktivnost CBS i nivoi metabolita sumpornih aminokiselina (homocistein, cistationin i cistein) su određeni postupcima opisanim u primeru 1.
[0302] Krive specifične aktivnosti CBS u funkciji vremena kod majmuna posle primanja pojedinačne doze od 2 mg/kg IV primenom ili doze od 2 mg/kg ili 6 mg/kg SC primenom 20NHS PEG-htCBS C15S su prikazane na SL.22A. Izračunati PK parametri za obe, IV i SC primenu nakon pojedinačne injekcije su ukratko prikazani u tabeli 25. Izračunato je da bioraspoloživost 20NHS PEG-htCBS C15S kod majmuna iznosi približno 80%, što je gotovo identično kao bioraspoloživost kod HO miševa kojima je data SC doza od 5 mg/kg (83%) . Izračunato je da poluvreme eliminacije 20NHS PEG-htCBS C15S iz plazme kod majmuna iznosi 67 sati na osnovu skupa podataka za IV i 73 sata na osnovu skupa podataka za SC. Izračunato je da cmaxiznosi 40.8 mU/µL, pri SC dozi od 2 mg/kg i 114.9 mU/µL pri SC dozi od 6 mg/kg.
[0303] U tabeli 25 su navedeni PK parametri dobijeni iz eksperimenata sa pojedinačnom dozom izvedenih sa 20NHS PEG-htCBS C15S kod majmuna.
Tabela 25. PK parametri nakon pojedinačne IV i SC injekcije 20NHS PEG -htCBS C15S kod makaki majmuna
[0304] Pošto su majmuni koji su primili injekciju bili zdravi, divljeg tipa i prirodno su imali niske nivoe Hcy (3-5 µM u poređenju sa 150-500 µM kod mišjih modela homocistinurije), farmakodinamički efekat nakon pojedinačne IV ili SC doze od 20NHS PEG -htCBS C15S nije bio očekivan. Nisu primećene značajne promene nivoa Hcy i Cys u plazmi kod majmuna koji su primili injekciju. Međutim, značajni pikovi Cth u plazmi su primećeni 8 sati nakon IV primene, i 8 i 48 sati posle SC primene u odnosu na početne nivoe, što je predstavljalo dokaz PD efekta čak i kod neobolelih zdravih majmuna (SL.22B). Pikovi nivoa Cth u plazmi su verovatno poticali od primene 20NHS PEG-htCBS C15S jer je CBS jedini enzim za koji je poznato da obrazuje Cth. Pored toga, enzim CBS normalno ne cirkuliše niti funkcioniše u plazmi. Primećeno je da se Cth koji je obrazovan u plazmi primenom 20NHS PEG -htCBS C 15S uklanja sporije od Cys ili Hcy. Zbog toga su metaboliti, posebno Cth, dalje praćeni u višedoznoj studiji da bi se odredilo da li je primećeni PD efekat bio izraženiji ili dozno zavisan.
B. Farmakokinetika i farmakodinamika ponovljene doze 20NHS; PEG-htCBS C15S kod majmuna
[0305] Eksperimenti sa ponovljenim dozama su izvedeni, pri čemu su tri grupe od 4 majmuna (1M+1Ž u glavnoj podgrupi i 1M+1Ž u podgrupi za oporavak) primale ukupno 6 uzastopnih SC doza na svaka 72 sata od 1 mg/kg (niska), 3 mg/kg (srednja), ili 10 mg/kg (visoka) 20NHS PEG-htCBS C15S. Krv je uzimana od majmuna u glavnim podgrupama na 0, 32, 72, 104, 144, 176, 216, 248, 288, 320, 360, 392 i 408 sati nakon prve injekcije, dok je životinjama u podgrupama za oporavak krv uzimana u dodatnim vremenskim tačkama od 432, 456, 480, 528 i 696 sati nakon prve injekcije. Plazma je uzimana i analizirana na aktivnost CBS i nivoe sumpornih aminokiselina (homocistein, cistationin, cistein, lantionin i homolantionin) pomoću postupaka opisanih u primeru 1.
[0306] Krive specifične aktivnosti 20NHS PEG-htCBS C15S u funkciji vremena za grupe sa niskom (1 mg/kg), srednjom (3 mg/kg) i visokom (10 mg/kg) dozom nakon 6 uzastopnih SC injekcija svaka 3 dana su prikazane na SL. 23A. Supkutana primena 20NHS PEG-htCBS C15S kod makaki majmuna je dovela do predvidivih i dozno-zavisnih nivoa aktivnosti CBS u plazmi nakon 6 doza datih na svaka 3 dana tokom 16 dana. Nasuprot rezultatima PK studije ponovljene doze kod pacova, nije detektovano slabljenje aktivnosti CBS nakon ponovljenih primena 20NHS PEG-htCBS C15S kod majmuna divljeg tipa. Svaka naknadna primena enzima je dovela do potpuno predvidive akumulacije aktivnosti CBS u plazmi i suštinski je dostigla nivoe ravnotežnog stanja nakon prve tri doze. Primećeno je da dalje doziranje održava ravnotežno stanje, pri čemu je brzina eliminacije ekvivalentna brzini apsorpcije što dovodi do konstantnog pika i najnižih nivoa u plazmi. Srednja vršna koncentracija plazme u ravnotežnom stanju (cmax-ss) je bila normalizovana za doze koje su u opsegu od 36 do 39 mU/µl, a najniži nivoi u plazmi su bili normalizovani u ravnotežnom stanju (cmin-ss) za doze u opsegu od 23 do 28 mU/µl. Zapaženo je da je brzina eliminacije 20NHS PEG-htCBS C15S log-linearna čime se potvrđuje kinetika prvog reda, tako da vreme potrebno da se polovina aktivnosti 20NHS PEG-htCBS C15S u plazmi smanji bilo konstantno (podaci nisu prikazani). Poluvreme eliminacije je procenjeno kod životinja u grupi za oporavak nakon poslednje doze 16. dana i bilo je između 49 i 64 sata, tj. slično poluvremenu eliminacije zapaženom kod majmuna nakon pojedinačne SC doze 20NHS PEG-htCBS C15S (73 sata), što je dokaz da višestruke doze nisu promenile brzinu eliminacije.
[0307] Nivoi cistationina u plazmi, biomarkera za koji je zaključeno da je pokazatelj aktivnosti 20NHS PEG-htCBS C15S čak i kod neobolelih zdravih majmuna (videti podatke za pojedinačnu dozu kod majmuna). Rezultati kod majmuna koji su primali 6 injekcija u razmaku od 72 sata niske (1 mg/kg), srednje (3 mg/kg), i visoke (10 mg/kg) doze su prikazani na SL.23B. Ti nivoi Cth su bili u dobroj korelaciji sa pikovima i najnižim nivoima aktivnosti 20NHS PEG-htCBS C15S u plazmi i primećeno je takođe da su dozno-zavisni. Nije bilo jasnih razlika između doznih grupa za homocistein i cistein (podaci nisu prikazani).
[0308] Pored tioetar cistationina proizvedenog putem CBS, dva tioetra lantionina i homolantionina, koji su izabrani kao surogat markeri proizvodnje vodonik sulfida, su izmerena u uzorcima plazme majmuna iz studije ponovljene doze u odabranim vremenskim tačkama. Vodonik sulfid je nov i važan signalni molekul u mnogim fiziološkim procesima i samim tim se u novije vreme intenzivno ispituje za terapijske primene.
[0309] Tabela 26 predstavlja nivoe cistationina, lantionina i homolantionina u plazmi majmuna divljeg tipa nakon ponovljene primene 20NHS PEG-htCBS C 15S u različitim dozama SC putem. Prikazani su nivoi metabolita na 0 sati (pre doze), 176 sati i 392 sata nakon prve injekcije. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM) u µM (n=4).
Tabela 26. Nivoi tioetara cistationina, lantionina i homolantionina u plazmi kod majmuna nakon ponovljene primene 20NHS PEG-htCBS C15S
[0310] Primećeno je da je ponovljena primena 20NHS PEG-htCBS C15S kod majmuna divljeg tipa povećala nivoe cistationina i lantionina u plazmi, ali nivoi homolantionina nisu bili značajno pogođeni. Zapaženo je da je povećanje cistationina i lantionina direktno proporcionalno dozi, i primećeno je da je dozna zavisnost izraženija kod lantionin nego kod cistationina.
C. LC/MS/MS test aktivnosti C15S
[0311] Bioanalitički postupak razvijen pomoću LC/MS/MS za određivanje cistationina M+4 kao proizvoda aktivnosti CBS upotrebom cistationina M+8 (<13>C2D6) kao internog standarda je bio razvijen i validiran i za uzorke plazme majmuna i čoveka i samim tim može da se koristi za određivanje aktivnosti CBS u uzorcima iz farmakokinetičkih i toksikoloških studija, kao i kliničkih ispitivanja. Enzimski test je suštinski izveden kao što je opisano u primeru 1 uz sledeće modifikacije. Deuterisani D,L-homocistein M+4 je korišćen kako bi se inicirala reakcija sa neobeleženim L-serinom u reakcionoj smeši. Nakon inkubacije od 30 min na 37°C, enzimska reakcija je zaustavljena zakišeljavanjem pomoću 6N HCl i obeleženi proizvod reakcije (cistationin M+4) je ekstrahovan pomoću EZ:faast kompleta (Phenomenex, SAD). Ukratko, 50 µl uzorka (kalibracioni standard, QC uzorak ili enzimska reakcija) je pomešano u epruveti na ledu i zaštićeno od svetlosti sa 100µl internog standardnog rastvora (cistationin M+8, 0.25 ng/µl) i 250 µl vode. Smeša je ekstrahovana na kertridž-kolonama MCX (Waters). Eluirani medijum (6N amonijak u metanolu) je uparen do suva na 45°C. Suvi ostatak je rastvoren u medijumu za eluent EZ:faast kompleta, derivatizovan i ekstrahovan tečno-tečnom ekstrakcijom prema protokolu proizvođača kompleta. Ekstrakcija čvrste faze je automatizovana sa pločama za ekstrakciju kako bi se povećala propusnost i uštedelo vreme. Zapažene su merljive koncentracije cistationina M+4 nezavisno od porekla enzima (htCBS C15S ili C15S/ME-200GS prisutnog u uzorcima plazme ili kontrolama ili tragovima endogene majmunske/humane CBS u uzorcima plazme). Dosta pažnje je posvećeno opsegu kalibracije budući da su dobijena određivanja bila u većem delu kvalifikovanog koncentracionog opsega (5.00 do 1500 nM).
[0312] Tabele 12-14 u nastavku prikazuju poređenje specifične aktivnosti C15S/ME-200GS određene putem LC/MS/MS upotrebom D,L-homocisteina M+4 kao supstrata i radiometrijskim ispitivanjem upotrebom L-[<13>C-U]-serina kao supstrata. Specifična enzimska aktivnost je prikazana u mU/µl. Skraćenica „n.d.“ znači „nije određeno“. Tabela 27 prikazuje poređenje specifičnih aktivnosti C15S/ME-200GS u skupu uzoraka plazme makaki majmuna kojem je IV ubrizgana pojedinačna doza od 2 mg/kg.
Tabela 27. Poređenje specifičnih aktivnosti C15S/ME-200GS određenih u dva testa u uzorcima plazme majmuna nakon pojedinačne IV doze od 2 mg/kg
[0313] Tabela 28 prikazuje poređenje specifičnih aktivnosti C15S/ME-200GS u skupu uzoraka plazme makaki majmuna kojem je SC ubrizgana pojedinačna doza od 2 mg/kg. Tabela 28. Poređenje specifičnih aktivnosti C15S/ME-200GS određenih u dva testa u uzorcima plazme majmuna nakon pojedinačne SC doze od 2 mg/kg
[0314] Tabela 29 prikazuje poređenje specifičnih aktivnosti C15S/ME-200GS u skupu uzoraka plazme makai majmuna kojem je SC ubrizgana pojedinačna doza od 6 mg/kg (odnosi se na primer 20).
Tabela 29. Poređenje specifičnih aktivnosti C15S/ME-200GS određenih u dva testa u uzorcima plazme majmuna nakon pojedinačne SC doze od 6 mg/kg
Primer 21. Ekstrapolacija PK/PD podataka sa životinja na ljude
[0315] U većini slučajeva, nivoi leka u plazmi potrebni da bi se dobio farmakodinamički odgovor su različiti među vrstama usled varijacija sekvence specifičnih za vrstu u receptoru ili ciljnom mestu enzima. Na primer, antitelo protiv humanog proteina može da ima veoma različit afinitet za mišji i humani ciljni protein usled razlika među vrstama u sekvenci ciljnog proteina. U slučaju 20NHS PEG-htCBS C15S, biološki cilj je aminokiselina, Hcy, koja je identična među vrstama. Dalje, raspodela leka u ciljnom tkivu može da varira među vrstama i možda se ne može lako predvideti na osnovu nivoa leka u plazmi zbog biološke raspodele specifične za vrstu. Međutim, „ciljno tkivo“ za 20NHS PEG/C15S je plazma što daje visok stepen sigurnosti predviđanju vrednosti za čoveka ekstrapoliranih iz poređenja farmakokinetičkih parametara u plazmi među vrstama.
[0316] Ove studije su izvedene kod miševa upotrebom SC doze od 7.5 mg/kg, a ispitivanja zavisnosti odgovora od doze su pokazala da doza od 5 mg/kg maksimalno povećava efikasnost u smislu modulisanja nivoa biomarkera u plazmi: Hcy, Cth i Cys. Upotrebom doze od 5 mg/kg i korigovanjem za razliku u telesnoj površini između ljudi (70 kg) i miševa (0.025 kg), za dozu od 0.4 mg/kg je procenjeno da predstavlja efikasnu humanu ekvivalentnu dozu (HED). Pri ovoj dozi, vršni nivoi u plazmi su bili 50 mU/µl kod miševa sa AUC od 3060 mU-h/mL. Pošto je supstrat za aktivnost 20NHS PEG-htCBS C15S (Hcy i serin) bio isti među vrstama, a mesto dejstva je bio sam pul krvi, ovi parametri obezbeđuju tačnu procenu ciljnih nivoa u plazmi čoveka potrebnih za efikasnost u kliničkom ispitivanju 20NHS PEG-htCBS.
[0317] Farmakokinetičke studije su izvedene na mišjim životinjskim modelima CBSDH, normalnim pacovima Sprague Dawley i normalnim makaki majmunima posle bilo pojedinačne ili više SC injekcija na raznim doznim nivoima. Pored toga, farmakokinetičke studije pojedinačne doze su izvedene kod sve 3 vrste nakon IV primene 20NHS PEG-htCBS C15S da bi se procenila bioraspoloživost kod sve 3 vrste nakon SC primene. Sažetak farmakokinetičkih parametara bioraspoloživosti (F%) korigovanih za dozu kod modela miša, pacova i majmuna nakon SC primene su prikazani u tabeli.
Tabela 30. PK parametri za OT-58 (htCBS C15S ME-200GS) za različite vrste i predviđene vrednosti za ljude na osnovu skaliranja površine tela
[0318] Prema ovim rezultatima, 20NHS PEG-htCBS C15S je polako apsorbovan u krvotok nakon SC primene kod sve 3 vrste. Poluvreme apsorpcije je bilo slično među vrstama u opsegu između 5 i 12 sati kod miša, između 10 i 16 sati kod pacova i između 8 i 10 sati kod majmuna posle pojedinačne SC injekcije, što je dovelo do vrednosti Tmaxkoje su bile u opsegu između 24 sata i 48 sati kod pojedinih životinja. Poluvreme eliminacije (T1/2) je bilo 20 sati kod miševa, 44.5 sata kod pacova i 73 sata kod majmuna. Procenat 20NHS PEG-htCBS C15S apsorbovane u krv nakon SC primene (F%) je bio >80% i kod modela miša (5 mg/kg doza) i majmuna (u dozama od 1, 3 ili 10 mg/kg). Međutim, procenat 20NHS PEG -htCBS C15S apsorbovan u krv je bio samo 20% kod mužjaka pacova i 36% ženki pacova. U tabeli 30, AUC/doza i Cmax/doza kod pacova su korigovane na 80% bioraspoloživosti (vrednosti u zagradama u tabeli 30) kako bi se omogućila poređenja među vrstama pri istom F%.
[0319] Poređenja među vrstama su izvedena na osnovu skaliranja površine tela pod pretpostavkom da je bioraspoloživost 80% kod sve 3 vrste (miš, pacov i majmun) da bi se odredilo da li postoji linearna korelacija između log vrednosti telesne mase i log vrednosti raznih PK parametara (AUC/doza, Cmax po dozi i T1/2). Linearna korelacija kod ovih parametara je označavala da su farmakokinetički parametri za 20NHS PEG-htCBS C15S skalirani prema površini tela, i da bi samim tim verovatno bili prediktivni za vrednosti kod čoveka. Linearne korelacije omogućavaju predviđanje kliničke doze i režima doziranja iz pretkliničkih podataka.
[0320] Uočena je linearna korelacija za farmakokinetičke parametre AUC, Cmax i T1/2među vrstama za 20NHS PEG-htCBS C15S. Kao što je prikazano na SL. 24A (AUC/doza), SL.
24B (Cmax/doza) i SL. 24C (T1/2), primećena je odlična linearna korelacija između log vrednosti telesne mase svake vrste u odnosu na njihove pridružene PK parametre korigovane za dozu. Ekstrapolacijom na log telesne mase za ljude (70 kg) za svaki parametar, izračunati su AUC/doza, Cmax/doza i T1/2za humane subjekte. Prediktivne vrednosti za čoveka su date u tabeli 30.
[0321] Ekstrapolirani/predviđeni poluživot kod ljudi je bio oko 175 sati ili 7.3 dana. Predviđena efikasna doza za čoveka izračunata je iz efikasne doze kod miševa (5 mg/kg) alometrijskim skaliranjem na 0.4 mg/kg kod čoveka od 70 kg. Pomoću predviđene humane cmaxod 34 mU/µL (po mg/kg) i opsega Tmaxod 48 do 72 sata, konstruisana je hipotetička kriva za PK krivu pojedinačne doze kod čoveka, koja je prikazana na SL.24D. E odsečak je bio 43.079 mg/µL, a poluživot je bio 176.737 sati. Podaci za miševe i majmune su takođe prikazani u komparativne svrhe na SL. 24D. Tabela 31 daje ekstrapolirane koncentracije procenjene za ljude.
Tabela 31. Ekstrapolirane koncentracije za ljude
[0322] Iz PK parametara izvedenih sa SL. 24D, PK kriva višestrukih doza je modelovana podrazumevajući kinetiku prvog reda kod ljudi, što je prikazano na SL. 24E.
A. Hipotetička PK kriva ponovljene doze kod ljudi
[0323] SL. 24F prikazuje predviđene PK vrednosti za 20NHS PEG-htCBS C15S kod ljudi pri SC dozi od 1 mg/kg koja se daje jednom nedeljno tokom pristupa ravnotežnom stanju nivoa u plazmi i predviđene vršne i najniže nivoe u ravnotežnom stanju (svetlo siva). SL.
24G prikazuje predviđene PK vrednosti za 20NHS PEG-htCBS C15S kod ljudi pri SC dozi od 1 mg/kg koja se daje dva puta nedeljno tokom pristupa ravnotežnom stanju nivoa u plazmi i predviđene vršne i najniže nivoe kod ljudi u ovom doznom intervalu (svetlo siva). Tabela 32 upoređuje predviđene vršne i najniže nivoe 20NHS PEG-htCBS C15S u plazmi kod ljudi pri SC dozama od 0.33, 0.66 i 1 mg/kg koje se daju jednom nedeljno i dva puta nedeljno (pod pretpostavkom da je bioraspoloživost kod ljudi 80%).
Tabela 32. Predviđeni nivoi u plazmi kod ljudi (podrazumevajući bioraspoloživost od
80%)
[0324] Iz ovih proračuna, predviđeno je da će doza od 0.66 mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S koja se kod humanih pacijenata primenjuje SC jednom nedeljno dovesti do nivoa u plazmi koji su u opsegu između 31 i 45 mU/µL u ravnotežnom stanju (eng. - steady state, ss). Slično tome, predviđeno je da će doza od 0.33 koja se daje dva puta nedeljno dovesti do nivoa u plazmi koji su u opsegu između 35 i 41 mU/µL u ravnotežnom stanju (nakon oko 8 doza). Ova predviđanja podrazumevaju supkutanu bioraspoloživost od 80% kao što je primećeno i kod miševa i kod majmuna. Očekuje se da će ove doze 20NHS PEG-htCBS C15S takođe proizvesti vršne i najniže nivoe u plazmi u efikasnom opsegu za nivoe u plazmi slične onima kod miševa (vršni nivoi od 50 mU/µL). Pored toga, ove doze odgovaraju humanoj efikasnoj dozi, predviđenoj samo na osnovu studija na miševima, od 0.4 mg/kg. Linearna korelacija telesne mase i PK parametara među pretkliničkim vrstama omogućila je alometrijsko skaliranje (skaliranje telesne površine) kako bi se predvideli PK parame tri AUC, Cmax i poluvreme eliminacije kod ljudi poređenjem vrednosti među vrstama.
[0325] Primećeno je da se oba postupka predviđanja efikasne doze kod ljudi (direktno na osnovu podataka o miševima i alometrijskog skaliranja za 3 vrste) podudaraju u smislu predviđanja efikasne doze (HED). Dakle, pod pretpostavkom da je bioraspoloživost 80%, predložena doza od 0.33 mg/kg koja se primenjuje dva puta dnevno ili 0.66 mg/kg koja se primenjuje jednom nedeljno će verovatno predstavljati efikasne doze u kliničkim ispitivanjima na ljudima.

Claims (6)

Patentni zahtevi
1. Kompozicija koja sadrži izolovani mutantni polipeptid humane skraćene cistationin beta sintaze (htCBS) konjugovan sa PEG grupom, naznačena time što izolovani mutantni polipeptid htCBS sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 sa izmenom cisteina na aminokiselinskom položaju koji odgovara položaju 15 u SEQ ID NO: 3 u serin i ne sadrži N-terminalni prvi metioninski ostatak koji odgovara SEQ ID NO:3, i PEGilovan je sa ME-200GS;
za upotrebu u postupku za lečenje homocistinurije kod humanog subjekta, gde se PEGilovani mutantni polipeptid htCBS primenjuje najmanje jednom nedeljno tokom najmanje šest nedelja u dozi između 0.33 i 10 mg/kg.
2. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time što doza predstavlja količinu izabranu iz grupe koja se sastoji od: 0.33, 0.5, oko 1, oko 2 i oko 5 mg/kg.
3. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time što doza iznosi oko 0.4 mg/kg.
4. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time što se PEGilovani mutantni polipeptid htCBS primenjuje najmanje dva puta nedeljno.
5. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time što se PEGilovani mutantni polipeptid htCBS primenjuje zajedno sa betainom.
6. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time što se betain primenjuje pre PEGilovanog mutantnog polipeptida htCBS.
RS20241229A 2015-11-09 2016-11-09 Kompozicije i postupci za lečenje homocistinurije RS66106B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/935,690 US9675678B2 (en) 2013-01-29 2015-11-09 Compositions and methods for treatment of homocystinuria
EP21204193.3A EP3998067B1 (en) 2015-11-09 2016-11-09 Compositions and methods for treatment of homocystinuria

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66106B1 true RS66106B1 (sr) 2024-11-29

Family

ID=58696136

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20241229A RS66106B1 (sr) 2015-11-09 2016-11-09 Kompozicije i postupci za lečenje homocistinurije
RS20220308A RS63070B1 (sr) 2015-11-09 2016-11-09 Kompozicije i postupci za upotrebu u lečenju homocistinurije

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220308A RS63070B1 (sr) 2015-11-09 2016-11-09 Kompozicije i postupci za upotrebu u lečenju homocistinurije

Country Status (26)

Country Link
US (3) US11077175B2 (sr)
EP (3) EP4487914A3 (sr)
JP (2) JP7009364B2 (sr)
KR (1) KR102819396B1 (sr)
CN (2) CN115920016A (sr)
AU (2) AU2016354030B2 (sr)
BR (1) BR112018007768A2 (sr)
CA (1) CA3001625A1 (sr)
CY (1) CY1125113T1 (sr)
DK (2) DK3998067T3 (sr)
ES (2) ES2909914T3 (sr)
FI (1) FI3998067T3 (sr)
HR (2) HRP20220407T1 (sr)
HU (2) HUE058749T2 (sr)
IL (2) IL258487B2 (sr)
LT (2) LT3373922T (sr)
MX (1) MX2018005312A (sr)
NZ (1) NZ741552A (sr)
PL (2) PL3998067T3 (sr)
PT (2) PT3998067T (sr)
RS (2) RS66106B1 (sr)
SG (1) SG10201912972SA (sr)
SI (2) SI3998067T1 (sr)
SM (2) SMT202400463T1 (sr)
WO (1) WO2017083327A1 (sr)
ZA (1) ZA201802376B (sr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9675678B2 (en) 2013-01-29 2017-06-13 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for treatment of homocystinuria
BR112018007768A2 (pt) 2015-11-09 2018-10-23 Univ Colorado Regents composições e métodos para tratamento de homocistinúria
JP7146897B2 (ja) * 2017-04-17 2022-10-04 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイト ホモシスチン尿症の治療のための酵素補充療法の最適化
DK3990005T3 (da) * 2019-06-26 2025-12-08 Travere Therapeutics Switzerland Gmbh Pegyleret cystathioninbetasynthase til enzymterapi til behandling af homocystinuri
EP4025243A4 (en) * 2019-09-03 2023-09-27 Travere Therapeutics Switzerland GmbH CYSTATHIONINE BETA-SYNTHASE ENZYMA THERAPY FOR THE TREATMENT OF HIGH HOMOCYSTEINE LEVELS

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS555429A (en) * 1978-06-23 1980-01-16 Nissan Motor Co Ltd Pressure regulator for fuel injection type gasoline engine
JPS5576559A (en) 1978-12-01 1980-06-09 Chiyou Lsi Gijutsu Kenkyu Kumiai Electron beam fine adjusting device
US5656425A (en) 1993-08-17 1997-08-12 Regents Of The University Of Colorado Screening for mutations by expressing cDNA segments
US5523225A (en) 1993-09-13 1996-06-04 Regents Of The University Of Colorado DNA sequence encoding human cystathionine β-synthase
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5635375A (en) 1995-01-09 1997-06-03 Regents Of The University Of Colorado Method of increasing the yield and heme saturation of cystathione β-synthase
EP1221615A2 (en) 1995-04-25 2002-07-10 Oridigm Corporation S-adenosyl methionine regulation of metabolic pathways and its use in diagnosis and therapy
US5705151A (en) 1995-05-18 1998-01-06 National Jewish Center For Immunology & Respiratory Medicine Gene therapy for T cell regulation
US6153655A (en) 1998-04-17 2000-11-28 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
CN100335503C (zh) 1998-04-28 2007-09-05 应用研究系统Ars股份公司 多元醇干扰素β偶联物
US6174696B1 (en) 1999-11-12 2001-01-16 Genzyme Corporation Method for the determination of homocysteine
WO2001002600A2 (en) 1999-07-06 2001-01-11 General Atomics Detection of analytes using attenuated enzymes
US6653062B1 (en) 2000-07-26 2003-11-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Preservation and storage medium for biological materials
US20030091543A1 (en) 2001-10-26 2003-05-15 Klein Matthew B. Therapeutic cell preparation grafts and methods of use thereof
US7485307B2 (en) 2002-06-17 2009-02-03 The Regents Of The University Of Colorado Human cystathionine β-synthase variants and methods of production thereof
GB0216001D0 (en) 2002-07-10 2002-08-21 Nat Blood Authority Process and composition
EP1396537A1 (en) * 2002-09-04 2004-03-10 Avidis SA Treatment of elevated plasma homocysteine
US20050036981A1 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Shigeo Yagi USE OF PLP WITH PEG-rMETase IN VIVO FOR ENHANCED EFFICACY
CN1552905A (zh) 2003-12-18 2004-12-08 中国农业科学院茶叶研究所 一类茶树胱硫醚-γ-合成酶特异表达序列标签及其生物芯片
US8500720B2 (en) 2005-05-09 2013-08-06 Medtronic, Inc Method and apparatus for treatment of cardiac disorders
US20070010492A1 (en) 2005-07-11 2007-01-11 Generale Robert J Composition and method for reducing homocysteine caused by drugs containing methyl compounds
EP1878739A1 (en) 2006-07-14 2008-01-16 LEK Pharmaceuticals D.D. One step IMAC (MCAC) purification of proteins
JP6041454B2 (ja) * 2007-03-15 2016-12-07 株式会社 Ｄｎａセキュリティー研究所 Ｄｎａ含有インク組成物
JP5074146B2 (ja) 2007-03-30 2012-11-14 オリンパス株式会社 カプセル型医療装置
CN101322840A (zh) 2008-05-28 2008-12-17 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 一种人胱硫醚β-合成酶重组蛋白及应用
EP2470568A2 (en) 2009-08-29 2012-07-04 Abbott Laboratories Therapeutic dll4 binding proteins
WO2011097381A2 (en) 2010-02-04 2011-08-11 The Board Of Regents Of Use University Of Texas System Engineered enzymes with methionine-gamma-lyase enzymes and pharmacological preparations therof
CA2803668A1 (en) 2010-07-01 2012-01-05 Isis Innovation Limited Treatment of cognitive disorders
US9034318B2 (en) 2011-08-30 2015-05-19 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Chemically modified cystathionine beta-synthase enzyme for treatment of homocystinuria
US9243239B2 (en) 2012-03-26 2016-01-26 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Purification of cystathionine beta-synthase
US9675678B2 (en) 2013-01-29 2017-06-13 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for treatment of homocystinuria
WO2015033279A1 (en) * 2013-09-04 2015-03-12 Mahesh Kandula Compositions and methods for the treatment of homocystinuria
EP3325496B1 (en) 2015-07-24 2024-02-07 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method of preparing physiologically active polypeptide conjugate
BR112018007768A2 (pt) 2015-11-09 2018-10-23 Univ Colorado Regents composições e métodos para tratamento de homocistinúria
JP7146897B2 (ja) * 2017-04-17 2022-10-04 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイト ホモシスチン尿症の治療のための酵素補充療法の最適化
JP7002314B2 (ja) * 2017-12-13 2022-02-10 株式会社ブリヂストン 空気入りタイヤ
DK3990005T3 (da) 2019-06-26 2025-12-08 Travere Therapeutics Switzerland Gmbh Pegyleret cystathioninbetasynthase til enzymterapi til behandling af homocystinuri
EP4025243A4 (en) 2019-09-03 2023-09-27 Travere Therapeutics Switzerland GmbH CYSTATHIONINE BETA-SYNTHASE ENZYMA THERAPY FOR THE TREATMENT OF HIGH HOMOCYSTEINE LEVELS

Also Published As

Publication number Publication date
RS63070B1 (sr) 2022-04-29
PL3998067T3 (pl) 2025-01-07
HUE068830T2 (hu) 2025-01-28
US11077175B2 (en) 2021-08-03
JP7482914B2 (ja) 2024-05-14
AU2022287540A1 (en) 2023-02-02
CN115920016A (zh) 2023-04-07
EP4487914A3 (en) 2025-03-26
JP2018532763A (ja) 2018-11-08
EP3998067A1 (en) 2022-05-18
SMT202200151T1 (it) 2022-05-12
AU2022287540B2 (en) 2025-02-27
CA3001625A1 (en) 2017-05-18
KR20180074703A (ko) 2018-07-03
US20220125896A1 (en) 2022-04-28
NZ741552A (en) 2022-04-29
AU2016354030B2 (en) 2022-09-15
PT3998067T (pt) 2024-11-04
EP4487914A2 (en) 2025-01-08
EP3373922A1 (en) 2018-09-19
HK1258502A1 (en) 2019-11-15
HRP20220407T1 (hr) 2022-05-27
DK3998067T3 (da) 2024-10-28
IL302198A (en) 2023-06-01
MX2018005312A (es) 2018-08-15
HUE058749T2 (hu) 2022-09-28
LT3998067T (lt) 2024-11-25
JP2022050589A (ja) 2022-03-30
KR102819396B1 (ko) 2025-06-12
IL258487B1 (en) 2023-05-01
HRP20241491T1 (hr) 2025-01-03
US11771745B2 (en) 2023-10-03
IL258487A (en) 2018-05-31
EP3373922B1 (en) 2022-01-05
PT3373922T (pt) 2022-03-28
ES2994256T3 (en) 2025-01-21
PL3373922T3 (pl) 2022-05-02
SI3373922T1 (sl) 2022-05-31
SMT202400463T1 (it) 2025-01-14
LT3373922T (lt) 2022-04-11
EP3373922A4 (en) 2019-05-15
US20240091325A1 (en) 2024-03-21
ES2909914T3 (es) 2022-05-10
US20200276282A1 (en) 2020-09-03
DK3373922T3 (da) 2022-03-28
FI3998067T3 (fi) 2024-10-31
WO2017083327A1 (en) 2017-05-18
SI3998067T1 (sl) 2025-03-31
ZA201802376B (en) 2020-11-25
AU2016354030A1 (en) 2018-05-10
CN108472277A (zh) 2018-08-31
JP7009364B2 (ja) 2022-02-10
SG10201912972SA (en) 2020-03-30
CY1125113T1 (el) 2024-02-16
EP3998067B1 (en) 2024-09-11
BR112018007768A2 (pt) 2018-10-23
IL258487B2 (en) 2023-09-01
US12194082B2 (en) 2025-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10653755B2 (en) Compositions and methods for treatment of homocystinuria
JP7482914B2 (ja) ホモシスチン尿症の治療する組成物および方法
JP2023123565A (ja) 治療用組換えクロトータンパク質ならびにそれを含む組成物および方法
JP2019059768A (ja) ホモシスチン尿症を処置するためのシスタチオニンβ−シンターゼ酵素
RS64301B1 (sr) Rekombinantna humana kisela alfa-glukozidaza
KR20140006037A (ko) 리소좀의 산 리파제 결핍을 치료하는 방법들
HK40072007A (en) Compositions and methods for treatment of homocystinuria
HK40072007B (en) Compositions and methods for treatment of homocystinuria
EP3230308B1 (en) Methods for treating and preventing cardiomyopathy
HK1258502B (en) Compositions and methods for treatment of homocystinuria
WO2018204603A1 (en) PROPIONYL-CoA CARBOXYLASE COMPOSITIONS AND USES THEREOF