RS66435B1 - Dozni režim za gp100-specifični tcr - anti-cd3 scfv fuzioni protein - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na lečenje kancera, posebno gp100 pozitivnih kancera. Konkretno, odnosi se na režim doziranja za bispecifični terapeutik za preusmeravanje T ćelija koji sadrži ciljni deo koji vezuje YLEPGPVTA-HLA-A2 kompleks fuzionisan za CD3 vezujući deo za preusmeravanje T ćelija.

[0002] Tehničke informacije otkrivene u nastavku mogu u nekim aspektima prevazići obim pronalaska, koji je definisan isključivo priloženim patentnim zahtevima. Takve dodatne tehničke informacije koje ne spadaju u obim priloženih patentnih zahteva nisu deo pronalaska. Sve reference na postupke lečenja u ovom opisu treba tumačiti kao reference na odgovarajuća jedinjenja, farmaceutske kompozicije i/ili lekove za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog ili životinjskog tela terapijom.

[0003] Humani glikoprotein 100 (gp100) je jedan od panela antigena povezanih sa melanomom na koje telo može da uspostavi prirodni imuni odgovor. Protein je glikoprotein od 661 aminokiseline povezan sa melanozomalnom membranom koji je eksprimiran u normalnim melanocitima i široko eksprimiran na većini ćelija kancera melanoma. Na primer, jedna studija (Trefzer et al., (2006) Melanoma Res. 16(2): 137-45) otkrili su da 82% od 192 metastaze melanoma od 28 pacijenata sa melanomom eksprimiraju gp100. Nekoliko studija je prijavilo više nivoe ekspresije gp100 u tkivima melanoma (Hofbauer et al., (2004) J Immunother.27(1): 73-78, Barrov et al., (2006) Clin Cancer Res. 12:764-71). Dok su većina gp100 pozitivnih kancera melanomi, literatura takođe sadrži brojne izveštaje o drugim oblicima kancera kao što su sarkom bistrih ćelija i različiti podtipovi kancera mozga koji eksprimiraju gp100 kao što je otkriveno, na primer, imunohistohemijom sa antitelom sa nazivom HMB-45, široko korišćeno gp100 specifično dijagnostičko antitelo (Huang et al., (2015) Int J Clin Exp Pathol.8(2):2171-5, Ozuguz et al., (2014) Indian Dermatol Online J 5(4): 488-90, Taddei et al., Appl Immunohistochem Mol Morphol (2001) 9(1):35-41). Tačna funkcija proteina je nepoznata, ali izgleda da je uključen u sazrevanje melanozoma (Hoashi et al., 2005; Kawakami i Rosenberg, 1997). Antigen gp100 je bio, i nastavlja da bude, meta brojnih kliničkih ispitivanja melanoma zasnovanih na imunoterapiji.

[0004] Rana gp100 ciljana imunoterapija uključivala je strategije vakcinacije sa peptidima ili virusima koji eksprimiraju gp100 protein u celosti, ili njegove delove (pregledno dato u (Lens (2008) Expert Opin Biol Ther. 8(3): 315-323.)). Ova ispitivanja su imala ograničen uspeh za koji se smatra da je rezultat stvaranja nedovoljnog imunološkog odgovora, a ne odraz validnosti mete. Stoga, princip upotrebe gp100 kao mete melanoma ostaje validan pristup za imunoterapiju specifičnu za melanom.

[0005] Razvoj novog bispecifičnog terapeutika koji se sastoji od receptora za T ćelije, specifičnog za gp100, ciljane grupe fuzionisane za CD3 vezujući deo za preusmeravanje T ćelija pruža novu opciju lečenja (Liddy et al., (2012). Nat Med. 8: 980-987). Mehanizam delovanja takvog terapeutika je značajno drugačiji od drugih prethodnika imunoterapije i rezultuje brzim i moćnim preusmeravanjem ne-gp100 specifičnih T ćelija da ubiju gp100 pozitivne ćelije. in vitro; stoga postoji razumno obrazloženje za očekivanje kako poboljšanih rezultata kliničke efikasnosti kod pacijenata, tako i vantumorske toksičnosti od aktivnosti protiv gp100 pozitivnih normalnih tkiva kao što su melanociti kože.

[0006] Peptid YLEPGPVTA (SEQ ID No: 1) odgovara aminokiselinskim ostacima broj 280-288 gp100. YLEPGPVTA (SEQ ID No: 1) peptid je predstavljen molekulima klase I HLA na gp100<+>/HLA-A*02<+>ćelije raka (Salgaller et al., (1996) Cancer Res 56: 4749-4757). WO2011/001152 opisuje TCR koji vezuju YLEPGPVTA peptid predstavljen kao kompleks peptid-HLA-A*02. TCR su mutirani u odnosu na prirodne gp100 TCR alfa i/ili beta varijabilne domene da bi imali poboljšane afinitete vezivanja za, i/ili poluživote vezivanja za kompleks, i mogu biti povezani (kovalentno ili drugačije) sa terapeutskim agensom. Jedno takvo terapeutsko sredstvo je anti-CD3 antitelo, ili funkcionalni fragment ili varijanta pomenutog anti-CD3 antitela kao što je varijabilni jednolančani fragment (scFv). Anti-CD3 antitelo ili fragment mogu biti kovalentno vezani za C- ili N-kraj alfa ili beta lanca TCR-a. Takvi TCR su korišćeni za lečenje melanoma kod pacijenata (identifikator kliničkog ispitivanja NCT01211262).

[0007] IMCgp100 je bispecifično terapeutsko sredstvo za preusmeravanje T ćelija koje sadrži rastvorljivi TCR sa pojačanim afinitetom koji se vezuje za YLEPGPVTA peptidni kompleks -HLA-A*02, fuzionisan sa anti-CD3 scFv. Pokazalo se da IMCgp100 funkcioniše in vitro vezivanjem za gp100 pozitivne ciljne ćelije i izazivanjem ubijanja putem regrutovanja i tumorspecifičnih i ne-tumor-specifičnih T ćelija. Kada se veže za kompleks peptid-HLA-A*02 na površini gp100 pozitivne ciljne ćelije, IMCgp100 unakrsno povezuje ciljanu ćeliju sa T ćelijom kroz interakciju anti-CD3 scFv dela molekula. Unakrsno povezivanje dve ćelije putem bispecifične terapije rezultira formiranjem imunske sinapse, aktivacijom T ćelije i preusmeravanjem T ćelijskog odgovora na gp100 pozitivnu ciljnu ćeliju. IMCgp100 može aktivirati i CD4<+>i CD8<+>T ćelije; međutim, njegova primarna funkcija je da indukuje odgovore CD8<+>T ćelija. CD8<+>T ćelije, takođe poznate kao citotoksični T limfociti (CTL), igraju suštinsku ulogu u repertoaru prirodnog imunog sistema za borbu protiv kancera. CTL su citolitički i funkcionišu tako što indukuju lizu tumorske ćelije kroz apoptotski put.

[0008] Kao što je prethodno pomenuto, gp100 se eksprimira u normalnim zdravim ćelijama uključujući melanocite, što povećava mogućnost reaktivnosti na meti, van tumora u kliničkom okruženju. Poznato je da su nivoi ekspresije gp100 u melanocitima niži nego u tumorima. Tokom pretkliničkog testiranja IMCgp100, potvrđeno je da je IMCgp100 bio u stanju da preusmeri aktivnost T ćelija na normalne melanocite, ali sa nižom potencijom od tumorskih ćelija, pri čemu je moć u ovom kontekstu direktno proporcionalna broju epitopa prikazanih na površini ciljne ćelije (Liddy et al., (2012). Nat Med. 8: 980-987). Dok ovi podaci ukazuju na potencijalni terapijski prozor između reaktivnosti na tumor i van tumora, reaktivnost na ciljne ćelije van tumora ne može se isključiti sa IMCgp100 tretmanom. Očekuje se da će se svaka reaktivnost na melanocite u koži tokom kliničkog testiranja manifestovati kao toksičnost na koži, kao što je osip, vitiligo i efekti lokalizovanog oslobađanja citokina i hemokina, koji se mogu kontrolisati tretmanom hidrokortizonom. Nikakvi drugi bezbednosni problemi nisu identifikovani tokom in vitro pretkliničkog testiranja IMCgp100, uključujući nepostojanje dokaza za unakrsnu reaktivnost van cilja. IMCgp100 je odobren za klinička ispitivanja na osnovu ovih podataka. Kao što će proceniti stručnjaci u ovoj oblasti, odgovarajući nivoi terapeutske doze se ne mogu prethodno predvideti i zavise i od mehanizma delovanja leka i od profila ekspresije ciljnog antigena. Stoga sledi da, iako su poznate toksičnosti na ciljne ćelije van tumora za brojne gp100 specifične vakcine i autologne terapije T ćelija koje su procenjene na klinici, i dalje bi bilo nemoguće a priori predvideti odgovarajuću terapijsku dozu za terapeutik koji preusmerava T ćelije. To je zato što, dok vakcine i autologne terapije T ćelija dovode do toga da samo mali deo T ćelija kod pacijenta može da prepozna gp100 pozitivne ćelije, terapeutik za preusmeravanje T ćelija u teoriji može da obezbedi svakoj CD3 pozitivnoj T ćeliji kod pacijenta. sposobnost prepoznavanja i reagovanja na gp100 pozitivne ćelije.

[0009] Bezbednost i tolerancija na IMCgp100 kod pacijenata sa uznapredovalim melanomom je ispitana u fazi I ispitivanja (identifikator kliničkog ispitivanja NCT01211262). Predstavljeni su privremeni rezultati ove studije (Middleton et al., (2015) Cancer Res 2015; 75 (15 Suppl): Abstract nr CT106). Utvrđeno je da je maksimalna tolerisana doza za nedeljnu primenu 600 ng/kg, koja je preneta na preporučenu dozu faze II (RP2D) od 50 µg po dozi, bez obzira na težinu pacijenta. Tokom dela studije o eskalaciji doze, teška hipotenzija (stepen 3/4) je primećena kao glavna toksičnost koja ograničava dozu. Grupa pacijenata je naknadno primala nedeljno doziranje RP2D i prijavljene su dalje epizode teške hipotenzije. Ostali uobičajeni neželjeni događaji uključivali su osip, pruritus, pireksiju i edem. Neželjeni događaji se obično manifestuju ubrzo nakon prve ili druge doze leka. Dodatne nedeljne doze IMCgp100 iznad doze 2 dovele su do manje neželjenih reakcija i opšteg poboljšanja težine ovih događaja. Da bi se povećala tolerancija tokom ranih doza, prva nedeljna doza IMCgp100 je smanjena za 20% na 40 µg kao što je uobičajena praksa, nakon čega je usledilo doziranje na RP2D u narednim nedeljama. Međutim, i dalje su se javljali slučajevi teške hipotenzije. Ekspresija gp100 u melanocitima unutar kože obezbeđuje veliki depo antigen pozitivnih ćelija u najvećem organu u telu. Snažno ciljanje gp100 pozitivnih ćelija od strane IMCgp100 dovodi do preusmerene aktivnosti T ćelija protiv gp100 pozitivnih melanocita kože. Ovo se manifestuje kao toksičnost na koži kod pacijenata. Analiza seruma pacijenata i uzoraka biopsije pokazuje lokalizovano oslobađanje citokina i hemokina kako u koži tako i u tumorima, što dovodi do toga da se velika količina T ćelija prenosi iz periferne cirkulacije u tkiva u izuzetno kratkom vremenskom periodu; značajne promene tečnosti povezane sa ovom brzom migracijom T ćelija dovode do hipotenzije.

[0010] U prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični terapeutik za preusmeravanje T ćelija koji sadrži (i) ciljni deo koji vezuje YLEPGPVTA-HLA-A2 kompleks fuzionisan za (ii) CD3 vezujući deo za preusmeravanje T ćelija, pri čemu je ciljni deo T ćelijski receptor (TCR), deo za preusmeravanje T ćelija koji vezuje CD3 je anti-CD3 antitelo, a bispecifični terapeutik sadrži sekvencu TCR alfa lanca iz SEQ ID No: 4 i sekvencu TCR beta lanca-anti-CD3 iz SEQ ID No: 5, za upotrebu u postupku lečenja gp100 pozitivnih kancera kod pacijenta koji obuhvata davanje bispecifičnog terapeutika navedenom pacijentu intravenskom infuzijom u

(a) najmanje jednoj prvoj dozi u opsegu od 10 do 30 µg;

(b) najmanje jednoj drugoj dozi u opsegu od 20 do 40 µg, pri čemu je ili svaka druga doza veća od prve doze; i zatim

(c) najmanje jednoj dozi u opsegu od 50 do 70 µg,

pri čemu se svaka doza primenjuje svakih 5-10 dana.

[0011] Pronalazači su iznenađujuće pronašli režim eskalacije doze unutar pacijenta koji obezbeđuje poboljšanu toleranciju za lečenje gp100 pozitivnih tumora sa bispecifičnim terapeutikom koji koristi mehanizam delovanja posredovan preusmeravanjem T ćelija. Predmetni pronalazak obezbeđuje eskalirajući režim doziranja u kome su neželjeni sporedni efekti, kao što je teška hipotenzija, značajno smanjeni. Režim doziranja je koristan za smanjenje ozbiljnosti ciljane vantumorske toksičnosti kod pacijenata, čime se smanjuje potreba da pacijenti ostanu hospitalizovani i/ili budu primljeni na intenzivnu negu tokom prvih nekoliko nedelja lečenja. Dodatna i iznenađujuća korist je da, kroz poboljšanje efekata na ciljnu vantumorsku aktivnost T ćelija korišćenjem režima doziranja, pacijenti mogu kasnije bezbedno da tolerišu veće ukupne terapijske nivoe doze od postojećeg R2P2 od 50 µg, za šta se očekuje poboljšanje kliničke efikasnosti. Bez želje da budu vezani teorijom, pronalazači pretpostavljaju da je limit doze toksičnosti u vidu hipotenzije vođen Cmaxnivoima izloženosti bispecifičnom terapijskom leku, prisustvom velike količine gp100 pozitivnih melanocita u predelu kože i stepenom ekspresije tumora gp100 kod pacijenta u odnosu i na opteređenost bolešću pacijenta i nivo ekspresije gp100 kod tumora pacijenata. Pronalazači veruju da režim doziranja može omogućiti dovoljno uništavanje normalnih melanocita kože koji eksprimiraju visoke nivoe gp100 da bi se kasnije omogućilo sigurnije davanje viših terapijskih doza koje rezultiraju poboljšanim ciljanjem preostalih gp100 pozitivnih tumorskih ćelija i time poboljšaju kliničku efikasnost.

[0012] Pronalazači su primetili da pacijenti sa tumorima većeg prečnika ili većim ukupnim opterećenjem bolesti doživljavaju objektivne tumorske odgovore pri većoj ukupnoj izloženosti IMCgp100 nego pacijenti sa manjim tumorima ili opterećenjem bolesti. Na osnovu ovih podataka, pronalazači pretpostavljaju da povećana izloženost leku u nedeljama nakon ublažavanja toksičnosti koja je ranije ograničavala dozu korišćenjem režima doziranja prema pronalasku može dovesti do poboljšanog odgovora tumora.

[0013] U predmetnom pronalasku, odgovarajuće doze su izražene kao određena težina terapeutika bez obzira na težinu pacijenta ili da li bi ista količina terapeutika bila primenjena ako bi se izračunala pomoću nekog od drugih postupaka koji se rutinski koriste za izračunavanje odgovarajuće doze za pacijenta kao što je kao težina terapeutika po kg telesne težine, površina tela ili čista mišićna masa itd. Poželjno je ako se navedena težina terapeutika daje u nedeljnim intervalima, npr. na dane 1, 8, 15, 22 itd., režima lečenja, ali interval doziranja može biti duži ili kraći. Interval doziranja može zavisiti od karakteristika vezivanja antigena bispecifičnog terapeutika koji preusmerava T ćelije i njegovog klirens poluživota. Dakle, svaka doza se može primeniti svakih 6-9 ili 6-8 dana. Poželjno je da se svaka doza daje svakih 7 dana. Odgovarajuće doze mogu biti razdvojene u različitim intervalima. Alternativno, mogu biti razdvojene istim intervalom.

[0014] Prva doza je u rasponu od 10-30 µg. Može biti u rasponu od 13-27 µg, 15-25 µg ili 18-22 µg. Doza može biti 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 µg. Jedna poželjna prva doza je 20 µg, koja se može primenjivati na nedeljnoj bazi. Može se dati jedna prva doza. Alternativno, može se primeniti više od jedne prve doze, poželjno 2-5 prvih doza i poželjnije dve prve doze. Poželjno je da, ako se daju dve ili više prvih doza, one budu iste. Međutim, one mogu biti drugačije.

[0015] Druga doza je u rasponu od 20-40µg i veća je od prve doze. Druga doza može biti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 µg veća od prve doze. Može biti u rasponu od 23-37 µg, 25-35 µg ili 28-32 µg. Sledeća doza može biti 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 35 µg. Jedna poželjna druga doza je 30 µg, koja se može davati nedeljno. Može se dati jedna druga doza. Alternativno, može se primeniti više od jedne druge doze, poželjno 2-5 drugih doza i poželjnije dve druge doze. Poželjno je da, ako se daju dve ili više drugih doza, one budu iste. Međutim, one mogu biti drugačije.

[0016] Doza nakon druge doze je u rasponu od 50-70 µg. Doza može biti najmanje 50, 55, 60 ili 65 µg. Jedna poželjna doza nakon druge doze je 50 µg. Druga je 60 µg i još jedna je 70 µg. Ista doza se može koristiti naknadno. Alternativno, doza se može povećati. Na primer, doza može biti veća za 5, 10, 15, 20, 30, 40 ili 50 µg.

[0017] Prva doza može biti 20 µg, druga doza može biti 30 µg i/ili doza nakon druge doze može biti 50 µg ili veća.

[0018] Bispecifični terapeutik za preusmeravanje T ćelija, koristan u ovom pronalasku, sadrži (i) ciljni deo koji se vezuje za YLEPGPVTA-HLA-A2 kompleks fuzionisan za (ii) deo za preusmeravanje T ćelija koji vezuje CD3, kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.

[0019] Ciljni deo je receptor T ćelija (TCR). TCR su opisani korišćenjem TCR nomenklature međunarodne imunogenetike (IMGT) i vezuju se za javnu bazu podataka IMGT TCR sekvenci. Jedinstvene sekvence definisane IMGT nomenklaturom su široko poznate i dostupne onima koji rade u oblasti TCR. Na primer, mogu se naći u "T cell Receptor Factsbook", (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8; Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011 (6): 595-603; Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 1O; Lefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260-266, i na veb stranici IMGT (www.IMGT.org)

[0020] TCR koji su ovde otkriveni mogu biti u bilo kom formatu poznatom stručnjacima. Na primer, TCR mogu biti αβ heterodimeri, ili mogu biti u jednolančanom formatu (kao što su oni opisani u WO9918129). Jednolančani TCR uključuju αβ TCR polipeptide tipa: Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ ili Vα-Cα-L-Vβ-Cβ, izborno u obrnutoj orijentaciji, pri čemu su Vα i Vβ TCR α i β varijabilni regioni, respektivno, Cα i Cβ su TCR α i β konstantni regioni respektivno, a L je sekvenca linkera. TCR u bispecifičnom terapeutiku za preusmeravanje T ćelija za upotrebu u pronalasku je u rastvorljivom obliku (tj. nema transmembranske ili citoplazmatske domene). Za stabilnost, takvi rastvorljivi TCR poželjno imaju uvedenu disulfidnu vezu između ostataka odgovarajućih konstantnih domena, kao što je opisano, na primer, u WO 03/020763. Poželjni TCR ovog tipa obuhvataju one koji imaju sekvencu konstantnog domena TRAC1 i sekvencu konstantnog domena TRBC1 ili TRBC2, osim što su Thr 48 TRAC1 i Ser 57 TRBC1 ili TRBC2 zamenjeni ostacima cisteina, pri čemu navedeni cisteini formiraju disulfidnu vezu između TRAC1 sekvence konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvence konstantnog domena TCR. Drugi TCR koji su ovde otkriveni mogu sadržati alfa i beta lance pune dužine.

[0021] Konstantni domen alfa i/ili beta lanca TCR otkrivenih ovde može biti skraćen u odnosu na nativne/prirodne TRAC/TRBC sekvence. Pored toga, TRAC/TRBC može sadržati modifikacije. Na primer, ekstracelularna sekvenca alfa lanca može uključiti modifikaciju u odnosu na nativni/prirodni TRAC pri čemu je aminokiselina T48 TRAC-a, prema IMGT numeraciji, zamenjena sa C48. Slično, ekstracelularna sekvenca beta lanca može uključiti modifikaciju u odnosu na nativni/prirodni TRBC1 ili TRBC2, pri čemu se S57 od TRBC1 ili TRBC2, prema IMGT numeraciji, zamenjuje sa C57. Ove supstitucije cisteina u odnosu na ekstracelularne sekvence nativnog alfa i beta lanca omogućavaju formiranje ne-nativne međulančane disulfidne veze koja stabilizuje ponovo presavijeni rastvorljivi TCR, tj. TCR formiran ponovnim savijanjem ekstracelularnih alfa i beta lanaca (WO 03/020763). Ova nenativna disulfidna veza olakšava prikaz pravilno presavijenih TCR-ova na fagu (Li et al., Nat Biotechnol 2005, Mar;23(3):349-54). Pored toga, upotreba stabilnog rastvorljivog TCR vezanog disulfidom omogućava pogodniju procenu afiniteta vezivanja i poluživota vezivanja. Alternativne pozicije za formiranje ne-nativne disulfidne veze su opisane u WO 03/020763.

[0022] TCR koji su ovde otkriveni mogu biti projektovani tako da uključuju mutacije. Postupci za proizvodnju mutiranih TCR varijanti visokog afiniteta kao što su fagni prikaz i mutageneza usmerena na mesto poznati su stručnjacima (na primer, videti WO 04/044004 i Li et al., Nat Biotechnol 2005, mar;23(3):349-54).

[0023] TCR korisni u ovom pronalasku mogu imati afinitet vezivanja i/ili poluvreme vezivanja za kompleks YLEPGPVTA-HLA-A2 najmanje dvostruko veći od TCR koji ima sekvencu ekstracelularnog alfa lanca SEQ ID No: 2 i ekstracelularni beta lanac sekvence SEQ ID No: 3. TCR korisni u pronalasku mogu imati KDza kompleks od ≤8 µM, ≤5 µM, ≤1µM, ≤0.1 µM, ≤0.01 µM, ≤0.001 µM, ili ≤0.0001 µM i/ili imaju poluživot vezivanja (T1⁄2) za kompleks od ≥1.5 s, ≥3 s, ≥10 s, ≥20 s, ≥40 s, ≥60 s, ≥600 s ili ≥6000 s. Poželjne KDi/ili poluživot vezivanja (T1⁄2) su približno 10-100 pM i približno 6-48 časova. Posebno poželjna KDi/ili poluživot vezivanja (T1⁄2) su približno 24 pM i približno 24 časa.

[0024] Afinitet vezivanja (obrnuto proporcionalan konstanti ravnoteže KD) i poluživot vezivanja (izražen kao T1⁄2) može se odrediti bilo kojim odgovarajućim postupkom. Shvatiće se da udvostručavanje afiniteta TCR rezultuje prepolovljenjem KD. T1⁄2 se izračunava kao ln2 podeljen sa stopom isključenja (koff). Dakle, udvostručenje T1⁄2 rezultira prepolovljenjem koff. KDi koffvrednosti za TCR se obično mere za rastvorljive oblike TCR, tj. one oblike koji su skraćeni da bi se uklonili ostaci hidrofobnog transmembranskog domena. Stoga treba razumeti da dati TCR ispunjava zahtev da ima afinitet vezivanja za, i/ili poluvreme vezivanja za kompleks YLEPGPVTA-HLA-A2, ako rastvorljivi oblik tog TCR ispunjava taj zahtev. Poželjno, afinitet vezivanja ili poluživot vezivanja datog TCR se meri nekoliko puta, na primer 3 ili više puta, koristeći isti protokol analize, i uzima se prosek rezultata. Ova merenja se mogu izvršiti korišćenjem postupka rezonance površinskog plazmona (BIAcore) iz Primera 3 WO2011/001152. Referentni gp100 TCR - koji ima sekvencu ekstracelularnog alfa lanca SEQ ID No: 2 i sekvencu ekstracelularnog beta lanca SEQ ID No: 3 - ima KDod približno 19 µM izmereno tom metodom, i koffod približno 1 s<-1>(tj. T1⁄2 od približno 0.7 s).

[0025] TCR koji su ovde otkriveni mogu biti povezani sa anti-CD3 antitelom, ili funkcionalnim fragmentom ili varijantom pomenutog anti-CD3 antitela, i mogu biti kao što je opisano u WO2011/001152. Fragmenti antitela i varijante/analozi koji su pogodni za upotrebu u kompozicijama i metodama opisanim ovde uključuju, ali nisu ograničeni na mini tela, Fab fragmente, F(ab')2fragmente, dsFv i scFv fragmente, Nanobodies<™>(ovi konstrukti, koje prodaje Ablynx (Belgija), sadrže sintetički pojedinačni imunoglobulinski varijabilni teški domen dobijen iz antitela kamile (npr. kamile ili lame)) i domen antitela (Domantis (Belgija), koja se sastoje od afinitetno sazrelog pojedinačnog imunoglobulinskog varijabilnog teškog domena ili imunoglobulinskog varijabilnog lakog domena).

[0026] Bispecifični terapeutik za preusmeravanje T ćelija za upotrebu u ovom pronalasku sadrži deo za preusmeravanje T ćelija koji se vezuje za CD3 koji je anti-CD3 antitelo, kao što je definisano u patentom zahtevu 1. Bispecifični terapeutik sadrži sekvencu TCR alfa lanca SEQ ID No: 4 i TCR beta lanac-anti-CD3 sekvencu SEQ ID No: 5.

[0027] TCR-anti CD3 fuzije koje su ovde otkrivene uključuju sekvencu aminokiselina TCR alfa lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od:

(i) sekvence TCR alfa lanca SEQ ID No: 2, gde su aminokiseline 1 do 109 zamenjene sekvencom SEQ ID No: 4, gde aminokiselina na poziciji 1 je S;

(ii) sekvence TCR alfa lanca SEQ ID No: 2, gde su aminokiseline 1 do 109 zamenjene sekvencom SEQ ID No: 4, gde aminokiselina na poziciji 1 je A;

(iii) sekvence TCR alfa lanca SEQ ID No: 2, gde su aminokiseline 1 do 109 zamenjene sekvencom SEQ ID No: 4, gde aminokiselina na poziciji 1 je G;

(iv) sekvence TCR alfa lanca SEQ ID No: 2, gde su aminokiseline 1 do 109 zamenjene sekvencom SEQ ID No: 4, gde aminokiselina na poziciji 1 je S, a C-terminus alfa lanca je skraćen za 8 aminokiselina od F196 do S203 inkluzivno, na osnovu numeracije SEQ ID No: 2;

(v) sekvence TCR alfa lanca SEQ ID No: 2, gde su aminokiseline 1 do 109 zamenjene sekvencom SEQ ID No: 4, gde aminokiselina na poziciji 1 je A, a C-terminus alfa lanca je skraćen za 8 aminokiselina od F196 do S203 inkluzivno, na osnovu numeracije SEQ ID No: 2;

(vi) sekvence TCR alfa lanca SEQ ID No: 2, gde su aminokiseline 1 do 109 zamenjene sekvencom SEQ ID No: 4, gde aminokiselina na poziciji 1 je G, a C-terminus alfa lanca je skraćen za 8 aminokiselina od F196 do S203 inkluzivno, na osnovu numeracije SEQ ID No: 2; i

TCR beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od:

(vii) TCR beta lanac anti-CD3 sekvence SEQ ID No: 5, gde aminokiseline na pozicijama 1 i 2 su D i I, respektivno;

(viii) TCR beta lanac anti-CD3 sekvence SEQ ID No: 5, gde aminokiseline na pozicijama 1 i 2 su A i I, respektivno;

(ix) TCR beta lanac-anti-CD3 sekvence SEQ ID No: 5, gde aminokiseline na pozicijama 1 i 2 su A i Q, respektivno;

(x) TCR beta lanac-anti-CD3 sekvenca SEQ ID No: 5, gde aminokiseline na pozicijama 1 i 2 su D i I respektivno, aminokiseline na pozicijama 108-131 su zamenjene sa RTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG (SEQ ID No: 6), a aminokiseline na pozicijama 254-258 su zamenjene sa GGEGGGSEGGGS (SEQ ID No: 7);

(xi) TCR beta lanac anti-CD3 sekvence SEQ ID No: 5, gde aminokiseline na pozicijama 1 i 2 su D i I, respektivno i aminokiselina na poziciji 257 je S, a aminokiselina na poziciji 258 je G ;

(xii) TCR beta lanac-anti-CD3 sekvenca SEQ ID No: 5, gde aminokiseline na pozicijama 1 i 2 su D i I, respektivno i aminokiselina na poziciji 256 je S, a aminokiselina na poziciji 258 je G;

(xiii) TCR beta lanac anti-CD3 sekvence SEQ ID No: 5, gde aminokiseline na pozicijama 1 i 2 su D i I, respektivno i aminokiselina na poziciji 255 je S, a aminokiselina na poziciji 258 je G;

1

(xiv) TCR beta lanac anti-CD3 sekvence SEQ ID No: 5, gde aminokiseline na pozicijama 1 i 2 su A i K, i gde aminokiselina na poziciji 257 je S, a aminokiselina na poziciji 258 je G;

(xv) TCR beta lanac-anti-CD3 sekvenca SEQ ID No: 5, gde aminokiseline na pozicijama 1 i 2 su A i K, i gde aminokiselina na poziciji 256 je S, a aminokiselina na poziciji 258 je G;

(xvi) TCR beta lanac anti-CD3 sekvence SEQ ID No: 5, gde aminokiseline na pozicijama 1 i 2 su A i K, i gde aminokiselina na poziciji 255 je S, a aminokiselina na poziciji 258 je G;

(xvii) TCR beta lanac-anti-CD3 sekvenca SEQ ID No: 5, gde aminokiseline na pozicijama 1 i 2 su A i I, respektivno, i gde aminokiselina na poziciji 257 je S, a aminokiselina na poziciji 258 je a G;

(xviii) TCR beta lanac anti-CD3 sekvence SEQ ID No: 5, gde aminokiseline na pozicijama 1 i 2 su A i I, respektivno, i gde aminokiselina na poziciji 256 je S, a aminokiselina na poziciji 258 je a G;

(xix) TCR beta lanac-anti-CD3 sekvenca SEQ ID No: 5, gde aminokiseline na pozicijama 1 i 2 su A i I, respektivno, i gde aminokiselina na poziciji 255 je S, a aminokiselina na poziciji 258 je a G;

[0028] Primeri takvih TCR-anti CD3 fuzija koje su ovde otkrivene su oni u kojima:

aminokiselinska sekvenca alfa lanca je (i) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (vi);

sekvenca aminokiselina alfa lanca je (i) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (x);

aminokiselinska sekvenca alfa lanca je (vi) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (ix);

sekvenca aminokiselina alfa lanca je (vi) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (vii);

sekvenca aminokiselina alfa lanca je (i) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (xi);

sekvenca aminokiselina alfa lanca je (i) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (xii);

sekvenca aminokiselina alfa lanca je (i) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (xiii);

sekvenca aminokiselina alfa lanca je (vi) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (xiv);

sekvenca aminokiselina alfa lanca je (vi) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (xv);

sekvenca aminokiselina alfa lanca je (vi) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (xvi);

sekvenca aminokiselina alfa lanca je (v) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (xvii);

sekvenca aminokiselina alfa lanca je (v) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (xviii);

sekvenca aminokiselina alfa lanca je (v) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (xix);

sekvenca aminokiselina alfa lanca je (vi) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (xi);

sekvenca aminokiselina alfa lanca je (vi) i beta lanac-anti-CD3 aminokiselinska sekvenca je (xii); i

sekvenca aminokiselina alfa lanca je (vi) a sekvenca aminokiselina beta lanca-anti-CD3 je (xiii).

[0029] Alternativno, ciljajući deo bispecifičnog terapeutika koji preusmerava T ćelije koji je ovde otkriven može biti antitelo. Termin "antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, tj. na molekule koji sadrže vezujuće mesto za antigen koje specifično vezuje antigen, bilo prirodno ili delimično ili u potpunosti proizvedeno sintetički. Termin "antitelo" uključuje fragmente antitela, derivate, funkcionalne ekvivalente i homologe antitela, humanizovana antitela, uključujući bilo koji polipeptid koji sadrži domen za vezivanje imunoglobulina, bilo prirodan ili potpuno ili delimično sintetički i bilo koji polipeptid ili protein koji ima vezujući domen koji je, ili je homologan domenu za vezivanje antitela. Stoga su uključeni himerni molekuli koji sadrže domen za vezivanje imunoglobulina, ili ekvivalentan, fuzionisan sa drugim polipeptidom. Kloniranje i ekspresija himernih antitela opisani su u EP-A-0120694 i EP-A-0125023. Humanizovano antitelo može biti modifikovano antitelo koje ima varijabilne regione nehumanog, npr. mišje, antitelo i konstantni region humanog antitela. Postupci za pravljenje humanizovanih antitela opisane su u npr. US Patentu br.5225539. Primeri antitela su izotipovi imunoglobulina (npr. IgG, IgE, IgM, IgD i IgA) i njihove izotipske podklase; fragmenti koji sadrže domen za vezivanje antigena kao što su Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; i dijatela. Antitela mogu biti poliklonska ili monoklonska. Monoklonsko antitelo se ovde može nazvati "mAb".

[0030] Moguće je uzeti antitelo, na primer monoklonsko antitelo, i koristiti tehnologiju rekombinantne DNK za proizvodnju drugih antitela ili himernih molekula koji zadržavaju specifičnost originalnog antitela. Takve tehnike mogu uključivati uvođenje DNK koja kodira varijabilni region imunoglobulina, ili regione koji određuju komplementarnost (CDR) antitela na konstantne regione, ili konstantne regione plus okvirne regione, različitog imunoglobulina (videti, na primer, EP-A-184187, GB 2188638A ili EP-A-239400). Hibridom (ili druga ćelija koja proizvodi antitela) može biti podložna genetskoj mutaciji ili drugim promenama, koje mogu ili ne moraju da promene specifičnost vezivanja proizvedenih antitela.

[0031] Pokazalo se da fragmenti celog antitela mogu obavljati funkciju vezivanja antigena. Primeri vezujućih fragmenata su (i) Fab fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iii) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog antitela; (iv) dAb fragment (Vard, E.S. et al., Nature. 1989 Oct 12;341(6242):544-6) koji se sastoji od VH domena; (v) izolovani CDR regioni; (vi) F(ab')2 fragmenti, bivalentni fragment koji sadrži dva povezana Fab fragmenta (vii) jednolančani Fv molekuli (scFv), pri čemu su VH domen i VL domen povezani peptidnim linkerom koji omogućava da se dva domena povezuju da formiraju mesto vezivanja antigena (Bird et al., Scince. 1988 Oct 21;242(4877):423-6; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1988. Aug;85(16):5879-83); (viii) bispecifični jednolančani Fv dimeri (PCT/US92/09965) i (ix) „dijatela“, multivalentni ili multispecifični fragmenti konstruisani fuzijom gena (WO94/13804; P. Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA.1993. Jul 15;90(14):6444-8). Dijatela su multimeri polipeptida, pri čemu svaki polipeptid sadrži prvi domen koji sadrži vezujući region lakog lanca imunoglobulina i drugi domen koji sadrži vezujući region teškog lanca imunoglobulina, pri čemu su dva domena povezana (npr. peptidnim linkerom), ali ne mogu da se povezuju jedno sa drugim da bi formirali mesto vezivanja antigena: mesta vezivanja antigena formiraju povezivanjem prvog domena jednog polipeptida unutar multimera sa drugim domenom drugog polipeptida unutar multimera (WO94/13804). Kada se koriste bispecifična antitela, to mogu biti konvencionalna bispecifična antitela, koja se mogu proizvesti na različite načine (Hollinger & Winter, Curr Opin Biotechnol. 1993. Aug;4(4):446-9), npr. pripremljeni hemijski ili iz hibridnih hibridoma, ili mogu biti bilo koji od prethodno pomenutih fragmenata bispecifičnih antitela. Možda bi bilo bolje koristiti scFv dimere ili dijatela pre nego cela antitela. Dijatela i scFv se mogu konstruisati bez Fc regiona, koristeći samo varijabilne domene, potencijalno

1

smanjujući efekte antiidiotipske reakcije. Drugi oblici bispecifičnih antitela uključuju jednolančane "januzine" opisane u Traunecker et al., EMBO J. 1991 Dec;10(12):3655-9). Bispecifična dijatela, za razliku od bispecifičnih celih antitela, takođe mogu biti korisna jer se mogu lako konstruisati i eksprimirati u E. coli. Dijatela (i mnogi drugi polipeptidi kao što su fragmenti antitela) odgovarajućih specifičnosti vezivanja mogu se lako odabrati korišćenjem fagnog prikaza (WO94/13804) iz biblioteka. Ako jedan krak dijatela treba da bude konstantan, na primer, sa specifičnošću usmerenom protiv antigena X, onda se može napraviti biblioteka gde se drugi krak menja i bira antitelo odgovarajuće specifičnosti. "Antigen-vezujući domen" je deo antitela koji obuhvata oblast koja se specifično vezuje za deo ili ceo antigen i komplementaran je sa njim. Kada je antigen veliki, antitelo se može vezati samo za određeni deo antigena, koji se naziva epitop. Domen koji se vezuje za antigen može biti obezbeđen sa jednim ili više varijabilnih domena antitela. Domen koji se vezuje za antigen može da sadrži varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH).

[0032] Vezujući deo može biti molekul sličan TCR koji je dizajniran da specifično vezuje kompleks peptid-MHC. Posebno su poželjna antitela koja imitiraju TCR, kao što su, na primer, ona opisana u WO2007143104 i Sergeeva et al., Blood. 2011 Apr 21;117(16):4262-72 i/ili Dahan and Reiter. Expert Rev Mol Med.2012 Feb 24;14:e6.

[0033] Ovde su takođe otkriveni vezujući delovi zasnovani na konstruisanim proteinskim skelama. Proteinske skele su izvedene iz stabilnih, rastvorljivih, prirodnih proteinskih struktura koje su modifikovane da obezbede mesto vezivanja za ciljni molekul od interesa. Primeri konstruisanih proteinskih skela uključuju, ali nisu ograničeni na, afitela, koja se zasnivaju na Z-domenu stafilokoknog proteina A koji obezbeđuje interfejs za vezivanje na dva njegova aheliksa (Nigren, FEBS J. 2008 Jun;275(11):2668-76); antitikalini, izvedeni iz lipokalina, koji uključuju mesta vezivanja za male ligande na otvorenom kraju beta-barel preklopa (Skerra, FEBS J. 2008 Jun;275(11):2677-83), nanotela i DARPins. Konstruisane proteinske skele su obično ciljane da vežu iste antigene proteine kao i antitela, i potencijalni su terapeutski agensi. One mogu delovati kao inhibitori ili antagonisti, ili kao sredstva za isporuku ciljanih molekula, kao što su toksini, do određenog tkiva in vivo (Gebauer i Skerra, Curr Opin Chem Biol.2009 Jun;13(3):245-55). Kratki peptidi se takođe mogu koristiti za vezivanje ciljnog proteina. Filomeri su prirodni strukturirani peptidi izvedeni iz bakterijskih genoma. Takvi peptidi predstavljaju raznovrstan niz strukturnih nabora proteina i mogu se koristiti za inhibiranje/remećenje interakcija protein-protein in vivo (Watt, Nat Biotechnol. 2006 Feb;24(2):177-83)].

[0034] Kao što je prethodno opisano u odnosu na TCR, deo za preusmeravanje T ćelija koji se vezuje za CD3 može biti anti-CD3 antitelo, ili funkcionalni fragment ili varijanta pomenutog anti-CD3 antitela, i može biti kao što je opisano u WO2011/001152.

[0035] Ovde otkriveni bispecifični terapeutik za preusmeravanje T ćelija može biti za upotrebu u postupku koji se sastoji od davanja pacijentu doze od ne više od 20 µg bispecifičnog terapeutika za preusmeravanje T ćelija u prvoj nedelji, doze ne veće od 30 µg drugoj nedelji, i doza od najmanje 50 µg u trećoj nedelji i narednim nedeljama, pri čemu je TCR deo bispecifičnog terapeutika povezan sa anti-CD3 antitelom dela koji preusmerava T ćelije ili njegovim fragmentom i ima afinitet vezivanja i/ili poluvreme vezivanja za YLEPGPVTA-HLA-A2 kompleks najmanje dvostruko veći od TCR koji ima sekvencu ekstracelularnog alfa lanca SEQ ID No: 2 i sekvencu ekstracelularnog beta lanca SEQ ID No: 3.

[0036] Bispecifični terapeutik za preusmeravanje T ćelija za upotrebu u ovom pronalasku se primenjuje intravenskom infuzijom. Alternativni putevi primene uključuju druge parenteralne puteve, kao što su subkutana ili intramuskularna infuzija, enteralna (uključujući oralnu ili rektalnu), inhalacioni ili intranazalni putevi.

[0037] Bispecifični terapeutik za upotrebu u ovom pronalasku može se primeniti kao monoterapija. Alternativno, može se primenjivati u kombinaciji sa jednom ili više terapija protiv kancera, poželjno imunomodulatornih terapija. Potencijal za dodatnu imunološku aktivaciju sa kombinovanim terapijama povećava rizik od toksičnosti van tumora. Takve terapije uključuju:

• agense za hemoterapiju, kao što su dakarbazin i temozolamid,

• imunoterapeutske agense, kao što su interleukin-2 (IL-2) i interferon (IFN) • inhibitore kontrolnih tačaka kao što su agensi koji ciljaju PD-1 ili PD-L1, npr. pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab, avelumab i durvalumab, i agensi koji ciljaju CTLA-4 kao što su ipilimumab i tremelimumab,

• BRAF inhibitore, kao što su vemurafenib i dabrafenib,

• MEK inhibitore, kao što je trametinib,

• TGF-β inhibitore kao što je galunisertib,

• Inhibitore MET kinaze kao što je merestinib.

[0038] Poželjne kombinovane terapije koriste durvalumab, tremelimumab, galunisertib i merestinib u kombinaciji sa bispecifičnim terapeuticima koji preusmeravaju T ćelije kao što je prethodno opisano. Gde se koristi merestinib – videti WO2010011538 ili sličan amidofenoksiindazol kao što je tamo opisano - u kombinaciji sa bispecifičnim terapeutikom,

1

doza merestiniba može biti u opsegu od 40 do 120 mg jednom dnevno, poželjno u opsegu od 80 do 120 mg jednom dnevno.

[0039] Bispecifični terapeutik se može davati samostalno za prvu i naredne doze, sa dodatnim terapeutskim agensima koji se dodaju nakon toga ili vice-versa. U primerima izvođenja predmetnog pronalaska gde se bispecifični terapeutik za preusmeravanje T ćelija i druga terapija kancera primenjuju u kombinaciji, bispecifični terapeutik za preusmeravanje T ćelija može se davati zasebno u nedeljama 1 i 2, a druga terapija se dodaje u nedelji 3 i narednim nedeljama.

[0040] Kombinovane terapije mogu dovesti do povećane imunološke aktivacije uključujući lučenje citokina i hemokina i promet limfocita, a samim tim i povećan rizik od neželjenih efekata kao što je teška hipotenzija. Shodno tome, doza bispecifičnog terapeutika koji preusmerava T ćelije može se inicijalno dati kao pojedinačni agens pre kombinovanog doziranja. U poželjnom izvođenju, doza od ne više od 20 µg se primenjuje u nedelji 1, doza od najviše 30 µg se primenjuje u nedelji 2, a doza od najmanje 50 µg se primenjuje u nedelji 3 i narednim nedeljama. Doziranje jedne ili više dodatnih imunomodulatornih terapija može se primenjivati od 3. nedelje.

[0041] Predmetni pronalazak se odnosi na lečenje gp100 pozitivnih kancera. Jedan takav kancer je melanom. Maligni melanom i dalje predstavlja veliki problem javnog zdravlja širom sveta. Procenjuje se da će skoro 76.000 novih dijagnoza melanoma biti postavljeno 2016. godine u Sjedinjenim Državama i očekuje se da će skoro 10.000 ljudi umreti od melanoma (American Cancer Society Statistics, 2016). Pored toga, stopa dijagnoze melanoma nastavlja da raste značajnom brzinom; prema podacima o nadzoru, epidemiologiji i krajnjim rezultatima iz 2015. godine, prosečna stopa incidencije porasla je za 1,4% svake godine tokom poslednje decenije, a melanom je sada peta najčešća dijagnoza kancera u Sjedinjenim Državama. Dok je prognoza za pacijente sa ranim stadijumom bolesti dobra nakon hirurške resekcije, srednja stopa preživljavanja brzo opada sa progresijom bolesti, padajući na manje od godinu dana za pacijente sa distalnom metastatskom bolešću (Garbe et al., Oncologist 2011; 16:5-24). Rastuća incidencija melanoma u kombinaciji sa lošim ishodima sa standardnom hemoterapijom i ranim signalima terapije zasnovane na imunološkom sistemu doveli su do intenzivnog istraživanja novih pristupa i kombinacija za poboljšanje antitumorskog imunološkog odgovora.

[0042] Melanom koji se leči u skladu sa ovim pronalaskom može biti kožni melanom ili uvealni melanom (takođe poznat kao okularni melanom). Alternativno, to može biti bilo koji od Lentigo maligna melanoma, melanoma sa površinskim širenjem, askralnog lentiginoznog melanoma, mukoznog melanoma, nodularnog melanoma, polipoidnog melanoma, dezmoplastičnog

1

melanoma, amelanotičnog melanoma, melanoma mekog tkiva, sitnoćelijskog melanoma sa malim ćelijama u obliku nevusa i spicoidnog melanoma.

[0043] Melanom koji se leči je generalno bolest u kasnoj fazi (uznapredovala bolest), koju obično karakterišu metastatske lezije. Na primer, faza III i/ili faza IV, (Balch et al., J Clin Oncol 2009; 27:6199-206).

[0044] Uvealni melanom (UM) je redak tip melanoma koji se biološki razlikuje od kožnog melanoma. UM je izuzetno maligna neoplazma koja zahvata vaskularne slojeve oka (iris, cilijarno telo i horoid). Uprkos retkoj stopi incidencije (predstavlja oko 3% slučajeva melanoma, oko 4.000 slučajeva širom sveta godišnje), (Papastefanou et al., (2011) J Skin Cancer;2011:573974). Supresivno okruženje i nedostatak aktivnosti inhibicije kontrolnih tačaka kod UM sugerišu da mobilizacija aktiviranih T ćelija sa tumor-specifičnim fokusom može imati antitumorsko delovanje u ovoj bolesti.

[0045] Kao što je prethodno pomenuto, drugi nemelanomski kanceri su prijavljeni u literaturi kao gp100 pozitivni, primeri su sarkom jasnih ćelija i neurološki kanceri kao što su neki gliomi. Premetni pronalazak se može koristiti za lečenje takvih kancera.

[0046] Ovde je takođe otkriven postupak lečenja gp100 pozitivnog karcinoma kod pacijenta koji se sastoji od davanja bispecifičnog terapeutika koji preusmerava T ćelije navedenom pacijentu, pri čemu se svaka doza primenjuje svakih 5-10 dana, najmanje prva i druga doza su ispod 40 µg i druga doza je veća od prve doze.

[0047] Ovde je takođe otkriven bispecifični terapeutik za preusmeravanje T ćelija koji sadrži (i) ciljni deo koji vezuje YLEPGPVTA-HLA-A2 kompleks fuzionisan za (ii) CD3 vezujući deo za preusmeravanje T ćelija, za upotrebu u postupku lečenja gp100 pozitivnog kancera kod pacijenta koji se sastoji od sledećih uzastopnih koraka:

(a) davanje pacijentu nedeljne doze u opsegu od 10-30 µg bispecifičnog terapeutika; (b)(i) ako pacijent doživi hipotenziju stepena 1 ili nižu povezanu sa lečenjem, povećanje doze koja se daje pacijentu na sedmičnu dozu u rasponu od 20-40 µg bispecifičnog terapeutika, ili

(b)(ii) ako pacijent doživi hipotenziju 2. ili višeg stepena u vezi sa lečenjem, nastavljanje davanja pacijentu nedeljne doze u rasponu od 10-30 µg bispecifičnog terapeutika sve dok pacijent ne doživi stepen 1 ili niži stepen u vezi sa lečenjem hipotenzije, a zatim povećanje doze koja se daje pacijentu na sedmičnu dozu u rasponu od 20-40 µg bispecifičnog terapeutika; i

(c)(i) ako pacijent doživi hipotenziju 1. ili nižeg stepena povezanu sa lečenjem,

1

povećanje doze koja se daje pacijentu na nedeljnu dozu od najmanje 50 µg bispecifičnog terapeutika ili

(c)(ii) ako pacijent doživi hipotenziju stepena 2 ili više u vezi sa lečenjem, nastavljanje davanja pacijentu nedeljne doze u rasponu od 20-40 µg bispecifičnog terapeutika sve dok pacijent ne doživi stepen 1 ili niži stepen hipotenzije povezanu sa lečenjem, a zatim povećanje doze koja se daje pacijentu na sedmičnu dozu od najmanje 50 µg bispecifičnog terapeutika.

[0048] Gornji metod može dalje da sadrži, između koraka (b) i (c), korak:

(d)(i) ako pacijent doživi hipotenziju stepena 1 ili nižu povezanu sa lečenjem, povećanje doze koja se daje pacijentu na sedmičnu dozu u rasponu od 30-45 µg bispecifičnog terapeutika, ili

(d)(ii) ako pacijent doživi hipotenziju 2. ili višeg stepena povezanu sa lečenjem, nastavljanje davanja pacijentu nedeljne doze u rasponu od 20-40 µg bispecifičnog terapeutika sve dok pacijent ne doživi stepen 1 ili niži stepen hipotenzije povezane sa lečenjem, a zatim povećanje doze koja se daje pacijentu na sedmičnu dozu u rasponu od 30-45 µg bispecifičnog terapeutika.

[0049] Stepen hipotenzije može proceniti lekar.

[0050] Citiranje ili identifikacija bilo kog dokumenta u ovoj specifikaciji ne predstavlja priznanje da je takav dokument dostupan kao prethodno stanje tehnike za ovaj pronalazak.

[0051] Ovde se upućuje na priložene crteže na kojima:

Slika 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu ekstracelularnog domena alfa lanca referentnog gp100 TCR (SEQ ID No; 2);

Slika 2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu ekstracelularnog domena beta lanca referentnog gp100 TCR (SEQ ID No; 3);

Slika 3 prikazuje aminokiselinsku sekvencu gp100-specifičnog TCR α lanca (SEQ ID No: 4);

Slika 4 prikazuje aminokiselinsku sekvencu anti-CD3 scFv fragmenta antitela (podebljano) fuzionisanog preko linkera, odnosno GGGGS (podvučeno), na N-terminusu gp100-specifičnog TCR β lanca (SEQ ID No 5);

Slika 5 prikazuje pojavu toksičnosti uključujući tešku i/ili ozbiljnu hipotenziju u odnosu

1

na broj doza IMCgp100;

Slika 6 prikazuje promet limfocita sa periferije nakon prve doze IMCgp100;

Slika 7 prikazuje proliferaciju T ćelija sa IMCgp100 u prisustvu ili odsustvu anti-CTLA-4;

Slika 8 prikazuje proliferaciju T ćelija sa IMCgp100 u prisustvu ili odsustvu anti-PD-L1;

Slika 9 prikazuje lučenje citokina IFNγ, TNFα i IL-2 sa IMCgp100 u prisustvu ili odsustvu anti-CTLA-4; i

Slika 10 prikazuje lučenje citokina IFNγ sa IMCgp100 u prisustvu ili odsustvu anti-CTLA-4.

Primeri

Primer 1 - identifikacija režima doziranja za IMCgp100 koji ublažava tešku hipotenziju povezanu sa lekom i omogućava povećanu gornju dozu

[0052] IMCgp100 je bispecifični agens za preusmeravanje T ćelija koje sadrži rastvorljivi TCR sa pojačanim afinitetom koji se vezuje za YLEPGPVTA peptidni kompleks -HLA-A*02, fuzionisan sa anti-CD3 scFv. [alfa i beta lanci IMCgp100 su SEQ ID No 4 i 5 respektivno] IMCgp100 je ispitivan u prvoj studiji za pronalaženje doze (FIH), kako bi se procenila bezbednost i podnošljivost IMCgp100 kod pacijenata sa uznapredovalim malignim melanomom (identifikator kliničkih ispitivanja: NCT01211262). Studija je osmišljena da identifikuje maksimalnu podnošljivu dozu (MTD) ili preporučenu dozu faze II (RP2D) IMCgp100 u 2 ponovljena režima doziranja: (Ruka 1) nedeljno doziranje (RP2D-QV) i (Ruka 2) dnevno doziranje x 4 dana (RP2D-QD).

[0053] U studiju su uključeni pacijenti sa stadijumom IV ili malignim melanomom stadijuma III koji se ne može hirurški ukloniti. Svi pacijenti su bili pozitivni na HLA-A*02, bili su stariji od 18 godina i klasifikovani su da imaju merljivu bolest prema kriterijumima RECIST 1.1, sa očekivanim životnim vekom većim od tri meseca i statusom učinka Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) od 1 ili manje. Nije bilo ograničenja u broju prethodnih terapija. Pacijentima je procenjena adekvatna hematološka, bubrežna, jetrena i srčana funkcija. Pacijenti sa simptomatskim metastazama na mozgu su posebno isključeni iz studije. Ukupno, 84 pacijenata je bilo lečeno.

[0054] IMCgp100 je davan intravenskom infuzijom korišćenjem kontrolisane infuzione pumpe.

1

Procedure skrininga i testovi kojima se utvrđuje podobnost su sprovedeni ne više od 14 dana pre početka doziranja IMCgp100, osim HLA tipizacije, MRI skeniranja, oftalmoloških, audioloških i ehokardioloških procena, koji su obavljeni u roku od 28 dana pre početka doziranja. Informisani pristanak je dobijen od svih pacijenata. Uzorci krvi za hematološke, biohemijske i farmakokinetičke (PK) analize su dobijeni na skriningu, 1. dan pre infuzije, 4, 10 i 24 sata nakon početka infuzije i 2., 8. i 30. dana.

Nedeljno doziranje: rezultati eskalacije doze

[0055] Praćen je standardni protokol eskalacije doze 3+3 faze I da bi se definisala maksimalna tolerantna doza (MTD). Ukratko, doza IMCgp100 je eskalirana u kohorti od 3(+3) pacijenata dok se ne ispune kriterijumi za MTD, ili dok se ne postigne ciljna limitirajuća doza. Eskalacija doze se odvijala u trostrukim koracima, prelazeći na modifikovani Fibonačijev dizajn u odnosu na bezbednost i PK profil ili ako je prijavljena toksičnost koja ograničava dozu (DLT). MTD je definisan kao najviši nivo doze pri kojem se DLT pojavila kod više od 33% pacijenata koji su uključeni na taj nivo. DLT su primećene u roku od 8 dana nakon tretmana i procenjene su u skladu sa NCI zajedničkim terminološkim kriterijumima za neželjene događaje (CTCAE) verzija 4.0. Prolazna limfopenija stepena 3 ili 4, i kožni osip koji nije opasan po život, isključeni su kao kriterijumi za ograničavanje doze zbog očekivanih farmakoloških efekata leka.

[0056] Tokom eskalacije doze, 31 pacijent je lečen u osam kohorti doza i primao je od 5 ng/kg do 900 ng/kg leka. Toksičnost koja ograničava dozu (DLT) povezana sa hipotenzijom 3 ili 4 stepena primećena je kod četiri pacijenta tokom eskalacije doze na 405 ng/kg (n=1 od 6), 600 ng/kg (n=1 od 6) i 900 ng/kg (n=2 od 6). U 3 od 4 DLT slučaja hipotenzije 3 ili 4 stepena, događaj se desio nakon prve doze IMCgp100 otprilike 12-18 sati nakon doze; 1 Događaj hipotenzije DLT se desio sa drugom dozom od 405 ng/kg, kod pacijenta koji je istovremeno primao antihipertenzivnu terapiju. Hipotenzija je u ova 4 slučaja lečena IV tečnostima (normalni fiziološki rastvor i koloidne infuzije); nijednom od pacijenata nije bila potrebna farmakološka (inotropna) podrška za krvni pritisak i svi su lečeni IV kortikosteroidnom terapijom. Svi slučajevi hipotenzije 3 ili 4 stepena su se rešili terapijom tečnošću i IV kortikosteroidnom terapijom u roku od 2 dana.

2

Tabela 1 – Rezime toksičnosti koja ograničava dozu (DLT) za nedeljnu eskalaciju doze

[0057] Na osnovu ovih podataka, MTD za nedeljno doziranje je deklarisan na 600 ng/kg.

Nedeljno doziranje: rezultati kohorte RP2D-QV

[0058] Pregled farmakokinetike i podataka o bezbednosti iz kohorti nedeljne eskalacije doze sugeriše da su ozbiljnije toksičnosti i veća izloženost lekovima IMCgp100 povezani sa većim apsolutnim dozama koje su primenjene. Na osnovu ovih podataka i opsega apsolutnih doza primenjenih pri MTD od 600 ng/kg (n=5 poena, opseg 34-66 µg QV, srednja doza od 54 µg), preporučena doza faze 2 nedeljnog režima doziranja (označena RP2D-QV) je prvobitno utvrđeno kao ravna doza od 50 µg koja se primenjuje na nedeljnoj bazi.

[0059] Tokom ovog vremena, dodatna tri pacijenta su doživela neželjene događaje koji su uključivali hipotenziju stepena 2 ili veću. Primećeno je da su ovi događaji ograničeni na prve dve doze (npr. ciklus 1 dan 1 (C1D1) i ciklus 1 dan 8 (C1D8)) (slika 5). U pokušaju da se izbegnu teški događaji hipotenzije, prva doza IMCgp100 je naknadno smanjena na 40 µg; međutim, hipotenzija (u stepenu 3/4) je primećena kod još dva pacijenta nakon doziranja C1D1 i/ili C1D8; kod jednog pacijenta je takođe zabeležena hipotenzija 2. stepena nakon treće doze. Nisu prijavljeni slučajevi teške hipotenzije nakon naknadnih doza. Treba napomenuti da su pronalazači uočili vezu između učestalosti i ozbiljnosti hipotenzije i nivoa ekspresije gp100 u tumorima pacijenta, pacijenti sa uvealnim melanomom imaju posebno visoke nivoe ekspresije gp100 i stoga su pod većim rizikom od toksičnosti.

[0060] Još 7 pacijenata (6 uvealnih i 1 kožni melanom) sa visokim rizikom od toksičnosti zbog visokog nivoa ekspresije gp100 unutar tumora uključeno je u fazu nedeljne ekspanzije doze, primilo je prvu dozu od 20 µg (C1 D1), nakon čega je usledila druga doza od 30 µg (C1 D8), konačno sa prelazom na ravnu dozu od 50 µg za treću dozu i dalje. Iznenađujuće, nije prijavljena teška hipotenzija (stepen 3/4) za ovih 7 pacijenata uprkos njihovom većem riziku od toksičnosti posredovane ekspresijom gp100.

[0061] Tabela 2 u nastavku rezimira tri režima doziranja korišćena u studiji, broj pacijenata lečenih svakim režimom i broj prijavljenih neželjenih događaja hipotenzije.

Tabela 2 – Rezime nedeljnih režima doziranja i hipotenzija

[0062] Ovi podaci pokazuju iznenađujuću korist režima eskalacije doze u dva koraka unutar pacijenata, u ublažavanju teške hipotenzije povezane sa lekovima kada se leče pacijenti sa gp100 pozitivnim kancerom.

Hipotenzija je rezultat prometa limfocita i oslobađanja citokina

[0063] Analiza krvi podgrupe pacijenata koji su dozirani nedeljno RP2D pokazala je izražen promet limfocita nakon primene IMCgp100. Nivoi limfocita su značajno opali oko 12-24h nakon infuzije, vraćajući se na početne nivoe do 8. dana. Ovaj efekat je bio izraženiji u slučajevima sa teškom i/ili ozbiljnom hipotenzijom (Slika 6). Analize citokina otkrile su skromne nivoe jednog ili više inflamatornih citokina. Najveća povećanja uočena na periferiji bila su u nivoima hemoatraktantnih hemokina tkiva koji odgovaraju prolaznom padu perifernih cirkulirajućih limfocita koji se generalno povlače 48 sati nakon doziranja i dostižu nivoe pre doze do 8. dana.

Dalje testiranje režima doziranja unutar pacijenta

[0064] Retrospektivni pregled podataka o odgovoru tumora kod pacijenata lečenih u Fazi 1 prethodne studije generalno je ukazao da su objektivni odgovori dobijeni kod pacijenata koji su primili veće apsolutne doze (približno 65-85 µg). Stoga je pretpostavljena hipoteza da upotreba 20 µg na C1D1 i 30 µg na C1D8 može omogućiti veće apsolutne doze, tj. iznad 50 µg, u ciklusu 1, dan 15 (C1D15) i dalje, i potencijalno poboljšati efikasnost.

[0065] Da bi se ovo testiralo, IMCgp100 se dalje istražuje u tekućoj fazi I otvorene, multicentrične studije kod pacijenata sa uznapredovalim uvealnim melanomom (identifikator kliničkog ispitivanja: NCT02570308). Prvi deo studije prati standardni dizajn eskalacije doze 3+3. Prva kohorta pacijenata je primila IMCgp100 primenjen intravenskom infuzijom u fiksnoj dozi od 20 µg na C1D1 i 30 µg na C1D8, nakon čega je usledila doza od 60 µg iz C1D15. Početni podaci ukazuju da nisu prijavljeni ozbiljni događaji povezani sa hipotenzijom za pacijente u ovoj kohorti (n=3). Dalje kohorte pacijenata će dobiti veće doze na C1D15 (npr.70 µg, 80 µg ili više).

Primer 2 – Dokazi o povećanom riziku od teške hipotenzije za IMCgp100 primenjen u kombinaciji sa drugim imunomodulirajućim lekovima

[0066] Istražena je imunološka aktivacija posredovana IMCgp100 in vitro u prisustvu ili odsustvu antitela inhibitora kontrolnih tačaka protiv PD-L1/PD-1 i CTLA-4.

Povećana potencija T ćelijskog odgovora sa IMCgp100 u kombinaciji sa anti-CTLA-4

[0067] U ovom eksperimentu proliferacija T ćelija je korišćena kao očitavanje za potenciju. IMCgp100 je korišćen u koncentraciji od 80 pM u prisustvu ili odsustvu 40 ug/ml anti-CTLA-4 (klon L3D10; Biolegend). HLA-A*02 pozitivni monociti pulsirani sa 10 nM ili 100 nM gp100 peptidom korišćeni su kao ćelije koje predstavljaju ciljni antigen i postavljene na 10.000 ćelija/bunarčiću. Efektorne CD3+ T ćelije su obeležene sa Cell Tracker Violet. Proliferacija T ćelija je merena nakon 5 dana korišćenjem Intellicyt testa zasnovanog na FACS.

[0068] Rezultati predstavljeni na slici 7 pokazuju da IMCgp100 u kombinaciji sa anti CTLA-4 rezultuje poboljšanim odgovorom T ćelija (pri nižim koncentracijama peptida) u odnosu na sam IMCgp100, što ukazuje na potencijal za vantumorske više nivoe efikasnosti i gp100 specifičnog za metu, kod pacijenata lečenih ovom kombinacijom u odnosu na monoterapiju IMCgp100.

2

Povećana potencija ubijanja T ćelija sa IMCgp100 u kombinaciji sa anti-PD-L1

[0069] U ovom eksperimentu, ubijanje T ćelija je korišćeno kao očitavanje za potenciju. IMCgp100 je korišćen u koncentraciji od 80 pM i 100 pM u prisustvu ili odsustvu 10 ug/ml anti-PD-L1 (klon 29E.2A3; BioLegend). HLA-A*02 pozitivne Mel624 ćelije su korišćene kao ciljne ćelije koje predstavljaju antigen. CD8+ T ćelije su korišćene kao efektorske ćelije u efektorskom ciljnom odnosu 5:1. Ubijanje T ćelija je mereno korišćenjem Incucyte ZOOM testa tokom 3 dana. Aktivacija kaspaze-3/7 u ciljnim ćelijama je praćena kao mera apoptoze (snimano svaka 2 sata).

[0070] Rezultati predstavljeni na slici 8 pokazuju da IMCgp100 u kombinaciji sa anti PD-L1 dovodi do povećanog ubijanja T ćelija u odnosu na sam IMCgp100, što ukazuje na potencijal za više nivoe vantumorske efikasnosti i gp100 specifične toksičnosti na meti, kod pacijenata koji se leče sa ovom kombinacijom u odnosu na monoterapiju IMCgp100.

Povećana proizvodnja proinflamatornih citokina sa IMCgp100 u kombinaciji sa anti-CTLA-4 ili anti-PD-L1

[0071] U ovom eksperimentu, lučenje citokina je procenjeno korišćenjem V-PLEX humanog pro-inflamatornog panela 1 test kita iz Meso Scale Discovery.

[0072] Za IMCgp100 u kombinaciji sa anti-CTLA-4 i anti-PD-L1, uzorci supernatanta su uzeti 24 sata od testa proliferacije i testa ubijanja, respektivno.

[0073] Podaci prikazani na slici 9 pokazuju povećanu sekreciju IFNγ, TNFα i IL-2 (pri niskim koncentracijama peptida) u prisustvu IMCgp100 i anti-CTLA-4, u odnosu na sam IMCgp100.

[0074] Podaci prikazani na Slici 10 pokazuju povećano lučenje IFNγ u prisustvu IMCgp100 i anti-PD-L1, u odnosu na sam IMCgp100.

[0075] Ovi podaci pokazuju povećanu imunološku aktivaciju kombinovanom terapijom IMCgp100 u odnosu na monoterapiju IMCgp100, a samim tim i potencijalno povećan rizik od teške hipotenzije za pacijente koji primaju kombinovanu terapiju, zbog ciljanog vantumorskog dejstva gp100 pozitivnih melanocita.

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Bispecifični terapeutik za preusmeravanje T ćelija koji sadrži (i) ciljni deo koji vezuje YLEPGPVTA-HLA-A2 kompleks fuzionisan za (ii) deo za preusmeravanje T ćelija koji se vezuje za CD3, naznačen time što, ciljni deo je T ćelijski receptor (TCR), CD3 vezujući deo za preusmeravanje T ćelija je anti-CD3 antitelo, a bispecifični terapeutski agens sadrži sekvencu TCR alfa lanca SEQ ID No: 4 i TCR beta lanac-anti-CD3 sekvencu SEQ ID No: 5, za upotrebu u postupku lečenja gp100 pozitivnog kancera kod pacijenta koji sadrži primenu bispecifičnog terapeutika na navedenog pacijenta intravenskom infuzijom u

(a) najmanje jednoj prvoj dozi u opsegu od 10 do 30 µg;

(b) najmanje jednoj drugoj dozi u opsegu od 20 do 40 µg, pri čemu je ili svaka druga doza veća od prve doze; a zatim

(c) najmanje jednoj dozi u opsegu od 50 do 70 µg,

pri čemu se svaka doza primenjuje svakih 5-10 dana.

2. Bispecifični terapeutik za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time da se svaka doza primenjuje svakih 7 dana.

3. Bispecifični terapeutik za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačen time da je prva doza 20 µg, a druga doza 30 µg.

4. Bispecifični terapeutik za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time da se primenjuju dve druge doze.

5. Bispecifični terapeutik za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji se primenjuje u kombinaciji sa jednom ili više terapija protiv kancera.

6. Bispecifični terapeutik za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, naznačen time da je terapija protiv kancera durvalumab, tremelimumab, galunisertib i merestinib.

7. Bispecifični terapeutik za upotrebu prema zahtevu patentnom 6, naznačen time da je terapija protiv kancera merestinib i doza merestiniba je u opsegu od 40 do 120 mg jednom dnevno, poželjno u opsegu od 80 do 120 mg jednom dnevno.

2

8. Bispecifični terapeutik za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time da se bispecifični terapeutik primenjuje kao monoterapija.

9. Bispecifični terapeut za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što, gp100 pozitivan kancer je melanom.

10. Bispecifični terapeutik za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što, melanom je melanom stadijuma III ili stadijuma IV.

11. Bispecifični terapeutik za upotrebu prema patentnom zahtevu 9 ili patentnom zahtevu 10, naznačen time da melanom uključuje metastatske lezije.

12. Bispecifični terapeutik za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9 do 11, naznačen time što, melanom je kožni melanom.

13. Bispecifični terapeutik za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9 do 11, naznačen time što, melanom je uvealni melanom.