RS66062B1

RS66062B1 - Nova anti-sirpa antitela i njihove terapijske primene

Info

Publication number: RS66062B1
Application number: RS20241172A
Authority: RS
Inventors: Nicolas Poirier; Caroline Mary; Bernard Vanhove; Vanessa Gauttier; Virginie Thepenier; Sabrina Pengam
Original assignee: Ose Immunotherapeutics
Priority date: 2016-04-14
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2024-11-29
Also published as: IL262251B2; JP2022169504A; HUE068840T2; JP7549626B2; ZA201806293B; SMT202400438T1; JP2019520034A; CN115785272A; NZ746545A; PH12018550160A1; KR20180134397A; DK3443010T3; MA44665A; PH12018550160B1; SA518400237B1; MD3443010T2; FI3443010T3; US11279766B2; JP7491666B2; EP4438626A3

Description

<Opis>

<Pronalazak se odnosi na oblast imunoterapije. Ovaj pronalazak obezbeđuje nova anti-SIRPa antitela sposobna da specifično smanje interakciju između SIRPa i CD47 bez uticaja na interakciju između>SIRPg i CD47.

Ciljanje imunih kontrolnih tačaka adaptivnog imuniteta pokazalo je veliku terapeutsku efikasnost u borbi protiv brojnih karcinoma, ali u ograničenom broju pacijenata. Imunske kontrolne tačke na mijeloidnim ćelijama (makrofagi, dendritične ćelije, MDSC, PMN) ostaju slabo proučene, dok ove<ćelije predstavljaju najzastupljeniji tip imunih ćelija u mnogim solidnim tumorima i često su povezane sa lošim ishodom.>

<Regulatorni protein signala alfa ili SIRPa (takođe označen kao SIRPα, CD172a ili SHPS-1), eksprimiran je na monocitima, većini subpopulacija tkivnih makrofaga, granulocita, podgrupa dendritskih ćelija u limfoidnim tkivima, nekim progenitorskim ćelijama koštane srži i na različitim nivoima na neuronima, sa izrazito visokom ekspresijom u oblastima mozga bogatim sinapsama, kao>što su granularni sloj malog mozga i hipokampus. SIRPa je prototipski član porodice SIRP uparenihreceptora blisko povezanih SIRP proteina. Gen koji kodira humani SIRP je polimorfni gen i nekoliko varijanti je opisano u ljudskoj populaciji. Najčešće varijante proteina su SIRPa v1 i v2 (pristupni brojevi NP_542970 (P78324) i CAA71403). Polimorfizmi u humanom SIRP dovode do promena u površinski izloženim amino kiselinama, ali to ne utiče na vezivanje za CD47.

Interakcija SIRPa, izraženog u mijeloidnim ćelijama, sa sveprisutnim receptorom CD47 je važna imunološka kontrolna tačka urođenog odgovora, uključena u regulaciju mijeloidnih funkcija.

Interakcija SIRPa sa CD47 je u velikoj meri opisana i obezbeđuje signal koji inhibira fagocitozu ćelijedomaćina. CD47 je široko izražen na nižim nivoima u većini zdravih ćelija, ali je takođe prekomernoizražen u nekim ćelijama kancera. Zato, CD47 funkcioniše kao "don’t-eat-me" signal. I CD47 i SIRPa<takođe učestvuju u mnogim drugim interakcijama. Jedna od najbolje okarakterisanih fizioloških funkcija interakcije CD47-SIRPa je njena uloga u homeostazi hematopoetskih ćelija, posebno crvenih krvnih zrnaca i trombocita. Pošto CD47 služi kao "don’t-eat-me" signal i kao takav je važna>determinanta fagocitoze ćelije domaćina od strane makrofaga, potencijalni doprinos interakcijeCD47-SIRPa u čišćenju ćelija kancera intenzivno je istražen poslednjih godina. Pokazalo se da je obilje CD47 receptora u tumorima u obrnutoj korelaciji sa ukupnim preživljavanjem pacijenata i da predstavlja nepovoljan prognostički faktor za nekoliko tipova kancera.

<Put SIRPa/CD47 je danas podložan različitim farmaceutskim razvojima da bi se poboljšala fagocitoza makrofaga. U stvari, kao i zaražene ćelije, ćelije kancera nose aberantni teret kao što su nepoznati proteini ili normalni proteini na abnormalnim nivoima, ali ove ćelije često podrivaju mehanizme urođene imunološke kontrole istovremenom prekomernom ekspresijom>imunoregulatornih molekula. Postaje jasno da jedan takav mehanizam uključuje CD47, protein od "self" koji eksprimiraju normalne ćelije. CD47 stupa u interakciju sa SIRPa i dovodi do prenošenja signala „don’t eat me“ do fagocitnih makrofaga, koji zatim ostavljaju ciljne ćelije netaknutim.

Prekomerna ekspresija CD47 od strane ćelija kancera čini ih otpornim na makrofage, čak i kada sućelije kancera obložene terapeutskim antitelima, i korelira sa lošim kliničkim ishodima kod brojnih<čvrstih i hematoloških kancera. U eksperimentalnim modelima, posebno modelima humanog tumor ksenografta kod imunodeficijentnih miševa, blokada CD47/SIRPa puta preko agenasa koji ciljaju na CD47 bila je veoma efikasna za promovisanje eliminacije tumora pomoću makrofaga i za smanjenje>diseminacije ćelija kancera i formiranje metastaza. Blokada CD47/SIRPa puta preko agenasa kojiciljaju CD47, povećanjem fagocitoze zavisne od antitela od strane makrofaga, opisana je kao sinergizam sa iscrpljujućim terapijskim antitumorskim antitelima kao što su Trastuzumab (anti-Her2), Cetuksimab (anti-EGFR), Rituksimab (anti-CD20) i Alemtuzumab (anti-CD52).

<Međutim, nedavno je pokazano da agensi koji ciljaju CD47 (anti CD47 ili SIRPa-Fc) predstavljaju>hematološku toksičnost (anemija ili trombocitopenija) u vezi sa fiziološkom ulogom CD47.

Osim toga, CD47 se takođe povezuje sa drugim članom SIRP porodice, SIRP-gama (takođe<označenim kao SIRPg, SIRPγ, CD172g ili SIRP beta 2) koji je prisutan na površini ljudskih T ćelija, a ne na ljudskim mijeloidnim ćelijama. SIRPg je rezultat duplikacije SIRPb gena kod primata starog>sveta pre skoro 35 miliona godina i eksprimiran je na ograničen način na T limfocitima za razlikuod ekspresije SIRPa na mijeloidnim ćelijama. SIRPg je odsutan kod miševa. Pokazalo se da interakcija SIRPg-CD47 posreduje u adheziji ćelija-ćelija, pojačava proliferaciju posredovanu od T-<ćelija zavisnu od superantigena i kostimuliše aktivaciju T-ćelija (Piccio et al., Blood, 105:6, 2005). Zbog velike sličnosti sekvenci između SIRPa i SIRPg, posebno u regionu koji je u interakciji sa CD47, anti-SIRPa antitela otkrivena u prethodnom stanju tehnike takođe vezuju SIRPg i imaju neželjene efekte kod ljudi kao što je inhibicija proliferacije T -ćelije i smanjenje imunološkog odgovora.>

<Zato, u stanju tehnike ostaje značajna potreba za novim i poboljšanim agensima, posebno antitelima, za bezbednu imunoterapiju, posebno protiv kancera, koja cilja na urođene imune ćelije>bez štetnog uticaja na imune odgovore T ćelija. Konkretno, postoji potreba za inhibicijom interakcije SIRPa-CD47 bez uticaja na interakciju SIRPg-CD47. Ovi pronalazači su napravili značajan korak napred sa pronalaskom koji je ovde otkriven.

Anti-SIRPa antitela su obezbeđena u prethodnom stanju tehnike, na primer u Lee et al. (Journal of Immunology, 2007), Hatherley et al. ili Liu et al. Anti-SIRPa antitela otkrivena u prethodnom stanju tehnike pokazuju sposobnost vezivanja za druge članove SIRP porodice proteina, uključujući SIRPb i SIRPg. Sa ciljem da se obezbede antitela korisna u terapiji, anti-SIRPa antitela koja utiču na drugi put osim CD47/SIRPa puta mogu imati štetne efekte, na primer na ukupni imuni odgovor. Svrhapronalaska je da ispuni ovu potrebu obezbeđivanjem novih agenasa, posebno antitela, koji<omogućavaju da se u celini ili delimično reše gore navedeni problemi.>

<Ovde, pronalazači obezbeđuju nova anti-SIRPa antitela, posebno humanizovana antitela, koja antagonizuju SIRPa-CD47 interakciju, ali ne vezuju specifično SIRPg i, prema tome, ne utiču na interakciju SIRPg-CD47.>

<- Izbegavaju hematološku toksičnost zbog ograničene ekspresije SIRPa (bez vezivanja za ljudske crvene krvne ćelije (RBC) i trombocite);>

<- Smanjuju rast tumora i modifikuju tumorsko mikrookruženje u monoterapiji;>

<- Predstavljaju sinergijski efekat sa inhibitorima kontrolnih tačaka i kostimulatornim agensima; - Indukuju izdržljive i robusne antitumorske memorijske T limfocitne odgovore;>

- Omogućavaju imunološke odgovore T ćelija, budući da su selektivni antagonisti interakcije SIRPa-CD47, ne remeteći interakciju CD47/SIRPg. Neočekivano, pronalazači obezbeđuju takva selektivna antitela uprkos visokoj identičnosti sekvenci između SIRPa i SIRPg sekvenci.

Ova nova antitela odabrana na osnovu ovih karakteristika su posebno obećavajuća za brojne terapeutske primene, posebno za lečenje kancera uključujući inflamatorne karcinome i karcinome sa infiltriranim mijeloidnim ćelijama (posebno sa infiltriranim MDSC i/ili TAM ćelijama).

Ovaj pronalazak se odnosi na anti-humano SIRP antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, koji sadrži:

- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 i SEQ ID NO: 30, i

- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 33.

Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi korišćeni ovde imaju isto značenje koje su obično razumljiva stručnjacima iz relevantne oblasti stanja tehnike.

Radi praktičnosti, dato je značenje određenih izraza i fraza upotrebljenih u specifikaciji, primerima i zahtevima.

Kako se ovde koristi, izraz "antitelo" obuhvata poliklonska antitela, monoklonska antitela ili rekombinantna antitela.

<Antitela ovog pronalaska uključuju rekombinantna antitela. Kako se ovde koristi, izraz "rekombinantno antitelo" se odnosi na antitela koja su proizvedena, eksprimirana, generisana ili izolovana rekombinantnim sredstvima, kao što su antitela koja se eksprimiraju korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćina; antitela izolovana iz biblioteke rekombinantnih kombinatornih antitela; antitela izolovana od životinje (npr. miša) koja su transgena zbog humanih imunoglobulinskih gena; ili antitela koja se proizvode, eksprimiraju, generišu ili izoluju na bilo koji drugi način na koji se određene sekvence gena imunoglobulina (kao>što su sekvence humanog imunoglobulinskog gena) sklapaju sa drugim sekvencama DNK.

Rekombinantna antitela uključuju, na primer, himerna i humanizovana antitela.

Kako se ovde koristi, "himerično antitelo" se odnosi na antitelo u kome je sekvenca varijabilnog domena izvedena iz zametne linije vrste sisara, kao što je miš, graftovano na sekvencu konstantnog domena izvedena iz zametne linije druga vrsta sisara, kao što je čovek.

Kako se ovde koristi, "humanizovano antitelo" se odnosi na antitelo u kome su CDR sekvence izvedene iz zametne linije druge vrste sisara, kao što je miš, graftovane na sekvence ljudskog okvira. Kako se ovde koristi, "fragment antitela koji se vezuje za antigen" označava deo antitela, tj. molekul koji odgovara delu strukture antitela prema pronalasku, koji pokazuje kapacitet vezivanja antigena za SIRPa, verovatno u svom izvornom obliku; takav fragment posebno pokazuje istu ili suštinski istu specifičnost vezivanja antigena za navedeni antigen u poređenju sa specifičnošću vezivanja antigena odgovarajućeg četvorolančanog antitela. Povoljno, fragmenti koji se vezuju za antigen imaju sličan afinitet vezivanja kao i odgovarajuća 4-lančana antitela. Međutim, fragmenti koji se vezuju za antigen koji imaju smanjeni afinitet za vezivanje antigena u odnosu na odgovarajuća 4-<lančana antitela su takođe obuhvaćeni pronalaskom. Kapacitet vezivanja antigena može se odrediti merenjem afiniteta između antitela i ciljnog fragmenta. Ovi fragmenti koji se vezuju za antigen mogu se takođe označiti kao "funkcionalni fragmenti" antitela.>

<Fragmenti antitela koji se vezuju za antigen su fragmenti koji sadrže njihove hipervarijabilne domene označene CDR (Komplementarni Determinativni Regioni) ili njihov deo(ove) koji obuhvata>mesto prepoznavanja antigena, tj. ekstracelularni domen SIRPa, čime se definiše specifičnost prepoznavanja antigena.

Svaki varijabilni domen lakog i teškog lanca (odnosno VL i VH) četvorolančanog imunoglobulina ima tri CDR-a, označena kao VL-CDR1 (ili LCDR1), VL-CDR2 (ili LCDR2), VL-CDR3 (ili LCDR3) i VH-CDR1 (ili HCDR1), VH-CDR2 (ili HCDR2), VH-CDR3 (ili HCDR3), respektivno.

<Stručnjak je u stanju da odredi lokaciju različitih regiona/domena antitela pozivajući se na standardne definicije u ovom pogledu, uključujući referentni sistem numerisanja, referencu na>sistem numerisanja KABAT ili primenom IMGT „collier de perle" algoritma. U tom pogledu, zadefiniciju sekvenci pronalaska, primećuje se da razgraničenje regiona/domena može da varira od jednog referentnog sistema do drugog. Shodno tome, regioni/domeni kao što su definisani u ovom<pronalasku obuhvataju sekvence koje pokazuju varijacije u dužini ili lokalizaciji dotičnih sekvenci unutar sekvence pune dužine varijabilnih domena antitela, od približno /- 10%.>

<Na osnovu strukture četvorolančanih imunoglobulina, fragmenti koji se vezuju za antigen mogu se tako definisati poređenjem sa sekvencama antitela u dostupnim bazama podataka i prethodnom stanju tehnike, a posebno poređenjem lokacije funkcionalnih domena u ovim sekvencama, uz napomenu da položaji okvira i konstantni domeni su dobro definisani za različite klase antitela,>posebno za IgG, posebno za IgG sisara. Takvo poređenje takođe uključuje podatke koji se odnose na 3-dimenzionalne strukture antitela.

Za svrhu ilustracije specifičnih izvođenja pronalaska, fragmenti antitela koji se vezuju za antigen koji sadrže varijabilne domene koji sadrže CDR pomenutog antitela obuhvataju Fv, dsFv, scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2. Fv fragmenti se sastoje od VL i VH domena antitela povezanih hidrofobnim interakcijama; u dsFv fragmentima, VH:VL heterodimer je stabilizovan disulfidnom vezom; u scFv fragmentima, VL i VH domeni su povezani jedan sa drugim preko fleksibilnog peptidnog linkera<formirajući tako jednolančani protein. Fab fragmenti su monomerni fragmenti koji se mogu dobiti digestijom antitela papainom; oni obuhvataju ceo L lanac i VH-CH1 fragment H lanca, koji su zajedno povezani disulfidnom vezom. F(ab’)2 fragment se može proizvesti razgradnjom pepsina>antitela ispod zglobnog disulfida; sadrži dva Fab’ fragmenta, i dodatno deo zglobnog regionamolekula imunoglobulina. Fab’ fragmenti se mogu dobiti od F(ab’)2 fragmenata presecanjem disulfidne veze u zglobnom regionu. F(ab’)2 fragmenti su dvovalentni, tj. obuhvataju dva mesta vezivanja antigena, poput nativnog molekula imunoglobulina; s druge strane, Fv (VHVL dimmer koji<čini varijabilni deo Fab), dsFv, scFv, Fab i Fab’ fragmenti su monovalentni, odnosno sadrže jedno mesto za vezivanje antigena. Ovi osnovni antigen-vezujući fragmenti pronalaska mogu se kombinovati zajedno da bi se dobili multivalentni antigen vezujući fragmenti, kao što su dijatela, tritela ili tetratela. Ovi multivalentni fragmenti koji vezuju antigen takođe su deo ovog pronalaska.>Kako se ovde koristi, izraz "bispecifična" antitela se odnosi na antitela koja prepoznaju dva različita antigena na osnovu toga što poseduju najmanje jedan region (npr. izveden iz varijabilnog regiona prvog antitela) koji je specifičan za prvi antigen, i najmanje drugi region (npr. izveden iz varijabilnog regiona drugog antitela) koji je specifičan za drugi antigen. Bispecifično antitelo se<specifično vezuje za dva ciljna antigena i zato je jedan tip multispecifičnog antitela. Multispecifična antitela, koja prepoznaju dva ili više različitih antigena, mogu se proizvesti metodama rekombinantne DNK ili uključuju, ali nisu ograničena na, antitela proizvedena hemijski bilo kojim pogodnim metodom. Bispecifična antitela obuhvataju sva antitela ili konjugate antitela, ili polimerne oblike antitela koji su sposobni da prepoznaju dva različita antigena. Bispecifična antitela obuhvataju antitela koja su redukovana i reformisana tako da zadrže svoje bivalentne karakteristike i antitela koja su hemijski spojena tako da mogu imati nekoliko mesta za prepoznavanje antigena za svaki antigen, kao što su BiME (antitela za poboljšanje bispecifičnih>makrofaga), BiTE (bispecifični angažeri T ćelija), DART (retargetiranje sa dvostrukim afinitetom); DNL (dock-and-lock), DVD-Ig (imunoglobulini sa dvostrukim varijabilnim domenom), HAS (humani serum albumin), kih (knobes into holes).

Nekoliko istraživanja za razvoj terapeutskih antitela dovelo je do projektovanja Fc regiona za optimizaciju svojstava antitela omogućavajući stvaranje molekula koji su bolje prilagođeni farmakološkoj aktivnosti koja se od njih zahteva. Fc region antitela posreduje u njegovom poluživotu u serumu i efektorskim funkcijama, kao što su citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC), ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) i ćelijska fagocitoza zavisna od antitela<(ADCP). Pokazalo se da nekoliko mutacija lociranih na interfejsu između CH2 i CH3 domena, kao što su T250Q/M428L i M252Y/S254T/T256E H433K/N434F, povećavaju afinitet vezivanja za FcRn i poluživot IgG1 in vivo. Međutim, ne postoji uvek direktna veza između povećanog vezivanja FcRn i>poboljšanog poluživota. Jedan pristup za poboljšanje efikasnosti terapeutskog antitela je povećanjenjegove serumske perzistentnosti, čime se omogućavaju viši nivoi u cirkulaciji, ređa primena i smanjene doze. Inženjerski Fc regioni mogu biti poželjni za smanjenje ili povećanje efektorske funkcije antitela. Za antitela koja ciljaju na molekule na površini ćelije, posebno na one na imunim<ćelijama, potrebno je ukidanje efektorskih funkcija. Nasuprot tome, za antitela namenjena za onkologiju, povećanje efektorskih funkcija može poboljšati terapeutsku aktivnost. Četiri humana IgG izotipa vezuju aktivirajuće Fcγ receptore (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa), inhibitorni FcγRIIb receptor i prvu komponentu komplementa (C1q) sa različitim afinitetima, dajući veoma različite efektorske funkcije. Vezivanje IgG za FcγRs ili C1q zavisi od ostataka koji se nalaze u zglobnom regionu i CH2 domenu. Dva regiona CH2 domena su kritična za vezivanje FcγRs i C1q i imaju jedinstvene sekvence u IgG2 i IgG4.>

<Kako se ovde koristi, "modifikovano antitelo" odgovara molekulu koji sadrži antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu je pomenuto monoklonsko antitelo ili njegov funkcionalni fragment povezan sa funkcionalno različitim molekulom. Modifikovano antitelo>pronalaska može biti ili fuzioni himerni protein ili konjugat koji je rezultat bilo kog pogodnog oblika vezivanja uključujući kovalentno vezivanje, graftovanjem, hemijsko vezivanje sa hemijskom ili biološkom grupom ili sa molekulom, kao što je PEG polimer ili drugi zaštitni grupa ili molekul pogodan za zaštitu od cepanja proteaza in vivo, za poboljšanje stabilnosti i/ili poluživota antitela ili funkcionalnog fragmenta. Sa sličnim tehnikama, posebno hemijskim spajanjem ili graftovanjem, modifikovano antitelo se može pripremiti sa biološki aktivnim molekulom, pri čemu se navedeni aktivni molekul bira na primer između toksina, posebno egzotoksina Pseudomonas A, A-lanca biljnog toksina ricina ili toksina saporina, posebno terapeutski aktivni sastojak, vektor (uključujući posebno proteinski vektor) pogodan za ciljanje antitela ili funkcionalnog fragmenta na specifične<ćelije ili tkiva ljudskog tela, ili može biti povezan sa oznakom ili sa linkerom, posebno kada su fragmenti antitela se koriste. PEGilacija antitela ili njegovih funkcionalnih fragmenata je posebno zanimljivo izvođenje jer poboljšava uslove isporuke aktivne supstance domaćinu, posebno za terapeutsku primenu. PEGilacija može biti specifična za mesto da bi se sprečila interferencija sa mestima prepoznavanja antitela ili funkcionalnih fragmenata, i može se izvesti sa PEG-om visoke molekulske težine. PEGilacija se može postići preko slobodnih cisteinskih ostataka prisutnih u>sekvenci antitela ili funkcionalnog fragmenta ili preko dodatih slobodnih ostataka Cisteina u amino sekvenci antitela ili funkcionalnog fragmenta.

Makromolekuli iz opisa obuhvataju antitela i njihove fragmente, ali takođe sadrže veštačke proteine, peptide i bilo koja hemijska jedinjenja sa sposobnošću da vezuju antigene koji oponašaju antitela, koja se ovde takođe nazivaju mimetikom antitela za vezivanje antigena. Takvi proteini se sastoje od afinina i antitikalina. Afitini su veštački proteini sa sposobnošću da selektivno vezuju antigene. Oni su strukturno izvedeni iz DNK vezujućeg proteina Sac7d, pronađenog u Sulfolobusacidocaldarius, mikroorganizmu koji pripada arhealnom domenu. Nasumičnim odabiranjemaminokiselina na površini vezivanja Sac7d, npr. generisanjem varijanti koje odgovaraju<nasumičnim supstitucijama 11 ostataka vezujućeg interfejsa Sac7d, može se stvoriti biblioteka afiniteta i podvrgavanjem rezultujuće biblioteke proteina krugovima prikaza ribozoma, afinitet se>može usmeriti ka različitim ciljevima, kao što su peptidi, proteini, virusi i bakterije. Afitini sumimetici antitela i razvijaju se kao alati u biotehnologiji. Takođe su korišćeni kao specifični inhibitori za različite enzime (Krehenbrink et al., J. mol. Biol., 383:5, 2008). Stručnjak može lako da<razvije antitikaline sa potrebnim svojstvima vezivanja koristeći metode poznate u tehnici, posebno kao što je otkriveno u patentnoj prijavi WO2008068637 i gore citiranoj publikaciji, posebno stvaranje biblioteka za prikaz faga i/ili ribozoma i njihov skrining korišćenjem antigena kako je ovde otkriveno. Antikalini su veštački proteini koji su u stanju da se vežu za antigene, bilo za>proteine ili male molekule. Oni su mimetici antitela izvedeni iz humanih lipokalina koji su porodica prirodno vezujućih proteina. Antikalini su oko osam puta manji sa veličinom od oko 180 aminokiselina i masom od oko 20 kDa (Skerra, Febs J., 275:11, 2008). Generisane su biblioteke za prikaz antitikalina faga koje omogućavaju skrining i selekciju, posebno antitikalina sa specifičnim svojstvima vezivanja. Stručnjak može lako razviti afinite sa potrebnim svojstvima vezivanja<koristeći metode poznate u stanju tehnike, posebno kao što je otkriveno u EP patentu EP1270725>B1, US patentu US8536307 B2, (Schlehuber and Skerra, Biophys. Chem., 96:2-3, 2002) i gorecitiranoj publikaciji, posebno stvaranje biblioteka za prikaz faga i/ili ribozoma i njihov skrining<korišćenjem antigena kako je ovde otkriveno. I antikalini i afiniti mogu se proizvesti u brojnim ekspresionim sistemima koji sadrže sisteme ekspresije bakterija. Dakle, opis pruža afinine, antitikaline i druge slične mimetike antitela sa karakteristikama ovde opisanih antitela, posebno u vezi sa vezivanjem za SIRPa, inhibicijom interakcije između SIRPa i CD47, nevezivanje za SIRPg,>nevezivanje za T ćelije, neinhibicija proliferacije T ćelija, neinhibicija interakcije između SIRPg i CD47, od kojih se svi smatraju makromolekulima pronalaska.

Sve varijante koje su ovde otkrivene za antitela ili njihove fragmente transponovane su mutatis<mutandis na makromolekule iz opisa, posebno na mimetike antitela koji se vezuju za antigen.>

<U opisu je otkriveno anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za najmanje dva, tri, četiri ili pet peptida>koji sadrže ili se sastoje od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 2 (G/ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) i SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) unutar SIRPa.

U jednom izvođenju, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za peptid koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T] E) unutar SIRPa i za najmanje jedan peptid koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 2 (G/ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) i SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) unutar SIRPa.

U jednom izvođenju, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za peptide koji sadrže ili se sastoje od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 2 (G/ARELIYNQKEGH),<SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) i SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) unutar SIRPa.>

<U jednom izvođenju, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za najmanje jedan peptid koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 9 (ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 10 (KFRKGSPDTE), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) i SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE). U jednom izvođenju, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano koje se specifično vezuje za>peptide SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 9 (ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 10 (KFRKGSPDTE), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) i SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) unutar SIRPa.

U jednom izvođenju, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za najmanje jedan peptid koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 11 (GRELIYN), DVE, SEQ ID NO: 12 (HTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) i SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) unutar SIRPa.

U jednom izvođenju, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano koje se specifično vezuje za peptide SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 11 (GRELIYN), DVE, SEQ ID NO: 12 (HTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) i SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) unutar SIRPa.

U jednom izvođenju, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za najmanje jedan peptid koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 13 (ARELIYN), SEQ ID NO: 12 (HTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) i SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) unutar SIRPa.

U jednom izvođenju, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano koje se specifično vezuje za peptide SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 13 (ARELIYN), SEQ ID NO: 12<(HTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) i SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) unutar SIRPa.>

<Ove linearne epitope su pronalazači identifikovali skeniranjem oligopeptida zasnovanim na nizu>(ponekad se naziva skeniranje preklapajućih peptida ili pepscan analiza). Ova tehnika koristi biblioteku oligo-peptidnih sekvenci iz preklapajućih i nepreklapajućih segmenata ciljnog proteina i testira njihovu sposobnost da vežu antitelo od interesa. Kombinovanjem nesusednih peptidnih sekvenci iz različitih delova ciljnog proteina i sprovođenjem konformacione rigidnosti na ovaj kombinovani peptid (kao što je korišćenje CLIPS skela) (Timmerman et al., 2007, J Mol Recognit., Sep-Oct; 20(5): 283-99), diskontinuirani epitopi se mogu mapirati sa veoma visokom pouzdanošću i<preciznošću (Gaseitsiwe et al., 2010 – Clin Vaccine Immunol. Jan; 17(1): 168-175). Sva testirana antitela pronalaska, uključujući HEFLB, specifično se vezuju za navedene epitope.>

mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano koje se specifično vezuje za konformacioni epitop koji sadrži ili se sastoji od peptida SEQ ID NO: 70 (ELIYNKKEGHFPR) i SEQ ID NO: 71 (RNNMDFSIRIGN) unutar SIRPa.

U jednom aspektu, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano koje se specifično vezuje za konformacioni epitop koji sadrži najmanje jedan peptid izabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 73 (YNQK) i „SIR“ u okviru SIRPa.

U jednoj realizaciji, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano koje se specifično vezuje za konformacioni epitop koji sadrži ili se sastoji od peptida aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 73 (YNQK) i peptid sekvence aminokiselina SIR unutar SIRPa.

Peptidi SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 i SIRP odgovaraju konformacionim epitopima. Ove konformacione epitope su odredili pronalazači koristeći procedure zaštite od proteolize (enzimska digestija: himotripsin, tripsin kompleksa antitelo-antigen imobilisan afinitetnom hromatografijom) nakon analize masene spektrometrije (MALDI TOF/TOF)<da bi se otkrili i sekvencionirali takvi peptidi od interesa , kao što je dobro poznato stručnjaku (Van de Water et al., Clinical Immunology and Immunopathology, 1997, vol.85). Korišćeni antigen je bio humani SIRPa (pristupni brojevi NP_542970), a jedno od korišćenih antitela pronalaska bila je varijanta HEFLB.>

<Anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela za vezivanje antigena prema pronalasku specifično vezuju pomenute konformacione epitope koji sadrže ili se sastoje od navedenih peptida u njihovom konformacionom rasporedu unutar nativnog SIRPa. Peptid aminokiselinske sekvence prikazan u SEQ ID NO: 73 (YNQK) odgovara peptidu koji se sastoji>od aminokiselina na pozicijama 80 do 83 u humanoj sekvenci aminokiselina SIRPa na koju upućuje pristupni broj NP_542970.

Peptid SIR sekvence aminokiselina, SIR peptid, odgovara peptidu koji se sastoji od aminokiselina na pozicijama od 105 do 107 u humanoj sekvenci aminokiselina SIRPa na koju se poziva pristupni broj NP_542970.

Kako se ovde koristi, izraz "SIRPa" se odnosi na SIRPa protein iz vrste sisara, poželjno humani SIRPa (npr. pristupni brojevi NP_542970 (P78324) i CAA71403).

Kako se ovde koristi, izraz "anti-SIRPa antitelo" se odnosi na antitelo koje se specifično vezuje za SIRPa, posebno za humani SIRPa.

<Specifično vezivanje između antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema pronalasku i epitopa (ili regiona koji sadrži epitop) implicira da antitelo pokazuje značajan afinitet>za epitop (region koji sadrži epitop) na određeni protein ili antigen (ovde SIRPa). "Primetan afinitet" uključuje vezivanje sa afinitetom od oko 10-9 M (KD) ili jačim. Poželjno, vezivanje se smatra<specifičnim kada je afinitet vezivanja između 10-9 M i 10-12 M, opciono između 10-9 M i 10-10 M, posebno 10-10 M. Da li domen vezivanja specifično reaguje sa ili se vezuje na cilj se može lako testirati, između ostalog, upoređivanjem reakcije pomenutog vezujućeg domena sa ciljnim proteinom ili antigenom sa reakcijom navedenog vezujućeg domena sa proteinima ili antigenima koji nisu ciljni protein.>

vrednost KD nižu od 10<-9>M, poželjno inferiornu od 10<-10>M za SIRPa, poželjnije inferiorno u odnosu na 1.10-11 M, posebno prema Biacore Analysis.

U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano koje smanjuje interakciju između SIRPa i CD47.

U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antitelo kao što je gore definisano da delimično ili potpuno, posebno u potpunosti, inhibira vezivanje CD47 za SIRPa, posebno humanog CD47 za humani SIRPa.

Takvo antitelo pronalaska specifično vezuje SIRPa i antagonizuje interakciju između SIRPa i CD47.

<Konkretno, anti-SIRPa antagonističko antitelo pronalaska je sposobno da smanji ili inhibira vezivanje CD47 za SIRPa za najmanje 50%, 60%, 70%, poželjno 80%, poželjnije 90% ili najpoželjnije 100%, u poređenju sa negativnim kontrolnim molekulom, u ogledu vezivanja.>

<Konkretno, anti-SIRPa antagonističko antitelo pronalaska je sposobno da smanji ili inhibira vezivanje CD47 za SIRPa za od 50% do 100%, poželjno od 60% do 90%, poželjnije od 70% do 80%, kao u poređenju sa negativnim kontrolnim molekulom, u ogledu vezivanja.>

<Metode za određivanje specifičnosti i afiniteta antitela putem kompetitivne inhibicije su poznate u>tehnici (videti, npr., Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Colligan et al., Current Protocols in Immunology, Green Publishing Assoc., NY (1992; 1993), Muller, Meth. Enzym., 92:589-601 (1983)) i opisane u primerima ispod.

Ove metode uključuju, ali nisu ograničene na, Biacore Analysis, Blitz analysis, protočnu citometriju i ELISA test.

U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo kako je gore definisano koje ima IC50 niži od 500 ng/ml, posebno niži od 400 ng/ml, 300 ng/ml, tačnije niži od 200 ng/ml, kao što je<određeno u kompetitivnom testu vezivanja SIRPa između CD47 i anti-SIRPa antitela pomoću ELISA. U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo kako je gore definisano koje ima IC50 niži od 500 ng/ml, posebno niži od 400 ng/ml, 300 ng/ml, tačnije niži od 200 ng/ml, niže od>150 ng/ml i još preciznije niže od 100 ng/ml kao što je određeno testom kompetitivne citometrije na humanim monocitima između CD47 i anti-SIRPa antitela.

U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela za vezivanje antigena kao što je gore definisano, a koje se ne vezuje<specifično za SIRPg, poželjno za humani SIRPg.>

U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antitelo kao što je gore definisano koje ima KD vrednost superiornu od 10-9 M, poželjno superiornu od 10-8 M, poželjnije superiorniji od 10-7 M za SIRPg, posebno sa Blitz analisys.

U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano koje ne inhibira<značajno, antagonizuje vezivanje CD47 za SIRP-g, koji se značajno ne takmiči sa vezivanjem CD47 za>SIRPg.

Ovaj antagonistički efekat se može odrediti korišćenjem metoda koje su definisane u primerima prijave.

<U pronalasku, može se smatrati da antitelo (ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen) ne antagonizuje vezivanje CD47 za SIRPg ako navedeno antitelo (ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen) ne indukuje povećanje, ili indukuje povećanje inferiorno od 1 log, KD vrednosti CD47 u kompetitivnom>testu vezivanja SIRPg od strane Blitz.

U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela za vezivanje antigena kao što je gore definisano koje se ne vezuje<specifično za T-ćelije, posebno za CD3+ T-ćelije.>

<Konkretno, anti- SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen pronalaska se ne vezuje za T-ćelije iz vrsta sisara, posebno za humane T-ćelije. Konkretno, smatra se da se anti-SIRPa antitelo (ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen) ne vezuje specifično za humane T ćelije ako, u populaciji humanih T ćelija izolovanih iz PBMC od zdravog donora, manje od 10%, poželjno manje od 5%,>poželjnije manje od 2%, najpoželjnije manje od 1% populacije humanih T ćelija prepoznaje pomenuto anti-SIRPa antitelo (ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen).

Ovaj efekat se može meriti metodama koje su opisane u primerima ove prijave. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano koje ne inhibira značajno proliferaciju T-<ćelija, posebno CD3+ T ćelija, poželjno od vrsta sisara i poželjnije od humanih T ćelija.>

Konkretno, smatra se da anti-SIRPa antitelo ne inhibira značajno proliferaciju T-ćelija ako jeproliferacija T-ćelija smanjena za manje od 30%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10%,<većina poželjno manje od 5% u poređenju sa negativnom kontrolom.>

U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano koje ne inhibira<značajno, antagonizuje vezivanje proteina surfaktanta za SIRP-a, koji ne značajno se takmiče sa vezivanjem proteina surfaktanta za SIRPa.>

Kako se ovde koristi, izraz "protein surfaktanta" se odnosi na surfaktantni protein iz vrste sisara, poželjno humani surfaktant protein.

U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano koje ne inhibira vezivanje humanog surfaktantnog proteina D (SP-D) za SIRPa.

za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano koje ne antagonizuje interakciju između proteina surfaktanta i SIRPa.

Kompeticija između SIRPa i proteina surfaktanta može se odrediti kompetitivnim testomkorišćenjem metoda koje su dobro poznate stručnjaku u oblasti. Ove metode uključuju, ali nisu<ograničene na, Biacore Analysis, Blitz analysis i ELISA test.>

U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano koje ima KD vrednost superiornu od 10-9 M, poželjno superiornu od 10-8 M za SIRPb, u posebno Blitz analizom. U sadašnjem opisu, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano, a koje obuhvata:

a) teški lanac koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3, i/ili

b) laki lanac koji se sastoji od LCDR1, LCDR2 i LCDR3,

pri čemu su navedeni CDR-ovi definisani na sledeći način:

- HCDR1 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 14 (SYWVH), - HCDR2 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 15 (NIDPSDSDTHYNQKFKD) ili SEQ ID NO: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG),

- HCDR3 koji sadrži ili se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO: 17 (GGTGTMAWFAY) SEQ ID NO: 18 (GGTGTLAWFAY), SEQ ID NO: 19 (GGTGTMAYFAY) ili SEQ ID NO: 20 (GGTGTLAYFAY),

- LCDR1 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 21

(RSSQSLVHSYGNTYLY),

<- LCDR2 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 22>

<(RVSNRFS), i>

<- LCDR3 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 23>

(FQGTHVPYT).

<18D5 / Varijanta A /Varijanta B>

<a) teški lanac koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3, i/ili>

<b) laki lanac koji se sastoji od LCDR1, LCDR2 i LCDR3,>

<- HCDR1 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 14 (SYWVH),>- HCDR2 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 15

(NIDPSDSDTHYNQKFKD),

- HCDR3 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 17

(GGTGTMAWFAY),

(RSSQSLVHSYGNTYLY),

- LCDR2 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 22

(RVSNRFS), i

- LCDR3 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 23

(FQGTHVPYT).

<a) teški lanac koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3, i/ili>

<b) laki lanac koji se sastoji od LCDR1, LCDR2 i LCDR3,>

- HCDR1 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 14 (SYWVH), - HCDR2 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 16

(NIDPSDSDTHYSPSFQG),

(GGTGTMAWFAY),

(RSSQSLVHSYGNTYLY),

(RVSNRFS), i

(FQGTHVPYT).

<a) teški lanac koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3, i/ili>

<b) laki lanac koji se sastoji od LCDR1, LCDR2 i LCDR3,>

<- HCDR1 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 14 (SYWVH),>- HCDR2 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 16

(NIDPSDSDTHYSPSFQG),

- HCDR3 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 18

(GGTGTLAWFAY),

(RSSQSLVHSYGNTYLY),

(RVSNRFS), i

(FQGTHVPYT).

<a) teški lanac koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3, i/ili>

<b) laki lanac koji se sastoji od LCDR1, LCDR2 i LCDR3,>

(NIDPSDSDTHYSPSFQG),

- HCDR3 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 19

(GGTGTMAYFAY),

(RSSQSLVHSYGNTYLY),

(RVSNRFS), i

(FQGTHVPYT).

<a) teški lanac koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3, i/ili>

<b) laki lanac koji se sastoji od LCDR1, LCDR2 i LCDR3,>

<- HCDR1 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 14 (SYWVH), - HCDR2 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG),>

<- HCDR3 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 20>(GGTGTLAYFAY),

- LCDR1 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY),

- LCDR2 koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 22 (RVSNRFS), i

(FQGTHVPYT).

Takva anti-SIRPa antitela mogu imati varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu HCDR1 i/ili HCDR2 i/ili HCDR3 humanih antitela kao što je ovde dato; i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu LCDR1 i/ili LCDR2 i/ili LCDR3 humanih antitela kao što je ovde dato.

Takvo antitelo može sadržati varijantu aminokiselinske sekvence jednog ili više CDR-ova<obezbeđenih humanih antitela, koja varijanta sadrži jednu ili više aminokiselinskih umetanja unutar ili pored CDR ostatka i/ili delecija(e) unutar ili u blizini CDR ostatka i/ili supstitucije(a) CDR ostatka(a) (sa supstitucijom(ama) koja je poželjan tip aminokiselinske alteracije za generisanje takvih varijanti).>

U sadašnjem opisu, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antigen-vezujućeg antitela kao što je gore definisano, a koje obuhvata:

- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane<između SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 i SEQ ID NO: 30, i/ili>

<- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz>grupe koju čine SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 i SEQ ID NO: 33.

<- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 i SEQ ID NO: 30, i>

<- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 i SEQ ID NO: 33.>

Sekvence specifičnih varijabilnih domena date su u Tabeli 1 ispod.

<(nastavak)>

Sekvence varijabilnih domena antitela prikazanih kao primer u ovom pronalasku mogu se zaključitiiz kombinacija sekvenci prikazanih u Tabeli 2.

<Tabela 2. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca specifičnih antitela prema>pronalasku.

<- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 33, i>

<- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 i SEQ ID NO: 30.>

<- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 29 i SEQ ID NO: 30,>

<poželjnije>

<- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 30,>

- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 24, i

- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 31,

ili

- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 25, i

- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 32,

ili

- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 33,

ili

- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 26, i

ili

<- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 33,>

<ili>

<- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 27, i>

<- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 32,>

<ili>

<- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 33, koji je deo pronalaska,>

<ili>

<- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 28, i>

<ili>

<- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene>u SEQ ID NO: 29, i

ili

- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 29, i

- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 33, koji je deo pronalaska,

ili

- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 30, i

ili

- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 33, koji je deo pronalaska.

U ovom opisu je otkriveno da antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen nema supstituciju amino kiseline W na poziciji 33 (W33) u varijabilnom domenu teškog lanca, pri čemu je navedena pozicija identifikovana u odnosu na SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 ili SEQ ID NO: 30, i/ili bez<supstitucije aminokiselina Y na poziciji 39 (Y39), R na poziciji 55 (R55) i/ili F na poziciji 60 (F60) u varijabilnom domenu lakog lanca, pri čemu su navedene pozicije identifikovane u odnosu na SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 ili SEQ ID: 33, posebno nema supstituciju na poziciji W33 u varijabilnom domenu teškog lanca i nema supstituciju na pozicijama Y39, R55 i F60 u varijabilnom domenu lakog lanca.>

<U pronalasku, antitela se mogu proizvesti sa bilo kojim konstantnim domenima teškog i lakog lanca. U jednom aspektu, anti-humano SIRP antitelo pronalaska je humanizovano monoklonsko antitelo, posebno pri čemu je konstantni domen lakog lanca antitela izveden iz konstantnog domena humanog kapa lakog lanca, tačnije gde se konstantni domen lakog lanca sastoji od sekvence SEQ ID>NO: 35, i gde je konstantni domen teškog lanca antitela izveden iz humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 (divljeg tipa ili mutiranog) konstantnog domena teškog lanca, posebno iz konstantnog domena teškog lanca humanog IgG4 , tačnije gde se konstantni domen teškog lanca antitela sastoji od sekvence sa SEQ ID NO: 34.

Kao što je dobro poznato stručnjaku u ovoj oblasti, izbor izotipova IgG konstantnog domena teškog lanca se usredsređuje na to da li su potrebne specifične funkcije i potreba za odgovarajućim in vivo poluživotom. Na primer, antitela dizajnirana za selektivnu eradikaciju ćelija kancera tipično zahtevaju aktivni izotip koji dozvoljava aktivaciju komplementa i ubijanje ćelija posredovano efektom putem citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisnih od antitela. I ljudski IgG1 i IgG3 (kraći poluživot) izotipovi ispunjavaju ove kriterijume, posebno humani IgG1 izotip (divlji tip i varijante). Konkretno, u zavisnosti od IgG izotipa konstantnog domena teškog lanca (posebno humanog divljeg tipa i varijanti IgG1 izotipa), anti-humano SIRPa antitelo pronalaska može biti citotoksično prema<ćelijama koje eksprimiraju SIRPa preko CDC, ADCC i/ili ADCP mehanizma (Salfeld, nature biotechnology, vol. 25, N°12, 2007; Irani et al. Molecular Immunology, vol. 67, izdanje 2, deo A, 2015). U stvari, region koji se može kristalizovati (Fc) reaguje sa različitim pomoćnim molekulima>da posreduje indirektne efektorske funkcije kao što su ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP) i citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC).

<Tabela 3. Primeri konstantnog domena teškog lanca i konstantnog domena lakog lanca pogodnih>za antitela prema pronalasku.

<- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 56, i - laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 57, ili>

<- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 36, i - laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 43, ili>

<- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 37, i - laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 44, ili>

<- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 37, i - laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 45, ili>

<- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 38, i - laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 44, ili>

<- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 38, i - laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 45, ili>

<- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 39, i - laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 44, ili>

- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 39, i - laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 45, koji je deo pronalaska,

ili

- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 40, i - laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 44, koji je deo pronalaska,

ili

- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 40, i - laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 45, ili

- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 41, i - laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 44, ili

- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 41, i - laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 45, ili

- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 42, i - laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 44, koji je deo pronalaska,

ili

- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 42, i - laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 45, koji je deo pronalaska.

Tabela 4. Sekvence teškog i lakog lanca specifičnih antitela prema pronalasku

<(nastavak)>

<U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano, pri čemu pomenute nesupresivne ćelije ne eksprimiraju markere MHC Klase II i eksprimiraju markere CD80->CD86.

U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano, pri čemu pomenute nesupresivne ćelije eksprimiraju najmanje jedan marker prirodnih ćelija ubica (NK). U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano, pri čemu je navedeno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen u stanju da inhibira M2 polarizaciju makrofaga i/ili favorizuje pro-inflamatorne makrofage tipa M1.

Antitela pronalaska mogu da modifikuju polarizaciju makrofaga da bi izazvala pro-inflamatorno okruženje, tj. mogu inhibirati anti-inflamatorni signal koji obezbeđuju makrofagi tipa M2 i/ili<favorizovati pro-inflamatorni signal koji obezbeđuju makrofagi tipa M1. Ovaj pristup omogućava da>se ponovo uspostavi inflamatorno okruženje pogodno za delovanje T efektorskih ćelija, posebno ueliminaciji ćelija kancera.

SIRPa ANTITELA

<Izvođenja navedena za antitela kao što su gore definisana se ponavljaju mutadis mutandis za antitela navedena u drugim aspektima pronalaska.>

sadrži ili se sastoji od peptida SEQ ID NO: 70 (ELIYNQKEGHFPR) i SEQ ID NO: 71 (RNNMDFSIRIGN) u okviru SIRPa.

U ovom opisu, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za konformacioni epitop koji sadrži najmanje jedan peptid izabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 73 (YNQK) i SIR.

U ovom opisu, otkriveno je antitelo na SIRPa ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za konformacioni epitop koji sadrži ili se sastoji od peptida SEQ ID NO: 73 (YNQK) i SIR unutar SIRPa.

U ovom opisu, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen koji sadrži:

a) teški lanac koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3, i/ili

b) laki lanac koji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3,

pri čemu su navedeni CDR-ovi definisani na sledeći način:

- HCDR1 koji sadrži ili se sastoji od peptida aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 14 (SYWVH),<- HCDR2 koji sadrži ili se sastoji od peptida aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15 (NIDPSDSDTHYNQKFKD) ili SEK ID NO: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG),>

<- HCDR3 koji sadrži ili se sastoji od peptida aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 17 (GGTGTMAWFAY), SEQ ID NO: 18 (GGTGTLAWFAY), SEQ ID NO: 19 (GGTGTMAYFAY) ili SEQ ID NO: 20 (GGTGTLAYFAY),>

<- LCDR1 koji sadrži ili se sastoji od peptida aminokiselinske sekvence SEK ID NO: SEQ ID NO: 21>(RSSQSLVHSYGNTYLY),

- LCDR2 koji sadrži ili se sastoji od peptida aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 22 (RVSNRFS), i

- LCDR3 koji sadrži ili se sastoji od peptida aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 23

(FQGTHVPYT).

U ovom opisu, otkriveno je anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezujespecifično za SIRPg i/ili koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i/ili koji ne inhibira proliferaciju<T-ćelija i/ili koji ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg, posebno koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa>i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i koji ne vezuje se specifično za T-ćelije i koji ne inhibiraproliferaciju T-ćelija i koji ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg.

<- anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kako je gore definisano prema pronalasku,>

<- anti-SIRPa antitela ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano, ili>

<- anti-SIRPa antitela ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg>i/ili koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i/ili koji ne inhibira proliferaciju T-ćelija i/ili koji ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg,

posebno, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i koji se ne vezuje specifično za T-ćelija i koja ne inhibira proliferaciju T-ćelija i koja ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg.

Ovaj opis takođe otkriva upotrebu:

- anti-SIRPa antitela ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano, ili

- anti-SIRPa antitela ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg<i/ili koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i/ili koji ne inhibira proliferaciju T-ćelija i/ili koji ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg,>

<posebno, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i koji se ne vezuje specifično za T-ćelija i koja ne inhibira proliferaciju T-ćelija i koja ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg, u proizvodnji leka.>

<- anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano, ili>

<- anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se>vezuje za antigen, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i/ili koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i/ili koji ne inhibira proliferaciju T-ćelija i/ili koji ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg,

posebno, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i koja ne inhibira proliferaciju T-ćelija i koja ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg,

za upotrebu u lečenju bilo kog stanja podložnog poboljšanju ili sprečavanju diferencijacijom supresorskih ćelija monocitnih mijeloida (Mo-MDSC) u nesupresivne ćelije.

Kao što je ovde definisano, "stanje koje je podložno poboljšanju ili sprečavanju diferencijacijom monocitnih mijeloidnih supresorskih ćelija (Mo-MDSC) u nesupresivne ćelije" odgovara kanceru<uključujući inflamatorne kancere i kancere sa infiltriranim mijeloidnim ćelijama (posebno sa infiltriranim MDSC i/ ili TAM ćelijama), infektivnu bolest, traumu, autoimunu bolest (kao što je>reumatoidni artritis, dijabetes tipa 1, lupus, psorijaza), vakcinaciju, hronične inflamatorne bolesti(kao što su inflamatorne bolesti creva uključujući Kronovu bolest i ulcerativni kolitis), septički šok,<hroničnu zaraznu bolest (kao što je kod Pseudomonas ili CMV), fibrozu, aterosklerozu ili disfunkciju transplantacije.>

<Ovaj opis takođe otkriva metod lečenja bilo kog stanja podložnog poboljšanju ili prevenciji>diferencijacijom supresorskih ćelija dobijenih iz monocita mijeloida (Mo-MDSC) u nesupresivnećelije kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata davanje navedenom subjektu efikasne<količine:>

posebno, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i koji ne inhibira proliferaciju T-ćelija i koji ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg.

posebno, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i koji ne inhibira proliferaciju T-ćelija i koji ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg ,

u proizvodnji leka za lečenje bilo kog stanja koje je podložno poboljšanju ili sprečavanju diferencijacijom supresorskih ćelija dobijenih iz monocita mijeloida (Mo-MDSC) u nesupresivne<ćelije.>

<Sadašnji opis takođe otkriva:>

<- anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i/ili koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i/ili koji ne inhibira proliferaciju T-ćelija i/ili koji ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg,>

<posebno, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i koja ne inhibira proliferaciju T-ćelija i koja ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg,>

za upotrebu u lečenju bilo kog stanja koje je podložno poboljšanju ili sprečavanju modifikovanjem polarizacije makrofaga na pro-inflamatorne makrofage.

Zaista, SIRPa deluje kao inhibitor kontrolne tačke i učestvuje u polarizaciji makrofaga. Konkretno, blokiranje SIRPa indukuje pro-inflamatornu funkciju makrofaga povezanih sa makrofagima tipa 1 (M1 pro-inflamatorni = M (IFNg)) i inhibira supresivnu aktivnost makrofaga u tumoru, pošto se pro-inflamatorni profil makrofaga dobija na trošak makrofaga tipa 2 (visoka fagocitna aktivnost tipa M2 = M (IL4)). Dakle, antagonist SIRPa je u stanju da inhibira M2 fenotipsku polarizaciju makrofaga i/ili favorizuje pro-inflamatornu funkciju makrofaga M1 tipa i može se koristiti u terapiji.

Kao što je ovde definisano, "stanje koje je podložno poboljšanju ili sprečavanju modifikovanjem polarizacije makrofaga u korist pro-upalnih makrofaga" odgovara na primer čvrstom karcinomu,<tečnom karcinomu, infektivnoj bolesti, traumi, autoimunoj bolesti, vakcinaciji, povredi mozga, povredi nerva, policitemiji, hemohromatozi ili hroničnoj inflamatornoj bolesti. Ovaj opis takođe>otkriva metod lečenja bilo kog stanja koje je podložno da se poboljša ili spreči modifikovanjempolarizacije makrofaga na pro-inflamatorne makrofage kod subjekta kome je to potrebno, koji se sastoji od davanja navedenom subjektu efektivne količine:

<- anti-SIRPa antitela ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i/ili koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i/ili koji ne inhibira proliferaciju T-ćelija i/ili koji ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg,>

<posebno, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i koji ne inhibira proliferaciju T ćelija i koji ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg .>

<- anti-SIRPa antitela ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se>vezuje za antigen, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i/ili koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i/ili koji ne inhibira proliferaciju T-ćelija i/ili koji ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg,

posebno, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i koji ne inhibira proliferaciju T-ćelija i koji ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg,

u proizvodnji leka za tretiranje bilo kog stanja koje je podložno da se poboljša ili spreči modifikovanjem polarizacije makrofaga na pro-inflamatorne makrofage. Modifikovanje polarizacije makrofaga u korist pro-inflamatornih ćelija može biti korisno u brojnim patologijama ili situacijama. Kao što je gore opisano, ova modifikacija je posebno korisna u kontekstu kancera, za obnavljanje antitumorske aktivnosti makrofaga i/ili sprečavanje protumorske aktivnosti makrofaga tipa M2. Neodgovarajući imuni odgovori usled viška polarizacije makrofaga tipa M2 javljaju se i kod infektivnih bolesti, fibroze, vakcinacije, traume i<hroničnih inflamatornih bolesti.>

<Prema tome, u skladu sa posebnim izvođenjem, anti-SIRPa antitelo se može koristiti za lečenje pojedinca koji ima kancer izabran iz grupe koju čine karcinomi pluća, mezoteliomski karcinomi,>kanceri jajnika, kanceri jetre, kanceri bešike, kanceri mozga, kanceri dojke, kanceri debelog creva, sarkomi, kanceri pankreasa, kanceri glave i vrata, kanceri bubrega, timomi, gliomi, melanomi i hematološki kanceri kao što su limfomi (Hodgkinov limfom i ne-Hodgkinov limfom), leukemije kao što su T i B Akutna ili Hronična Limfoblastična Leukemija (ALL ili CLL) Akutna ili Hronična<Mijeloična Leukemija (AML ili CML) i Mijeloma.>

<- anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano prema>pronalasku

za upotrebu u lečenju patologije izabrane iz grupe koju čine kancer (posebno inflamatorni kanceri i kanceri sa infiltriranim mijeloidnim ćelijama, posebno sa infiltriranim MDSCs i/ili TAM ćelijama),<zarazna bolest, hronična inflamatorna bolest, autoimuna bolest, neurološka bolest, povreda mozga, povreda nerva, policitemija, hemohromatoza, trauma, septički šok, hronična infektivna bolest (kao što su Pseudomonas ili CMV), fibroza, ateroskleroza, gojaznost, dijabetes tipa II i disfunkcija transplantacije.>

U jednom izvođenju, opis otkriva metod lečenja patologije izabrane iz grupe koju čine kancer (posebno inflamatorni kanceri i kanceri sa infiltriranim mijeloidnim ćelijama, posebno sa infiltriranim MDSCs i/ili TAM ćelijama), zarazna bolest, hronična inflamatorna bolest, autoimuna bolest, neurološka bolest, povreda mozga, povreda nerva, policitemija, hemohromatoza, trauma,septički šok, hronična infektivna bolest (kao što su Pseudomonas ili CMV), fibroza, ateroskleroza,gojaznost, dijabetes tipa II i disfunkcija transplantacije kod subjekta kome je to potrebno,<uključujući davanje navedenom subjektu efektivne količine:>

<posebno, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i koji ne inhibira proliferaciju T-ćelija i koji ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg.>

<- anti-SIRPa antitela ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se>vezuje za antigen kao što je gore definisano, ili

- anti-SIRPa antitela ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili mimetik antitela koji se vezuje za antigen, koji inhibira vezivanje CD47 za SIRPa i koji se ne vezuje specifično za SIRPg i/ili koji se ne vezuje specifično za T-ćelije i/ili koji ne inhibira proliferaciju T-ćelija i/ili koji ne inhibira vezivanje CD47 za SIRPg,

u proizvodnji leka za tretiranje patologije izabrane iz grupe koju čine kancer (posebno inflamatorni kanceri i kanceri sa infiltriranim mijeloidnim ćelijama, posebno sa infiltriranim MDSCs i/ili TAM ćelijama), zarazna bolest, hronična inflamatorna bolest, autoimuna bolest, neurološka bolest, povreda mozga, povreda nerva, policitemija, hemohromatoza, trauma,<septički šok, hronična infektivna bolest (kao što su Pseudomonas ili CMV), fibroza, ateroskleroza, gojaznost, dijabetes tipa II i disfunkcija transplantacije.>

vezuje za antigen kako je gore definisano u skladu sa pronalaskom, za njegovu upotrebu kako je<gore definisano, pri čemu se daje pomenuto anti-humano SIRP antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen pacijentu koji ima SIRPa-pozitivan tumor.>

U jednom izvođenju, opis otkriva upotrebu:

za proizvodnju vakcine.

Supresivne mijeloidne ćelije ograničavaju efikasnost vakcinacije, posebno kod male dece. Prema tome, anti-SIRPa /g bi ograničio korist koju daje anti-SIRPa na odgovor vakcine, sprečavajući T limfocite da reaguju na vakcinaciju.

Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku se može primeniti na različite pogodne puteve, npr., intravenozno (IV), subkutano (SC) ili, intramuskularno (IM) subjektu.

Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen se može primeniti samostalno ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensom, npr., drugim humanim monoklonskim antitelom ili njegovim<fragmentom koji se vezuje za antigen. U drugom primeru, antitelo se primenjuje zajedno sa drugim agensom, na primer, imunosupresivnim agensom, agensom za stimulaciju eritropoeze (ESA), u kombinaciji sa terapeutskim ćelijskim kompozicijama, i slično.>

<Konkretno, anti-SIRPa antitela ovog pronalaska mogu se kombinovati sa nekim drugim>potencijalnim strategijama za prevazilaženje mehanizama izbegavanja imunog tumora sa agensima koji su u kliničkom razvoju ili su već na tržištu (videti tabelu 1 od Antonia et al. Immuno-oncology combinations: a review of clinical experience and future prospects. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res.20, 6258-6268, 2014):

1- Reverzija inhibicije adaptivnog imuniteta (blokiranje puteva kontrolnih tačaka T-ćelija), na primer korišćenjem anti-CTLA4, anti-PD1 ili anti-PD-L1 molekula;

2- Uključivanje adaptivnog imuniteta (promovisanje signalizacije kostimulatornog receptora T-ćelija korišćenjem molekula agonista, posebno antitela), na primer ciljanjem CD137 (4-1BB)<korišćenjem molekula agonista uključujući agonista anti-CD137 (anti-4-1BB) antitela ili CD137 (4-1BB) liganda;>

<3- Poboljšanje funkcije urođenih imunih ćelija;>

<4- Aktiviranje imunog sistema (potenciranje efektorske funkcije imunoloških ćelija), na primer kroz strategije zasnovane na vakcini.>

<Primena drugog terapeutskog agensa može biti istovremeno ili ne sa primenom anti-SIRPa antitela. U zavisnosti od prirode drugog agensa, može se pripremiti istovremena primena u obliku>kombinovanog leka (proizvoda), takođe poznatog kao "combo". Combo je kombinacija sa fiksnom dozom koja uključuje dva ili više aktivnih farmaceutskih sastojaka kombinovanih u jednom doznom obliku, koji se proizvodi i distribuira u fiksnim dozama. Ali režim doze i/ili način primene se takođe mogu razlikovati.

U poželjnom izvođenju, ovo drugo terapeutsko sredstvo je izabrano iz grupe koju čine hemoterapeutska sredstva, sredstva za radioterapiju, imunoterapeutska sredstva, sredstva za<ćelijsku terapiju (kao što su CAR-T ćelije), antibiotici i probiotici.>

Posebno, imunoterapeutski agensi korisni u kontekstu pronalaska se biraju iz grupe koju čineterapeutske vakcine (DNK, RNK ili peptidne vakcine), blokatori ili aktivatori imunih kontrolnih<tačaka, posebno adaptivne imune ćelije (T ili B limfociti) ili imunokonjugati kao što su konjugati antitelo-lek.>

<Kako se ovde koristi, izraz "imunoterapeutski agensi" se posebno odnosi na agense koji bi mogli da>prevedu vakcine protiv kancera od zanimljivih bioloških fenomena do efikasnih terapeutskihagenasa uključujući: faktore rasta T-ćelija za povećanje broja i repertoara naivnih T ćelija, faktore rasta za povećanje broj dendritskih ćelija (DC), agonisti za aktiviranje DC i drugih ćelija koje predstavljaju antigen (APC), adjuvansi koji omogućavaju i povećavaju vakcine protiv kancera, agonisti za aktiviranje i stimulaciju T ćelija, inhibitori blokade kontrolne tačke T-ćelija, T-ćelije<faktori rasta za povećanje rasta i preživljavanja imunih T ćelija, agensi za inhibiciju, blokiranje ili neutralisanje ćelija kancera i imunosupresivnih citokina dobijenih iz imunih ćelija.>

<Brojni blokatori ili aktivatori imunološke kontrolne tačke su poznati u stanju tehnike. U kontekstu>pronalaska, primeri blokatora imunih kontrolnih tačaka ili aktivatora adaptivnih imunih ćelija (B ili T limfocita) koji bi mogli biti korisni su anti-PDL1, anti-PD1, anti-CTLA4, anti-CD137, anti-CD2, anti-CD28 , anti-CD40, anti-HVEM, anti-BTLA, anti-CD160, anti-TIGIT, anti-TIM-1/3, anti-LAG-3, anti-2B4 i anti-OX40, anti-CD40 agonist, CD40-L , agonisti TLR, anti-ICOS, ICOS-L i agonisti receptora B-<ćelija, posebno anti-PDL1, anti-PD1, anti-CD137.>

<Antitelo se može obezbediti u efektivnoj dozi od oko 1 ng/kg telesne težine do oko 30 mg/kg telesne težine, ili više. U specifičnim izvođenjima, doza može da se kreće od 1 μg/kg do oko 20>mg/kg, opciono od 10 μg/kg do 10 mg/kg ili od 100 μg/kg do 5 mg/kg.

Izraz "efektivna doza" ili "efektivno doziranje" ili "efektivna količina" je definisana kao količina dovoljna da se postigne ili bar delimično postigne željeni efekat. Izraz "efektivna doza" treba da obuhvati količinu dovoljnu da izleči ili bar delimično zaustavi bolest i njene komplikacije kod pacijenta koji već pati od bolesti. Količine ili doze koje su efikasne za ovu upotrebu zavisiće od stanja koje se leči, isporučenog konstrukta antitela, terapijskog konteksta i ciljeva, težine bolesti, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na terapeutsko sredstvo, putanje davanja,<veličine (telesne težine, telesnu površine ili veličine organa) i/ili stanja (starost i opšte zdravlje) pacijenta i opšteg stanja sopstvenog imunog sistema pacijenta. Odgovarajuća doza se može podesiti tako da se može dati pacijentu jednom ili u nizu davanja, a da bi se postigao optimalni terapeutski>efekat.

Doziranje za takve svrhe može se ponoviti po potrebi, npr. dnevno, polunedeljno, nedeljno,<polumesečno, mesečno ili po potrebi tokom relapsa.>

za upotrebu u dijagnostičkom testu, posebno u personalizovanoj medicini, tačnije u pratećemdijagnostičkom testu.

U jednom izvođenju, opis otkriva upotrebu:

u proizvodnji leka za dijagnostički test, posebno u personalizovanoj medicini, tačnije u pratećem<dijagnostičkom testu.>

U jednom aspektu, opis otkriva upotrebu anti-SIRPa antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema pronalasku, u proizvodnji leka pogodnog za upotrebu u dijagnostičkom testu, posebno za upotrebu u personalizovanoj medicini, ili u pratećem dijagnostičkom testu.

U jednom aspektu, pronalazak se takođe odnosi na upotrebu najmanje jednog anti-humanog SIRP antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema pronalasku, kao sredstva za<određivanje ekspresije i/ili nivoa ekspresije SIRPa u biološkom uzorku prethodno dobijenom od pojedinca.>

U jednom aspektu, pronalazak se takođe odnosi na in vitro ili ex vivo metod za određivanje SIRPapozitivnih ćelija kod subjekta iz biološkog uzorka prethodno dobijenog od navedenog subjekta, koji sadrži:

<i) određivanje in vitro ekspresije i/ili nivoa ekspresije SIRPa, u biološkom uzorku koji je prethodno dobijen od navedenog subjekta korišćenjem anti-humanog SIRPa antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen ili mimetika antitela koji se vezuje za antigen prema pronalasku.>

<- određivanje nivoa ekspresije SIRPa u uzorku tumora koji je prethodno dobijen od subjekta, posebno sa anti-humanim SIRPa antitelom ili njegovim fragmentom koji se vezuje za antigen prema pronalasku, i>

<- upoređivanje nivoa ekspresije SIRPa sa vrednošću reprezentativnom za nivo ekspresije SIRPa u>populaciji ispitanika koji ne reaguje,

pri čemu je viši nivo ekspresije SIRPa u uzorku tumora subjekta indikativan za subjekta koji će reagovati na tretman.

U jednom aspektu, pronalazak se takođe odnosi na metod in vitro ili ex vivo određivanja prisustva SIRPa+ ćelija u uzorku koji je prethodno dobijen od subjekta koji obuhvata određivanje prisustva SIRPa kao biomarkera koji predviđa odgovor subjekta na tretman, posebno odgovor subjekta sa dijagnozom kancera, pri čemu pomenuta metoda obuhvata:

- određivanje nivoa ekspresije SIRPa u uzorku tumora koji je prethodno dobijen od subjekta, posebno sa anti-humanim SIRP antitelom ili njegovim fragmentom koji se vezuje za antigen prema pronalasku, i

- upoređivanje nivoa ekspresije SIRPa sa vrednošću reprezentativnom za nivo ekspresije SIRPa u populaciji ispitanika koji ne reaguje,

pri čemu je viši nivo ekspresije SIRPa u uzorku tumora subjekta indikativan za pacijenta koji će reagovati na tretman.

Kako se ovde koristi, "farmaceutska kompozicija" je namenjena da obuhvata kompoziciju pogodnu za primenu subjektu ili pacijentu, kao što je sisar, posebno čovek. Generalno, "farmaceutska kompozicija" je sterilna i obično ne sadrži zagađivače koji su sposobni da izazovu neželjeni odgovor unutar subjekta (npr. jedinjenje(a) u farmaceutskoj kompoziciji je farmaceutskog kvaliteta).

<Farmaceutske kompozicije mogu biti dizajnirane za davanje subjektima ili pacijentima kojima je to potrebno preko brojnih različitih puteva primene uključujući oralni, bukalni, rektalni, parenteralni,>intraperitonealni, intradermalni, intrahealni i slično.

Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" podrazumeva ekscipijent, diluent, nosač i adjuvans koji su korisni u pripremi farmaceutske kompozicije koja je generalno bezbedna,<netoksična i ni biološki ni na drugi način nepoželjna, i uključuje ekscipijent, diluent, nosač i adjuvans koji su prihvatljivi za veterinarsku upotrebu kao i za ljudsku farmaceutsku upotrebu. "Farmaceutski prihvatljivi nosač" kako se ovde koristi uključuje i jedan i više od jednog takvog>ekscipijenta, diluenta, nosača i adjuvansa.

Konkretno, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja kao aktivni sastojak sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kao što je gore definisano i farmaceutski prihvatljivnosač.

U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na terapeutsko sredstvo, posebno na kombinovanosredstvo za proizvod, koje kao aktivne sastojke sadrži: anti-SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano prema pronalasku i drugo terapeutsko sredstvo, pri<čemu su navedeni aktivni sastojci formulisani za odvojenu, sekvencijalnu ili kombinovanu terapiju, posebno za kombinovanu ili sekvencijalnu upotrebu.>

<Konkretno, pronalazak se odnosi na kombinovani proizvod koji sadrži anti-SIRPa antitelo ili njegov>fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano prema pronalasku i drugo terapeutsko sredstvo za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu leka.

U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na kombinovani proizvod kao što je gore definisano, pri<čemu je drugi terapeutski agens izabran iz grupe koju čine hemoterapeutski agensi, agensi za radioterapiju, agensi za ćelijsku terapiju, imunoterapeutski agensi, antibiotici i probiotici.>

je navedeni blokator imunih kontrolnih tačaka ili aktivator adaptivnih imunih ćelija (T i B limfociti) izabran iz grupe koju čine anti-PDL1, anti-PD1, anti-CTLA4, anti-CD137, anti-CD2, anti-CD28, anti-CD40, anti-HVEM, anti-BTLA, anti-CD160, anti-TIGIT, anti-TIM-1/3, anti-LAG-3, anti-2B4 i anti-OX40, anti-CD40 agonisti, CD40-L, TLR agonisti, anti-ICOS, ICOS-L i agonisti receptora B-ćelija, posebno izabrani iz grupe koju čine anti-PDL1, anti-PD1 i anti-CD137.

U jednom izvođenju, pomenuti imunoterapeutski agens je antitelo koje cilja tumorski antigen, posebno izabrano iz grupe koju čine anti-Her2, anti-EGFR, anti-CD20, anti-CD19, anti-CD52.

U jednom aspektu, opis otkriva kombinovani proizvod kao što je gore definisano, za istovremenu,odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u lečenju bilo kog stanja koje je podložno da se poboljša ilispreči diferencijacijom supresorskih ćelija dobijenih iz monocita (Mo-MDSC) u nesupresivne ćelije.U jednom izvođenju, opis otkriva metod lečenja bilo kog stanja koje je podložno poboljšanju ili<sprečavanju diferencijacijom monocitnih supresorskih ćelija dobijenih iz mijeloida (Mo-MDSC) u nesupresivne ćelije kod subjekta kome je to potrebno, koji se sastoji od istovremenog davanja, odvojeno ili uzastopno pomenutom subjektu efektivne količine kombinovanog proizvoda kao što je gore definisano.>

proizvodnji leka za lečenje bilo kog stanja koje je podložno poboljšanju ili sprečavanju diferencijacijom supresorskih ćelija dobijenih iz monocita (Mo-MDSC) u nesupresivne ćelije.

U jednom aspektu, opis otkriva kombinovani proizvod kao što je gore definisano, za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u lečenju bilo kog stanja koje je podložno da se poboljša ili<spreči modifikovanjem polarizacije makrofaga na pro-inflamatorne makrofage.>

U jednom izvođenju, opis otkriva metod lečenja bilo kog stanja koje je podložno poboljšanju ili<sprečavanju modifikovanjem polarizacije makrofaga na pro-inflamatorne makrofage kod subjekta kome je to potrebno, koji se sastoji od davanja istovremeno, odvojeno ili uzastopno navedenom subjektu efikasne količine kombinovanog proizvoda kao što je gore definisano.>

<U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na kombinovani proizvod kao što je gore definisano, za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u lečenju patologije izabrane iz grupe koju čine kancer, zarazna bolest, hronična inflamatorna bolest, autoimuna bolest, neurološka bolest, povreda mozga, povreda nerva, policitemija, hemohromatoza, trauma, septički šok, hronična zarazna bolest (kao što je sa Pseudomonas ili CMV), fibroza, ateroskleroza, gojaznost, dijabetes tipa II i disfunkcija>transplantacije ili za upotrebu u vakcinaciji.

U jednom izvođenju, opis otkriva metod lečenja patologije izabrane iz grupe koju čine kancer, zarazna bolest, hronična inflamatorna bolest, autoimuna bolest, neurološka bolest, povreda mozga, povreda nerva, policitemija, hemohromatoza, trauma, septički šok, hronična zarazna bolest (kao što je sa Pseudomonas ili CMV), fibroza, ateroskleroza, gojaznost, dijabetes tipa II i disfunkcija transplantacije kod subjekta kome je to potrebno, što se sastoji u istovremenoj primeni, odvojeno ili uzastopno navedenom subjektu efektivne količine kombinovanog proizvoda kao što je gore definisano.

U jednom izvođenju, opis otkriva upotrebu kombinovanog proizvoda kako je gore definisano, u proizvodnji leka za lečenje patologije izabrane iz grupe koju čine kancer, zarazna bolest, hronična inflamatorna bolest, autoimuna bolest, neurološka bolest, povreda mozga, povreda nerva, policitemija, hemohromatoza, trauma, septički šok, hronična zarazna bolest (kao što je saPseudomonas ili CMV), fibroza, ateroskleroza, gojaznost, dijabetes tipa II i disfunkcijatransplantacije ili za upotrebu u vakcinaciji.

U jednom izvođenju, opis otkriva izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano, pri čemu navedeni molekul nukleinske kiseline sadrži:

- sekvencu koja kodira varijabilni domen teškog lanca navedenog antitela, a poželjno sadrži:

- SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 ili SEQ ID NO: 60,

- SEQ ID NO: 61 ili SEQ ID NO: 62, i

- SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 ili SEQ ID NO: 66,

i/ili

- sekvencu koja kodira varijabilni domen lakog lanca navedenog antitela, a poželjno sadrži:

- SEQ ID NO: 67,

- SEQ ID NO: 68, i

- SEQ ID NO: 69.

<(nastavak)>

Posebno, opis otkriva molekul nukleinske kiseline koji sadrži ili se sastoji od sekvence izabrane između SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51,SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 i SEQ ID NO: 55.

<(nastavak)>

<Kako se ovde koristi, "vektor" je molekul nukleinske kiseline koji se koristi kao vehikulum za>prenos genetskog materijala u ćeliju. Izraz "vektor" obuhvata plazmide, viruse, kozmide i veštačkehromozome. Generalno, projektovani vektori obuhvataju poreklo replikacije, mesto za višestruko kloniranje i marker koji se može birati. Sam vektor je generalno nukleotidna sekvenca, obično DNK sekvenca, koja sadrži insert (transgen) i veću sekvencu koja služi kao "kičmu" vektora. Savremeni vektori mogu da obuhvataju i dodatne karakteristike pored transgenskog umetka i kičme: promoter, genetski marker, otpornost na antibiotike, gen reporter, sekvenca ciljanja, oznaka zaprečišćavanje proteina. Vektori koji se nazivaju ekspresioni vektori (ekspresioni konstrukti) su specifično za ekspresiju transgena u ciljnoj ćeliji i generalno imaju kontrolne sekvence.

<ĆELIJE DOMAĆINI>

U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na izolovanu ćeliju domaćina koja sadrži vektor kao što jegore definisano. Kako se ovde koristi, termin "ćelija domaćin" treba da obuhvati bilo koju<pojedinačnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja može biti ili je bila primalac vektora, egzogenih molekula nukleinske kiseline i polinukleotida koji kodiraju konstrukt antitela iz ovog pronalaska; i/ili>primaoce same konstrukcije antitela. Uvođenje odgovarajućeg materijala u ćeliju može se izvestiputem transformacije, transfekcije i slično. Izraz "ćelija domaćin" je takođe namenjen da uključi potomstvo ili potencijalno potomstvo jedne ćelije. Pogodne ćelije domaćini uključuju prokariotske<ili eukariotske ćelije, a takođe uključuju, ali nisu ograničene na, bakterije, ćelije kvasca, ćelije>gljivica, biljne ćelije i životinjske ćelije kao što su ćelije insekata i ćelije sisara, npr. miša, pacova,zeca, makaka ili čoveka.

<- antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kako je gore definisano,>

<- molekul nukleinske kiseline koji kodira pomenuto antitelo ili se vezuje za antigen,>

<- vektor koji sadrži pomenuti molekul nukleinske kiseline, i/ili>

<- ćeliju koja sadrži pomenuti vektor.>

<U kontekstu ovog pronalaska, izraz "komplet" označava dve ili više komponenti (od kojih jedna odgovara antitelu ili njegovom vezivanju antigena, molekulu nukleinske kiseline, vektoru ili ćeliji pronalaska) upakovanih zajedno u kontejner, recipijent ili na drugi način. Komplet se zato može opisati kao skup proizvoda i/ili pribora koji su dovoljni za postizanje određenog cilja, koji se može>prodati kao jedna celina.

Komplet može sadržati jednog ili više primalaca (kao što su bočice, ampule, kontejneri, špricevi, boce, kese) bilo kog odgovarajućeg oblika, veličine i materijala koji sadrže konstrukt antitela iz ovog pronalaska u odgovarajućoj dozi za primenu. Komplet može dodatno da sadrži uputstva za upotrebu (npr. u obliku letaka ili uputstva za upotrebu), sredstva za davanje konstrukta antitela ovog pronalaska kao što je špric, pumpa, infuzer ili slično, sredstva za rekonstituciju konstrukta antitela prema pronalasku i/ili sredstva za razblaživanje konstrukta antitela prema pronalasku. U jednom izvođenju, opis otkriva komplet kao što je gore definisano za jedinicu davanja jedne doze. Komplet pronalaska takođe može da sadrži prvog primaoca koji sadrži osušeni/liofilizovani konstrukt antitela i drugog primaoca koji sadrži vodenu formulaciju. U određenim izvođenjima ovog pronalaska, obezbeđeni su kompleti koji sadrže jednokomorne i višekomorne prethodno napunjene špriceve (npr. špriceve za tečnost i špriceve za liošpriceve).

U jednom aspektu, opis otkriva polipeptid, posebno antigen, koji sadrži ili se sastoji od epitopnesekvence humane SIRPa koja se sastoji od SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E). U jednom<izvođenju, opis otkriva polipeptid, posebno antigen, koji sadrži ili se sastoji od epitopne sekvence humanog SIRPa koja se sastoji od SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), pri čemu navedeni polipeptid ima veličinu do do 300 aminokiselina.>

U jednom izvođenju, polipeptid ima veličinu između 50 i 300, poželjno između 100 i 250 amino kiselina.

U jednom izvođenju, polipeptid ima veličinu do 50, 100, 150, 200, 250 ili 300 amino kiselina.

<U jednom izvođenju, opis otkriva polipeptid, posebno antigen, koji sadrži ili se sastoji od epitopnih sekvenci humanog SIRPa koji se sastoji od SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 2 (G/ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), SEQ ID NO: 4>(QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) i SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE). U jednom izvođenju, opis otkriva polipeptid, posebno antigen, koji sadrži ili se sastoji od najmanje jednog peptida izabranog iz grupe koju čine SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 i SEQ ID NO: 72, pri čemu se navedeni polipeptid sastoji niza do 300 aminokiselina.

U jednom aspektu, opis otkriva polipeptid, posebno antigen, koji sadrži ili se sastoji od peptida aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 73 (YNQK) i/ili peptida SIR aminokiselinske sekvence unutar SIRPa, navedenog polipeptid koji se sastoji od niza do 300 aminokiselina.

<NAČIN PROIZVODNJE ANTITELA>

<U jednom aspektu, opis otkriva metodu proizvodnje antitela, posebno antitela prema pronalasku, koji obuhvata imunizaciju životinje koja nije čovek, posebno sisara koji nije čovek, protiv najmanje jednog antigena kako je gore definisano, a posebno sakupljanje rezultujućeg seruma od pomenute imunizovane ne-humane životinje da bi se dobila antitela usmerena protiv pomenutog antigena. Posebno, opis otkriva metodu proizvodnje antitela koja se sastoji od imunizacije neljudske životinje protiv antigena koji se sastoji od ili se sastoji od epitopne sekvence humane SIRPa koja se sastoji od SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), i posebno sakupljanje rezultujućeg seruma od pomenute imunizovane ne-humane životinje da bi se dobila antitela usmerena protiv pomenutog antigena. Konkretno, opis otkriva metodu proizvodnje antitela koji se sastoji od imunizacije ne-humane>životinje protiv antigena koji se sastoji od ili se sastoji od epitopne sekvence humane SIRPa koja se sastoji od SEK ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E) i na najmanje jedna epitopska sekvenca humanog SIRPa izabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 2 (G/ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) ili SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE), a posebno sakupljanje rezultujućeg seruma od pomenute imunizovane životinje koja nije ljudska da bi se dobila antitela usmerena protiv pomenutog antigena.

Posebno, opis otkriva metodu proizvodnje antitela koja se sastoji od imunizacije neljudske životinje protiv antigena koji sadrži ili se sastoji od epitopnih sekvenci humanog SIRPa koji se sastoji SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 2 (G/ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) i SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE), a posebno prikupljanje rezultujućeg seruma od pomenute imunizovane nehumane životinje da bi se dobila antitela usmerena protiv pomenutog antigena.

METODA SELEKCIJE ANTITELA

<a. testiranje (npr. prema metodi koja je opisana u Primerima 1, 2 i 3) sposobnosti antitela, fragmenta koji se vezuje za antigen ili mimetika takvog antitela da se veže za SIRPa, posebno za antigen kako je gore definisano,>

<b. testiranje (npr. prema metodi koja je opisana u Primerima 7 i 8) sposobnosti antitela, fragmenta koji se vezuje za antigen ili mimetika takvog antitela da se veže za SIRPb, c. testiranje (npr. prema metodi koja je opisana u Primerima 9 i 10) sposobnosti antitela, fragmenta koji se vezuje za antigen ili mimetika takvog antitela da se veže za SIRPg, d. testiranje (npr. u skladu sa metodom koja je opisana u Primerima 4 i 5) sposobnosti antitela,>fragmenta koji se vezuje za antigen ili mimetika takvog antitela da inhibira vezivanje humanog CD47 za humani SIRPa;

e. testiranje (npr. prema metodi opisanom u Primeru 12) sposobnosti antitela, fragmenta koji se vezuje za antigen ili mimetika takvog antitela da se veže za T ćelije;

f. testiranje (npr. prema metodi opisanoj u Primeru 13) sposobnosti antitela, fragmenta koji se vezuje za antigen ili mimetika takvog antitela da inhibira proliferaciju T ćelija;

g. testiranje (npr. prema metodi opisanoj u Primeru 11) sposobnosti antitela, fragmenta koji se vezuje za antigen ili mimetika takvog antitela da inhibira vezivanje humanog CD47 za humani SIRPg;

i opciono sadrži sledeći korak:

- odabir antitela, fragmenta koji se vezuje za antigen ili mimetika takvog antitela koji se<specifično vezuje za SIRPa, posebno za antigen kao što je gore definisano, i koje značajno>inhibira vezivanje CD47 za SIRPa, i koje se ne vezuje specifično za humani SIRPg, i/ili koji se nevezuje specifično za humane T-ćelije, i/ili koji ne inhibira značajno proliferaciju humanih T-ćelija, i/ili koji ne inhibira značajno vezivanje humanog CD47 za humani SIRPg; tačnije koji se specifično vezuje za SIRPa, posebno za antigen kako je gore definisan, i koji značajno inhibiravezivanje CD47 za SIRPa, i koji se ne vezuje specifično za humani SIRPg, i koji se ne vezuje<specifično za humane T-ćelije, i koji ne inhibira značajno proliferaciju humanih T-ćelija, i koji ne>inhibira značajno vezivanje humanog CD47 za humani SIRPg.

Metoda odabira antitela prema pronalasku može povoljno da se izvede dalje od postupka proizvodnje antitela prema pronalasku.

LEGENDA SLIKA

<Procena pomoću ELISA na imobilizovanom SIRPa-His himernih (♦), HALA (□), HFLA (*), HFLB (+), HEFLA (·), HEFLB (■), SIRP29 (△), Kwar23 (o) na Slici A; od HCLA (•), HCLB (x), HELA (◊), HELB>(-) na Slici B; HALB (-), HBLA (_), HBLB (■) na Slici C. Otkrivanje je izvedeno sa magarećim antihumanim antitelom i otkriveno kolorimetrijom na 450nm korišćenjem TMB supstrata. ED50 je koncentracija naznačenog antitela koja dostiže 50% signala u ovom testu. Vezivanje m18D5 klona(■) (n=4), SE5A5 komercijalnog klona (A) (n=7), 6G10 klona (∇) (n=3) i 12D7 klona (◻) (n=4) na Slici D.

<Slika 2. Biacore analiza afiniteta anti-SIRP antitela na humani SIRPa rekombinantni protein. SIRPa-His rekombinantni protein je imobilisan na CM5 čip pri 5μg/ml (500RU) i navedena antitela su>dodata u različitim koncentracijama. Vrednosti su merene nakon perioda asocijacije (ka) od 3 min, nakon čega je usledio period disocijacije od 10 min (kd) da bi se odredila konstanta afiniteta (KD).

Slika 3. Analiza vezivanja anti-SIRPa antitela na humanim monocitima (homozigot za SIRPavarijantu 1 (v1/v1)).

<(A, B) Procena citofluorometrijom na ljudskim monocitima v1/v1 (prethodno obojenim antitelom inhibitorom vezivanja Fc receptora) himernih (♦), HALA (□), HFLA (*), HFLB (+),>HEFLA (·), HEFLB (■), SIRP29 (△), Kwar23 (o). Otkrivanje je izvedeno sa PE obeleženim mišjimanti-humanim Fc mAb na Cantoll citometru, vrednosti koje odgovaraju procentu obojenih monocita. ED50 je koncentracija naznačenog antitela koja dostiže 50% signala u ovom ogledu.

Slika A odgovara procentu obojenih monocita v1/v1.

Slika B odgovara srednjoj vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) monocita v1/v1.

<(C, D) Studija vezivanja SIRPa antitela na humane monocite pomoću protočne citometrije>(FACS): testirana su različita anti-SIRPa antitela: m18D5 (■) (n=1), SE7C2 (▲)(n=2), 12D7<(?)(n=2), 6G10 (♦) (n=4): Slika C predstavlja srednji intenzitet fluorescencije (MFI) različitih>antitela u odnosu na dozni odgovor. Slika D predstavlja procenat obojenih monocita u odnosuna odgovor na dozu antitela. Statističke analize su vršene kada je to bilo moguće.

<(E, F, G) Vezivanje SIRPa varijanti u populaciji pomoću anti-h SIRPa antitela: Kapacitet različitih anti-hSIRPa antitela da vežu varijante SIRPa kod 32 volontera izmeren je FACS sa PE-anti>mišjim IgG. Svi klonovi su testirani na 10 μg/ml: m18D5 (■), 12D7 (▼), 6G10 (♦) i komercijalnaantitela SE5A5 (□), SE7C2 (△). Slika E predstavlja homozigote Varijanta 1 volontera (n=16).Slika F predstavlja homozigotnu varijantu 2 volontera (n=8). Slika G predstavlja heterozigoteV1/V2 volontera (n=8).

Slika 4. Kompeticija anti-SIRPa antitela sa CD47 na SIRPa.

<(A) Procena pomoću ELISA na imobilizovanom SIRPa-His himernih (♦), HFLA (*), HFLB (+), HEFLA (▲), HEFLB (■), SIRP29 (△), Kwar23 (o) u različitim koncentracijama inkubiranih sa konstantnom koncentracijom biotinilovanog CD47-Fc (6μg/ml). Otkrivanje je izvedeno sa>streptavidin peroksidazom da bi se detektovao molekul CD47 i otkriveno kolorimetrijom na 450nm korišćenjem TMB supstrata. Rezultati drugog eksperimenta dati su sa IC50 vrednostima. IC50 je koncentracija naznačenog antitela da inhibira 50% signala u ovom ogledu.

<(B) Studija antagonističke aktivnosti anti-SIRPa antitela na interakciju SIRPa-CD47 pomoću ELISA: Različita anti-SIRPa antitela su testirana na dozni odgovor: m18D5 klon (■)(n=1),>komercijalno antitelo SE5A5 (A)(n= 2) i m12D7 (D)(n=2). Slika predstavlja procenat CD47pozitivnih SIRPa-CD47 interakcija izmerenih ELISA testom tokom doznog odgovora anti-hSIRPa antitela.

Slika 5. Kompeticija anti-SIRPa antitela sa CD47 na humanim monocitima.

<(A, B) Procena citometrijom na ljudskim monocitima (v1/v1) himernih (♦), HFLA (*), HFLB (+), HEFLA (·), HEFLB (■) u različitim koncentracijama inkubiranih sa konstantnom koncentracijom biotinilovanog CD47-Fc (10 μg/ml). Otkrivanje je izvršeno sa PhycoErythrin-streptavidinom da bi se detektovao molekul CD47 i otkrije Cantoll citometrom. IC50 je koncentracija naznačenog antitela>da inhibira 50% signala u ovom ogledu. Slika A odgovara procentu pozitivnih ćelija. Slika B odgovara srednjoj vrednosti intenziteta fluorescencije. (C) Studija antagonističke aktivnosti anti-SIRPa antitela na interakciju Sirpa-CD47 pomoću FACS: Različita anti-SIRPa antitela su testirana na dozni odgovor: m18D5 klon (■ )(n=1), komercijalno antitelo SE7C2 (▲) (n= 2) i m12D7 (D)(n=2).

Slika C predstavlja procenat CD47 pozitivnih ćelija izmeren pomoću FACS nakon kompeticije saanti-hSIRPa antitelima.

<Slika 6. (A) Blitz analiza afiniteta anti-SIRP antitela na humani SIRPa rekombinantni protein koji je prethodno inkubiran ili ne sa SP-D ligandom. SIRPa-His rekombinantni protein je imobilisan na NINTA biosenzor pri 10 μg/ml i SP-D ligand je dodat u 100 μg/ml (koncentracija zasićenja). Zatim je dodato anti-SIRPa antitelo u količini od 20 μg/ml i vrednosti afiniteta su zaključene nakon>perioda asocijacije (ka) od 120 sekundi nakon čega je usledio period disocijacije od 120 sekundi(kd) da bi se odredila konstanta afiniteta (KD). (B) Blitz analiza afiniteta anti-SIRP antitela na humanom SIRPa rekombinantnom proteinu prethodno inkubiranom sa mišjim 18D5 antitelom. SIRPa-His rekombinantni protein je imobilizovan na NINTA biosenzor pri 10 μg/ml i dodato je anti-SIRPa antitelo u 20 μg/ml (koncentracija zasićenja). Zatim je dodat SP-D ligand u količini od 100μg/ml i vrednosti afiniteta su izvedene nakon perioda asocijacije (ka) od 120 sekundi nakon čega jeusledio period disocijacije od 120 sekundi (kd) da bi se odredila konstanta afiniteta (KD).

<Slika 7. (A) Blitz analiza afiniteta anti-SIRP antitela na humani SIRPb rekombinantni protein. SIRPb-His rekombinantni protein je imobilizovan na NINTA biosenzor i navedena antitela su dodata u količini od 20 μg/ml. Vrednosti su izvedene nakon perioda asocijacije (ka) od 120 sekundi nakon čega je usledio period disocijacije od 120 sekundi (kd) da bi se odredila konstanta afiniteta>(KD). (B) Analiza vezivanja anti-SIRP antitela (humani SIRPb-His premaz i anti-humana kappa detekcija). Procena pomoću ELISA na imobilizovanom SIRPb-His od HEFLB (■ ), SIRP29 (△), Kwar23 (o), B4B6 (♦) i IgG4 Ab kontrole (■). Otkrivanje je izvedeno sa magarećim anti-humanim antitelom sa izuzetkom B4B6 otkrivenog sa mišjim antitelom i otkrivenog kolorimetrijom na 450nm korišćenjem TMB supstrata.

SIRPg-His rekombinantni protein je imobilisan na NINTA biosenzor i navedena antitela su dodata u količini od 10 μg/ml. Vrednosti su izvedene nakon perioda asocijacije (ka) od 120 sekundi nakon čega je usledio period disocijacije od 120 sekundi (kd) da bi se odredila konstanta afiniteta (KD).

<(B) Analiza vezivanja ELISA testom anti-SIRP antitela na SIRPg (humani SIRPg-His premaz i antihumana kappa detekcija). Procena pomoću ELISA na imobilizovanom SIRPg-His od HEFLB (■),>SIRP29 (△), Kwar23 (o), LSB2-20 (•) i IgG4 Ab kontrole (■). Otkrivanje je izvedeno sa magarećim anti-humanim antitelom i otkriveno kolorimetrijom na 450nm korišćenjem TMB supstrata.

<Slika 9. Blitz analiza afiniteta CD47 na humani SIRPg rekombinantni protein prethodno inkubiranom sa anti-SIRP antitelima. SIRPg-His rekombinantni protein je imobilisan na NINTA>biosenzor pri 10 μg/ml i navedena antitela su dodata u 20 μg/ml (koncentracija zasićenja). Zatim je dodat CD47Fc u količini od 100 μg/ml i vrednosti afiniteta su izvedene nakon perioda asocijacije(ka) od 120 sekundi, nakon čega je usledio period disocijacije od 120 sekundi (kd) da bi se odredilakonstanta afiniteta (KD).

<Slika 10. Geometrijski srednji intenzitet fluorescencije meren protočnom citometrijom na (A) perifernim humanim CD3+ T ćelijama, (B) crvenim krvnim zrncima ili (C) trombocitima nakon>bojenja različitim monoklonskim antitelima i otkrivanja sekundarnim anti-IgG fluorescentnim antitelom.

<Slika 11. Procenat pozitivnih perifernih humanih CD3+ T ćelija nakon bojenja različitim>monoklonskim antitelima. Tabela pokazuje vrednost % pozitivnih ćelija u duplim eksperimentima.

Slika 12. Humane T ćelije izolovane iz mononuklearnih ćelija periferne krvi zdravih volonterastimulisane su (A) (C) anti-CD3+ anti-CD28 perlama u odnosu 1:1 tokom 3 dana ili (B) (D)<alogeneičnim dendritikom ćelije (DC) u odnosu 5 T ćelija : 1 DC tokom 5 dana ili (E) sa različitim koncentracijama derivata nepročišćenog proteina tuberkulina (PPD) tokom 5 dana. Antitela su>dodata na dan 0 kulture. Proliferacija je merena ugradnjom H3-timidina tokom poslednjih 12 h kulture.

<Slika 13. Mišje CD8+ T ćelije su izolovane iz splenocita naivnih miševa. CD8 T ćelije su stimulisane>anti-CD3+ anti-CD28 perlama u odnosu 1:1 tokom 3 dana. Antitela su dodata na dan 0 kulture. Proliferacija je merena ugradnjom H3-timidina tokom poslednjih 12 h kulture.

<Slika 14. Humane T ćelije izolovane iz mononuklearnih ćelija periferne krvi zdravih volontera stimulisane su alogeneičnim dendritskim ćelijama (DC) u odnosu 5 T ćelija : 1 DC tokom 5 dana.>Antitela su dodata na dan 0 kulture. Proliferacija je merena ugradnjom H3-timidina tokom poslednjih 12 h kulture.

<Slika 15. (A) Anti-tumorski efekat anti-SIRPa (klon P84) i.p. primena tri puta nedeljno tokom 4>nedelje (300 μg/injekcija) u kombinaciji ili ne sa dve injekcije (dan 4 & 8) od anti-4-1-BB mAb (3H3klon, 100 μg/injekcija) ili sa injekcijama (dva puta nedelju) anti-PDL-1 (10F.9G2 klon, 200μg/injekcija, tretman tokom 4 nedelje) u ortotropnom modelu mišjeg hepatoma (2.5.10^6 Hepa 1.6<ćelija ubrizganih kroz portalnu venu 0. dana). Smatralo se da su miševi izlečeni kada su preživeli tri puta duže od vremena potrebnog da svi kontrolni miševi uginu. (B) Ćelije koje se infiltriraju tumorom analizirane su 13. dana nakon inokulacije tumora. (C) Ćelije koje infiltriraju tumor i ćelije slezine su analizirane 13. dana nakon inokulacije tumora. (D) Miševi koji su prethodno izlečeni u modelu hepatoma injekcijom anti-SIRPa anti-4-1BB ili mutantni miševi SIRPa tretirani anti-4-1BB su ponovo izazvani injekcijom Hepa 1.6 ćelija u slezinu (2.5.10^6 ćelija/miš). Naivni miševi su injektirani paralelno na isti način kako bi se uporedio razvoj tumora sa ponovo izazvanim>miševima. Miševi su tada ostavljeni nelečeni. (E) Miševi koji su prethodno izlečeni u modelu hepatoma pomoću anti-SIRPa anti 4-1BB ponovo su izazvani injekcijom Hepa 1.6 ćelija u slezinu (2.5.10^6 ćelija/miš) i njihova slezina je sakupljena 30 dana nakon ponovnog izlaganja. Izolovani su splenociti i splenociti T-ćelija. Naivnim miševima je intravenozno ubrizgan vehikulum, celi splenociti (10.10^6/miš) ili T-ćelije prečišćene od splenocita (2.5.10^6/miš) i svi su primili injekciju Hepa1.6 ćelija u slezinu (2.5.10^6 ćelije/miš). Miševi su tada ostavljeni nelečeni i smatrani su izlečenim kada su preživeli tri puta duže od vremena potrebnog da svi kontrolni miševi uginu.

<Slika 16. Miševi koji su prethodno izlečeni u modelu hepatoma injekcijom anti-SIRPa anti-PDL1 ponovo su izazvani injekcijom Hepa 1.6 ćelija u slezinu (2.5.10^6 ćelija/miš). Naivni miševi su>injektirani paralelno na isti način kako bi se uporedio razvoj tumora sa ponovo izazvanim miševima. Miševi su tada ostavljeni nelečeni.

<Slika 17. Antitumorski efekat anti-SIRPa (klon P84) i.p. primena tri puta nedeljno tokom 4 nedelje (200 μg/injekcija) u ortotopskom modelu karcinoma mlečne žlezde miša (0.25.10^6 od 4T1 ćelija>ubrizganih u mlečnu žlezdu). Razvoj tumora je procenjen merenjem prečnika tumora i izračunat prema formuli: =(0,52*(d2))^1,5. Miševi su eutanazirani kada je razvoj tumora bio skoro 1000 mm3 prema etičkim smernicama.

<Slika 18. Analiza fenotipa imunih ćelija u slezini, tumoru i limfnim čvorovima miševa tretiranih>anti-SIRPa (P84 klon) ili ctrl mAb i.p. tri puta nedeljno tokom dve nedelje (200 μg/injekcija) uortotropnom modelu mišjeg karcinoma mlečne žlezde (0.25.10^6 od 4T1 ćelija ubrizganih umlečnu žlezdu). Analiza imunih ćelija je obavljena dve nedelje nakon inokulacije tumora.

<Slika 19. Anti-SIRPa (klon P84), anti-CD47 (klon MIAP410) i irelevantna kontrola izotipa davani su intraperitonealno 0 i 2 dana u dozi od 12 mg/kg kod C57BI/6 miševa. Uzorci krvi su prikupljeni na dan 0 i dan 3 u epruvetama koje sadrže EDTA, a krvna slika je obavljena hematološkim>analizatorom XS-800i (Sysmex). Nivo hemoglobina (levo) i procenat hematokrita (desno) su procenjeni 3. dana. Isprekidane linije predstavljaju vrednosti normalnog opsega kod C57BI/6 miševa za svaki parametar.

<Slika 20. (gore) Analiza protočne citometrije anti-SIRPa (HEFLB, siva) i anti-CD47 (B6H12, crna)>mAb u poređenju sa kontrolnim mAb (isprekidana linija) na humanim trombocitima svežeizolovanim iz krvi zdravih donora. (Dole) Merenje agregacije humanih trombocita korišćenjem<optičkog agregometra u prisustvu 50 μg/ml kontrolnog mAb, anti-SIRPa (HEFLB), anti-CD47>(B6H12) ili anti-integrin αIIb kao pozitivne kontrole inhibitora agregacije. Antitela su procenjenana neaktiviranim i ADP-aktiviranim trombocitima.

<Slika 21. Alogeneične CD4+ T ćelije su kultivisane u odnosu 1:1 sa CD14+ mijeloidnim ćelijama ekstrahovanim iz (A) svežeg ili (B) zamrznutog ascitesa kancera jajnika sa 10 μg/ml kontrolnog>antitela (belo), anti-SIRPa HEFLB (crno) ili anti-CD47 mAb (sivo). Proliferacija je merena 5. dana ugradnjom 3H-timidina. (C) Alternativno, alogeneične T ćelije su kultivisane u odnosu 5:1 saalogeneičim dendritskim ćelijama i različitim odnosom CD14+ mijeloidnih ćelija ekstrahovanih izascitesa kancera jajnika u prisustvu 10 μg/ml antitela kao u (A).

HBLB, HCLA, HCLB, HELA, HELB, HFLA, HFLB, HEFLA i HEFLB" odgovaraju specifičnim humanizovanim varijantama 18D5. Antitela 6G10 i 12D7 pripadaju prijaviocu; ova antitela su dobijena istom metodom kao m18D5 i korišćena su kao kontrola. Ova kontrolna antitela su IgG2a mišja monoklonska anti-humana SIRPa antitela.

<Pored toga, komercijalna antitela su korišćena za poređenje. Prvo je anti-SIRPa antitelo, nazvano SE7C2 (Santa Cruz sc-23863); drugo antitelo je antitelo koje može da prepozna i SIRP α /β i>nazvano je SE5A5 (BioLegend BLE323802); a treće je anti-humano SIRPa antitelo pod nazivomKwar23 (Creative Biolabs). Za poređenje je takođe korišćeno anti-humano SIRPa antitelo pod nazivom SIRP29 sa Univerziteta u Torontu opisano u PCT prijavi WO2013056352.

Primer 1. Analiza vezivanja anti-SIRPa antitela na SIRPa od ELISA

Metoda: Aktivnost vezivanja anti-SIRPa antitela je procenjena pomoću ELISA. Za ELISA test sa<himeričnim antitelom, humanizovanim antitelom, SIRP29 i Kwar23, rekombinantni hSIRPa (Sino Biologicals, Peking, Kina; referenca 11612-H08H) je imobilizovan na plastiku pri 0.5 μg/ml u karbonatnom puferu (pH9) i prečišćeno antitelo je dodato da bi se izmerilo vezivanje. Posle inkubacije i ispiranja, dodat je peroksidazom obeležen magareći anti-humani IgG (Jackson Immunoresearch; SAD; referenca 709-035-149) i otkriven je konvencionalnim metodama.>

Za ELISA test sa mišjim antitelima, rekombinantni hSIRPa (Sino Biologicals, Peking, Kina; referenca 10975-H08H) je imobilisan na plastiku pri 0.5 μg/ml u karbonatnom puferu (pH9.2) i prečišćeno antitelo je dodato za merenje vezivanja. Posle inkubacije i ispiranja, dodat je peroksidazom obeležen kozji anti-mišji Fc lanac (Jackson Immunoresearch; referenca 115-036-071) i otkriven je konvencionalnim metodama.

Rezultati: Kao što je prikazano na slikama 1A, 1B i 1C, aktivnost vezivanja različitih anti-SIRPaantitela na SIRPa merena ELISA testom pokazala je efektivne koncentracije (EC50) od 2.9 ng/ml za<himerično antitelo, 3.9 ng/ml za HALA , 5.1 ng/ml za HFLA, 4.0 ng/ml za HFLB, 7.1 ng/ml za HEFLA, 4.4 ng/ml HEFLB u prvom eksperimentu, 4.06 ng/ml za himerično antitelo, 5.60 ng/ml za HCLA, 5.59 ng/ml za HCLB, 4.61 ng/ml za HELA, 4.13 ng/ml za HELB u drugom eksperimentu i 2.74 ng/ml za himerično antitelo, 2.53 ng/ml za HALB, 2.68 ng/ml za HBLA, 2.95 ng/ml za HBLB u trećem eksperimentu. Ovi rezultati ukazuju na to da su testirana antitela prema pronalasku dobra SIRPa veziva pomoću ELISA u poređenju sa drugim poznatim anti-SIRPa antitelima SIRP29 (3.7 ng/ml) i>Kwar23 (3.3 ng/ml). Ovi rezultati ukazuju na to da je epitop prepoznat od strane svih antitela pronalaska dostupan kada se SIRPa obloži na plastičnu posudu.

Kao što je prikazano na Slici 1D, aktivnost vezivanja različitih anti-SIRPa antitela na SIRPa merena ELISA-om pokazala je efektivnu dozu (ED50) od 0.16nM (24ng/ml) za SE5A5 i 0.06nM (9ng/ml) za klon m18D5. Čini se da klonovi 6G10 i 12D7 nisu vezali SIRPa ELISA testom. Ovi rezultati ukazuju na to da je klon m18D5 dobro vezivo za SIRPa pomoću ELISA u poređenju sa komercijalnim antitelom i ukazuju na to da je epitop koji prepoznaje ovaj klon dostupan kada se SIRPa obloži naplastičnoj posudi u poređenju sa klonovima 6G10 i 12D7.

Primer 2. Merenje afiniteta biosenzora anti-SIRPa antitela za SIRPa

<Metoda: Rekombinantni hSIRPa (Sino Biologicals, Peking, Kina; referenca 11612-H08H) je imobilizovan u CM5 senzorski čip (GeHealthcare; Francuska) pri 5 μg/ml (500RU) i antitela su primenjena u različitim koncentracijama sa brzinom protoka od 40μl/min. Analiza je obavljena sa>BIAcore 3000 (Biacore, GeHealthcare). Vrednosti su merene nakon perioda asocijacije (ka) od 3 min, nakon čega je usledio period disocijacije od 10 min (kd) da bi se odredila konstanta afiniteta (KD).

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 2, antitela pronalaska imaju jak afinitet (KD) za SIRPa (od>1.93e-10 M do 3.67e-10 M), što je ekvivalentno afinitetu poznatih anti-SIRPa antitela SIRP29 iKwar23 i bolji od afiniteta komercijalnih anti-SIRPa antitela SE7C2 i SE5A5.

Primer 3. Ogled vezivanja SIRPa na humanim monocitima citofluorometrijom

<Metoda: Da bi se izmerilo vezivanje anti-SIRPa antitela na humanim monocitima, inhibitor vezivanja humanog Fc receptora (BD pharmingen; SAD; referenca 564220) je prvo dodat na 30 minuta na sobnoj temperaturi da bi se blokirali humani Fc receptori na humanim monocitima kako>bi se smanjila pozadina. Zatim je antitelo inkubirano 30 minuta na 4°C, i isprano pre nego što jeobojeno 30 minuta na 4°C sa PE-obeleženim anti-humanim IgG Fc (Biolegend; SAD; referenca 409303). Za mišja antitela, korišćen je PE-obeležen anti-mišlgG (Jackson Immunoresearch; referenca 715-116-151). Uzorci su analizirani na BD LSRII ili Canto II citofluorometru.

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 3, rezultati ukazuju na snažno vezivanje anti-SIRPa antitela>pronalaska na humane monocite i vezivanje (kako je mereno pomoću MFI (Srednji FluorescentniIntenzitet)) na poznata anti-SIRPa antitela Kwar23 , SE7C2 i SE5A5.

Primer 4. Kompetitivna analiza između CD47 i anti-SIRPa antitela antagonistima ELISA ogledom

<Metoda: Za kompetitivni ELISA test, rekombinantni hSIRPa (Sino Biologicals, Peking, Kina;>referenca 11612-H08H) je imobilisan na plastiku pri 0.5 μg/ml u karbonatnom puferu (pH9.2). Za<himerično antitelo, humanizovana antitela, SIRP29 i Kwar23, prečišćeno antitelo (u različitim koncentracijama) je pomešano sa 6 μg/ml finalne (fiksne koncentracije) biotinilovanog Humanog CD47Fc (AcroBiosystems interchim; Francuska; referenca: #CD7-H82F6) da bi se izmerilo kompetitivno vezivanje tokom 2h na 37°C. Posle inkubacije i ispiranja, dodat je streptavidin obeležen peroksidazom (Vector laborating; SAD; referenca SA-5004) da bi se otkrilo vezivanje Biotin-CD47Fc i otkriveno konvencionalnim metodama.>

Za mišja antitela, prečišćeno antitelo (u različitim koncentracijama) je pomešano sa 0.04 μg/ml od CD47Fc (Sino Biologicals, Peking, Kina; referenca 12283-H02H) da bi se izmerilo kompetitivno vezivanje tokom 2 sata na 37°C. Posle inkubacije i ispiranja, dodat je magareći anti-humani Fc lanac obeležen peroksidazom (Jackson Immunoresearch; referenca 709-035-149) da bi se otkrilo vezivanje CD47Fc i otkriveno konvencionalnim metodama.

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 4, antitela pronalaska imaju antagonističku aktivnost na interakciju SIRPa-CD47. Konkretno, primećeno je da himerno antitelo, HFLA, HFLB, HEFLA i HEFLB>imaju bolju antagonističku aktivnost u poređenju sa antagonističkom aktivnošću SIRP29 i komercijalnim anti-SIRPa antitelom SE5A5.

Primer 5. Kompetitivna analiza između CD47 i humanizovanih anti-SIRPa antitela na humanim monocitima pomoću antagonističkog citofluorometrijskog ogleda

<Metoda: Da bi se izmerila kompeticija između CD47 i humanizovanih anti-SIRPa antitela na>humanim monocitima, prečišćeno antitelo je dodato na monocite tokom 15 minuta na 4°C, a zatimpomešano sa 5 μg/ml finalnog biotinilovanog Humanog CD47Fc (AcroBiosystems interchim;Francuska; referenca: #CD7-H82F6) i inkubirano 30 minuta na 4°C da bi se izmerilo kompetitivno<vezujuće antitelo. Posle inkubacije i ispiranja, PE-obeleženi streptavidin (BDBiosciences; SAD; referenca 554061) je dodat 15 minuta na 4°C da bi se otkrilo vezivanje Biotin-CD47Fc i analiziralo>na BD LSRII ili Canto II citofluorometru.

Da bi se izmerila kompeticija između CD47 i mišjih anti-hSIRPa antitela na humanim monocitima,<prečišćeno antitelo je dodato na monocite tokom 15 minuta na 4°C, a zatim pomešano sa 5 μg/ml finalnog CD47Fc (Sino Biologicals, Peking, Kina; referenca 12283 -H02H) i inkubirano 15 minuta na>4°C da bi se izmerilo kompetitivno vezujuće antitelo. Posle inkubacije i ispiranja, FITC-obeleženanti-humani Fc (Beckman Coulter; referenca IM1627) je dodat 15 minuta na 4°C da bi se otkrilo vezivanje CD47Fc i analiziralo na BD LSRII ili Canto II citofluorometru.

Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 5, antitela pronalaska imaju antagonističku aktivnost nainterakciju SIRPa-CD47 na humanim monocitima.

Primer 6. Kompeticija Blitz metodom sa SP-D

<Metoda: Ova metoda je izvedena sa Blitz-om (Forté Bio; SAD; referenca C22-2 No 61010-1).>

<Uslov A: SIRPa Anti-SIRPa antitelo Surfaktant Protein D (SP-D). U prvom koraku, SIRPa (His) rekombinantni protein (Sino Biologicals, Peking, Kina; referenca 11612-H08H) je imobilizovan na>10 μg/ml pomoću histidinskog repa u Ni-NTA biosenzor (Forté Bio; SAD; referenca 18-0029) na 30 sekundi. U drugom koraku, dodata su anti-SIRPa antitela u koncentraciji od 20 μg/mL (koncentracija zasićenja) tokom 120 sekundi. Zatim je humani SP-D (R et D Systems; SAD; referenca 1920-SP-050) povezan sa 100 μg/mL, u kompeticiji sa anti-SIRPa antitelima, tokom 120 sekundi. Disocijacija SP-D je izvršena u kinetičkom puferu tokom 120 sekundi. Analiza podataka je urađena<pomoću softvera Blitz pro 1.2, koji je izračunao konstantu asocijacije (ka) i konstantu disocijacije (kd) i odredio konstantu afiniteta KD (ka/kd).>

<Uslov B: SIRPa Surfaktant Protein D (SP-D) Anti-SIRPa antitelo. U prvom koraku, Sirp-a (His)>rekombinantni protein (Sino Biologicals, Peking, Kina; referenca 11612-H08H) je imobilizovan na 10 μg/ml pomoću histidinskog repa u NiNTA biosenzor (Forte Bio; SAD; referenca 18-0029 ) na 30 sekundi. U drugom koraku, humani SP-D (R et D Systems; SAD; referenca 1920-SP-050) je dodat u<količini od 100 μg/mL tokom 120 sekundi. Zatim su antitela na SIRPa povezana sa 20 μg/mL>(koncentracija zasićenja) tokom 120 sekundi. Disocijacija anti-SIRPa antitela je napravljena u<kinetičkom puferu tokom 120 sekundi. Podaci za analizu su napravljeni pomoću softvera Blitz pro>1.2, koji je izračunao konstantu asocijacije (ka) i konstantu disocijacije (kd) i odredio konstantuafiniteta KD (ka/kd).

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 6, vezivanje anti-SIRPa antitela 18D5 ne blokira vezivanje>SPD za SIRPa i vezivanje SP-D ne blokira vezivanje 18D5 za SIRPa. Dakle, antitelo pronalaska neinhibira interakciju između SIRPa i SP-D.

Primer 7. Afinitet anti-SIRPa antitela za SIRPb Blitz metodom

<Metoda: Ova metoda je izvedena sa Blitz (Forté Bio; SAD; referenca C22-2 No 61010-1).>

Rekombinantni hSIRPb-His (Antibodies-online; SAD; referenca ABIN3077231) je imobilizovan na<10 μg/ml pomoću histidinskog repa u NiNTA biosenzor (Forté Bio; SAD; referenca 18-0029) u trajanju od 30 sekundi. Zatim, anti-SIRPa antitelo je povezano sa 20 μg/mL tokom 120 sekundi.>Disocijacija anti-SIRPa antitela je napravljena u kinetičkom puferu tokom 120 sekundi. Analizapodataka je urađena pomoću softvera Blitz pro 1.2, koji je izračunao konstantu asocijacije (ka) i konstantu disocijacije (kd) i odredio konstantu afiniteta KD (ka/kd).

Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 7A, antitela pronalaska imaju niži afinitet za SIRPb u poređenju sa SIRPa. Posebno je primećeno da himerično antitelo, HFLA, HFLB, HEFLA, HEFLB imajusmanjeni afinitet za SIRPb u poređenju sa SIRP29 i Kwar23.

Primer 8. ELISA vezivanje anti-SIRP antitela na SIRPb

Metoda: Za ELISA test aktivnosti, rekombinantni hSIRPb-His (Antibodies online; SAD; referencaABIN1466557) je imobilisan na plastiku pri 1 μg/ml u karbonatnom puferu (pH9.2) i dodato je<prečišćeno antitelo da bi se izmerilo vezivanje. Posle inkubacije i ispiranja, dodat je peroksidazom>obeležen magareći anti-humani IgG (Jackson Immunoresearch; SAD; referenca 709-035-149) iotkriven je konvencionalnim metodama.

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 7B, anti-SIRPa antitela imaju nizak afinitet za SIRPb. Mora se naznačiti da je otkriće obavljeno sa magarećom anti-humanom antitelom za sva antitela osim za>B4B6 (otkriveno sa mišjim antitelom), što može objasniti da je signal dobijen za anti-SIRPb antitelo B4B6 niži od dobijenog signala za anti-SIRPa antitela.

Primer 9. Analiza afiniteta anti-SIRPa antitela za SIRPg Blitz metodom

<Rekombinantni hSIRPg-His (Sino Biologicals, Peking, Kina; referenca 11828-H08H) je imobilizovan na 10 μg/ml pomoću histidinskog repa u Ni-NTA biosenzor (Forté Bio; SAD; referenca 18-0029) u>trajanju od 30 sekundi. Zatim, anti-SIRPa antitelo je povezano sa 20 μg/mL tokom 120 sekundi.Disocijacija anti-SIRPa antitela je napravljena u kinetičkom puferu tokom 120 sekundi. Analiza podataka je urađena pomoću softvera Blitz pro 1.2, koji je izračunao konstantu asocijacije (ka) i konstantu disocijacije (kd) i odredio konstantu afiniteta KD (ka/kd).

Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 8A, anti-SIRPa antitela pronalaska imaju nizak afinitet zaSIRPg. Ovaj afinitet je nešto slabiji od afiniteta poznatih anti-SIRPa antitela SIRP29 i Kwar23.

<Međutim, kinetička svojstva se razlikuju između anti-SIRPa antitela, SIRP29 i Kwar23, sa visokom konstantom brzine disocijacije (Kd) za anti-SIRPa antitela u poređenju sa SIRP29 i Kwar23.>

Konkretno, HFLB ima najniži afinitet za SIRPg sa KD vrednošću od 1.036e-7 M što je jednako 2-log razlici u poređenju sa KD vrednostima SIRP29 i Kwar23.

Primer 10. ELISA vezivanje anti-SIRP antitela na SIRPg

<Metoda: Za ELISA test aktivnosti, hSIRPg-His (Sino Biologicals, Peking, Kina; referenca 11828->H08H) je imobilisan na plastiku pri 1 μg/ml u karbonatnom puferu (pH9.2) i dodato je prečišćenoantitelo da bi se izmerilo vezivanje. Posle inkubacije i ispiranja, dodat je peroksidazom obeleženmagareći anti-humani IgG (Jackson Immunoresearch; SAD; referenca 709-035-149) i otkriven jekonvencionalnim metodama.

Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 8B, anti-SIRPa antitelo HEFLB ne vezuje SIRPg, dok poznataanti-SIRPa antitela SIRP29 i Kwar23 pokazuju značajno vezivanje za SIRPg.

Primer 11. Kompeticija Blitz metode sa CD47 za SIRPg: SIRPg anti-SIRPa antitelo CD47

<Metoda: Ova metoda je izvedena sa Blitz (Forté Bio; SAD; referenca C22-2 No 61010-1). U prvom>koraku, hSIRPg-His (Sino Biologicals, Peking, Kina; referenca 11828-H08H) je imobilizovan na 10<μg/ml pomoću histidinskog repa u Ni-NTA biosenzor (Forté Bio; SAD; referenca 18-0029) za 30 sekundi. U drugom koraku, dodato je anti-SIRPa antitelo u koncentraciji od 20 μg/mL (koncentracija zasićenja) tokom 120 sekundi. Zatim je humani CD47Fc ((Sino Biologicals, Peking,>Kina; referenca 12283-H02H) povezan sa 100 μg/mL, u kompeticiji sa anti-SIRPa antitelima, tokom120 sekundi. Disocijacija CD47Fc je napravljena u kinetičkom puferu u trajanju od 120 sekundi. Podaci za analizu su napravljeni pomoću softvera Blitz pro 1.2, koji je izračunao konstantu asocijacije (ka) i konstantu disocijacije (kd) i odredio konstantu afiniteta KD (ka/kd).

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 9, anti-SIRPa HEFLB pronalaska nije u kompeticiji sa>vezivanjem CD47 za SIRPg. Nasuprot tome, druga poznata antitela SIRP29 i, posebno, kwar23 su ukompeticiji sa vezivanjem CD47 za SIRPg.

Primer 12. Vezivanje za krvne ćelije protočnom citometrijom

Metoda: Eksperiment je realizovan radi analize vezivanja anti-SIRPa antitela na humanim krvnim<ćelijama. CD3-pozitivni T limfociti, crvena krvna zrnca i trombociti su ekstrahovani iz prečišćene krvi zdravih volontera. Ćelije su zatim obojene 30 minuta na 4°C sa 10 mikrograma/ml svakog>testiranog antitela, isprane i zatim obojene sekundarnim fluorescentnim anti-IgG antitelom još 30minuta na 4°C. Nakon ispiranja, ćelije su analizirane na CANTO II (BD Bioscience) protočnom citometru.

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 10, T ćelije, crvena krvna zrnca i trombociti su pozitivni na CD47, koji se eksprimira ubikvitarno, i obojeni su antitelom B6H12. Antitela SIRP29 i Kwar23, poput LSB2.20 (specifično anti-SIRPγ antitelo), vezuju se za T ćelije za koje je poznato da eksprimiraju SIRPγ. Međutim, anti-SIRPa humanizovano 18D5 antitelo se ne vezuje za T ćelije (isti rezultati dobijeni sa četiri različite testirane humanizovane varijante 18D5). Crvena krvna zrnca i trombociti ne eksprimiraju SIRPa i zato nisu otkriveni sa humanizovanim 18D5 antitelom i drugim>anti-SIRPa antitelima. Ovaj rezultat pokazuje specifičnost humanizovanog 18D5 antitela za SIRPa na živim ćelijama u poređenju sa poznatim anti-SIRPa antitelima.

Kao što je prikazano na Slici 11, T-ćelije nisu obojene humanizovanim antitelom 18D5 (isti rezultati dobijeni sa pet različitih testiranih humanizovanih varijanti 18D5) i himeričnim 18D5 (podaci nisu prikazani), dok je više od 70% T ćelija obojeno od SIRP29 i Kwar23.

Primer 13. Proliferacija humanih CD3+ T ćelija

<Metoda: hPBMC su izolovani iz penastog premaza zdravih volontera. CD4 ili CD8 T ćelije su odabrane pozitivnom selekcijom korišćenjem AutoMACS (Miltenyi) i postavljene u ploču sa 96>posudica (50000 ćelija/posudica). Proliferativne signale obezbeđuju ili anti CD3/anti-CD28 obložene mikroperle (LifeTechnologies) u odnosu 1 perla za 1 T ćeliju tokom tri dana, ilialogeneične zrele dendritske ćelije generisane in vitro u 5 T ćeliji za 1 mDC tokom 5 dana ili sa<različitim koncentracijama nepročišćenog proteinskog derivata tuberkulina (PPD) tokom 5 dana.>Antitela koja ciljaju na SIRPa/CD47 put su dodavana od početka testa proliferacije u koncentraciji<zasićenja (10 μg/mL). Proliferacija je merena ugradnjom H3-timidina tokom poslednjih 12 h kulture. Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 12, varijante anti-SIRPa antitela HALA i HEFLB ne>inhibiraju proliferaciju T ćelija kada su T ćelije stimulisane sa antiCD3+ anti-CD28 perlama (A) (C)ili alogeničnim dendritskim ćelijama (B) (D) ili sa PPD (E), dok anti-SIRPa Kwar23 inhibira proliferaciju T ćelija kada se T ćelije stimulišu alogeničnim dendritskim ćelijama. Kao što seočekivalo, anti-CD47 antitela i anti-SIRPg antitelo su inhibitori proliferacije T ćelija.

Primer 14. Proliferacija mišjih CD8+ T ćelija

Metoda: Splenociti su izolovani od naivnih miševa. CD8 T ćelije su odabrane pozitivnom selekcijom<korišćenjem AutoMACS (Miltenyi) i postavljene u ploču sa 96 posudica (50000 ćelija/posudica). Proliferativni signali su obezbeđeni mikroperlama obloženim anti-CD3/anti-CD28 (LifeTechnologies) u odnosu 1 perla za 1 T ćeliju tokom tri dana. Od početka testa proliferacije>dodato je mišje anti-SIRPa antitelo (P84) i anti-CD47 antitelo (MIAP310) koje cilja na SIRPa/CD47 put u koncentraciji zasićenja (10 μg/mL). Proliferacija je merena ugradnjom H3-timidina tokom poslednjih 12 h kulture.

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 13, ne postoji inhibicija anti-SIRPa ili anti-CD47 antitela na proliferaciju T ćelija miša. Ovaj rezultat se objašnjava činjenicom da miševi ne eksprimiraju SIRPg>gen. Dakle, miševi se mogu koristiti kao model za predviđanje in vivo efekata specifičnog anti-SIRPaantitela koje ne vezuje SIRPg. Nasuprot tome, anti-CD47 ili neselektivna anti-SIRPa antitela u vivopretkliničkoj efikasnosti, posebno na adaptivni imunitet i stvaranje memorijskih T limfocita, ne predviđaju situaciju kod ljudi.

Primer 15. Proliferacija humanih T ćelija

<Metoda: hPBMC su izolovani iz penastog premaza zdravih volontera. CD4 ili CD8 T ćelije su odabrane pozitivnom selekcijom korišćenjem AutoMACS (Miltenyi) i postavljene u ploču sa 96>posudica (50000 ćelija/posudica). Proliferativne signale obezbeđuju ili anti-CD3/anti-CD28 obložene mikroperle (LifeTechnologies) u odnosu 1 perla za 1 T ćelije tokom tri dana, ili<alogeneične zrele dendritske ćelije generisane in vitro u 5 T ćelija za 1 mDC tokom 5 dana. Antitela su dodavana od početka testa proliferacije u zasićenoj koncentraciji (5μg/mL za anti-CD47 i anti->SIRPa antitela i 2,5 μg/mL za anti-PD-1/PD-L1 antitela i rekombinantni 4-1BBL). Proliferacija je merena ugradnjom H3-timidina tokom poslednjih 12 h kulture.

Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 14, anti-PD-1/PD-L1 antitela i rekombinantni 4-1BBL imaju<pojačani efekat na proliferaciju humanih T ćelija, dok anti-CD47 ima negativan efekat na proliferaciju humanih T ćelija. Konkretno, anti-CD47 antitelo sprečava humanu T-ćelijsku>imunostimulacionu efikasnost agenasa agonista anti-PD-1/PD-L1 ili 4-1BB. Anti-SIRPa HEFLBnema značajan uticaj na proliferaciju T ćelija.

Primer 16. Anti-tumorski efekti kod miševa

<Metoda: Miševi su anestezirani koktelom ksilazin/ketamin. Posle laparotomije, tumorske ćelije Hepa 1.6 su ubrizgane kroz portalnu venu (2,5.106 ćelija/100 μL) u PBS. Lečenje je počelo 4 dana nakon injekcije tumora. Agonističko anti-4-1BB monoklonsko antitelo (3H3) je ubrizgano dva puta na d4 i d8 nakon intraperitonealne injekcije Hepa 1.6 ćelija (Hepatokarcinoma ćelije, HCC) u PBS (100 μg/injekcija). Anti-PDL1 monoklonsko antitelo je ubrizgano dva puta nedeljno tokom 4>nedelje intraperitonealno u PBS (200 μg/injekcija). Antagonističko anti-SIRPa antitelo (P84) jeubrizgano tri puta nedeljno tokom četiri nedelje intraperitonealno u PBS (300 μg/injekcija). Antitumorski odgovor je procenjen na ortotopskom modelu HCC trinaest dana nakon inokulacije tumora. Tada su prikupljeni tumor i slezina da bi se fenotipizirale imune ćelije koje su se infiltrirale u tumor ili na sistemski način. Splenociti i ne-parenhimske ćelije (NPC) jetre koje su infiltrirajuće imune ćelije, su obojene sa četiri različite mešavine za dobijanje protočne citometrije.

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 15A, samo anti-SIRPa antitelo značajno produžava preživljavanje kod frakcije miševa (28%). U kombinaciji sa anti-4-1BB ili anti-PDL1 antitelima, anti-SIRPa antitelo omogućava veoma visoku stopu odgovora miševa koji prežive čak i nakon povlačenja terapije.>

<Kao što je prikazano na Slici 15B, kombinacija anti-SIRPa sa kostimulativnim agensom (npr. anti-4-1BB) ili inhibitorom kontrolne tačke T-ćelija (npr. anti-PDL1) modifikuje tumorsko mikrookruženje>smanjenjem regulatornih i imunosupresivnih imunih ćelija (Tregs, Mo-MDSC) uz povećanje akumulacije efektorske memorije CD8+ T ćelija u kombinaciji sa anti-4-1BB. Mo-MDSC karakteriše visoka ekspresija Ly6C i nema Ly6G među pozitivnom populacijom CD11b i negativnom populacijom MHC klase II.

Kao što je prikazano na Slici 15C, kombinacija anti-SIRPa sa ko-stimulativnim agensom (npr. anti-4-1BB) ili inhibitorom kontrolne tačke T-ćelija (npr. anti-PDL1) modifikuje ćelijski sastav mikrookruženja tumora i na periferiji u slezina, smanjenjem učestalosti nezrelih i naivnih B ćelija uz<povećanje akumulacije memorije i ćelija plazmablasta. Slično, akumulacija citolitičkih (CD27-negativnih) NK ćelija indukuje tumor i periferiju kombinacijom anti-SIRPa sa anti-41BB ili anti->PDL1.

Sve u svemu, anti-SIRPa modifikuje tumor i periferni imunitet, posebno adaptivne (T-ćelije, Tregs,B-ćelije) i urođene (MDSC, Makrofagi, NK ćelije) imune ćelije, doprinoseći eliminaciji tumora idugotrajnoj zaštiti.

Primer 17. Antitumorski efekti kod prethodno izlečenih miševa

<Metoda: Miševi koji su prethodno izlečeni u modelu hepatoma injekcijom anti-SIRPa anti-4-1BB ili mutantni miševi SIRPa tretirani sa anti-4-1BB su ponovo izazvani injekcijom Hepa 1.6 ćelija u>slezinu (2.5.10^6 ćelija/miš ). Miševi su anestezirani sa 3% izoflurana u vazduhu. Nakon incizije na boku miševa i izolacije slezine, tumorske Hepa 1.6 ćelije su ubrizgane u slezinu (2,5,106 ćelija/50μL) u PBS. Naivni miševi su ubrizgavani paralelno na isti način kako bi se uporedio razvoj tumora saponovo izazvanim miševima.

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 15D, svi izlečeni miševi su preživeli kada su ponovo izazvani, a naprotiv, svi naivni miševi su uginuli. Ovaj rezultat pokazuje da su memorijske T ćelije>indukovane pod anti-SIRPa terapijom ili odsustvom SIRPa signala (SIRPa mutantni miševi) i da i dalje opstaju dugoročno kod izlečenih miševa.

Primer 18. Anti-tumorski efekti splenocita T-ćelija ili celih splenocita sakupljenih od miševa koji su prethodno izlečeni

<Metoda: Izlečeni miševi ponovo izazvani anti-SIRPa anti-4-1BB su eutanazirani i slezina je sakupljena. Nakon lize crvenih krvnih zrnaca, ekstrahovani su splenociti i CD3 pozitivne T ćelije su izolovane iz dela splenocita pomoću AutoMACS. Nakon anestezije, miševima su intravenozno>ubrizgani ili splenociti T-ćelija (2,5.106 ćelija/100 μL) ili celi splenociti (10.106 ćelija/100 μL) ili samo ekscipijent (PBS). Svi miševi su primili Hepa 1.6 ćelije kroz portalnu venu kao što je prethodno opisano (2,5.106 ćelija/100 μL).

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 15E, splenociti i izolovani T limfociti sakupljeni od izlečenih miševa imaju visok pozitivan efekat na preživljavanje miševa. Ovi rezultati pokazuju da su>memorijske T ćelije prisutne u splenocitima izlečenih miševa nakon tretmana hepatoma iodgovorne su za dugoročnu adaptivnu imunološku memoriju.

Primer 19. Anti-tumorski efekti kod prethodno izlečenih miševa

<Metoda: Miševi koji su prethodno izlečeni u modelu hepatoma injekcijom anti-SIRPa anti-PDL-1>ponovo su izazvani injekcijom Hepa 1.6 ćelija u slezinu (2.5.10^6 ćelija/miš). Miševi su anesteziranisa 3% izoflurana u vazduhu. Nakon incizije na boku miševa i izolacije slezine, tumorske Hepa 1.6ćelije su ubrizgane u slezinu (2,5.106 ćelija/50μL) u PBS. Naivni miševi su ubrizgavani paralelno naisti način kako bi se uporedio razvoj tumora sa ponovo izazvanim miševima.

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 16, svi izlečeni miševi su preživeli kada su ponovo izazvani, a naprotiv, svi naivni miševi su uginuli. Ovaj rezultat sugeriše da su memorijske T ćelije i dalje>prisutne kod izlečenih miševa. Ovaj rezultat pokazuje da su memorijske T ćelije indukovane podanti-SIRPa terapijom i da i dalje opstaju dugoročno kod izlečenih miševa.

Primer 20. Efekti rasta tumora u modelu karcinoma dojke

Metoda: Miševi su anestezirani sa 3% izoflurana u vazduhu. Miševi su obrijani na abdomenu i 4T1<ćelije su ubrizgane u mlečnu žlezdu insulinskim špricem (30 Gauges) u 50 μL PBS. Antagonističko>antiSIRPa antitelo (P84) ili kontrolno antitelo je ubrizgano tri puta nedeljno tokom četiri nedeljeintraperitonealno u PBS (200 μg/injekcija).

Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 17, anti-SIRPa antitelo značajno (p<0.01) smanjuje rasttumora u modelu karcinoma dojke u poređenju sa kontrolnim antitelom.

<Slika 18 prikazuje analizu imunih ćelija dve nedelje nakon inokulacije. Anti-SIRPa ima pozitivan>efekat na mijeloidne i ne-mijeloidne ćelije (T i NK ćelije) kako u tumoru tako i na periferiji (slezina)uz dramatično smanjenje Treg-ova i akumulaciju memorijskih T ćelija.

Primer 21. Efekti SIRPa antitela na koncentraciju hemoglobina i na hematokrit

<Metoda: Anti-SIRPa (klon P84), anti-CD47 (klon MIAP410) i irelevantna kontrola izotipa davani su intraperitonealno 0 i 2 dana u dozi od 12 mg/kg kod C57Bl/6 miševa. Uzorci krvi su prikupljeni na>dan 0 i dan 3 u epruvetama koje sadrže EDTA, a krvna slika je obavljena hematološkimanalizatorom XS-800i (Sysmex). Nivo hemoglobina (levo) i procenat hematokrita (desno) procenjeni su 3. dana.

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 19, anti-SIRPa antitelo nema toksično dejstvo na>koncentraciju hemoglobina i na hematokrit. Nasuprot tome, anti-CD47 antitelo izaziva smanjenjekoncentracije hemoglobina i hematokrita u skladu sa anemijom uočenom tokom faze 1 kod čoveka.

Primer 22. Agregacija trombocita

<Metoda: Krv je sakupljena od zdravih donatora dobrovoljaca u Vacuette collection epruvete (Greiner Bio-One) puferovane sa natrijum citratom. Plazma bogata trombocitima (PRP) i plazma siromašna trombocitima (PPP) dobijene su centrifugiranjem u trajanju od 10 minuta na 200 g i 15>minuta na 3500 g, respektivno. Radni PRP je podešen na 3.10<8>trombocita.L<-1>. Ogledi inhibicije: mAbsu prethodno inkubirana sa PRP za konačnu koncentraciju od 40 ili 50 μg/mL-1 test antitela. Posle 3 minuta bez mešanja, agregacija trombocita je započeta dodatkom ADP 5μM. Agregacija je određena merenjem transmisije svetlosti kroz uzorak na 37°C uz neprekidno mešanje pomoću standardnog<optičkog agregometra (TA-8V Thrombo-Aggregometer, SD Innovation SAS, Frouard, Francuska). Prenos PPP je postavljen kao 100%. Agregacija je zabeležena uz mešanje u trajanju od ukupno 5>minuta. Indukcioni ogledi: Agregacija trombocita je direktno inicirana dodavanjem mAb

(50 μg.mL-1). Agregacija je zabeležena uz mešanje na ukupno maks.10 minuta.

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 20, za razliku od anti-CD47 antitela, anti-SIRPa antitela se ne vezuju za humana crvena krvna zrnca ili trombocite. Shodno tome, anti-CD47 indukuje in vitro>agregaciju trombocita kod ljudi, dok anti-SIRPa antitela ne. Slično, anti-SIRPa antitela ne ometajureverzibilnu ADP-indukovanu agregaciju humanih trombocita, dok je anti-integrin alfa 2b potpuno poništava.

Primer 23. Proliferacija alogeneičnih T ćelija od strane SIRPa-blokirajućih CD14+ ćelija iz kanceroznog ascitesa jajnika

<Metoda: Alogeneične CD4 T ćelije su izolovane pozitivnom selekcijom korišćenjem AutoMACS (Miltenyi) iz hPBMC penastog premaza zdravog volontera. CD4 su postavljeni u ploču sa 96 posudica (50000 ćelija/posudica). CD14+ ćelije su izolovane istom metodom iz ascitesa obolele od>kancera jajnika. CD14+ ćelije su obložene alogenim CD4 T ćelijama u odnosu 1:1 tokom 5 dana. U nekim uslovima, humane alogeneične, monocitnog porekla dendritične ćelije (moDC) sazrele sa LPS-om su dodate u odnosu 1:5 da bi se stimulisale T ćelije i analizirano je imunosupresivno dejstvo<različitog odnosa CD14+ MDSC prečišćenog iz ascita. Antitela koja ciljaju na SIRPa/CD47 put su>dodavana od početka testa proliferacije u koncentraciji zasićenja (10 μg/mL). Proliferacija je merena ugradnjom H3-timidina tokom poslednjih 12 h kulture.

<Rezultati: Kao što je prikazano na Slikama 21A i 21B, sveže i smrznute humane mijeloične ćelije>(TAM) prečišćene od ascitesa kancera jajnika su hipo-stimulirajući alogeneični humani T limfociti.

Za razliku od anti-CD47 antitela, anti-SIRPa antitela modifikuju svojstva mijeloidnih ćelija<omogućavajući aktivaciju i proliferaciju humanih T-ćelija.>

Kao što je prikazano na Slici 21C, humane mijeloične ćelije (MDSC) prečišćene od ascitesa kancerajajnika mogu da potisnu proliferaciju humanih T-ćelija indukovanu alogeneičnim moDC u odnosu 1:1 i 2:1 mijeloida prema T-ćelijama. Za razliku od anti-CD47 antitela, anti-SIRPa antitela nepojačavaju imunosupresiju izazvanu humanim MDSC.

Claims

Patentni zahtevi

<1. Anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, naznačeno time, što sadrži:>

<- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane>iz grupe koju čine SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 i SEQ ID NO: 30, i

- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 33.
2. Anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema zahtevu 1,<naznačeno time, što sadrži:>

<- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene>u SEQ ID NO.30; i

- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO.33.
3. Anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema zahtevu 1,<naznačeno time, što sadrži:>

<- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene>u SEQ ID NO.28; i

- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO.33.
4. Anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema zahtevu 1,<naznačeno time, što sadrži:>

<- varijabilni domen teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene>u SEQ ID NO.29; i

- varijabilni domen lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO.33.

<
5. Anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od>zahteva 1 do 4, naznačeno time, što se konstantni domen lakog lanca sastoji od sekvence SEQ IDNo: 35.

<
6. Anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od>zahteva 1 do 5, naznačeno time, što se konstantni domen teškog lanca antitela sastoji od sekvenceSEQ ID No: 34.
7. Anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema zahtevu 1,<naznačeno time, što sadrži:>

- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 39, i

<- laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 45, ili>

<- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 40, i>

<- laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 45,>

<ili>

<- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID BR: 41, i>

- laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 45,

ili

- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 42, i

- laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 45.
8. Anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema zahtevu 7,<naznačeno time, što sadrži:>

- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 42, i

- laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 45.
9. Anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema zahtevu 7,<naznačeno time, što sadrži:>

- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 40, i

- laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 45.
10. Anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema zahtevu 7,<naznačeno time, što sadrži:>

- teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 41, i

- laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 45.
11. Anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema zahtevima 1 do10, naznačeno time, što je za upotrebu kao lek.

<
12. Anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1 do 10, naznačeno time, što je za upotrebu u prevenciji ili lečenju bolesti izabrane iz grupe koju čine kancer, posebno inflamatorni kancer i kancer sa infiltriranim mijeloidnim ćelijama, posebno sa infiltriranim MDSCs i/ili TAM ćelijama, zarazna bolest, hronična inflamatorna bolest,>auto-imuna bolest, neurološka bolest, povreda mozga, povreda nerva, policitemija, hemohromatoza, trauma, septički šok, hronična zarazna bolest, posebno Pseudomonas i CMV, fibroza, ateroskleroza, gojaznost, dijabetes tipa II i disfunkcija transplantacije, ili je za upotrebu u vakcinaciji.

<
13. Anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 10, za upotrebu prema zahtevu 11 ili 12, naznačeno time, što se>pomenuto anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen primenjuje kod pacijenta sa SIRPa-pozitivnim tumorom.

<
14. Farmaceutska kompozicija naznačena time, što sadrži najmanje jedno anti-humano SIRPa>antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1do 10, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

<
15. Kombinovani proizvod naznačen time, što sadrži:>

<- najmanje jedno anti-humano SIRPa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 10, i>

- najmanje jedan drugi terapeutski agens odabran iz grupe koju čine hemoterapeutski agensi, agensi za radioterapiju, imunoterapeutski agensi, agensi za ćelijsku terapiju, antibiotici i probiotici; posebno imunoterapeutski agensi izabrani iz grupe koju čine blokator kontrolnih<tačaka ili aktivator adaptivnih imunih ćelija, posebno izabrani iz grupe koju čine anti-PDL1, anti-PD1, anti-CTLA4, anti-CD137, anti-CD2, anti-CD28, anti-CD40, anti-HVEM, anti-BTLA, anti-CD160, anti-TIGIT, anti-TIM-1/3, anti-LAG-3, anti-2B4 i anti-OX40, anti-CD40 agonist,>CD40-L, TLR agonisti, anti-ICOS, ICOS-L i agonisti receptora B-ćelija,

za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu kao lek.
16. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen naznačen time, što je prema bilo kom od zahteva 1 do 10.
17. Vektor naznačen time, što sadrži molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 16.
18. Izolovana ćelija domaćina naznačena time, što sadrži molekul nukleinske kiseline premazahtevu 16 i/ili vektor prema zahtevu 17.

<19. Metoda in vitro ili ex vivo za određivanje SIRPa pozitivne ćelije kod subjekta iz biološkog uzorka prethodno dobijenog od navedenog subjekta, naznačena time, što obuhvata:>

<i) određivanje in vitro ekspresije i/ili nivoa ekspresije SIRPa, u biološkom uzorku koji je>prethodno dobijen od pomenutog subjekta korišćenjem anti-humanog SIRPa antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 10.