[go: up one dir, main page]

RS65394B1 - Postupci i kompozicije za toleranciju na herbicide kod biljaka - Google Patents

Postupci i kompozicije za toleranciju na herbicide kod biljaka

Info

Publication number
RS65394B1
RS65394B1 RS20240411A RSP20240411A RS65394B1 RS 65394 B1 RS65394 B1 RS 65394B1 RS 20240411 A RS20240411 A RS 20240411A RS P20240411 A RSP20240411 A RS P20240411A RS 65394 B1 RS65394 B1 RS 65394B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
plant
seq
ppo
herbicide
plants
Prior art date
Application number
RS20240411A
Other languages
English (en)
Inventor
Artem G Evdokimov
Clayton T Larue
Farhad Moshiri
Xuefeng Zhou
Joel E Ream
Original Assignee
Monsanto Technology Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Technology Llc filed Critical Monsanto Technology Llc
Publication of RS65394B1 publication Critical patent/RS65394B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/03—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with oxygen as acceptor (1.3.3)
    • C12Y103/03004—Protoporphyrinogen oxidase (1.3.3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90206—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2430/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving synthetic organic compounds as analytes
    • G01N2430/20—Herbicides, e.g. DDT

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
POZIVANJE NA POVEZANE PATENTNE PRIJAVE
[0001] Ova patentna prijava polaže pravo prvenstva u privremenoj prijavi US br.62/200,428, podnetoj 3. avgusta 2015. godine, čije je obelodanjivanje ovim uključeno referencom u celosti.
INKORPORISANJE LISTE SEKVENCI
[0002] Spisak sekvenci koji se nalazi u datoteci pod nazivom MONS383WO_ST25.txt, koja iznosi 69,4 KB (mereno u MS-WINDOWS) i kreirana je 27. jula 2016. godine, podneta je elektronskim podneskom i uključena je ovde referencom.
OSNOVNE INFORMACIJE
Oblast pronalaska
[0003] Ovaj pronalazak se odnosi na oblast biotehnologije. Preciznije, pronalazak se odnosi na molekule rekombinantne DNK koji kodiraju enzime koji obezbeđuju toleranciju na herbicide koji inhibiraju protoporfirinogen oksidazu.
Stanje tehnike
[0004] Poljoprivredna proizvodnja useva često koristi transgene osobine stvorene metodama biotehnologije. Heterologni gen, poznat i kao transgen, unosi se u biljku da bi se proizvela transgena osobina. Ekspresija transgena u biljci daje joj poželjnu osobinu, kao što je tolerancija na herbicid. Primeri transgenih osobina tolerancije na herbicid uključuju toleranciju na glifosat, toleranciju na glufosinat i toleranciju na dikambu. Sa povećanjem broja vrsta korova otpornih na najčešće korišćene herbicide, na terenu su potrebne nove osobine tolerancije na herbicide. Herbicidi od posebnog interesa uključuju herbicide koji inhibiraju protoporfirinogen oksidazu (PPO), koji se nazivaju PPO herbicidi. PPO herbicidi obezbeđuju suzbijanje spektra korova otpornih na herbicide, čineći tako osobinu koja daje toleranciju na ove herbicide posebno korisnom u sistemu useva u kombinaciji sa jednom ili više drugih osobina tolerancije na herbicide.
[0005] Protoporfirinogen oksidaza funkcioniše na putevima biosinteze i hlorofila i hema gde konvertuje protoporfirinogen IX u protoporfirin IX. Nakon proizvodnje protoporfirina IX, biosintetički putevi hlorofila i hema se razilaze, sa različitim metalnim jonima koji se inkorporiraju (gvožđe za hem i magnezijum za hlorofil). Segmenti ovog puta su konzervirani kod prokariota i eukariota, a mnogi PPO enzimi koji se nalaze kod prokariota i eukariota su relativno slični. Neki prokarioti (npr. cijanobakterije) koriste ovaj put za proizvodnju hlorofila i hema, dok drugi prokarioti (npr. Escherichia coli) koriste ovaj put za proizvodnju hema.
[0006] Herbicidno nesenzitivne protoporfirinogen oksidaze ("iPPO") su izolovane iz određenog broja prokariota i eukariota. Na strukturnoj osnovi, veruje se da postoje najmanje tri različite podklase PPO enzima: HemY (Hansson and Hederstedt, "Cloning and characterization of the Bacillus subtilis hemEHY gene cluster, which encodes protoheme IX biosynthetic enzymes" Journal of Bacteriology 174(24):8081-8093 (1992)), HemG (Sasarman, et al.,, "Mapping of a new hem gene in Escherichia coli K12" Microbiology 113:297-303 (1979)), i HemJ (Boynton, et al.,, "Discovery of a gene involved in a third bacterial protoporphyrinogen oxidase activity through comparative genomic analysis and functional complementation" Applied and Environmental Microbiology 77(14):4795-4801 (2011)). Ovaj pronalazak pruža nove rekombinantne iPPO-ove koji su članovi porodice HemG. Uprkos dvadesetogodišnjem istraživanju i broju do sada identifikovanih iPPO, transgena poljoprivredna kultura koja sadrži rekombinantne iPPO tek treba da bude komercijalizovana. Jaka platforma za suzbijanje korova delimično zavisi od kontinuiranog razvoja paketa svojstava tolerancije na herbicide. Identifikovanje i korišćenje iPPO za stvaranje osobina transgenih useva stoga predstavlja napredak u poljoprivredi.
SAŽETAK PRONALASKA
[0007] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje molekul rekombinantne DNK koji se sastoji od heterolognog promotora operativno povezanog sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji ima najmanje 95% identičnosti sa polipeptidnom sekvencom izabranom od SEQ ID NO:1 i 11, pri čemu polipeptid ima aktivnost protoporfirinogen oksidaze neosetljive na herbicide. U određenim otelotvorenjima, polipeptid ima najmanje 95% identičnosti sekvence, najmanje 96% identičnosti sekvence, najmanje 97% identičnosti sekvence, najmanje 98% identičnosti sekvence, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa polipeptidnom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO:1 i 11 i ima aktivnost protoporfirinogen oksidaze neosetljive na herbicide. U nekim otelotvorenjima postoji molekul rekombinantne DNK, pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline izabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO:32, 42, 49 i 54. U konkretnim otelotvorenjima, molekul rekombinantne DNK kodira polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO:1 i 11. Pronalaskom je stoga obezbeđen rekombinantni polipeptid koji sadrži najmanje 95% identičnosti sekvence sa punom dužinom aminokiselinske sekvence izabrane između SEQ ID NO:1 i 11, pri čemu polipeptid ima aktivnost protoporfirinogen oksidaze neosetljive na herbicide.
[0008] U određenim otelotvorenjima heterologni promoter, na primer, promoter funkcionalan u biljnoj ćeliji, operativno je povezan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa polipeptidnom sekvencom pronalaska, na primer, polipeptidna sekvenca izabrana od SEQ ID NO:1 i 11, pri čemu polipeptid ima aktivnost protoporfirinogen oksidaze neosetljive na herbicide. Takav rezultujući DNK molekul može dalje da sadrži ciljnu sekvencu koja funkcioniše za lokalizaciju polipeptida unutar ćelije.
[0009] U jednom aspektu, pronalazak pruža DNK konstrukt koji sadrži rekombinantni DNK molekul pronalaska. U jednom otelotvorenju, takav DNK konstrukt obuhvata, u operativnoj vezi sa sekvencom nukleinske kiseline pronalaska, ciljnu sekvencu koja funkcioniše da lokalizuje polipeptid unutar ćelije. Molekul DNK može biti prisutan u genomu transgene biljke, semena ili ćelije. U određenim otelotvorenjima, polipeptid daje toleranciju na herbicide ćeliji, biljci, semenu ili delu biljke.
[0010] Drugi aspekt pronalaska obezbeđuje transgenu biljku, seme, ćeliju ili biljni deo koji sadrži rekombinantni DNK molekul pronalaska ili rekombinantni polipeptid pronalaska.
Transgena biljka, seme, ćelija ili biljni deo stoga može da sadrži, tj. prikazuje, toleranciju na najmanje jedan PPO herbicid. U nekim otelotvorenjima, transgena biljka, seme, ćelija ili biljni deo sadrži dodatnu osobinu tolerancije na transgeni herbicid.
[0011] Drugi aspekt pronalaska pruža postupak za dodeljivanje tolerancije na herbicid biljci, semenu, ćeliji ili biljnom delu, koji obuhvata: heterologno eksprimiranje rekombinantnog polipeptida pronalaska u biljci, semenu, ćeliji ili biljnom delu. U nekim otelotvorenjima postupka, biljka, seme, ćelija ili biljni deo obuhvata aktivnost protoporfirinogen oksidaze koju daje rekombinantni polipeptid. U nekim otelotvorenjima, tolerancija na herbicid je na najmanje jedan PPO herbicid izabran iz grupe koja se sastoji od acifluorfena, fomesafena, laktofena, flumioksazina i S-3100.
[0012] Drugi aspekt pronalaska odnosi se na postupak transformacije biljaka, koji se sastoji od koraka: a) uvođenja rekombinantnog DNK molekula pronalaska u biljnu ćeliju; i b) regeneracije transgene biljke iz one koja sadrži rekombinantni DNK molekul. Postupak može dalje da obuhvata korak izbora biljke koja je tolerantna na najmanje jedan PPO herbicid. Postupak se takođe može sastojati od koraka ukrštanja regenerisane biljke sa samom sobom ili sa drugom biljkom i sakupljanja semena sa ukrštene.
[0013] Još jedan aspekt pronalaska pruža postupak za suzbijanje korova na površini rasta biljaka, koji se sastoji od kontaktiranja područja rasta biljaka koje sadrži transgene biljke ili seme sa najmanje jednim PPO herbicidom, pri čemu je transgena biljka ili seme tolerantno na PPO herbicid i pri čemu se korovi suzbijaju u području rasta biljaka.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0014]
Sl. 1 Poravnanje sekvenci proteina H_N90, H_N20, H_N60, H_N10, H_N30, H_N40, H_N50, H_N70, H_N100 i H_N110 (SEQ ID NO:1-10), sa konsenzusnim pozicijama prikazanim u nastavku.
Sl. 2 Rezultati testa iz PPO bakterijskog skrining sistema sa PPO herbicidima izmerenim na 8 sati rasta E. coli koja sadrži testirani iPPO.
KRATAK OPIS SEKVENCI
[0015]
SEQ ID NO:1 je aminokiselinska sekvenca H_N90.
SEQ ID NO:2 je aminokiselinska sekvenca H_N20.
SEQ ID NO:3 je aminokiselinska sekvenca H_N60.
SEQ ID NO:4 je aminokiselinska sekvenca H_N10, koja je HemG protoporfirinogen oksidaza divljeg tipa E. coli (NCBI GenBank Accession No. WP_021498199).
SEQ ID NO:5 je aminokiselinska sekvenca H_N30.
SEQ ID NO:6 je aminokiselinska sekvenca H_N40.
SEQ ID NO:7 je aminokiselinska sekvenca H_N50.
SEQ ID NO:8 je aminokiselinska sekvenca H_N70.
SEQ ID NO:9 je aminokiselinska sekvenca H_N100.
SEQ ID NO:10 je aminokiselinska sekvenca H_N110.
SEQ ID NO:11 do SEQ ID NO:17 su sekvence aminokiselina kojima nedostaje početni metonin koji odgovara SEQ ID NO:1, 2, 4, 5, 6, 7, odnosno 9.
SEQ ID NO:18 i SEQ ID NO:19 su varijante aminokiselina SEQ ID NO:11.
SEQ ID NO:20 je aminokiselinska varijanta SEQ ID NO:17.
SEQ ID NO:21 je aminokiselinska sekvenca WH, koja je protoporfirinogen oksidaza divljeg tipa iz Amaranthus tuberculatus (vodena konoplja).
SEQ ID NO:22 do SEQ ID NO:31 su nukleotidne sekvence koje kodiraju SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO:10, respektivno, kodon optimizovan za ekspresiju E. coli.
SEQ ID NO:32 do SEQ ID NO:41 su nukleotidne sekvence koje kodiraju SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO:10, respektivno, kodon optimizovan za ekspresiju dikotiledona.
SEQ ID NO:42 do SEQ ID NO:48 su nukleotidne sekvence koje kodiraju SEQ ID NO:11 do SEQ ID NO:17, respektivno, kodon optimizovan za ekspresiju dikotiledona.
SEQ ID NO:49 i SEQ ID NO:52 su nukleotidne varijante SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:12, respektivno.
SEQ ID NO:50, 51 i 53 su nukleotidne sekvence koje kodiraju SEQ ID NO:18, 19 i 20.
SEQ ID NO:54 do SEQ ID NO:63 su nukleotidne sekvence koje kodiraju SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO:10, respektivno, kodon optimizovan za ekspresiju monokotiledona.
DETALJAN OPIS
[0016] Navedeni su sledeći opisi i definicije kako bi se bolje definisao pronalazak i kako bi se prosečni stručnjaci vodili u praksi pronalaska. Ukoliko nije drugačije navedeno, pojmove treba shvatati u skladu sa konvencionalnom upotrebom od strane prosečnih stručnjaka u relevantnoj oblasti.
[0017] Pronalazak pruža nove, rekombinantne DNK molekule i proteine koji kodiraju protoporfirinogen oksidaze (iPPO) neosetljive na herbicide. Na primer, pronalazak u jednom otelotvorenju pruža vektore i ekspresione kasete koji kodiraju mikrobiološki izvedene iPPO za ekspresiju u ćelijama i biljkama. Takođe su dati postupci za proizvodnju ćelija i biljaka tolerantnih na PPO herbicide. Pronalazak dalje pruža postupke i sastave za korišćenje proteinskog inženjeringa i bioinformatičkih alata za dobijanje i poboljšanje iPPO.
[0018] U specifičnim aspektima, pronalazak obezbeđuje rekombinantne DNK molekule i proteine. Kao što se ovde koristi, termin „rekombinantni“ se odnosi na DNK, protein, ćeliju, seme ili organizam koji se ne javlja prirodno, a koji je rezultat genetskog inženjeringa i kao takav se obično ne bi nalazio u prirodi. "Rekombinantni DNK molekul" je DNK molekul koji sadrži DNK sekvencu koja se prirodno ne javlja i koja je rezultat ljudske intervencije, kao što je DNK molekul koji sadrži kombinaciju najmanje dva DNK molekula koji su međusobno heterologni. Primer rekombinantnog DNK molekula je DNK molekul koji je ovde dat i koji kodira protoporfirinogen oksidazu neosetljivu na herbicide operativno povezanu sa heterolognim regulatornim ili drugim elementom, kao što je heterologni promoter.
"Rekombinantni protein" je protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se prirodno ne javlja i kao takva je rezultat ljudske intervencije, kao što je konstruisani protein ili himerni protein. Rekombinantna ćelija, seme ili organizam je ćelija, seme ili organizam koji sadrže transgenu DNK, za na primer transgenu ćeliju, seme, biljku ili biljni deo koji sadrže rekombinantni DNK molekul i stoga proizvedeni kao rezultat transformacije biljaka.
[0019] Kao što se ovde koristi, termin „genetski inženjering“ odnosi se na stvaranje neprirodne DNK, proteina ili organizma koji se obično ne bi nalazili u prirodi i stoga podrazumeva primenu ljudske intervencije. Genetski inženjering se može koristiti za proizvodnju konstruisanog DNK, proteina ili organizma koji je zamišljen i stvoren u laboratoriji koristeći jednu ili više tehnika biotehnologije kao što su molekularna biologija, biohemija proteina, bakterijska transformacija i transformacija biljaka. Na primer, genetski inženjering se može koristiti za stvaranje himernog gena koji se sastoji od najmanje dva međusobno heterologna DNK molekula koristeći jednu ili više tehnika molekularne biologije, kao što su kloniranje gena, ligacija DNK i sinteza DNK. Himerni gen se može sastojati od dva ili više heterolognih DNK molekula koji su operativno povezani, kao što je sekvenca koja kodira proteine operativno povezana sa elementom ekspresije gena kao što je sekvenca koja kodira tranzitne peptide ili heterologni promoter. Genetski inženjering se može koristiti za stvaranje konstruisanog proteina čija je polipeptidna sekvenca kreirana korišćenjem jedne ili više tehnika proteinskog inženjeringa, kao što je dizajn proteina korišćenjem mesto-usmerene mutageneze i usmerena evolucija korišćenjem nasumične mutageneze i DNK rekombinacije. Konstruisani protein može imati jednu ili više delecija, insercija ili supstitucija u odnosu na kodirajuću sekvencu proteina divljeg tipa i svaka delecija, insercija ili supstitucija može sadržati jednu ili više aminokiselina. U drugom otelotvorenju, konstruisani protein može sadržati dva heterologna peptida koji su operativno povezani, kao što je enzim operativno povezan sa tranzitnim peptidom.
[0020] Kao što se ovde koristi, "neosetljiv na herbicide" označava sposobnost protoporfirinogen oksidaze (PPO) da održi barem neku od svojih enzimskih aktivnosti u prisustvu jednog ili više PPO herbicida. Enzimska aktivnost protoporfirinogen oksidaze može se meriti na bilo koji način poznat u struci, na primer, enzimskim testom u kojem se proizvodnja produkta protoporfirinogen oksidaze ili potrošnja supstrata protoporfirinogen oksidaze u prisustvu jednog ili više PPO herbicida meri fluorescencijom, tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC) ili masenom spektrometrijom (MS). Drugi primer testa za merenje enzimske aktivnosti protoporfirinogen oksidaze je bakterijski test, kao što su ovde opisani testovi rasta, pri čemu je rekombinantna protoporfirinogen oksidaza eksprimirana u bakterijskoj ćeliji kojoj inače nedostaje PPO aktivnost i meri se sposobnost rekombinantne protoporfirinogen oksidaze da dopuni ovaj nokaut fenotip. Neosetljivost na herbicide može biti potpuna ili delimična neosetljivost na određeni herbicid i može se izraziti kao procentualna (%) tolerancija ili neosetljivost na određeni PPO herbicid. Kao što se ovde koristi, "protoporfirinogen oksidaza neosetljiva na herbicide" ili "iPPO" pokazuje neosetljivost na herbicide u prisustvu jednog ili više PPO herbicida.
[0021] Kao što se ovde koristi, "hemG nokaut soj" označava organizam ili ćeliju organizma, kao što je E. coli, koji nema aktivnost HemG u meri u kojoj nije u stanju da raste na hranljivoj podlozi bez hema, ili takav da je njegov rast detektabilno oštećen u odsustvu hema u odnosu na inače izogeni soj koji sadrži funkcionalni HemG. HemG nokaut soj, od na primer E. coli, može biti pripremljen s obzirom na znanje iz ove oblasti, na primer s obzirom na sekvencu E. coli hemG (Ecogene Accession No. EG11485; Sasarman et al., "Nucleotide sequence of the hemG gene involved in the protoporphyrinogen oxidase activity of Escherichia coli K12" Can J Microbiol 39:1155-1161, 1993).
[0022] Kao što se ovde koristi, termin "transgen" se odnosi na DNK molekul veštački inkorporiran u genom organizma zbog ljudske intervencije, kao što je postupak transformacije biljaka. Kao što se ovde koristi, pojam "transgeni" znači da sadrži transgen, na primer „transgena biljka“ se odnosi na biljku koja sadrži transgen u svom genomu, a "transgena osobina" se odnosi na karakteristiku ili fenotip koja je preneta ili dodeljena prisustvom transgena inkorporiranog u genom biljke. Kao rezultat takve genomske promene, transgena biljka je nešto što se izrazito razlikuje od srodne divlje biljke, a transgena osobina je osobina koja se prirodno ne nalazi u divljoj biljci. Transgene biljke pronalaska sadrže molekule rekombinantne DNK i konstruisane proteine koje pruža pronalazak.
[0023] Kao što se ovde koristi, termin "heterologno" se odnosi na odnos između dve ili više stavki izvedenih iz različitih izvora i stoga obično nije povezan sa prirodom. Na primer, molekul rekombinantne DNK koji kodira proteine je heterologan u odnosu na operativno povezani promoter ako se takva kombinacija obično ne nalazi u prirodi. Pored toga, određeni molekul rekombinantne DNK može biti heterologan u odnosu na ćeliju, seme ili organizam u koji je umetnut kada se prirodno ne bi pojavio u toj ćeliji, semenu ili organizmu.
[0024] Kao što se ovde koristi, termin "izolovan" se odnosi na bar delimično odvajanje molekula od drugih molekula koji su obično povezani sa njim u svom prirodnom stanju. U jednom otelotvorenju, termin "izolovan" se odnosi na DNK molekul koji je odvojen od nukleinskih kiselina koje normalno okružuju DNK molekul u njegovom prirodnom stanju. Na primer, DNK molekul koji kodira protein koji je prirodno prisutan u bakteriji bio bi izolovani DNK molekul ako nije bio u DNK bakterije iz koje DNK molekul koji kodira protein se prirodno nalazi. Dakle, DNK molekul fuzionisan ili operativno povezan sa jednim ili više drugih DNK molekula sa kojima ne bi bio povezan u prirodi, na primer kao rezultat rekombinantne DNK ili tehnika transformacije biljaka, ovde se smatra se izolovanim. Takvi molekuli se smatraju izolovanim čak i kada su integrisani u hromozom ćelije domaćina ili prisutni u rastvoru nukleinske kiseline sa drugim molekulima DNK.
[0025] Kao što se ovde koristi, termin "molekul DNK koji kodira protein" odnosi se na molekul DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira protein. "Sekvenca koja kodira protein” označava sekvencu DNK koja kodira protein. "Sekvenca" označava sekvencijalni raspored nukleotida ili aminokiselina. Granice sekvence koja kodira protein može se odrediti start kodonom translacije na 5'-terminusu i stop kodonom translacije na 3'-terminusu. Molekul koji kodira protein može da sadrži DNK sekvencu koja kodira proteinsku sekvencu. Kao što se ovde koristi, "transgena ekspresija", "eksprimiranje transgena", "proteinska ekspresija" i "eksprimiranje proteina" označavaju proizvodnju proteina kroz proces transkripcije DNK molekula u informacionu RNK (mRNK) i translacije mRNK u polipeptidne lance, koji se na kraju mogu presavijati u proteine. Molekul DNK koji kodira proteine može biti operativno povezan sa heterolognim promoterom u DNK konstruktu za upotrebu u eksprimiranju proteina u ćeliji transformisanoj sa molekulom rekombinantne DNK. Kao što se ovde koristi, "operativno povezani" označava dva DNK molekula povezana na način da jedan može uticati na funkciju drugog. Operativno povezani DNK molekuli mogu biti deo jednog neprekinutog molekula i mogu ili ne moraju biti susedni. Na primer, promoter je operativno povezan sa molekulom DNK koji kodira proteine u DNK konstruktu gde su dva DNK molekula tako raspoređena da promoter može uticati na ekspresiju transgena.
[0026] Kao što se ovde koristi, "DNK konstrukt" je rekombinantni DNK molekul koji se sastoji od dve ili više heterolognih DNK sekvenci. Konstrukti DNK su korisni za transgenu ekspresiju i mogu se sastojati od vektora i plazmida. Konstrukti DNK mogu se koristiti u vektorima u svrhu transformacije, odnosno unošenja heterologne DNK u ćeliju domaćina, kako bi se proizvele transgene biljke i ćelije, a kao takvi mogu biti sadržani i u plastidnoj DNK ili genomskoj DNK transgene biljke, semena, ćelije ili biljnog dela. Kao što se ovde koristi, "vektor" označava bilo koji rekombinantni DNK molekul koji se može koristiti u svrhu bakterijske biljne transformacije. Molekuli rekombinantne DNK, kako je navedeno u spisku sekvenci, mogu se, na primer, insertovati u vektor kao deo konstrukta koji ima molekul rekombinantne DNK operativno povezan sa elementom genske ekspresije koji funkcioniše u biljci da pokrene ekspresiju konstruisanog proteina kodiranog molekulom rekombinantne DNK. Opšti postupci korisni za manipulaciju DNK molekula za izradu i korišćenje rekombinantnih DNK konstrukata i vektora transformacije biljaka su dobro poznati u struci i detaljno opisani u, na primer, priručnicima i laboratorijskim priručnicima, uključujući MR Green and J Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Fourth Edition) ISBN: 978-1-936113-42-2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2012). Komponente za DNK konstrukt, ili vektor koji sadrži DNK konstrukt, uključuju jedan ili više elemenata ekspresije gena operativno povezanih sa transkribabilnom DNK sekvencom, kao što su sledeći: promoter za ekspresiju operativno povezane DNK, operativno povezan molekul DNK koji kodira protein, i operativno povezani 3' netranslirani region (UTR). Elementi ekspresije gena korisni u praktikovanju predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, jedan ili više sledećih tipova elemenata: promoter, 5' UTR, pojačivač, lider, cis-delujući element, intron, ciljna sekvenca, 3' UTR i jedan ili više selektivnih marker transgena.
[0027] Konstrukti DNK pronalaska mogu uključivati promoter operativno povezan sa molekulom DNK koji kodira protein koji je dat pronalaskom, pri čemu promoter pokreće ekspresiju molekula rekombinantnog proteina. Promoteri korisni u praktikovanju predmetnog pronalaska uključuju one koji funkcionišu u ćeliji za ekspresiju operativno povezanog polinukleotida, kao što je bakterijski ili biljni promoter. Takvi promoteri su raznovrsni i dobro poznati u struci i uključuju, na primer, one koji su inducibilni, virusni, sintetički, konstitutivni, vremenski regulisani, prostorno regulisani i/ili prostorno-vremenski regulisani.
[0028] U jednom otelotvorenju pronalaska, DNK konstrukt koji je ovde dat uključuje ciljnu sekvencu koja je operativno povezana sa heterolognom nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptidni molekul koji ima aktivnost protoporfirinogen oksidaze neosetljive na herbicide, pri čemu ciljna sekvenca olakšava lokalizaciju polipeptidnog molekula unutar ćelije. Ciljne sekvence su poznate u struci kao signalne sekvence, ciljni peptidi, sekvence lokalizacije i tranzitni peptidi. Primer ciljne sekvence je hloroplastni tranzitni peptid (CTP), mitohondrijska ciljna sekvenca (MTS) ili dvostruki hloroplastni i mitohondrijski ciljni peptid. Olakšavanjem lokalizacije proteina unutar ćelije, ciljna sekvenca može povećati akumulaciju rekombinantnog proteina, zaštititi protein od proteolitičke razgradnje i/ili poboljšati nivo tolerancije na herbicide i time smanjiti nivoe povreda u transgenoj ćeliji, semenu ili organizmu nakon primene herbicida.
[0029] CTP i drugi ciljni molekuli koji se mogu koristiti u vezi sa ovim pronalaskom poznati su u struci i uključuju, ali nisu ograničeni na, Arabidopsis thaliana EPSPS CTP (Klee et al., Mol Genet.210:437-442, 1987), Petunia hybrida EPSPS CTP (della-Cioppa et al., PNAS 83:6873-6877, 1986), signalna sekvenca cab-m7 kukuruza (Becker et al., Plant Mol Biol.
20:49-60, 1992; PCT WO 97/41228), mitohondrijalna predsekvenca (npr.Silva Filho et al., Plant Mol Biol 30:769-780, 1996), i signalna sekvenca glutation reduktaze graška (Creissen et al., Pogon J.8:167-175, 1995; PCT WO 97/41228).
[0030] Rekombinantni DNK molekuli predmetnog pronalaska mogu se sintetizovati i modifikovati postupcima poznatim u struci, bilo u potpunosti ili delimično, posebno kada je poželjno obezbediti sekvence korisne za DNK manipulaciju (kao što su mesta prepoznavanja restriktivnih enzima ili mesta kloniranja na bazi rekombinacije), sekvence koje biljke preferiraju (kao što su upotreba biljnog kodona ili Kozak konsenzus sekvenca) ili sekvence korisne za dizajn DNK konstrukta (kao što su razdvajačke ili linker sekvence). Predmetni pronalazak uključuje rekombinantne DNK molekule i konstruisane proteine koji imaju najmanje 95% identičnosti sekvence, najmanje 96% identičnosti sekvence, najmanje 97% identičnosti sekvence, najmanje 98% identičnosti sekvence i najmanje 99% identičnosti sekvence bilo kog od rekombinantnih DNK molekula ili polipeptidnih sekvenci koje su ovde date i koji imaju aktivnost protoporfirinogen oksidaze neosetljive na herbicide. Kao što se ovde koristi, termin "procentualna identičnost sekvence" ili "% identičnost sekvence" odnosi se na procenat identičnih nukleotida ili aminokiselina u linearnoj polinekulotidnoj ili polipeptidnoj sekvenci referentne ("upit") sekvence (ili njenog komplementarnog lanca) u poređenju sa test sekvencom ("subjekt") (ili njenim komplementarnim lancem) kada su dve sekvence optimalno poravnate (sa odgovarajućim nukleotidnim ili aminokiselinskim insercijama, delecijama ili prazninama koje ukupno iznose manje od 20 procenata referentne sekvence preko prozora poređenja). Optimalno poravnanje sekvenci za poravnanje prozora poređenja dobro je poznato stručnjacima u ovoj oblasti i može se sprovesti alatima kao što su algoritam lokalne homologije Smith and Waterman-a, algoritam homolognog poravnanja Needleman i Wunsch-a, pretraga za metodu sličnosti Pearson i Lipman-a, i kompjuterizovanim implementacijama ovih algoritama kao što su GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA koji su dostupni kao deo softverskog paketa za sekvencijalnu analizu
GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., San Diego, CA), MEGAlign (DNAStar Inc., 1228 S. Park St., Madison, WI 53715) i MUSCLE (version 3.6) (Edgar, "MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput" Nucleic Acids Research 32(5):1792-7 (2004)) za, na primer, sa podrazumevanim parametrima. "Frakcija identičnosti" za poravnate segmente test sekvence i referentne sekvence je broj identičnih komponenti koje dele dve poravnate sekvence podeljeno ukupnim brojem komponenti u delu segmenta referentne sekvence koji se poravnava, odnosno cela referentna sekvenca ili manji definisani deo referentne sekvence. Procentualna identičnost sekvence je predstavljena kao razlomak identičnosti pomnožen sa 100. Poređenje jedne ili više sekvenci može biti sa sekvencom pune dužine ili njenim delom, ili sa dužom sekvencom.
[0031] Konstruisani proteini mogu se proizvesti promenom (tj. modifikacijom) proteina divljeg tipa kako bi se proizveo novi protein sa modifikovanim karakteristikama, npr. određenim obrascem ćelijske lokalizacije, kao što je usmeren na hloroplast ili mitohondrije, ili novom kombinacijom korisnih karakteristika proteina, kao što su izmenjeni Vmax, Km, Ki, IC50, specifičnost supstrata, specifičnost inhibitora/herbicida, selektivnost supstrata, sposobnost interakcije sa drugim komponentama u ćeliji, kao što su partnerski proteini ili membrane, i stabilnost proteina, između ostalog. Modifikacije se mogu vršiti na određenim pozicijama aminokiselina u proteinu i mogu biti supstitucija aminokiseline koja se nalazi na toj poziciji u prirodi (odnosno u proteinima divljeg tipa) sa različitom aminokiselinom.
Konstruisani proteini koje pruža pronalazak tako daju novi protein sa jednom ili više izmenjenih karakteristika proteina u odnosu na slični protein koji se nalazi u prirodi. U jednom otelotvorenju pronalaska, konstruisani protein ima izmenjene proteinske karakteristike, kao što su one koje rezultiraju smanjenom osetljivošću na jedan ili više herbicida u poređenju sa sličnim proteinom divljeg tipa, ili poboljšanom sposobnošću da prenese toleranciju na herbicide na transgenu biljku koja eksprimira konstruisani protein na jedan ili više herbicida. U jednom otelotvorenju, pronalazak pruža konstruisani protein, i molekul rekombinantne DNK koji ga kodira, koji se sastoji od najmanje jedne aminokiselinske supstitucije izabrane iz Tabele 1 i ima najmanje 95% identičnosti sekvence, oko 96% identičnosti sekvence, oko 97% identičnosti sekvence, oko 98% identičnosti sekvence i oko 99% identičnosti sekvence sa bilo kojom od sekvenci konstruisanog proteina navedenih u ovom dokumentu, tj. SEQ ID NO:1 i 11. Mutacije aminokiselina mogu se napraviti kao jedna aminokiselinska supstitucija u proteinu ili u kombinaciji sa jednom ili više drugih mutacija, kao što je jedna ili više drugih aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija. Mutacije se mogu napraviti bilo kojim postupkom koji je poznat stručnjacima u ovoj oblasti.
Tabela 1: Supstitucije aminokiselina.
Ostatak Konzervativne supstitucije Ostatak Konzervativne supstitucije
[0032] Kao što se ovde koristi, "divlji tip" označava prirodnu sličnu, ali ne i identičnu verziju. "DNK molekul divljeg tipa" ili "divlji tip proteina" je prirodna verzija DNK molekula ili proteina, odnosno verzija DNK molekula ili proteina koja već postoji u prirodi. Primer divljeg tipa proteina korisnog za poređenje sa konstruisanim proteinima koje pruža pronalazak je protoporfirinogen oksidaza iz Arabidopsis thaliana. "Biljka divljeg tipa“ je netransgena biljka istog tipa kao i transgena biljka, i kao takva se genetski razlikuje od transgene biljke koja sadrži osobinu tolerancije na herbicide. Primeri biljke divljeg tipa korisne za poređenje sa transgenim biljkama kukuruza su netransgeni kukuruz LH244 (ATCC deposit number PTA-1173) i samooplodni kukuruz 01DKD2 (I294213) (ATCC deposit number PTA-7859). Za transgene biljke soje, uzorna uporedna linija bi bila netransgena soja A3555 (ATCC deposit number PTA-10207), a za transgene biljke pamuka, uzorna uporedna linija bi bio netransgeni Coker 130 (Plant Variety Protection Number 8900252).
Transgene biljke i herbicidi
[0033] Jedan aspekt pronalaska obuhvata transgene biljne ćelije, transgena biljna tkiva, transgene biljke i transgena semena koji sadrže molekule rekombinantne DNK i konstruisane proteine koje pruža pronalazak. Ove ćelije, tkiva, biljke i semena koja sadrže molekule rekombinantne DNK i konstruisane proteine pokazuju toleranciju na herbicide na jedan ili više PPO herbicida i, opciono, toleranciju na jedan ili više dodatnih herbicida.
[0034] Pogodni postupci za transformaciju ćelija biljaka domaćina za upotrebu sa aktuelnim pronalaskom uključuju praktično svaki postupak kojim se DNK može uneti u ćeliju (na primer, gde je rekombinantni DNK konstrukt stabilno integrisan u biljni hromozom) i dobro su poznati u struci. Primeran i široko korišćen postupak za uvođenje rekombinantnog DNK konstrukta u biljke je Agrobacterium sistem transformacije, koji je dobro poznat stručnjacima u ovoj oblasti. Još jedan primeran postupak za uvođenje rekombinantnog DNK molekula u biljke je insercija rekombinantnog DNK konstrukta u biljni genom na unapred određenom mestu postupcima mesto-usmerene integracije. Mesto-usmerena integracija može se postići bilo kojim postupkom poznatim u struci, na primer, korišćenjem cinkov prst nukleaza, konstruisanih ili nativnih meganukleaza, TALE-endonukleaza ili RNK-vođene endonukleaze (na primer CRISPR/Cas9 sistem). Transgene biljke se mogu regenerisati iz transformisane biljne ćelije postupcima biljne ćelijske kulture. Transgena biljka homozigotna u odnosu na transgen (to jest, dve alelne kopije transgena) može se dobiti samooplodnjom (samooprašivanjem) transgene biljke koja sadrži jedan alel transgena sa sobom, na primer biljke R0, da bi se proizvelo seme R1. Četvrtina proizvedenog semena R1 će biti homozigotna u odnosu na transgen. Biljke koje se uzgajaju iz proklijalog semena R1 mogu se testirati na zigotnost, obično koristeći SNP test, sekvenciranje DNK ili test termičke amplifikacije koji omogućava razlikovanje između heterozigota i homozigota, što se naziva testom zigotnosti.
[0035] Kao što se ovde koristi, "PPO inhibitor herbicid" ili "PPO herbicid" je hemikalija koja cilja i inhibira enzimsku aktivnost protoporfirinogen oksidaze (PPO), koja katalizuje dehidrogenaciju protoporfirinogena IX da bi se formirao protoporfirin IX, koji je prekursor za hem i hlorofil. Inhibicija protoporfirinogen oksidaze uzrokuje stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika, što rezultira poremećajem ćelijske membrane i na kraju smrću osetljivih ćelija. PPO herbicidi su dobro poznati u struci i komercijalno dostupni. Primeri PPO herbicida uključuju, ali nisu ograničeni na, difeniletre (kao što su acifluorfen, njegove soli i estri, aklonifen, laktofen, njegove soli i estri, i fomesafen, njegove soli i estri); pirimidindioni etil [3-2-hloro-4-fluoro-5- (1-metil-6-trifluorometil-2,4-diokso-1,2,3,4-tetrahidropirimidin-3-il)fenoksi]-2-piridiloksi]acetat (CAS registarski broj 353292-31-6 i ovde naveden kao S3100). Protoporfirinogen oksidaze i ćelije, semena, biljke i biljni delovi dati pronalaskom pokazuju toleranciju na herbicide na jedan ili više PPO herbicida.
[0036] Herbicidi se mogu primeniti na površinu rasta biljaka koja obuhvata biljke i semena koja su data pronalaskom kao postupak za suzbijanje korova. Biljke i semena data ovim pronalaskom obuhvataju svojstvo tolerancije na herbicide i kao takvi su tolerantni na primenu jednog ili više PPO herbicida. Primena herbicida može biti preporučena komercijalna norma (1X) ili bilo koja frakcija ili više njih, kao što je dvostruka preporučena komercijalna norma (2X). Doze herbicida mogu se izraziti kao kiselinski ekvivalent po funti po akru (lb ae/acre) ili kiselinski ekvivalent po gramu po hektaru (g ae/ha) ili kao funte aktivnog sastojka po akru (lb ai/acre) ili gram aktivnog sastojka po hektaru (g ai/ha), u zavisnosti od herbicida i formulacije. Primena herbicida obuhvata najmanje jedan PPO herbicid. Površina za rast biljaka može ili ne mora da obuhvata korovske biljke u vreme primene herbicida. Herbicidno efikasna doza PPO herbicida za upotrebu u području za suzbijanje korova može se sastojati od opsega od oko 0,1X do oko 30X norme na etiketi tokom vegetacije.1X norma na etiketi za neke primerne PPO herbicide data je u tabeli 2. Jedan (1) akr je ekvivalentan 2,47105 hektara, a jedna (1) funta je ekvivalentna 453,592 grama. Norme herbicida mogu se konvertovati između engleskog i metričkog sistema kao: (lb ai/ac) pomnoženo sa 1,12 = (kg ai/ha) i (kg ai/ha) pomnoženo sa 0,89 = (lb ai/ac).
Tabela 2: Primerni PPO herbicidi
[0037] Primene herbicida mogu biti sekvencijalno ili pomešano u rezervoaru sa jednim, dva ili kombinacijom nekoliko herbicida ili bilo kojim drugim kompatibilnim herbicidom.
Višestruke primene jednog herbicida ili dva ili više herbicida, u kombinaciji ili samostalno, mogu se koristiti tokom vegetacione sezone na površinama koje obuhvataju transgene biljke pronalaska za suzbijanje širokog spektra dikotiledonih korova, monokotiledonih korova, ili oboje, na primer, dve primene (kao što su primena pre sadnje i primena posle nicanja ili primena pre nicanja i primena posle nicanja) ili tri primene (kao što su primena pre sadnje, primena pre nicanja i primena posle nicanja ili primena pre nicanja i dve primene posle nicanja).
[0038] Kao što se ovde koristi, "tolerancija" ili "tolerancija na herbicid" znači sposobnost biljke, semena ili ćelije da se odupre toksičnim efektima herbicida kada je primenjen. Usevi otporni na herbicide mogu nastaviti da rastu i na njih ne utiče ili na njih minimalno utiče prisustvo primenjene hemikalije. Kao što se ovde koristi, "osobina tolerancije na herbicid" je transgena osobina koja daje poboljšanu toleranciju na herbicide biljci u poređenju sa biljkom divljeg tipa. Razmatrane biljke koje se mogu proizvesti sa osobinom tolerancije na herbicide predmetnog pronalaska mogu uključivati, na primer, bilo koju biljku, uključujući biljne kulture kao što su soja (npr. Glycine max), kukuruz, pamuk (Gossypium sp.) i uljana repica, između ostalog.
[0039] Transgene biljke, potomstvo, semena, biljne ćelije i biljni delovi pronalaska takođe mogu da sadrže jednu ili više dodatnih osobina. Dodatne osobine mogu se uvesti ukrštanjem biljke koja sadrži transgen koji sadrži rekombinantne molekule DNK koje pruža pronalazak sa drugom biljkom koja sadrži jednu ili više dodatnih osobina. Kao što se ovde koristi, "ukrštanje" znači oplemenjivanje dve individualne biljke da bi se proizvelo potomstvo biljke. Tako se mogu ukrstiti dve biljke da bi se proizvelo potomstvo koje sadrži poželjne osobine od svakog roditelja. Kao što se ovde koristi "potomstvo" označava potomstvo bilo koje generacije roditeljske biljke, a transgeno potomstvo sadrži DNK konstrukt koji je obezbeđen pronalaskom i nasleđen od najmanje jedne roditeljske biljke. Dodatne osobine mogu se uvesti takođe ko-transformacijom DNK konstrukta za tu dodatnu transgenu osobinu sa DNK konstruktom koji obuhvata rekombinantne DNK molekule koje pruža pronalazak (na primer, sa svim DNK konstruktima prisutnim kao deo istog vektora koji se koristi za transformaciju biljke) ili unošenjem dodatnih osobina u transgenu biljku koja obuhvata DNK konstrukt koji je dat pronalaskom ili obrnuto (na primer, korišćenjem bilo kog od postupaka transformacije biljke ili uređivanja genoma na transgenoj biljci ili biljnoj ćeliji). Takve dodatne osobine uključuju, ali nisu ograničene na, povećanu otpornost na insekte, povećanu efikasnost korišćenja vode, povećane performanse prinosa, povećanu otpornost na sušu, povećani kvalitet semena, poboljšani nutritivni kvalitet, proizvodnju hibridnog semena i toleranciju na herbicide, u kojima se osobina meri u odnosu na biljku divljeg tipa. Primeri dodatnih osobina tolerancije na herbicide mogu uključivati transgenu ili netransgenu toleranciju na jedan ili više herbicida kao što su inhibitori ACCaze (na primer ariloksifenoksi propionati i cikloheksandioni), ALS inhibitori (na primer sulfoniluree, imidazolinoni, triazoloirimidini i triazolinoni), EPSPS inhibitori (na primer glifosat), sintetički oksini (na primer fenoksini, benzoeve kiseline, karboksilne kiseline, semikarbazoni), inhibitori fotosinteze (na primer triazini, triazinoni, nitrili, benzotiadiazoli i uree), inhibitori sinteze glutamina (na primer glufosinat), inhibitori HPPD (na primer izoksazoli, pirazoloni i triketoni), PPO inhibitori (na primer difeniletri, N-fenilfalimidid, ariltriazinoni, pirimidindioni), inhibitori dugolančanih masnih kiselina (na primer hloroacetamidi, oksiacetamidi i pirazoli), između ostalog.
Primerne osobine otpornosti na insekte mogu uključivati otpornost na jedan ili više članova insekata u okviru jednog ili više redova Lepidoptera, Koleoptera, Hemiptera i Homoptera, između ostalog. Takve dodatne osobine su poznate stručnjacima u ovoj oblasti; na primer, spisak takvih transgenih osobina je obezbeđena od strane Službe za inspekciju zdravlja životinja i biljaka (APHIS) Ministarstva poljoprivrede Sjedinjenih Država (USDA).
[0040] Ćelija transformisana polinukleotidom predmetnog pronalaska, kao što je konstrukt ekspresije, može biti izabrana za prisustvo polinukleotida ili njegove kodirane enzimske aktivnosti pre ili nakon regeneracije takve ćelije u transgenu biljku. Transgene biljke koje sadrže takav polinukleotid mogu se stoga izabrati, na primer, identifikovanjem transgene biljke koja sadrži polinukleotid ili kodiranu enzimsku aktivnost i/ili pokazuje izmenjenu osobinu u odnosu na inače izogenu kontrolnu biljku. Takva osobina može biti, na primer, tolerancija na PPO herbicid.
[0041] Transgene biljke i potomstvo koji sadrže transgenu osobinu koju pruža pronalazak mogu se koristiti sa svim postupcima oplemenjivanja koji su opšte poznati u struci. U biljnim linijama koje obuhvataju dve ili više transgenih osobina, transgene osobine mogu biti nezavisno segregacione, povezane ili kombinacija obe u biljnim linijama koje sadrže tri ili više transgenih osobina. Razmatrano je i povratno ukrštanje sa roditeljskom biljkom i unakrsno oprašivanje sa netransgenom biljkom, kao i o vegetativnom razmnožavanju. Opisi načina oplemenjivanja koji se obično koriste za različite osobine i useve dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Da bi se potvrdilo prisustvo transgena u određenoj biljci ili semenu, mogu se izvršiti različiti testovi. Takvi testovi uključuju, na primer, testove molekularne biologije, kao što su ’Southern i northern blotting’, PCR i sekvenciranje DNK; biohemijske testove, kao što je detekcija prisustva proteinskog proizvoda, na primer, imunološkim sredstvima (ELISA i ’Western blots’) ili enzimskom funkcijom; testove biljnih delova, kao što su testovi lista ili korena; i takođe, analizom fenotipa cele biljke.
[0042] Introgresija transgene osobine u genotip biljke postiže se kao rezultat procesa konverzije povratnog ukrštanja. Biljni genotip u koji je introgresirana transgena osobina može se nazvati konvertovanim genotipom povratnog ukrštanja, linijom, inbredom ili hibridom. Slično tome, biljni genotip koji nema željenu transgenu osobinu može se nazvati nekonvertovanim genotipom, linijom, inbredom ili hibridom.
[0043] Nakon detaljnog opisa pronalaska, biće očigledno da su modifikacije, varijacije i ekvivalentna otelotvorenja moguća bez odstupanja od obima pronalaska definisanog u priloženim patentnim zahtevima. Pored toga, treba uvažiti da su primeri u ovom obelodanjivanju navedeni kao neograničavajući primeri.
PRIMERI
Primer 1: Otkriće mikrobne protoporfirinogen oksidaze
[0044] Nove protoporfirinogen oksidaze su identifikovane iz baza podataka mikrobnih sekvenci koristeći bioinformatičke metode i novi sistem skrininga bakterija protoporfirinogen oksidaze. Sekvenca E. coli HemG (SEQ ID NO:4) korišćena je kao početna sekvenca za bioinformatičku analizu baza podataka mikrobnih sekvenci. Bioinformatičkom analizom identifikovano je trideset tri nove navodne protoporfirinogen oksidaze iz porodice HemG PPO iz različitih bakterijskih izvora. Sekvence koje kodiraju ove pretpostavljene enzime HemG PPO upoređene su korišćenjem mapiranja filogenetskog stabla i utvrđeno je da su relativno različite. Deset je odabrano za dalju analizu iz ove grupe od trideset tri zbog njihove zastupljenosti pojedinačnih jedinstvenih članova klastera na filogenetskom stablu.
[0045] Sekvence kodiranja za deset izabranih enzima HemG PPO optimizovane su za ekspresiju E. coli kako bi se eliminisali svi retki kodoni pronađeni u sekvenci DNK divljeg tipa. Sekvence kodiranja optimizovane za E. coli za deset enzima HemG PPO su zatim klonirane u bakterijske ekspresijske vektore. Enzim PPO osetljiv na herbicide koji se prirodno nalazi u vodenoj konoplji (Amaranthus tuberculatus) kloniran je u bakterijski ekspresijski vektor za upotrebu kao kontrola i PPO funkcije i osetljivosti na herbicide (u daljem tekstu: "WH" i dat kao SEQ ID NO:21; NCBI GenBank Accession No. ABD52326; Patzoldt, et al. "A codon deletion confers resistance to herbicides inhibiting protoporphyrinogen oxidase" Proceedings of the National Academy of Science USA.103(33):12329-12334 (2006)). Enzim PPO vodene konoplje nije član porodice HemG. Enzim HemG PPO koji se prirodno nalazi u E. coli je kloniran u bakterijski ekspresijski vektor za upotrebu kao kontrola i za PPO aktivnost i za ispitivanje njegove osetljivosti na herbicide (u daljem tekstu H_N10 i naveden kao SEQ ID NO:4).
[0046] Protoporfirinogen oksidaza bakterijski skrining sistem je stvoren da bi se testirali rekombinantni proteini na aktivnost protoporfirinogen oksidaze i na taj način potvrdilo da su oni funkcionalni PPO enzimi. Ovaj sistem skrininga je koristio funkcionalni test spasavanja u soju E. coli koji je sadržao gen nokaut za enzim PPO E. coli (SEQ ID NO:4). HemG nokaut soj E. coli koji je korišćen pokazao je veoma minimalan rast na bakterijskom medijumu bez hema (kao što je LB medijum), ali je rast oporavljen kada je bakterijski medijum dopunjen slobodnim hemom ili kada je aktivna rekombinantna protoporfirinogen oksidaza eksprimirana u E. coli. Soj hemG nokaut E. coli bi se stoga mogao koristiti sa ekspresijom rekombinantnog proteina za brzo i lako testiranje proteina na aktivnost protoporfirinogen oksidaze.
[0047] Soj hemG nokaut E. coli je transformisan bakterijskim ekspresijskim vektorima koji sadrže gen koji kodira deset pretpostavljenih enzima HemG PPO, enzim E. coli HemG PPO i enzim PPO vodene konoplje. Bakterija je zatim isprugana na ploče sa LB medijumom, što je bakterijski medijum bez hema. Ekspresija rekombinantnog PPO enzima spasila je rast E. coli, što je rezultiralo rastom na LB pločama. Rast transformisanog soja hemG nokaut E. coli na LB pločama ukazao je na to da proteinska sekvenca funkcioniše kao protoporfirinogen oksidaza. Deset enzima HemG PPO (SEQ ID NO:1-10) i enzim PPO vodene konoplje (SEQ ID NO:21) uspeli su da obnove rast transformisanog soja HemG nokaut E. coli u ovom testu, potvrđujući tako njihovu aktivnost PPO. Poravnanje proteinskih sekvenci PPO enzima, sa konsenzus pozicijama, dato je kao Slika 1. Koristeći ovaj test, može se pregledati veliki broj novih ili konstruisanih proteina kako bi se potvrdila i izmerila aktivnost protoporfirinogen oksidaze.
Primer 2: Neosetljivost inhibitora protoporfirinogen oksidaze
[0048] Nove protoporfirinogen oksidaze koje su tolerantne na herbicide PPO identifikovane su pomoću bakterijskog sistema za skrining herbicida. Ovaj sistem skrininga koristio je test rasta hemG nokaut soja E. coli u LB tečnom medijumu sa PPO herbicidom za identifikaciju PPO koje nisu osetljive na PPO herbicid.
[0049] Soj hemG nokaut E. coli je transformisan bakterijskim ekspresijskim vektorom koji sadrži potvrđenu PPO aktivnost i kultivisan je u LB tečnom medijumu. Prečišćeni kristalni oblik jednog od pet različitih PPO herbicida (acifluorfen (1 mM), flumioksazin (0,5 mM), laktofen (0,5 mM), fomesafen (1 mM) i S-3100 (100 µM), koji predstavljaju tri različite PPO hemijske podklase, dodat je medijumu. Eksprimirani su rekombinantni proteini i izmerene su stope rasta E. coli. Krive rasta (OD600) su merene za različite varijante u prisustvu i odsustvu PPO herbicida u izabranim vremenskim tačkama od vremena nula do dvadeset četiri sata. Rast transformisanog hemG nokaut soja E. coli u LB medijumu u prisustvu PPO herbicida ukazao je da gen koji se koristi za transformaciju E. coli kodira herbicidno neosetljivu protoporfirinogen oksidazu (iPPO).
[0050] Nove protoporfirinogen oksidaze su korišćene u ovom testu za testiranje neosetljivosti na PPO herbicide. Utvrđeno je da deset protoporfirinogen oksidaza datih kao SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO:10 daju normalne stope rasta na soju hemG nokaut E. coli u LB medijumu u prisustvu PPO herbicida, što ukazuje na to da su ovi proteini protoporfirinogen oksidaze (iPPO) neosetljive na herbicide (Slika 2).
Soj hemG nokaut E. coli koji eksprimira PPO vodene konoplje (SEQ ID NO:21) bio je osetljiv na svih pet PPO herbicida, potvrđujući da je test bio u stanju da razlikuje osetljive i neosetljive PPO za svaki od herbicida. Koristeći ovaj test, može se izvršiti skrining velikog broja novih ili konstruisanih proteina kako bi se potvrdila aktivnost protoporfirinogen oksidaze u prisustvu PPO herbicida.
Primer 3: Enzimski test protoporfirinogen oksidaze (PPO)
[0051] Protoporfirinogen oksidaze su enzimski okarakterisane za merenje afiniteta vezivanja supstrata svakog PPO enzima (Km) i osetljivosti na PPO herbicid (IC50). Biljni enzimi PPO divljeg tipa iz vodene konoplje, soje i kukuruza korišćeni su za poređenje sa mikrobnim HemG protoporfirinogen oksidazama (date kao SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 10).
[0052] Etioplasti i hloroplasti su pripremljeni od etiolatiranih kotiledona (soja, Glycine max), etiolatiranih listova/koleoptila (kukuruz, Zea mays) i rasklopljenih vršnih listova (vodena konoplja, Amaranthus tuberculata) generalno procedurom koju su opisali Grossmann et al., ("Herbicid Saflufenacil (Kixor™) is a New Inhibitor of Protoporphyrinogen IX Oxidase Activity" Weed Science, 58(1):1-9 (2010)). Seme soje (A3555) i kukuruza (LH244) stavljeno je između dva lista vlažnog papira za klijanje (Anchor Paper Company, Saint Paul, Minnesota, USA) u čašu vode u neprekidnom mraku osam do deset dana. Biljke vodene konoplje bile su gajene 30 dana u stakleniku. Tkivo je sakupljeno, postavljeno između vlažnih listova papirnih ubrusa do mlevenja u fini prah sa avanom i tučkom u tečnom azotu. Pufer za homogenizaciju (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 500 mM saharoza, 1 mM EDTA, 1 mM magnezijum hlorid i 2 g/l goveđeg serumskog albumina) dodat je zamrznutom prašku u 4:1 (ml pufera za homogenizaciju u g svežeg tkiva), snažno pomešan i filtriran kroz četiri sloja prethodno navlaženog Miracloth<™>(Merck-Millipore, Darmstadt, Nemačka). Filtrat je centrifugiran na 9299g pet minuta. Pelet je resuspendovan u homogenizacionom puferu i centrifugiran na 150g dva minuta. Rastvor supernatanta je centrifugiran na 4000g petnaest minuta. Svi koraci centrifugiranja izvedeni su na 4°. Pelet (intaktna plastidna frakcija) je resuspendovan u 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 2 mM EDTA i 20% (v/v) glicerina i uskladišten u alikvotima na -80°. Ukupni protein u plastidnim preparatima meren je Bradfordovom metodom (MM Bradford, "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utility the principle of protein-dye binding" Analytical Biochemistry, 72:248-254 (1976)) sa goveđim serumskim albuminom kao standardom.
[0053] Izabrani PPO enzimi su eksprimirani u ćelijskoj liniji E. coli hemG nokaut. Bakterijske ćelije iz prekonoćne kulture korišćene su za inokulaciju 20 ml sveže podloge. Ovim kulturama je dozvoljeno da rastu oko 48 sati na 20°C do guste kulture. Bakterijske ćelije su prikupljene centrifugiranjem, a ćelijski peleti skladišteni na -80°C dok se ne izvrše enzimski testovi. Zamrznute bakterijske pelete su resuspendovane u ekstrakcionom puferu (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA i 1 mM MgCl2) i sonicirane (Sonics VibraCell™ , Newtown, CT USA) tokom tri ciklusa od 30 sekundi u ledenom kupatilu sa jednominutnim periodom mirovanja između ciklusa. Razbijene ćelije su centrifugirane na 200g 2 minuta na 4°C i supernatantni rastvor je korišćen za PPO enzimske testove nakon razblaživanja sa ekstrakcionim puferom. Ukupni protein je meren metodom Bradford (1976) sa goveđim serumskim albuminom kao standardom.
[0054] Protoporfirinogen IX (protogen) je sintetizovan redukcijom komercijalno dostupnog protoporfirina sa amalgamom natrijum žive kako su opisali JM Jacobs i NJ Jacobs ("Measurement of Protoporphyrinogen Oxidase Activity" in Current Protocols in Toxicology (1999) 8.5.1-8.5.13, John Wiley & Sons, Inc.). Protoporfirin (Proto) je dodat u 0,01N kalijum hidroksid u 20% etanolu i mešan u mraku do rastvaranja (oko 40 minuta). Zapremina od 0,8 ml stavljena je u polipropilensku bočicu od 2 ml sa poklopcem na zavrtanje sa O-ringom, i dodato je oko 1 g (puna špatula, ulje drenirano) amalgama natrijum žive (broj proizvoda 451908, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, čuvano pod uljem). Epruveta je odmah zatvorena i snažno pomešana sa vrtložnom mešalicom i odzračivana oko svakih 30 sekundi otpuštanjem poklopca dok rastvor više nije fluorescentno crven pod UV svetlom (oko pet minuta).
Reakciona bočica je isprana argonom i kratko centrifugirana da bi se peletirao preostali natrijum amalgam. Rastvor supernatanta je odmah razblažen 1:1 (v/v) rastvorom 0,1M DTT i 0,5M Tris-HCl, pH 7,5 i bočica je isprana argonom. Dobijeni rastvor je podeljen na manje alikvote u epruvete sa polipropilenskim poklopcem od 0,5 ml koje su isprane argonom odmah nakon dodavanja alikvota. Zatvorene epruvete su prekrivene aluminijumskom folijom i uskladištene na -80°C. Za enzimski test, alikvoti protogena su odmrznuti, čuvani prekriveni na ledu i korišćeni istog dana. Koncentracija protogena u preparatu izračunata je oduzimanjem koncentracije Proto, mereno fluorescentnom HPLC (metoda opisana od strane Matsumoto et al, "Porphyrin Intermediate Involved in Herbicidal Action of delta-Aminolevulinic Acid on Duckweed (Lemna paucicostata Hegelm.)" Pesticide Biochem. and Phys. 48:214-221 (1994)), u finalnom rastvoru protogena (obično oko 1% početnog materijala) iz koncentracije Proto u početnom materijalu i pod pretpostavkom da nema značajnih nečistoća ni u jednom uzorku. Protogen pripremljen i skladišten u ovim uslovima bio je stabilan najmanje šest meseci.
[0055] Aktivnost PPO u ekstraktu biljnog plastida i preparatima bakterijskog ekstrakta merena je generalno kao što je opisano u Grossmann. et al. (2010). Deset mikrolitara ili plastidnog ekstrakta (40 µg ukupnog proteina) ili bakterijskog ekstrakta (16 do 35 µg ukupnog proteina za različite bakterijske ekstrakte) dodato je u pufer za analizu (100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM DTT, 1 mM EDTA i 0,085% (v/v) Tween 80). S-3100 (takođe poznat kao "SYN-523"; npr . U.S. Patent Publication US20100062941 A1) je dodat kao zapremina od dva mikrolitra iz 100X osnovnog rastvora pripremljenog u acetonu. S-3100 analitičkog kvaliteta obezbedila je hemijska kompanija Sumitomo. Svi testovi su sprovedeni u finalnoj koncentraciji od 1% (v/v) acetona. Ekstrakti (plastidni ili bakterijski), pufer i S-3100 su inkubirani na 30°C (biljni ekstrakti) ili 37°C (bakterijski ekstrakti) pet minuta pre dodavanja dva mikrolitra protogena za pokretanje testa. Svi testovi su urađeni u mikrotitarskoj pločici od crnog polistirena sa 96 bunara (COSTAR<®>3925, Corning, Inc., Corning, New York) pri finalnoj zapremini od 200 mikrolitara. Nakon dodavanja protogena (3 µM za merenja IC50; promenljiva za merenja Km) u sve bunare, pločica je inkubirana na 30°C (biljni ekstrakti) ili 37°C (bakterijski ekstrakti) pre pokretanja prikupljanja podataka. Fluorescencija tokom vremena merena je na 30°C (biljni ekstrakti) ili 37°C (bakterijski ekstrakti) sa talasnim dužinama ekscitacije i emisije od 405 mm, odnosno 630 mm, u SpectraMax<®>M5 MultiMode čitaču mikropločica (Molecular Devices, Sunnyvale, California). Test slepa proba je izvedena dodavanjem ekstrakta inaktiviranog toplotom (pet minuta na 100°C) u testnu smešu.
[0056] Afinitet vezivanja protoporfirinogen oksidaza za supstrat (protoporfirinogen) meren je kao Km. Prividne vrednosti Kmza svaku procenjenu PPO izračunate su korišćenjem fitovanjem krive pravougaone hiperbole pomoću softverskog paketa SoftPro<®>kinetics (Molecular Devices, Sunnyvale, California). Osetljivost enzimske aktivnosti na PPO herbicid S-3100 izmerena je kao koncentracija koja daje 50% inhibicije kontrolne aktivnosti (IC50). Vrednosti IC50S-3100 za svaku procenjenu PPO određene su grafički iz semilogaritamskog dijagrama koncentracije S-3100 u odnosu na aktivnost PPO.
[0057] Utvrđeno je da su Kmza PPO enzime iz tri biljna izvora (vodena konoplja, soja ili kukuruz) i mikrobni HemG PPO enzimi (SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO:10) slični, u rasponu od 0,3 uM do 2,0 uM. Tri ispitivana biljna PPO enzima bila su osetljiva na S-3100
sa vrednostima IC50od 0,009, 0,004 i 0,003 uM, respektivno. Nasuprot tome, PPO enzimi iz bakterijskog izvora (SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO:10) bili su neosetljivi na S-3100 sa vrednostima IC50većim od 100 uM. Podaci su dati u tabeli 3.
Tabela 3. PPO enzimska aktivnost enzima prečišćenih iz biljnih ili mikrobnih izvora
Primer 4: Enzimska optimizacija protoporfirinogen oksidaza
[0058] Optimizacija proteina se koristi za poboljšanje ili promenu enzimskih svojstava novih protoporfirinogen oksidaza. Za optimizaciju enzima koristi se jedna ili više metoda proteinskog projektovanja. Neograničeni primeri pristupa projektu proteina uključuju mutacije skeniranja alaninima; mutacije skeniranja homologije; mutacije skeniranja Pro/Gly; zamene regiona ili mutacije; i kombinacije ovih različitih tehnika (videti, M Lehmann i M Wyss, Current Opinion in Biotechnology 12(4): 371-375 (2001); B Van den Burg i VGH Eijsink, Current Opinion in Biotechnology 13(4): 333-337 (2002); i Weiss et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97(16):8950-8954 (2000)). Sekvence DNK koje kodiraju projektovane protoporfirinogen oksidaze se sintetišu i kloniraju u bakterijski ekspresijski vektor. Vektor se koristi za transformaciju soja hemG nokaut E. coli za početni skrining oslobađanja bakterija visoke propusnosti kao što je opisano u primeru 1.
Konstruisane protoporfirinogen oksidaze koje oslobađaju soj hemG nokaut E. coli se testiraju na osetljivost na jedan ili više PPO herbicida korišćenjem testa rasta bakterija kao što je opisano u primeru 2. Alternativno, transformisani soj hemG nokaut E. coli je zasejan na medijumu sa i bez PPO herbicida. Projektovane varijante koje pokazuju toleranciju na PPO herbicide eksprimirane su u sistemu ekspresije bakterija i detaljna biohemijska karakterizacija je izvršena korišćenjem prečišćenog proteina sa kontinualnim fluorimetrijskim testom kao što je opisano u primeru 3. Konstruisane varijante koje su neosetljive na PPO herbicide izabrane su za kloniranje u vektore transformacije biljaka, transformaciju biljaka i testiranje in planta.
Primer 5: Ekspresija i ispitivanje enzima HemG PPO u kukuruzu
[0059] Mikrobni HemG PPO enzimi su eksprimirani u transgenim biljkama kukuruza, a transgene biljke su analizirane na toleranciju na PPO herbicide. Konstruisani su vektori transformacije biljaka koji sadrže rekombinantni DNK molekul koji kodira jedan od mikrobnih enzima HemG PPO navedenih kao SEQ ID NO: 1-20. DNK sekvenca koja kodira PPO enzim može uključivati na 5' kraju kodon za metionin, obično poznat kao startni kodon, ili ovaj kodon može biti eliminisan kako bi se olakšalo operativno povezivanje sekvence tranzitnog peptida sa 5' krajem sekvence kodiranja. Primeri proteinskih sekvenci PPO enzima koje sadrže metionin na amino-terminusu su navedeni kao SEQ ID NO:1-10. Primeri proteinskih sekvenci PPO enzima bez metionina na amino-terminusu su navedeni kao SEQ ID NO:11-20. Za transformaciju biljaka, nukleotidne sekvence koje kodiraju navodne PPO enzime bile su kodonski optimizovane za ekspresiju dikotiledona ili monokotiledona. Tabela 4 daje SEQ ID NO koja odgovara sekvencama proteina i nukleotida mikrobnog HemG PPO enzima u vektorima transformacije.
Tabela 4. SEQ ID NO koji odgovara PPO varijantama
[0060] Kreirana su četiri vektora transformacije biljke za ekspresiju HemG PPO H_N10 (SEQ ID NO:4) koristeći dve različite kombinacije promotera plus lider plus intron sa dve različite sekvence ciljnog peptida (TP) i dve različite 3'UTR sekvence. Konstrukti transformacije biljke su označeni sa 1, 6, 11 i 16. Za ispitivanje kukuruza in planta, embrioni nezrelog kukuruza (LH244) transformisani su korišćenjem Agrobacterium tumefaciens i standardnih metoda poznatih u struci.
[0061] Transgene biljke kukuruza proizvedene su korišćenjem konstrukata za transformaciju biljaka 6 i 16 koji sadrže gen koji kodira HemG PPO H_N10 (SEQ ID NO:4). Uzorci listova su prikupljeni od biljaka R0 i skenirani pomoću PCR kako bi se utvrdio broj kopija transgena insertovanih u genom biljke. Biljke koje sadrže jednu kopiju (jedan primerak) bile su samooprašene i unakrsno oprašene kako bi se generisalo seme R1 i F1 za buduća ispitivanja. Biljke koje sadrže više kopija (više primeraka) su prskane na sledeći način: (1) 5 g/ha S-3100 u približno fazi rasta V5, zatim 10 g/ha S-3100 u približno fazi rasta V7, za ukupnu primenu od 15 g/ha S-3100 ili (2) 10 g/ha S-3100 u približno fazi rasta V5. Prosečan procenat oštećenja, na skali od 0-100, pri čemu je nula bez oštećenja, a 100 potpuna smrtnost useva, procenjen je 7 dana nakon konačnog tretmana za svaku seriju. Poprskani netransgeni kukuruz LH244 korišćen je kao kontrola i pokazao je prosečno 43,3% oštećenja kada je tretiran sa ukupno 15 g/ha S-3100 (Tretman 1) i prosečno 26,7% oštećenja kada je tretiran sa ukupno 10 g/ha S-3100 (Tretman 2). Transgene biljke kukuruza koje eksprimiraju HemG H_N10 (SEQ ID NO:4) nadmašile su kontrolne biljke sa prosekom od 28,9% oštećenja kada su tretirane sa ukupno 15 g/ha S-3100 (Tretman 1) i prosečnim oštećenjem od 24,2% kada su tretirane sa ukupno 10 g/ha S-3100 (Tretman 2). Podaci su dati u tabeli 5.
Tabela 5: Tolerancija I transgenog kukuruza na herbicid
[0062] Biljke transgenog kukuruza proizvedene su korišćenjem konstrukata za transformaciju biljaka 6, 20, 21, 22 i 23 koji sadrže gen koji kodira enzime HemG PPO H_N90 (SEQ ID NO:1), H_N10 (SEQ ID NO:4), H_N60 (SEQ ID NO:3), H_N110 (SEQ ID NO:10) i H_N40 (SEQ ID NO:6), respektivno. Ovih pet konstrukata imalo je istu promoter plus lider plus intron kombinaciju, sa dve različite sekvence ciljnog peptida (TP) i istom 3'UTR sekvencom. Uzorci listova su uzeti iz biljke R0 i analizirani pomoću PCR kako bi se odredio broj transgenih kopija. Biljke sa jednom kopijom za do 12 jedinstvenih događaja po konstruktu presađena su u saksije, samoprašene i unakrsno oprašene kako bi se generisalo seme R1 i F1, respektivno, za buduća ispitivanja. Biljke sa više kopija i ekstra jednom kopijom su poprskane sa 40 grama/ha S-3100 u približno V5 fazi rasta, a ocene oštećenja su uzete 7 dana nakon tretmana. Zabeležen je prosečan procenat (%) oštećenja za sve biljke koje eksprimiraju svaki PPO enzim i broj biljaka koje su ocenjene kao visoko tolerantna (manje od 10% oštećenja), pri čemu je svaka biljka jedinstveni pojedinačni ili višestruki transformant. Biljke transgenog kukuruza koje eksprimiraju H_N10 (SEQ ID NO:4) imale su ukupno prosečno oštećenje od 39,5% i proizvele su 31 visoko tolerantnu biljku od 139 testiranih biljaka. Biljke transgenog kukuruza koje eksprimiraju H_N60 (SEQ ID NO:3) imale su ukupno prosečno oštećenje od 55,8% i proizvele su 19 visoko tolerantnih biljaka od 86 testiranih biljaka. Biljke transgenog kukuruza koje eksprimiraju H_N90 (SEQ ID NO:1) imale su najniže ukupno prosečno oštećenje od 31,4% i proizvele su 44 visoko tolerantne biljke od 99 testiranih biljaka. Biljke transgenog kukuruza koje eksprimiraju H_N40 (SEQ ID NO:6) imale su ukupno prosečno oštećenje od 47,0% i proizvele su najveći udeo visoko tolerantnih biljaka sa 53 visoko tolerantne biljke od 98 testiranih biljaka. Biljke transgenog kukuruza koje eksprimiraju H_N110 (SEQ ID NO: 10) imale su prosečno oštećenje od 43,0%, ali nisu proizvele biljke visoke tolerancije. Podaci su dati u tabeli 6.
Tabela 6: Tolerancija II na herbicide transgenog kukuruza
[0063] Podaci o transgenom kukuruzu R0 pokazali su da su pet mikrobnih enzima HemG PPO H_N90 (SEQ ID NO:1), H_N10 (SEQ ID NO:4), H_N60 (SEQ ID NO:3), H_N40 (SEQ ID NO:6) i H_N110 (SQ ID NO:10) proizveli smanjene stope oštećenja kada su eksprimirani u transgenim biljkama i na taj način preneli toleranciju useva na PPO herbicid.
[0064] Transgene biljke F1 proizvedene iz unakrsnog oprašivanja biljaka R0 sa jednom kopijom koje eksprimiraju H_N10 (SEQ ID NO:4) u jednoj od dve konfiguracije konstrukta testirane su u stakleniku na toleranciju na herbicide. Biljke su tretirane sa 40 grama/ha S-3100 u fazi rasta V3, a ocena oštećenja je uzeta sedam dana nakon tretmana. Biljke transgenog kukuruza koje eksprimiraju H_N10 (SEQ ID NO:4) u konfiguraciji konstrukta 6 rezultirale su sa 13 od 18 događaja koji proizvode biljke visoke tolerancije (10% ili manje oštećenja), ali konfiguracija konstrukta 16 nije rezultirala događajima koji proizvode biljke visoke tolerancije.
[0065] Transgene biljke F1 proizvedene od unakrsnog oprašivanja biljaka R0 sa jednom kopijom koje eksprimiraju H_N10 (SEQ ID NO:4) u jednoj od dve konfiguracije konstrukta (konstrukti 6 i 16) testirane su na toleranciju na herbicide na terenu. Ova F1 populacija je bila segregirana (50% hemizigota i 50% ništa) i izbor za transgene biljke nije sproveden pre ocene oštećenja. Očekuje se da će ukupna prosečna ocena oštećenja za takvu populaciju biti viša od homogene transgene populacije, jer je teško razlikovati netransgene biljke od transgenih biljaka. Ispitivanja su sprovedena na dve lokacije sa dve replikacije i 3 tretmana po konstruktu. Kao negativna kontrola korišćene su netransgene biljke kukuruza. Tretmani primene herbicida bili su sledeći: Tretman 1 je bio 0.036 lb ai/acre S-3100 primenjen u V2, nakon čega je usledio V4, zatim V8; Tretman 2: bio 0.072 lb ai/acre S-3100 primenjen u V2, zatim V4, zatim V8; Tretman 3: bio je 0.144 lb ai/acre S-3100 primenjen u V2, zatim V4, zatim V8. Procenat oštećenja useva procenjen je u fazi rasta V2 (CIPV2) i u fazi rasta V4 (CIPV4) 5 do 7 dana nakon tretmana (greška V2 i greška V4 su polovina najmanje značajne razlike (LSD)). Ocene oštećenja useva kombinovane su za obe lokacije. Sve netransgene biljke i biljke sa događajima generisanim korišćenjem konstrukta 16 pokazale su između 94,6-99,5% oštećenja nakon primene herbicida u V2 i V4 za svaki od tri tretmana. Biljke sa događajima generisanim korišćenjem konstrukta 6 pokazale su samo 30% do 50% oštećenja nakon primene herbicida u V2 i bez oštećenja nakon primene herbicida u V4. Podaci su dati u tabeli 7.
Tabela 7. Terensko ispitivanje efikasnosti kukuruza F1 koji sadrži PPO H_N10 (SEQ ID NO:4)
[0066] Podaci transgenog kukuruza F1 iz staklenika i polja pokazali su da je mikrobni enzim HemG PPO H_N10 (SEQ ID NO:4) proizveo smanjene stope oštećenja kada je eksprimiran u transgenim biljkama i na taj način dao toleranciju useva na PPO herbicid.
Primer 6: Ekspresija i ispitivanje enzima HemG PPO u sojinim biljkama
[0067] Mikrobni HemG PPO enzimi su eksprimirani u biljkama transgene soje, a transgene biljke su analizirane na toleranciju na PPO herbicide. Konstruisani su vektori transformacije biljaka koji se sastoje od rekombinantnog DNK molekula koji kodira jedan od mikrobnih enzima HemG PPO koji su dati kao H_N10 (SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:13); H_N20 (SEQ ID NO:12); H_N30 (SEQ ID NO:14); H_N40 (SEQ ID NO:15); H_N50 (SEQ ID NO:16); H_N90 (SEQ ID NO:11); i H_N100 (SEQ ID NO:17, 20).
[0068] U soji, ekscidirani embrioni (A3555) su transformisani sa konstruktima transformacije 1 i 11 koristeći A. tumefaciens i standardne postupke poznate u struci. Konstrukti transformacije 1 i 11 imali su istu promoter plus lider plus intron kombinaciju, istu 3'UTR sekvencu, istu mikrobnu HemG PPO H_N10 (SEQ ID NO:4), ali su se razlikovali u sekvencama ciljnog peptida (TP). Regenerirane transgene biljke R0 gajene su u stakleniku. Biljke koje predstavljaju dvadeset pojedinačnih kopija R0 soje proizvedenih od konstrukta 11 i koje eksprimiraju mikrobni PPO enzim H_N10 (SEQ ID NO: 4) poprskane su sa 210 g/ha flumioksazina (Valor®, Valent U.S.A. Corporation, Walnut Creek CA). Herbicid je prskan u razvojnoj fazi V3 sa tri potpuno razvijena trifolijatna lista i ocene oštećenja su procenjene 8 dana nakon tretmana. Zabeležen je procenat biljaka koje su ocenjene kao visoko tolerantne (15% ili manje oštećenja). Nakon primene 210 g/ha flumioksazina, kontrolne biljke netransgene soje imale su prosečnu stopu oštećenja od 30% i nisu imale visoko tolerantne biljke. Biljke soje koje eksprimiraju mikrobni PPO enzim H_N10 (SEQ ID NO:4) imale su prosečnu ocenu oštećenja od 22%, a 9% testiranih biljaka bilo je visoko tolerantno na herbicid.
[0069] Biljke koje predstavljaju deset događaja R0 soje sa više kopija proizvedene iz konstrukta 11 i koje eksprimiraju mikrobni PPO enzim H_N10 (SEQ ID NO: 4) poprskane su sa 5g/ha S-3100. Herbicid je prskan u razvojnoj fazi V3 sa tri potpuno razvijena trifolijatna lista i stope oštećenja su procenjene 8 dana nakon tretmana. Zabeležen je procenat biljaka koje su ocenjene kao visoko tolerantne (25% ili manje oštećenja). Nakon primene S-3100 (5 g/ha), netransgena kontrolne biljke soje imale su prosečnu stopu oštećenja od 60% i nisu imale visoko tolerantne biljke. Biljke soje koje eksprimiraju mikrobni PPO enzim H_N10 (SEQ ID NO:4) imale su prosečnu ocenu oštećenja od 47%, a 30% testiranih biljaka bilo je visoko tolerantno na herbicid.
[0070] Transgene biljke soje R1 sa jednom kopijom u stakleniku poprskane su jednom od tri stope primene herbicida: Tretman 1 je bio 5 grama ai/ha S-3100 primenjeno u V4, a zatim R1; Tretman 2 je bio 10 grama ai/ha S-3100 primenjeno u V4, zatim R1; Tretman 3 je bio 30 grama ai/ha S-3100 primenjeno u V4, zatim R1. Procenat oštećenja useva u V2 (CIPV2) ocenama procenjen je deset dana nakon tretmana. Netransgene biljke su imale prosečne ocene oštećenja od 89% do 100% i nisu bile dostupne za ocenjivanje u fazi rasta R1. Biljke proizvedene od konstrukta 1 i koje eksprimiraju mikrobni PPO enzim H_N10 (SEQ ID NO: 4) imale su ocene oštećenja u rasponu od 3% do 15,7%. Podaci su dati u tabeli 8.
Tabela 8: Skrining efikasnosti S-3100 za soju R1 u stakleniku
[0071] Za procenu velikog broja konstrukata u transgenim biljkama u pogledu tolerancije na herbicide u rano transformisanom tkivu sadnica korišćen je postupak transformacije i skrininga biljaka velike propusnosti. To je omogućilo brži i skrining većeg obima konfiguracija konstrukta i PPO enzima.
[0072] Geni koji kodiraju sedam mikrobnih enzima HemG PPO H_N10 (SEQ ID NO:13); H_N20 (SEQ ID NO:12); H_N30 (SEQ ID NO:14); H_N40 (SEQ ID NO:15); H_N50 (SEQ ID NO:16); H_N90 (SEQ ID NO:11); i H_N100 (SEQ ID NO:17, 20) bili su operativno povezani sa trideset sedam različitih ciljnih peptida i klonirani u vektor transformacije osnovne biljke. To je omogućilo uporedno poređenje sedam različitih enzima HemG PPO sa trideset sedam različitih ciljnih peptida koji koriste isti promoter i 3'UTR elemente za ekspresiju gena. Ovi konstrukti za transformaciju biljaka korišćeni su za transformaciju ekscidiranih embriona soje (germplazma A3555) koristeći A. tumefaciens i standardne postupke poznate u struci. Četiri stotine eksplanta je inokulisano za svaki konstrukt, što je rezultiralo sa dvanaest kontejnera po konstruktu. Za ispitivanje tolerancije na herbicide korišćen je sterilni rastvor PPO herbicida. Rastvor herbicida je sadržao 0,3 g S-3100 u koncentratu ulja useva (5,0 ml) i 495 ml dejonizovane vode. Ovo je filtrirano kroz filter za kulturu tkiva Nalgene® Rapid-Flow™ od 0,45 mikrona i membranski filter celuloznog acetata bez površinski aktivnih materija (VWR, Radnor, PA, USA). Dobijeni sterilni rastvor je bio u tresilici pre nanošenja.
[0073] Pet nedelja nakon transformacije, četiri od dvanaest kontejnera za biljke po konstruktu su poprskana u dva prolaza sterilnim rastvorom PPO herbicida. Tretirane biljke su zatim zatvorene u posudu i dobijale su najmanje 15 sati izlaganja svetlosti nakon prskanja svakog dana tokom četiri dana. Na kraju četvrtog dana nakon primene S-3100, tretirane biljke su fotografisane i bodovane na vizuelnoj skali zelenog obojenja (zeleno obojenje je bilo reprezentativno za zdravo fotosintetsko biljno tkivo u poređenju sa foto-beljenim tkivom) u odnosu na oštećenje. Vrednosti bodovanja bile su 0 za lošu toleranciju, veliko oštećenje, nisko zeleno obojenje; 1 za određenu toleranciju, prosečnu štetu, umerenu zelenu boju; i 2 za dobru toleranciju, malu štetu, visoko zeleno obojenje. Bodovanje za svaki konstrukt je prikazano u Tabeli 9, gde n.d. ukazuje da analiza nije sprovedena. Rezultati ukazuju da je u ovom skriningu visoke propusnosti jedan broj konstrukata obezbedio toleranciju na PPO herbicid.
Tabela 9. Visokopropusni skrining soje na toleranciju na herbicide: ocena obojenja
[0074] Biljke u neprskanim posudama, a koje odgovaraju konstruktima sa rezultatom 2, presađene su otprilike 7 nedelja nakon transformacije i uzgajane kao biljke R0 koristeći standardne postupke poznate u struci. Sadnice koje odgovaraju netolerantnim ocenama 0 i 1 takođe su uzgojene da služe kao negativne kontrole. Biljke R0 su gajene u stakleniku u uslovima uzgajališta dugog dana (18 sati svetlosti na 80°F, a zatim 6 sati mraka na 74°F) tokom približno četiri nedelje. U jedanaestoj nedelji, biljke R0 su poprskane u dva prolaza sa istim rastvorom herbicida (0,3 g S-3100) koji je prethodno opisan. Ocene oštećenja od herbicida prikupljene su sedam dana nakon tretmana.
[0075] Rezultati primene tolerancije na herbicide u toku jedanaest nedelja na biljke R0 potvrdili su niske ocene procenata oštećenja uočene u skriningu visoke propusnosti nakon pet nedelja. Svaka ocena oštećenja od 30% ili više bila je ekvivalentna ocenama oštećenja netransgene soje. Nekoliko konstrukata se izdvojilo kao oni koji daju veoma dobru toleranciju na primenu herbicida. Na primer, TP1 sa PPO H_N90 (SEQ ID NO:11) je imao samo 3% oštećenja i sa PPO H_N30 (SEQ ID NO:14) ili PPO H_N40 (SEQ ID NO:15) je imao samo 5% oštećenja; TP20 sa PPO H_N90 (SEQ ID NO:11) je imao samo 5% oštećenja. Nasuprot tome, TP32 sa PPO H_N90 (SEQ ID NO:11) imao je rezultat oštećenja od 50%. Podaci su dati u Tabeli 10, gde n.d. ukazuje da analiza nije sprovedena.
Tabela 10. Tolerancija R0 transgene soje na herbicide: ocene procentualnog oštećenja
[0076] Da bi se dalje procenili konstrukti transformacije biljaka u soji, ekscidirani embrioni (A3555) su transformisani korišćenjem vektora transformacije biljaka sa A. tumefaciens i standardnim postupcima poznatim u struci. Regenerisane transgene sadnice R0 uzgajane su u stakleniku i razdvojene u grupe. Grupe su prskane sa jednim ili više PPO herbicida po grupi kako bi se procenila tolerancija na herbicide. Na primer, transgene biljke R0 su prskane u približno V2-V4 fazi rasta sa laktofenom po normi od 110 g ai/ha (0,09 lb ai/acre) ili 220 g ai/ha (0,19 lb ai/acre). Biljke su procenjene na oštećenje jedan do četrnaest dana nakon tretmana i zabeleženi se rezultati oštećenja. Uzorci listova su korišćeni za identifikaciju transgenih biljaka sa jednom kopijom transgenog DNK inserta, a biljke R0 koje sadrže samo jednu kopiju i prolaze testiranje herbicidnim raspršivanjem su samooprašene za proizvodnju semena R1.
[0077] Biljke R1 su uzgojene u stakleniku i podeljene u grupe. Grupe su prskane sa jednim ili više PPO herbicida po grupi kako bi se procenila tolerancija na herbicide. Na primer, PPO herbicid laktofen je primenjen pre nicanja i/ili u fazi rasta V2 do V6 po normi od 220 g ai/ha (0,19 lb ai/acre). Biljke su procenjene na oštećenja jedan do četrnaest dana nakon tretmana i zabeleženi su rezultati oštećenja. Neprskane transgene biljke su korišćene za fenotipsko poređenje sa neprskanim biljkama divljeg tipa.
[0078] Biljke R2 su generisane samooprašivanjem homozigotne transgene biljke R1 i sakupljanjem semena. Biljke R2 su procenjene testovima na jednoj ili više terenskih lokacija ili staklene bašte. Tretmani herbicidima su primenjeni, a parcele ili biljke su ocenjene na oštećenje useva jedan do četrnaest dana nakon primene herbicida na skali od 0 do 100, pri čemu je nula bez oštećenja, a 100 potpuna smrtnost useva.
Primer 7: Test lisnog diska
[0079] Test lisnog diska je korišćen za brzu i minimalno štetnu procenu tolerancije na herbicide u transgenim biljkama koje eksprimiraju rekombinantni PPO enzim. Lisno tkivo uzorkovano je iz najmlađeg potpuno zelenog lista biljaka kukuruza i soje. Pet diskova listova prečnika 4 mm isečeno je iz uzoraka listova pomoću jednokratne biopsijske zumbalice sa klipom (Integra® Miltex®, Inc., York, Pennsylvania) i diskovi listova su stavljeni u jedan ml rastvora za inkubaciju (1 mM MES, pH 6,5, 1% m/v saharoza, 1% (v/v) aceton) u polistirenskim pločicama sa 24 bunara sa poklopcima. Za analizu tolerancije na herbicide, S-3100 je dodat u rastvor za inkubaciju do finalne koncentracije od 1 mikromol. Primenjena je vakuumska infiltracija i ploče lisnih diskova su inkubirane u kontinualnom mraku jedan dan na sobnoj temperaturi (23-24°C), nakon čega je usledila jednodnevna (soja) ili dvodnevna (kukuruz) kontinuirana svetlosna inkubacija pod gornjim fluorescentnim i sijalicama sa užarenom niti (520 uE) na 26-27°C. Oštećenje lisnog diska je zatim ocenjeno vizuelno na skali od 0 (najniže oštećenje) do 4 (najviše oštećenje), sa nižim ocenama koje ukazuju na bolju toleranciju na PPO herbicid.
[0080] Lisni diskovi iz transgenih biljaka kukuruza proizvedenih korišćenjem konstrukta 6 i eksprimiranjem PPO enzima H_N10 (SEQ ID NO: 4) pokazali su značajnu toleranciju na herbicid na osnovu prosečne ocene lisnog diska od 0,4. Ovaj rezultat je bio u skladu sa tolerancijom na PPO herbicide uočenom u celim biljkama transformisanim sa konstruktom 6 i eksprimiranjem PPO enzima H_N10 (SEQ ID NO: 4). Lisni diskovi iz transgenih sojinih biljaka proizvedenih korišćenjem konstrukta 1 i konstrukta 11 i eksprimiranjem PPO enzima H_N10 (SEQ ID NO: 4) pokazali su da su biljke sa konstruktom 1 imale značajnu toleranciju na herbicide sa ocenom oštećenja nula, dok su biljke sa konstruktom 11 imale ocenu oštećenja 1,6, a netransgene biljke su imale ocenu oštećenja 2,6.
Primer 8: Ekspresija i ispitivanje enzima HemG PPO u pamuku
[0081] Mikrobni enzimi HemG PPO eksprimirani su u transgenim biljkama pamuka, a transgene biljke su analizirane na toleranciju na PPO herbicida. U pamuku, ekscidirani embrioni (Coker 130) su transformisani ovim vektorima koristeći A. tumefaciens i standardne postupke poznate u struci. Regenerisane transgene sadnice R0 uzgajane su u stakleniku i podeljene u grupe. Grupe su korišćene za prskanje PPO herbicida (jedan PPO herbicid po grupi) za procenu tolerancije. Na primer, transgene sadnice R0 su prskane u približno V2-V4 fazi rasta sa laktofenom u dozi od 110 g ai/ha (0,09 lb ai/acre) ili 220 g ai/ha (0,19 lb ai/acre). Biljke su procenjene na oštećenje jedan do četrnaest dana nakon tretmana i zabeleženi su rezultati oštećenja. Uzorci listova su korišćeni za identifikaciju transgenih biljaka sa jednom kopijom transgenog inserta. Biljke R0 koje sadrže samo jednu kopiju i prolaze ispitivanje herbicidnim raspršivanjem su samooprašene radi proizvodnje semena R1.
[0082] Biljke R1 su uzgajane u stakleniku i podeljene u grupe. Grupe su prskane sa jednim ili više PPO herbicida po grupi kako bi se procenila tolerancija a herbicide. Na primer, PPO herbicid laktofen je primenjen pre nicanja i/ili na dva prava lista do prve faze cveta u dozi od 220 g ai/ha (0,19 lb ai/acre) (1X). Biljke su procenjene na oštećenja jedan do četrnaest dana nakon tretmana i zabeleženi se rezultati oštećenja. Neprskane transgene biljke su korišćene za fenotipsko poređenje sa neprskanim biljkama divljeg tipa.
[0083] Biljke R2 su generisane samooprašivanjem homozigotne transgene biljke R1 i sakupljanjem semena. Biljke R2 su procenjene u testovima na jednoj ili više terenskih lokacija ili staklenoj bašti. Primenjeni su tretmani herbicidima, a parcele ili biljke su ocenjene na oštećenje useva jedan do četrnaest dana nakon primene herbicida na skali od 0 do 100, pri čemu je nula bez oštećenja, a 100 potpuna smrtnost useva.

Claims (10)

Patentni zahtevi
1. Rekombinantni DNK molekul koji sadrži heterologni promoter operativno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira protein koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa polipeptidnom sekvencom SEQ ID NO:1 ili 11, pri čemu protein ima aktivnost protoporfirinogen oksidaze neosetljive na herbicide i pri čemu je heterologni promotor funkcionalan u biljnoj ćeliji.
2. Rekombinantni DNK molekul prema patentnom zahtevu 1, pri čemu:
(a) sekvenca nukleinske kiseline je izabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:49 i SEQ ID NO:54, ili
(b) protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:11.
3. DNK konstrukt koji sadrži rekombinantni DNK molekul prema patentnom zahtevu 1 ili zahtevu 2.
4. Transgena biljka, seme, ćelija ili deo biljke koji sadrži molekul rekombinantne DNK prema patentnom zahtevu 1 ili zahtevu 2.
5. Transgena biljka, seme, ćelija ili deo biljke koji sadrži rekombinantni polipeptid koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence u odnosu na punu dužinu aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO:11, pri čemu polipeptid ima aktivnost protoporfirinogen oksidaze neosetljive na herbicide.
6. Postupak za dodeljivanje tolerancije na herbicid biljci, semenu, ćeliji ili delu biljke, koji sadrži heterologno eksprimiranje rekombinantnog polipeptida prema patentnom zahtevu 5 u navedenoj biljci, semenu, ćeliji ili delu biljke.
7. Postupak transformacije biljke, koji obuhvata korake:
a) uvođenje molekula rekombinantne DNK prema patentnom zahtevu 1 ili zahtevu 2 u biljnu ćeliju; i
b) regenerisanje biljke iz one koja sadrži molekul rekombinantne DNK.
8. Postupak za suzbijanje korova u području rasta biljaka, koji se sastoji od kontaktiranja područja rasta biljaka koje sadrži transgenu biljku ili seme prema patentnom zahtevu 4 sa najmanje jednim PPO herbicidom, pri čemu je transgena biljka ili seme tolerantno na PPO herbicid i pri čemu se korovi suzbijaju u području rasta biljaka.
9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, u kojoj PPO herbicid pripada klasi difenil etara, N-fenilftalimida ili pirimidin diona.
10. Postupak prema patentnom zahtevu 8, u kome je herbicid PPO izabran iz grupe koju čine acifluofen, flumioksazin, laktofen, fomesafen i etil[3-2-hloro-4-fluoro-5- (1-metil-6-trifluorometil-2,4-diokso-1,2,3,4-tetrahidropirimidin-3-il)fenoksi]-2-piridiloksi]acetat (S-3100, CAS registarski broj 353292-31-6)).
RS20240411A 2015-08-03 2016-07-29 Postupci i kompozicije za toleranciju na herbicide kod biljaka RS65394B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562200428P 2015-08-03 2015-08-03
PCT/US2016/044774 WO2017023778A1 (en) 2015-08-03 2016-07-29 Methods and compositions for herbicide tolerance in plants
EP16833627.9A EP3331997B1 (en) 2015-08-03 2016-07-29 Methods and compositions for herbicide tolerance in plants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65394B1 true RS65394B1 (sr) 2024-04-30

Family

ID=57943510

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240411A RS65394B1 (sr) 2015-08-03 2016-07-29 Postupci i kompozicije za toleranciju na herbicide kod biljaka

Country Status (26)

Country Link
US (5) US10370677B2 (sr)
EP (1) EP3331997B1 (sr)
JP (4) JP7030684B2 (sr)
KR (1) KR102723024B1 (sr)
CN (2) CN108235709B (sr)
AR (5) AR105589A1 (sr)
AU (3) AU2016303496B2 (sr)
BR (1) BR112018002068A2 (sr)
CA (1) CA2993656C (sr)
CL (1) CL2018000301A1 (sr)
CO (1) CO2018002368A2 (sr)
DK (1) DK3331997T5 (sr)
EC (1) ECSP18015892A (sr)
ES (1) ES2975746T3 (sr)
HR (1) HRP20240421T1 (sr)
HU (1) HUE066001T2 (sr)
MX (4) MX386169B (sr)
PE (1) PE20181026A1 (sr)
PH (1) PH12018500208A1 (sr)
PL (1) PL3331997T3 (sr)
PT (1) PT3331997T (sr)
RS (1) RS65394B1 (sr)
RU (1) RU2755224C2 (sr)
UA (1) UA126894C2 (sr)
WO (1) WO2017023778A1 (sr)
ZA (1) ZA201800469B (sr)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150305329A1 (en) 2012-06-04 2015-10-29 Michael Fefer Formulations Containing Paraffinic Oil and Anti-Settling Agent
CA2877585C (en) 2013-03-15 2016-04-12 Suncor Energy Inc. Herbicidal compositions
EP3331997B1 (en) * 2015-08-03 2024-01-24 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for herbicide tolerance in plants
US10378023B2 (en) 2015-09-01 2019-08-13 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for herbicide tolerance in plants
US10563220B2 (en) 2015-12-21 2020-02-18 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for efficient targeting of transgenes
UA127343C2 (uk) 2016-07-29 2023-07-26 Монсанто Текнолоджі Ллс Спосіб і композиція для експресії генів в рослині
CA3026528A1 (en) * 2017-12-15 2019-06-15 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for ppo herbicide tolerance
AU2017319643B2 (en) 2017-12-20 2024-01-25 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for controlling harmful organisms in crops
AU2019264145B2 (en) * 2018-04-30 2025-03-20 Nutrien Ag Solutions (Canada) Inc. Macrocyclic tetrapyrrole compounds, compositions and methods for increasing abiotic stress resistance in plants
JP7588289B2 (ja) 2019-02-15 2024-11-22 ニュートリエン・エージー・ソリューションズ・（カナダ）・インコーポレイテッド 植物の健康を増進するプロトポルフィリンｉｘ誘導体及びその使用
CN111423990B (zh) * 2020-04-10 2021-08-27 科稷达隆(北京)生物技术有限公司 一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌及其制备方法
EP4250928A1 (en) 2020-11-24 2023-10-04 Syngenta Crop Protection AG Herbicidal compounds
AU2022253338B2 (en) 2021-04-07 2024-09-12 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
CN115336534A (zh) * 2021-05-12 2022-11-15 北京大北农生物技术有限公司 原卟啉原氧化酶的用途
WO2023044364A1 (en) 2021-09-15 2023-03-23 Enko Chem, Inc. Protoporphyrinogen oxidase inhibitors
JP7732840B2 (ja) * 2021-10-14 2025-09-02 株式会社三共 遊技機
JP7732843B2 (ja) * 2021-10-14 2025-09-02 株式会社三共 遊技機
JP7732839B2 (ja) * 2021-10-14 2025-09-02 株式会社三共 遊技機
JP7732841B2 (ja) * 2021-10-14 2025-09-02 株式会社三共 遊技機
CN116042637B (zh) * 2021-10-28 2025-09-09 中国科学技术大学 一种水稻抗草铵膦除草剂遗传位点及其应用
KR20240136380A (ko) 2022-01-14 2024-09-13 엔코 켐 인코포레이티드 프로토포르피리노겐 산화효소 억제제
AU2023231748A1 (en) 2022-03-11 2024-09-05 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2023222589A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
AR129821A1 (es) 2022-07-13 2024-10-02 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos herbicidas
UY40630A (es) 2023-02-03 2024-08-15 Syngenta Crop Protection Ag “Plantas y partes de estas que se han modificado para comprender una enzima BioA o BIO3-BIO1 (BioDA
WO2024167793A1 (en) * 2023-02-09 2024-08-15 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for ppo herbicide tolerance
WO2024175476A1 (en) 2023-02-24 2024-08-29 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2024175475A1 (en) 2023-02-24 2024-08-29 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
CN120752221A (zh) 2023-03-17 2025-10-03 先正达农作物保护股份公司 除草三嗪衍生物
UY40714A (es) 2023-04-19 2024-12-13 Syngenta Crop Protection Ag Una enzima o fragmento funcional de protoporfirinógeno oxidasa (ppo) modificado, y plantas que compr
JP2023112065A (ja) * 2023-06-21 2023-08-10 住友化学株式会社 除草剤耐性作物の栽培地における雑草の防除方法
WO2025016884A1 (en) 2023-07-20 2025-01-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2025016885A1 (en) 2023-07-20 2025-01-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2025153595A1 (en) 2024-01-17 2025-07-24 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5767373A (en) 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
US6023012A (en) 1996-02-28 2000-02-08 Novartis Finance Corporation DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase
US5939602A (en) 1995-06-06 1999-08-17 Novartis Finance Corporation DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof
US6084155A (en) 1995-06-06 2000-07-04 Novartis Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
AR006928A1 (es) 1996-05-01 1999-09-29 Pioneer Hi Bred Int Una molecula de adn aislada que codifica una proteina fluorescente verde como marcador rastreable para la transformacion de plantas, un metodo para laproduccion de plantas transgenicas, un vector de expresion, una planta transgenica y celulas de dichas plantas.
FR2751347B1 (fr) 1996-07-16 2001-12-07 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides
US7586023B1 (en) * 1996-12-27 2009-09-08 Sumitomo Chemical Company, Limited Methods of conferring ppo-inhibiting herbicide resistance to plants by gene manipulation
ZA98371B (en) * 1997-01-31 1999-07-16 Du Pont Genetically transformed plants demonstrating resistance to porphyrinogen biosynthesis-inhibiting herbicides.
JPH1118775A (ja) 1997-07-04 1999-01-26 Sumitomo Chem Co Ltd プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドおよびその利用
AU741013B2 (en) * 1997-09-11 2001-11-22 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Novel protoporphyrinogen oxidase tolerant to light-requiring herbicides
CN1373811A (zh) * 1999-08-13 2002-10-09 辛根塔参与股份公司 耐除草剂的原卟啉原氧化酶
BR0014681A (pt) 1999-10-11 2002-08-20 Processo para aumentar o rendimento ou a biomassa da colheita usando o gene para protoporfirinógeno oxidase
AU2001260114A1 (en) 2000-03-14 2001-09-24 Syngenta Participations Ag Protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
NZ526737A (en) 2000-11-29 2005-12-23 Kumiai Chemical Industry Co Gene encoding acetolactic acid synthase gene
US7314974B2 (en) 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
KR100480479B1 (ko) * 2002-04-22 2005-04-07 주식회사 싸이젠하베스트 프로토포르피리노겐 옥시다아제의 엽록체 및 미토콘드리아동시발현을 이용한 작물의 제초제 저항성 증대 방법 및 이유전자를 제초제 저항성 선발 마커로 사용하는 형질전환세포주 선발 방법
KR100559155B1 (ko) * 2004-04-12 2006-03-13 전남대학교산학협력단 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자 및 이를이용한 식물의 제초제 저항성 증대방법
US7842856B2 (en) 2005-08-25 2010-11-30 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Herbicide resistance gene, compositions and methods
US7671254B2 (en) * 2005-08-25 2010-03-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Herbicide resistance gene, compositions and methods
KR101070376B1 (ko) * 2008-11-06 2011-10-05 한국생명공학연구원 제초제 저항성 Ｐｒｏｔｏｘ 형질전환 벼 사상의 도입유전자 위치 및 이용방법
JP5365159B2 (ja) * 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法
AU2010321223A1 (en) 2009-11-18 2012-08-02 Basf Plant Science Company Gmbh Process for the production of fine chemicals
AR079622A1 (es) 2009-12-16 2012-02-08 Dow Agrosciences Llc Combinaciones de proteinas insecticidas que comprenden cry1ab y cry2aa, que se unen a sitios receptores unicos en el perforador de maiz europeo, utiles para prevenir el desarrollo de resistencia a insectos.
CA2805937A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Chimeric promoters and methods of use
MY169304A (en) * 2010-12-16 2019-03-21 Basf Agro Bv Plants having increased tolerance to herbicides
CA2997731C (en) 2011-05-13 2020-05-26 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
US9150625B2 (en) 2011-05-23 2015-10-06 E I Du Pont De Nemours And Company Chloroplast transit peptides and methods of their use
RU2632569C2 (ru) 2011-07-15 2017-10-05 Зингента Партисипейшнс Аг Способы увеличения урожая и стрессоустойчивости у растения
US10041087B2 (en) * 2012-06-19 2018-08-07 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
AR091489A1 (es) 2012-06-19 2015-02-11 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo)
WO2014164761A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CA2920591A1 (en) 2013-08-12 2015-02-19 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
UA123757C2 (uk) 2013-08-12 2021-06-02 Басф Агро Б. В. Мутована протопорфіриногеноксидаза, що надає рослинам стійкості до ппо-інгібуючого гербіциду
EP3032942B1 (en) 2013-08-16 2020-03-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
AT514775B1 (de) 2013-08-28 2017-11-15 Erber Ag Polypeptid zur hydrolytischen Spaltung von Zearalenon und/oder Zearalenon Derivaten, isoliertes Polynukleotid davon sowie Zusatzstoff enthaltend das Polypeptid
MD4770B1 (ro) 2013-12-18 2021-10-31 BASF Agro B.V. Plante cu toleranţă sporită la erbicide
PH12017501047B1 (en) 2014-12-16 2022-06-15 Farmhannong Co Ltd Methods for conferring or enhancing herbicide resistance on plants and/or alga with protoporphyrinogen oxidase variants
MX389329B (es) 2015-06-17 2025-03-11 Basf Agro Bv Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas.
EP3331997B1 (en) 2015-08-03 2024-01-24 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for herbicide tolerance in plants
US10378023B2 (en) 2015-09-01 2019-08-13 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for herbicide tolerance in plants
US10563220B2 (en) 2015-12-21 2020-02-18 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for efficient targeting of transgenes
EP3458591B1 (en) * 2016-05-20 2024-10-23 BASF Agro B.V. Dual transit peptides for targeting polypeptides
UA127343C2 (uk) 2016-07-29 2023-07-26 Монсанто Текнолоджі Ллс Спосіб і композиція для експресії генів в рослині
CA3026528A1 (en) 2017-12-15 2019-06-15 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for ppo herbicide tolerance

Also Published As

Publication number Publication date
EP3331997A4 (en) 2019-06-05
AU2020281034A1 (en) 2021-01-14
MX2021011148A (es) 2021-10-22
RU2755224C2 (ru) 2021-09-14
PH12018500208A1 (en) 2018-07-30
US11198886B2 (en) 2021-12-14
AU2022263577A1 (en) 2022-12-15
DK3331997T5 (da) 2024-10-07
AU2016303496B2 (en) 2020-09-03
PT3331997T (pt) 2024-04-22
HUE066001T2 (hu) 2024-06-28
JP2025011207A (ja) 2025-01-23
US20190382786A1 (en) 2019-12-19
KR102723024B1 (ko) 2024-10-28
US10370677B2 (en) 2019-08-06
AU2020281034B2 (en) 2023-08-03
CL2018000301A1 (es) 2018-05-04
MX2021011150A (es) 2021-10-22
CA2993656A1 (en) 2017-02-09
MX2021011149A (es) 2021-10-22
EP3331997B1 (en) 2024-01-24
PE20181026A1 (es) 2018-06-27
US20170037427A1 (en) 2017-02-09
KR20240159016A (ko) 2024-11-05
JP2023116671A (ja) 2023-08-22
US11236353B2 (en) 2022-02-01
JP7030684B2 (ja) 2022-03-07
US20250092413A1 (en) 2025-03-20
ZA201800469B (en) 2018-12-19
US12123009B2 (en) 2024-10-22
BR112018002068A2 (pt) 2018-09-25
MX386169B (es) 2025-03-18
EP3331997A1 (en) 2018-06-13
RU2018107701A3 (sr) 2020-06-23
WO2017023778A1 (en) 2017-02-09
JP2018527911A (ja) 2018-09-27
ECSP18015892A (es) 2018-04-30
DK3331997T3 (da) 2024-04-15
CO2018002368A2 (es) 2018-11-22
AU2016303496A1 (en) 2018-03-01
AR120669A2 (es) 2022-03-09
ES2975746T3 (es) 2024-07-12
CN108235709B (zh) 2023-09-29
AR122348A2 (es) 2022-09-07
CN108235709A (zh) 2018-06-29
KR20180028532A (ko) 2018-03-16
MX2018001525A (es) 2018-04-24
AR120670A2 (es) 2022-03-09
AR105589A1 (es) 2017-10-18
RU2018107701A (ru) 2019-09-05
AU2022263577B2 (en) 2025-01-02
HRP20240421T1 (hr) 2024-06-21
UA126894C2 (uk) 2023-02-22
US20190382787A1 (en) 2019-12-19
CN117143890A (zh) 2023-12-01
US20220127634A1 (en) 2022-04-28
PL3331997T3 (pl) 2024-07-01
JP2021168691A (ja) 2021-10-28
CA2993656C (en) 2025-11-18
AR120668A2 (es) 2022-03-09
JP7344933B2 (ja) 2023-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12123009B2 (en) Methods and compositions for PPO herbicide tolerance in plants
US11319551B2 (en) Methods and compositions for PPO herbicide tolerance in plants
EP3206481A1 (en) Herbicide tolerance genes and methods of use thereof
KR102895027B1 (ko) 식물에서 제초제 내성을 위한 방법 및 조성물
KR20250174111A (ko) 식물에서 제초제 내성을 위한 방법 및 조성물