[go: up one dir, main page]

RS65691B1 - Svinja i ćelije rezistentne na virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (prrsv) koje imaju modifikovane cd163 gene - Google Patents

Svinja i ćelije rezistentne na virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (prrsv) koje imaju modifikovane cd163 gene

Info

Publication number
RS65691B1
RS65691B1 RS20240750A RSP20240750A RS65691B1 RS 65691 B1 RS65691 B1 RS 65691B1 RS 20240750 A RS20240750 A RS 20240750A RS P20240750 A RSP20240750 A RS P20240750A RS 65691 B1 RS65691 B1 RS 65691B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
nucleotide
deletion
compared
seq
reference sequence
Prior art date
Application number
RS20240750A
Other languages
English (en)
Inventor
Randall S Prather
Kevin D Wells
Kristin M Whitworth
Original Assignee
Univ Missouri
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Missouri filed Critical Univ Missouri
Publication of RS65691B1 publication Critical patent/RS65691B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/02—Breeding vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
    • C12N15/8778—Swine embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0609—Oocytes, oogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/108—Swine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis pronalaska
OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI
[0001] Predmetni pronalazak je kao što je definisano u patentnim zahtevima i odnosi se na životinje svinje koje sadrže najmanje jednu modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD 163, kao što je specifično navedeno u patentnim zahtevima. Pronalazak se dalјe odnosi na ćelije svinje koje sadrže takve modifikovane hromozomske sekvence. Životinje i ćelije imaju povećanu rezistenciju na virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRSV). Životinje i potomci imaju hromozomske modifikacije CD163 gena tako da su inhibirani ulazak i replikacija PRRSV, a rezultujuće životinje ispoljavaju rezistenciju na bolest i sindrom prouzrokovan virusom. U obimu u kome je ovde opisana druga tematika, ona je uklјučena samo u svrhe upućivanja. Opisani su takođe postupci uzgoja za stvaranje životinja koje su rezistentne na patogene i populacija životinja napravlјeni upotrebom takvih postupaka. Opisani su takođe postupci za gensko editovanje CD163 koji uklјučuju direktno injeciranje embriona i razvoj životinja, životinja osnivača i linija koje su rezistene na patogene kao što je PRRSV.
POZNATO STANJE TEHNIKE
[0002] Virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRSV) pripada grupi sisarskih arterivirusa, koji takođe uklјučuju mišji virus koji podiže laktat dehidrogenazu, virus majmunske hemoragične groznice i virus arteritisa konja. Arterivirusi dele važne osobine vezana za virusnu patogenezu, uklјučujući tropizam za makrofage i sposobnost da prouzrokuju ozbiljnu bolest i upornu infekciju. Sindromi kliničke bolesti prouzrokovane infekcijom sa virusom reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRSV) prvi put su prijavlјeni u Sjedinjenim Državama 1987. godine (Keffaber, 1989), a kasnije i u Evropi, 1990. godine (Wensvoort i saradnici, 1991). Infekcija sa PRRSV dovodi do respiratorne bolesti koja uključuje kašalј i groznicu, reproduktivnu insuficijenciju tokom kasne gestacije i smanjene performanse rasta. Virus takođe učestvuje u raznovrsnim interakcijama sindroma polimikrobne bolesti uz održavanje doživotne subkliničke infekcije (Rowland i saradnici, 2012).
[0003] Od svoje pojave, PRRS je postao najvažnija bolest komercijalnih svinja u Severnoj Americi, Evropi i Aziji, sa samo kontinentima Australije i Antarktika bez bolesti. Procenjuje se da samo u Severnoj Americi troškovi gubitaka povezanih sa PRRSV za proizvođače iznose 664 miliona dolara svake godine (Holtkamp i saradnici, 2013). U 2006. godini, teži oblik bolesti, poznat kao visoko patogeni PRRS (HP-PRRS), desetkovao je populacije svinja širom Kine. Genetički diverzitet je ograničio razvoj vakcina potrebnih za efektivnu kontrolu i eliminaciju bolesti. Iako bi genetička selekcija za prirodnu rezistenciju mogla biti opcija, rezultati su do danas bili ograničeni (Boddicker i saradnici, 2014).
[0004] Molekulska poređenja između severnoameričkih i evropskih virusa klasifikuju sve izolate PRRSV u jedan od dva genotipa, tipa 2 ili tipa 1, tim redom. Iako ova dva genotipa poseduju identičnost na nivou nukleotida od samo oko 70% (Nelsen i saradnici, 1999), oba karakterišu tropizam za ćelije pozitivne na CD163, uspostavlјanje dugotrajne infekcije i proizvodnja sličnih kliničkih znakova.
[0005] CD163 je membranski protein tipa 1 od 130 kDa sastavlјen od devet domena receptora “hvatača” bogatih cisteinom (SRCR, od engl. scavenger receptor cysteine-rich) (Fabriek i saradnici, 2005). CD163 svinja sadrži 17 egzona koji kodiraju peptidnu signalnu sekvencu, nakon koje sledi devet SRCR domena, dva linkerska domena, označena takođe kao prolin serin treoninski (PST) domeni, koji se nalaze nakon SRCR 6 i SRCR 9, kao i citoplazmatski domen praćen kratkim citoplazmatskim repom. Površinska ekspresija CD163 je ograničena na ćelije monocitno-makrofagne loze. Protein je prvi put identifikovan u tkivima ljudi zbog njegove sposobnosti da vezuje komplekse hemoglobina i haptoglobina (HbHp) (Kristiansen i saradnici, 2001). Uklanjanje HbHp „hvatanjem” je glavna funkcija CD163 i utvrđeno je da je locirana na SRCR 3 (Madsen i saradnici, 2004). Metaboliti koje oslobađaju makrofagi nakon razgradnje HbHp uklјučuju bilirubin, CO i slobodno gvožđe. Jedna od važnih funkcija CD163 je prevencija oksidativne toksičnosti koja je rezultat slobodnog hemoglobina (Kristiansen i saradnici, 2001; Soares i saradnici, 2009).
[0006] CD163, kao receptor za PRRSV, prvi put je opisan od strane Calvert-a i saradnika (2007). Transfekcija nepermisivnih ćelijskih linija sa cDNK za CD163 iz različitih vrsta, uklјučujući majmunske, čoveka, vrste pasa i miša mogu učiniti ćelije permisivnim za PRRSV infekciju (Calvert i saradnici, 2007). Pored CD163, drugi receptorski protein, CD169 (takođe poznat kao sijaloadhezin ili SIGLEC1), identifikovan je kao primarni PRRSV receptor uklјučen u obrazovanje početne interakcije sa heterodimerom GP5-matriks (M), glavnim proteinom na površini viriona (Delputte i saradnici, 2002). U ovom modelu, naknadna interakcija između CD163 i GP2, 3, 4 heterotrimera u endozomalnom odelјku posreduje u uklanjanju omotača i oslobađanju virusnog genoma u citoplazmu (Van Breedam i saradnici, 2010, Allende i saradnici, 1999). Prethodni model koji opisuje PRRSV infekciju alveolarnih makrofaga identifikovao je SIGLEC1 (CD169) kao primarni virusni receptor na površini makrofaga; ipak, prethodni rad sa upotrebom SIGLEC1<-/->svinja nije pokazao razliku u replikaciji virusa u poređenju sa svinjama divlјeg tipa (Prather i saradnici, 2013). Ovi rezultati su podržali prethodne in vitro studije koje su pokazale da su ćelijske linije rezistene na PRRSV kojima nedostaju površinski CD 169 i CD 163 podržavale replikaciju virusa nakon transfekcije sa CD163 plazmidom (Welch i saradnici, 2010).
[0007] Mnoge od karakteristika kako PRRSV patogeneze (posebno na molekulskom nivou), tako i epizootiologije nisu dovoljno razjašnjeni, što otežava pokušaje uvođenja kontrole. Trenutno, proizvođači često vakcinišu svinje vakcinama za PRRSV koje sadrže modifikovane žive atenuirane sojeve ili mrtve viruse, međutim, današnje vakcine često ne obezbeđuju zadovolјavajuću zaštitu. Navedeno je posledica kako varijacija u sojevima, tako i neadekvatne stimulacije imunskog sistema. Pored zabrinutosti oko efikasnosti dostupnih PRRSV vakcina, postoje jaki dokazi da vakcina sa modifikovanim živim virusima koja se trenutno koristi može opstati u pojedinačnim svinjama i krdima svinja i akumulirati mutacije (Mengeling i saradnici, Am. J. Vet. Res, 60(3): 334-340 (1999)), kao što je pokazano sa virulentnim terenskim izolatima nakon eksperimentalne infekcije svinja (Rowland i saradnici, Virology, 259:262-266 (1999)). Štaviše, pokazano je da se virus iz vakcine izlučuje u spermi vakcinisanih nerasta (Christopher-Hennings i saradnici, Am. J. Vet. Res, 58(1): 40-45 (1997)). Kao alternativu vakcinaciji, pojedini stručnjaci zagovaraju strategiju „testiranja i uklanjanja” u krdima za rasplod (Dee i Molitor, Vet. Rec., 143:474-476 (1998)). Uspešna upotreba ove strategije zavisi od uklanjanja svih svinja koje su bilo akutno ili perzistentno inficirane sa PRRSV, nakon čega sledi stroga kontrola da bi se sprečilo ponovno unošenje virusa. Poteškoća i veliki deo troškova povezanih sa ovom strategijom su u tome što se malo zna o patogenezi perzistentne PRRSV infekcije i što stoga ne postoje pouzdane tehnike za identifikaciju perzistentno inficiranih svinja.
[0008] Kao što se može videti, u oblasti tehnike postoji potreba za razvojem strategija za indukovanje rezistencije na PRRSV kod životinja. Whitworth i saradnici, Biol of Reprod 91(3):78, 1-13 (D1) opisuju upotrebu CRISPR/Cas9 sistema za proizvodnju genetički modifikovanih svinja od jajnih ćelija i embriona dobijenih in vitro. WO 2015011483 (D2) opisuje domen 5 iz CD163 za upotrebu u antivirusnim kompozicijama za PRRS i transgene životinje.
WO 2012158828 (D3) opisuje životinje rezistene na virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja.
Randall Prather i saradnici, XXIII konferencija o genomu bilјaka i životinja - 10-14. januar 2015, San Dijego (D4) opisuje postupak genetičkog inženjeringa posredovanog sa CRISPR/Cas9 i postavlјa pitanje da li je CD163 ulazni medijator za PRRSV infekciju.
KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0009] Predmetni pronalazak je kao što je definisano u patentnim zahtevima, a u obimu u kome je ovde opisana druga tematika, ona je uključena samo u svrhe upućivanja. Opisane su životinje različite od čoveka, njihovo potomstvo i životinjske ćelije koje sadrže najmanje jednu modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163.
[0010] Opisani su i postupci uzgoja za stvaranje životinja ili loza koje imaju smanjenu podložnost na infekciju patogenom. Postupak obuhvata genetičko modifikovanje oocite ili ćelije sperme, da bi se u najmanje jednu oocitu i ćeliju sperme uvela modifikovana hromozomska sekvenca u gen koji kodira protein CD 163, pri čemu postupak obuhvata i oplodnju oocita sa ćelijom sperme da bi se stvorila oplođena jajna ćelija koja sadrži modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. Alternativno, postupak obuhvata genetičko modifikovanje oplođene jajne ćelije, da bi se u oplođenu jajnu ćeliju uvela modifikovana hromozomska sekvenca u gen koji kodira protein CD163. Postupak dalјe obuhvata prenošenje oplođene jajne ćelije u surogat ženku, pri čemu gestacija i prašenje u terminu proizvode životinju potomka, a životinja potomak se dalje podvrgava skriningu u kontekstu podložnosti na patogen i selektuju se potomci koji imaju smanjenu podložnost na patogen u poređenju sa životinjama koje su ne sadrže modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163.
[0011] Opisane su takođe populacije životinja koje su napravlјene postupcima uzgoja.
[0012] Dalјe je opisan postupak povećanja rezistencije grla stoke na infekciju sa patogenom. Postupak obuhvata genetičko editovanje najmanje jedne hromozomske sekvence iz gena koji kodira protein CD 163, tako da je proizvodnja ili aktivnost proteina CD 163 smanjena u poređenju sa proizvodnjom ili aktivnošću CD63 proteina kod grla stoke koje ne sadrži editovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD 163.
[0013] U kontekstu predmetnog pronalaska, modifikacije hromozomske sekvence u genu koji kodira protein CD163 su kao što je specifično navedeno u patentnim zahtevima. Preciznije, modifikovana hromozomska sekvenca sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koju čine:
insercija 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 na istom alelu;
delecija 1506 baznih parova od nukleotida 1.525 do nukleotida 3.030 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
insercija 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
delecija 1280 baznih parova od nukleotida 2.818 do nukleotida 4.097 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
delecija 1373 bazna para od nukleotida 2.724 do nukleotida 4.096 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
delecija 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
delecija 28 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
delecija 1387 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 4.531 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
delecija 1382 bazna para od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113;
delecija 452 bazna para od nukleotida 2.440 do nukleotida 4.160 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; i
delecija 452 bazna para od nukleotida 3.015 do nukleotida 3.466 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0014] U obimu u kome su druge modifikacije ovde opisane, one su uklјučene samo u svrhe upućivanja.
[0015] Modifikacije hromozomske sekvence u genu koji kodira protein CD163, koje su ovde obezbeđene, mogu smanjiti podložnost životinje, potomstva, ćelije ili populacije (npr. životinje, potomstva, ćelija ili populacije svinja) na patogen (npr. virus kao što je kao virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRSV)).
[0016] U bilo kojoj od životinja, potomaka, ćelija, populacija i postupaka koji su ovde opisani, modifikovana hromozomska sekvenca može dovesti do proizvodnje suštinski nefunkcionalnog proteina CD 163 od strane životinje, potomstva, ćelije ili populacije.
[0017] U bilo kojoj od životinja, potomaka, ćelija, populacija i postupaka koji su ovde opisani, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju koja ne menja okvir čitanja u genu koji kodira protein CD 163.
[0018] U bilo kojoj od životinja, potomaka, ćelija, populacija svinja i postupaka koji su ovde opisani, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati SEQ ID NO: 118. Alternativno, modifikacija hromozomske sekvence u genu koji kodira protein CD163 može sadržavati: deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 na istom alelu; deleciju 124 bazna para od nukleotida 3.024 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; deleciju 123 bazna para od nukleotida 3.024 do nukleotida 3.146 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; inserciju 1 baznog para između nukleotida 3.147 i 3.148 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; deleciju 130 baznih parova od nukleotida 3.030 do nukleotida 3.159 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; deleciju 132 bazna para od nukleotida 3.030 do nukleotida 3.161 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; deleciju 1506 baznih parova od nukleotida 1.525 do nukleotida 3.030 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; inserciju 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; deleciju 1280 baznih parova od nukleotida 2.818 do nukleotida 4.097 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; deleciju 1373 bazna para od nukleotida 2.724 do nukleotida 4.096 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; deleciju 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; deleciju 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; deleciju 28 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; deleciju 1387 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 4.531 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; deleciju 1382 bazna para od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113; deleciju 1720 baznih parova od nukleotida 2.440 do nukleotida 4.160 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; deleciju 452 bazna para od nukleotida 3.015 do nukleotida 3.466 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; ili bilo koju od njihovih kombinacija.
[0019] Opisane su i nukleinske kiseline. Molekuli nukleinskih kiselina sadrže nukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine: (a) nukleotidna sekvenca koja sadrži SEQ ID NO: 47; (b) nukleotidna sekvenca koja je najmanje 80% identična sekvenci SEQ ID NO: 47, pri čemu navedena nukleotidna sekvenca sadrži najmanje jednu supstituciju, inserciju ili deleciju u odnosu na SEQ ID NO: 47; i (c) cDNK sekvenca (a) ili (b).
[0020] Na primer, molekul nukleinskih kiselina može sadržavati: (a) nukleotidnu sekvenca koja je najmanje 87,5% identična sekvenci SEQ ID NO: 47, pri čemu navedena nukleotidna sekvenca sadrži najmanje jednu supstituciju, inserciju ili deleciju u odnosu na SEQ ID NO: 47; ili (b) cDNK sekvencu iz (a).
[0021] Opisane su i dodatne nukleinske kiseline. Nukleinska kiselina može sadržavati SEQ ID NO: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 118 ili 119.
[0022] Bilo koji od molekula nukleinskih kiselina mogu biti izolovani molekuli nukleinskih kiselina.
[0023] Ostali predmeti i karakteristike biće delimično očigledni, a delimično specifično istaknuti u nastavku tekstu.
KRATAK OPIS SLIKA
[0024]
SL.1. Vektori i CRISPR upotrebljeni za ciljano modifikovanje CD163. Panel A prikazuje egzone 7, 8 i 9 gena za CD 163 divlјeg tipa na koga je ciljano delovano radi modifikacije upotrebom CRISPR. Panel B prikazuje vektor dizajniran tako da se ciljano zameni egzon 7 svinje (domen SRCR5 iz CD163 svinje) sa DNK koja kodira humani SRCR8 iz CD163L. Ovaj vektor sa ciljanim delovanjem je upotrebljavan u transfekcijama uz selekciju lekovima sa G418. PCR prajmeri za analize velikog opsega, levog kraka i desnog kraka obeleženi su strelicama za 1230, 3752, 8791, 7765 i 7775. Panel C prikazuje vektor sa ciljanim delovanjem koji je identičan vektoru prikazanom na panelu B, ali gde je uklonjena Neo kaseta. Ovaj vektor sa ciljanim delovanjem je upotrebljavan za ciljano delovanje na CD 163 u ćelijama koje su već bile rezistene na neomicin. Prajmeri upotrebljeni u analizama malih delecija ilustrovani su strelicama i obeleženi kao GCD163F i GCD163R. Panel D naglašava egzone na koje je ciljano delovano sa CRISPR. Lokacija CRISPR 10, 131, 256 i 282 predstavlјena je strelicama okrenutim nadole na egzonu 7. Brojevi CRISPR predstavlјaju broj baznih parova sa spoja introna i egzona za intron 6 i egzon 7.
SL.2. Vektor i CRISPR upotrebljeni za ciljano modifikovanje CD1D. Panel A prikazuje egzone 3, 4, 5, 6 i 7 gena za CD1D divlјeg tipa na koga je ciljano delovano radi modifikacije sa CRISPR. Panel B prikazuje vektor dizajniran tako da se ciljano zameni egzon 3 sa selektivnim markerom Neo. Ovaj vektor sa ciljanim delovanjem je upotrebljavan u kombinaciji sa CRISPR da bi se modifikovao CD1D. PCR prajmeri za analize velikog opsega, levog kraka i desnog kraka obeleženi su strelicama za 3991, 4363, 7373 i 12806. Panel C prikazuje egzone na koje je ciljano delovano sa CRISPR. Lokacije CRISPR 4800, 5350, 5620 i 5626 predstavlјene su strelicama okrenutim nadole na egzonu 3. Prajmeri upotrebljeni u analizama malih delecija ilustrovani su strelicama i obeleženi kao GCD1DF i GCD1DR.
SL.3. Generisanje CD163 i CD1D nokaut svinja sa CRISPR/Cas9 i SCNT. A) Cilјana delecija CD163 u somatskim ćelijama nakon transfekcije sa CRISPR/Cas9 i donorskom DNK. Genotip divlјeg tipa (WT) rezultuje trakom od 6545 baznih parova (bp). Lejnovi 1-6 predstavlјaju šest različitih kolonija iz jedne transfekcije upotrebom CRISPR 10 sa Cas9 i donorskom DNK koja sadrži Neo. Lejnovi 1, 4 i 5 pokazuju veliku homozigotnu deleciju od 1500-2000 bp. Lejn 2 predstavlјa manju homozigotnu deleciju. Lejnovi 3 i 6 predstavlјaju bilo WT alel i malu deleciju ili bialelnu modifikaciju oba alela. Tačne modifikacije svake kolonije određivane su samo sekvenciranjem kolonija upotrebljenih za SCNT. Slaba WT traka u pojedinim lejnovima može predstavlјati unakrsnu kontaminaciju fetalnim fibroblastima iz susedne WT kolonije. NTC = kontrola bez matrice. B) Cilјana delecija CD1D u somatskim ćelijama nakon transfekcije sa CRISPR/Cas9 i donorskom DNK. WT genotip rezultuje trakom od 8729 bp. Lejnovi 1-4 predstavlјaju kolonije sa delecijom u CD1D od 500-2000 bp. Deluje da je lejn 4 WT kolonija. NTC = kontrola bez matrice. C) Slika CD163 nokaut svinje proizvedene sa SCNT tokom studije. Ovo muško prase sadrži homozigotnu deleciju CD163 od 1506 bp. D) Slika CD1D svinja proizvedenih tokom studije. Ova prasad sadrže deleciju u CD1D od 1653 bp. E) Genotip dva SCNT legla koja su sadržavala deleciju CD163 od 1506 bp. Lejnovi 1-3 (leglo 63) i lejnovi 1-4 (leglo 64) predstavlјaju genotip za svako od prasadi iz svakog legla. Krmača označava ženku primaoca SCNT embriona, a WT predstavlјa WT kontrolu. NTC = kontrola bez matrice. F) Genotip dva SCNT legla koji je sadržavao deleciju u CD1D od 1653 bp. Lejnovi 1-7 (leglo 158) i lejnovi 1-4 (leglo 159) predstavlјaju genotip za svako prase.
SL. 4. Efekat CRISPR/Cas9 sistema u embrionima svinja. A) Učestalost obrazovanja blastocista nakon injeciranja različitih koncentracija CRISPR/Cas9 sistema u zigote. Toksičnost CRISPR/Cas9 sistema bila je najniža sa 10 ng/µl. B) Kada se uvede u zigote, CRISPR/Cas9 sistem može uspešno poremetiti ekspresiju eGFP u blastocistama. Originalno uvećanje X4. C) Vrste mutacija u eGFP generisane upotrebom CRISPR/Cas9 sistema: WT genotip (SEQ ID NO:16), #1 (SEQ ID NO:17), #2 (SEQ ID NO:18) i #3 (SEQ ID NO:19).
SL.5. Efekat CRISPR/Cas9 sistema kod ciljnog delovanja na CD163 u embrionima svinja. A) Primeri mutacija generisanih u CD163 sa CRISPR/Cas9 sistemom: WT genotip (SEQ ID NO:20), #1-1 (SEQ ID NO:21), #1-4 (SEQ ID NO:22) i #2-2 (SEQ ID NO:23). Svi embrioni ispitivani sekvenciranjem DNK pokazali su mutaciju u CD163 (18/18). CRISPR 131 je naznačen podeblјanim slovima. B) Očitavanja sekvenciranja za homozigotnu deleciju prouzrokovanu sa CRISPR/Cas9 sistemom. Slika predstavlјa # 1-4 sa panela A koje nose deleciju 2 bp u CD163.
SL.6. Efekat CRISPR/Cas9 sistema prilikom uvođenja dve vrste CRISPR. A) PCR amplifikacija CD163 u blastocistama nastalim od zigota injeciranih sa CRISPR/ Cas9. Lejnovi 1, 3, 6 i 12 pokazuju dizajniranu deleciju između dva različita CRISPR. B) PCR amplifikacija CD1D u blastocistama nastalim od zigota injeciranih sa CRISPR/Cas9. CD1D je imao nižu učestalost delecije u poređenju sa CD163 (3/23), što je utvrđeno elektroforezom u gelu; lejnovi 1, 8 i 15 pokazuju očiglednu deleciju u CD1D. C) CRISPR/Cas9 sistem je uspešno cilјano delovao na dva gena kada su sistemu obezbeđena dva CRISPR koji ciljano deluju na CD163 i eGFP. Prikazane su modifikacije CD163 i eGFP: CD163 WT (SEQ ID NO:24), CD163 #1 (SEQ ID NO:25), CD163 #2 (SEQ ID NO:26), CD163 #3 (SEQ ID NO:27), eGFP WT (SEQ ID NO:28), eGFP #1-1 (SEQ ID NO:29), eGFP #1-2 (SEQ ID NO: 30), eGFP #2 (SEQ ID NO:31) i eGFP #3 (SEQ ID NO:32).
SL. 7. CD163 nokaut svinje generisane CRISPR/Cas9 sistemom injeciranim u zigote. A) PCR amplifikacija CD163 iz nokaut svinja; jasan znak delecije detektovan je u leglima 67-2 i 67-4. B) Slika CD163 nokaut svinja sa surogatom. Sve životinje su zdrave i ne pokazuju znakove abnormalnosti. C) Genotip CD163 nokaut svinja. Sekvenca divlјeg tipa (WT) je prikazana kao SEQ ID NO: 33. Dve životinje (iz legla 67-1 (SEQ ID NO:34) i 67-3 (SEQ ID NO:37)) nosile su homozigotnu deleciju ili inserciju u CD163. Druge dve životinje (iz legla 67-2 i 67-4) nose bialelnu modifikaciju CD163: #67-2 A1 (SEQ ID NO:35), #67-2 A2 (SEQ ID NO:36), # 67-4 A1 (SEQ ID NO:38) i #67-4 a2 (SEQ ID NO:39). Delecija je bila prouzrokovana uvođenjem dva različita CRISPR sistema sa Cas9. Nijedna životinja nakon injeciranja zigota sa CD163 nije pokazala mozaičan genotip.
SL. 8. CD1D nokaut svinje generisane CRISPR/Cas9 sistemom injeciranim u zigote. A) PCR amplifikacija CD1D iz nokaut svinja; 166-1 prikazuje mozaičan genotip za CD1D.166-2, 166-3 i 166-4 ne pokazuju promenu veličine za amplikon, ali je sekvenciranje amplikona ukazalo na modifikacije. WT FF = fetalnih fibroblasti divlјeg tipa. B) PCR amplifikacija u analizi velikog opsega koja je pokazala jasnu deleciju jednog alela kod prasadi 166-1 i 166-2. C) Slika CD1D nokaut svinja sa surogatom. D) Podaci o sekvenci za CD1D nokaut svinje; WT (SEQ ID NO:40), #166-1.1 (SEQ ID NO: 41), #166-1.2 (SEQ ID NO:42), #166-2 (SEQ ID NO:43), #166-3.1 ( SEQ ID NO:44), #166-3.2 (SEQ ID NO:45) i #166-4 (SEQ ID NO:46). Start kodon atg u egzonu 3 je pokazan podeblјanim slovima, kao i malim slovima.
SL. 9. Klinički znaci tokom akutne PRRSV infekcije. Rezultati za dnevnu procenu prisustva respiratornih znakova i groznice kod CD 163 /+ (n=6) i CD 163 -/(n=3).
SL.10. Histopatologija pluća tokom akutne PRRSV infekcije. Reprezentativne mikrofotografije tkiva obojenih sa H i E iz svinja divljeg tipa i nokaut svinja. Levi panel pokazuje edem i infiltraciju mononuklearnih ćelija. Desni panel prikazuje arhitekturu pluća za normalna pluća kod nokaut svinja.
SL.11. Viremija kod raznih genotipova. Potrebno je napomenuti da podaci za CD163-/- prase leže duž X ose.
SL.12. Proizvodnja antitela kod svinja sa null, alelima divljeg tipa i neokarakterisanim alelima.
SL.13. Ekspresija CD163 na površini ćelije kod pojedinačnih svinja. Linije koje se pojavlјuju udesno kod neokarakterisanih A, neokarakterisanih B i CD163 /+ panela predstavlјaju CD163 antitelo, dok su linije koje se pojavlјuju nalevo na ovim panelima kontrole bez antitela (signal pozadine). Potrebno je napomenuti da se kod CD163-/- životinja bojenje na CD163 preklapa sa kontrolom za signal pozadine, kao i da je bojenje CD163 kod neokarakterisanih alela ugrubo polovina od vrednosti nivoa kod WT i za signal pozadine (potrebno je takođe napomenuti da je ovo log skala i da je vrednost stoga manja od ~10%).
SL.14. Nivo CD 169 na alveolarnim makrofagima iz tri reprezentativne svinje i u kontroli bez antitela (anti-CD169 obeležen sa FITC).
SL. 15. Viremija kod raznih genotipova. Potrebno je napomenuti da podaci za prasad sa Δ43 aminokiselina leže duž X-ose.
SL.16. Genomska sekvenca egzona 7-10 iz CD163 divlјeg tipa koji su upotrebljavani kao referentna sekvenca (SEQ ID NO: 47). Sekvenca uklјučuje 3000 bp uzvodno od egzona 7 do poslednje baze egzona 10. Podvučeni regioni pokazuju lokacije egzona 7, 8, 9 i 10, tim redom.
SL. 17. Dijagram modifikacija CD163 gena koji ilustruje nekoliko modifikacija CD163 gena, predviđeni proteinski proizvod za svaku modifikaciju i relativnu ekspresiju u makrofagima za svaku modifikaciju, što je izmereno nivoima CD163 na površini alveolarnih makrofaga svinja (PAM). Crni regioni označavaju introne, a beli regioni označavaju egzone. Šrafirani region označava mimik egzona 11 iz hCD163L1, homologa svinjskog egzona 7. Sivi region ukazuje na sintetisan intron sa PGK Neo konstruktom.
SL.18. Dijagram proteina i genske sekvence svinjskog CD163. A) SRCR (ovalni oblici) i PST (kvadrati) domeni CD163 proteina zajedno sa odgovarajućim egzonima gena. B) Poređenje SRCR 5 iz CD163 svinja (SEQ ID NO: 120) sa SRCR 8 homologom iz humanog CD163L1 (SEQ ID NO: 121).
SL.19. Reprezentativni rezultati za površinsku ekspresiju CD 163 i CD 169 na PAM iz svinja divljeg tipa i svinja sa modifikovanim CD163. Paneli A-E prikazuju rezultate za modifikacije CD163 gena kao što je ilustrovano na Sl.17. Objedinjeni podaci za d7(1467) i d7(1280) su prikazani na panelu D.
SL.20. Nivoi haptoglobina u serumu kod svinja divljeg tipa i svinja sa modifikovanim CD163.
SL.21. Relativna permisivnost PAM divlјeg tipa i HL11m na infekciju sa izolatima PRRSV tipa 2.
SL.22. Infekcija svinja sa modifikovanim CD163, sa izolatima PRRSV tipa 1 i tipa 2.
SL.23. Opterećenje virusom za WT i svinje sa modifikovanim CD163 koje su bile inficirane virusima tipa 2.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0025] Predmetni pronalazak je kao što je definisano u patentnim zahtevima, a u obimu u kome je druga tematika ovde opisana, ona je uklјučena samo u svrhe upućivanja. Ovde su opisane i životinje i postupci za proizvodnju životinja sa editovanim genima koje imaju modifikacije CD163 gena i koje su rezistene na infekcije sa PRRSV i drugim srodnim respiratornim virusima. Životinje imaju hromozomske modifikacije (insercije ili delecije) koje inaktiviraju ili na drugi način modulišu aktivnost CD163 gena. CD163 je neophodan za ulazak PRRSV u ćeliju, kao i za replikaciju virusa. Prema tome, CD163-null životinje pokazuju rezistenciju na infekciju sa PRRSV kada je ona uvedena kao izazov. Ove životinje mogu biti stvorene upotrebom bilo kog od brojnih protokola koji se oslanjaju na gensko editovanje.
[0026] Ovde su takođe opisani postupci za pravlјenje životinje svinje koji obuhvataju uvođenje, u ćeliju životinje svinje ili embrion svinje, agensa koji se specifično vezuje za cilјno mesto na hromozomu u ćeliji i prouzrokuje dvolančani prekid u DNK ili na drugi način inaktivira ili smanjuje aktivnost CD163 gena ili njegovog proteina upotrebom postupaka genskog editovanja, kao što su sistem grupisanih kratkih palindromskih ponovaka sa jednakim rastojanjima (CRISPR)/Cas, efektorne nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN), nukleaze sa cinkanim prstima (ZFN), rekombinazni fuzioni proteini ili meganukleaze.
[0027] Ovde je takođe opisana upotreba jednog ili više od određenih CD163 lokusa u tandemu sa polipeptidom sposobnim da utiče na cepanje i/ili integraciju specifičnih sekvenci nukleinskih kiselina unutar CD 163 lokusa. Primeri upotrebe CD 163 lokusa u tandemu sa polipeptidom ili RNK sposobnima da utiču na cepanje i/ili integraciju lokusa CD 163 uklјučuju polipeptid izabran iz grupe koju čine proteini sa cinkanim prstima, meganukleaze, TAL domeni, TALEN, CRISPR/Cas rekombinaze vođene sa RNK, proteini sa leucinskim rajsfešlusima i drugi proteini koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Posebni primeri uklјučuju himerni („fuzioni”) protein koji sadrži polipeptid sa domenom vezivanja za specifično mesto u DNK i polipeptid sa domenom za cepanje (npr. nukleaze), kao što su to ZFN protein koji sadrži polipeptid sa cinkanim prstima i FokI nukleazni polipeptid. Ovde su opisani i polipeptidi koji sadrže domen vezivanja za DNK koji se specifično vezuje za CD163 gen. Takav polipeptid može takođe sadržavati nukleazni (za cepanje) domen ili poludomen (npr. „homing” endonukleaze, uklјučujući „homing” endonukleaze sa modifikovanim domenom vezivanja za DNK), i/ili ligazni domen, tako da polipeptid može indukovati cilјani dvolančani prekid i/ili olakšati rekombinaciju nukleinske kiseline od interesa na mestu prekida. Domen vezivanja za DNK koji cilјano deluje na CD163 lokus može biti funkcionalan domen koji cepa DNK. Prethodno navedeni polipeptidi mogu biti upotrebljeni za uvođenje egzogene nukleinske kiseline u genom organizma domaćina (npr. životinjske vrste) u okviru jednog ili više od CD163 lokusa. Domeni vezivanja za DNK mogu sadržavati protein sa cinkanim prstima, sa jednim ili više cinkanih prstiju (npr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više cinkanih prstiju), koji je konstruisan (ne javlja se u prirodi) tako da se vezuje za bilo koju sekvencu unutar CD 163 gena. Bilo koji od ovde opisanih proteina sa cinkanim prstima može se vezivati za ciljno mesto unutar kodirajuće sekvence cilјnog gena ili unutar susednih sekvenci (npr. promotora ili drugih elemenata za ekspresiju). Protein sa cinkanim prstima se može vezivati za cilјno mesto u CD163 genu.
Definicije
[0028] Jedinice, prefiksi i simboli mogu biti označeni u svojim oblicima prihvaćenim od strane SI. Ukoliko nije drugačije naznačeno, nukleinske kiseline se pišu s leva na desno u orijentaciji od 5' ka 3', a aminokiselinske sekvence se pišu s leva na desno u orijentaciji od amino ka karboksilnom kraju. Numerički opsezi navedeni unutar specifikacije, uklјučuju brojeve koji definišu opseg i svaki ceo broj unutar definisanog opsega. Aminokiseline ovde mogu biti označene bilo njihovim uobičajeno poznatim simbolima od tri slova ili simbolima od jednog slova koje preporučuje IUPAC-IUB Komisija za biohemijsku nomenklaturu. Slično navedenom, nukleotidi mogu biti označeni njihovim uobičajeno prihvaćenim kodovima od jednog slova. Ukoliko nije drugačije predviđeno, termini za softver, elektriku i elektroniku koji su ovde upotrebljeni sa značenjima su koja su definisana Novim IEEE standardnim rečnikom električnih i elektronskih pojmova (5. izdanje, 1993). Termini definisani u nastavku teksta su potpunije definisani pozivanjem na specifikaciju u celini.
[0029] Kao što će stručnjak iz oblasti tehnike i podrazumevati, za bilo koje i sve svrhe upotrebe, posebno u pogledu obezbeđivanja pisanog opisa, svi opsezi koji su ovde navedeni takođe obuhvataju bilo koje i sve moguće podopsege i kombinacije njihovih podopsega, kao i pojedinačne vrednosti koje čine opseg, posebno vrednosti koje su celi brojevi. Navedeni opseg uklјučuje svaku specifičnu vrednost, ceo broj, decimani broj ili identitet unutar opsega. Bilo koji navedeni opseg lako može biti prepoznat kao onaj koji dovoljno opisuje, kao i onaj koji omogućava da isti opseg bude podeljen na najmanje jednake polovine, trećine, četvrtine, petine ili desetine. Kao neograničavajući primer, svaki opseg koji se ovde razmatra može lako biti rapodeljen na donju trećinu, srednju trećinu i gornju trećinu itd.
[0030] Kada se uvode elementi predmetnog pronalaska ili njihov(i) poželjni primer(i) izvođenja, predviđeno je da jednina, množina i „navedeno” označe da postoji jedan ili više od elemenata. Predviđeno je i da termini „sadrži”, „uključuje” i „ima” butu inkluzivni i označavaju da mogu postojati dodatni elementi drugačiji od elemenata koji su navedeni u vidu liste.
[0031] Termin „i/ili” označava bilo koju od stavki, bilo koju kombinaciju stavki ili sve stavke sa kojima je ovaj termin povezan. Termin „jedan ili više” je lako razumlјiv stručnjaku iz oblasti tehnike, posebno kada se čita u kontekstu njihove upotrebe.
[0032] „Vezujući protein” je protein koji je u stanju da se veže za drugi molekul. Vezujući protein se može vezivati za, na primer, molekul DNK (protein koji vezuje DNK), molekul RNK (protein koji vezuje RNK) i/ili proteinski molekul (protein koji vezuje protein). U slučaju proteina koji vezuje protein, on se može vezivati za sebe samog (da bi obrazovao homodimere, homotrimere itd.) i/ili se može vezivati za jedan ili više molekula različitog proteina ili više različitih proteina. Vezujući protein može imati više od jedne vrste vezujućih aktivnosti. Na primer, proteini sa cinkanim prstima imaju aktivnost vezivanja za DNK, vezivanja za RNK i vezivanja za proteine.
[0033] Termin „konzervativno modifikovane varijante” primenjuje se i na aminokiselinske sekvence i na sekvence nukleinskih kiselina. U pogledu određenih sekvenci nukleinskih kiselina, „konzervativno modifikovane varijante” se odnosi na one nukleinske kiseline koje kodiraju identične ili konzervativno modifikovane varijante aminokiselinskih sekvenci. Usled degeneracije genetičkog koda, veliki broj funkcionalno identičnih nukleinskih kiselina kodira bilo koji dati protein. Na primer, svi od kodona GCA, GCC, GCG i GCU kodiraju aminokiselinu alanin. Prema tome, na svakoj poziciji gde je alanin specifično određen kodonom, kodon može biti izmenjen u bilo koji od odgovarajućih kodona koji su opisani, bez izmene kodiranog polipeptida. Takve varijacije nukleinskih kiselina su „tihe varijacije” i predstavlјaju jednu vrstu konzervativno modifikovanih varijacija. Svaka sekvenca nukleinske kiseline koja je ovde opisana i koja kodira polipeptid, imajući u vidu genetički kod, opisuje stoga i svaku moguću tihu varijaciju nukleinske kiseline.
[0034] Prosećno iskusan stručnjak će takođe prepoznati da svaki kodon u nukleinskoj kiselini (osim AUG, koji je obično jedini kodon za metionin; i UGG, koji je obično jedini kodon za triptofan) može biti modifikovan tako da se dobije funkcionalno identičan molekul. Shodno tome, svaka tiha varijacija nukleinske kiseline koja kodira polipeptid predmetnog pronalaska je implicitna u svakoj opisanoj polipeptidnoj sekvenci i u okviru je obima predmetnog pronalaska.
[0035] U kontekstu aminokiselinskih sekvenci, stručnjak će prepoznati da pojedinačne supstitucije, delecije ili adicije u okviru sekvence nukleinske kiseline, peptida, polipeptida ili proteina koje menjaju, dodaju ili delecijom uklanjaju jednu aminokiselinu ili mali procenat aminokiselina u kodiranoj sekvenci, predstavljaju „konzervativno modifikovanu varijantu” pri čemu je rezultat izmene supstitucija aminokiseline sa hemijski sličnom aminokiselinom. Tako, na primer, bilo koji broj aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe celih brojeva koja se sastoji od 1 do 15 može biti tako izmenjen. Prema tome, na primer, može biti uvedeno 1, 2, 3, 4, 5, 7 ili 10 izmena.
[0036] Konzervativno modifikovane varijante obično obezbeđuju biološku aktivnost sličnu aktivnosti nemodifikovane polipeptidne sekvence iz koje su izvedene. Na primer, specifičnost za supstrat, aktivnost enzima ili vezivanje liganda/receptora u principu iznosi najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% od aktivnosti nativnog proteina za njegov nativni supstrat. Tabele konzervativnih supstitucija koje obezbeđuju funkcionalno slične aminokiseline su dobro poznate u oblasti tehnike.
[0037] Svaka od sledećih šest grupa sadrži aminokiseline koje jedna za drugu predstavljaju konzervatine supstitucije: [1] alanin (A), serin (S), treonin (T); [2] asparaginska kiselina (D), glutaminska kiselina (E); [3] asparagin (N), glutamin (Q); [4] arginin (R), lizin (K); [5] izoleucin (I), leucin (L), metionin (M), valin (V); i [6] fenilalanin (F), tirozin (Y), triptofan (W). Pogledati takođe, Creighton (1984) Proteins W. H. Freeman and Company.
[0038] Termin „CRISPR” označava „grupisane kratke palindromske ponovke na jednakim rastojanjima”. Termin „Cas9” se odnosi na „protein povezan sa CRISPR tipa 9.” Termini „CRISPR/Cas9” ili „CRISPR/Cas9 sistem” odnose se na nukleazni sistem koji se može programirati za genetički inženjering i koji uklјučuje Cas9 protein, ili njegov derivat, i jednu ili više nekodirajućih RNK koje mogu obzebediti funkciju CRISPR RNK (crRNK) i transktivirajuće RNK (tracrRNK) za Cas9. CrRNK i tracrRNK mogu biti upotrebljene pojedinačno ili se mogu kombinovati tako da se proizvede „RNK vodič” (gRNK). CrRNK ili gRNK obezbeđuju sekvencu koja je komplementarna mestu u genomu na koga se ciljano deluje. CRISPR/Cas9 sistemi su ovde dodatno opisani u nastavku teksta.
[0039] Upućivanja na deleciju u nukleotidnoj sekvenci od nukleotida x do nukleotida y ovde označavaju da su svi nukleotidi iz opsega bili deletirani, uključujući x i y. Tako, na primer, fraza „delecija 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa SEQ ID NO: 47” označava da je svaki od nukleotida 3.317 sve do 3.147 uklonjen delecijom, uklјučujući nukleotide 3.117 i 3.147.
[0040] „Rezistencija na bolest” je karakteristika životinje, pri čemu životinja izbegava simptome bolesti koji su rezultat interakcija između životinje i patogena, kao što su interakcije između životinje svinje i PRRSV. Preciznije, sprečava se da patogeni prouzrokuju bolesti i povezane simptome bolesti kod životinje, ili alternativno, smanjuju se incidencija i/ili ozbilјnost kliničkih znakova ili se smanjuju klinički simptomi. Za stručnjaka iz oblasti tehnike je bitna napomena da kompozicije i postupci koji su ovde opisani mogu biti upotrebljeni sa drugim kompozicijama i postupcima koji su dostupni u oblasti tehnike za zaštitu životinja od napada patogena.
[0041] Termin „kodira” ili „kodiran”, kada se isti odnosi na određenu nukleinsku kiselinu, označava se da sadrži informaciju za translaciju u specifično naveden protein. Nukleinska kiselina koja kodira protein može sadržavati intervenišuće sekvence (npr. introne) unutar regiona nukleinske kiseline koji će biti podvrgnuti translaciji ili joj mogu nedostajati takve intervenišuće netranslatirajuće sekvence (npr. kao u cDNK). Informacija kojom je protein kodiran specifično je određena upotrebom kodona. Uobičajeno je da je aminokiselinska sekvenca kodirana nukleinskom kiselinom upotrebom „univerzalnog” genetičkog koda. Kada je nukleinska kiselina pripremlјena ili izmenjena sintetički, može se iskoristiti prednost poznatih preferencija kodona predviđenog domaćina gde je nukleinsku kiselinu potrebno eksprimirati.
[0042] Kao što se ovde upotrebljava, „gensko editovanje”, „editovanje gena”, „editovan gen”, „genetički editovano” i „efektori za gensko editovanje” odnose se na upotrebu tehnologije „hominga” (usmeravanja) sa nukleazama koje se javljaju u prirodi ili su veštački proizvedene genetičkim inženjeringom, koje se takođe označavaju i kao „molekulske makaze, „homing endonukleaze” ili „endonukleaze sa ciljanim delovanjem”. Nukleaze stvaraju specifične dvolančane hromozomske prekide (DSB) na želјenim lokacijama u genomu, što u pojedinim slučajevima koristi endogene mehanizme ćelije za popraku indukovanog prekida prirodnim procesima homologne rekombinacije (HR) i/ili nehomolognog spajanja krajeva (NHEJ, od enlg. nonhomologous end-joining). Efektori genskog editovanja uključuju nukleaze sa cinkanim prstima (ZFN), efektorne nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN), sisteme grupisanih kratkih palindromskih ponovaka na jednakim rastojanjima/CAS9 (CRISPR/Cas9) i meganukleaze (npr. meganukleaze rekonstruisane kao „homing” endonukleaze). Termini takođe uklјučuju upotrebu transgenih procedura i tehnika, uklјučujući, na primer, kada je promena delecija ili relativno mala insercija (obično manja od 20 nukleotida) i/ili se ne uvodi DNK iz stranih vrsta. Termin takođe obuhvata potomstvo životinja kao što je ono stvoreno seksualnim ukrštanjem ili aseksualnim razmnožavanjem od prvobitne životinje sa editovanim genom.
[0043] Kao što se ovde upotrebljava, „heterologno”, kada se odnosi na nukleinsku kiselinu, predstavlja nukleinsku kiselinu koja potiče iz strane vrste ili, ukoliko je iz iste vrste, značajno je modifikovana u odnosu na svoj nativni oblik po sastavu i/ili genomskom lokusu i to namernom lјudskom intervencijom. Na primer, promotor koji je operativno povezan sa heterolognim strukturnim genom je iz vrste koja se razlikuje od one iz koje je izveden strukturni gen, ili, ukoliko je iz iste vrste, jedan ili oba su značajno modifikovani u odnosu na njihov originalni oblik. Heterologni protein može poticati iz strane vrste ili, ukoliko je iz iste vrste, značajno je modifikovan u odnosu na svoj prvobitni oblik namernom lјudskom intervencijom.
[0044] Kao što se ovde upotrebljava, „tehnologija „homing” DNK”, „homing tehnologija” i „homing endonukleaza” pokrivaju bilo koji od mehanizama koji omogućava da se određeni molekul ciljano usmeri na određenu DNK sekvencu uklјučujući proteine sa cinkanim prstima (ZF), efektore slične aktivatoru transkripcije (TALE) meganukleaze i sistem CRISPR/Cas9.
[0045] Termini „povećana rezistencija” i „smanjena podložnost” ovde označavaju, ali nisu ograničeni na, statistički značajno smanjenje incidencije i/ili težine kliničkih znakova ili kliničkih simptoma koji su povezani sa infekcijom patogenom. Na primer, „povećana rezistencija” ili „smanjena podložnost” mogu se odnositi na statistički značajno smanjenje incidencije i/ili težine kliničkih znakova ili kliničkih simptoma koji su povezani sa PRRSV infekcijom kod životinje koja sadrži najmanje jednu modifikovanu hromozomsku sekvencu u gen koji kodira protein CD163, u poređenju sa kontrolnom životinjom koja ima nemodifikovanu hromozomsku sekvencu. Termin „statistički značajno smanjenje kliničkih simptoma” označava, ali nije ograničen na, učestalost incidencije najmanje jednog kliničkog simptoma u editovanoj grupi subjekata koja je za najmanje 10%, poželјno najmanje 20%, poželјnije najmanje 30%, još poželјnije najmanje 50%, a još više poželјno za najmanje 70% niža u odnosu na kontrolnu grupu koja nije editovana, a nakon situacije izazova sa infektivnim agensom.
[0046] Kao što se ovde upotrebljava, izraz „nokin” (engl. knock-in) označava zamenu endogenog gena sa transgenom ili sa istim endogenim genom uz neke strukturne modifikacije, ali uz zadržavanje transkripcione kontrole endogenog gena.
[0047] „Nokaut” (engl. knock-out) označava remećenje strukture ili regulatornog mehanizma gena. Nokauti mogu biti generisani putem homologne rekombinacije sa ciljanim vektorima, vektorima za zamenu ili vektorima po principu „udari-i-beži” (engl. hit-and-ran) ili nasumičnom insercijom vektora za „zarobljavanje” gena što rezultuje potpunim, delimičnim ili uslovnim gubitkom funkcije gena.
[0048] Termin „životinja” uklјučuje bilo koju životinju različitu od čoveka, na primer, domaću životinju (npr. grlo stoke). Termin „grlo stoke” uklјučuje bilo koju od životinja koje se tradicionalno uzgajaju u stočarstvu, na primer životinju svinje, goveda (npr. goveda muznih krava), ovce, koze, kopitare (npr. konje ili magarce), bivole, kamile ili živinu (npr. kokoške, ćurke, patke, guske, biserke ili domaće golubove). Termin „grlo stoke” ne uklјučuje pacove, miševe ili druge glodare.
[0049] Kao što se ovde upotrebljava, termin „mutacija” uklјučuje izmene u nukleotidnoj sekvenci polinukleotida, kao što su to na primer gen ili kodirajuća DNK sekvenca (CDS), u poređenju sa sekvencom divlјeg tipa. Termin uklјučuje, bez ograničenja, supstitucije, insercije, pomeraje okvira čitanja, delecije, inverzije, translokacije, duplikacije, mutacije donorskog mesta obrade, tačkaste mutacije i slično.
[0050] Kao što se ovde upotrebljava, „operativno povezan” uklјučuje upućivanje na funkcionalnu vezu između dve sekvence nukleinskih kiselina, npr. promotorske sekvence i druge sekvence, pri čemu promotorska sekvenca započinje i posreduje u transkripciji DNK sekvence koja odgovara drugoj sekvenci. U principu, operativno povezano označava da su sekvence nukleinskih kiselina koje su povezane u nizu i, kada je to potrebno, spajaju dva kodirajuća regiona za proteine, u kontinuitetu i sa istim okvirom čitanja.
[0051] Kao što se ovde upotrebljava, „polinukleotid” uklјučuje termine koji se odnose na dezoksiribopolinukleotid, ribopolinukleotid ili konzervativno modifikovane varijante; termin se takođe može odnositi na njihove analoge koji imaju esencijalnu prirodu kao prirodan ribonukleotid po tome što oni hibridizuju, pod strogim uslovima hibridizacije, sa suštinski istom nukleotidnom sekvencom kao nukleotidi koji se javljaju u prirodi i/ili dozvolјavaju translaciju u istu(e) aminokiselinu(e) kao nukleotid(i) koji se javlja(ju) u prirodi. Polinukleotid može biti pune dužine ili podsekvenca nativnog ili heterolognog strukturnog ili regulatornog gena. Ukoliko nije drugačije naznačeno, termin uklјučuje upućivanje na specifično navedenu sekvencu, kao i njenu komplementarnu sekvencu. Prema tome, DNK ili RNK sa okosnicama koje su modifikovane u cilju veće stabilnosti ili iz drugih razloga, predstavljaju „polinukleotide” kako je ovde za taj termin i predviđeno. Štaviše, DNK ili RNK koje sadrže neobične baze, kao što je inozin, ili modifikovane baze, kao što su tricilovane baze, da navedemo samo dva primera, polinukleotidi su u kontekstu upotrebe termina u ovom tekstu. Potrebno je ipak napomenuti da je napravlјen veliki broj modifikacija u DNK i RNK koje mogu poslužiti u mnoge korisne svrhe poznate stručnjacima iz oblasti tehnike.
[0052] Termin polinukleotid, kako se ovde upotrebljava, obuhvata takve hemijski, enzimski ili metabolički modifikovane oblike polinukleotida, kao i hemijske oblike DNK i RNK koji su karakteristični za viruse i ćelije, uklјučujući, između ostalog, jednostavne i složene ćelije.
[0053] Termini „polipeptid”, „peptid” i „protein” ovde se upotrebljavaju naizmenično za označavanje polimera aminokiselinskih ostataka. Termini se takođe mogu primeniti na konzervativno modifikovane varijante i na polimere aminokiselina u kojima su jedan ili više aminokiselinskih ostataka veštački hemijski analog odgovarajuće aminokiseline koja se javlja u prirodi, kao i na polimere aminokiselina koji se javljaju u prirodi. Suštinska priroda tavih aminokiselinskih analoga koje se javaljaju u prirodi je da, kada se ugrade u protein, protein je specifično reaktivan sa antitelima koja su proizvedena na isti protein, ali koji se u potpunosti sastoje od aminokiselina koje se javlјaju u prirodi.
[0054] Termini „polipeptid”, „peptid” i „protein” takođe uklјučuju modifikacije uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, glikozilaciju, vezivanje lipida, sulfaciju, gama-karboksilaciju ostataka glutaminske kiseline, hidroksilaciju i ADP-ribozilaciju. Potrebno je ipak napomenuti da, kao što je dobro poznato i prethodno navedeno, polipeptidi nisu uvek u potpunosti linearni. Na primer, polipeptidi mogu biti razgranati kao rezultat ubikvitinacije, i mogu biti kružni, sa ili bez grananja, u principu kao rezultat događaja nakon translacije, uklјučujući događaje prirodne obrade i događaje prouzrokovane lјudskom manipulacijom koji se ne dešavaju prirodno. Kružni, razgranati i razgranati kružni polipeptidi mogu biti sintetisani netranslatirjućim prirodnim procesom, kao i potpuno sintetičkim postupcima. Dalјe, ovaj pronalazak razmatra upotrebu kako varijanti proteina pronalaska koje sadrže metionin, tako i varijanti koje su bez metionina na amino kraju.
[0055] Ovde, „smanjenje incidencije i/ili težine kliničkih znakova” ili „smanjenje kliničkih simptoma” označavaju, ali bez ograničenja na, smanjenje broja inficiranih subjekata u grupi, smanjenje ili eliminisanje broja subjekata koji ispoljavaju kliničke znake infekcije, ili smanjenje težine bilo kojih od kliničkih znakova koji su prisutni kod jednog ili više subjekata, u poređenju sa infekcijom divlјeg tipa. Na primer, ovi termini obuhvataju sve kliničke znake infekcije, patologiju pluća, viremiju, proizvodnju antitela, smanjenje opterećenja patogenom, izlučivanje patogena, smanjenje prenosa patogena ili smanjenje bilo kog kliničkog znaka koji je simptomatičan za PRRSV. Poželјno je da su ovi klinički znaci smanjeni kod jedne ili više životinja pronalaska za najmanje 10% u poređenju sa subjektima koji nemaju modifikaciju u CD163 genu i koji postaju inficirani. Poželјnije je da su klinički znaci smanjeni kod subjekata pronalaska za najmanje 20%, poželјno za najmanje 30%, poželјnije za najmanje 40%, a još poželјnije za najmanje 50%.
[0056] Termini „ostatak” ili „aminokiselinski ostatak” ili „aminokiselina” ovde se upotrebljavaju naizmenično za označavanje aminokiseline koja je ugrađena u protein, polipeptid ili peptid (zajedniči „protein”). Aminokiselina može biti aminokiselina koja se javlja u prirodi i, ukoliko nije drugačije ograničena, može obuhvatati analoge prirodnih aminokiselina koji nisu prirodi i mogu funkcionisati na sličan način kao aminokiseline koje se javlјaju u prirodi.
[0057] Termin „selektivno hibridizuje” uklјučuje pozivanje na hibridizaciju, pod strogim uslovima hibridizacije, sekvence nukleinske kiseline sa drugom sekvencom nukleinske kiseline ili sa drugim biološkim molekulima. Kada se koristi sistem detekcije zasnovan na hibridizaciji, probe tipa nukleinskih kiselina se biraju tako da budu komplementarne referentnoj sekvenci nukleinske kiseline, a zatim se biraju i odgovarajući uslovi za selektivnu hibridizaciju probe i referentne sekvence, ili njihovo vezivanje jedne za drugu, tako da se obrazuje molekul tipa dupleksa.
[0058] Termin „strogi uslovi” ili „uslovi strogosti hibridizacije” uklјučuje upućivanje na uslove pod kojima će proba hibridizovati sa svojom cilјnom sekvencom u većem stepenu koji je moguće detektovati u odnosu na hibridizaciju sa drugim sekvencama (npr. najmanje 2 puta većim u odnosu na signal pozadine). Uslovi strogosti zavise od vrste sekvenci i biće različiti u različitim okolnostima. Kontrolisanjem strogosti uslova hibridizacije i/ili uslova ispiranja, mogu biti identifikovane ciljne sekvence koje su 100% komplementarne probi (homologne analize).
[0059] Alternativno, uslovi strogosti mogu biti podešeni tako da se omogući određeno pogrešno sparivanje u sekvenci, odnosno tako da se detektuju niži stepeni sličnosti (heterologne analize). U principu, proba je dužine manje od oko 1000 nukleotida, opciono dužine manje od 500 nukleotida.
[0060] Uslovi strogosti će obično biti oni u kojima je koncentracija soli manja od oko 1,5 M jona Na, a obično je koncrentracija Na jona (ili drugih soli) od oko 0,01 do 1,0 M na pH 7,0 do 8,3, dok je temperatura najmanje oko 30°C za kratke probe (npr. od 10 do 50 nukleotida) i najmanje oko 60° C za duže probe (npr. veće od 50 nukleotida). Uslovi strogosti se takođe mogu postići dodavanjem agenasa za destabilizaciju poput formamida. Specifičnost je obično u funkciji pranja nakon hibridizacije, a kritični faktori su jonska snaga i temperatura finalnog rastvora za pranje. Za DNK/DNK hibride, termička tačka toplјenja (Tm) može biti aproksimirana na osnovu jednačine iz Meinkoth i Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284 (1984): Tm [°C] = 81,5 16,6 (log M) 0,41(% GC)-0,61 (% form)- 500/L; gde je M molarnost monovalentnih katjona, % GC je procenat guanozinskih i citozinskih nukleotida u DNK, % form je procenat formamida u hibridizacionom rastvoru, a L je dužina hibrida u baznim parovima. Tmje temperatura (pod definisanom jonskom jačinom i pH) na kojoj se 50% komplementarne cilјne sekvence hibridizuje sa savršeno uparenom probom. Tm se smanjuje za oko 1°C sa svakim pogrešnim uparivanjem od 1%; prema tome, Tm, uslovi hibridizacije i/ili pranja mogu biti podešeni tako da se hibridizacija vrši sa sekvencama želјene identičnosti. Na primer, ukoliko su potrebne sekvence koje su identične za > 90%, Tmmože biti smanjena za 10°C. U principu, uslovi strogosti se biraju tako da budu oko 5°C niži od Tmza specifičnu sekvencu i njen komplement pri definisanoj jonskoj jačini i određenom pH. Međutim, veoma strogi uslovi mogu podrazumevati hibridizaciju i/ili pranje na 1 do 4°C niže od Tm; pri umereno strogim uslovima se mogu koristiti hibridizacija i/ili pranje na 6 do 10°C nižoj temperaturi od Tm; uslovi niske strogosti mogu koristiti hibridizaciju i/ili pranje na 11 do 20°C nižoj temperaturi od Tm. Za stručnjake se stoga podrazumeva da su varijacije u strogosti hibridizacije i/ili rastvorima za pranje putem upotrebe jednačine, kompozicija za hibridizaciju i pranje, kao i želјenog Tm, inherentno opisane. Opsežan vodič za hibridizaciju nukleinskih kiselina može se naći u Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes, deo I, poglavlje 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); i Current Protocols in Molecular Biology, poglavlje 2, Ausubel i saradnici, ur., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).
[0061] „TALE domen za vezivanje DNK” ili „TALE” je polipeptid koji sadrži jedan ili više TALE ponavlјajućih domena/jedinica. Ponavljajući domeni su uključeni u vezivanje TALE za njegovu srodnu cilјnu DNK sekvencu. Jedna „jedinica ponovka” (takođe označena kao „ponovak”) obično je dužine od 33-35 aminokiselina i ispolјava najmanje neku homologiju sekvence sa drugim TALE ponavlјajućim sekvencama unutar TALE proteina koji se javlja u prirodi. Cinkani prsti i TALE domeni vezivanja mogu biti i „konstruisani” tako da se vezuju za unapred određenu nukleotidnu sekvencu, na primer, putem genetičkog inženjeringa (izmenom jedne ili više aminokiselina) heliksnog regiona prepoznavanja u proteinimaa sa cinkanim prstima ili TALE proteinima koji se javljaju u prirodi. Prema tome, konstruisani proteini koji vezuju DNK (sa cinkanim prstima ili TALE) su proteini koji se ne javlјaju u prirodi. Neograničavajući primeri postupaka za konstruisanje proteina koji se vezuju za DNK su dizajniranje i selekcija. Dizajnirani protein koji vezuje DNK je protein koji se ne javlja u prirodi a čiji dizajn/sastav proističe uglavnom iz racionalnih kriterijuma. Racionalni kriterijumi za dizajniranje uklјučuju primenu pravila supstitucije i kompjuterizovanih algoritama za obradu informacija u bazi podataka koja čuva informacije o postojećim ZFP i/ili TALE dizajnima i podatke o vezivanjima. Pogledati, na primer, U.S. Pat. No. 6,140,081; 6,453,242; i 6,534,261; pogledati takođe WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 i WO 03/016496 i SAD objavu br.20110301073.
[0062] Kao što se ovde upotrebljava, „vektor” uklјučuje nukleinsku kiselinu koja se upotrebljava u transfekciji ćelije domaćina i u koju se može insertovati polinukleotid. Vektori su često replikoni. Ekspresioni vektori dozvolјavaju transkripciju nukleinske kiseline koja je u njih insertovana.
[0063] „Divlјeg tipa” označava one životinje i blastociste, embrione ili ćelije koji su iz njih izvedene, koje nisu bile genetički editovane ili na drugi način genetički modifikovane, a obično su to sojevi dobijeni ukrštanjem u i van srodstva (inbred i outbred sojevi) razvijeni od sojeva koji se javlјaju u prirodi.
[0064] „Protein koji vezuje DNK sa cinkanim prstima” (ili domen vezivanja) je protein, ili domen unutar većeg proteina, koji vezuje DNK na način specifičan za sekvencu, preko jednog ili više cinkanih prstiju, što su regioni aminokiselinske sekvence unutar domena za vezivanje čija je struktura stabilizovana koordinativnom vezom jona cinka. Termin protein koji vezuje DNK sa cinkanim prstima često se skraćuje kao protein sa cinkanim prstima ili ZFP.
[0065] „Selektovani” protein sa cinkanim prstima ili TALE je protein koji se ne nalazi u prirodi i čija proizvodnja je prvenstveno rezultat empirijskog procesa kao što je prikazivnje u fagima, analiza interakcije postupkom sa pristupom „zamke” ili hibridna selekcija. Pogledati, npr. U.S. Pat. No.
5,789,538; U.S. Pat. No. 5,925,523; U.S. Pat. No. 6,007,988; U.S. Pat. No. 6,013,453; U.S. Pat. No.
6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197, WO 02/099084 i SAD objavu br.20110301073.
[0066] Termini koji slede upotrebljavaju se za opis odnosa sekveci između polinukleotida/polipeptida predmetnog pronalaska sa referentnim polinukleotidom/polipeptidom: (a) „referentna sekvenca”, (b) „prozor za poređenje”, (c) „identičnost sekvenci”, i (d) „procenat identičnosti sekvenci”.
(a) Kao što se ovde upotrebljava, „referentna sekvenca” je definisana sekvenca koja se upotrebljava kao osnova za poređenje sekvence sa polinukleotidom/polipeptidom predmetnog pronalaska. Referentna sekvenca može biti podskup ili određena sekvenca u celosti; na primer, može biti segment cDNK ili genske sekvence pune dužine, ili kompletna cDNK ili genska sekvenca.
(b) Kao što se ovde upotrebljava, „prozor za poređenje” uklјučuje upućivanje na susedni i specifično naveden segment polinukleotidne/polipeptidne sekvence, gde se polinukleotidna/polipeptidna sekvenca može porediti sa referentnom sekvencom i gde deo polinukleotidne/polipeptidne sekvence u prozoru za poređenje može sadržavati adicije ili delecije (tj. gapove/praznine) u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne sadrži adicije ili delecije) radi optimalnog poravnavanja dve sekvence. U principu, prozor za poređenje je dužine najmanje 20 susednih nukleotida/aminokiselina, a opciono može biti od 30, 40, 50, 100 jedinica ili duži. Stručnjaci iz oblasti tehnike podrazumevaće da se, da bi se izbegla velika sličnost sa referentnom sekvencom usled uklјučivanja gapova u polinukleotid/polipeptidnu sekvencu, obično uvodi parametar ograničenja pražnina koji se oduzima od broja podudaranja.
[0067] Postupci poravnavanja sekvenci za poređenje su dobro poznati u oblasti tehnike. Optimalno poravnavanje sekvenci radi poređenja može biti vršeno algoritmom lokalne homologije iz Smith and Waterman, Adv. Appl. Math.2: 482(1981); algoritmom za poravnavanje homologije iz Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol.48: 443 (1970); postupcima pretraživanja sličnosti iz Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444 (1988); i implementiranim verzijama ovih algoritama u kompjuterskim programima, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na: CLUSTAL u PC/Gene programu kompanije Intelligenetics, Mountain View, Kalifornija; GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA i TFASTA, kao i srodne programe u softverskom paketu GCG kompanije Wisconsin Genetics, verzija 10 (dostupnom kod Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Kalifornija, SAD). CLUSTAL program je dobro opisan u Higgins i Sharp, Gene 73: 237-244 (1988); Higgins i Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); Corpet i saradnici, Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huang i saradnici, Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992) i Pearson i saradnici, Methods in Molecular Biology 24: 307-331 (1994).
[0068] BLAST familija programa koji mogu biti upotrebljeni za pretraživanje sličnosti u bazama podataka uklјučuje: BLASTN za poređenje ispitivane nukleotidne sekvence sa bazama podataka za nukleotidne sekvence; BLASTX za poređenje ispitivane nukleotidne sekvence sa bazama podataka za proteinske sekvence; BLASTP za ispitivane nukleotidne sekvence u bazama podataka za proteinske sekvence; TBLASTN za poređenje ispitivane proteinske sekvence sa bazama podataka za nukleotidne sekvence; i TBLASTX za poređenje ispitivane nukleotidne sekvence u bazama podataka za nukleotidne sekvence. Pogledati, Current Protocols in Molecular Biology, poglavlje 19, Ausubel i saradnici, ur., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995); Altschul i saradnici, J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); i Altschul i saradnici, Nucleic Acids Res.25: 3389-3402 (1997). Softver za izvođenje BLAST analiza je javno dostupan, na primer preko Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (ncbi.nlm.nih.gov/). Ovaj algoritam je detalјno opisan u brojnim publikacijama. Pogledati, npr. Altschul SF i saradnici, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, 25 NUCLEIC ACIDS RES. 3389 (1997); National Center for Biotechnology Information, THE NCBI HANDBOOK [INTERNET], poglavlje 16: The BLAST Sequence Analysis Tool (McEntyre J, Ostell J, ur., 2002), dostupan na http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21097/pdf/ch16.pdf. BLASTP program za aminokiselinske sekvence takođe je detaljno opisan (pogledati Henikoff i Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
[0069] Pored izračunavanja procenta identičnosti sekvenci, BLAST algoritam takođe vrši statističku analizu sličnosti između dve sekvence (pogledati, npr. Karlin i Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA90: 5873-5877 (1993)). Mogu se koristiti i brojni programi za filtriranje niske složenosti da bi se smanjila takva poravnavanja niske složenosti. Na primer, SEG (Wooten i Federhen, Comput. Chem., 17: 149-163 (1993)) i XNU (Claverie i States, Comput. Chem., 17: 191-201 (1993)) filteri za nisku složenost mogu biti upotrebljeni samostalno ili u kombinaciji.
[0070] Ukoliko nije drugačije navedeno, vrednosti identičnosti/sličnosti nukleotida i proteina koje su ovde obezbeđene, izračunavane su upotrebom GAP (GCG, verzija 10) sa zadatim vrednostima. GAP (Global Alignment Program) takođe može biti upotrebljen za upoređivanje polinukleotida ili polipeptida predmetnog pronalaska sa referentnom sekvencom. GAP upotrebljava algoritam iz Needleman i Wunsch (J. Mol. Biol.48: 443-453, 1970) da bi se pronašlo poravnavanje dve kompletne sekvence kod koga je broj podudaranja dovedeno do maksimuma, dok se broj praznina svodi na minimum. GAP predstavlјa jednog člana porodice najbolјih poravnavanja. Može postojati mnogo članova ove familije, ali nijedan drugi član nije sa boljim kvalitetom. GAP prikazuje četiri cifre kao meru dobrog kvaliteta poravnavanja: kvalitet, odnos, identičnost i sličnost. Kvalitet je mera koja je maksimalno povećana da bi se sekvence poravnale. Odnos je kvalitet podelјen brojem baza u kraćem segmentu. Procenat identičnosti je procenat simbola koji se zaista podudaraju. Procenat sličnosti je procenat simbola koji su slični. Simboli koji se nalaze preko puta praznina se ignorišu. Sličnost se boduje kada je vrednost matrice bodovanja za par simbola veća ili jednaka 0,50, što je prag sličnosti. Matrica bodovanja koja se upotrebljava u verziji 10 softverskog paketa komanije Wisconsin Genetics je BLOSUM62 (pogledati Henikoff i Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915).
[0071] Višestruko poravnavanje sekvenci može biti urađeno upotrebom CLUSTAL postupka poravnavanja (Higins i Sharp (1989) CABIOS. 5: 151-153) sa zadatim parametrima (OGRANIČENJE PRAZNINE=10, OGRANIČENJE DUŽINE PRAZNINE=10). Zadati parametri za poravnavanja u parovima upotrebom CLUSTAL postupka uklјučuju KTUPLE 1, OGRANIČENJE PRAZNINE=3, PROZOR=5 i SAČUVANE DIJAGONALE=5.
[0072] (c) Kao što se ovde upotrebljava, „identičnost sekvenci” ili „identičnost” u kontekstu dve sekvence nukleinskih kiselina ili polipeptida uklјučuje upućivanje na ostatke u dve sekvence koje su iste kada su poravnate sa maksimalnim preklapanjem u određenom prozoru za poređenje. Kada se upotrebljava procenat identičnosti sekvenci u odnosu na proteine, podrazumeva se da se pozicije ostataka koji nisu identični često razlikuju po konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama, gde su aminokiselinski ostaci supstituisani drugim aminokiselinskim ostacima sa sličnim hemijskim osobinama (npr. sa sličnim naelektrisanjem ili hidrofobnošću) i stoga tako da se ne menjaju funkcionalne osobine molekula. Tamo gde se sekvence razlikuju po konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti sekvenci može biti podešen naviše, da bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Za sekvence koje se razlikuju po takvim konzervativnim supstitucijama kaže se da imaju „sličnost sekvenci” ili „sličnost”. Sredstva za uvođenje ovog podešavanja dobro su poznata stručnjacima iz oblasti tehnike. Ovo obično uklјučuje skorovanje konzervativne supstitucije kao delimičnog, a ne potpuno pogrešnog uparivanja, čime se povećava procenat identičnosti sekvenci. Tako, na primer, kada je identičnoj aminokiselino dodeljen skor 1, a nekonzervativnoj supstituciji je dat skor nula, konzervativnoj supstituciji se daje skor između nula i 1. Skorovanje konzervativnih supstitucija može biti izračunato prema algoritmu iz Meyers i Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 1117 (1988), na primer kao što je implementirano u program PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornija, SAD).
[0073] (d) Kao što se ovde upotrebljava, „procenat identičnosti sekvenci” označava vrednost utvrđenu poređenjem dve optimalno poravnate sekvence u prozoru za poređenje, pri čemu deo polinukleotidne sekvence u prozoru za poređenje može sadržavati adicije ili delecije (tj. praznine) u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne sadrži adicije ili delecije) radi optimalnog poravnavanja dve sekvence. Procenat se izračunava određivanjem broja pozicija na kojima se javljaju identična baza nukleinske kiseline ili aminokiselinski ostatak u obe sekvence, da bi se dobio broj podudarnih pozicija, delјenjem broja podudarnih pozicija sa ukupnim brojem pozicija u prozoru za poređenje i množenjem rezultata sa 100, da bi se dobio procenat identičnosti sekvenci.
Životinje i ćelije koje imaju modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163
[0074] CD163 ima 17 egzona i protein je koji se sastoji od vanćelijskog regiona sa 9 domena receptora “hvatača” bogatih cisteinom (SRCR), transmembranskog segmenta i kratkog citoplazmatskog repa. Nekoliko različitih varijanti je rezultat diferencijalne obrade jednog gena (Ritter i saradnici, 1999a; Ritter i saradnici, 1999b). Dužina citoplazmatskog dela je u osnovi velikog dela ovih varijacija.
[0075] CD 163 ima brojne važne funkcije, uključujući delovanje u vidu receptora „hvatača” za haptoglobin i hemoglobin. Eliminacija slobodnog hemoglobina u krvi je važna funkcija CD163 pošto hem grupa može biti veoma toksična (Kristiansen i saradnici, 2001). CD163 ima citoplazmatski rep koji olakšava endocitozu. Mutacija ovog repa dovodi do smanjenog preuzimanja kompleksa haptoglobina i hemoglobina (Nielsen i saradnici, 2006). Ostale funkcije C163 uklјučuju adheziju eritroblasta (SRCR2), to što je TWEAK receptor (SRCR1-4 i 6-9), bakterijski receptor (SRCR5), receptor afričkog svinjskog virusa (Sanchez-Tones i saradnici, 2003) i sa potencijalnom ulogom u vidu imunomodulatora (diskutovano u Van Gorp i saradnici, 2010a). Imajući u vidu ove važne funkcije, prethodno je smatrano da bi potpuni nokaut CD163 dao životinje koje ne bi bile vijabilne ili bi bile ozbilјno ugrožene (pogledati, npr. PCT objavu br.2012/158828).
[0076] CD 163 je član superfamilije receptora “hvatača” bogatih cisteinom (SRCR) i sastoji se od unutarćelijskog domena i 9 vanćelijskih SRCR domena. Kod lјudi, endocitoza CD163 koji posreduje u preuzimanju hemoglobina i hema preko SRCR3 štiti ćelije od oksidativnog stresa (Schaer i saradnici, 2006a; Schaer i saradnici, 2006b; Schaer i saradnici, 2006c). CD163 takođe služi kao receptor za slabog induktora apoptoze sličnog faktoru nekroze tumora (TWEAK: SRCR1-4 i 6-9), kao receptor za patogene (za virus afričke svinjske groznice; bakterije: SRCR2) i u vezivanju eritroblasta (SRCR2).
[0077] CD163 ima ulogu u infekciji sa mnogih različitih patogena i pronalazak stoga nije ograničen na životinje koje imaju smanjenu podložnost na infekciju sa PRRSV, već uklјučuje i životinje koje imaju smanjenu podložnost na bilo kog patogena koji se oslanja na CD163, bilo za infekciju i ulazak u ćeliju ili za kasniju replikaciju i/ili održavanje uporne infekcije u ćeliji. Proces PRRSV infekcije započinje početnim vezivanjem za heparan sulfat na površini alveolarnog makrofaga. Pre 2013, godine, smatralo se da se dalje odvija siguronosno vezivanje za sijaloadhesin (SIGLEC1, takođe označen kao CD169 ili SN). Virus se zatim internalizuje putem endocitoze posredovane klaterinom. Drugi molekul, CD163, olakšava potom uklanjanje omotača virusa u endozomu (Van Breedam i saradnici, 2010a). Virusni genom se oslobađa i ćelija se inficira.
[0078] Ovde su opisane životinje i njihovo potomstvo, kao i ćelije koje sadrže najmanje jednu modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163, npr. inserciju ili deleciju („INDEL”), što kod životinje obezbeđuje pobolјšanu ili potpunu rezistenciju na infekciju patogenom (npr. na PRRSV). Podnosioci su pokazali da je CD163 kritičan gen u PRRSV infekciji i stvorili su rezistente životinje i linije osnivače.
[0079] Predmetni opis obezbeđuje genetički modifikovane životinje, njihovo potomstvo ili životinjske ćelije koje sadrže najmanje jednu modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. Predmetni pronalazak ne uklјučuje inaktivaciju ili editovanje SIGLEC1 (CD169) gena, za koga se ranije smatralo da je kritičan za rezistenciju na PRRSV.
[0080] Editovana hromozomska sekvenca može biti (1) inaktivirana, (2) modifikovana ili (3) sadržavati integrisanu sekvencu koja rezultuje null mutacijom. Inaktivirana hromozomska sekvenca je izmenjena tako da je funkcija proteina CD163 u odnosu na infekciju sa PRRSV poremećena, smanjena ili eliminisana. Prema tome, genetički editovana životinja koja sadrži inaktiviranu hromozomsku sekvencu može biti označena kao „nokaut” ili „kondicionalni nokaut”. Slično navedenom, genetički editovana životinja koja sadrži integrisanu sekvencu može se nazvati „nokin” ili „kondicionalni nokin”. Štaviše, genetički editovana životinja koja sadrži modifikovanu hromozomsku sekvencu može sadržavati cilјanu tačkastu mutaciju(e) ili drugu modifikaciju tako da se proizvodi izmenjeni proteinski proizvod. Ukratko, postupak može obuhvatati uvođenje najmanje jednog molekula RNK koji kodira cilјanu nukleazu sa cinkanim prstima i, opciono, najmanje jednog pomoćnog polinukleotida u embrion ili ćeliju. Postupak dalјe obuhvata inkubiranje embriona ili ćelije, da bi se omogućila ekspresija nukleaze sa cinkanim prstima, pri čemu se dvolančani prekid uveden u cilјnu hromozomsku sekvencu upotrebom nukleaze sa cinkanim prstima popravlјa procesom nehomologne popravke oštećenja DNK spajanjem krajeva koji je sklon greškama, ili procesom popravke oštećenja DNK usmerenog homologijom. Postupak editovanja hromozomskih sekvenci koje kodiraju protein povezan sa germinativnim razvojem, upotrebom tehnologije ciljanog delovanja nukleaze sa cinkanim prstima, brz je, precizan i veoma efikasan.
[0081] Alternativno, postupak može obuhvatati upotrebu CRISPR/Cas9 sistema za modifikovanje genomske sekvence. Da bi se za modifikovanje genomskih sekvenci upotrebio Cas9, protein može biti isporučen direktno u ćeliju. Alternativno, iRNK koja kodira Cas9 može biti isporučena u ćeliju, ili gen koji obezbeđuje ekspresiju iRNK koja kodira Cas9 može biti isporučen u ćeliju. Dodatno, bilo crRNK i tracrRNK sa specifičnošću za ciljni molekul mogu biti isporučene direktno u ćeliju ili gRNK sa specifičnošću za ciljni molekul mogu biti u ćeliji (ove RNK alternativno mogu biti proizvedene sa gena konstruisanog tako da eksprimira ove RNK). Selecilja mesta ciljanog delvoanja i specifično dizajniranje crRNK/gRNK su dobro poznati u oblasti tehnike. Diskusija o konstruisanjeu i kloniranju gRNK se može naći na http://www.genome-engineering.org/crispr/wp-content/uploads/2014/05/CRISPRReagent-Description-Rev20140509.pdf.
[0082] Najmanje jedan lokus CD163 može biti upotrebljen kao cilјno mesto za editovanje koje je specifično za određeno mesto. Editovanje specifično za mesto može uklјučivati inserciju egzogene nukleinske kiseline (npr. nukleinske kiseline koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid od interesa) ili delecije nukleinskih kiselina iz lokusa. Na primer, integracija egzogene nukleinske kiseline i/ili delecija dela genomske nukleinske kiseline može modifikovati lokus tako da proizvodi poremećen CD163 gen (tj. protein CD163 sa smanjenom aktivnošću).
[0083] Ovde su opisane životinje različite od čoveka, potomci navedenih životinja i životinjske ćelije koje sadrže najmanje jednu modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. U kontekstu pronalaska, životinje i ćelije su životinje i ćelije svinje, a u obimu u kome su druge životinje i ćelije ovde pomenute, one su uklјučene samo u svrhe upućivanja.
[0084] Opisani su životinja različita od čoveka ili njeno potomstvo ili životinjska ćelija koji sadrži najmanje jednu modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. Modifikovana hromozomska sekvenca dovodi do proizvodnje suštinski nefunkcionalnog proteina CD163 od strane životinje, potomstva ili ćelije.
[0085] Opisana je druga životinja različita od čoveka ili njeno potomstvo ili životinjska ćelija koja sadrži najmanje jednu modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. Modifikovana hromozomska sekvenca sadrži deleciju koja ne menja okvir čitanja u genu koji kodira protein CD163.
[0086] Životinja ili ćelija svinje pronalaska je kao što je definisano u patentnim zahtevima, i u obimu u kome su druge životinje ili ćelije svinja ovde opisane, one su uklјučene samo u svrhe upućivanja. Opisana je životinja svinje ili njeno potomstvo ili ćelija svinje koja sadrži najmanje jednu modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. Modifikovana hromozomska sekvenca sadrži: (a) SEQ ID NO: 118; ili (b) modifikaciju izabrana iz grupe koju čine: delecija 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; insercija 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 na istom alelu; delecija 124 bazna para od nukleotida 3.024 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 123 bazna para od nukleotida 3.024 do nukleotida 3.146 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; insercija 1 baznog para između nukleotida 3.147 i 3.148 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 130 baznih parova od nukleotida 3.030 do nukleotida 3.159 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 132 bazna para od nukleotida 3.030 do nukleotida 3.161 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1506 baznih parova od nukleotida 1.525 do nukleotida 3.030 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; insercija 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1280 baznih parova od nukleotida 2.818 do nukleotida 4.097 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1373 bazna para od nukleotida 2.724 do nukleotida 4.096 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 28 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1387 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 4.531 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1382 bazna para od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113; delecija 1720 baznih parova od nukleotida 2.440 do nukleotida 4.160 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 452 bazna para od nukleotida 3.015 do nukleotida 3.466 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; i njihove kombinacije.
[0087] Modifikacija hromozomske sekvence u genu koji kodira protein CD163 smanjuje podložnost životinje, potomstva ili ćelije na infekciju patogenom (npr. virusom kao što je PRRSV), u poređenju sa podložnošću na infekciju patogenom kod životinje, potomstva ili ćelije koji ne sadrže modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163.
[0088] Na primer, modifikacija hromozomske sekvence u genu koji kodira protein CD 163 može smanjiti podložnost životinje, potomstva ili ćelije na PRRSV virus tipa 1, PRRSV tipa 2 ili PRRSV viruse i tipa 1 i tipa 2.
[0089] Modifikacija hromozomske sekvence u genu koji kodira protein CD163 može smanjiti životinju, potomstvo ili ćeliju na PRRSV izolat izabran iz grupe koju čine NVSL 97-7895, KS06-72109, P129, VR2332, CO90, AZ25, MLV-ResPRRS, KS62-06274, KS483 (SD23983), CO84, SD13-15, Lelistad, 03-1059, 03-1060, SD01-08, 4353PZ i njihove kombinacije.
[0090] Životinja ili potomstvo mogu biti embrion, mlada ili odrasla jedinka. Slično navedenom, ćelija može obuhvatati embrionalnu ćeliju, ćeliju dobijenu iz mlade životinje ili ćeliju dobijenu iz odrasle životinje.
[0091] Životinja ili potomci mogu obuhvatati pripitomlјene životinje. Slično navedenom, ćelija može sadržavati ćeliju dobijenu iz pripitomlјene životinje. Pripitomljena životinja može uklјučivati grlo stoke, na primer životinju svinje, goveče (npr. krave ili muzna goveda), ovce, koze, kopitare (npr. konja ili magarca), bivole, kamile ili živinu (npr. kokošku, ćurku, patku, gusku, biserku ili domaćeg goluba). Grlo stoke je poželјno goveče ili svinja, a najpoželјnije je životinja svinje. U kontekstu predmetnog pronalaska, životinja je životinja svinje.
[0092] Životinja ili potomstvo mogu uključivati genetički editovanu životinju. Ćelija može uključivati genetički editovanu ćeliju.
[0093] Životinja ili ćelija mogu biti genetički editovane upotrebom “homing” endonukleaze. „Homing” endonukleaza može biti endonukleaza koja se javlјa u prirodi, ali poželјno je racionalno dizajnirana endonukleaza koja se ne javlja u prirodi i koja ima sekvencu prepoznavanja DNK koja je dizajnirana tako da endonukleaza cilјano deluje na hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. Prema tome, “homing” endonukleaza može biti dizajnirana “homing” endonukleaza. „Homing” endonukleaza može obuhvatati, na primer, sistem grupisanih kratkih palindromskih ponovaka na jednakim rastojanjima (CRISPR)/Cas, efektornu nukleazu nalik aktivatoru transkripcije (TALEN), nukleazu sa cinkanim prstima (ZFN), rekombinazni fuzioni protein, meganukleazu ili njihovu kombinaciju. Životinja ili ćelija su poželјno životinja ili ćelija koje su genetički editovane upotrebom CRISPR/Cas9 sistema.
[0094] Genetički editovana životinja, njeno potomstvo ili genetički editovana ćelija poželјno pokazuju povećanu rezistenciju na patogen (npr. virus kao što je PRRSV) u poređenju sa životinjom koja nije editovana. U kontekstu predmetnog pronalaska, životinja svinje ili ćelija svinje imaju smanjenu podložnost na infekciju sa PRRSV u poređenju sa podložnošću životinje ili ćelije koja ne sadrži modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163 na infekciju sa PRRSV.
[0095] Na primer, genetički editovana životinja može ispoljavati povećanu rezistenciju na PRRSV virus tipa 1, PRRSV tipa 2 ili na PRRSV viruse i tipa 1 i tipa 2.
[0096] Genetički editovana životinja može pokazivati povećanu rezistenciju na izolat PRRSV izabran iz grupe koju čine NVSL 97-7895, KS06-72109, P129, VR2332, CO90, AZ25, MLV-ResPRRS, KS62-06274, KS483 (SD23983), CO84, SD13-15, Lelistad, 03-1059, 03-1060, SD01-08, 4353PZ i njihove kombinacije.
[0097] Životinja, potomstvo ili ćelija mogu biti heterozigotni u kontekstu modifikovane hromozomske sekvence. Alternativno, životinja, potomstvo ili ćelija mogu biti homozigotni u kontekstu modifikovane hromozomske sekvence.
[0098] Kod bilo koje životinje, potomstva ili ćelije, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati inserciju u genu koji kodira protein CD163, deleciju u genu koji kodira protein CD163 ili njihovu kombinaciju. Na primer, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju u genu koji kodira protein CD163 (npr. deleciju koja ne menja okvir čitanja). Alternativno, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati inserciju u genu koji kodira protein CD163.
[0099] Insercija ili delecija mogu prouzrokovati smanjenje proizvodnje ili aktivnosti proteina CD163, u poređenju sa proizvodnjom ili aktivnošću proteina CD163 u životinji, potomstvu ili ćeliji kojima nedostaju insercija ili delecija.
[0100] Insercija ili delecija mogu dovesti do proizvodnje suštinski nefunkcionalnog proteina CD163 od strane životinje, potomstva ili ćelije. Pod „suštinski nefunkcionalan protein CD163”, podrazumeva se da nivo proteina CD163 u životinji, potomstvu ili ćeliji nije moguće detektovati, ili ukoliko ga je moguće detektovati, on je za najmanje oko 90% niži od nivoa uočenog kod životinje, potomstva ili ćelije koji ne sadrže inserciju ili deleciju.
[0101] Kada životinja, potomstvo ili ćelija obuhvataju životinju, potomstvo ili ćeliju svinje, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati modifikaciju u egzonu 7 gena koji kodira protein CD 163, egzonu 8 gena koji kodira protein CD 163, intronu koji je u nizu sa egzonom 7 ili egzonom 8 gena koji kodira protein CD 163, ili njihovu kombinaciju. Pogodno je da modifikovana hromozomska sekvenca sadrži modifikaciju u egzonu 7 gena koji kodira protein CD 163. U kontekstu predmetnog pronalaska, modifikacije hromozomske sekvence u genu koji kodira protein CD163 su kao što je navedeno u patentnim zahtevima, a u obimu u kome su druge modifikacije ovde opisane, uklјučene su samo u svrhe upućivanja.
[0102] Modifikacija u egzonu 7 gena koji kodira protein CD 163 može obuhvatati deleciju (npr. deleciju koja ne menja okvir čitanja u egzonu 7). Alternativno, modifikacija u egzonu 7 gena koji kodira protein CD163 može obuhvatati inserciju.
[0103] U bilo kojoj od opisanih životinja, potomaka ili ćelija svinje, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati SEQ ID NO: 118. Alternativno, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati modifikaciju izabranu iz grupe koju čine: delecija 11 baznih parova od nukleotida 3.137 na nukleotid 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; insercija 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 na istom alelu; delecija 124 bazna para od nukleotida 3.024 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 123 bazna para od nukleotida 3.024 do nukleotida 3.146 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; insercija 1 baznog para između nukleotida 3.147 i 3.148 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 130 baznih parova od nukleotida 3.030 do nukleotida 3.159 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 132 bazna para od nukleotida 3.030 do nukleotida 3.161 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1506 baznih parova od nukleotida 1.525 do nukleotida 3.030 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; insercija 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1280 baznih parova od nukleotida 2.818 do nukleotida 4.097 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1373 bazna para od nukleotida 2.724 do nukleotida 4.096 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 28 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1387 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 4.531 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1382 bazna para od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113; delecija 1720 baznih parova od nukleotida 2.440 do nukleotida 4.160 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 452 bazna para od nukleotida 3.015 do nukleotida 3.466 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; ili njihove kombinacije.
[0104] Na primer, modifikacija može obuhvatati deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0105] Modifikacija može obuhvatati inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 na istom alelu.
[0106] Modifikacija može obuhvatati deleciju 124 bazna para od nukleotida 3.024 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0107] Modifikacija može obuhvatati deleciju 123 bazna para od nukleotida 3.024 do nukleotida 3.146 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0108] Modifikacija može da obuhvati insercija 1 baznog para između nukleotida 3.147 i 3.148 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0109] Modifikacija može obuhvatati deleciju 130 baznih parova od nukleotida 3.030 do nukleotida 3.159 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0110] Modifikacija može obuhvatati deleciju 132 bazna para od nukleotida 3.030 do nukleotida 3.161 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0111] Modifikacija može obuhvatati deleciju 1506 baznih parova od nukleotida 1.525 do nukleotida 3.030 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0112] Modifikacija može obuhvatati inserciju 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0113] Modifikacija može obuhvatati deleciju 1280 baznih parova od nukleotida 2.818 do nukleotida 4.097 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0114] Modifikacija može obuhvatati deleciju 1373 bazna para od nukleotida 2.724 do nukleotida 4.096 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0115] Modifikacija može obuhvatati deleciju 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0116] Modifikacija može obuhvatati deleciju 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0117] Modifikacija može obuhvatati deleciju 28 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0118] Modifikacija može obuhvatati deleciju 1387 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 4.531 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0119] Modifikacija može da obuhvati deleciju 1382 bazna para od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113.
[0120] Modifikacija može obuhvatati deleciju 1720 baznih parova od nukleotida 2.440 do nukleotida 4.160 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0121] Modifikacija može obuhvatati deleciju 452 bazna para od nukleotida 3.015 do nukleotida 3.466 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0122] Životinja, potomstvo ili ćelija svinje mogu sadržavati bilo koju kombinaciju prethodno navedenih insercija i delecija.
[0123] SEQ ID NO: 47 obezbeđuje nukleotidnu sekvencu za region koji počinje 3000 baznih parova (bp) uzvodno od egzona 7 u CD 163 genu svinje divljeg tipa i proteže se do poslednje baze egzona 10 ovog gena. SEQ ID NO: 47 se ovde upotrebljava kao referentna sekvenca i prikazana je na Sl.16.
[0124] Kada životinja, potomstvo ili ćelija svinje sadrže inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, insercija 2 bazna para može uklјučivati inserciju dinukleotida AG.
[0125] Kada životinja, potomstvo ili ćelija svinje sadrže inserciju 1 baznog para između nukleotida 3.147 i 3.148 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, insercija 1 baznog para može uklјučivati inserciju jednog adeninskog ostatka.
[0126] Kada životinja, potomstvo ili ćelija svinje sadrže inserciju 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, insercija od 7 baznih parova može sadržavati sekvencu TACTACT (SEQ ID NO: 115).
[0127] Kada životinja, potomstvo ili ćelija svinje sadrže deleciju iz 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, a insercija od 12 baznih parova može sadržavati sekvencu TGTGGAGAATTC (SEQ ID NO: 116).
[0128] Kada životinja, potomstvo ili ćelija svinje sadrže deleciju 1382 bazna para od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113, insercija od 11 baznih parova može sadržavati sekvencu AGCCAGCGTGC (SEQ ID NO: 117).
[0129] Kada modifikovana hromozomska sekvenca u genu koji kodira protein CD163 sadrži deleciju, delecija poželјno podrazumeva deleciju koja ne menja okvir čitanja. Delecije koja ne menjaju okvir čitanja su delecije koje ne prouzrokuju pomeraj okvira čitanja tripleta i na taj način rezultuju proteinskim proizvodom koji ima internu deleciju jedne ili više aminokiselina, ali koji nije skraćen. Delecije tri bazna para ili više puta po tri bazna para unutar egzona može dovesti do mutacije koja ne menja okvir čitanja, pod pretpostavkom da se obrada odvija na ispravan način.
[0130] Očekuje se da će sledeći INDEL koji su ovde opisani za životinje i ćelije svinja dovesti do delecija koje ne menjaju okvir čitanja, pošto su delecije unutar egzona 7 iz CD 163 gena svinje višestruke delecije od po tri: delecija 1506 baznih parova od nukleotida 1.525 do nukleotida 3.030 kao u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1373 bazna para od nukleotida 2.724 do nukleotida 4.096 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 123 bazna para od nukleotida 3.024 do nukleotida 3.146 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1387 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 4.531 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1382 bazna para od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113; i delecija 1720 baznih parova od nukleotida 2.440 do nukleotida 4.160 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0131] Shodno navedenom, kod životinja, potomstvo i ćelija svinja, insercija ili delecija u genu koji kodira protein CD163 može uklјučivati deleciju koja ne menja okvir čitanja u egzonu 7 i izabrana je iz grupe koju čine delecija 1506 baznih parova od nukleotida 1.525 do nukleotida 3.03 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1373 bazna para od nukleotida 2.724 do nukleotida 4.096 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 123 bazna para od nukleotida 3.024 do nukleotida 3.146 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1387 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 4.531 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1382 bazna para od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113; delecija 1720 baznih parova od nukleotida 2.440 do nukleotida 4.160 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; i njihove kombinacije.
[0132] Životinja, potomstvo i ćelija svinje mogu sadržavati inserciju ili deleciju izabranu iz grupe koju čine: insercija 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 na istom alelu; delecija 28 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 452 bazna para od nukleotida 3.015 do nukleotida 3.466 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; i njihove kombinacije.
[0133] Na primer, životinja, potomci ili ćelije svinje mogu sadržavati inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 na istom alelu.
[0134] Životinja, potomstvo i ćelija svinje mogu sadržavati deleciju 28 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0135] Životinja, potomstvo i ćelija svinje mogu sadržavati deleciju 452 bazna para od nukleotida 3.015 do nukleotida 3.466 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0136] Životinja, potomstvo i ćelija svinje mogu sadržavati bilo koju kombinaciju bilo koje od modifikovanih hromozomskih sekvenci koje su ovde opisane.
[0137] Na primer, životinja, potomstvo ili ćelija svinje može sadržavati inserciju 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0138] Životinja, potomstvo ili ćelija svinje može sadržavati inserciju 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i deleciju 1382 baznih parova od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0139] Životinja, potomstvo i ćelija svinje mogu sadržavati SEQ ID NO: 118 u jednom alelu gena koji kodira protein CD 163; i deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0140] Životinja, potomstvo ili ćelija svinje mogu sadržavati SEQ ID NO: 118 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0141] Životinja, potomstvo ili ćelija svinje mogu sadržavati deleciju 1280 baznih parova od nukleotida 2.818 do nukleotida 4.097 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD 163; i deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0142] Životinja, potomstvo ili ćelija svinja mogu sadržavati deleciju 1280 baznih parova od nukleotida 2.818 do nukleotida 4.097 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0143] Životinja, potomstvo i ćelija svinje mogu sadržavati deleciju 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0144] Životinja, potomstvo ili ćelija svinje mogu sadržavati SEQ ID NO: 118 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i deleciju 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD163.
[0145] Životinja, potomstvo i ćelija svinje mogu sadržavati deleciju 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD163.
[0146] Životinja, potomstvo ili ćelija svinja mogu sadržavati deleciju 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0147] Životinja, potomstvo ili ćelija svinje mogu sadržavati deleciju 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD 163; i deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0148] Životinja, potomstvo ili ćelija svinje koji sadrže bilo koju od prethodno opisanih insercija ili delecija mogu sadržavati hromozomsku sekvencu koja ima visok stepen identičnosti sa SEQ ID NO: 47 izvan insercije ili delecije. Tako, na primer, životinja, potomstvo ili ćelija svinje mogu sadržavati hromozomsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,9% ili 100% idetnična sa SEQ ID NO: 47 u regionima hromozomske sekvence izvan insercije ili delecije.
[0149] Životinja, potomstvo ili ćelija svinje mogu sadržavati hromozomsku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 118 ili 119. Kao što je dalјe opisano u nastavku teksta, u Primerima, SEQ ID NO. 98-114 i 119 obezbeđuju nukleotidne sekvence za region koji odgovara regionu iz CD163 svinje divlјeg tipa koji je naveden u SEQ ID NO:47, i uklјučuju insercije ili delecije u hromozomskoj sekvenci CD163 svinje koje su ovde opisane. SEQ ID NO: 118 obezbeđuje sekvencu za region koji odgovara regionu iz CD163 svinje divlјeg tipa koji je naveden u SEQ ID NO: 47, pri čemu je egzon 7 zamenjen sintetisanim egzonom koji kodira homologa SRCR 8 humanog proteina nalik CD163 tipa 1 (hCD163L1).
[0150] Na primer, životinja, potomstvo ili ćelija svinje mogu sadržavati hromozomsku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 98, 101, 105, 109, 110, 112, 113 ili 114. SEQ ID NO: 98, 101, 105, 109, 110, 112, 113 i 114 obezbeđuju nukleotidne sekvence za delecije koje ne menjaju okvir čitanja u egzonu 7 hromozomske sekvence CD163 svinja.
[0151] U vidu još jednog primera, životinja, potomstvo ili ćelija svinje mogu sadržavati hromozomsku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 103, 111 ili 119.
[0152] Životinja, potomstvo ili ćelija svinja mogu sadržavati deleciju 11 baznih parova u jednom alelu gena koji kodira protein CD163 i inserciju 2 bazna para sa delecijom 377 baznih parova u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0153] Životinja, potomstvo ili ćelija svinja mogu sadržavati deleciju 124 bazna para u jednom alelu gena koji kodira protein CD163 i deleciju 123 bazna para u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0154] Životinja, potomstvo i ćelija svinje mogu sadržavati inserciju 1 baznog para.
[0155] Životinja, potomstvo i ćelija svinje mogu sadržavati deleciju od 130 baznih parova u jednom alelu gena koji kodira protein CD163 i deleciju od 132 bazna para u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0156] Životinja, potomstvo i ćelija svinje mogu sadržavati deleciju od 1506 baznih parova.
[0157] Životinja, potomstvo ili ćelija svinje mogu sadržavati inserciju od 7 baznih parova.
[0158] Životinja, potomstvo ili ćelija svinja mogu sadržavati deleciju od 1280 baznih parova u jednom alelu gena koji kodira protein CD163 i deleciju od 1373 baznih parova u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0159] Životinja, potomstvo i ćelija svinje mogu sadržavati deleciju od 1467 baznih parova.
[0160] Životinja, potomstvo ili ćelija svinje mogu sadržavati deleciju od 1930 baznih parova u intronu 6 od nukleotida 488 do nukleotida 2.417, sa insercijom od 12 baznih parova na nukleotidu 4.488 i dodatnom delecijom 129 baznih parova u egzonu 7.
[0161] Životinja, potomstvo ili ćelija svinja mogu sadržavati deleciju 28 baznih parova u jednom alelu gena koji kodira protein CD163 i deleciju 1387 baznih parova u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0162] Životinja, potomstvo ili ćelija svinje mogu sadržavati deleciju 1382 bazna para sa insercijom od 11 baznih parova u jednom alelu gena koji kodira protein CD 163 i deleciju 1720 baznih parova u drugom alelu gena koji kodira protein CD163.
[0163] Bilo koja od ćelija koje sadrže najmanje jednu modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163 može uključivati ćeliju sperme. Alternativno, bilo koja od ovih ćelija može obuhvatati jajnu ćeliju (npr. oplođenu jajnu ćeliju).
[0164] Bilo koja od ćelija koje sadrže najmanje jednu modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163 može obuhvatati somatsku ćeliju. Na primer, bilo koja od ćelija može obuhvatati fibroblast (npr. fetalni fibroblast).
Cilјana integracija nukleinske kiseline u CD163 lokus
[0165] Integracija egzogene nukleinske kiseline specifična za mesto u CD163 lokus, može se postići bilo kojom tehnikom koja je poznata stručnjacima iz oblasti tehnike. Na primer, integracija egzogene nukleinske kiseline u CD163 lokus može uključivati dovođenje ćelije (npr. izolovane ćelije ili ćelije u tkivu ili organizmu) u kontakt sa molekulom nukleinske kiseline koji sadrži egzogenu nukleinsku kiselinu. Takav molekul nukleinske kiseline može sadržavati nukleotidne sekvence koje uokviruju egzogenu nukleinsku kiselinu i olakšavaju homolognu rekombinaciju između molekula nukleinske kiseline i najmanje jednog CD163 lokusa. Nukleotidne sekvence koje okružuju egzogenu nukleinsku kiselinu i olakšavaju homolognu rekombinaciju mogu biti komplementarne endogenim nukleotidima CD163 lokusa. Alternativno, nukleotidne sekvence koje okružuju egzogenu nukleinsku kiselinu i olakšavaju homolognu rekombinaciju mogu biti komplementarne prethodno integrisanim egzogenim nukleotidima. Mnoštvo egzogenih nukleinskih kiselina može biti integrisano u jedan CD163 lokus, kao što je naslagivanjem gena.
[0166] Integracija nukleinske kiseline u CD163 lokus može biti olakšana (npr. katalizovana) endogenom ćelijskom mašinerijom ćelije domaćina, kao što je, na primer i bez ograničenja, sa endogenom DNK i endogenim rekombinaznim enzimima. Alternativno, integracija nukleinske kiseline u CD163 lokus može biti olakšana sa jednim ili sa više faktora (npr. polipeptida) koji su obezbeđeni u ćeliji domaćinu. Na primer, mogu biti obezbeđeni polipeptidi nukleaze(a), rekombinaze(a) i/ili ligaze(a) (bilo nezavisno ili kao deo himernog polipeptida) dovođenjem u kontakt polipeptida sa ćelijom domaćinom, ili ekspresijom polipeptida unutar ćelije domaćina. Shodno tome, nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jedan nukleazni polipeptid, rekombinazu i/ili ligazu može biti uvedena u ćeliju domaćina, bilo istovremeno ili sekvencijalno sa nukleinskom kiselinom koja će biti integrisana u CD163 lokus sa specifičnošću za mesto, pri čemu se najmanje jedan nukleazni polipeptid, rekombinaza i/ili ligaza eksprimiraju sa nukleotidne sekvence u ćeliji domaćinu.
Polipeptidi koji vezuju DNK
[0167] Integracija specifična za mesto može se postići i korišćenjem faktora koji su sposobni da prepoznaju i da se vežu za određene nukleotidne sekvence, na primer, u genomu organizma domaćina. Na primer, mnogi proteini sadrže polipeptidne domene koji su sposobni da prepoznaju i da se vežu za DNK na način specifičan za mesto. DNK sekvenca koju prepoznaje polipeptid koji vezuje DNK može biti označena kao „cilјna” sekvenca. Polipeptidni domeni koji su sposobni da prepoznaju i da se vežu za DNK na način specifičan za mesto, generalno se pravilno uvijaju i funkcionišu nezavisno, tako da se vezuju za DNK na način specifičan za mesto čak i kada su eksprimirani u polipeptidu koji nije protein iz kojeg je domen prvobitno izolovan. Slično navedenom, cilјne sekvence za prepoznavanje i vezivanje upotrebom polipeptida koji se vezuju za DNK, generalno u stanju da budu prepoznate i vezane za takve polipeptide, čak i kada su prisutne u velikim DNK strukturama (npr. hromozomu), posebno kada je mesto gde se nalazi cilјna sekvenca poznato kao ono koje je dostupno za solubilne ćelijske proteine (npr. gen).
[0168] Dok se polipeptidi koji vezuju DNK i koji su identifikovani iz proteina koji postoje u prirodi, obično vezuju za diskretnu nukleotidnu sekvencu ili motiv (npr. konsenzusnu sekvencu prepoznavanja), postoje i postupci koji su poznati u oblasti tehnike za modifikovanje mnogih takvih polipeptida koji vezuju DNK da bi oni prepoznali različitu nukleotidnu sekvencu ili motiv. Polipeptidi koji vezuju DNK obuhvataju, na primer i bez ograničenja: domene za vezivanje DNK sa cinkanim prstima; leucinske rajsfešluse; UPA domene koji vezuju DNK; GAL4; TAL; LexA; Tet represore; LacI; i receptore za steroidne hormone.
[0169] Na primer, polipeptid koji vezuje DNK može biti sa cinkanim prstima. Pojedinačni motivi cinkanih prstiju mogu biti dizajnirani tako da ciljano deluju i vezuju se specifično za bilo koje od velikog broja DNK mesta. Kanonski Cys2His2(kao i nekanonski Cys3His) polipeptidi sa cinkanim prstima vezuju DNK insercijom α-heliksa u veliki žleb dvostruke zavojnice cilјne DNK. Prepoznavanje DNK cinkanim prstima je modularno; svaki prst stupa u kontakt prevashodno sa tri uzastopna bazna para u ciljnom molekulu, a nekoliko klјučnih ostataka u polipeptidu posreduje u prepoznavanju. Uklјučivanjem više domena za vezivanje DNK sa cinkanim prstima u endonukleazu sa ciljanim delovanjem, specifičnost vezivanja za DNK endonukleaze sa ciljanim delovanjem može biti dodatno povećana (i stoga se može povećati specifičnost bilo kog regulatornog efekta gena koji je time obezbeđen). Pogledati, npr. Urnov i saradnici (2005) Nature 435:646-51. Prema tome, jedan ili više polipeptida sa cinkanim prstima koji vezuju DNK mogu biti konstruisani i iskorišćeni tako da endonukleaza sa ciljanim delovanjem koja je uvedena u ćeliju domaćina interaguje sa DNK sekvencom koja je jedinstvena u genomu ćelije domaćina.
[0170] Poželјno je da je protein sa cinkanim prstima koji ne javlja u prirodi konstruisan tako da se vezuje za cilјno mesto od izbora. Pogledati, na primer, Beerli i saradnici (2002) Nature Biotechnol.
20:135-141; Pabo i saradnici (2001) Ann. Rev. Biochem.70:313-340; Isalan i saradnici (2001) Nature Biotechnol.19:656-660; Segal i saradnici (2001) Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637; Choo i saradnici (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.10:411-416; U.S. Pat. No.6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; i SAD patentnu objavu br.2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.
[0171] Konstruisan domen vezivanja sa cinkanim prstima može imati novu specifičnost vezivanja u poređenju sa proteinom sa cinkanim prstima koji se javlja u prirodi. Postupci genetičkog inženjeringa uklјučuju, ali nisu ograničeni na, racionalan dizajn i razne vrste selekcije. Racionalan dizajn uklјučuje, na primer, upotrebu baza podataka koje sadrže sekvence tripleta (ili kvadripleta) nukleotida i pojedinačnih aminokiselinskih sekvenci sa cinkanim prstima, u kojima je svaka sekvenca tripleta ili kvadripleta nukleotida povezana sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci sa cinkanim prstima koje vezuju određenu sekvencu tripleta ili kvadripleta. Pogledati, na primer, U.S. Pat. No. 6,453,242 i 6,534,261.
[0172] Postupci selekcije za primer, uklјučujući prikaz u fagima i dvohibridne sisteme, opisani su u U.S. Pat. No.5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; and 6,242,568; kao i WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 i GB 2,338,237. Dodatno, opisano je pojačavanje specifičnosti vezivanja za domene vezivanja sa cinkanim prstima, na primer, u WO 02/077227.
[0173] Dodatno, kao što je opisano u ovim i drugim referencama, domeni sa cinkanim prstima i/ili proteini sa višeprstim cinkanim prstima mogu biti povezani zajedno upotrebom bilo koje pogodne linkerske sekvence, uklјučujući, na primer, linkere dužine od 5 ili više aminokiselina. Pogledati, takođe, U.S. Pat. No.6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949 za linkerske sekvence za primer koje su dužine od 6 ili više aminokiselina. Proteini koji su ovde opisani mogu uklјučivati bilo koju kombinaciju pogodnih linkera između pojedinačnih cinkanih prstiju proteina.
[0174] Selekcija cilјnih mesta: ZFP i postupci za racionalan dizajn i konstruisanje fuzionih proteina (i polinukleotida koji ih kodiraju) poznati su stručnjacima iz oblasti tehnike i detalјno su opisani u U.S. Pat. No.6,140,0815; 789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 i WO 03/016496.
[0175] Dodatno, kao što je opisano u ovim i drugim referencama, domeni sa cinkanim prstima i/ili proteini sa višeprstim cinkanim prstima mogu biti povezani zajedno upotrebom bilo koje pogodne linkerske sekvence, uklјučujući, na primer, linkere dužine od 5 ili više aminokiselina. Pogledati, takođe, U.S. Pat. No. 6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949 za linkerske sekvence za primer dužine od 6 ili više aminokiselina. Proteini koji su ovde opisani mogu uklјučivati bilo koju kombinaciju pogodnih linkera između pojedinačnih cinkanih prstiju proteina.
[0176] Alternativno, polipeptid koji vezuje DNK je domen koji vezuje DNK iz GAL4. GAL4 je modularni transaktivator u Saccharomyces cerevisiae, ali takođe deluje kao transaktivator u mnogim drugim organizmima. Pogledati, npr. Sadowski i saradnici (1988) Nature 335:563-4. U ovom regulatornom sistemu, ekspresija gena koji kodiraju enzime metaboličkog puta galaktoze u S. cerevisiae strogo je regulisana dostupnim izvorom uglјenika. Johnston (1987) Microbiol. Rev. 51:458-76. Kontrola transkripcije ovih metaboličkih enzima je posredovana interakcijom između pozitivnog regulatornog proteina, GAL4, i simetrične DNK sekvence od 17 bp za koju se GAL4 specifično vezuje (uzvodna aktivaciona sekvenca (UAS)).
[0177] Nativan GAL4 se sastoji od 881 aminokiselinskog ostatka i sa molekulskom je težinom od 99 kDa. GAL4 sadrži funkcionalno autonomne domene, čije su kombinovane aktivnosti odgovorne za aktivnost GAL4 in vivo. Ma i Ptashne (1987) Cell 48:847-53); Brent i Ptashne (1985) Cell 43(3 Pt 2):729-36. N-terminalnih 65 aminokiselina GAL4 sadrži domen koji vezuje GAL4 DNK. Keegan i saradnici (1986) Science 231:699-704; Johnston (1987) Nature 328:353-5. Vezanje specifično za sekvencu zahteva prisustvo dvovalentnog katjona koordinativno vezanog sa 6 Cys ostataka prisutnih u domenu za vezivanje DNK. Domen koji sadrži koordinativno vezan katjon interaguje sa i prepoznaje očuvani CCG triplet na svakom kraju UAS od 17 bp, preko direktnog kontakta sa velikim žlebom DNK zavojnice. Marmorstein i saradnici (1992) Nature 356:408-14. Funkcija vezivanja DNK proteina postavlјa C-terminalne domene za aktiviranje transkripcije u blizini promotora, tako da aktivirajući domeni mogu usmeravati transkripciju.
[0178] Dodatni polipeptidi koji vezuju DNK i koji mogu biti upotrebljeni uklјučuju, na primer i bez ograničenja, vezujuću sekvencu iz AVRBS3-inducibilnog gena; konsenzusnu vezujuću sekvencu iz AVRBS3-inducibilnog gena ili sintetičku vezujuću sekvencu konstruisanu iz nje (npr. UPA domen za vezivanje DNK); TAL; LexA (pogledati, npr. Brent i Ptashne (1985), navedeno iznad); LacR (pogledati, npr. Labow i saradnici (1990) Mol. Cell. Biol.10:3343-56; Bairn i saradnici (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(12):5072-6); receptor za steroidne hormone (Ellliston i saradnici (1990) J. Biol. Chem.
265:11517-12); Tet represor (U.S. Pat. No. 6,271,341) i mutirani Tet represor koji vezuje tet operatorsku sekvencu u prisustvu, ali ne i u odsustvu, tetraciklina (Tc); domen koji vezuje DNK iz NF-kapaB; i komponente regulatornog sistema opisanog u Wang i saradnici (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(17):8180-4, koji koriste fuziju GAL4, hormonskog receptora i VP16.
[0179] Domen koji vezuje DNK jedne ili više nukleaza upotrebljenih u postupcima i kompozicijama koje su ovde opisane, može sadržavati TAL efektorski domen za vezivanje DNK koji se javlja u prirodi ili onaj koji je konstruisan (koji se ne javlja u prirodi). Pogledati, npr. SAD patentnu objavu br.2011/0301073.
[0180] Alternativno, nukleaza može sadržavati CRISPR/Cas sistem. Takvi sistemi uklјučuju CRISPR lokus (kratkih palindromskih ponovaka na jednakim rastojanjima), koji kodira RNK komponente sistema, kao i Cas (povezan sa CRISPR) lokus, koji kodira proteine (Jansen i saradnici, 2002. Mol. Microbiol.43: 1565-1575; Makarova i saradnici, 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova i saradnici, 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft i saradnici, 2005. PLoS Comput. Biol.1: e60). CRISPR lokusi kod mikrobnih domaćina sadrže kombinaciju Cas gena, kao i nekodirajuće RNK elemenate sposobne da programiraju specifičnost cepanja nukleinskih kiselina posredovanog sa CRISPR.
[0181] CRISPR tipa II je jedan od najbolјe okarakterisanih sistema i vrši cilјani dvolančani prekid DNK u prirodi, u četiri uzastopna koraka. Najpre, dve nekodirajuće RNK, pre-crRNK niz i tracrRNK, transkribuju se sa CRISPR lokusa. U drugom koraku, tracrRNK hibridizuje sa regionima ponovake pre-crRNK i posreduje u obradi pre-crRNK u zrele crRNK koje sadrže pojedinačne spejserske sekvence. Treće, kompleks zrele crRNK:tracrRNK usmerava Cas9 ka cilјnoj DNK preko Votson-Krikovog uparivanja baza između spejsera na crRNK i protospejsera na cilјnoj DNK, pored motiva susednog protospejseru (PAM), što je dodatni zahtev za prepoznavanje cilјnog molekula. Konačno, Cas9 posreduje u cepanju cilјne DNK da bi se stvorio dvolančani prekid unutar protospejsera.
[0182] Za upotrebu CRISPR/Cas sistema, da bi se stvorile ciljne insericje i delecije, dve nekodirajuće RNK (crRNK i TracrRNK) mogu biti zamenjene jednom RNK koja se označava kao RNK vodič (gRNK, od engl. guide RNA). Aktivnost CRISPR/Cas sistema se sastoji od tri koraka: (i) insercije egzogenih DNK sekvenci u CRISPR niz da bi se sprečili budući napadi, u procesu koji se naziva „adaptacija”, (ii) ekspresije relevantnih proteina, kao i ekspresije i obrade sekvence, nakon čega sledi (iii) interferencija sa stranom nukleinskom kiselinom koja je posredovana sa RNK. U bakterijskoj ćeliji, nekoliko Cas proteina je uklјučeno u prirodnu funkciju CRISPR/Cas sistema i ima uloge u funkcijama kao što je insercija strane DNK itd.
[0183] Cas protein može biti „funkcionalni derivat” Cas proteina koji se javlja u prirodi. „Funkcionalni derivat” polipeptida nativne sekvence je jedinjenje koje ima zajedničku kvalitativnu biološku osobinu kao polipeptid nativne sekvence. „Funkcionalni derivati” uklјučuju, ali nisu ograničeni na, fragmente nativne sekvence i derivate polipeptida nativne sekvence i njenihove fragmente, pod uslovom da oni imaju zajedničku biološku aktivnost sa odgovarajućim polipeptidom nativne sekvence. Biološka aktivnost koja se ovde razmatra je sposobnost funkcionalnog derivata da hidrolizuje DNK supstrat u fragmente. Termin „derivat” obuhvata kako varijante aminokiselinske sekvence polipeptida, kovalentne modifikacije, tako i njihove fuzije. Pogodni derivati Cas polipeptida ili njegovog fragmenta uklјučuju, ali nisu ograničeni na mutante, fuzije, kovalentne modifikacije Cas proteina ili njegovog fragmenta. Cas protein, koji uklјučuje Cas protein ili njegov fragment, kao i derivate Cas proteina ili njegovog fragmenta, koji mogu biti dobijeni iz ćelije ili sintetisani hemijski ili kombinacijom ova dva postupka. Ćelija može biti ćelija koja prirodno proizvodi Cas protein, ili ćelija koja prirodno proizvodi Cas protein i genetički je izmenjena tako da proizvodi endogeni Cas protein na višem nivou ekspresije ili da proizvodi Cas protein sa egzogeno uvedene nukleinske kiseline, koja je nukleinska kiselina koja kodira Cas koji je isti ili različit od endogenog Cas. U pojedinim slučajevima, ćelija prirodno ne proizvodi Cas protein i genetički je izmenjena tako da proizvodi Cas protein.
[0184] Polipeptid koji vezuje DNK može specifično prepoznavati i vezivati se za cilјnu nukleotidnu sekvencu koja je sadržana unutra genomske nukleinske kiseline organizma domaćina. Bilo koji broj diskretnih slučajeva cilјne nukleotidne sekvence može se naći u genomu domaćina u pojedinim primerima. Cilјna nukleotidna sekvenca može biti retka u genomu organizma (npr. u genomu može postojati manje od oko 10, oko 9, oko 8, oko 7, oko 6, oko 5, oko 4, oko 3, oko 2 ili oko 1 kopije(a) cilјne sekvence). Na primer, cilјna nukleotidna sekvenca može biti locirana na jedinstvenom mestu unutar genoma organizma. Cilјne nukleotidne sekvence mogu biti, na primer i bez ograničenja, nasumično dispergovane kroz genom jedna u odnosu na drugu; nalaziti se u različitim grupama vezanosti gena u genomu; nalaziti se u istoj grupi vezanosti gena; nalaziti se na različitim hromozomima; nalaziti se na istom hromozomu; nalaziti se u genomu na mestima koja se eksprimiraju pod sličnim uslovima u organizmu (npr. time što su pod kontrolom istih, ili suštinski funkcionalno identičnih, regulacionih faktora); i nalaziti se blizu jedan drugom u genomu (npr. cilјne sekvence mogu biti sadržane unutar nukleinskih kiselina integrisanih kao konkatemeri na genomskim lokusima).
Endonukleaze sa ciljanim delovanjem
[0185] Polipeptid koji vezuje DNK i specifično prepoznaje i vezuje se za cilјnu nukleotidnu sekvencu može biti sadržan unutar himernog polipeptida, tako da himerni polipeptid time stiče karakteristiku specifičnog vezivanja za cilјnu sekvencu. U primerima, takav himerni polipeptid može sadržavati, na primer i bez ograničenja, polipeptide nukleaza, rekombinaza i/ili ligaza, kao što su polipeptidi koji su prethodno opisani. Himerni polipeptidi koji sadrže polipeptid koji vezuje DNK i nukleazni polipeptid, rekombinaze i/ili ligaze mogu takođe sadržavati druge funkcionalne polipeptidne motive i/ili domene, kao što su na primer i bez ograničenja: spejserska sekvenca pozicionirana između funkcionalnih polipeptida u himernom proteinu; vodeći peptid; peptid koji cilјano usmerava fuzioni protein do organele (npr. do jedra); polipeptidi koje cepa ćelijski enzim; peptidni tagovi (npr. Myc, His itd.); i druge aminokiselinske sekvence koje ne ometaju funkciju himernog polipeptida.
[0186] Funkcionalni polipeptidi (npr. polipeptidi koji vezuju DNK i polipeptidi nukleaza) u himernom polipeptidu mogu biti operativno povezani. Funkcionalni polipeptidi himernog polipeptida mogu biti operativno povezani svojom ekspresijom sa jednog polinukleotida koji kodira najmanje funkcionalne polipeptide koji su ligacijom povezani jedan sa drugim tako da se ne menja okvir čitanja, čime nastaje himerni gen koji kodira himerni protein. Alternativno, funkcionalni polipeptidi himernog polipeptida mogu biti operativno povezani na druge načine, kao što je unakrsnim povezivanjem nezavisno eksprimiranih polipeptida.
[0187] Polipeptid koji vezuje DNK ili RNK vodič koji specifično prepoznaju i vezuju se za cilјnu nukleotidnu sekvencu mogu biti sadržani u prirodnom izolovanom proteinu (ili njegovom mutantu), pri čemu prirodni izolovani protein ili njegov mutant takođe sadrže nukleazni polipeptid (takođe mogu sadržavati polipeptid rekombinaze i/ili ligaze). Primeri takvih izolovanih proteina uklјučuju TALEN, rekombinaze (npr. Cre, Hin, Tre i FLP rekombinazu), CRISPR/Cas9 vođen sa RNK i meganukleaze.
[0188] Kao što se ovde upotrebljava, termin „endonukleaza sa ciljanim delovanjem” odnosi se na prirodne ili konstruisane izolovane proteine i njihove mutante koji sadrže polipeptid koji vezuje DNK ili RNK vodiča i nukleazni polipeptid, kao i na himerne polipeptide koji sadrže polipeptid koji vezuje DNK ili RNK vodiča i nukleazu. Može biti upotrebljena bilo koja endonukleaza sa ciljanim delovanjem koja sadrži polipeptid koji vezuje DNK ili RNK vodiča, a koja specifično prepoznaje i vezuje se za cilјnu nukleotidnu sekvencu sadržanu unutar CD163 lokusa (npr. bilo zato što je cilјna sekvenca sadržana u nativnoj sekvenci lokusa, ili zato što je cilјna sekvenca uvedena u lokus, na primer, rekombinacijom).
[0189] Pojedini primeri pogodnih himernih polipeptida uklјučuju, bez ograničenja, kombinacije sledećih polipeptida: polipeptida koji vezuju DNK sa cinkanim prstima; polipeptida FokI nukleaze; TALE domena; leucinskih rajsfešlusa; motiva za vezivanje DNK iz transkripcionih faktora; i domene za prepoznavanje i/ili cepanje DNK izolovane iz, na primer i bez ograničenja, TALEN, rekombinaze (npr. Cre, Hin, RecA, Tre i FLP rekombinaza), CRISPR/Cas9 vođenog sa RNK, meganukleaze; i drugih koji su poznati stručnjacima. Posebni primeri uklјučuju himerni protein koji sadrži polipeptid koji vezuje DNK na specifičnom mestu i nukleazni polipeptid. Himerni polipeptidi mogu biti konstruisani postupcima koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike za izmenu sekvence prepoznavanja polipeptida koji vezuje DNK i nalazi se unutar himernog polipeptida, tako da himerni polipeptid ciljano deluje na određenu nukleotidnu sekvencu od interesa.
[0190] Himerni polipeptid može sadržavati domen koji vezuje DNK (npr. cinkani prst, efektorni domen TAL itd.) i nukleazni domen (za cepanje). Domen cepanja može biti heterologan domenu koji vezuje DNK, na primer, kao što su domen koji vezuje DNK sa cinkanim prstima i domen cepanja iz nukleaze ili TALEN domen koji vezuje DNK i domen cepanja, ili meganukleazni domen koji vezuje DNK i domen cepanja iz različite nukleaze. Heterologni domeni cepanja se mogu dobiti iz bilo koje endonukleaze ili egzonukleaze. Primeri endonukleaza iz kojih može biti izveden domen cepanja uklјučuju, ali nisu ograničeni na, restrikcione endonukleaze i „homing” endonukleaze. Pogledati, na primer, 2002-2003 Katalog, New England Biolabs, Beverly, Mass.; i Belfort i saradnici (1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388. Poznati su i dodatni enzimi koji cepaju DNK (npr.51 nukleaza; nukleaza mung pasulјa; DNKza I pankreasa; mikrokokna nukleaza; HO endonukleaza kvasca; pogledati takođe Linn i saradnici (ur.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Jedan ili više od ovih enzima (ili njihovih funkcionalnih fragmenata) mogu biti upotrebljeni kao izvor domena cepanja i poludomena cepanja.
[0191] Slično navedenom, poludomen cepanja može biti izveden iz bilo koje nukleaze ili njenog dela, kao što je prethodno navedeno, što zahteva dimerizaciju za aktivnost cepanja. U principu, dva fuziona proteina su potrebna za cepanje ukoliko fuzioni proteini sadrže polu-domene cepanja. Alternativno, može biti upotrebljen jedan protein koji sadrži dva polu-domena cepanja. Dva poludomena cepanja mogu biti izvedena iz iste endonukleaze (ili njenih funkcionalnih fragmenata), ili svaki poludomen cepanja može biti izveden iz različite endonukleaze (ili njenih funkcionalnih fragmenata). Dodatno, cilјna mesta za dva fuziona proteina su poželјno raspoređena, jedno u odnosu na drugo, tako da vezivanje dva fuziona proteina za njihova odgovarajuća cilјna mesta postavlјa poludomene cepanja u prostornu orijentaciju jednog prema drugom tako da se omogući da poludomeni cepanja obrazuju funkcionalan domen cepanja, npr. dimerizacijom. Prema tome, bliske ivice cilјnih mesta mogu biti razdvojene sa 5-8 nukleotida ili sa 15-18 nukleotida. Međutim, bilo koji ceo broj nukleotida, ili nukleotidnih parova, može biti umetnut između dva cilјna mesta (npr. od 2 do 50 parova nukleotida ili više). U principu, mesto cepanja leži između cilјnih mesta.
[0192] Restrikcione endonukleaze (restrikcioni enzimi) prisutne su u mnogim vrstama i sposobne su da vezuju DNK sa specifičnošću za sekvencu (na mestu prepoznavanja), kao i da cepaju DNK na ili blizu mesta vezivanja, na primer, tako da su jedna ili više egzogenih sekvenci (donorksa/transgena) ugrađene u ili blizu mesta (ciljanog) vezivanja. Određeni restrikcioni enzimi (npr. tipa IIS) cepaju DNK na mestima uklonjenim sa mesta prepoznavanja i imaju domene vezivanja i cepanja koji se mogu odvojiti. Na primer, enzim tipa IIS Fok I katalizuje dvolančano cepanje DNK, 9 nukleotida od njegovog mesta prepoznavanja na jednom lancu i 13 nukleotida od njegovog mesta prepoznavanja na drugom. Pogledati, na primer, U.S. Pat. No.5,356,802; 5,436,150 and 5,487,994; kao i Li i saradnici (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li i saradnici (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim i saradnici (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim i saradnici (1994b) J. Biol. Chem.
269:31,978-31,982. Prema tome, fuzioni proteini mogu sadržavati domen cepanja (ili poludomen cepanja) iz najmanje jednog restrikcionog enzima tipa IIS i jednog ili više domena za vezivanje sa cinkanim prstima, koji mogu, ali ne moraju biti konstruisani genetičkim inženjeringom.
[0193] Restrikcioni enzim tipa IIS za primer, čiji se domen cepanja može razdvojiti od domena vezivanja, je Fok I. Ovaj poseban enzim je aktivan kao dimer. Bitinaite i saradnici (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. Shodno tome, za potrebe predmetnog opisa, deo Fok I enzima koji je upotrebljavan u opisanim fuzionim proteinima smatra se polu-domenom cepanja. Za cilјano dvolančano cepanje i/ili cilјanu zamenu ćelijskih sekvenci upotrebom fuzije peptida sa cinkanim prstima i Fok I, mogu stoga biti upotrebljena dva fuziona proteina, od kojih svaki sadrži poludomen cepanja FokI, da bi se ponovo uspostavio katalitički aktivan domena cepanja. Alternativno, može biti upotrebljeni i jedan polipeptidni molekul koji sadrži domen vezivanja za DNK i dva Fok I polu-domena cepanja.
[0194] Domen cepanja ili poludomen cepanja može biti bilo koji deo proteina koji zadržava aktivnost cepanja, ili koji zadržava sposobnost multimerizacije (npr. dimerizacije), da bi se obrazovao funkcionalan domen cepanja.
[0195] Restrikcioni enzim tipa IIS za primer su opisani u SAD patentnoj objavi br. 2007/0134796. Predmetnim opisom se razmatraju i dodatni restrikcioni enzimi koji takođe sadrže domene vezivanja i cepanja koji se mogu razdvojiti. Pogledati, na primer, Roberts i saradnici (2003) Nucleic Acids Res.
31:418-420.
[0196] Domen cepanja može sadržavati jedan ili više konstruisanih poludomena cepanja (koji se takođe označavaju kao mutanti domena dimerizacije) a koji svode na minimum ili sprečavaju homodimerizaciju, kao što je opisano, na primer, u SAD patentnim objavama br. 2005/0064474; 2006/0188987 i 2008/0131962.
[0197] Alternativno, nukleaze mogu biti sastavljene in vivo na cilјnom mestu nukleinske kiseline, upotrebom takozvane tehnologije „split-enzima” (pogledati, npr. SAD patentnu objavu br.
20090068164). Komponente takvih split enzima mogu biti eksprimirane ili na odvojenim ekspresionim konstruktima, ili one mogu biti povezane u jedan otvoreni okvir čitanja gde su pojedinačne komponente razdvojene, na primer, samocepajućim 2A peptidom ili IRES sekvencom. Komponente mogu biti pojedinačni domeni za vezivanje sa cinkanim prstima ili domeni iz domena za vezivanje nukleinskih kiselina meganukleaze.
Nukleaze sa cinkanim prstima
[0198] Himerni polipeptid može sadržavati po potrebi konstruisanu nukleazu sa cinkanim prstima (ZFN) koja može biti dizajnirana tako da isporuči ciljani dvolančani prekid u DNK specifičan za mesto, u koji se može integrisati egzogena nukleinska kiselina ili donorska DNK (pogledati, SAD patentnu objavu 2010/0257638). ZFN su himerni polipeptidi koji sadrže nespecifični domen cepanja iz restrikcione endonukleaze (na primer, FokI) i polipeptid domena koji vezuje DNK sa cinkanim prstima. Pogledati, npr. Huang i saradnici (1996) J. Protein Chem.15:481-9; Kim i saradnici (1997a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3616-20; Kim i saradnici (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-60; Kim i saradnici (1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:883-7; Kim i saradnici (1997b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12875-9; Kim i saradnici (1997c) Gene 203:43-9; Kim i saradnici (1998) Biol. Chem.379:489-95; Nahon i Raveh (1998) Nucleic Acids Res.26:1233-9; Smith i saradnici (1999) Nucleic Acids Res.27:674-81. ZFN mogu sadržavati nekanonske domene vezivanja DNK sa cinkanim prstima (pogledati, SAD patentnu objavu 2008/0182332). FokI restrikciona endonukleaza mora dimerizovati preko nukleaznog domena da bi došlo do cepanja DNK i da bi se uvelo dvolančani prekid. Posledično, ZFN koji sadrže nukleazni domen iz takve endonukleaze takođe zahtevaju dimerizaciju nukleaznog domena da bi došlo do cepanja cilјne DNK. Mani i saradnici (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 334:1191-7; Smith i saradnici (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-9. Dimerizacija ZFN može biti olakšana sa dva susedna, suprotno orijentisana mesta za vezivanje DNK. Id.
[0199] Postupak integracije specifične za mesto kojim se egzogena nukleinska kiselina ugrađuje u najmanje jedan CD 163 lokus domaćina može uklјučivati uvođenje ZFN u ćeliju domaćina, pri čemu ZFN prepoznaje i vezuje se za cilјnu nukleotidnu sekvencu, i pri čemu je cilјna nukleotidna sekvenca sadržana unutar najmanje jednog CD 163 lokusa domaćina. U određenim primerima, cilјna nukleotidna sekvenca nije sadržana u genomu domaćina na bilo kojoj drugoj poziciji osim u okviru najmanje jednog CD163 lokusa. Na primer, polipeptid ZFN koji vezuje DNK može biti konstruisan tako da prepozna i vezuje se za cilјnu nukleotidnu sekvencu identifikovanu unutar najmanje jednog CD163 lokusa (npr. sekvenciranjem CD163 lokusa). Postupak integracije specifične za mesto kojim se egzogena nukleinska kiselina ugrađuje u najmanje jedan CD163 lokus za izvođenje kod domaćina, obuhvata uvođenje ZFN u ćeliju domaćina, a može takođe sadržavati uvođenje u ćeliju egzogene nukleinske kiseline, pri čemu se rekombinacija egzogene nukleinske kiseline u nukleinsku kiselinu domaćina koja sadrži najmanje jedan CD 163 lokus olakšava prepoznavanjem specifičnim za mesto i vezivanjem ZFN za cilјnu sekvencu (i naknadnim cepanjem nukleinske kiseline koja sadrži CD163 lokus).
Opcione egzogene nukleinske kiseline za integraciju u CD163 lokus
[0200] Egzogene nukleinske kiseline za integraciju u CD163 lokus uklјučuju: egzogenu nukleinsku kiselinu za integraciju specifičnu za mesto, u najmanje jedan CD163 lokus, na primer i bez ograničenja, ORF; nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira endonukleazu sa ciljanim delovanjem; i vektor koji sadrži najmanje jedno ili oba od prethodno navedenih. Prema tome, određene nukleinske kiseline uključuju nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptid, strukturne nukleotidne sekvence i/ili mesta za prepoznavanje i vezivanje polipeptida koji se vezuju za DNK.
Opcioni molekuli egzogenih nukleinskih kiselina za integraciju specifičnu za mesto
[0201] Kao što je prethodno navedeno, obezbeđena je insercija egzogene sekvence (takođe označene kao „donorska sekvenca” ili „donor” ili „transgen”), na primer, radi ekspresije polipeptida, korekcije mutiranog gena ili radi povećanja ekspresije gena divljeg tipa. Biće očigledno da donorska sekvenca obično nije identična genomskoj sekvenci u kojoj je smeštena. Donorska sekvenca može sadržavati nehomolognu sekvencu okruženu sa dva regiona homologije, da bi se omogućila efikasna popravka usmerena homologijom (HDR) na lokaciji od interesa. Dodatno, donorske sekvence mogu sadržavati vektorski molekul koji sadrži sekvence koje nisu homologne regionu od interesa u ćelijskom hromatinu. Donorski molekul može sadržavati nekoliko isprekidanih regiona homologije sa ćelijskim hromatinom. Na primer, za cilјanu inserciju sekvenci koje nisu normalno prisutne u regionu od interesa, navedene sekvence mogu biti prisutne u molekulu donorske nukleinske kiseline i okružene regionima homologije sa sekvencom u regionu od interesa.
[0202] Donorski polinukleotid može biti DNK ili RNK, jednolančana ili dvolančana, a iste mogu biti uvedene u ćeliju u linearnom ili kružnom obliku. Pogledati, npr. SAD patentne objave br.
2010/0047805, 2011/0281361, 2011/0207221 i 2013/0326645. Ukoliko se uvode u linearnom obliku, krajevi donorske sekvence mogu biti zaštićeni (npr. od egzonukleolitičke degradacije) postupcima poznatim stručnjacima iz oblasti tehnike. Na primer, jedan ili više od didezoksinukleotidnih ostataka dodaje se na 3' kraj linearnog molekula i/ili se oligonukleotidi koji su komplementarni sami sebi vezuju za jedan ili oba kraja. Pogledati, na primer, Chang i saradnici (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls i saradnici (1996) Science 272:886-889. Dodatni postupci za zaštitu egzogenih polinukleotida od degradacije uklјučuju, ali nisu ograničene na, dodavanje terminalne amino grupe(a) i upotrebu modifikovanih internukleotidnih veza kao što su, na primer, fosforotioati, fosforamidati i ostaci O-metil riboze ili dezoksiriboze.
[0203] Polinukleotid može biti uveden u ćeliju kao deo vektorskog molekula koji ima dodatne sekvence kao što su, na primer, mesto početka replikacije, promotori i geni koji kodiraju rezistenciju na antibiotike. Štaviše, donorski polinukleotidi mogu biti uvedeni kao gola nukleinska kiselina, kao nukleinska kiselina u kompleksu sa agensom kao što je lipozom ili poloksamer, ili mogu biti isporučeni virusima (npr. adenovirusom, sa AAV, herpesvirusom, retrovirusom, lentivirusom i lentivirusom sa defektom u integrazi (IDLV)).
[0204] Donor je generalno integrisan tako da njegovu ekspresiju pokreće endogeni promotor na mestu integracije, odnosno promotor koji pokreće ekspresiju endogenog gena u koji je donor integrisan (npr. CD163). Međutim, biće očigledno da donor može sadržavati promotor i/ili pojačivač, na primer konstitutivni promotor ili inducibilni ili promotor specifičan za određeno tkivo.
[0205] Štaviše, iako nisu potrebne za ekspresiju, egzogene sekvence mogu takođe uklјučivati transkripcione ili translacione regulatorne sekvence, na primer, promotore, pojačivače, insulatore, interna mesta ulaska u ribozom, sekvence koje kodiraju 2A peptide i/ili poliadenilacione signale.
[0206] Egzogene nukleinske kiseline koje mogu biti integrisane na način specifičan za mesto u najmanje jedan CD 163 lokus, tako da se CD 163 lokus modifikuje, uklјučuju, na primer i bez ograničenja, nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid od interesa; nukleinske kiseline koje sadrže agronomski važan gen; nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira RNKi molekul; ili nukleinske kiseline koje remete strukturu CD 163 gena.
[0207] Egzogena nukleinska kiselina može biti integrisane u CD163 lokus tako da se modifikuje CD163 lokus, pri čemu nukleinska kiselina sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid od interesa, a tako da se nukleotidna sekvenca eksprimira u domaćinu sa CD163 lokusa. U pojedinim primerima, polipeptid od interesa (npr. strani protein) eksprimiran je sa nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid od interesa u komercijalnim količinama. U takvim primerima, polipeptid od interesa može biti ekstrahovan iz ćelije domaćina, tkiva ili biomase.
Molekuli nukleinskih kiselina koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira endonukleazu sa ciljanim delovanjem
[0208] Nukleotidna sekvenca koja kodira endonukleazu sa ciljanim delovanjem može biti konstruisana manipulacijom (npr. ligacijom) nativnih nukleotidnih sekvenci koje kodiraju polipeptide sadržane unutar endonukleazu sa ciljanim delovanjem. Na primer, nukleotidna sekvenca gena koji kodira protein koji sadrži polipeptid koji vezuje DNK, može biti pregledana da bi se identifikovala nukleotidna sekvenca gena koja odgovara polipeptidu koji vezuje DNK, a ta nukleotidna sekvenca može biti zatim upotrebljena kao element nukleotidne sekvence koja kodira endonukleazu sa ciljanim delovanjem i koja sadrži polipeptid koji vezuje DNK. Alternativno, aminokiselinska sekvenca endonukleaze sa ciljanim delovanjem može biti upotrebljena za dedukciju nukleotidne sekvence koja kodira endonukleazu sa ciljanim delovanjem, na primer, u skladu sa degeneracijom genetičkog koda.
[0209] U molekulima nukleinskih kiselina za primer koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira endonukleazu sa ciljanim delovanjem, poslednji kodon prve polinukleotidne sekvence koja kodira nukleazni polipeptid, i prvi kodon druge polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptid vezivanja za DNK, mogu biti razdvojeni bilo kojim brojem tripleta nukleotida, npr. bez kodiranja intronske sekvence ili „STOP” kodona. Slično navedenom, poslednji kodon nukleotidne sekvence koja kodira prvu polinukleotidnu sekvencu a koja kodira polipeptid koji vezuje DNK, i prvi kodon druge polinukleotidne sekvence koja kodira nukleazni polipeptid, mogu biti razdvojeni bilo kojim brojem nukleotidnih tripleta. Poslednji kodon (tj. onaj koji je najviše 3' u sekvenci nukleinske kiseline) prve polinukleotidne sekvence koja kodira nukleazni polipeptid i druge polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptid koji vezuje DNK, mogu biti fuzionisani tako da budu u fazi sa prvim kodonom dodatne kodirajuće sekvence polinukleotida koja je direktno uz njega, ili je od njega razdvojena samo kratkom peptidnom sekvencom, kao što je ona koju kodira sintetički nukleotidni linker (npr. nukleotidni linker koji je možda upotrebljen za postizanje fuzije). Primeri takvih dodatnih polinukleotidnih sekvenci uklјučuju, na primer i bez ograničenja, tagove, peptide sa ciljanim mestom i mesta enzimskog cepanja. Slično navedenom, prvi kodon koji je najviše 5' (u sekvenci nukleinske kiseline) u prvoj i drugoj polinukleotidnoj sekvenci može biti fuzionisan tako da bude u fazi sa poslednjim kodonom dodatne polinukleotidne kodirajuće sekvence koja je direktno uz njega, ili je od njega razdvojena samo kratkom peptidnom sekvencom.
[0210] Sekvenca koja razdvaja polinukleotidne sekvence koje kodiraju funkcionalne polipeptide u endonukleazi sa ciljanim delovanjem (npr. polipeptid koji vezuje DNK i nukleazni polipeptid) može se, na primer, sastojati od bilo koje sekvence pod uslovom da kodirana aminokiselinska sekvenca time sa velikom verovatnoćom ne menja značajno translaciju endonukleaze sa ciljanim delovanjem. Usled autonomne prirode poznatih nukleaznih polipeptida i poznatih polipeptida koji vezuju DNK, intervenišuće sekvence neće ometati odgovarajuće funkcije ovih struktura.
Drugi postupci za nokaut pristup
[0211] Razne druge tehnike koje su poznate u oblasti, mogu biti upotrebljene za inaktiviranje gena, da bi se napravile nokaut životinje i/ili da bi se uveli konstrukti nukleinskih kiselina u životinje i proizvele životinje osnivači, kao i napravile linije životinja koje su nokaut ili u kojima je konstrukt nukleinske kiseline integrisan u genom. Takve tehnike uklјučuju, bez ograničenja, mikroinjeciranje u pronukleus (U.S. Pat. No.4,873,191), transfer gena u germinativne linije posredovan retrovirusom (Van der Putten i saradnici (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82.6148-1652), ciljano delovanje na gene u embrionalnim matičnim ćelijama (Thompson i saradnici (1989) Cell 56, 313-321), elektroporaciju embriona (Lo (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814), transfer gena posredovan spermom (Lavitran i saradnici (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 14230-14235; Lavitran i saradnici (2006) Reprod. Fert. Develop.18, 19-23) i in vitro transformaciju somatskih ćelija, kao što su kumulusne ili mlečne ćelije dojke, ili adultne, fetalne ili embrionalne matične ćelije, nakon čega sledi nuklearna transplantacija (Wilmut i saradnici (1997) Nature 385, 810-813; i Wakayama i saradnici (1998) Nature 394, 369-374). Mikroinjeciranje u pronukleus, transfer gena posredovan čelijama sperme i nuklearni transfer iz somatskih ćelija su posebno korisne tehnike. Životinja koja je genomski modifikovana je životinja u kojoj sve od njenih ćelija imaju genetičku modifikaciju, uklјučujući njene germinativne ćelije. Kada se postupci upotrebljavaju tako da se proizvede životinja koja je mozaična u pogledu svoje genetičke modifikacije, životinja može biti inbred i potomstvo koje je genomski modifikovano može biti izdvojeno selekcijom. Kloniranje se, na primer, može upotrebljavati za pravljenje mozaične životinje ukoliko su njene ćelije modifikovane u stanju blastocista, ili se genomska modifikacija može odigrati kada se modifikuje jedna ćelija. Životinje koje su modifikovane tako da polno ne sazrevaju, mogu biti homozigotne ili heterozigotne za modifikaciju, u zavisnosti od specifičnog pristupa koji se upotrebljava. Ukoliko je određeni gen inaktiviran nokaut modifikacijom, normalno bi bila potrebna homozigotnost. Ukoliko je određeni gen inaktiviran interferencijom sa RNK ili dominantno negativnom strategijom, onda je heterozigotnost često adekvatna.
[0212] Uobičajeno je da se kod mikroinjeciranja embriona/zigota, konstrukt nukleinske kiseline ili iRNK uvode u oplođenu jajnu ćeliju; upotrebljavaju se oplođene jajne ćelije sa 1 ili 2 ćelije pošto je jedarna struktura koja sadrži genetički materijal iz glave ćelija sperme i jajne ćelije vidlјiva unutar protoplazme. Oplođene jajne ćelije u fazi pronukleusa se mogu dobiti in vitro ili in vivo (tj. mogu biti hirurški izvučene iz jajovoda životinja donora). In vitro oplođene jajne ćelije mogu biti proizvedene na sledeći način. Na primer, jajnici svinja mogu biti prikupljeni u klanici i održavani na 22-28°C tokom transporta. Jajnici zatim mogu biti oprani i izolovani radi aspiracije folikula, a folikuli opsega od 4-8 mm mogu biti aspirirani u konične epruvete za centrifugiranje od 50 mL upotrebom igala kalibra 18 i pod vakuumom. Folikularna tečnost i aspirirane oocite mogu dalje biti isprane kroz predfiltere sa komercijalnim TL-HEPES (Minitube, Verona, Wis.). Oocite okruženi kompaktnom kumulusnom masom mogu biti selektovane i stavljene u TCM-199 medijum za sazrevanje oocita (Minitube, Verona, Wis.) u koji je dodato 0,1 mg/mL cisteina, 10 ng/mL epidermalnog faktora rasta, 10% svinjske folikularne tečnosti, 50 µM 2-merkaptoetanola, 0,5 mg/ml cAMP, 10 IU/mL svakog od gonadotropina iz seruma trudnih kobila (PMSG) i humanog horionskog gonadotropina (hCG), tokom približno 22 sata u vlažnom vazduhu na 38,7°C i sa 5% CO2. Nakon toga, oocite mogu biti prebačene u svež TCM-199 medijum za sazrevanje, koji neće sadržavati cAMP, PMSG ili hCG i dalje biti inkubirane dodatna 22 sata. Zrele oocite mogu biti odvojene od svojih kumulusnih ćelija vorteksovanjem u 0,1% rastvoru hijaluronidaze tokom 1 minuta.
[0213] Za svinje, zrele oocite mogu biti oplođene u 500 µl Minitube PORCPRO IVF sistemu medijuma (Minitube, Verona, Wis.), u Minitube posudama za oplodnju sa 5 bunarića. U pripremi za in vitro oplodnju (IVF), sveže prikupljena ili smrznuta sperma svinja može biti oprana i resuspendovana u PORCPRO IVF medijumu do 400.000 ćelija sperme. Koncentracije ćelija sperme može biti analizirana komjuterskom analizom sperme (SPERMVISION, Minitube, Verona, Wis.). Konačna in vitro inseminacija može biti obavljena u zapremini od 10 µl sa finalnom koncentracijom od približno 40 pokretnih ćelija sperme/jajnoj ćeliji, u zavisnosti od nerasta. Sve oplođene oocite mogu biti inkubirane na 38,7°C u atmosferi sa 5,0% CO2tokom 6 sati. Šest sati nakon inseminacije, pretpostavlјeni zigoti mogu biti dva puta isprani u NCSU-23 i premešteni u 0,5 mL istog medijuma. Ovaj sistem može rutinski proizvesti 20-30% blastocista kod većine nerasta sa stopom polispermične oplodnje od 10-30%.
[0214] Linearizovani konstrukti nukleinskih kiselina ili iRNK mogu biti injecirani u jedan od pronukleusa ili u citoplazmu. Injecirane jajne ćelije mogu zatim biti prenete u ženku primaoca (npr. u jajovode ženke primaoca) i ostavljene da se razviju u ženki primaocu, da bi se proizvele transgene ili genski editovane životinje. Preciznije, in vitro oplođeni embrioni mogu biti centrifugirani na 15.000 x g tokom 5 minuta da se istaložili lipidi, što omogućava vizualizaciju pronukleusa. Embrioni dalje mogu biti injecirani upotrebom Eppendorf FEMTOJET injektora i mogu biti kultivisani do obrazovanja blastocista. Stope deljenja embriona i obrazovanje blastocista, kao i kvalitet mogu biti beleženi.
[0215] Embrioni mogu biti hirurški preneti u materice asinhronih primaoca. Uobičajeno je da 100-200 (npr. 150-200) embriona može biti deponovano u ampularno-istmički spoj jajovoda upotrebom TOMCAT<®>katetera od 5,5 inča. Nakon operacije može se uraditi ultrazvučni pregled trudnoće u realnom vremenu.
[0216] U transferu jedra iz somatske ćelije, transgena ili genski editovana ćelija kao što je embrionalna blastomera, fetalni fibroblast, fibroblast uha odrasle jedinke ili granulozna ćelija koje uključuju konstrukt nukleinske kiseline koji je prethodno opisan, može biti uvedena u oocit bez jedra (enukleisan) da bi se uspostavila kombinovana ćelija. Oocitima može biti uklonjeno jedro delimičnom disekcijom zona u blizini polarnog tela, a zatim istiskivanjem citoplazme u području disekcije. Uobičajeno je da se za injeciranje transgene ili genski editovane ćelije u enukleisanu oocitu koja je zaustavljena u mejozi 2 upotrebljava injekciona pipeta sa oštrim zakošenim vrhom. U pojedinim konvencijama, oocite zaustavlјene u mejozi 2 nazivaju se jajnim ćelijama. Nakon proizvodnje svinjskog ili goveđeg embriona (npr. fuzijom i aktiviranjem oocita), embrion se prenosi u jajovode ženke primaoca, oko 20 do 24 sata nakon aktivacije. Pogledati, na primer, Cibelli i saradnici (1998) Science 280, 1256-1258 i U.S. Pat. No. 6,548,741, 7,547,816, 7,989,657 ili 6,211,429. Kod svinja, ženke primaoci mogu biti proveravane u pogledu trudnoće približno 20-21 dan nakon transfera embriona.
[0217] Standardne tehnike ukršanja mogu biti upotrebljene za stvaranje životinja koje su homozigotne za inaktivirani gen od inicijalnih heterozigotnih životinja osnivača. Međutim, homozigotnost ne mora biti potrebna. Ovde opisane svinje sa editovanim genom mogu biti ukršane sa drugim svinjama od interesa.
[0218] Jednom kada su genski editovane životinje generisane, inaktivacija endogene nukleinske kiseline može biti procenjena upotrebom standardnih tehnika. Inicijalni skrining može biti obavljen Southern blot analizom, da bi se utvrdilo da li je došlo do inaktivacije ili ne. Za opis Southern analize, pogledajte odelјke 9.37-9.52 u Sambrook i saradnici, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, drugo izdanje, Cold Spring Harbor Press, Plainview; N.Y. Tehnike lančane reakcije polimeraze (PCR) takođe mogu biti upotrebljene u početnom skriningu. PCR se odnosi na proceduru ili tehniku u kojoj se cilјne nukleinske kiseline amplifikuju. U principu, informacije o sekvenci sa krajeva regiona od interesa ili dalјe od toga, koriste se za dizajniranje oligonukleotidnih prajmera koji su identični ili slični u sekvenci sa suprotnim lancima matrice koji će biti amlifikovana. PCR može biti upotrebljen za amplifikaciju specifičnih sekvenci iz DNK, kao i RNK, uklјučujući sekvence iz ukupne genomske DNK ili ukupne ćelijske RNK. Prajmeri su obično dužine od 14 do 40 nukleotida, ali mogu biti opsega od 10 nukleotida do stotinu nukleotida. PCR je opisan u, npr PCR Primer: A Laboratory Manual, ur. Dieffenbach i Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Nukleinske kiseline takođe mogu biti amplifikovane lančanom reakcijom ligaze, amplifikacijom sa premeštanjem lanca, samoodrživom replikacijom sekvence ili amplifikacijom na bazi sekvence nukleinske kiseline. Pogledati, na primer, Lewis (1992) Genetic Engineering News 12,1; Guatelli i saradnici (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874; i Weiss (1991) Science 254:1292. U fazi blastocista, embrioni mogu biti pojedinačno obrađeni za analizu sa PCR-om, Southern hibridizacijom i splinkeret PCR-om (pogledati, npr. Dupuy i saradnici, Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99:4495).
Interferirajuće RNK
[0219] Poznati su različiti interferirajući RNK (RNKi) sistemi. Dvolančana RNK (dsRNK) indukuje degradaciju homolognih genskih transkripata koje je specifično za sekvencu. Kompleks za utišavanje indukovan sa RNK (RISC) metaboliše dsRNK u male interferirajuće RNK (siRNK) od 21-23 nukleotida. RISC sadrži dvolančanu RNazu (dsRNazu, npr. Dicer) i ssRNazu (npr. Argonaut 2 ili Ago2). RISC koristi antisens lanac kao vodič za pronalaženje ciljnog mesta za cepanje. Poznate su i siRNK i mikroRNK (miRNK). Postupak inaktivacije gena u genetički editovanoj životinji obuhvata indukovanje interferencije RNK sa ciljnim genom i/ili nukleinskom kiselinom tako da se ekspresija cilјnog gena i/ili nukleinske kiseline smanjuje.
[0220] Na primer, sekvenca egzogene nukleinske kiseline može indukovati interferenciju RNK sa nukleinskom kiseline koja kodira polipeptid. Na primer, dvolančana mala interferirajuća RNK (siRNK) ili mala RNK za strukture ukosnice (shRNK) koje su homologne cilјnoj DNK, mogu biti upotrebljene za smanjenje ekspresije te DNK. Konstrukti za siRNK mogu biti proizvedeni kao što je opisano, na primer, u Fire i saradnici (1998) Nature 391:806; Romano i Masino (1992) Mol. Microbiol. 6:3343; Cogoni i saradnici (1996) EMBO J.15:3153; Cogoni i Masino (1999) Nature 399:166; Misquitta i Paterson (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1451; i Kennerdell i Carthew (1998) Cell 95:1017. Konstrukti za shRNK mogu biti proizvedeni kao što je opisano u McIntyre i Fanning (2006) BMC Biotechnology 6:1. U principu, shRNK se transkripcijom prepisuje kao jednolančani molekul RNK koji sadrži komplementarne regione i stoga se može upariti i obrazovati strukture kratkih ukosnica.
[0221] Verovatnoća pronalaženja jedne, pojedinačne funkcionalne siRNK ili miRNK usmerene na određeni gen je velika. Predvidlјivost specifične sekvence siRNK je, na primer, oko 50%, ali broj interferirajućih RNK može biti određen sa visokim stepenom poverenja da će će barem jedna od njih biti efektivna.
[0222] Mogu biti upotrebljene in vitro ćelije, in vivo ćelije ili genetički editovana životinja kao što je grlo stoke, koje eksprimiraju RNKi usmerenu na gen koji kodira CD163. RNKi mogu biti, na primer, izabrane iz grupe koju čine siRNK, shRNK, dsRNK, RISC i miRNK.
Inducibilni sistemi
[0223] Za inaktivaciju CD163 gena može biti upotrebljen i inducibilni sistem. Poznati su razni inducibilni sistemi koji omogućavaju prostornu i vremensku kontrolu inaktivacije gena. Za nekoliko je dokazano da su funkcionalni in vivo kod životinje svinja.
[0224] Primer inducibilnog sistema je tetraciklinski (tet)-on promotorski sistem, koji može biti upotrebljen za regulisanje transkripcije nukleinske kiseline. U ovom sistemu, mutirani Tet represor (TetR) je fuzionisan sa domenom aktivacije VP 16 transktivatorskog proteina herpes simpleks virusa, da bi se stvorio transkripcioni aktivator pod kontrolom tetraciklina (tTA), koji se reguliše sa tet ili doksiciklinom (dox). U odsustvu antibiotika, transkripcija je minimalna, dok se u prisustvu tet ili dox transkripcija indukuje. Alternativni inducibilni sistemi uklјučuju egdizonske ili rapamicinske sisteme. Egdizon je hormon presvlačenja insekata čiju proizvodnju kontrolišu heterodimer egdizonskog receptora i proizvod ultraspirakl gena (USP). Ekspresija se indukuje tretmanom sa egdizonom ili analogom egdizona kao što je muristeron A. Agens koji se daje životinji da bi se pokrenuo inducibilni sistem označava se kao indukcioni agens.
[0225] Tetraciklinski inducibilni sistem i Cre/loxP rekombinazni sistem (bilo konstitutivni ili inducibilni) među najčešće su upotrebljavanim inducibilnim sistemima. Tetraciklinski inducibilni sistem uklјučuje transaktivatora pod kontrolom tetraciklina (tTA)/reverzni tTA (rtTA). Postupak upotrebe ovih sistema in vivo uklјučuje generisanje dve linije genetički editovanih životinja. Jedna životinjska linija eksprimira aktivator (tTA, rtTA ili Cre rekombinaza) pod kontrolom odabranog promotora. Druga životinjska linija eksprimira akceptor, u kome je ekspresija gena od interesa (ili gena koji se modifikuje) pod kontrolom cilјne sekvence za tTA/rtTA transaktivatore (ili je okružena loxP sekvencama). Parenje dve životinje obezbeđuje kontrolu genske ekspresije.
[0226] Regulatorni sistemi zavisni od tetraciklina (tet sistemi) oslanjaju se na dve komponente, tj. na transaktivatora pod kontrolom tetraciklina (tTA ili rtTA) i promotor koji zavisi od tTA/rtTA i kontroliše ekspresiju nizvodne cDNK na način zavisan od tetraciklina. U odsustvu tetraciklina ili njegovih derivata (kao što je doksiciklin), tTA se vezuje za tetO sekvence, omogućavajući transkripcionu aktivaciju promotora zavisnog od tTA. Međutim, u prisustvu doksiciklina, tTA ne može stupiti u interakciju sa svojom ciljnim molekulom i ne dolazi do transkripcije. Tet sistem koji koristi tTA naziva se tet-OFF, pošto tetraciklin ili doksiciklin dozvolјavaju smanjenje transkripcije. Davanje tetraciklina ili njegovih derivata omogućava privremenu kontrolu ekspresije transgena in vivo. rtTA je varijanta tTA koja nije funkcionalna u odsustvu doksiciklina, ali zahteva prisustvo liganda za transaktivaciju. Ovaj tet sistem se stoga naziva tet-ON. Tet sistemi su upotrebljavani in vivo za inducibilnu ekspresiju nekoliko transgena, koji kodiraju, npr. reporterske gene, onkogene ili proteine uklјučene u signalnu kaskadu.
[0227] Cre/lox sistem koristi Cre rekombinazu, koja katalizuje rekombinaciju specifičnu za mesto ukrštanjem između dve udalјene sekvence za Cre prepoznavanja, tj. loxP mesta. DNK sekvenca uvedena između dve loxP sekvence (označena kao floksovana DNK) iseca se rekombinacijom posredovanom sa Cre. Kontrola Cre ekspresije u transgenoj i/ili genski editovanoj životinji, upotrebom bilo prostorne kontrole (sa promotorom specifičnim za tkivo ili ćeliju) ili vremenske kontrole (sa inducibilnim sistemom), rezultuje kontrolom isecanja DNK između dva loxP mesta. Jedna primena je za uslovnu inaktivaciju gena (uslovni nokaut). Drugi pristup je za prekomernu ekspresiju proteina, gde je floksovan stop kodon insertovan između promotorske sekvence i DNK od interesa. Genetički editovane životinje ne eksprimiraju transgen dok je eksprimiran Cre, što dovodi do isecanja floksovanog stop kodona. Ovaj sistem je primenjivan na tkivno-specifičnu onkogenezu i kontrolisanu ekspresiju antigenskog receptora u B limfocitima. Inducibilne Cre rekombinaze su takođe razvijane. Inducibilna Cre rekombinaza se aktivira samo davanjem egzogenog liganda. Inducibilne Cre rekombinaze su fuzioni proteini koji sadrže originalnu Cre rekombinazu i a omen koji vezuje ligand. Funkcionalna aktivnost Cre rekombinaze zavisi od spolјašnjeg liganda koji je u stanju da se veže za ovaj specifičan domen u fuzionom proteinu.
[0228] Mogu biti upotrebljene in vitro ćelije, in vivo ćelije ili genetički editovana životinja kao što je grlo stoke, koje sadrže CD163 gen pod kontrolom inducibilnog sistema. Genetička modifikacija životinje može biti genomska ili mozaična. Inducibilni sistem može biti, na primer, izabran iz grupe koju čine Tet-On, Tet-Off, Cre-lox i Hif1 alfa.
Vektori i nukleinske kiseline
[0229] Raznovrsne nukleinske kiseline mogu biti uvedene u ćelije u svrhu nokaut pristupa, radi inaktivacije gena, dobijanja ekspresije gena ili u druge svrhe. Kao što se ovde upotrebljava, termin nukleinska kiselina uklјučuje DNK, RNK i analoge nukleinskih kiselina, kao i nukleinske kiseline koje su dvolančane ili jednolančane (tj. sens ili antisens jednolančani lanci). Analozi nukleinskih kiselina mogu biti modifikovani u ostatku baze, ostatku šećera ili fosfatnoj okosnici, da bi se pobolјšala, na primer, stabilnost, hibridizacija ili rastvorlјivost nukleinske kiseline. Modifikacije ostatka baze uklјučuju dezoksiuridin za dezoksitimidin i 5-metil-2'-dezoksicitidin i 5-bromo-2'-doksicitidin za dezoksicitidin. Modifikacije ostatka šećera uklјučuju modifikaciju 2' hidroksilne grupe riboze šećera da bi se obrazovali 2'-O-metil ili 2'-O-alil šećeri. Dezoksiribozna fosfatna okosnica može biti modifikovana tako da proizvodi morfolino nukleinske kiseline, u kojima je svaki bazni ostatak povezan sa šestočlanim, morfolino prstenom ili peptidnim nukleinskim kiselinama, u kojima je dezoksifosfatna okosnica zamenjena pseudopeptidnom okosnicom, a četiri vrste baza su zadržane. Pogledati, Summerton i Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7(3):187; and Hyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chem.4:5. Pored toga, dezoksifosfatna okosnica može biti zamenjena, na primer, fosforotioatnom ili fosforoditioatnom okosnicom, fosforoamiditnom ili alkil fosfotriesterskom okosnicom.
[0230] Cilјna sekvenca nukleinske kiseline može biti operativno povezana sa regulatornim regionom kao što je promotor. Regulatorni regioni mogu biti regulatorni regioni svinja ili mogu biti iz drugih vrsta. Kao što se ovde upotrebljava, operativno povezan se odnosi na pozicioniranje regulatornog regiona u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline na način koji dozvolјava ili olakšava transkripciju cilјne nukleinske kiseline.
[0231] Bilo koji tip promotora može biti operativno povezan sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline. Primeri promotora uklјučuju, bez ograničenja, promotore specifične za tkivo, konstitutivne promotore, inducibilne promotore i promotore koji reaguju ili ne reaguju na određeni stimulus. Pogodni tkivno specifični promotori mogu dovesti do preferencijalne ekspresije transkripta nukleinske kiseline u beta ćelijama i uklјučuju, na primer, humani insulinski promotor. Drugi tkivno specifični promotori mogu dovesti do preferencijalne ekspresije u, na primer, hepatocitima ili srčanom tkivu, a mogu uklјučivati i promotore albumina ili teškog lanca alfa-miozina, tim redom. Može biti upotrebljen i promotor koji olakšava ekspresiju molekula nukleinske kiseline bez značajne tkivne ili vremenske specifičnosti (tj. konstitutivni promotor). Na primer, mogu biti upotrebljeni promotor beta aktina kao što je promotor gena za beta aktin kod pileta, ubikvitinski promotor, miniCAG promotor, promotor gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) ili promotor 3-fosfoglicerat kinaze (PGK), kao i virusni promotori kao što je promotor timidin kinaze (HSV-TK) herpes simpleks virusa, SV40 promotor ili promotor citomegalovirusa (CMV). Na primer, fuzija promotora gena za beta aktin pileta i CMV pojačivača može biti upotrebljena kao promotor. Pogledati, na primer, Xu i saradnici (2001) Hum. Gene Ther.12:563; i Kiwaki i saradnici (1996) Hum. Gene Ther.7:821.
[0232] Dodatni regulatorni regioni koji mogu biti korisni u konstruktima nukleinskih kiselina uklјučuju, ali nisu ograničeni na, poliadenilacione sekvence, sekvence za kontrolu translacije (npr. za interni ulazni segment ribozoma, IRES), pojačivače, inducibilne elemente ili introne. Takvi regulatorni regioni ne moraju biti neophodni, iako mogu povećati ekspresiju utičući na transkripciju, stabilnost iRNK, translacionu efikasnost ili slično. Takvi regulatorni regioni mogu biti uklјučeni u konstrukt nukleinske kiseline po želјi, da bi se dobila optimalna ekspresija nukleinskih kiselina u ćeliji(ama). Dovoljan nivo ekspresije može, međutim, ponekad biti dobijena bez takvih dodatnih elemenata.
[0233] Može biti upotrebljen i konstrukt nukleinske kiseline koji kodira signalne peptide ili selektivne markere. Signalni peptidi mogu biti upotrebljeni tako da se kodirani polipeptid usmeri na određenu ćelijsku lokaciju (npr. na ćelijsku površinu). Neograničavajući primeri selektivnih markera uklјučuju puromicin, ganciklovir, adenozin deaminazu (ADA), aminoglikozid fosfotransferazu (neo, G418, APH), dihidrofolat reduktazu (DHFR), higromicin-B-fosftransferazu, timidin kinazu (TK) i ksantin-guanin fosforiboziltransferazu (XGPRT). Takvi markeri su korisni za selekciju stabilnih transformanata u kulturi. Drugi selektivni markeri uklјučuju fluorescentne polipeptide, kao što su zeleni fluorescentni protein ili žuti fluorescentni protein.
[0234] Sekvenca koja kodira selektivni marker može biti okružena sekvencama prepoznavanja za rekombinazu kao što je, na primer, Cre ili Flp. Na primer, selektivni marker može biti okružen loxP mestima za prepoznavanje (mesta za prepoznavanje od 34-bp koje prepoznaje Cre rekombinaza) ili FRT mestima za prepoznavanje tako da selektivni marker može biti isečen iz konstrukta. Pogledati, Orban i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. (1992) 89:6861, za revijski pregled Cre/lox tehnologije, kao i Brand i Dymecki, Dev. Cell (2004) 6:7. Transpozon koji sadrži transgen koji se može aktivirati sa Cre- ili Flp, prekinut genom selektivnog markera, takođe može biti upotrebljen za dobijanje životinja sa uslovnom ekspresijom transgena. Na primer, ekspresija markera/transgena koju pokreće promotor, može biti ubikvitarna ili specifična za tkivo, što bi rezultovalo ubikvitarnom ili tkivno specifičnom ekspresijom markera kod F0 životinja (npr. svinja). Specifična aktivacija transgena u tkivu može biti postignuta, na primer, ukršanjem svinje koja ima ubikvitarnu ekspresiju transgena prekinutog markerom sa svinjom koja eksprimira Cre ili Flp na način koji je specifičan za tkivo, ili ukrštanjem svinje koja eksprimira transgen prekinut marker na način koji je specifičan za tkivo, sa svinjom koja ubikvitarno eksprimira Cre ili Flp rekombinazu. Kontrolisana ekspresija transgena ili kontrolisano isecanje marktera omogućava ekspresiju transgena.
[0235] Egzogena nukleinska kiselina može kodirati polipeptid. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid može uklјučivati tag sekvencu koja kodira „tag” dizajniran tako da se olakša naknadna manipulacija kodiranog polipeptida (npr. da bi se olakšala lokalizacija ili detekcija). Tag sekvence mogu biti insertovane u sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid tako da se kodirani tag nalazi bilo na karboksilnom ili amino kraju polipeptida. Neograničavajući primeri kodiranih tagova uklјučuju glutation S-transferazu (GST) i FLAG<™>tag (Kodak, New Haven, Conn).
[0236] Konstrukti nukleinskih kiselina mogu biti metilovani upotrebom SssI CpG metilaze (New England Biolabs, Ipswich, Mass.). U principu, konstrukt nukleinske kiseline može biti inkubiran sa S-adenozilmetioninom i SssI CpG-metilazom u puferu na 37°C. Hipermetilacija može biti potvrđena inkubiranjem konstrukta sa jednom jedinicom HinP1I endonukleaze tokom 1 sata na 37°C i analizom proizvoda elektroforezom u agaroznom gelu.
[0237] Konstrukti nukleinskih kiselina mogu biti uvedeni u ćelije embriona, fetusa ili odraslih životinja bilo kog tipa, uklјučujući, na primer, germinativne ćelije kao što su oocit ili jajna ćelija, progenitorske ćelije, adultne ili embrionalne matične ćelije, primordijalne germinativne ćelije, ćelija bubrega kao što je PK-15 ćelija, ćelija ostrvaca pankreasa, beta ćelija, ćelija jetre ili fibroblast kao što je dermalni fibroblast, upotrebom različitih tehnika. Neograničavajući primeri tehnika uklјučuju upotrebu sistema transpozona, rekombinantnih virusa koji mogu inficirati ćelije, ili lipozoma ili drugih nevirusnih postupaka kao što su elektroporacija, mikroinjeciranje ili precipitacija kalcijum fosfatom, koji su u stanju da isporuče nukleinske kiseline ćelijama.
[0238] U transpozonskim sistemima, transkripciona jedinica konstrukta nukleinske kiseline, tj. regulatorni region operativno povezan sa sekvencom egzogene nukleinske kiseline, okružena je invertovanim ponovcima transpozona. Nekoliko transpozonskih sistema, uklјučujući, na primer, Uspavanu lepoticu (pogledati U.S.Pat.No.6,613,752 i SAD objavu br. 2005/0003542); Princa žabu (Miskey i saradnici (2003) Nucleic Acids Res. 31:6873); Tol2 (Kawakami (2007) Genome Biology 8(Suppl.1): S7; Minos (Pavlopoulos i saradnici (2007) Genome Biology 8(Suppl.1):S2); Hsmar1 (Miskey i saradnici (2007)) Mol Cell Biol.27:4589); i Pasoš, razvijeni su za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije, uklјučujući ćelije miševa, lјudi i svinja. Transpozon Uspavana lepotica je posebno koristan. Transpozaza može biti isporučena kao protein, kodiran na istom konstruktu nukleinske kiseline kao i egzogena nukleinska kiselina, a može biti uvedena i u poseban konstrukt nukleinske kiseline ili biti obezbeđena kao iRNK (npr. transkribovana iRNK kojoj je dodata struktura kape in vitro).
[0239] Insulatorni elementi takođe mogu biti uklјučeni u konstrukt nukleinske kiseline da bi se održala ekspresija egzogene nukleinske kiseline i da bi se inhibirala neželјena transkripcija gena domaćina. Pogledati, na primer, SAD objavu br. 2004/0203158. Uobičajeno je da insulatorni element okružuje transkripcionu jedinicu sa svake strane i da se nalazi unutar invertovanih ponovaka transpozona. Neograničavajući primeri insulatornih elemenata uključuju insulatorne elemente tipa regiona vezivanja matriksa (MAR) i insulatorne elemente graničnog tipa. Pogledati, na primer, U.S. Pat. No.
6,395,549; 5,731,178; 6,100,448 i 5,610,053, kao i SAD objavu br.2004/0203158.
[0240] Nukleinske kiseline mogu biti ugrađene u vektore. Vektor je širok pojam koji uklјučuje bilo koji specifičan segment DNK dizajniran tako da se kreće od nosioca u cilјnu DNK. Vektor može biti označen kao ekspresioni vektor ili vektorski sistem, što je skup komponenti potrebnih za ostvarivanje insercije DNK u genom ili drugu ciljnu DNK sekvencu kao što je epizom, plazmid ili čak virusni/fagni DNK segment. Vektorski sistemi kao što su virusni vektori (npr. retrovirusni, adeno-asociranih virusa i integrišućih fagnih virusa) i vektori koji nisu virusni (npr. transpozoni) koji se upotrebljavaju za isporuku gena kod životinja, imaju dve osnovne komponente: 1) vektor koji se sastoji od DNK (ili RNK koja je reverzno transkribovana u cDNK) i 2) transpozaze, rekombinaze ili drugog enzima za integrisanje, koji prepoznaje i vektor i sekvencu ciljne DNK i insertuje vektor u cilјnu DNK sekvencu. Vektori najčešće sadrže jednu ili više ekspresionih kaseta koje sadrže jednu ili više sekvenci za kontrolu ekspresije, pri čemu je sekvenca za kontrolu ekspresije DNK zapravo sekvenca koja kontroliše i reguliše transkripciju i/ili translaciju druge DNK sekvence ili iRNK, tim redom.
[0241] Poznato je mnogo različitih tipova vektora. Na primer, poznati su plazmidi i virusni vektori, npr. retrovirusni vektori. Sisarski ekspresioni plazmidi obično imaju početak replikacije, pogodan promotor i opcioni pojačivač, neophodna mesta vezivanja za ribozom, poliadenilaciona mesta, mesta obrade za donora i akceptora, sekvence terminacije transkripcije i bočne netranskribujuće 5' sekvence. Primeri vektora uklјučuju: plazmide (koji takođe mogu biti nosioci druge vrste vektora), adenovirusne, vektore adeno-asociranih virusa (AAV), lentivirusne (npr. modifikovane HIV-1, SIV ili FIV), retrovirusne vektore (npr. ASV, ALV ili MoMLV) i transpozone (npr. Uspavanu lepoticu, P-elemente, Tol-2, Princa žabu, prase-Bac).
[0242] Kao što se ovde upotrebljava, termin nukleinska kiselina odnosi se i na RNK i na DNK, uklјučujući, na primer, cDNK, genomsku DNK, sintetičku (npr. hemijski sintetisanu) DNK, kao i nukleinske kiseline koje se javljaju u prirodi i one koje su hemijski modifikovane, npr. sa sintetičkim bazama ili alternativnim okosnicama. Molekul nukleinske kiseline može biti dvolančan ili jednolančan (tj. sens ili antisens jednolančani molekul).
Životinje osnivači, životinjske linije, osobine i reprodukcija
[0243] Životinje osnivači mogu biti proizvedene kloniranjem i drugim postupcima koji su ovde opisani. Osnivači mogu biti homozigotni za genetičku modifikaciju, kao u slučaju kada se zigot ili primarna ćelija podvrgavaju homozigotnoj modifikaciji. Slično navedenom, osnivači takođe mogu biti heterozigotni. U slučaju životinja koje sadrže najmanje jednu modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD 163, osnivači su poželјno heterozigotni. Osnivači mogu biti genomski modifikovani, što označava da su sve ćelije u njihovom genomu podvrgnute modifikaciji. Osnivači mogu biti i mozaični za modifikaciju, što se može dogoditi kada se vektori uvedu u jednu od mnoštva ćelija u embrionu, obično u fazi blastocista. Potomstvo mozaičnih životinja može biti dalje ispitano, da bi se identifikovalo potomstvo koje je genomski modifikovano. Linija životinja je uspostavljena kada je stvorena grupa životinja koja se može reprodukovati polnim putem ili upotrebom tehnika potpomognute reprodukcije, sa heterogenim ili homozigotnim potomstvom koje dosledno eksprimira modifikaciju.
[0244] U stočarstvu je poznato da su mnogi aleli povezani sa različitim osobinama kao što su proizvodne osobine, osobine vrste, osobine obradivosti i druge funkcionalne osobine. Stručnjaci su naviknuti da prate i kvantifikuju ove osobine, npr. Visscher i saradnici, Livestock Production Science, 40 (1994) 123-137, U.S. Pat. No.7,709,206, US 2001/0016315, US 2011/0023140 i US 2005/0153317. Životinjska linija može uklјučivati osobinu izabranu od osobine u grupi koja se sastoji od proizvodne osobine, osobine vrste, osobine obradivosti, osobine plodnosti, osobine majčinstva i osobine rezistencije na bolesti. Dalјe osobine uklјučuju ekspresiju rekombinantnog genskog proizvoda.
[0245] Životinje sa želјenom osobinom ili osobinama mogu biti modifikovane tako da se sprečilo njihovo polno sazrevanje. Pošto su životinje sterilne do sazrevanja, moguće je regulisati polnu zrelost i na taj način kontrolisati diseminaciju životinja. Životinje koje su bile uzgajane ili modifikovane tako da imaju jednu ili više osobina, mogu stoga biti obezbeđene primaocima tako da bude smanjen rizik da će primaoci ukrštati životinje i time prisvojiti vrednost osobina sebima sebi. Na primer, genom životinje može biti genetički modifikovan, gde modifikacija obuhvata inaktivaciju gena za polno sazrevanje, pri čemu gen za polno sazrevanje kod životinje divlјeg tipa eksprimira faktor selektivan za polno sazrevanje. Životinja može biti tretirana davanjem jedinjenja za otklanjanje nedostatka prouzrokovanog gubitkom ekspresije gena, da bi se indukovalo polno sazrevanje kod životinje.
[0246] Uzgoj životinja kojima je potrebno davanje jedinjenja da bi se indukovala polna zrelost, može biti obavljeno u objektu za tretiranje, što je prednost. Objekat za tretiranje može primenjivati standardizovane protokole na dobro kontrolisanom uzorku, da bi se efikasno proizvodile konzistentne životinje. Potomstvo životinja može biti distribuirano na mnotvo lokacija za uzgoj. Farme i farmeri (termin koji uklјučuje i ranč i rančere) mogu stoga naručiti želјeni broj potomstva sa specifičo navedenim rasponom starosti i/ili težine i/ili osobina i zatim dobiti datu isporuku u želјeno vreme i/ili na željenoj lokaciju. Primaoci, npr. farmeri, mogu zatim uzgajati životinje i isporučivati ih na tržište po želјi.
[0247] Genetički modifikovano grlo stoke koje ima inaktiviran gen za polno sazrevanje može biti isporučeno (npr. na jednu ili više lokacija, na mnoštvo farmi). Životinje mogu biti starosti između oko 1 dana i oko 180 dana. Životinja može imati jednu ili više osobina (na primer, eksprimirati želјenu osobinu ili osobinu visoke vrednosti ili novu osobinu ili rekombinantnu osobinu).
Postupci uzgoja i postupci za povećanje rezistencije životinje na infekciju i populacije životinja
[0248] Ovde je opisan postupak uzgoja za stvaranje životinja ili loza koje imaju smanjenu podložnost na infekciju patogenom. Postupak obuhvata genetičko modifikovanje oocita ili ćelije sperme, da bi se uvela modifikovana hromozomska sekvenca u gen koji kodira protein CD 163, u najmanje jednu od oocita i ćelija sperme, a zatim oplodnju oocita sa ćelijom sperme, da bi se stvorila oplođena jajna ćelija koja sadrži modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. Alternativno, postupak obuhvata genetičku modifikaciju oplođene jajne ćelije, da bi se u oplođeno jaje uvela modifikovana hromozomska sekvenca u gen koji kodira protein CD163. Postupak dalјe obuhvata prenos oplođene jajne ćelije u surogat ženku, gde trudnoća i porođaj u terminu proizvode životinju potomka; skrining navedene životinje potomka u pogledu podložnosti na patogen; i selekciju životinja potomaka koje imaju smanjenu podložnost na patogen u poređenju sa životinjama koje ne sadrže modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163.
[0249] Opisan je još jedan postupak uzgoja za stvaranje životinja ili loza koje imaju smanjenu podložnost na infekciju patogenom. Postupak obuhvata genetičko modifikovanje oocita ili ćelije sperme, da bi se uvela modifikovana hromozomska sekvenca u gen koji kodira protein CD 163 u najmanje jednu od oocita i ćelija sperme, a zatim oplodnju oocita sa ćelijom sperme, da bi se stvorila oplođena jajna ćelija koja sadrži modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. Alternativno, postupak obuhvata genetičku modifikaciju oplođene jajne ćelije, da bi se u oplođeno jaje uvela modifikovana hromozomska sekvenca u gen koji kodira protein CD163. Postupak dalјe obuhvata prenos oplođene jajne ćelije u surogat ženku, gde trudnoća i porođaj u terminu proizvode životinju potomka; skrining navedene životinje potomka u pogledu podložnosti na patogen; i selekciju životinja potomaka koje imaju smanjenu podložnost na patogen u poređenju sa životinjama koje ne sadrže modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. Modifikovana hromozomska sekvenca rezultuje proizvodnjom suštinski nefunkcionalnog proteina CD163 od strane životinje potomka.
[0250] Opisan je još jedan postupak uzgoja za stvaranje životinja ili loza koje imaju smanjenu podložnost na infekciju patogenom. Postupak obuhvata genetičko modifikovanje oocita ili ćelije sperme, da bi se uvela modifikovana hromozomska sekvenca u gen koji kodira protein CD 163 u najmanje jednu od oocita i ćelija sperme, a zatim oplodnju oocita sa ćelijom sperme, da bi se stvorila oplođena jajna ćelija koja sadrži modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. Alternativno, postupak obuhvata genetičku modifikaciju oplođene jajne ćelije, da bi se u oplođeno jaje uvela modifikovana hromozomska sekvenca u gen koji kodira protein CD163. Postupak dalјe obuhvata prenos oplođene jajne ćelije u surogat ženku, gde trudnoća i porođaj u terminu proizvode životinju potomka; skrining navedene životinje potomka u pogledu podložnosti na patogen; i selekciju životinja potomaka koje imaju smanjenu podložnost na patogen u poređenju sa životinjama koje ne sadrže modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. Modifikovana hromozomska sekvenca sadrži deleciju koja ne menja okvir čitanja u genu koji kodira protein CD163.
[0251] Patogen poželјno obuhvata virus, npr. PRRSV.
[0252] Na primer, modifikacija može smanjiti podložnost na PRRSV virus tipa 1, PRRSV tipa 2 ili na PRRSV viruse i tipa 1 i tipa 2.
[0253] Modifikacija može smanjiti podložnost na izolat PRRSV izabran iz grupe koju čine NVSL 97-7895, KS06-72109, P129, VR2332, CO90, AZ25, MLV-ResPRRS, KS62-06274, KS483 (SD23983), CO84, SD13-15, Lelistad, 03-1059, 03-1060, SD01-08, 4353PZ i njihove kombinacije.
[0254] Životinja može biti embrion, mlada ili odrasla jedinka.
[0255] Životinja može obuhvatati pripitomlјenu životinju. Pripitomeljena životinja može uklјučivati grlo stoke, na primer, životinju svinje, goveče (npr. krave ili muzna goveda), ovce, koze, kopitare (npr.
konja ili magarca), bivole, kamile ili živinu (npr. kokošku, ćurku, patku, gusku, biserku ili domaćeg goluba). Grlo stoke je poželјno goveče ili životinja svinje, a najpoželјnije je životinja svinje.
[0256] Korak genetičke modifikacije oocita, ćelije sperme ili oplođene jajne ćelije može obuhvatati genetičko editovanje oocita, ćelije sperme ili oplođene jajne ćelije. Genetičko editovanje može uklјučivati upotrebu endonukleaze. „Homing” endonukleaza može biti endonukleaza koja se javlјa u prirodi, ali je poželјno racionalno dizajnirana endonukleaza koja se ne javlja u prirodi i ima sekvencu prepoznavanja DNK koja je dizajnirana tako da endonukleaza cilјano deluje na hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. Prema tome, „homing” endonukleaza može biti dizajnirana „homing” endonukleaza. „Homing” endonukleaza može obuhvatati, na primer, sistem grupisanih kratkih palindromskih ponovaka na jednakim rastojanjima (CRISPR)/Cas, efektornu nukleazu nalik aktivatoru transkripcije (TALEN), nukleazu sa cinkanim prstima (ZFN), rekombinazni fuzioni protein, meganukleazu ili njihovu kombinaciju). Genetičko editovanje poželјno uklјučuje upotrebu CRISPR/Cas9 sistema.
[0257] Oocit, ćelija sperme ili oplođena jajna ćelija mogu biti heterozigotni za modifikovanu hromozomsku sekvencu. Alternativno, oocit, ćelija sperme ili oplođena jajna ćelija mogu biti homozigotni za modifikovanu hromozomsku sekvencu.
[0258] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati inserciju u genu koji kodira protein CD 163, deleciju u genu koji kodira protein CD 163 ili njihovu kombinaciju. Na primer, modifikovana hromozomska sekvenca sadrži deleciju u genu koji kodira protein CD163 (npr. deleciju koja ne menja okvir čitanja). Alternativno, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati inserciju u genu koji kodira protein CD163.
[0259] Insercija ili delecija mogu prouzrokovati smanjenje proizvodnje ili aktivnosti proteina CD163, u poređenju sa proizvodnjom ili aktivnošću proteina CD163 kod životinje kojoj nedostaju insercija ili delecija.
[0260] Insercija ili delecija mogu rezultovati proizvodnjom suštinski nefunkcionalnog proteina CD163 od strane životinje. Pod „suštinski nefunkcionalnim proteinom CD163”, podrazumeva se da nivo proteina CD163 u životinji, potomstvu ili ćeliji nije moguće detektovati, ili ukoliko se može detektovati, on je najmanje oko 90% niži od nivoa koji se može zapaziti kod životinje, potomstva ili ćelije koji ne sadrže inserciju ili deleciju.
[0261] Kada je životinja zapravo životinja svinje, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati modifikaciju u egzonu 7 gena koji kodira protein CD 163, egzonu 8 gena koji kodira protein CD163, intronu koji je susedan egzonu 7 ili egzonu 8 gena koji kodira protein CD163, ili njihovu kombinaciju. Pogodno je da modifikovana hromozomska sekvenca sadrži modifikaciju u egzonu 7 gena koji kodira protein CD 163.
[0262] Modifikacija u egzonu 7 gena koji kodira protein CD 163 može obuhvatati deleciju (npr. deleciju koja ne menja okvir čitanja u egzonu 7). Alternativno, modifikacija u egzonu 7 gena koji kodira protein CD163 može obuhvatati inserciju.
[0263] Kada je životinja zapravo životinja svinje, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati: (a) SEQ ID NO: 118; ili (b) modifikaciju izabranu iz grupe koju čine: delecija 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; insercija 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 na istom alelu; delecija 124 bazna para od nukleotida 3.024 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 123 bazna para od nukleotida 3.024 do nukleotida 3.146 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; insercija 1 baznog para između nukleotida 3.147 i 3.148 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 130 baznih parova od nukleotida 3.030 do nukleotida 3.159 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 132 bazna para od nukleotida 3.030 do nukleotida 3.161 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1506 baznih parova od nukleotida 1.525 do nukleotida 3.030 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; insercija 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1280 baznih parova od nukleotida 2.818 do nukleotida 4.097 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1373 bazna para od nukleotida 2.724 do nukleotida 4.096 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 28 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1387 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 4.531 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1382 bazna para od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113; delecija 1720 baznih parova od nukleotida 2.440 do nukleotida 4.160 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 452 bazna para od nukleotida 3.015 do nukleotida 3.466 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; ili njihove kombinacije.
[0264] Kada životinja svinje sadrži inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, insercija od 2 bazna para može uklјučivati insercija dinukleotida AG.
[0265] Kada životinja svinje sadrži inserciju 1 baznog para između nukleotida 3.147 i 3.148 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, insercija 1 baznog para može uklјučivati insercija jednog adeninskog ostatka.
[0266] Kada životinja svinje sadrži inserciju 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, insercija od 7 baznih parova može sadržavati sekvencu TACTACT (SEQ ID NO: 115).
[0267] Kada životinja svinje sadrži deleciju 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, insercija od 12 baznih parova može sadržavati sekvencu TGTGGAGAATTC (SEQ ID NO: 116).
[0268] Kada životinja svinje sadrži deleciju 1382 bazna para od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113, insercija od 11 baznih parova može sadržavati sekvencu AGCCAGCGTGC (SEQ ID NO: 117).
[0269] Kada modifikovana hromozomska sekvenca u genu koji kodira protein CD163 sadrži deleciju, delecija poželјno obuhvata deleciju koje ne menjaju okvir čitanja. Shodno tome, kada je životinja zapravo životinja svinje, insercija ili delecija u genu koji kodira protein CD163 može obuhvatati deleciju koja ne menja okvir čitanja u egzonu 7 izabranu iz grupe koju čine delecija 1506 baznih parova od nukleotida 1.525 do nukleotida 3.030 u poređenju na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 47; delecija 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1373 bazna para od nukleotida 2.724 do nukleotida 4.096 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 123 bazna para od nukleotida 3.024 do nukleotida 3.146 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1387 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 4.531 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 1382 bazna para od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113; delecija 1720 baznih parova od nukleotida 2.440 do nukleotida 4.160 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; i njihove kombinacije.
[0270] Kada je životinja svinja, insercija ili delecija mogu biti izabrane iz grupe koju čine: insercija 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 na istom alelu; delecija 28 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; delecija 452 bazna para od nukleotida 3.015 do nukleotida 3.466 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; i njihove kombinacije.
[0271] Na primer, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 na istom alelu.
[0272] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 28 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0273] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 452 bazna para od nukleotida 3.015 do nukleotida 3.466 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
[0274] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati bilo koju kombinaciju bilo koje od modifikovanih hromozomskih sekvenci koje su ovde opisane.
[0275] Na primer, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati inserciju 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0276] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati inserciju 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i deleciju 1382 bazna para od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0277] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati SEQ ID NO: 118 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0278] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati SEQ ID NO: 118 u jednom alelu gena koji kodira protein CD 163; i inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0279] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 1280 baznih parova od nukleotida 2.818 do nukleotida 4.097 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD 163; i deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0280] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 1280 baznih parova od nukleotida 2.818 do nukleotida 4.097 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0281] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0282] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati SEQ ID NO: 118 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i deleciju 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD163.
[0283] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD163.
[0284] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0285] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD 163; i deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0286] Modifikovana hromozomska sekvenca koja sadrži bilo koju od prethodno opisanih insercija ili delecija može sadržavati hromozomsku sekvencu koja ima visok stepen identičnosti sa SEQ ID NO: 47 izvan insercije ili delecije. Tako, na primer, oocita, ćelija sperme ili oplođena jajna ćelija mogu sadržavati hromozomsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,9% ili 100% identična SEQ ID NO: 47 u regionima hromozomske sekvence izvan insercije ili delecije.
[0287] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati hromozomsku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 118 ili 119. Kao što je dalјe opisano u Primerima u nastavku teksta, SEQ ID NO. 98-114 i 119 obezbeđuju nukleotidne sekvence za region koji odgovara regionu CD163 svinje divlјeg tipa datog u SEQ ID NO:47 i uklјučuju insercije ili delecije u hromozomskoj sekvenci CD163 svinje koje su ovde opisane. SEQ ID NO: 118 obezbeđuje sekvencu za region koji odgovara regionu iz CD163 svinje divlјeg tipa koji je naveden u SEQ ID NO: 47, pri čemu je egzon 7 zamenjen sintetisanim egzonom koji kodira homologa SRCR 8 iz humanog proteina sličnog CD163 tipa 1 (hCD163L1).
[0288] Na primer, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati hromozomsku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 98, 101, 105, 109, 110, 112, 113 ili 114. SEQ ID NO: 98, 101, 105, 109, 110, 112, 113 ili 114 obezbeđuju nukleotidne sekvence za delecije koje ne menjaju okvir čitanja u egzonu 7 hromozomske sekvence CD163 svinje.
[0289] Kao drugi primer, modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati hromozomsku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 103, 111 ili 119.
[0290] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 11 baznih parova u jednom alelu gena koji kodira protein CD163 i inserciju 2 bazna para sa delecijom 377 baznih parova u drugom alelu gena koji kodira protein CD163.
[0291] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 124 bazna para u jednom alelu gena koji kodira protein CD163 i deleciju 123 bazna para u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0292] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati inserciju 1 baznog para.
[0293] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 130 baznih parova u jednom alelu gena koji kodira protein CD163 i deleciju 132 bazna para u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0294] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju od 1506 baznih parova.
[0295] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati inserciju 7 baznih parova.
[0296] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 1280 baznih parova u jednom alelu gena koji kodira protein CD163 i deleciju 1373 bazna para u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0297] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju od 1467 baznih parova.
[0298] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 1930 baznih parova introna 6 od nukleotida 488 do nukleotida 2.417, sa insercijom od 12 baznih parova na nukleotidu 4.488 i deleciju dodatnih 129 baznih parova u egzonu 7.
[0299] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 28 baznih parova u jednom alelu gena koji kodira protein CD163 i deleciju 1387 baznih parova u drugom alelu gena koji kodira protein CD 163.
[0300] Modifikovana hromozomska sekvenca može sadržavati deleciju 1382 bazna para sa insercijom 11 baznih parova u jednom alelu gena koji kodira protein CD 163 i deleciju 1720 baznih parova u drugom alelu gena koji kodira protein CD163.
[0301] U bilo kom od postupaka uzgoja, selektovana životinja može biti upotrebljeni kao životinja osnivač.
[0302] U bilo kom od postupaka uzgoja, oplodnja može obuhvatati veštačku inseminaciju.
[0303] Obezbeđena je takođe populacija životinja napravlјenih bilo kojim od postupaka uzgoja. Populacija životinja je poželјno rezistena na infekciju patogenom, na primer sa virusom kao što je PRRSV. Na primer, populacija može biti rezistena na infekciju PRRSV virusom tipa 1, PRRSV tipa 2 ili PRRSV virusima tipa 1 i tipa 2. Populacija može biti rezistena na infekciju izolatom PRRSV izabranim iz grupe koju čine NVSL 97-7895, KS06-72109, P129, VR2332, CO90, AZ25, MLV-ResPRRS, KS62-06274, KS483 (SD23983), CO84, SD13-15, Lelistad, 03-1059, 03-1060, SD01-08, 4353PZ i njihove kombinacije.
[0304] Opisan je takođe postupak za povećanje rezistencije grla stoke na infekciju sa patogenom. Postupak obuhvata genetičko editovanje najmanje jedne hromozomske sekvence iz gena koji kodira protein CD163 tako da je smanjena proizvodnja ili aktivnost proteina CD163, u poređenju sa proizvodnjom ili aktivnošću proteina CD63 kod grla stoke koje ne sadrži editovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. Poželјno je da patogen obuhvata virus (npr. PRRSV).
[0305] Opisan je još jedan postupak za povećanje rezistencije grla stoke na infekciju sa patogenom koji obuhvata. Postupak obuhvata genetičko editovanje najmanje jedne hromozomske sekvence iz gena koji kodira protein CD 163 tako da grlo stoke proizvodi suštinski nefunkcionalan protein CD163.
[0306] Opisan je još jedan postupak povećanja rezistencije grla stoke na infekciju patogenom. Postupak obuhvata genetičko editovanje najmanje jedne hromozomske sekvence iz gena koji kodira protein CD163, da bi se uvela delecija koje ne menjaju okvir čitanja, pri čemu su proizvodnja ili aktivnost proteina CD163 smanjeni kod grla stoke, u poređenju sa proizvodnjom ili aktivnošću proteina CD63 kod grla stoke koje ne sadrži editovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163. Delecija koja ne menja okvir čitanja može biti, na primer, bilo koja od ovde opisanih delecija koje ne menjaju okvir čitanja.
Nukleinske kiseline
[0307] Opisane su i nukleinske kiseline. Molekul nukleinske kiseline može sadržavati nukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine: (a) nukleotidna sekvenca koja sadrži SEQ ID NO: 47; (b) nukleotidna sekvenca koja je najmanje 80% identična sekvenci SEQ ID NO: 47, pri čemu navedena nukleotidna sekvenca sadrži najmanje jednu supstituciju, inserciju ili deleciju u odnosu na SEQ ID NO: 47; i (c) cDNK sekvencu (a) ili (b).
[0308] Alternativno, nukleinska kiselina može sadržavati (a) nukleotidnu sekvenca koja je najmanje 87,5% identična sekvenci SEQ ID NO: 47, pri čemu navedena nukleotidna sekvenca sadrži najmanje jednu supstituciju, inserciju ili deleciju u odnosu na SEQ ID NO: 47; i (b) cDNK sekvencu (a).
[0309] Bilo koji od molekula nukleinskih kiselina koji su ovde opisani mogu biti izolovani molekuli nukleinskih kiselina.
[0310] Na primer, izolovana nukleinska kiselina može sadržavati nukleotidnu sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 47.
[0311] Alternativno, nukleinska kiselina može sadržavati nukleotidnu sekvenca koja je najmanje 80% identična sekvenci SEQ ID NO: 47, pri čemu navedena nukleotidna sekvenca sadrži najmanje jednu supstituciju, inserciju ili deleciju u odnosu na SEQ ID NO: 47. Nukleinska kiselina može sadržavati nukleotidnu sekvenca koja je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99% ili najmanje 99,9% identična sekvenci SEQ ID NO: 47, pri čemu navedena nukleotidna sekvenca sadrži najmanje jednu supstituciju, inserciju ili deleciju u odnosu na SEQ ID NO: 47.
[0312] Molekul nukleinske kiseline je poželјno najmanje 87,5% identičan sekvenci SEQ ID NO: 47, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži najmanje jednu supstituciju, inserciju ili deleciju u odnosu na SEQ ID NO: 47.
[0313] Supstitucija, insercija ili delecija poželјno redukuju ili eliminišu proizvodnju ili aktivnost proteina CD163, u poređenju sa nukleinskom kiselinom koja ne sadrži supstituciju, insercija ili deleciju.
[0314] Nukleinska kiselina može sadržavati SEQ ID NO: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 118 ili 119.
[0315] Na primer, nukleinska kiselina može sadržavati SEQ ID NO: 98, 101, 105, 109, 110, 112, 113 ili 114.
[0316] Na primer, nukleinska kiselina može sadržavati SEQ ID NO: 103, 111 ili 119.
[0317] Nukleinska kiselina može sadržavati cDNK.
[0318] Obezbeđene su i dodatne nukleinske kiseline. Nukleinska kiselina može sadržavati SEQ ID NO: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 118 ilii 119. Na primer. nukleinska kiselina može sadržavati SEQ ID NO: 98, 101, 105, 109, 110, 112, 113 ili 114. Kao drugi primer, nukleinska kiselina može sadržavati SEQ ID NO: 103, 111 ili 119.
[0319] Obim pronalaska je kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima.
PRIMERI
[0320] Neograničavajući primeri koji slede obezbeđeni su kao dodatna ilustracija predmetnog pronalaska.
Primer 1: Upotreba CRISPR/Cas9 sistema za proizvodnju genetički modifikovanih svinja iz oocita i embriona dobijenih in vitro
[0321] Nedavno objavljeni izveštaji opisuju „homing” endonukleaze, kao što su nukleaze sa cinkanim prstima (ZFN), efektorne nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN) i komponente u sistemu grupisanih kratkih palindromskih ponovaka na jednakim rastojanjima (CRISPR)/CRISPR-asociranog (Cas9), i ukazuju da bi genetički inženjering (GE) kod svinja sada mogao biti efikasniji. „Homing”endonukleaze sa ciljanim delovanjem mogu indukovati dvolančane prekide (DSB) na specifičnim lokacijama u genomu i prouzrokovati bilo nasumične mutacije kroz nehomologna spajanja krajeva (NHEJ) ili stimulaciju homologne rekombinacije (HR), ukoliko je obezbeđena donorska DNK. Cilјana modifikacija genoma putem HR može biti postignuta sa „homing” endonukleazama, ukoliko je donorska DNK obezbeđena zajedno sa nukleazom za ciljano delovanje. Nakon uvođenja specifičnih modifikacija u somatske ćelije, ove ćelije su bile upotrebljene za proizvodnju GE svinja u različite svrhe putem SCNT. Prema tome, „homing” endonukleaze su korisno sredstvo u generisanju GE svinja. Među različitim „homing” endonukleazama, CRISPR/Cas9 sistem prilagođen iz prokariota, gde se upotrebljava kao odbrambeni mehanizam, delovao je kao efektivan pristup. U prirodi, Cas9 sistem zahteva tri komponente, RNK (~20 baza) koja sadrži region komplementaran cilјnoj sekvenci (cisreprimirajuća RNK [crRNK]), RNK koja sadrži region komplementaran crRNK (trans-aktivirajuća crRNK [tracrRNK]) i Cas9, kao enzimsku proteinsku komponentu u ovom kompleksu. Može biti konstruisana jedna RNK vodič (gRNK) koja služi ulozi uparivanja baza crRNK i tracrRNK. Kompleks gRNK/protein može skenirati genom i katalizovati DSB u regionima koji su komplementarni sa crRNK/gRNK. Za razliku od drugih dizajniranih nukleaza, potrebno je da bude dizajniran samo kratak oligomer da bi se konstruisali reagensi potrebni za ciljano delovanje na gen od interesa, dok je za udruživanje ZFN i TALEN potrebna serija koraka kloniranja.
[0322] Za razliku od standardnih postupaka koji se trenutno koriste za remećenje strukture gena, upotreba dizajniranih nukleaza nudi mogućnost upotrebe zigota kao polaznog materijala za GE. Standardni postupci za remećenje strukture gena kod stoke uklјučuju HR u kultivisanim ćelijama i naknadnu rekonstrukciju embriona transferom jedra iz somatskih ćelija (SCNT). Pošto klonirane životinje proizvedene putem SCNT ponekad pokazuju znake defekata tokom razvića, potomstvo SCNT/GE osnivača se obično upotrebljava za istraživanja, da bi se izbegle ometajuće SCNT anomalije i fenotip do kojih bi moglo doći ukoliko se životinje osnivači upotrebljavaju za eksperimente. Uzimajući u obzir duži period gestacije i veće troškove gajenja svinja u poređenju sa glodarima, postoje i prednosti smanjenja potrebe za uzgojem u kontekstu vremena i troškova. Nedavno objavljeni izveštaj je pokazao i da direktno injeciranje ZFN i TALEN u zigote svinja može poremetiti endogeni gen i proizvesti prasad sa želјenim mutacijama. Ipak, samo oko 10% prasadi je pokazalo bialelnu modifikaciju cilјnog gena, dok su pojedina bili sa mozaičnim genotipovima. Nedavno objavljen članak je zatim pokazao da CRISPR/Cas9 sistem može indukovati mutacije u embrionima u razvoju i proizvoditi GE svinje sa većom efikasnošću nego ZFN ili TALEN. Međutim, GE svinje proizvedene CRISPR/Cas9 sistemom takođe su posedovale mozaične genotipove. Dodatno, sve prethodno navedene studije su upotrebljavale zigote dobijene za eksperimente in vivo, što zahteva intenzivan rad i brojne krmače za dobijanje dovolјnog broja zigota.
[0323] Ovaj primer opisuje efikasan pristup za upotrebu CRISPR/Cas9 sistema u generisanju GE svinja putem kako injeciranja in vitro dobijenih zigota, tako i modifikacije somatskih ćelija praćene sa SCNT. Ciljano je delovano na dva endogena gena (CD163 i CD1D) i jedan transgen (eGFP), a samo oocite ili zigoti koji su dobijeni in vitro upotrebljavani su za SCNT ili RNK injeciranja, tim redom. Deluje da je CD163 neophodan za produktivnu infekciju virusom reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja, virusom za koga je poznato da prouzrokuje značajan ekonomski gubitak u industriji svinja. CD1D se smatra neklasičnim proteinom glavnog kompleksa histokompatibilnosti koji je uklјučen u prezentaciju lipidnih antigena nevarijantnim prirodnim T-ćelijama ubicama. Svinje sa deficijencijom ovih gena dizajnirane su tako da budu modeli za polјoprivredu i biomedicinu. Transgen eGFP je upotrebljavan kao ciljni molekul za preliminarne eksperimente dokaza koncepta i optimizacije postupaka.
MATERIJALI I METODE
[0324] Hemikalije i reagensi. Ukoliko nije drugačije navedeno, sve hemikalije upotrebljene u ovoj studiji nabavljene su od kompanije Sigma.
Dizajn gRNK za konstruisanje specifičnih CRISPR
[0325] RNK vodiči su dizajnirani za regione unutar egzona 7 u CD163, koji su bili jedinstveni za CD163 divlјeg tipa i nisu bili prisutni u vektoru sa ciljanim delovanjem tipa razmene domena (opisano u nastavku), tako da bi CRISPR rezultovao u DSB unutar CD163 divlјeg tipa, ali ne i u vektoru sa ciljanim delovanjem tipa razmene domena. Postojale su samo četiri lokacije na kojima bi vektor sa ciljanim delovanjem uveo polimorfizam pojedinačnih nukleotida (SNP) i koji bi izmenio protospejserski susedni motiv (PAM) iz S. pyogenes (Spy). Selektovana su sva četiri cilјna molekula uklјučujući:
(SEQ ID NO: 1) GGAAACCCAGGCTGGTTGGAgGG (CRISPR 10),
(SEQ ID NO:2) GGAACTACAGTGCGGCACTGtGG (CRISPR 131),
(SEQ ID NO:3) CAGTAGCACCCCGCCCTGACgGG (CRISPR 256) i
(SEQ ID NO:4) TGTAGCCACAGCAGGGACGTcGG (CRISPR 282). PAM mogu biti identifikovani na osnovu podeblјanih slova u svakoj gRNK.
[0326] Za mutacije u CD1D, pretraga cilјnih mesta za CRISPR je bila proizvolјno ograničena na kodirajući lanac unutar prvih 1000 bp primarnog transkripta. Ipak, RepeatMasker [26] (biblioteka ponovaka „Svinja”) identifikovao je repetitivni element koji počinje na bazi 943 primarnog transkripta. Pretraga cilјnih mesta za CRISPR je zatim bila ograničena na prvih 942 bp primarnog transkripta. Pretraga je dalјe ograničena na prvih 873 bp primarnog transkripta pošto je poslednji Spy PAM bio lociran na bazi 873. Prvo ciljno mesto (CRISPR 4800) izabrano je pošto se preklapa sa start kodonom lociranim na bazi 42 u primarnom transkriptu (CCAGCCTCGCCCAGCGACATgGG (SEQ ID NO:5)). Dva dodatna ciljna mesta (CRISPR 5620 i 5626) selektovana su pošto su bila najdistalnije u odnosu na prvi izabrani region unutar proizvolјno izabranog regiona (CTTTCATTTATCTGAACTCAgGG (SEQ ID NO:6) i TTATCTGAACTCAGGGTCCCcGG (SEQ ID NO:7)). Ova ciljna mesta se preklapaju. U odnosu na start kodon, najproksimalniji Spy PAM su bili locirani u jednostavnoj sekvenci koja je sadržavala ekstenzivnu homopolimernu sekvencu, što je utvrđeno vizuelnim pregledom. Četvrti ciljni region (CRISPR 5350) izabran je pošto je, u odnosu na izabrani prvi ciljni region, bio najproksimalniji ciljni region koji nije sadržavao ekstenzivne homopolimerne regione (CAGCTGCAGCATATATTAAgGG (SEQ ID NO:8)). Specifičnost dizajniranih crRNK potvrđena je pretraživanjem sličnih sekvenci svinja u GenBank bazi podataka. Oligonukleotidi (Tabela 1) anilirani su i klonirani u p330X vektor koji je sadržavao dve ekspresione kasete, Cas9 iz S. pyogenes sa kodonima optimizovanim za čoveka, i humernu RNK vodiča. P330X je zatim podvrgavan digestiji sa BbsI (New England Biolabs) praćenjem protokola laboratorije dr. Zhang-a (http://www.addgene.org/crispr/zhang/).
[0327] Za ciljano delovanje na eGFP, dve specifične gRNK koje ciljano deluju na kodiranjuću sekvencu za eGFP dizajnirane su unutar prvih 60 bp od eGFP start kodona. I eGFP1 i eGFP2 gRNK su bile na antisens lancu, a eGFP1 je direktno ciljano delovano na start kodon. Sekvenca za eGFP1 gRNK je bila CTCCTCGCCCTTGCTCACCAtGG (SEQ ID NO:9), dok je sekvenca za eGFP2 gRNK bila GACCAGGATGGGCACCACCCcGG (SEQ ID NO: 10).
Tabela 1. Dizajnirane crRNK. Aniling prajmera 1 i prajmera 2 vršen je po protokolu dr. Zhang-a.
Sinteza donorske DNK za CD 163 i CD1D gene
[0328] Oba, i CD163 i CD1D svinje bili su amplifikovani PCR postupkom, iz DNK izolovane iz fetalnih fibroblasta koji bi se kasnije koristili za transfekcije, da bi se osigurala izogena podudarnost između cilјanog vektora i transfektovane ćelijske linije. Ukratko, LA taq polimeraza (Clontech) korišćena je sa nizvodnim prajmerom CTCTCCCTCACTCTAACCTACTT (SEQ ID NO:11) i reverznim prajmerom TATTTCTCTCACATGGCCAGTC (SEQ ID NO:12) koji su upotrebljavani za amplifikaciju fragmenta CD 163 od 9538 bp. Fragment je bio DNK sekvenca koja je validirana i upotrebljena za konstruisabnje vektora sa ciljanim delovanjem tipa razmene domena (Sl. 1). Ovaj vektor je uklјučivao 33 tačkaste mutacije unutar egzona 7, da bi kodirao istu aminokiselinsku sekvencu kao humani CD163L iz egzona 11. Zamenski egzon je bio od 315 bp. Dodatno, naredni intron je zamenjen modifikovanim miostatinskim intronom B koji je sadržavao gen markera selekcije koji je mogao biti uklonjen sa Cre-rekombinazom (Cre) i koji je prethodno pokazivao normalnu obradu transkripta, sadržavajući zadržano loxP mesto (Wells, neobjavlјeni rezultati). Dugi krak konstrukta bio je od 3469 bp i uklјučivao je DS egzon za razmenu domena. Kratki krak je bio od 1578 bp i uklјučivao je egzone 7 i 8 (Sl.1, panel B). Ovaj plazmid je bio upotrebljen za pokušaj zamene kodirajućeg regiona egzona 7 u prvim eksperimentima transfekcije i omogućio je selekciju cilјanih događaja preko selektivnog markera (G418). Ukoliko bi došlo do cilјnog događaja, marker bi mogao da bude uklonjen delecijom od strane Cre-rekombinaze. Vektor za ciljano delovanje na CD163 tipa DS modifikovan je zatim radi upotrebe sa ćelijskim linijama koje su već sadržavale SIGLEC1 gen prekinut sa Neo, koji nije mogao biti uklonjen delecijom sa Cre. U ovom vektoru za ciljano delovanje, Neo kaseta, loxP i miostatinski intron B su bili uklonjeni, a samo je DS egzon ostao sa WT dugim i kratkim krakom (Sl.1, panel C).
[0329] Genomska sekvenca za CD1D svinja amplifikovana je sa LA taq, upotrebom nizvodnog prajmera CTCTCCCTCACTCTAACCTACTT(SEQ ID NO: 13) i reverznog prajmera GACTGGCCATGTGAGAGAAATA (SEQ ID NO: 14), što je rezultovalo fragmentom od 8729 bp. Fragment je DNK koja je sekvencirana i upotrebljena za konstruisanje ciljnog vektora prikazanog na Sl. 2. Neo kaseta je pod kontrolom fosfoglicerol kinaznog (PGK) promotora i okružena je loxP sekvencama, koje su uvedene zarad selekcije. Dugi krak konstrukta bio je od 4832 bp, dok je kratki krak bio od 3563 bp i uključivo je egzone 6 i 7. Ukoliko bi došlo do uspešnog HR, egzoni 3, 4 i 5 bi bili uklonjeni i zamenjeni Neo kasetom. Ukoliko bi se popravka sa NHEJ desila na pogrešan način, egzon 3 bi bio oštećen.
Prikupljanje fetalnih fibroblasta
[0330] Fetalno tkivo svinje je prikupljano 35. dana gestacije, da bi se kreirale ćelijske linije. Dve ćelijske linije fetalnih fibroblasta divlјeg tipa (WT) iz mužjaka i ženki uspostavljene su iz velikog belog ukrštanja u domaćinstvu. U ovim studijama su takođe upotrebljavani fetalni fibroblasti iz mužjaka i ženki koji su prethodno bili modifikovani tako da sadrže Neo kasetu (SIGLEC1-/- genetika). Fetalni fibroblasti su prikupljani kao što je opisano, uz manje modifikacije; samleveno tkivo svakog fetusa je podvrgavano digestiji u 20 ml medijuma za digestiju (Dulbekov modifikovani Eagle medijum [DMEM] koji je sadržavao L-glutamin i 1 g/L D-glukoze [Cellgro] i u koji je bilo dodato 200 jedinica/ml kolagenaze i 25 Kunicovih jedinica/ml DNazeI) tokom 5 h na 38,5°C. Nakon digestije, ćelije fetalnih fibroblasta su isprane i kultivisane sa DMEM, 15% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 40µg/ml gentamicina. Nakon kultivisanja preko noći, ćelije su tipsinizovane i zamrznute na -80°C u alikvotima, u FBS sa 10% dimetil sulfoksida, nakon čega su čuvane u tečnom azotu.
Transfekcija ćelija i genotipizacija
[0331] Uslovi transfekcije su suštinski bili kao što je prethodno prijavlјeno. Donorska DNK je uvek upotrebljavana u konstantnoj količini od 1µg, sa različitim količinama CRISPR/Cas9 plazmida (navedeno u nastavku). Donorska DNK je pre transfekcije linearizovana sa MLUI (CD163) (NEB) ili AFLII (CD1D) (NEB). Pol uspostavlјenih ćelijskih linija je određivan PCR postupkom pre transfekcije, kao što je prethodno opisano. I muške i ženske ćelijske linije su zatim transfektovane, a podaci o genomskoj modifikaciji su zajednički analizirani između transfekcija. Ćelijske linije fetalnih fibroblasta sličnog broja pasaža (2-4) kultivisane su tokom 2 dana, nakon čega su ostavljene da postignu konfluentnost od 75%-85% u DMEM-u koji je sadržavao L-glutamin i 1 g/L D-glukoze (Cellgro) i u koji je bilo dodato 15% FBS, 2,5 ng/ml bazičnog faktora rasta fibroblasta i 10 mg/ml gentamicina. Ćelije fibroblasta su zatim prane fiziološkim rastvorom puferisanim fosfatom (PBS) (Life Technologies) i tripsinizovane. Čim su se ćelije odvojile, ćelije su isprane sa medijumom za elektroporaciju (75% citosoli [120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2,10 mM K2HPO4, pH 7,6, 5 Mm MgCh]) i sa 25% Opti-MEM (LifeTechnologies). Koncentracija ćelija je kvantifikovana upotrebom hemocitometra. Ćelije su zatim istaložene na 600 X g tokom 5 minuta, nakon čega su resuspendovane u gustini od 1 × 10<6>u medijum za elektroporaciju. Za svaku elektroporaciju je upotrebljavano po 200 µl ćelija u kivetama sa razmakom od 2 mm uz tri (1 msec) kvadratna impulsa primenjena kroz BTX ECM 2001 na 250 V. Nakon elektroporacije, ćelije su resuspendovane u DMEM-u koji je prethodno opisan. Za selekciju, dodato je po 600 µg/ml G418 (Life Technologies) 24 h nakon transfekcije, a medijum je promenjen 7. dana. Kolonije su prikupljane 14. dana nakon transfekcije. Fetalni fibroblasti su zasejavani u gustini od 10.000 ćelija/ploči ukoliko je upotrebljavana selekcija sa G418 i u gustini od 50 ćelija/ploči ukoliko nije upotrebljavana selekcija sa G418. Kolonije fetalnih fibroblasta su prikupljane primenom autoklaviranih cilindara za kloniranje od 10 mm koji su bili zaptiveni oko svake kolonije autoklaviranom vakuum mašću. Kolonije su dalje isprane PBS-om i prikupljene su upotrebom tripsina; potom su resuspendovane u DMEM medijumu za kulture. Deo (1/3) resuspendovanih kolonija je prebačen na PCR ploču sa 96 bunarića, dok su preostale (2/3) ćelije kultivisane u bunarićima ploče sa 24 mesta. Talozi ćelija su resuspendovani u po 6 µl pufera za lizu (40 mM Tris, pH 8,9, 0,9% Triton X-100, 0,4 mg/ml proteinaze K [NEB]) i inkubirane su na 65°C tokom 30 minuta radi lize ćelija, nakon čega je sledila inkubacija na 85°C tokom 10 minuta da bi se inaktivirala proteinaza K.
PCR skrining za DS i velike i male delecije
[0332] Detekcija popravki usmerenih sa HR. PCR velikog opsega upotrebljavan je za identifikaciju mutacija bilo u CD163 ili CD1D. Tri različita PCR testa su upotrebljena za identifikaciju HR događaja: PCR amplifikacija regiona koji se protežu od CD163 ili CD1D sekvenci u donorskoj DNK do endogenih CD163 ili CD1D sekvenci bilo na desnoj ili levoj strain, kao i PCR velikog opsega koji je amplifikovao velike regione CD163 ili CD1D koji su sadržavali dizajnirane donorske DNK. Povećanje veličine PCR proizvoda, bilo na 1,8 kb (CD1D) ili 3,5 kb (CD163), koje je nastajalo adicijom egzogenih Neo sekvenci, smatrano je dokazom reparacije gena usmerene sa HR. Svi PCR uslovi uklјučivali su početnu denaturaciju od 95°C u trajanju od 2 min, nakon čega su sledila 33 ciklusa od po 30 sekundi na 94°C, 30 sekundi na 50°C i 7-10 minuta na 68°C. LA taq je upotrebljavana za sve testove prema preporukama proizvođača. Prajmeri su prikazani u Tabeli 2.
Tabela 2. Prajmeri upotrebljeni za identifikaciju popravki CD163 i CD1D usmerenih sa HR
[0333] Test malih delecija (NHEJ). Male delecije su utvrđivane PCR amplifikacijom regiona CD163 ili CD1D koji okružuju predviđeno mesto isecanja i koje uvodi CRISPR/Cas9 sistem. Veličina amplikona je bila 435 bp i 1244 bp za CD163 i CD1D, tim redom. Lizati iz i embriona i fetalnih fibroblasta amplifikovani su PCR postupkom sa LA taq. Uslovi PCR analiza bili su početna denaturacija od 95°C tokom 2 min, nakon čega su sledila 33 ciklusa od po 30 sekundi na 94°C, 30 sekundi na 56°C i 1 min na 72°C. Za genotipizaciju transfektovanih ćelija, insercije i delecije (INDEL) su identifikovane razdvajanjem PCR amplikona elektroforezom u agaroznom gelu. Za genotipizaciju embriona, DNK dobijenih PCR proizvoda je naknadno sekvencirana, da bi se identifikovale male delecije upotrebom nizvodih prajmera koji su upotrebljavani u PCR postupku. Informacije o prajmerima su prikazane u Tabeli 3.
Tabela 3. Prajmeri upotrebljeni za identifikaciju mutacija nastalih sa NHEJ u CD163 i CD1D
Nuklearni transfer iz somatskih ćelija (SCNT)
[0334] Da bi se proizveli SCNT embrioni, upotrebljavani su bilo oocite dobijene od krmača (ART, Inc.) ili oocite dobijene od nazimica iz lokalne klanice. Oocite dobijene od krmača otpremane su preko noći u medijumu za sazrevanje (TCM-199 sa 2,9 mM Hepes, 5 µg/ml insulina, 10 ng/ml epidermalnog faktora rasta [EGF], 0,5 µg/ml svinjskog folikulostimulirajućeg hormona [p-FSH)], 0,91 mM piruvata, 0,5 mM cisteina, 10% svinjske folikularne tečnosti i 25 ng/ml gentamicina), a nakon 24 h su prebacivane u svež medijum. Nakon 40-42 h sazrevanja, kumulusne ćelije su uklanjane iz oocita vorteksiranjem u prisustvu 0,1% hijaluronidaze. Jajne ćelije nazimica su sazrevale kao što je opisano u nastavku za in vitro oplodnju (IVF). Tokom manipulacije, oocite su stavlјane u medijum za manipulaciju (TCM-199 [Life Technologies] sa 0,6 mM NaHCO3, 2,9 mM Hepes, 30 mM NaCl, 10 ng/ml gentamicina i 3 mg/ml BSA, sa osmolarnošću od 305 mOsm) u koji je bilo dodato 7,0 µg/ml citohalazina B. Polarna tela, zajedno sa delom bliske citoplazme za koju se pretpostavlja da sadrži ploču metafaze II, uklonjena su i donorska ćelija je postavlјena u perivitelinski prostor upotrebom tanke staklene kapilare. Rekonstruisani embrioni su zatim fuzionisani u medijumu za fuziju (0,3 M manitola, 0,1 mM CaCl2, 0,1 mM MgCl2i 0,5 mM Hepes) sa dva DC impulsa (u intervalu od 1 sekunde) pri 1,2 kV/cm tokom 30 lsec upotrebom BTX električnog ćelijskog manipulatora (Harvard Apparatus). Nakon fuzije, fuzionisani embrioni su potpuno aktivirani sa 200µM timerosala tokom 10 minuta u mraku i 8 mM ditiotreitola tokom 30 minuta. Embrioni su zatim inkubirani u modifikovanom medijumu za zigote svinja PZM3-MU1 sa 0,5µM Scriptaid reagensa (S7817; Sigma-Aldrich), inhibitorom histon deacetilaze, tokom 14-16 h, kao što je prethodno opisano.
Vantelesna oplodnja (IVF)
[0335] Za IVF, jajnici prepubertalnih nazimica su dobijeni iz klanice (Farmland Foods Inc.). Nezrele oocite su aspirirane iz folikula srednje veličine (3-6 mm) upotrebom hipodermičke igle kalibra 18 koja je bila pričvršćena za špric od 10 ml. Oocite sa ravnomerno tamnom citoplazmom i intaktnim okolnim kumulusnim ćelijama su zatim selektovane za sazrevanje. Oko 50 kompleksa kumulusa i oocita stavlјeno je u bunarić koji je sadržavao 500 µl medijuma za sazrevanje, TCM-199 (Invitrogen) sa 3,05 mM glukoze, 0,91 mM natrijum piruvata, 0,57 mM cisteina, 10 ng/ml EGF, 0,5 µg/ml luteinizirajućeg hormona (LH), 0,5 µg/ml FSH, 10 ng/ml gentamicina (APP Pharm) i 0,1% polivinil alkohola, tokom 42-44 h na 38,5°C, u vlažnom vazduhu sa 5% CO2. Na kraju sazrevanja, okolne kumulusne ćelije su uklonjene iz oocita vorteksiranjem od 3 min u prisustvu 0,1% hijaluronidaze. In vitro sazrele oocite su zatim stavlјene u kaplјice od 50 µl IVF medijuma (modifikovani Tris-puferisani medijum koji je sadržavao 113,1 mM NaCl, 3 mM KCl, 7,5 mM CaCl2, 11 mM glukoze, 20 mM Tris, 2 mM kafeina, 5 mM natrijum piruvata i 2 mg/ml goveđeg serumskog albumina [BSA]) u grupama od po 25-30 oocita.
Po jedan talog zamrznute sperme od 100 µl odmrzavan je u 3 ml Dulbekovog PBS-a u koji je bilo dodat 0,1% BSA. Bilo zamrznuta WT ili sveža eGFP sperma je isprana u 60% Percoll-a tokom 20 minuta na 6503 g i u modifikovanom medijumu puferisanom sa Tris, centrifugiranjem od 10 minuta. U pojedinim slučajevima, sveže prikupljena sperma heterozigotna za prethodno opisani eGFP transgen isprana je tri puta u PBS-u. Talog sperme je zatim resuspendovan sa IVF medijumom do 0,5 X 10<6>ćelija/ml. U kaplјice sa oocitama je zatim uvedeno po pedeset mikolitara suspenzije sperme. Gameti su istovremeno inkubirani tokom 5 h na 38,5°C u atmosferi sa 5% CO2u vazduhu. Nakon oplodnje, embrioni su inkubirani u PZM3-MU1 na 38,5°C i u vazduhu sa 5% CO2.
Transfer embriona
[0336] Embrioni generisani za proizvodnju GE CD163 ili CD1D svinja prebacivani su u surogate bilo 1. dana (SCNT) ili 6. dana (injecirani zigot) nakon prvog „refleksa stajanja” (engl. standing estrus). Za transfer 6. dana, zigoti su kultivisane dodatnih pet dana u PZM3-MU1, u prisustvu 10 ng/ml ps48 (Stemgent, Inc.). Embrioni su hirurški prebacivani u ampularno-istmički spoj jajovoda surogata.
In vitro sinteza RNK za CRISPR/Cas9 sistem
[0337] DNK matrica za in vitro transkripciju je amplifikovana upotrebom PCR postupka (Tabela 4). CRISPR/Cas9 plazmid upotrebljen za eksperimente transfekcije ćelija služio je kao matrica za PCR. Da bi se Cas9 eksprimirao u zigotima, za proizvodnju Cas9 iRNK je upotrebljavan komplet mMESSAGE mMACHINE Ultra (Ambion). Na Cas9 iRNK je zatim dodat poli A signal upotrebom kompleta za dodavanje Poli (A) „repa” (Ambion). CRISPR RNK vodič je proizvedena sa MEGAshortscript (Ambion). Kvalitet sintetisanih RNK je vizuelizovan na 1,5% agaroznom gelu, nakon čega su iste razblažene do finalne koncentracije od 10 ng/µl (i gRNK i Cas9) i raspodeljene u alikvote od po 3 µl.
Tabela 4. Prajmeri upotrebljeni za amplifikaciju matrice za in vitro transkripciju.
Mikroinjeciranje dizajniranog CRISPR/Cas9 sistema u zigote
[0338] Informaciona RNK koja kodira Cas9 i gRNK injecirana je u citoplazmu oplođenih oocita 14 h nakon oplodnje (pretpostavlјeni zigoti) upotrebom FemtoJet mikroinjektora (Eppendorf).
Mikroinjeciranje je vršeno u medijumu za manipulaciju na zagrejanoj ploči Nikon invertnog mikroskopa (Nikon Corporation; Tokio, Japan). Injecirani zigoti su zatim prebacivani u PZM3-MU1 sa 10 ng/ml ps48 do dalјe upotrebe.
Statistička analiza
[0339] Broj kolonija sa modifikovanim genomom je klasifikovan kao 1, a kolonije bez modifikacije genoma su klasifikovane kao 0. Razlike su određivane upotrebom PROC GLM (SAS) programa sa pvrednošću od 0,05 koja je smatrana značajnom. Srednje vrednosti su izračunavane kao srednje vrednosti najmanjih kvadrata. Podaci su predstavljeni kao numeričke srednje vrednosti ± SEM.
REZULTATI
CD163 i CD1D nokaut dobijen posredstvom CRISPR/Cas9 u somatskim ćelijama
[0340] Efikasnost četiri različita CRISPR plazmida (vodiči 10, 131, 256 i 282) koji su ciljano delovali na CD163 ispitivani su u količini od 2 µg/µl donorske DNK (Tabela 5). CRISPR 282 je doveo do značajno većeg prosečnog obrazovanja kolonija nego tretman sa CRISPR 10 i 256 (p < 0,05). Na osnovu prethodno opisane PCR analize velikog obima, utvrđene su velike delecije opsega od 503 bp pa čak do 1506 bp umesto DS putem HR, što je prvobitno bilo zamišlјeno (Sl.3, panel A). Ovo nije bilo očekivano pošto su prethodni izveštaji sa drugim sistemima za editovanje DNK pokazali mnogo manje delecije upotrebom ZFN kod svinja, od 6-333 bp. CRISPR 10 i mešavina sva četiri CRISPR rezultovali su većim brojem kolonija sa modifikovanim genomom od CRISPR 256 i 282 (Tabela 5, p < 0,002). Transfekcija sa CRISPR 10 i plazmidom koji je sadržavao Neo, ali bez homologije sa CD163, nije dovela do obrazovanja kolonija koje su prikazivale veliku deleciju. Zanimlјivo je da je jedna monoalelna delecija takođe detektovana kada je donorska DNK bila uvedena bez bilo kog CRISPR. Ovaj test verovatno predstavlјa potcenjivanje stope mutacija, pošto nisu skrinovane bilo kakve potencijalne male delecije sekvenciranjem, a koje ne bi mogle ni biti detektovane na agaroznom gelu u transfektovanim somatskim ćelijama.
Nuklearni transfer iz somatskih ćelija (SCNT)
[0334] Da bi se proizveli SCNT embrioni, upotrebljavani su bilo oocite dobijene od krmača (ART, Inc.) ili oocite dobijene od nazimica iz lokalne klanice. Oocite dobijene od krmača otpremane su preko noći u medijumu za sazrevanje (TCM-199 sa 2,9 mM Hepes, 5 µg/ml insulina, 10 ng/ml epidermalnog faktora rasta [EGF], 0,5 µg/ml svinjskog folikulostimulirajućeg hormona [p-FSH)], 0,91 mM piruvata, 0,5 mM cisteina, 10% svinjske folikularne tečnosti i 25 ng/ml gentamicina), a nakon 24 h su prebacivane u svež medijum. Nakon 40-42 h sazrevanja, kumulusne ćelije su uklanjane iz oocita vorteksiranjem u prisustvu 0,1% hijaluronidaze. Jajne ćelije nazimica su sazrevale kao što je opisano u nastavku za in vitro oplodnju (IVF). Tokom manipulacije, oocite su stavlјane u medijum za manipulaciju (TCM-199 [Life Technologies] sa 0,6 mM NaHCO3, 2,9 mM Hepes, 30 mM NaCl, 10 ng/ml gentamicina i 3 mg/ml BSA, sa osmolarnošću od 305 mOsm) u koji je bilo dodato 7,0 µg/ml citohalazina B. Polarna tela su uklonjena, zajedno sa delom bliske citoplazme za koju se pretpostavljalo da sadrži ploču metafaze II, i donorska ćelija je postavlјena u perivitelinski prostor upotrebom tanke staklene kapilare. Rekonstruisani embrioni su zatim fuzionisani u medijumu za fuziju (0,3 M manitola, 0,1 mM CaCl2, 0,1 mM MgCl2i 0,5 mM Hepes) sa dva DC impulsa (u intervalu od 1 sekunde) od 1,2 kV/cm tokom 30 lsec upotrebom BTX električnog ćelijskog manipulatora (Harvard Apparatus). Nakon fuzije, fuzionisani embrioni su potpuno aktivirani sa 200µM timerosala tokom 10 minuta u mraku i 8 mM ditiotreitola tokom 30 minuta. Embrioni su zatim inkubirani u modifikovanom medijumu za zigote svinja PZM3-MU1 sa 0,5µM Scriptaid reagensa (S7817; Sigma-Aldrich), inhibitorom histon deacetilaze, tokom 14-16 h, kao što je prethodno opisano.
Vantelesna oplodnja (IVF)
[0335] Za IVF, jajnici prepubertalnih nazimica su dobijeni iz klanice (Farmland Foods Inc.). Nezrele oocite su aspirirane iz folikula srednje veličine (3-6 mm) upotrebom hipodermičke igle kalibra 18 koja je bila pričvršćena za špric od 10 ml. Oocite sa ravnomerno tamnom citoplazmom i intaktnim okolnim kumulusnim ćelijama su zatim selektovane za sazrevanje. Oko 50 kompleksa kumulusa i oocita stavlјeno je u bunarić koji je sadržavao 500 µl medijuma za sazrevanje, TCM-199 (Invitrogen) sa 3,05 mM glukoze, 0,91 mM natrijum piruvata, 0,57 mM cisteina, 10 ng/ml EGF, 0,5 µg/ml luteinizirajućeg hormona (LH), 0,5 µg/ml FSH, 10 ng/ml gentamicina (APP Pharm) i 0,1% polivinil alkohola, tokom 42-44 h na 38,5°C, u vlažnom vazduhu sa 5% CO2. Na kraju sazrevanja, okolne kumulusne ćelije su uklonjene iz oocita vorteksiranjem od 3 min u prisustvu 0,1% hijaluronidaze. In vitro sazrele oocite su zatim stavlјene u kaplјice od 50 µl IVF medijuma (modifikovani Tris-puferisani medijum koji je sadržavao 113,1 mM NaCl, 3 mM KCl, 7,5 mM CaCl2, 11 mM glukoze, 20 mM Tris, 2 mM kafeina, 5 mM natrijum piruvata i 2 mg/ml goveđeg serumskog albumina [BSA]) u grupama od po 25-30 oocita. Po jedan talog zamrznute sperme od 100 µl odmrzavan je u 3 ml Dulbekovog PBS-a u koji je bilo dodat 0,1% BSA. Bilo zamrznuta WT ili sveža eGFP sperma je isprana u 60% Percoll-a tokom 20 minuta na 6503 g i u modifikovanom medijumu puferisanom sa Tris, centrifugiranjem od 10 minuta. U pojedinim slučajevima, sveže prikupljena sperma heterozigotna za prethodno opisani eGFP transgen isprana je tri puta u PBS-u. Talog sperme je zatim resuspendovan sa IVF medijumom do 0,5 X 10<6>ćelija/ml. U kaplјice sa oocitima je zatim uvedeno po pedeset mikolitara suspenzije sperme. Gameti su istovremeno inkubirani tokom 5 h na 38,5°C u atmosferi sa 5% CO2u vazduhu. Nakon oplodnje, embrioni su inkubirani u PZM3-MU1 na 38,5°C i u vazduhu sa 5% CO2.
Transfer embriona
[0336] Embrioni generisani za proizvodnju GE CD163 ili CD1D svinja prebacivani su u surogate bilo 1. dana (SCNT) ili 6. dana (injecirani zigot) nakon prvog „refleksa stajanja” (engl. standing estrus). Za transfer 6. dana, zigoti su kultivisani dodatnih pet dana u PZM3-MU1, u prisustvu 10 ng/ml ps48 (Stemgent, Inc.). Embrioni su hirurški prebacivani u ampularno-istmički spoj jajovoda surogata.
In vitro sinteza RNK za CRISPR/Cas9 sistem
[0337] DNK matrica za in vitro transkripciju je amplifikovana upotrebom PCR postupka (Tabela 4). CRISPR/Cas9 plazmid upotrebljen za eksperimente transfekcije ćelija služio je kao matrica za PCR. Da bi se Cas9 eksprimirao u zigotima, za proizvodnju Cas9 iRNK je upotrebljen komplet mMESSAGE mMACHINE Ultra (Ambion). Na Cas9 iRNK je zatim dodat poli A signal upotrebom kompleta za dodavanje Poli (A) „repa” (Ambion). CRISPR RNK vodič je proizvednea sa MEGAshortscript (Ambion). Kvalitet sintetisanih RNK je vizuelizovan na 1,5% agaroznom gelu, nakon čega su iste razblažene do finalne koncentracije od 10 ng/µl (i gRNK i Cas9) i raspodeljene u alikvote od po 3 µl.
Mikroinjeciranje dizajniranog CRISPR/Cas9 sistema u zigote
[0338] Informaciona RNK koja kodira Cas9 i gRNK injecirana je u citoplazmu oplođenih oocita 14 h nakon oplodnje (pretpostavlјeni zigoti) upotrebom FemtoJet mikroinjektora (Eppendorf). Mikroinjeciranje je vršeno u medijumu za manipulaciju na zagrejanoj ploči Nikon invertnog mikroskopa (Nikon Corporation; Tokio, Japan). Injecirani zigoti su zatim prebacivani u PZM3-MU1 sa 10 ng/ml ps48 do dalјe upotrebe.
Statistička analiza
[0339] Broj kolonija sa modifikovanim genomom je klasifikovan kao 1, a kolonije bez modifikacije genoma su klasifikovane kao 0. Razlike su određivane upotrebom PROC GLM (SAS) programa sa pvrednošću od 0,05 koja je smatrana značajnom. Srednje vrednosti su izračunavane kao srednje vrednosti najmanjih kvadrata. Podaci su predstavljeni kao numeričke srednje vrednosti ± SEM.
REZULTATI
CD163 i CD1D nokaut dobijen posredstvom CRISPR/Cas9 u somatskim ćelijama
[0340] Efikasnost četiri različita CRISPR plazmida (vodiči 10, 131, 256 i 282) koji su ciljano delovanil na CD163 ispitivani su u količini od 2 µg/µl donorske DNK (Tabela 5). CRISPR 282 je doveo do značajno većeg prosečnog obrazovanja kolonija nego tretman sa CRISPR 10 i 256 (p < 0,05). Na osnovu prethodno opisane PCR analize velikog obima, utvrđene su velike delecije opsega od 503 bp pa čak do 1506 bp umesto DS putem HR, što je prvobitno bilo zamišlјeno (Sl.3, panel A). Ovo nije bilo očekivano pošto su prethodni izveštaji sa drugim sistemima za editovanje DNK pokazali mnogo manje delecije upotrebom ZFN kod svinja, od 6-333 bp. CRISPR 10 i mešavina sva četiri CRISPR rezultovali su većim brojem kolonija sa modifikovanim genomom od CRISPR 256 i 282 (Tabela 5, p < 0,002). Transfekcija sa CRISPR 10 i plazmidom koji je sadržavao Neo, ali bez homologije sa CD163, nije dovela do obrazovanja kolonija koje su prikazivale veliku deleciju. Zanimlјivo je da je jedna monoalelna delecija takođe detektovana kada je donorska DNK bila uvedena bez bilo kog CRISPR. Ovaj test verovatno predstavlјa potcenjivanje stope mutacija, pošto nisu skrinovane bilo kakve potencijalne male delecije sekvenciranjem, a koje ne bi mogle ni biti detektovane na agaroznom gelu u transfektovanim somatskim ćelijama.
Tabela 5. Efikasnost četiri različita CRISPR plazmida (vodiči 10, 131, 256 i 282) koji ciljano deluje na CD163. Četiri različita CRISPR su testirana u količini od 2 µg do 1 µg donorske DNK (Sl.1).
[0341] Prvobitni cilј je bio da se sa HR dobije događaj cilјnog delovanja tipa razmene domena (DS) za CD163, ali CRISPR nisu povećali efikasnost cilјanog delovanja na CD 163. Potrebno je napomenuti da su upotrebljene razne kombinacije ovog vektora sa ciljanim delovanjem za modifikovanje CD 163 sa HR, tradicionalnim transfekcijama, kao i da je nakon skrininga 3399 kolonija rezultat bio 0 cilјnih događaja (Whitworth i Prather, neobjavlјeni rezultati). Dobijene su dve svinje sa potpunim DS koji je bio rezultat HR i koje su sadržavale svih 33 mutacija za koje je pokušano da budu uvedene transfekcijom sa CRISPR 10 i vektorom sa ciljanim delovanjem tipa DS kao donorskom DNK.
[0342] Ispitivana je zatim efikasnost mutacija indukovanih sa CRISPR/Cas9 bez selekcije lekovima; ćelijska linija fetalnih fibroblasta upotrebljena u ovoj studiji već je imala integraciju Neo rezistentne kasete i bila je SIGLEC1 nokaut. Isptitvano je takođe da li će odnos CRISPR/Cas9 i donorske DNK povećati modifikaciju genoma ili dovesti do toksičnog efekta pri visokoj koncentraciji. CRISPR 131 je izabran za ovo ispitivanje, pošto je u prethodnom eksperimentu rezultovao visokim brojem ukupnih kolonija i povećanim procentom kolonija koje poseduju modifikovani genom. Povećanje količine CRISPR 131 DNK sa 3:1 na 20:1 nije imalo značajan uticaj na preživlјavanje fetalnih fibroblasta. Procenat kolonija sa genomom modifikovanim sa NHEJ nije bio značajno različit između različitih koncentracija CRISPR, ali je broj za NHEJ bio najvezći za odnos 10:1 (Tabela 6, p = 0,33). Čak i pri najvećem odnosu CRISPR DNK prema donorskoj DNK (20:1), HR nije uočen.
Tabela 6. Efikasnost mutacija indukovanih sa CRISPR/Cas9 bez selekcije lekovima. Četiri različita odnosa donorske DNK i CRISPR 131 DNK su upoređivana u prethodno modifikovanoj ćelijskoj liniji bez upotrebe selekcije sa G418.
[0343] Na osnovu ovog iskustva, pokušano je sa cilјanim remećenjem CD1D u somatskim ćelijama. Dizajnirana su i testirana četiri različita CRISPR u ćelijama muškog i ženskog pola. Modifikacije CD1D su mogle biti detektovane kod tri primenjena CRISPR, dok upotreba CRISPR 5350 nije dovela do modifikacije CD1D sa delecijom koja je bila dovoljno velika da bi se detektovala elektroforezom u agaroznom gelu (Tabela 7). Zanimlјivo je da genetička modifikacija nije bila dobijena putem HR, iako je obezbeđena donorska DNK. Međutim, zapažene su velike delecije slične dobijenima u eksperimentima za CD 163 nokaut (Sl.3, panel B). Nije opisana cilјana modifikacija CD1D sa velikom delecijom kada CRISPR/Cas9 nije bio upotrebljavan sa donorskom DNK. Modifikacija CD1D nakon ciljanog delovanja CRISPR/Cas9 bila je 4/121 i 3/28 u muškim i ženskim kolonijama ćelija, tim redom. U podatke o transfekciji su uključeni samo INDEL-i koji su se mogli detektovati elektroforezom u agaroznom gelu.
Tabela 7. Četiri različita CRISPRS su testirana u količini od 2 µg do 1 µg donorske DNK (prikazano na Sl.2). Tretman donorskom DNK je služio kao kontrola bez CRISPR.
Proizvodnja CD163 i CD1D svinja putem SCNT upotrebom GE ćelija
[0344] Ćelije koje prikazuju modifikaciju CD163 ili CD1D upotrebljavane su za SCNT da bi se proizvele CD163 i CD1D nokaut svinje (Sl. 3). Sedam transfera embriona (CD163, Tabela 8), šest transfera embriona (CD163-bez Neo) i pet transfera embriona (CD1D) u nazimice primaoce obavlјeno je sa SCNT embrionima dobijenim iz muških i ženskih fetalnih fibroblasta transfektovanih sa CRISPR/Cas9 sistemima. Šest (CD163), dve (CD163-bez Neo) i četiri (CD1D) (Tabela 9) nazimice primaoci su ostale trudne do termina, što je rezultovalo stopom trudnoće od 85,7%, 33,3% i 80%, tim redom. Od primalaca CD163, petoro je rodilo zdravu prasad carskim rezom. Jedan (O044) se oprasio prirodno. Veličina legla se kretala od jedan do osam. Četiri svinje su bile eutanazirane zbog neuspeha da napreduju nakon rođenja. Jedno prase je eutanazirano zbog teškog rascepa nepca. Sva preostala prasad su delovala zdravo (Sl. 3, panel C). Dva legla muških prasadi koja su dobijena iz fetalnih fibroblasta transfektovanih sa CRISPR 10 i donorskom DNK opisanom na Sl.3, panel B, imala su deleciju od 30 bp u egzonu 7 pored CRISPR 10 i dodatnu deleciju od 1476 bp u prethodnom intronu, čime je bio uklonjen spoj intron 6/egzon 7 u CD163 (Sl. 3, panel E). Genotipovi i predviđeni proizvodi translacije su sumirani u Tabeli 10. Jedno muško prase i jedno žensko leglo (4 praseta) dobijeni su iz transfekcije prethodno modifikovanih SIGLEC1 ćelija sa CD163-bez Neo. Svih pet prasića su bili dvostruki nokauti za SIGLEC1 i CD163. Muško prase je imalo bialelnu modifikaciju CD163 sa delecijom od 28 bp u egzonu 7 na jednom alelu i delecijom od 1387 bp na drugom alelu koja je uklјučivala delimičnu deleciju egzona 7 i potpuno delecija egzona 8, kao i introna u nastavku, čime je spoj introna i egzona. Ženska prasad su imala bialelnu mutaciju CD163, uklјučujući deleciju od 1382 bp sa insercijom od 11 bp na jednom alelu i deleciju CD163 od 1720 bp na drugom alelu. Rezime modifikacija CD 163 i predviđenih proizvoda translacije se mogu naći u Tabeli 10. Rezime CD1D modifikacija i predviđenih proizvoda translacije nakon CRISPR modifikacije se mogu naći u Tabeli 11. Ukratko, rođena su jedno žensko i dva muška legla, što je rezultovalo sa 13 prasića. Jedno prase je umrlo odmah po rođenju. Dvanaest od 13 prasadi sadržavalo je ili bialelnu ili homozigotnu deleciju CD1D (Sl.3, panel F). Jedno prase je bilo WT.
Tabela 8. Podaci o transferu embriona za CD163.
Tabela 9. Podaci o transferu embriona za CD1D.
Tabela 11. Genotip i previđeni proizvod translacije za svinje sa modifikovanim CD1D
Efikasnost CRISPR/Cas9 sistema u svinjskim zigotima
[0345] Na osnovu cilјanog remećenja strukture CD163 i CD1D u somatskim ćelijama upotrebom CRISPR/Cas9 sistema, ovaj pristup je primenjivan na embriogenezu svinja. Najpre je isptivana efikasnost CRISPR/Cas9 sistema u razvoju embriona. CRISPR/Cas9 sistem koji je cilјano delovao na eGFP uvođen je u zigote oplođene spermom nerasta koji su bili heterozigotni za eGFP transgen. Nakon injeciranja, praćeni su potonji embrioni koji eksprimiraju eGFP. Ispitivane su razne koncentracije CRISPR/Cas9 sistema i uočena je citotoksičnost isporučenog CRISPR/Cas9 sistema (Sl. 4, panel A); razvoj embriona nakon injeciranja CRISPR/Cas9 bio je niži u poređenju sa kontrolom. Međutim, sve koncentracije CRISPR/Cas9 koje su bile ispitivane bile su efektivne u generisanju modifikacije eGFP pošto nisu pronađeni embrioni sa ekspresijom eGFP u grupi koja je injecirana sa CRISPR/Cas9 (Sl.4, panel B); od neinjeciranih kontrolnih embriona 67,7% je bilo zeleno, što ukazuje na ekspresiju eGFP. Kada su pojedinačne blastocisti bili genotipizovani, bilo je moguće identifikovati male mutacije u blizini mesta vezivanja CRISPR (Sl.4, panel C). Na osnovu toksičnosti i efektivnosti, 10 ng/µl gRNK i Cas9 iRNK upotrebljavano je za sledeće eksperimente.
[0346] Kada su komponente CRISPR/Cas9 koje su dizajnirane tako da ciljano deluju na CD163 uvedene u pretpostavlјene zigote, zapažena je cilјana modifikacija gena u potonjim blastocistima. Kada su pojedinačni blastocisti genotipizovani u pogledu mutacije u CD163, nađene su specifične mutacije kod svih embriona (100% efikasnost GE). Još važnije, dok su se mogli naći embrioni sa homozigotnim ili bialelnim modifikacijama (8/18 i 3/18, tim redom) (Sl. 5), opisani su i mozaični (sa monoalelnim modifikacijama) genotipovi (4/18 embriona). Pojedini embrioni (8/10) iz uzorka su injecirani sa 2 ng/µl Cas9 i 10 ng/µl CRISPR i nije pronađena razlika u efikasnosti mutageneze. Na osnovu in vitro rezultata, dva CRISPR koji predstavlјaju različite gRNK su zatim uvedeni, da bi se poremetila strukutra CD163 ili CD1D tokom embriogeneze i indukovala specifična delecija cilјnih gena. Kao rezultat navedenog, bilo je moguće uspešno indukovati dizajniranu deleciju CD163 i CD1D uvođenjem dva vodiča. Dizajnirana delecija se definiše kao delecija koja uklanja genomsku sekvencu između dva uvedena vodiča. Među embrionima koji su primili dva CRISPR koji ciljano deluju CD163, svi osim jednog embriona su rezultovali cilјanom modifikacijom CD163. Dodatno, nađeno je 5/13 embriona sa dizajniranom delecijom CD163 (Sl. 6, panel A), a delovalo je i da 10/13 embriona ima modifikaciju CD163 bilo na homozigotan ili bialelni način. Cilјano delovanje na CD1D sa dva CRISPR je takođe bilo efektivno pošto su svi embrioni (23/23) pokazali modifikaciju CD1D. Ipak, dizajnirana delecija CD1D se mogla naći samo kod dva embriona (2/23) (Sl. 6, panel B). Pet od dvadeset tri embriona koji su posedovali mozaične genotipove takođe je pronađeno, ali ostali embrioni su imali bilo homozigotnu ili bialelnu modifikaciju CD1D. Konačno, ispitano je da li može biti ostvareno ciljano delovanje na više gena sa CRISPR/Cas9 sistema unutar istog embriona. U tu svrhu, ciljano delovanje i na CD163 i na eGFP izvršeno je u zigotima koje su oplođeni heterozigotnom eGFP spermom. Kada su blastociste iz injeciranih embriona genotipizovani za CD163 i eGFP, utvrđeno je da je ciljano delovanje na CD163 i eGFP tokom embriogeneze bilo uspešno. Rezultati sekvenciranja su pokazali da ciljano delovanje uvođenjem višestrukih CRISPR sa Cas9 može biti ostvareno na više gena (Sl.6, panel C).
Proizvodnja CD163 i CD1D mutanata iz zigota injeciranih sa CRISPR/ Cas9
[0347] Na osnovu uspeha iz prethodne in vitro studije, proizvedeni su pojedini zigoti injecirani sa CRISPR/Cas9, a po 46-55 blastocista je prebacivano po primaocu (pošto se ovaj broj pokazao efektivnim u proizvodnji svinja iz in vitro dobijenih embriona). Urađena su četiri transfera embriona, po dva za CD163 i CD1D, čime je dobijena trudnoća za svaku modifikaciju. Proizvedena su četiri zdrava prasića koja su nosila modifikacije na CD163 (Tabela 8). Sva prasad, leglo 67 od krmače primaoca ID O083, pokazala su homozigotnu ili bialelnu modifikaciju CD163 (Sl. 7). Dva praseta su pokazala dizajniranu deleciju CD163 sa dva isporučena CRISPR. Sva prasad su bila zdrava. Za CD1D, jedna trudnoća je takođe proizvela četiri praseta (leglo 166 od krmače primaoca sa identifikacionim brojem O165): jednu ženku i tri mužjaka (Tabela 9). Jedno prase (166-1) je nosilo mozaičnu mutaciju CD1D, uklјučujući delecija 362 bp koja je potpuno uklonila egzon 3 koji sadrži start kodon (Sl.8). Jedno prase je sadržavalo inserciju 6 bp sa pogrešnim uparivanjem od 2 bp na jednom alelu i veliku deleciju na drugom alelu. Dva dodatna praeta su imala bialelnu inserciju po jednog bp. Nisu detektovane mozaične mutacije za CD163.
DISKUSIJA
[0348] Povećanje efikasnosti proizvodnje GE svinja može imati veliki uticaj obezbeđivanjem više GE svinja za polјoprivredu i biomedicinu. Prethodno opisani podaci pokazuju da upotrebom CRISPR/Cas9 sistema, sa visokom efikasnošću mogu biti proizvedene GE svinje sa specifičnim mutacijama. CRISPR/Cas9 sistem je uspešno primenjivan za modifikaciju gena kako u somatskim ćelijama, tako i u preimplantacionim embrionima.
[0349] Kada je CRISPR/Cas9 sistem bio uveden u somatske ćelije, on je uspešno indukovao cilјano remećenje strukture ciljnih gena sa NHEJ, ali nije povećao sposobnost ciljanog delovanja putem HR.
Efikasnost ciljanog delovanja pojedinačnih CRISPR/Cas9 u somatskim ćelijama je varirala, što je ukazivalo da dizajn vodiča može uticati na efikasnost ciljanog delovanja. Preciznije, nije bilo moguće pronaći cilјanu modifikaciju CD1D kada su CRISPR 5350 i Cas9 uvedeni u somatske ćelije. Navedeno ukazuje da bi moglo biti korisno dizajnirati više gRNK i potvrditi njihove efikasnosti pre proizvodnje svinja. Još uvek nije jasan razlog za nedostatak popravke usmerene sa HR u prisustvu donorske DNK. Nakon skrininga 886 kolonija (i CD163 i CD1D) transfektovanih sa CRISPR i donorskom DNK, samo kod jedne kolonije je bilo dokaza za delimičan HR događaj. Rezultati su pokazali da je CRISPR/Cas9 sistem radio sa uvedenom donorskom DNK i prouzrokovao neočekivane velike delecije na cilјnim genima, ali nije povećao efikasnost HR za ova dva određena cilјana vektora. Ipak, specifičan mehanizam za uočavanje velike delecije nije poznat. Prethodni izveštaji naše grupe su ukazivali da se donorska DNK može efektivno upotrebljavati sa ZFN da bi se indukovala popravka usmerena sa HR. Slično navedenom, uočeno je povećanje efikasnosti ciljanog delovanja kada je donorska DNK bila upotrebljena sa CRISPR/ Cas9 sistemom, ali potpuna popravka usmerena sa HR nije zapažena. U prethodnoj studiji koja je koristila ZFN, uočeno je da se cilјana modifikacija može desiti kombinacijom HR i NHEJ pošto je pronađena delimična rekombinacija uvedene donorske DNK nakon indukovanja DSB sa ZFN. Jedno od objašnjenja bi moglo biti da HR i NHEJ putevi nisu nezavisni, već da mogu delovati zajedno da bi se završio proces nakon nastanka DSB prouzrokovanih „homing” endonukleazama. Veće koncentracije CRISPR mogu pobolјšati efikasnost ciljanog delovanja u somatskim ćelijama iako nije utvrđena statistički značajna razlika u ovim eksperimentalnim rezultatima. Ovo može ukazati da je CRISPR ograničavajući faktor u sistemu CRISPR/Cas9, ali je potrebna i dalja potvrda navedenog. Cilјne ćelije su uspešno upotrebljavane za proizvodnju GE svinja putem SCNT, što ukazuje da primena CRISPR/Cas9 ne utiče na sposobnost ćelija da budu klonirane. Nekoliko prasića je bilo eutanazirano zbog zdravstvenih problema; ipak, navedeno nije neuobičajeno kod prasadi dobijene sa SCNT.
[0350] Kada je CRISPR/Cas9 sistem bio uveden u embrion u razvoju, injeciranjem u zigot, skoro 100% embriona i svinja je sadržavalo INDEL u cilјnom genu, što pokazuje da je tehnologija veoma efektivna tokom embriogeneze. Efikasnost uočena tokom ove studije prevazilazi učestalosti prijavlјene u drugim studijama koje koriste „homing” endonukleaze tokom embriogeneze. Smanjenje broja embriona koji dostižu stadijum blastocista ukazuje da koncentracija CRISPR/Cas9 uvedenog u ovoj studiji može biti toksična za embrione. Dalјa optimizacija sistema isporuke može povećati preživlјavanje embriona i time pobolјšati sveukupnu efikasnost procesa. Stopa mutageneze od skoro 100% koja je ovde bila uočena, bila je različita od iste u prethodnim izveštajima kod svinja kod kojih je nokaut bio posredovan sa CRISPR/Cas9; međutim, razlika u efikasnosti između studija može biti kombinacija vodiča i cilјanog molekula koji su odabrani. U ovoj studiji, niže koncentracije CRISPR/Cas9 (10 ng/µl svakog) bile su efektivne u generisanju mutacija kod embriona u razvoju i u proizvodnji GE svinja. Koncentracija je niža nego što je ranije prijavlјeno kod zigota svinja (125 ng/µl Cas9 i 12,5 ng/µl CRISPR). Niža koncentracija komponenti CRISPR/Cas9 mogla bi biti korisna za razvoj embriona pošto unošenje viška količina nukleinske kiseline u embrione u razvoju može biti toksično. Pojedini mozaični genotipovi su takođe viđeni u embrionima injeciranim sa CRISPR/Cas9 iz in vitro testova; ipak, samo jedno prase proizvedeno ovim pristupom imalo je mozaičan genotip. Potencijalno, injeciranje sa komponentama CRISPR/Cas9 može biti efektivnije od uvođenja drugih „homing” endonukleaza pošto se smatralo da je mozaičan genotip glavna prepreka za upotrebu CRISPR/Cas9 sistema u zigotima. Druga prednost upotreba CRISPR/Cas9 sistema koju pokazuju rezultati predmetnog pronalaska je da nije izgublјeno nijedno prase sa nokautom CD163 koje je proizvedeno od zigota dobijenih sa IVF injeciranjem CRISPR/Cas9 sistema, dok je nekoliko prasića koji su bili rezultat SCNT eutanazirano nakon nekoliko dana. Ovo ukazuje da bi tehnologija mogla ne samo da zaobiđe potrebu za SCNT u generisanju nokaut svinja, već i da bi bi takođe mogla da prevaziđe uobičajene zdravstvene probleme povezane sa SCNT. Sada kada je injeciranje CRISPR/Cas9 iRNK u zigote optimizovano, budući eksperimenti će uklјučivati i istovremeno injeciranje donorske DNK.
[0351] Predmetna studija pokazuje da uvođenje dva CRISPR sa Cas9 u zigote može indukovati hromozomske delecije kod embriona u razvoju i proizvesti svinje sa predviđenom delecijom, odnosno sa specifičnom delecijom između dva CRISPR vodiča. Ovako dizajnirana delecija može biti korisna pošto je moguće specifično odrediti veličinu delecije, ne oslanjajući se na nasumične događaje prouzrokovane sa NHEJ. Preciznije, ukoliko postoji insercija/delecija nukleotida u više od tri prouzrokovana “homing” endonukleazom, mutacija može dovesti pre do hipomorfne mutacije pošto ne bi došlo do pomeraja u okviru čitanja. Ipak, uvođenjem dva CRISPR je moguće indukovati veće delecije koja će imati veće šanse da generišu nefunkcionalan protein. Zanimlјivo je da su CD1D CRISPR dizajnirani duž većeg područja genoma od CD163; postojalo je rastojanje od 124 bp između CD163 CRISPR 10 i 131, dok rastojanje između CRISPR 4800 i 5350 za CD1D iznosilo 550 bp. Veća udalјenost između CRISPR nije bila veoma efektivna u generisanju delecije, što je prikazano u studiji. Međutim, pošto je ova studija uklјučila samo ograničen broj zapažanja i postoji potreba da se razmotri efikasnost pojedinačnih CRISPR, što se ovde ne razmatra, potrebna je dalјa studija da se potvrdi odnos između udalјenosti između CRISPR i verovatnoća prouzrokovanja predviđenih delecija.
[0352] CRISPR/Cas9 sistem je takođe bio efektivan u istovremenom ciljanom delovanju na dva gena unutar istog embriona, a jedini dodatni korak je uvođenje jednog dodatnog CRISPR sa crRNK. Ovo ilustruje lakoću remećenja strukture višestrukih gena u poređenju sa drugim “homing” endonukleazama. Ovi rezultati ukazuju da se ova tehnologija može koristiti za ciljano delovanje na klastere gena ili familije gena koje mogu imati kompenzatorni efekat, što se pokazalo otežavajućim za utvrđivanje uloge pojedinačnih gena ukoliko se svi geni poremete. Rezultati pokazuju da se CRISPR/Cas9 tehnologija može biti primenjena u generisanju GE svinja povećanjem efikasnosti ciljanog delovanja na gene u somatskim ćelijama i direktnom injeciranjem u zigote.
Primer 2: Povećana rezistenciju na PRRSV kod svinja koje imaju modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163
[0353] Virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRSV) opustošio je industriju svinja tokom poslednjih četvrt veka. Spekulacije o načinu ulaska virusa uklјučivale su i SIGLEC1 i CD 163. Dok nokaut SIGLEC1 nije uticao na odgovor na infekciju virusom, u ovom primeru je pokazano da CD163 null životinje ne pokazuju kliničke znake infekcije, patologiju pluća, viremiju ili proizvodnju antitela što su sve obeležja PRRSV infekcije. Ne samo da je potvrđen posrednik za ulazak PRRSV; ali ukoliko bi bilo dozvolјeno da slično stvorene životinje uđu u snabdevanje hranom, time bi bila opisana i strategija za sprečavanje značajnih ekonomskih gubitaka i patnje životinja.
MATERIJALI I METODE
Genotipizacija
[0354] Genotipizacija je bila zasnovana kako na sekvenciranju DNK, tako i na sekvenciranju iRNK. Genotip oca je imao deleciju 11 bp u jednom alelu, za koju je bilo predviđeno da, nakon translacije, rezultuje nedostatkom 45 aminokiselina u domenu 5 usled preuranjenog stop kodona na aminokiselini 64. U drugom alelu je došlo do adicije 2 bp u egzonu 7 i delecije 377 bp u intronu pre egzona 7, za koje je bilo predviđeno da, nakon translacije, rezultuju nedostatkom prvih 49 aminokiselina u domenu 5 usled preuranjenog stop kodona na aminokiselini 85. Jedna krmača je imala adiciju od 7 bp u jednom alelu, za koju je bilo predviđeno da, nakon translacije, rezultuje nedostatkom prvih 48 aminokiselina u domenu 5 usled preuranjenog stop kodona na aminokiselini 70. Drugi alel je bio neokarakterisan (A), pošto nije bilo trake od egzona 7 ni nakon PCR postupka niti nakon PCR postupka velikog obima od 6,3 kb. Ostale 3 krmače su bile klonovi i imale su deleciju 129 bp u egzonu 7 za koju je bilo predviđeno da će dovesti do delecije 43 aminokiseline iz domena 5. Drugi alel je bio neokarakterisan (B).
Rast PRRSV u kulturi i proizvodnja virusnog inokuluma za infekciju svinja bili su obuhvaćeni odobrenom IBC prijavom 973
[0355] Tipski soj PRRSV, izolat NVSL 97-7895 (GenBank # AF3256912001-02-11), uzgajan je kao što je opisano u odobrenom IBC protokolu 973. Ovaj laboratorijski izolat je bio upotrebljavan u eksperimentalnim studijama oko 20 godina (Ladinig i saradnici, 2015). Drugi izolat je upotrebljen za 2. ispitivanje, KS06-72109 kao što je prethodno opisano (Prather i saradnici, 2013).
Infekcija svinja sa PRRSV
[0356] Za infekciju svinja upotrebljen je standardizovani protokol infekcije sa PRRSV. Prasad stara tri nedelјe inokulisana su sa približno 10<4>TCID50 PRRS virusa koji je bio davan intramuskularnim (IM) i intranazalnim (IN) putevima. Svinje su svakodnevno praćene i one koje su ispolјavale simptome bolesti lečene su prema preporukama CMG veterinara. Svinje koje su ispoljile teško stanje i bile su u opasnosti da podlegnu infekciji, humano su eutanazirane i prikuljeni su uzorci. Osoblјe i veterinari nisu bili upoznati sa genetički statusom svinja da bi eliminisali pristrasnost u proceni ili lečenju. PRRSV je prisutan u telesnim tečnostima tokom infekcije; uzorci krvi su stoga prikupljani i čuvani na -80°C do merenja, da bi se odredili količina ili stepen viremije kod svake svinje. Na kraju eksperimenta, svinje su izmerene i humano eutanazirane, a tkiva su prikupljena i fiksirana u puferisanom formalinu od 10%, nakon čega su ukalupljea u parafin i obrađena za histopatologiju od strane patologa sa sertifikatom odbora.
Skoring fenotipova kod svinja izloženih izazovu infekcije
[0357] Fenotip svinja je svakodnevno objektivno skorovan na sledeći način: Kakvo je ponašanje svinje? Ocena ponašanja: 0: BAR (svesna, oprezna i reaguje na stimuluse), 1: QAR (tiha, oprezna i reaguje na stimuluse), 2: Blago depresivna, 3: Depresivna, 4: Moribundna. Kakvo je telesno stanje svinje? Ocena stanja tela: 1: Izmršavela, 2: Mršava, 3: Idealana, 4: Debela, 5: Predebela/Gojazna. Koja je rektalno temperatura svinje? Normalna telesna temperatura 101,6-103,6°F (groznicom se smatra ≥ 104°F). Ima li hromosti (stepen)? Koji ud? Proceniti udove u kontekstu oticanje zglobova i lezija papka (proverite dno i strane papka). Ocena hromosti: 1: Nema hromosti, 2: Blaga i neravnomerna prilikom hoda, deluje ukočeno u pojedinim zglobovima, ali nema hromosti, 3: Blaga hromost, blago hramlje tokom hodanja, 4: Umereno hromost, očigledna hromost uklјučujući hromost u dodiru prstiju, 5: Jaka hromost, bez opterećenja udova telom, potrebna ohrabrenje da stoji/hoda. Ima li respiratornih poteškoća (stepen)? Da li postoji disanje otvorenim ustima? Da li postoji nazalni sekret (boja sekreta, količina sekreta: blag/umjeren/ozbilјan)? Da li ste primetili da životinja kašlјe? Ima li očnog sekreta? Respiratorni skor: 0: Normalno, 1: blaga dispneja i/ili tahipneja pod stresom (prilikom manipulisanja), 2: blaga dispneja i/ili tahipneja u mirovanju, 3: umerena dispneja i/ili tahipneja pod stresom (prilikom manipulisanja), 4: umerena dispneja i/ili tahipneja u mirovanju, 5: teška dispneja i/ili tahipneja pod stresom (prilikom manipulisanja), 6: teška dispneja i/ili tahipneja u mirovanju. Da li postoje dokazi o dijareji (stepen) ili povraćanju? Ima li krvi ili sluzi? Ocena dijareje: 0: nema uočenog fecesa, 1: normalna stolica, 2: meka stolica, ali je obrazovana (meke konzistencija kao jogurt, stvara slojeve slične fecesu krava), 3: tečna dijareja smeđe/tonirane boje sa čestičnim fekalnim materijalom, 4: tečna dijareja smeđe/tonirane boje bez čestičnog fekalnog materijala, 5: tečna dijareja koja deluje slična vodi.
[0358] Ovaj sistem bodovanja razvila je dr Megan Niederwerder na KSU i zasnovan je na sledećim publikacijama (Halbur i saradnici, 1995; Merck; Miao i saradnici, 2009; Patience i Thacker, 1989; Winckler i Willen, 2001). Skorovi i temperature su analizirani upotrebom ANOVA testa razdvojenog na osnovu genotipova kao tretmana.
Merenje PRRSV viremije
[0359] Viremija je određivana sa dva pristupa. Titracija virusa je vršena dodavanjem serijskih razblaženja seruma od 1:10 konfluentnim MARC-145 ćelijama u ploči sa 96 bunarića. Serum je razblaživan u Eagle-ovom minimalnom esencijalnom medijumu sa dodatkom 8% fetalnog goveđeg seruma, penicilina, streptomicina i amfotericina B, kao što je prethodno opisano (Prather i saradnici, 2013). Ćelije su ispitivane nakon 4 dana inkubacije na prisustvo citopatskog efekta upotrebom mikroskopa. Najveće razblaženje koje pokazuje citopatski efekat ocenjivano je kao krajnja tačka titracije. Ukupna RNK je izolovana iz seruma upotrebom MagMAX-96 kompleta za izolaciju virusne RNK kompanije Life Technologies, da bi se izmerila virusna nukleinska kiselina. Lančana reakcija polimeraze nakon reverzne transkripcije vršena je upotrebom kompleta EZ-PRRSV MPX 4.0 kompanije Tetracore na CFX-96 sistemu za PCR u realnom vremenu (Bio-Rad) prema uputstvima proizvođača. Svaka reakcija (25 µl) je sadržavala RNK iz 5,8 µl seruma. Standardna kriva je konstruisana pripremanjem serijskih razblaženja RNK kontrole koja je bila isporučena u kompletu (Tetracore). Prijavlјen je broj matrice po PCR reakciji.
Bojenje PAM ćelija na SIGLEC1 i CD 163
[0360] Svinjski alveolarni makrofagi (PAM) su prikupljeni ekscizijom pluća i njihovim ispunjavanjem sa ~ 100 ml hladnog fiziološkog rastvora puferisanog fosfatom. Nakon izvlačenja fiziološkog rastvora puferisanog fosfatom, isprane ćelije su istaložene, pa su resuspendovane u 5 ml hladnog fiziološkog rastvora puferisanog fosfatom i čuvane na ledu. Približno 10<7>PAM je inkubirano u 5 ml različitih antitela (anti-svinjski CD169 (klon 3B11/11; AbD Serotec); anti-svinjski CD163 (klon 2A10/11; AbD Serotec)), razblaženih u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom sa 5% fetalnog goveđeg seruma i 0,1% natrijum azida, tokom 30 minuta na ledu. Ćelije su zatim isprane i resuspendovane u razblaženju kozjeg anti-mišjeg IgG (life Technologies) konjugovanog sa fluorescein izotiocijanatom (FITC) od 1/100 u puferu za bojenje, nakon čega su ćelije inkubirane tokom 30 minuta na ledu. Najmanje 10<4>ćelija je analizirano upotrebom FACSCalibur protočnog citometra i Cell Quest softvera (Becton Dickinson).
Merenje Ig specifičnih za PRRSV
[0361] Da bi se izmerio Ig specifičan za PRRSV, rekombinantan PRRSV N protein je eksprimiran u bakterijama (Trible i saradnici, 2012), nakon čega je konjugovan sa magnetnim kuglicama kompanije Luminex, upotrebom kompleta (Luminex Corporation). Kuglice sa kuplovanim N proteinom su potom razblaživane u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom koji je sadržavao 10% kozjeg seruma, do 2.500 kuglica/50 µl, što je potom stavlјano u bunariće polistirenske ploče sa 96 bunarića okruglog dna. Serum je zatim razblaživan do 1:400 u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom koji je sadržavao 10% kozjeg seruma i po 50 µl razblaženja je prebacivano u po 2 bunarića koji su služili kao duplikati merenja. Konačno, ploča je inskubirana tokom 30 minuta uz lagano mućkanje na sobnoj temperaturi. Ploča je zatim isprana (3X) sa fiziološkim rastvorom puferisanim fosfatnom koji je sadržavao 10% kozjeg seruma i dodato je po 50 µl afinitetno prečišćenog kozjeg anti-svinjskog sekundarnog antitela konjugovanog sa biotinom-SP (IgG, Jackson ImmunoResearch) ili antifinitetno prečišćenog kozjeg antisvinjskog IgM obeleženog biotinom (KPL) koji su razblaživani do 2 µg/ml u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom sa 10% kozjeg seruma. Nakon inkubacije od 30 min, ploče su ponovo isprane (3X) i dodato je po 50 µl fikoeritrina konjugovanog sa streptavidinom (2 µg/ml (Moss, Inc.) u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom sa 10% kozjeg seruma). Ploče su isprane 30 minuta kasnije i mikrosfere su resuspendovane u 100 µl fiziološkog rastvora puferisanog fosfatom koji je sadržavao 10% kozjeg seruma, nakon čega su analizirane upotrebom MAGPIX i xPONENT 4.2 softvera kompanije Luminex. Zabeležen je srednji intenzitet fluorescencije (MFI).
REZULTATI
[0362] Mutacije u CD163 su kreirani upotrebom CRISPR/Cas9 tehnologije kao što je opisano prethodno u Primeru 1. Nekoliko životinja osnivača je proizvedeno injeciranjem u zigote i nuklearnim transferom iz somatskih ćelija. Pojedini od ovih osnivača su pareni stvarajući potomstvo za proučavanje. Jedan mužjak osnivač je sparen sa ženkama sa dva genotipa. Mužjak osnivač (67-1) posedovao je delecija od 11 bp u egzonu 7 na jednom alelu i adiciju od 2 bp u egzonu 7 (i 377 bp deleciju u prethodnom intronu) drugog alela, što je smatrano null životinjom (CD163<-/->). Jedna ženka osnivač (65-1) imala je adiciju od 7 bp u egzonu 7 u jednom alelu i neokarakterisani odgovarajući alel, tako da se smatrala heterozigotnom za nokaut (CD163<-/->). Genotip druge ženke osnivača (3 životinje koje su bile klonovi) sadržavao je još neokarakterisan alel i alel sa delecijom od 129 bp u egzonu 7. Predviđeno je da će ovo delecija rezultovati delecijom 43 aminokiseline u domenu 5. Parenja između ovih životinje su dovele do toga da su sva prasad nasledila null alel od nerasta i bilo deleciju 43 aminokiseline ili jedan od neokarakterisanih alela iz krmača. Pored prasadi divlјeg tipa koji su služili kao pozitivna kontrola za izazov virusom, ovo je proizvelo 4 dodatna genotipa (Tabela 8).
Tabela 12. Genoti ovi is itivani na rezistenciu izazova sa PRRSV NVSL i KS06 soevi
[0363] U vreme odlučivanja, prasad sa editovanim genima, kao i starosno odgovarajuća prasad divljeg tipa, transportovana su na Državni univerzitet u Kanzasu radi infekcije sa PRRSV kao izazovom. Inficiranje sa PRRSV je sprovedeno kao što je prethodno opisano (Prather i saradnici, 2013). Prasad, stara tri nedelјe, dovedena su u objekat za indukovanje infekcije i držana su kao jedna grupa. Svi eksperimenti su započeti nakon odobrenja institucionalnih komiteta za upotrebu životinja i biološke bezbednosti. Nakon aklimatizacije, svinje su inficirane izolatom PRRSV, NVSL 97-7895 (Ladinig i saradnici, 2015), razmnožavanim na MARC-145 ćelijama (Kim i saradnici, 1993). Svinje su bile inficirane sa približno 10<5>TCID50virusa. Polovina inokuluma je isporučena intramuskularno, a ostatak je isporučivan intranazalno. Sve inficirane svinje su držane kao jedna grupa, što je omogućilo kontinuirano izlaganje virusu od strane inficiranih susednih životinja. Uzorci krvi su prikupljani u različitim danima do 35 dana nakon infekcije i na kraju, 35. dana. Svinje su zatim obdukovane i tkiva su fiksirana u puferisanom formalinu od 10%, nakon čega su ukalupljana u parafin i obrađena za histopatologiju. Klinički znaci povezani sa PRRSV beleženi su tokom trajanja infekcije i uklјučivali su respiratorni distres, nedostatak apetita, letargiju i groznicu. Rezultati za kliničke znakove tokom perioda studije sumirani su na Sl. 9. Kao što se očekivalo, svinje divljeg tipa divljeg tipa (CD163+/+) pokazale su rane znake PRRSV infekcije, koji su dostigli vrhunac između 5. i 14. dana i opstali su u grupi tokom ostatka studije. Procenat febrilnih svinja dostigao je vrhunac oko 10. dana. Nasuprot tome, Null (CD163-/-) prasad nisu pokazala nikakve kliničke znake tokom celog perioda studije. Respiratorni znaci tokom akutne PRRSV infekcije ogledali su se u značajnim histopatološkim promenama u plućima (Tabela 9). Infekcija svinja divlјeg tipa pokazala je histopatologiju u skladu sa PRRS uklјučujući intersticijski edem sa infiltracijom mononuklearnih ćelija (Sl. 10). Nasuprot tome, nije bilo dokaza o promenama u plućima Null (CD163-/-) svinja. Veličina uzorka za različite genotipove je mala; ipak, srednji skorovi su bili 3,85 (n=7) za alel divljeg tipa, 1,75 (n=4) za neokarakterisan A, 1,33 (n=3) za neokarakterisan B i 0 (n=3) i za null (CD163-/-).
Tabela 13. Mikrosko ska analiza luća
[0364] Vrhunac kliničkih znakova bio je u korelaciji sa nivoima PRRSV u krvi. Merenje virusne nukleinske kiseline rađeno je izolovanjem ukupne RNK iz seruma, nakon čega je sledila amplifikacija PRRSV RNK upotrebom komercijalnog PCR testa u realnom vremenu za PRRSV sa reverznom transkriptazom (Tetracore, Rockville, MD). Standardna kriva je generisana pripremanjem serijskih razblaženja PRRSV RNK kontrole, isporučene u RT-PCR kompletu, i standardizovanjem rezultata kao broja matrivca po PCR reakciji od 50 µl. Izolat PRRSV pratio je tok PRRSV viremije kod CD163+/+ svinje divlјeg tipa (Sl.11). Viremija je bila očigledna četvrtog dana, dostigla je vrhunac 11. dana i opadala je do kraja studije. Nasuprot tome, virusna RNK nije detektovana kod CD163<-/->svinja u bilo kojoj vremenskoj tački tokom perioda studije. U skladu sa viremijom, proizvodnja antitela kod null i svinja sa neokarakterisanim alelima bila je detektovana do 14. i povećana do 28. dana. Nije bilo proizvodnje antitela kod null životinja (Sl. 12). Zajedno, ovi podaci pokazuju da svinje divlјeg tipa podržavaju replikaciju PRRSV sa proizvodnjom kliničkih znakova konzistentnih sa PRRS. Nasuprot tome, nokaut svinje nisu proizvodile viremiju i ispoljavale kliničke znake, iako su svinje bile inokulisane i stalno izlagane inficiranim susednim životinjama.
[0365] Na kraju studije, alveolarni makrofagi svinja su uklonjeni lavažom pluća i obojeni su u kontekstu površinske ekspresije SIGLEC1 (CD169, klon 3B11/11) i CD163 (klon 2A10/11), kao što je prethodno opisano (Prather i saradnici, 2013). Relativno visoki nivoi ekspresije CD163 su detektovani kod CD163+/+ životinja divlјeg tipa (Sl. 13). Nasuprot navedenom, CD163-/- svinje su pokazale samo pozadinske nivoe bojenja sa anti-CD163, potvrđujući time nokaut fenotip. Nivoi ekspresije za drugi makrofagni marker CD 169 bili su slični i kod životinja divljeg tipa i nokaut svinja (Sl. 14). Drugi površinski markeri makrofaga, uklјučujući MHC II i CD172, bili su isti za oba genotipa (podaci nisu prikazani).
[0366] Iako je veličina uzorka bila mala, svinje divlјeg tipa su imale tendenciju da dobijaju manju težinu tokom trajanja eksperimenta (prosečan dnevni prirast 0,81 kg ± 0,33, n=7) u odnosu na svinje druga tri genotipa (neokarakterisan A 1,32 kg ± 0,17, n=4; neokarakterisan B 1,20 kg ± 0,16, n = 3; null 1,21 kg ± 0,16, n = 3).
[0367] U drugom ispitivanju, 6 svinja sa alelima divlјeg tip, 6 sa Δ43 aminokiselina i 6 svinja sa neokarakterisanim alelom (B) inficirano je kao što je prethodno opisano, osim što je KS06-72109 upotrebljen za inokulaciju prasadi. Slično NVSL podacima, prasad divlјeg tipa i sa neokarakterisanim B razvijala su viremiju. Ipak, kod svinja tipa Δ43 aminokiselina, KS06 nije doveo do viremije (Sl.15; Tabela 7).
IMPLIKACIJE I ZAKLJUČAK
[0368] Klinički najrelevantnija bolest za industriju svinja je PRRS. Dok su programi vakcinacije bili uspešni u prevenciji ili ublažavanju većine patogena kod svinja, dokazano je da je PRRSV veći izazov. Ovde je CD163 identifikovan kao ulazni medijator za ovaj virusni soj. Nerast osnivač je kreiran injeciranjem CRISPR/Cas9 u zigote (Whitvorth i saradnici, 2014) i stoga nema transgena. Dodatno, jedan od alela iz krmače (takođe stvoren upotrebom CRISPR/Cas9) ne sadrži transgen. Prema tome, prase br. 40 nosi adiciju od 7 bp u jednom alelu i delecija od 11 bp u drugom alelu, ali ne sadrži transgen. Ovi aleli CD163 u osnovi rezistencije na viruse, predstavlјaju manje izmene genoma s obzirom da je genom svinja od oko 2,8 milijardi bp (Groenen i saradnici, 2012). Ukoliko bi se slično stvorene životinje uvele u snabdevanje hranom, mogli bi se sprečiti značajni ekonomski gubici.
Primer 3: Povećana rezistencija na genotip 1 svinjskog reproduktivnog i PRRS virusa kod svinja sa SRCR domenom 5 iz CD163 koji je zamenjen sa homolognim domenom 8 humanog SRCR nalik CD163
[0369] CD163 se smatra glavnim receptorom za virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRSV). U ovoj studiji, svinje su genetički modifikovane (GM) tako da poseduju jedan od sledećih genotipova: potpuni nokaut (KO) CD163, delecije unutar domena 5 receptora „hvatača” bogatog cisteinom (SRCR) za CD163 ili zamenu (razmenom domena) domena 5 SRCR sa sintetisanim egzonom koji kodira homologa domena 8 iz humanog SRCR sličnog CD163 (hCD 163L 1). Imunofenotipizacija svinjskih alveolarnih makrofaga (PAM) pokazala je da svinje sa KO ili delecijama SRCR domena 5 nisu eksprimirale CD163, kao i da PAM nisu podržavale PRRSV infekciju. PAM iz svinja koje su posedovale homolog domena 8 hCD163L1 eksprimirali su CD163 i podržavali su replikaciju virusa tipa 2, ali ne i virusa genotipa tipa 1. Infekcija svinja sa modifikovanim CD163, reprezentativnim virusima tipa 1 i tipa 2 dala je slične rezultate. Iako se virusi tipa 1 i tipa 2 smatraju genetički i fenotipski sličnima na nekoliko nivoa, uklјučujući potrebu za CD163 kao receptorom, rezultati pokazuju jasnu razliku između PRRSV genotipova u prepoznavanju molekula CD163.
MATERIJALI I METODE
Genomske modifikacije CD163 gena svinja
[0370] Eksperimenti koji su uklјučivali životinje i viruse rađeni su u skladu sa Vodičem za brigu i upotrebu polјoprivrednih životinja u istraživanju i nastavi Saveza društava za nauku o životinjama, kao i sa USDA Zakonom o dobrobiti životinja i propisima o dobrobiti životinja, a odobreni su od strane Državnog univerziteta u Kanzasu i institucionalnih komiteta za negu i upotrebu životinja i dalje institucionalnih odbora za biološku bezbednost Univerziteta u Misuriju. Mutacije u CD163 koje su upotrebljavane u ovoj studiji kreirane su upotrebom CRISPR/Cas9 tehnologije, kao što je opisano u prethodnim primerima. Mutacije su prikazane u vidu dijagrama na Sl.17. Dijagrami genomskih regiona koji su prikazani na Sl.17 pokrivaju sekvencu od introna 6 do introna 8 svinjskog CD 163 gena. Introni i egzoni prikazani u vidu dijagrama na Sl.17 nisu nacrtani u razmeri. Predviđeni proteinski proizvod je ilustrovan desno od svake genomske strukture. Relativna ekspresija makrofaga, merena nivoom površinskog CD163 na PAM, prikazana je krajnje desno na Sl.17. Crni regioni ukazuju na introne; beli regioni ukazuju na egzone; šrafiran region označava mimika egzona 11 iz hCD163L1, homologa svinjskog egzona 7; dok sivi region ukazuje na sintetisani intron sa PGK Neo konstruktom, kao što je prikazano na Sl.17.
[0371] Genski konstrukt KO-d7(11) za CD163, prikazan na Sl.17, poseduje deleciju 11 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147. Genski konstrukt KO-i7(2) za CD163, poseduje inserciju od 2 bazna para u egzonu 7 između nukleotida 3.149 i 3.150, kao i deleciju 377 baznih parova u intronu uzvodno od egzona 7, od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949. Predviđeno je da će ove izmene prouzrokovati mutacije tipa pomeraja okvira čitanja i preuranjenog stop kodona, što rezultuje samo delimičnom translacijom SRCR 5 i KO fenotipom. Tri druge mutacije su proizvele delecije u egzonu 7. Prva, d7(129), ima deleciju 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172. Konstrukt sa d7(129) takođe ima deleciju od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u egzonu 6, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 bp. Druga dva deleciona konstrukta, d7(1467) i d7(1280), imaju potpune delecije egzona 7 i 8 kao što je ilustrovano na Sl.17. d7(1467) ima deleciju 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897, a d7(1280) ima deleciju 1280 baznih parova od nukleotida 2.818 do nukleotida 4.097. Kod ovih delecionih konstrukata, drugi egzoni CD163 ostaju intaktni.
[0372] Poslednji konstrukt prikazan na Sl.17, HL11m, proizveden je upotrebom cilјanog događaja koji je delecijom ukloni egzon 7 i zamenio ga sintetisanim egzonom koji je kodirao homologa SRCR 8 iz humanog proteina sličnog CD163 tipa 1 (domen 8 hCD163L1 je kodiran egzonom11 iz hCD163L1). Peptidna sekvenca SRCR 8 je kreirana uvođenjem 33 nukleotidne promene u sekvencu svinjskog egzona 7. Neomicinska kaseta je uklјučena u sintetisani egzon da bi se omogućio skrining za modifikaciju. SEQ ID NO: 118 obezbeđuje nukleotidnu sekvencu za HL11m konstrukt u regionu koji odgovara istom regionu u referentnoj sekvenci SEQ ID NO: 47.
[0373] Dijagram svinjskog CD163 proteina i gena obezbeđen je na Sl. 18. SCRC (ovalni oblici) i PST (kvadrati) domeni proteina CD163, zajedno sa odgovarajućim egzonima gena prikazani su u okviru panela A na Sl.18. Poređenje peptidne sekvence za SRCR 5 iz CD163 svinje (SEQ ID NO: 120) i homologa SRCR 8 iz humanog CD163 (SEQ ID NO: 121) prikazani su u okviru panela B na Sl.18. Slika je zasnovana na pristupnim brojevima AJ311716 (svinjski CD163) i GQ397482 (hCD163-L1) iz GenBank baze podataka.
Virusi
[0374] Panel virusa upotrebljen u ovom primeru je naveden u Tabeli 14. Izolati su razmnožavani i titrirani na MARC-145 ćelijama (Kim i saradnici, 1993). Za titraciju, svaki virus je serijski razblaživan u odnosu 1:10 u MEM sa dodatkom 7% FBS, Pen-Strep (80 jedinica/ml i 80 µg/ml, tim redom), 3 µg/ml FUNGIZONE (amfotericina B) i 25 mM HEPES. Razblaženi uzorci su dodavani u četvoroplikatu konfluentnim MARC-145 ćelijama u ploči sa 96 bunarića, do finalne zapremine od 200 µl po bunariću, nakon čega su ćelije inkubirane tokom četiri dana na 37°C u 5% CO2. Krajnja tačka titracije je identifikovana kao poslednji bunarić sa citopatskim efektom (CPE). Infektivna doza kulture tkiva od 50% (TCID50/ml) je izračunavana je upotrebom postupaka koji su kao što je prethodno opisano (Reed i Muench, 1938).
Tabela 14. PRRSV izolati.
Infekcija alveolarnih makrofaga
[0375] Priprema i infekcija makrofaga urađeni su kao što je prethodno opisano (Gaudreault i saradnici, 2009 i Patton i saradnici, 2008). Pluća su uklonjena iz eutanaziranih svinja i urađena je lavaža sipanjem 100 ml hladnog fiziološkog rastvora puferisanog fosfatom (PBS) u traheju. Traheje su zatim pritisnute klemama i pluća su nežno masirana. Alveolarni sadržaj je presut u epruvete za centrifugiranje od 50 ml i čuvan je potom na ledu. Svinjski alveolarni makrofagi (PAM) su istaloženi centrifugiranjem na 1200 × g tokom 10 minuta na 4 ° C. Talozi su resuspendovani i jedan put isprani u hladnom sterilnom PBS-u. Ćelijski taloži su dalje resuspendovni u medijumu za zamrzavanje koji je sadržavao 45% RPMI 1640, 45% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 10% dimetilsulfoksida (DMSO), nakon čega su čuvane u tečnom azotu do upotrebe. Zamrznute ćelije su odmrzavane na ledu, pa su izbrojane i podešene do 5 × 10<5>ćelije/ml u medijumu (RPMI 1640 u koji je bilo dodato 10% FBS, PenStrep i FUNGIZONE; RPMI-FBS). Približno 10<3>PAM po bunariću dodato je zatim u ploče sa 96 mesta i ploče su inkubirane preko noći na 37°C u 5% CO2. Ćelije su dalje nežno oprane, da bi se uklonile ćelije koje nisu adherirale. Serijski razblaženja virusa od 1:10 dodavana su zatim u triplikate bunarića. Nakon inkubacije preko noći, ćelije su isprane sa PBS-om i fiksirane su tokom 10 minuta sa 80% acetonom. Nakon sušenja, bunarići su obojeni sa SDOW-17 mAt specifičnim za N-protein PRRSV (Rural Technologies Inc.) razblaženim 1:1000 u PBS-u sa 1% riblјeg želatina (PBS-FG; Sigma Aldrich). Nakon 30 minuta inkubacije na 37°C, ćelije su isprane sa PBS-om i obojene sa anti-mišjim IgG obeleženim sa ALEXAFLUOR 488 (Thermofisher Scientific) razblaženim 1:200 u PBS-FG. Ploče su inkubirane 30 minuta u mraku na 37°C, nakon čega su isprane sa PBS-om i posmatrane pod fluorescentnim mikroskopom. Infektivna doza kulture tkiva od 50% (TCID50)/ml je izračunavana je u skladu sa postupkom koji je prethodno opisan (Reed i Muench 1938).
Merenje površinske ekspresije CD169 i CD163 na PAM
[0376] Bojenje za površinsku ekspresiju CD 169 i CD 163 vršeno je kao što je prethodno opisano (Prather i saradnici, 2013). Približno 1×10<6>PAM je smešteno u polistirenske epruvete za protočnu citometriju (FACS) od 12 mm × 75 mm, nakon čega su inkubirane tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi u 1 ml PBS-a sa 10% normalnog mišjeg seruma, da bi se blokirali Fc receptori. Ćelije su zatim istaložene centrifugiranjem, pa su resuspendovane u 5 µl mišjeg anti-svinjskog CD169 mAt konjugovanog sa FITC (klon 3B11/11; AbD Serotec) i 5 µl mišjeg anti-svinjskog CD1169 mAt konjugovanog sa PE (Clone: 2A10/11, AbD Serotec). Nakon 30 minuta inkubacije, ćelije su dva puta isprane sa PBS-om koji je sadržavao 1% goveđeg serumskog albumina (BSA frakcija V; Hyclone) i odmah su analizirane na BD LSR Fortessa protočnom citometru (BD Biosciences) upotrebom FCS Express 5 softvera (De Novo Software). Za svaki uzorak je analizirano najmanje 10.000 ćelija.
Merenje PRRS viremije
[0377] RNK je izolovana iz 50 µl seruma, upotrebom Ambion-ovog MagMAX 96 kompleta za izolaciju iz virusa (Applied Biosistems) prema uputstvima proizvođača. PRRSV RNK je kvantifikovana upotrebom EZ-PRRSV MPX 4.0 cilјno-specifičnih reagensa za RT-PCR u realnom vremenu (Tetracore) koji su korišćeni prema uputstvima proizvođača. Svaka ploča je sadržavala kvantifikacione standarde i kontrolne setove kompanije Tetracore dizajnirane za upotrebu sa RT-PCR reagensima. PCR je rađen na CFX96 Touch PCR sistemu za detekciju u realnom vremenu (Bio-Rad) u formatu sa 96 bunarića, upotrebom preporučenih parametara amplifikacije. Rezultati PCR analiza su predstavljani kao log broj od broja RNK kopija PRRSV na 50 µl reakcione zapremine, što približno odgovara broju kopija po ml seruma. Površina ispod krive (AUC) za viremiju tokom vremena izračunavana je upotrebom GraphPad Prism programa, verzije 6.00 za Windows.
Merenje antitela na PRRSV
[0378] Mikrosferni fluorescentni imunoesej (FMIA) za detekciju antitela protiv proteina nukleokapsida (N) PRRSV urađen je kao što je prethodno opisano (Stephenson i saradnici, 2015). Rekombinantni PRRSV N protein bio je kuplovan za karboksilovane MAGPLEX polistirenske mikrosferne kuglice kompanije Luminex prema uputstvima proizvođača. Za FMIA, približno 2500 kuglica obloženih antigenom, resuspendovanih u 50 µL PBS-a sa 10% kozjeg seruma (PBS-GS), smešteno je u svaki bunarić polistirenske ploče sa 96 bunarića okruglog dna. Serumi su razblaživani 1:400 u PBS-GS, nakon čega je po 50 µl dodavano u svaki bunar. Ploča je umotana u foliju i inkubirana tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi uz lagano mućkanje. Ploča je zatim postavlјena na magnet i kuglice su isprane tri puta sa 190 µl PBS-GS. Za detekciju IgG, 50 µl afinitetnog prečišćenog kozjeg anti-svinjskog sekundarnog antitela konjugovanog sa biotinom-SP (IgG, Jackson ImmunoResearch) razblaženo je do 2 µg/ml u PBS-GS i po 100 µl je dodavano u svaki bunar. Ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, nakon čega je tri puta isprana, pa je dodato 50 µl fikoeritrina konjugovanog sa streptavidinom (2 µg/ml u PBS-GS; SAPE). Nakon 30 minuta, mikrosfere su isprane, resuspendovane u 100 µl PBS-GS i analizirane upotrebom MAGPIX instrumenta (LUMINEX) i xPONENT 4.2 softvera kompanie LUMINEX. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) je izračunavan za najmanje 100 kuglica mikrosfera.
Merenje haptoglobina (HP)
[0379] Količina Hp u serumu je merena upotrebom Hp ELISA kompleta specifičnog za svinje (Genway Biotech Inc.), a koraci su izvođeni prema uputstvima proizvođača. Uzorci seruma su razblaživani 1:10,000 u 1X rastvoru za razblaživanje, nakon čega su pipetirani u duplikatu na ELISA ploču sa 96 bunarića koja je prethodno bila obložena sa anti-svinjskim Hp i dalje su inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta, pa zatim isprani tri puta. Anti-Hp-HRP konjugat je dalje dodavan u svaki bunarić i ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. Ploča je još jednom isprana i u svaki bunar je potom dodato po 100 µl rastvora sa hromogenim supstratom. Nakon inkubacije u mraku tokom 10 minuta, u svaki bunar je dodavano i po 100 µl stop rastvora. Ploča je očitana na 450 nm upotrebom Fluostar Omega čitača mikroploča na bazi filtera (BMG Labtech).
REZULTATI
Fenotipske osobine PAM iz svinja sva modifikovanim CD163 genom
[0380] Osobine raspršivanja ćelija napred i bočno u materijalu za lavažu pluća upotrebljene su da bi se postavio prag za mononuklearnu subpopulaciju ćelija. Reprezentativni rezultati bojenja na CD169 i CD163 za različite modifikacije gena prikazane na Sl.17 su predstavlјeni na Sl.19. U reprezentativnom primeru predstavlјenom u okviru panela A na Sl.19, više od 91% PAM-ova iz WT svinja je bilo pozitivno i na CD169 i na CD163. Rezultati za 12 WT svinja upotrebljenih u ovoj studiji pokazali su srednju vrednost od 85 /- 8% dvostruko pozitivnih ćelija. Kao što je prikazano u okviru panela B na Sl.19, PAM iz CD163 KO svinje nisu pokazale nikakve dokaze za CD163, ali su zadržale normalne površinske nivoe CD169. Iako je bilo predviđeno da bi polipeptidi CD163 izvedeni iz d7(1467) i d7(1280) delecionih genotipova trebali da proizvedu modifikovane CD163 polipeptide usidrene za površinu PAM, rezultati imunobojenja nisu pokazali površinsku ekspresiju CD163 (pogledati Sl.19, panel D). Pošto MAt 2A10 prepoznaje epitop koji se nalazi u prva tri SRCR domena, odsustvo detekcije nije rezultat delecije imunskoreaktivnog epitopa. Za genotip d7(129) je bilo predviđeno da poseduje deleciju od 43 aminokiseline u SRCR 5 (pogledati Sl.17). U primeru predstavlјenom u okviru panela C na Sl.19, samo 2,4% ćelija je palo u dvostruko pozitivan kvadrant. Analiza PAM iz devet d7(129) svinja upotrebljenih u ovoj studiji, pokazala je procente dvostruko pozitivnih ćelija u rasponu od 0% do 3,6% (srednja vrednost = 0,9%). Površinska ekspresija CD169 ostala je slična sa WT PAM. Za potrebe ove studije, svinje koje su posedovale KO, d7(1467), d7(1280), i d7(129) genotipove, bile su kategorisane kao one koje poseduju CD163-null fenotip.
[0381] CD163 modifikacija koja sadrže peptidnu sekvencu HL11m za domen 8 iz hCD163L1, pokazala je dvostruku ekspresiju CD163<+>i CD169<+>na PAM (panel E na Sl.19). Međutim, u svim od HL11m svinja koje su analizirane u ovoj studiji, površinska ekspresija CD163 bila je značajno smanjena u poređenju sa WT PAM. Nivoi CD163 su pali na kontinuumu ekspresije, u rasponu od CD163 koji se ne može detektovati do svinja koje poseduju umerene nivoe CD163. U primeru prikazanom u okviru panela E na Sl.19, približno 60% ćelija je bilo u dvostruko pozitivnom kvadrantu, dok je 40% ćelija bojeno samo za CD169. Analiza PAM od ukupno 24 HL11m svinja pokazala je 38 /- 12% PAM ćelija koje su bile pozitivne samo na CD169 i 54+/-14% ćelija koje su bile dvostruko pozitivno (CD169<+>CD163<+>).
Cirkulišući nivoi haptoglobina u WT i svinjama sa modifikovanim CD163
[0382] Kao molekul za čišćenje, CD163 je odgovoran za uklanjanje HbHp kompleksa iz krvi (Fabriek i saradnici, 2005; Kristiansen i saradnici, 2001; i Madsen i saradnici, 2004). Nivo Hp u serumu obezbeđuje pogodan postupak za određivanje ukupnih funkcionalnih osobina makrofaga koji eksprimiraju CD163. Nivoi HP u serumima iz WT, HL11m i CD163-null svinja bili su merene u dobi od tri do četiri nedelјe, neposredno pre infekcije sa PRRSV. Rezultati, predstavlјeni na Sl.20, pokazali su da su serumi WT svinja imali najniže količine Hb (srednja vrednost A450=23+/- 0,18, n=10). Srednja vrednost i standardna devijacija za svaku grupu bile su WT, 0,23+/- 0,18, n=10; HL11m, 1,63+/- 0,8, n=11; i 2,06 /- 0,57, n=9, za null grupu. Null grupa je bila sastavlјena od genotipova koji nisu eksprimirali CD163 (CD163 nulti fenotip svinja). Hp merenja su vršena na jednoj ELISA ploči. Grupe sa istim slovom nisu se značajno razlikovale (p>0,05. Kruskal-Valisova jednofaktorska ANOVA sa Dunetovim post-testom). Srednja vrednost za A450 kod WT svinja bila je značajno drugačija od one za HL11m i CD163-null svinje (p<0,05). Iako je srednja vrednost A450 bila niža za HL11m grupu u poređenju sa CD163-null grupom (A450 = 1,6+/-0,8 naspram 2,1+/-0,6), razlika nije bila statistički značajna. Pošto se interakcija između HbHp i CD163 dešava preko SRCR 3 (Madsen i saradnici, 2004), povećana cirkulacija Hp u HL11m svinje, u poređenju sa WT svinjama verovatno nije posledica smanjenog afiniteta CD163 za Hb/Hp, već je rezultat smanjenog broja CD163<+>makrofaga zajedno sa smanjenom ekspresijom CD163 na preostalim makrofagima (pogledati, panel E na Sl.19).
Infekcija PAM virusima tipa 1 i tipa 2
[0383] Permisivnost svinja sa modifikovanim CD163 na PRRSV prvobitno je procenjivana inficiranjem PAM ćelija in vitro sa panelom od šest PRRSV izolata tipa 1 i devet izolata tipa 2 (pogledati Tabelu 14 za listu virusa). Virusi u panelu predstavlјaju različite genotipove, kao i razlike u nukleotidnim i peptidnim sekvencama, patogenezi i godinama izolacije. Podaci predstavlјeni u Tabeli 15 pokazuju rezultate eksperimenata upotrebom PAM iz tri svinje za svaku od grupa CD163 genotipova. Navedeni virusi odgovaraju PRRSV izolatima navedenim u Tabeli 14. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost /- standardna devijacija za procenat inficiranih PAM. CD163-null PAM su bili iz svinja koje eksprimiraju d7(129) alel (pogledati Sl. 17 i 19 za konstrukte CD163 gena i ekspresiju CD163 na PAM-ovima, tim redom).
Tabela 15. Infekcija PAM iz svinja divljeg tipa i GM svinja sa različitim izolatima PRRSV
[0384] Kao što se očekivalo, WT PAM su bile inficirane svim virusima. Nasuprot tome, svinje CD163-null fenotipa su bile negativne na infekciju svim virusima. Uočena je značajna razlika u odgovoru PAM iz HL11m svinja. Nijedan od virusa tipa 1 nije bio u stanju da inficira HL11m PAM; dok su svi virusi iz panela tipa 2 inficirali HL11m PAM, iako u mnogo nižim procentima u poređenju sa WT PAM.
[0385] Permisivnost je takođe procenjivana poređenjem krajnjih tačaka titracije virusa između WT i HL11m PAM za iste viruse tipa 2. Rezultati su prikazani za dve WT i dva HL11m svinje (Sl. 21). Log10vrednosti za TCID50su izračunavane na osnovu infekcije kultura makrofaga istim uzorkom virusa. Rezultati infekcija predstavlјaju dve različite svinje iz svakog genotipa. Virusi upotrebljeni za infekciju navedeni su u Tabeli 14. Log10vrednosti za TCID50kod PAM iz HL11m svinja bile su 1-3 log vrednost niže u poređenju sa WT PAM inficiranim istim virusom. Jedini izuzetak je bila infekcija modifikovanim živim sojem virusa iz vakcine. Sveukupno uzeti, rezultati ukazuju da PAM iz HL11m svinja poseduju smanjenu podložnost ili permisivnost na infekciju sa virusima tipa 2.
Infekcija svinja sa modifikovanim CD163 virusima tipa 1 i tipa 2
[0386] WT (krugovi), HL11m (kvadrati) i CD163-null (trouglovi) svinje bile su inficirane reprezentativnim virusima tipa 1 (SD13-15) (Sl.22, panel A, levi grafik) i tipa 2 (NVSL 97-7895) (Sl.22, panel A, desni grafik). Svinja null fenotipa je bila izvedena iz KO i d(1567) alela (pogledati Sl.17). Svinje iz tri genotipa koje su inokulisane istim virusom, bile su združene u jednom oboru, što je omogućilo kontinuirano izlaganje svinja sa modifikovanim CD163 virusu koji se oslobađao iz susednih WT životinja iz obora. Broj svinja inficiranih reprezentativnim virusom tipa 1 bio je: WT (n=4), HL11m (n=5) i Null (n=3); i virusom tipa 2: WT (n=4), HL11m (n=4) i Null (n=3). Kao što je prikazano na Sl.22, CD163-null svinje inficirane bilo virusom tipa 1 ili tipa 2 bile su negativne u pogledu viremije u svim vremenskim tačkama i nisu se serokonvertovale. Kao što se očekivalo, WT svinje su bile produktivno inficirane i posedovale su srednje nivoe viremije koji su se približavali vrednosti od 10<6>matrica po 50 µl PCR reakcije 7 dana nakon infekcije za oba virusa. Do 14. dana, sve WT svinje su bile serokonvertovane (pogledati Sl. 22, panel B). U skladu sa rezultatima PAM infekcije (Tabela 15), pet HL11m svinje inficiranih virusom tipa 1 nisu pokazale dokaze viremije ili antitela na PRRSV. Sve HL11m svinje inficirane izolatom tipa 2, NVSL, podržale su infekciju i bile su serokonvertovane (Sl. 22, panel B). Prisustvo redukovane permisivnosti kod HL11m svinje bilo je nejasno. Srednja viremija za tri od četiri HL11m svinje bila je slična vrednosti kod WT svinja. Međutim, za jednu od HL11m svinja, #101 (otvoreni kvadrati na Sl. 22, panel A, desni grafik), viremija je bila znatno smanjena u poređenju sa drugim svinjama u grupi HL11m genotipova. Objašnjenje za smanjenje viremije za 3 do 4 log vrednosti kod svinje #101 nije bilo jasno, ali je ukazivalo da pojedine HL11m svinje mogu biti manje permisivne za PRRSV, što je zapažanje koje podržava in vitro rezultate za PAM infekcije (Tabela 15). Pošto su sve svinje bile inokulisane istom količinom virusa i ostale su pomešane sa WT svinjama, niža viremija kod svinje #101 nije bila rezultat primanja manje količine virusa ili manje izloženosti virusu. Protočna citometrija makrofaga je pokazala da je ekspresija CD163 kod svinje #101 bila uporediva sa drugim HL11m svinjama (podaci nisu prikazani). Nije bilo razlike ni u sekvenci mimika za egzon 11.
[0387] Dodatna ispitivanja virusnih infekcija su sprovedena upotrebom dva virusa, NVSL 97-7895 i KS06-72109. Rezultati su prikazani na Sl.23. Svinje su praćene tokom 35 dana nakon infekcije, a podaci su prikazani kao površina ispod krive (AUC) za merenja viremije 3, 7, 11, 14, 21, 28 i 35 dana nakon infekcije. Kao što je prikazano na Sl.23. za NVSL, srednja vrednost AUC za sedam WT svinja inficiranih sa NVSL bila je 168 /- 8 u odnosu na 165 /- 15 za sedam HL11m svinja. Za KS06, srednje vrednosti AUC za šest WT i šest HL11m svinja bile su 156 /-9 i 163 /-13. tim redom. Za oba virusa nije bilo statistički značajne razlike između WT i HL11m svinja (p> 0,05). Sveukupno uzeto, rezultati su pokazali da HL11m svinje nisu uspele da podrže infekciju sa PRRSV tipa 1, ali su zadržale permisivnost za infekciju virusima tipa 2. Iako je došlo do smanjenja permisivnosti PAM iz HL11m svinja na PRRSV koje su inficirane in vitro sa izolatima tipa 2, ova razlika nije bila preneta i na svinju. Za rezultate prikazane na Sl. 23, opterećenje virusom je određivano izračunavanjem površine ispod krive (AUC) za svaku svinju tokom perioda infekcije od 35 dana. Izračunavanje AUC je vršeno upotrebom log10od PCR merenja viremije urađenih 0, 4, 7, 10, 14, 21, 28 i 35 dana nakon infekcije. Horizontalne linije pokazuju srednju vrednost i standardnu devijaciju. Klјuč: WT = svinje divlјeg tipa, HL11 = HL11m genotip svinja; Null = CD163-null genotip.
DISKUSIJA
[0388] CD163 je površinski protein makrofaga važan za uklanjanje viška Hb iz krvi i modulisanje inflamacije u odgovoru na oštećenje tkiva. Funkcioniše i kao virusni receptor. CD163 učestvuje i u proi u anti-inflamatornim odgovorima (Van Gorp i saradnici, 2010). Makrofagi pozitivni na CD163 su smešteni u alternativno aktiviranoj M2 grupu makrofaga, koji se generalno opisuju kao visoko fagocitni i anti-inflamatorni. M2 makrofagi učestvuju u čišćenju i popravci nakon mehaničkog oštećenja tkiva ili infekcije (Stein i saradnici, 1992). U kontekstu anti-inflamatornog kapaciteta, ekspresija CD163 je povećana anti-inflamatornim proteinima, kao što je IL-10 (Sulahian i saradnici, 2002). Tokom inflamacije, CD163 smanjuje inflamaciju tako što smanjuje oksidaciju kroz uklanjanje cirkulišućeg hema iz krvi. Proizvodi degradacije hema, kao što su bilverdin, bilirubin i uglјen monoksid moćni su anti-inflamatorni molekuli (Soares i Bach, 2009 i Jeney i saradnici, 2002). U kontekstu proinflamatornog kapaciteta, umrežavanje CD 163 na površini makrofaga upotrebom anti-CD 163 antitela ili bakterijama dovodi do lokalizovanog oslobađanja pro-inflamatornih citokina, uklјučujući IL-6, GM-CSF, TNFα i IL-1β ( Van den Heuvel i saradnici, 1999 i Fabriek i saradnici, 2009).
[0389] GM svinje kojima nedostaje CD163 ne podržavaju replikaciju PRRSV izolatom tipa 2 (Whitworth i saradnici, 2016). U ovoj studiji, in vitro ispitivanja infekcija su pokazala rezistenciju makrofaga CD163-null fenotipa na obiman panel PRRSV izolata tipa 1 i tipa 2, dodatno proširujući rezistenciju tako da potencijalno uklјuči sve PRRSV izolate (Tabela 15). Potvrđena je rezistenciju makrofaga CD163-null fenotipa na viruse tipa 1 i tipa 2 in vivo (Sl.22 i Sl.23). Na osnovu ovih rezultata, doprinos drugih PRRSV receptora koji su prethodno bili opisani u literaturi (Zhang i Yoo, 2015) može biti isključen. Na primer, Shanmukhappa i saradnici (2007) su pokazali da su ne-permisivne BHK ćelije transfektovane sa CD151 plazmidom stekle sposobnost da podrže replikaciju PRRSV, a pokazano je i da inkubacija sa poliklonskim anti-CD151 antitelom značajno smanjuje infekciju MARC-145 ćelija. Dodatno, ranije je pokazano da ćelijska linija majmuna, SJPL, koja je prvobitno razvijena za upotrebu u razmnožavanju virusa svinjskog gripa, podržava replikaciju PRRSV (Provost i saradnici, 2012). Važne osobine SJPL ćelijske linije uklјučivala su prisustvo CD 151 i odsustvo sijaloadhezina i CD163. Uzeti zajedno, ovi podaci su obezbedili ubedlјive dokaze da je samo prisustvo CD151 dovolјno da podrži replikaciju PRRSV. Rezultati ove studije koji pokazuju odsustvo PRRSV infekcije kod makrofaga i svinja koje poseduju CD163-null fenotip, ukazuju da CD151, kao alternativni receptor za PRRSV, nije biološki relevantan.
[0390] Virusni proteini GP2a i GP4, koji obrazuju deo heterotrimernog kompleksa GP2a, GP3, GP4 na površini PRRSV, mogu biti koprecipitirani sa CD163 u testovima taloženja iz ćelija transfektovanih sa GP2 i GP4 plazmidima (Das i saradnici, 2009). Pretpostavlјa se da GP2 i GP4 obrazuju interakciju sa jednim ili više SRCR domena iz CD 163. In vitro testovi infektivnosti koji uklјučuju okosnicu cDNK iz CD163 svinja sa razmenom domena između svinjskog SRCR 5 i homologa iz SRCR 8 hCD163-L1 dalјe lokalizuju region koji koriste virusi tipa 1 za SRCR 5 (Van Gorp i saradnici, 2010). Zanimlјivo je pretpostaviti da se stabilna interakcija između GP2/GP4 i CD163 odvija preko SRCR 5. Dodatni virusni glikoproteini, kao što su GP3 i GP5, mogu dalјe stabilizovati kompleks virusa i receptora ili mogu funkcionisati kao koreceptorski molekuli. Potreba za SRCR 5 je istraživana u ovoj studiji inficiranjem makrofaga i svinja koje poseduju HL11m alel, koji je ponovo doveo do zamene domena sa SRCR 8 iz CD163L1 uvođenjem supstitucije od 33 bp u svinjski egzon 7. HL11m alel je takođe uklјučivao neomicinsku kasetu za selekciju ćelija pozitivnih na genetičku modifikaciju (Sl. 17). HL11m svinje su eksprimirale CD163 na PAM, iako sa smanjenim nivoima u poređenju sa WT PAM (Sl. 19, uporediti panele A i E). Smanjena ekspresija je verovatno bila posledica prisustva neomicinske kasete, koja se nalazila između mimika egzona 11 i sledećeg introna. HL11m svinje nisu bile permisivne na infekciju virusom tipa 1, što potvrđuje važnost SRCR 5. Ipak, HL11m makrofagi i HL11m svinje su podržavali infekciju virusima tipa 2. Na osnovu rezultata titracije virusa i procenta infekcije, PAM iz HL11m svinja su pokazale sveukupno smanjenje permisivnosti za virus u poređenju sa WT makrofagima (Tabela 15 i Sl.17). Smanjena permisivnost može biti posledica smanjenog nivoa CD163 na HL11m makrofagima, u kombinaciji sa smanjenim afinitetom virusa za modifikovani protein CD163. Pod pretpostavkom da virusi tipa 2 poseduju zahtev za SRCR 5 i da L1 SRCR 8 može funkcionisati kao pogodna zamena, niži afinitet može biti objašnjen razlikom u peptidnim sekvencama između humanog SRCR 8 i svinjskog SRCR 5 (pogledati Sl. 18, panel B). Međutim, smanjena permisivnost PAM nije važila i kod svinja. Srednja viremija za HL11m svinje nije bila značajno različita u poređenju sa WT svinjama (Sl.23). Pored PAM, PRRSV infekcija intravaskularnih, septalnih i makrofaga limfoidnog tkiva doprinosila je viremiji (Lawson i saradnici, 1997 i Morgan i saradnici, 2014). Potencijalni doprinosi ovih i drugih populacija ćelija pozitivnih na CD163 u održavanju ukupnog opterećenja virusom u HL11m svinjama zaslužuju dalјe studije.
[0391] Iako su CD163 plazmidi koji poseduju delecije SRCR domena stabilno eksprimirani u HEK ćelijama (Van Gorp i saradnici, 2010), delecija egzona 7 i 8 u d7(1467) i d7(1280) rezultovala je nedostatkom vidlјive površinske ekspresije CD163 (Sl. 19, panel D). Pošto 2A10 mAt koje se upotrebljava za protočnu citometriju prepoznaje tri N-terminalna SRCR domena (Van Gorp i saradnici, 2010), a verovatno i domene egzona 7 i 8 (Sanchez i saradnici, 1999), odsustvo detekcije nije bilo usled uklanjanja epitopa za 2A10 u mutiranim proteinima. Dok se mala količina ekspresije CD163 može detektovani na PAM iz pojedinih od d7(129) svinja (pogledati Sl.19, panel C), količina eksprimiranog proteina nije bila dovolјna da podrži infekciju sa PRRSV kod PAM ili svinja. Odsustvo ekspresije CD163 u delecionim mutantima egzona 7 i 8 nije u potpunosti shvaćeno, ali je verovatno rezultat degradacije iRNK i/ili proteina.
[0392] Godine 2003, CD163 je identifikovan kao receptor za virus afričke svinjske groznice (ASFV; Sanchez-Torres i saradnici, 2003). Ovaj zaklјučak je zasnovan na zapažanju da inficirani makrofagi poseduju zreli fenotim pozitivan na CD163, dok anti-CD163 antitela, kao što je 2A10, blokiraju ASFV infekciju makrofaga in vitro. Ostaje da se utvrdi da li su svinje bez CD163 rezistene na infekciju sa ASFV.
[0393] Modeli ćelijske kulture koji uklјučuju modifikacije PRRSV receptora obezbedili su dragocen uvid u mehanizme ulaska, replikacije i patogeneze PRRSV. Jedan jedinstveni aspekt ove studije bilo je sprovođenje paralelnog eksperimenta in vivo upotrebom svinja sa modifikovanim receptorima. Ovo istraživanje ima važan uticaj na izvodlјivost razvoja preventivnih lekova za jednu od najozbilјnijih bolesti sa kojima se ikada suočila svetska industrija svinja.
[0394] Primeri koji su ovde opisani su obezbeđeni kao ilustracije i nije predviđeno da ograniče obim pronalaska.
[0395] Imajući u vidu prethodno navedeno, videće se da je nekoliko cilјeva pronalaska postignuto i da su dobijeni i drugi korisni rezultati.
REFERENCE
[0396]
Allende R i saradnici, 1999. North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome viruses differ in non-structural protein coding regions. J. Gen. Virol.80: 307-315.
Bauer BK i saradnici, Arginine supplementation in vitro increases porcine embryo development and affects mRNA transcript expression. Reprod Fertil Dev 2011; 23:107.
Beaton BP i saradnici, Compound transgenics: recombinase- mediated gene stacking. U: Pinkert CA (ur.). Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, 3. izd. Waltham, MA: Elsevier; 2014:565-578.
Benfield DA i saradnici, 1992. Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (Isolate ATCC VR-2332). J Vet Diag Invest 4:127-133.
Boddicker i saradnici, 2014. Genome-wide association and genomic prediction for host response to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection. Genetics, selection, evolution: GSE 46, 18.
Borg NA i saradnici, CD1d-lipid- antigen recognition by the semi-invariant NKT T-cell receptor. Nature 2007; 448:44-49.
Brinster RL i saradnici, Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A 1985; 82:4438-4442.
Calvert JG i saradnici, 2007. CD163 expression confers susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome viruses. J Virol.81:7371-7379.
Carter DB i saradnici, Phenotyping of transgenic cloned piglets. Cloning Stem Cells 2002; 4:131-145. Cong L i saradnici, Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013; 339:819-823.
Dai Y i saradnici, Targeted disruption of the alpha1,3-galactosyltransferase gene in cloned pigs. Nat Biotechnol 2002; 20:251-255.
Das PB i saradnici, 2009. The minor envelope glycoproteins GP2a and GP4 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus interact with the receptor CD163. J Virol.84:1731-40.
Delputte PL i saradnici, 2002. Involvement of the matrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparin-like receptor on porcine alveolar macrophages. J Virol.76:4312-4320.
Etzerodt A. i saradnici, 2013. Plasma clearance of hemoglobin and haptoglobin in mice and effect of CD163 gene targeting disruption. Antioxidants & redox signaling 18, 2254-2263.
Etzerodt A. i saradnici, 2013. CD163 and inflammation: biological, diagnostic, and therapeutic aspects. Antioxidants & redox signaling 18, 2352-2363.
Fabriek BO i saradnici, 2005. The macrophage scavenger receptor CD163. Immunobiology.
210:153-160.
Fabriek BO i saradnici, 2009. The macrophage scavenger receptor CD163 functions as an innate immune sensor for bacteria. Blood.113:887-892.
Gaj T i saradnici, ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas- based methods for genome engineering. Trends Biotechnol 2013; 31: 397-405.
Gaudreault N i saradnici, 2009. Factors affecting the permissiveness of porcine alveolar macrophages for porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Archiv Virol.154:133-136. Graversen J.H. i saradnici, 2012. Targeting the hemoglobin scavenger receptor CD163 in macrophages highly increases the anti-inflammatory potency of dexamethasone. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 20, 1550-1558.
Groenen M.A. i saradnici, 2012. Analyses of pig genomes provide insight into porcine demography and evolution. Nature 491, 393-398.
Hai T i saradnici, One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system. Cell Res 2014; 24: 372-375.
Halbur P.G. i saradnici, 1995. Comparison of the pathogenicity of two US porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus. Veterinary pathology 32, 648-660.
Hammer RE i saradnici, Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature 1985; 315:680-683.
Hauschild J i saradnici, Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108:12013-12017.
Holtkamp D.J. i saradnici, 2013. Assessment of the economic impact of porcine reprodutive and respiratory syndrome virus on United States pork producers. Journal of Swine Health and Production 21, 72-84.
Hwang WY i saradnici, Efficient genome editing in zebrafish using a knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning. Cell Res 2011; 21:979-982.
Hwang WY i saradnici, Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol 2013; 31:227-229.
Jeney V i saradnici, 2002. Pro-oxidant and cytotoxic effects of circulating heme. Blood. 100:879-887.
Keffaber K.K., 1989. Reproductive failure of unknown etiology. American Association of Swine Practitioners Newsletter 1, 1-10.
Kim H.S i saradnici, 1993. Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line. Arch Virol 133, 477-483.
Kristiansen M i saradnici, 2001. Identification of the haemoglobin scavenger receptor. Nature.
409:198-201.
Kwon DN i saradnici, Production of biallelic CMP-Neu5Ac hydroxylase knock-out pigs. Sci Rep 2013; 3:1981.
Ladinig A. i saradnici, 2015. Pathogenicity of three type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains in experimentally inoculated pregnant gilts. Virus Res 203, 24-35.
Lai L i saradnici, Production of alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning. Science 2002; 295:1089-1092.
Lai L i saradnici, Creating genetically modified pigs by using nuclear transfer. Reprod Biol Endocrinol 2003; 1:82.
Lai L i saradnici, Production of cloned pigs by using somatic cells as donors. Cloning Stem Cells 2003; 5:233-241.
Lawson SR i saradnici, 1997. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection of gnotobiotic pigs: sites of virus replication and co-localization with MAC-387 staining at 21 days post-infection. Virus Res.51:105-113.
Lee K i saradnici, Engraftment of human iPS cells and allogeneic porcine cells into pigs with inactivated RAG2 and accompanying severe combined immunodeficiency. Proc Natl Acad Sci U S A 2014; 111:7260-7265.
Lee K i saradnici, Piglets produced from cloned blastocysts cultured in vitro with GM-CSF. Mol Reprod Dev 2013; 80: 145-154.
Li D i saradnici, Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol 2013; 31:681-683.
Lillico SG i saradnici, Live pigs produced from genome edited zygotes. Sci Rep 2013; 3:2847.
Machaty Z i saradnici, Complete activation of porcine oocytes induced by the sulfhydryl reagent, thimerosal. Biol Reprod 1997; 57:1123-1127.
Madsen M i saradnici, 2004. Molecular characterization of the haptoglobin-hemoglobin receptor CD 163. Ligand binding properties of the scavenger receptor cysteine-rich domain region. J Biol Chem.279:51561-51567.
Merck, The Merck Veterinary Manual. http://www.merckmanuals.com/vet/appendixes/reference_guides/normal_rectal_temperature_ ran ges.html.
Miao Y.L. i saradnici, 2009. Centrosome abnormalities during porcine oocyte aging. Environmental and molecular mutagenesis 50, 666-671.
Morgan SB i saradnici, 2014. Pathology and Virus Distribution in the Lung and Lymphoid Tissues of Pigs Experimentally Inoculated with Three Distinct Type 1 PRRS Virus Isolates of Varying Pathogenicity. Transbound Emerg Dis. Nov 10. pp 1-11.
Nelsen CJ i saradnici, 1999. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents. J. Virol.73, 270-280.
Neumann EJ i saradnici, Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States. J Am Vet Med Assoc 2005; 227:385-392.
Niu Y i saradnici, Generation of gene-modified Cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell 2014; 156:836-843.
Patience J.F i saradnici, 1989. Swine Nutrition Guide, in: Center, P.S. (Ed.), University of Saskatchewan, Saskatoon, CA, pp.149-171.
Patton JP i saradnici, 2008. Modulation of CD163 receptor expression and replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in porcine macrophages. Virus Res.140: 161-171. Prather RS i saradnici, An intact sialoadhesin (Sn/SIGLEC1/CD 169) is not required for attachment! internalization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol 2013; 87:9538-9546.
Prather, R.S. i saradnici, 2013. An intact sialoadhesin (Sn/SIGLEC1/CD169) is not required for attachment/internalization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol 87, 9538-9546.
Provost C i saradnici, 2012. Identification of a new cell line permissive to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection and replication which is phenotypically distinct from MARC-145 cell line. Virol J.9:267.
Reed JL i saradnici, 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene 27:493-497.
Ross JW i saradnici, Optimization of square-wave electroporation for transfection of porcine fetal fibroblasts. Transgenic Res 2010; 19:611-620.
Rowland R.R. i saradnici, 2012. Control of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) through genetic improvements in disease resistance and tolerance. Frontiers in genetics 3, 260. Sanchez C i saradnici, 1999. The porcine 2A10 antigen is homologous to human CD163 and related to macrophage differentiation. Journal of Immunology 162:5230-5237.
Sánchez-Torres C i saradnici, 2003. Expression of porcine CD163 on monocytes/macrophages correlates with permissiveness to African swine fever infection. Arch Virol.148:2307-2323.
Schaer, C.A. i saradnici, 2006a. Constitutive endocytosis of CD163 mediates hemoglobin-heme uptake and determines the noninflammatory and protective transcriptional response of macrophages to hemoglobin. Circulation research 99, 943-950.
Schaer D.J. i saradnici, 2006b. CD163 is the macrophage scavenger receptor for native and chemically modified hemoglobins in the absence of haptoglobin. Blood 107, 373-380.
Schaer D.J. i saradnici, 2006c. Hemophagocytic macrophages constitute a major compartment of heme oxygenase expression in sepsis. European journal of haematology 77, 432-436.
Shanmukhappa K i saradnici, 2007. Role of CD151, A tetraspanin, in porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection. Virol J.4:62.
Shimozawa N i saradnici, Abnormalities in cloned mice are not transmitted to the progeny. Genesis 2002; 34:203-207.
Smit AFA i saradnici, RepeatMasker Open-3.0. 1996-2010. Current Version: open-4.0.5 (RMLib: 20140131 and Dfam: 1.2). http:// www.repeatmasker.org&gt. CD163: accessed July 25, 2014; CD1D: accessed August 27, 2013.
Soares MP i saradnici, 2009. Heme oxygenase-1: from biology to therapeutic potential. Trends Mol Med.15:50-58.
Stein M i saradnici, 1992. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: a marker of alternative immunologic macrophage activation. J Exp Med.176:287-292. Stephenson R i saradnici, 2015. Multiplex serology for common viral infections in feral pigs in Hawaii between 2007 and 2010. Prihvaćeno za objavljivanje. J Wildlife Dis 51:239-2343.
Sulahian TH1 i saradnici, 2002. Human monocytes express CD163, which is upregulated by IL-10 and identical to p155. Cytokine.200012:1312-1321.
Terns MP i saradnici, CRISPR-based adaptive immune systems. Curr Opin Microbiol 2011; 14:321-327.
Trible B.R. i saradnici, 2012. Recognition of the different structural forms of the capsid protein determines the outcome following infection with porcine circovirus type 2. J Virol 86, 13508-13514. U.S. Department of Agriculture and U.S. Department of Health and Human Services. Dietary Guidelines for Americans, 2010.7. izdanje.
Van Breedam W i saradnici, Porcine reproductive and respiratory syndrome virus entry into the porcine macrophage. J Gen Virol 2010; 91:1659-1667.
Van Breedam, W. i saradnici, 2010. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus entry into the porcine macrophage. J Gen Virol 91, 1659-1667.
Van den Heuvel MM i saradnici, 1999. Regulation of CD 163 on human macrophages: cross-linking of CD163 induces signaling and activation. J Leukoc Biol.66:858-866.
van den Hoff MJ i saradnici, Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Res 1992; 20:2902.
Van Gorp H. i saradnici, 2010. Scavenger receptor CD163, a Jack-of-all-trades and potential target for cell-directed therapy. Mol Immunol 47, 1650-1660.
Van Gorp H i saradnici, 2010. Identification of the CD163 protein domains involved in infection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol.84:3101-3105.
Walters EM i saradnici, Advancing swine models for human health and diseases. Mo Med 2013; 110:212-215.
Wang H i saradnici, One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 2013; 153: 910-918.
Welch SK i saradnici, 2010. A brief review of CD163 and its role in PRRSV infection. Virus Res.
154:98-103.
Wells K.D. i saradnici, 2014. Use of the CRISPR/Cas9 system to produce genetically engineered pigs from in vitro-derived oocytes and embryos. Biol Reprod 91, 78.
Wensvoort G. i saradnici, 1991. Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus. Veterinary Quarterly 13, 121-130.
Whitworth KM i saradnici, 2016. CD163 facilitates both entry and replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Nature Biotech.34:20-22.
Whitworth KM i saradnici, Method of oocyte activation affects cloning efficiency in pigs. Mol Reprod Dev 2009;76:490-500.
Whitworth KM i saradnici, Activation method does not alter abnormal placental gene expression and development in cloned pigs. Mol Reprod Dev 2010; 77:1016-1030.
Whitworth KM i saradnici, Scriptaid corrects gene expression of a few aberrantly reprogrammed transcripts in nuclear transfer pig blastocyst stage embryos. Cell Reprogram 2011; 13:191-204. Whitworth K.M. i saradnici, 2014. Use of the CRISPR/Cas9 system to produce genetically engineered pigs from in vitro-derived oocytes and embryos. Biol Reprod 91, 78.
Whyte JJ i saradnici, Genetic modifications of pigs for medicine and agriculture. Mol Reprod Dev 2011; 78:879-891.
Whyte JJ i saradnici, Gene targeting with zinc finger nucleases to produce cloned eGFP knockout pigs. Mol Reprod Dev 2011; 78:2.
Wiedenheft B i saradnici, RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature 2012; 482:331-338.
Winckler C. i saradnici, 2001. The reliability and repeatability of a lameness scoring system for use as an indicator of welfare in dairy cattle. Acta Agricultura Scandinavica Section A. Animal Science, 103-107.
Yang D i saradnici, Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning. Cell Res 2011; 21:979-982.
Yoshioka K i saradnici, Birth of piglets derived from porcine zygotes cultured in a chemically defined medium. Biol Reprod 2002; 66:112-119.
Zhang Q i saradnici, 2015. PRRS virus receptors and their role for pathogenesis. Vet Microbiol.
177:229-241.
Zhao J i saradnici, Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos. Cell Reprogram 2010; 12:75-83. Zhao J i saradnici, Significant improvement in cloning efficiency of an inbred miniature pig by histone deacetylase inhibitor treatment after somatic cell nuclear transfer. Biol Reprod 2009; 81:525-530.
TABELA SEKVENCI
SEQ VRSTA OPIS SEQ ID NO:1 nukleotidna CRISPR 10
SEQ ID NO:2 nukleotidna CRISPR 131
SEQ ID NO:3 nukleotidna CRISPR 256
SEQ ID NO:4 nukleotidna CRISPR 282
SEQ ID NO:5 nukleotidna CRISPR 4800
SEQ ID NO:6 nukleotidna CRISPR 5620
SEQ ID NO:7 nukleotidna CRISPR 5626
SEQ ID NO:8 nukleotidna CRISPR 5350
SEQ VRSTA OPIS
SEQ ID NO:9 nukleotidna eGFP1
SEQ ID NO:10 nukleotidna eGFP2
SEQ ID NO:11 nukleotidna Nizvodni prajmer 9538, fragment SEQ ID NO:12 nukleotidna Reverzni primer 9538, fragment SEQ ID NO:13 nukleotidna Nizvodni prajmer 8729, fragment SEQ ID NO:14 nukleotidna Nizvodni prajmer 8729, fragment SEQ ID NO:15 nukleotidna CD163 divljeg tipa
SEQ ID NO:16 nukleotidna Sl.4, panel C WT
SEQ ID NO:17 nukleotidna Sl.4, panel C #1
SEQ ID NO:18 nukleotidna Sl.4, panel C #2
SEQ ID NO:19 nukleotidna Sl.4, panel C #3
SEQ ID NO:20 nukleotidna Sl.5, panel A WT
SEQ ID NO:21 nukleotidna Sl.5, panel A #1-1
SEQ ID NO:22 nukleotidna Sl.5, panel A #1-4
SEQ ID NO:23 nukleotidna Sl.5, panel A #2-2
SEQ ID NO:24 nukleotidna Sl.6, panel C CD163 WT SEQ ID NO:25 nukleotidna Sl.6, panel C CD163 #1
SEQ ID NO:26 nukleotidna Sl.6, panel C CD163 #2
SEQ ID NO:27 nukleotidna Sl.6, panel C CD163 #3
SEQ ID NO:28 nukleotidna Sl.6, panel C eGFP WT
SEQ ID NO:29 nukleotidna Sl.6, panel C eGFP #1-1
SEQ ID NO:30 nukleotidna Sl.6, panel C eGFP #1-2
SEQ ID NO:31 nukleotidna Sl.6, panel C eGFP #2
SEQ ID NO:32 nukleotidna Sl.6, panel C eGFP #3
SEQ ID NO:33 nukleotidna Sl.7, panel C WT
SEQ ID NO:34 nukleotidna Sl.7, panel C #67-1
SEQ ID NO:35 nukleotidna Sl.7, panel C #67-2 a1
SEQ ID NO:36 nukleotidna Sl.7, panel C #67-2 a2
SEQ ID NO:37 nukleotidna Sl.7, panel C #67-3
SEQ ID NO:38 nukleotidna Sl.7, panel C #67-4 a1
SEQ ID NO:39 nukleotidna Sl.7, panel C #67-4 a2
SEQ ID NO:40 nukleotidna Sl.8, panel D WT
SEQ ID NO:41 nukleotidna Sl.8, panel D #166-1.1
SEQ ID NO:42 nukleotidna Sl.8, panel D #166-1.2
SEQ ID NO:43 nukleotidna Sl.8, panel D #166-2
SEQ ID NO:44 nukleotidna Sl.8, panel D #166-3.1
SEQ ID NO:45 nukleotidna Sl.8, panel D #166-3.2
SEQ ID NO:46 nukleotidna Sl.8, panel D #166-4
SEQ ID NO:47 nukleotidna Sl.16 delimičan WT CD163 SEQ VRSTA OPIS
SEQ ID NO.48-67 nukleotidna Sekvence prajmera (Tabela 1)
SEQ ID NO.68-79 nukleotidna Sekvence prajmera (Tabela 2)
SEQ ID NO.80-85 nukleotidna Sekvence prajmera (Tabela 3)
SEQ ID NO.86-97 nukleotidna Sekvence prajmera (Tabela 4)
SEQ ID NO: 98 nukleotidna Alel sa delecijom od 1506 bp
SEQ ID NO: 99 nukleotidna Alel sa delecijom od 7 bp
SEQ ID NO: 100 nukleotidna Alel sa delecijom od 1280 bp
SEQ ID NO: 101 nukleotidna Alel sa delecijom od 1373 bp
SEQ ID NO: 102 nukleotidna Alel sa delecijom od 11 bp
SEQ ID NO: 103 nukleotidna Alel sa delecijom od 2 bp i 377 bp
SEQ ID NO: 104 nukleotidna Alel sa delecijom od 124 bp
SEQ ID NO: 105 nukleotidna Alel sa delecijom od 123 bp
SEQ ID NO: 106 nukleotidna Alel sa delecijom od 1 bp
SEQ ID NO: 107 nukleotidna Alel sa delecijom od 130 bp
SEQ ID NO: 108 nukleotidna Alel sa delecijom od 132 bp
SEQ ID NO: 109 nukleotidna Alel sa delecijom od 1467 bp
SEQ ID NO: 110 nukleotidna Alel sa delecijom od 1930 bp u egzonu 6, od 129 bp u egzonu 7 i 12 bp
SEQ ID NO: 111 nukleotidna Alel sa delecijom od 28 bp
SEQ ID NO: 112 nukleotidna Alel sa delecijom od 1387 bp
SEQ ID NO: 113 nukleotidna Alel sa delecijom od 1382 bp i 11 bp
SEQ ID NO: 114 nukleotidna Alel sa delecijom od 1720 bp
SEQ ID NO: 115 nukleotidna Insertovana sekvenca za SEQ.99
SEQ ID NO: 116 nukleotidna Insertovana sekvenca za SEQ.110
SEQ ID NO: 117 nukleotidna Insertovana sekvenca za SEQ.113
SEQ ID NO: 118 nukleotidna Sekvenca za razmenu domena
SEQ ID NO: 119 nukleotidna Alel sa delecijom od 452 bp
SEQ ID NO: 120 peptid SRCR 5 iz CD163 svinja
SEQ ID NO: 121 peptid SRCR 8 homolog humanog CD163L1
Prather, Randall
Wells, Kevin
Whitworth, Kristin
<120> PATHOGEN-RESISTANT ANIMALS HAVING MODIFIED CD163 GENES <130> UMO 16001.WO2
<150> US 62/202,145
<151> 2015-08-06
<160> 121
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 1
ggaaacccag gctggttgga ggg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 2
ggaactacag tgcggcactg tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 3
cagtagcacc ccgccctgac ggg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 4
tgtagccaca gcagggacgt cgg 23
101
<210> 5
ccagcctcgc ccagcgacat ggg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 6
ctttcattta tctgaactca ggg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 7
ttatctgaac tcagggtccc cgg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 8
cagctgcagc atatatttaa ggg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 9
ctcctcgccc ttgctcacca tgg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide 102 <211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 11
ctctccctca ctctaaccta ctt 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 12
tatttctctc acatggccag tc 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 13
ctctccctca ctctaaccta ctt 23
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 14
gactggccat gtgagagaaa ta 22
<210> 15
<211> 27767 103 <212> DNA
atacaagtgc cttttacaga caatctgcac aagttatttg ttagacatat ttgattatag 60 aattaatatt aaaaggggtt ataacaatca agcattgata atttaattat gtttgcctat 120 tttactttag ttttttgaca taactgtgta actattgcga tttttttatt cctaatgtaa 180 ttagttcaaa acaaagtgca gaaatttaaa atattcaatt caacaacagt atataagtca 240 atattccccc cttaaatttt tacaaatctt tagggagtgt ttctcaattt ctcaatttct 300 ttggttgttt catgtcccat atggaagaaa acatgggtgt gaaagggaag cttactcttt 360 tgattacttc ccttttctgg ttgactccac ctccattatg aagcctttct gtatttttgt 420 ggaagtgaaa tgatttttag aattcttagt ggttctcttc ttcaggagaa catttctagg 480 taataataca agaagattta aatggcataa aaccttggaa tggacaaact cagaatggtg 540 ctacatgaaa actctggatc tgcaggtaaa atcttctcat ttattctata tttacctttt 600 aaatagagtg tagcaatatt ccgacagtca atcaatctga tttaatagtg attggcatct 660 ggagaagaag taacagggaa aaaggcaata agctttataa ggggaacttt tatcttccat 720 agactcaaaa ttgaagacgt gactagaaga ttgctagatt tggcatcagt tttgtaaaat 780 tgctgaggtg aaattaagta agggatgaaa attaactaaa ttgtgttgag tatgaaacta 840 gtagttgtta gaaaagatag aacatgaagg aatgaatatt gattgaaagt tgatgaccta 900 gaggacattt agactaacac ctctgagtgt caaagtctaa tttatgattt acatcgatgc 960 gttaaactca tttaacattc ttactttttt cccctcaagc atttaagctg aagtataaca 1020 tttcacatga aagcctggat tataaatgca cagttcagtg acctatctca gaggagtgac 1080 tgccatagca ttttttttgt ctttttgcct tcagagccac agcaacgcgg gatccgaagc 1140 cgcgtctgcg acccacacca cagctcacgg caatgccgga tctttaaccc actgagcgag 1200 gccggggatc gaacccgcag tctcatggtt cctagtagga ttcgttaacc actgcgccac 1260 gacgggaact cctaccatag catttttact tttaagttac tgttggttta gagtaagaag 1320 gagaaatgag agtgatggag cgtttgctat atttggagac aaggtcctat attggaggtt 1380 ctcaaatata aattttgtcg ctttttcctc caatgtattg ttcaactact atttagcagg 1440 ccactgtgcc aggtactggt gaaactggtg aacatgatag atgtaattca ttccctcatg 1500 gaactttcca tctaacaatg tggatcaggt aggcttggag atgaga 1a0t4gc cagtggttga 1560 tttctcaccc ctaggatgcc tataaacatg agtattttca aagctacttc actgaggtta 1740 tatgatcctg gtgtgaattt ttcctgcctg acttgccatt tagaaggaag tgtttcctgg 1800
aatttccatt gtggcttggt ggttaaagac cctgcattgt ctctgtgagg atgtgggttc 1860 aatctctggc ctcattcagt gagtgggtta aggatctggt gtcgctgcaa gctgtggcta 1920 agatcccaca ttgccatgtc tgtggtgtag actggcacct ggagctctga tttgaccaca 1980 atcttaggaa cttcagatgt ggccataaaa aggaaaaaaa agttaggaag ggttttctgt 2040 cttgtttgga ccttcgttaa tctcaaacct ttggaaccat ctctcctcca aaacctcctt 2100 tgggtaagac tgtatgtttg ccctctctct tcttttcgca gactttagaa gatgttctgc 2160
ccatttaagt tccttcactt tggctgtagt cgctgttctc agtgcctgct tggtcactag 2220
ttctcttggt gagtactttg acaaatttac ttgtaaccga gcccaactgt gacaagaaac 2280 actgaaaagc aaataattgc tcctgaagtc tagatagcat ctaaaaacat gcttcatggt 2340 ttcaaggatc atatattgaa accccaggga tcctctagag tcgacctgca gcatgcaggg 2400 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 2460 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gtgcataagg aaagactatc 2520 tcaacgtctt attcctcagc ttacattaga tttgaaactc tagtcaccta aaatgcaaat 2580 ctcatttact taccatcaga gatattaatg acctatagaa ttcagcataa ataaagtttc 2640 atgtatggat attagcttat ggttctagtc actgctaatt gaaacctgtg atattgctgt 2700
ttgttttgac tcctatgaaa taacattctc ccattgtacc atggatgggt ccagaaacat 2760 ttctcaaatc ctggcttgaa aaaataaata agtaatctaa agaataataa ttctctactt 2820 gctctttgaa tcttgaccaa ttgctgcatt tacctattgt tacaggagga aaagacaagg 2880 agctgaggct aacgggtggt gaaaacaagt gctctggaag agtggaggtg aaagtgcagg 2940 aggagtgggg aactgtgtgt aataatggct gggacatgga tgtggtctct gttgtttgta 3000 ggcagctggg atgtccaact gctatcaaag ccactggatg ggctaatttt agtgcaggtt 3060 ctggacgcat ttggatggat catgtttctt gtcgagggaa tgagtcagct ctctgggact 3120 gcaaacatga tggatgggga aagcataact gtactcacca acaggatgct ggagtaacct 3180
105
gctcaggtaa gacatacaca aataagtcaa gcctatacat gaaatgcttt gtgggaaaaa 3240 ataaaattac ccaatccatt actaaaagac cacttctggt attttacaca tgacaaagcc 3360 catattaaaa aaaaaaaatt cagaagagat tctgaatgct ataataaatg agcaagtgac 3420 tagcttcaat tttatattag gtcattctac cttctacttc tacatgaaaa tatcataatg 3480 tctaagttaa ttccttgtcc cctttcccaa taaagcactg ctttcatgca ctggcctatg 3540 aatcatgaac tttttgccct ttaactgatg atcaacttac caaatcaaga aataaatatt 3600 cttagcactg atcctttttt gttgttgttg gaggaagaat gttttgcaaa gtagaattgc 3660 ttttttctgt ttaacagtgc tattcatttc atttacatgg tcgttttaat ttataaaaca 3720 tttcataagt ttcacctcat atgcccttac aataactcag gaagttatat gttagacctt 3780 tctgctgaca aatcccagag tcatgtttct gacccagttc agattccttg gcttcccatt 3840 tctctttgct catgtcattg acctttatgc agccctctta cctcccacct ttctattaca 3900 gaccatctcc tccataggac tggtgttaga aagtactaat ctctacccag gcattgtggt 3960 gcaatgtggg cagcacaggc tggtatctag aaaaatgctg aagtgaattc cagctcagct 4020 gctcgttaat actatcgttt taagtaagct gttcaatcct ttgaaattca ctttctgagc 4080 actcagtgat ataataaatg tagagctact ggtacactgt ctggtatgta ataggtgtta 4140 ccaattaacc ttagtttcct catgggtcac tggttctcat tacctagaca actcatttct 4200 ctttcttcct ctttctcttt ctccattctc ctcctccttc ttcctcttct tcttgtctgt 4260
tattgttata tcattttgct gagaaagtta agaaataaca actctaacct ctacatcgac 4320 cacctagagc aaagttaaaa ataataataa accttgccag actcttacta taattgttgc 4380 tgtctataga gttgactgtt taagttaaga catcagtata tatttttaat ttttgtgttt 4440 tttttttcat acttttacat gaggatcctt tatataagga tgagttaaac aaacttgatt 4500 tttgaagttt atacccctga ggctcaactg cataataata gaaagggatc catagcctct 4560 caaggactta actagtttca tgagttttca gaatctgaat ttctgagatt ctccacccca 4620 attaaagctc aagcctcaga acatatatcc ttctcttggt aaattctatt cttatcacat 4680 gcgtaataat aaaaaagaga gatgttggag acagattttt ttcctcacat tctgtctcta 4740 ctgttttcta ggtgtttgat tctgtgttat ttaacctcag tttgcttatc tgtgaagtag 4800 ggattatggt aataacatat aatgctttat gttgtaaaga ctaaagaa 1g06a tagcatatgt 4860 ttactttttc aaaaaagaac ttcttagggt tttttttttt taaccacaaa gtgtttctat 5040 tttttaggtg tcccaaaatt tcgttccaaa tatctttttc tcagatattt tagtcctcat 5100 agaacaccta gggatagtgg atagagaaaa ttttctttat taaaaagctg ttctttgcta 5160 aaaattgtag caggtacttt tgggaggggg gaaaactttg attcagaaac tgctaagaca 5220 tggagtgttt tgactaattt ttcctcaatt tttaatgttt tttataccat agggtacttt 5280 tgcaaactat tatgcatact tatatatttt tacttttttc ctgtctttta acttccaaat 5340 tcaacttcag acaattattc atgcactaaa ctgtttgtag taagaaagat taaaattaaa 5400 aaattaacca ttcaacaaat gactggtttg ccatttttac tactttgttg tatgaacaat 5460 ttttttttct acaaatgaat actttgagtc tgatttatcc attcctacat aaaagttttt 5520 actatatctt agtattggaa ggaaacaaaa caaaacacaa tgtaaatttt aatctataaa 5580 ttttgggggg gtaaatatac atagatgaaa gtcttaacca ttaattagag tcaaaagatt 5640 aaaattctcc aatatgtgaa cttaggctgc atccaaaatg aagcatcatt tttaaggaca 5700 gcatcaaaag tgaccagagg aattttactt tctttctttt tttttttttt gaattttagt 5760 ttctaaactc acttctgaat aaatacaact tctaaattct cgtcttttct ctactctaga 5820 tggatctgat ttagagatga ggctggtgaa tggaggaaac cggtgcttag gaagaataga 5880 agtcaaattt caaggaacgt ggggaacagt gtgtgatgat cacttcaaca taaatcatgc 5940 ttctgtggtt tgtaaacaac ttgaatgtgg aagtgctgtc agtttctctg gttcagctaa 6000 ttttggagaa ggttctggac caatctggtt tgatgatctt gtatgcaatg gaaatgagtc 6060 agctctctgg aactgcaaac atgaaggatg gggaaagcac aattgcgatc atgctgagga 6120 tgctggagtg atttgcttaa gtaaggactg acctgggttt gttctgttct ccatgagagg 6180 gcaaaaaaag gggagtaaaa gtcttaaaag ctcaaactgt taaaaacata atgatgattg 6240 cttcttttat catcttatta ttatctaatt tcaggtcgaa attctagtac ctgtgcagtt 6300 ttttacctta actgaaatta agataaatag gatagggagg aaggatgagc agtgacattt 6360 aggtccaagt catgaggtta gaaggaaatg ttcagagaat agcccattcc ctcagccctc 6420 aaagaaagaa agaaagaaaa agaaaaaaaa aaagaaagct taactagaaa attttgttct 6480
107
ctggatgttt tagaggcaaa ccatcccttt atcattccta cctacaaagc cttctcttaa 6540 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 6660 gggggggggg gtgaaaaaag aaccaaacaa tttcaacaaa aaaccaaaca attccaacaa 6720 aattggtcca ataagcaaac ctctagataa atttcagtgc cctggatgtt ttgttaggaa 6780 ctcttcctac aatgcgtgct ttccattctg aaaagtccta tctacttgcc tgatccactt 6840
ctccttccat cctaaacgat tttcagtggt agtatattac tgttgtctct gtctctactt 6900
atatatcttc cccttttcac tcactcctct caggtacagc tcttcagttt gcccttattc 6960
ttgtttcctt gtcaatgact tgttttgtgt ccctcttaca gatggagcag acctgaaact 7020 gagagtggta gatggagtca ctgaatgttc aggaagattg gaagtgaaat tccaaggaga 7080 atggggaaca atctgtgatg atggctggga tagtgatgat gccgctgtgg catgtaagca 7140 actgggaggt ccaactgctg tcactgccat tgtcgagtta acgccagtga gggactggac 7200 acattggctc acacacatac agccatgaca cgatctgctc tatggtccga tgattaaagg 7260 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 7320 gggggggggg gggggggggg gggggggggg ggggggggag aagagctggt ggacatttct 7380 ggaaaggaac caaaacccgg aagggccttg ttcttcagga tttgggatgg attggggagg 7440 gagaaaattg tttctaatat ttcttggtgg gaattctttt acagttgtga caaatctttc 7500
acatattctt catttgagta gtttggaggg ttgtctgact gttttctata ataaatgtcc 7560
caagtgctat gaggtaccac atttcaaatt ctaattctac ctgaagctcc aaaaagacaa 7620 aatgttatag gtcttttctt tatatctaat ttgcttatgg tttttagcca ttgacaattt 7680
ttttttctta actcttgaaa ctataaccct atttctaacc aaattcatgt tctatactgg 7740
ctcttcaaaa acccaggaga tgggaaagcc agaatctcca gtgtttcagc ttctgggaag 7800 gagcaagttt ttaaaaatac cctctgggag ctaaattcca catgtatcta tggcctaagt 7860 gtatgtttat tttgcagatg gatcagatct ggaactgaga cttaaaggtg gaggcagcca 7920 ctgtgctggg acagtggagg tggaaattca gaaactggta ggaaaagtgt gtgatagaag 7980 ctggggactg aaagaagctg atgtggtttg caggcagctg ggatgtggat ctgcactcaa 8040 aacatcatat caagtttatt ccaaaaccaa ggcaacaaac acatggctgt ttgtaagcag 8100 ctgtaatgga aatgaaactt ctctttggga ctgcaagaat tggcagt 1g0g8g gtggacttag 8160 ttgaagagac tgtcttttct tcatcatata gtcctacatc ctttgtcata aattaattga 8340
ccataggtgt gtgggtttat atctgggctc tctattctgt tcctttgatc tatatgtctg 8400
tttttatgcc agcaccatgc tgttttgatt actatagctt tgtagtatca tctgaagtca 8460 ggaaacatga ttcctccagc tttgttcttc tttctcaaga ttgttttgtc tattcagagt 8520
ttatgttccc atgcagattt aatttttaaa tttatttaat ttttattttt tatttttaat 8580
ttaaattaat ttaaattttt tatttcccaa cgtacagcca agggggccag ggtaaccttt 8640 acatgtatac attaaaaatt tcaggttttt cccccaccca tttctttctg ttggcaagta 8700
aatttttgaa caaagtttcc caatgctttt taaggggaat tcccttgggg gggggggggg 8760 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 8820 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg agacgaaatt gactatattt 8880 tctttgttgg gaatctttta cagttgtgac aaatctttca catattcttc atttgagtag 8940
tttggagggt tgtctgactg ttttctataa taaatgtccc aagtgctatg aggtaccaca 9000
tttcaaattc taattctacc tgaagctcca aaaagacaaa atgttatagg tcttttcttt 9060
atatctaatt tgcttatggt ttttagccat tgacaatttt tttttcttaa ctcttgaaac 9120
tataacccta tttctaacca aattcatgtt ctatactggc tcttcaaaaa cccaggagat 9180 gggaaagcca gaatctccag tgtttcagct tctgggaagg agcaagtttt taaaaatacc 9240 ctctgggagc taaattccac atgtatctat ggcctaagtg tatgtttatt ttgcagatgg 9300 atcagatctg gaactgagac ttaaaggtgg aggcagccac tgtgctggga cagtggaggt 9360 ggaaattcag aaactggtag gaaaagtgtg tgatagaagc tggggactga aagaagctga 9420 tgtggtttgc aggcagctgg gatgtggatc tgcactcaaa acatcatatc aagtttattc 9480 caaaaccaag gcaacaaaca catggctgtt tgtaagcagc tgtaatggaa atgaaacttc 9540 tctttgggac tgcaagaatt ggcagtgggg tggacttagt tgtgatcact atgacgaaac 9600 caaaattacc tgctcaggta agaatttcaa tcaatgtgtt aggaaaattg cattctactt 9660 tcttttacat gtagctgtcc agttttccca gcaccacttg ttgaaaaaac tgtctttttc 9720
ttcatcatat agtcctacat cccttggcca taaattaatt gaccataagg ggtgtgggtt 9780
109
taatatccgg ggctcctcaa ttcgggtccc ttggatccta aaagccggtt ttataacccg 9840 catggaatcc ccccaacaaa ggaccttctt tccccaaaaa tgcggctcag ccaactcaaa 9960 aagattttat gaatcacaaa ccgcacatta tcttcctaaa attactattc ctatgtttta 10020 atttgcaaag tcattccgat atagttggcg cagagtaact catttagata tccaccccac 10080 cagttcctca ctcaagtaag gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 10140 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggc 10200 ccccatgtga gattttgtgt gtcctttaag agtggagtct ctatttccca ctgctctctg 10260
gttctcccca aagtaagccc tgctggcttt caaaacttct gggagcttgc cttcttggta 10320 taggactcct gggctaggga gtctaatgtt tggcttagac cccttactgc ttgggaagaa 10380 tctctgcaac tgtaatgaat tatcttccta tttgtgggtt gctgaggata tggtcttaac 10440
tgttctgtgt tctacccctc ctatccatct tgttgtggtt ccttctttat atctttagtt 10500
gtagaaaagt ttttcttatc aacagttgct ctgtaaattg taacttgggt gtacacctag 10560 taggaggtga gctcagggtc ttcctactct gccatcttgg ccatgtcctc taaacatttt 10620 ggtgtatttc actgcaacct ttttaaaaat ctcaaaagtg agctgtgatt ggctagtctt 10680 gtggataatc tctagcattt gatgctaatc atatttatac aaatactttg ttgaaaagtg 10740
atgccttttt aactattatt aaaaaacgta ttgacataac tattgctatt atactgaaaa 10800 gaaagacctt agagaaaata gcataagagc aaaaccatta aacatggaga catctagtca 10860 tagggtggaa attttatgtg gtccatatcc cctaaccagt ggctttacac caggcacatc 10920 ctaactaaga tctgctccca agtgtcttcc ctgatgcttt aaattgtgtt acatggaaac 10980
tatcctttga tgaagaaatg caacctttta aaatacaaca ttgaaacttt tgtgctttaa 11040
ttttgctttt caacattttt tctttttaaa agaagaaatt tatttgtttt tttaaatttt 11100
aatggccacg gcatatggaa gttctcaggc cagggataga attcaagcca caggtgcgac 11160 ccatgccaca actgctgcaa caccagatcc tttaacccac tgcaccaggc cagggattga 11220 agccttgcct tactgacaat ctgagccact tcagtcagat aaagaaattt cttcattaag 11280 cagagtattc acatggttta aacttcaaaa tattaaagtg taaactcttt ccccaccact 11340 gtccccagct caccaactct acttaccaca gacaactgat gtggttaggg tatttaaata 11400 gtaaatccaa gaaaatataa acaaatccgt atatataggt ttcacc 1c1c0at tttattatcc 11460
ttttctcatc ggtagggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 11640 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg ggggaatggg 11700 aagaaaaaac caccatggtt aatttttttt atccctctac acccgggaaa attacccttg 11760 gggccacact tttctataga aaggggatta tttaaaaggg tctgaaaaag aatttttttt 11820 tcgaaagggg aaatatttgg cctaacttag tcacataagc catgttctct ggcaagttag 11880 gtaacataca tttttgtcat tgggggcaac aaaaacaatt ttccttttgg accttttggg 11940 actccgcatt ggttagggaa ggggaagtat attggaattc ggaaaattcc ttccaaatta 12000 aaaaaggttt gttattttca tattaaccta tttcatatta attagcatga attccagcgc 12060 cattaaaagg gaaaacacct ggagtggtaa gaaaaaagtt tttttttctc tttttttttt 12120
ttttttttta atggccacat ctgtggcatg tgaagttccc aggctagggg tcgaatagga 12180 gctacagctg ccagcttgca ccacagccac aacaatgcca gagccaagcc tcatctgcga 12240 cctataccac aactcatggc aatgctggtt ccttaacccc ctgagtgagg cctggggtca 12300 aacccacatc ctcatggata ctaaccggct ttgttaccgc tgagccatga gggaaactcc 12360 ctttttctca ttgaaaataa gtcaaataga taagcagctt aaggctgttt gggtgattct 12420 gtggtccagt aattatcaaa tcctactgga caagaataga gaatgtgcaa atgagggaac 12480 gtgttggtga gatcaggctc tgcccactga gctatcctct gtcatgggcc ctgtgctgtt 12540 ctcagagctg tacttcctag ggcattgttc tcatttcaat tctgagttca gtgtggagag 12600 tatacgtgtg tgggggctgc acgcttttca caacccactt tctgctgata ctgatttagg 12660 gatccttgga ttgctttaca gttgagtcat cattaactag tgtcacttgc cttcaaagtc 12720 agcaaaataa ttgtctccaa actagtaggc ttctagtgta tttgctttaa tccaatgcca 12780 tgtgaaagta acatggtcaa agaataagtt atataccttg acctaccctg tgaccaggct 12840 cttcctctta atttattgac cactgcctta aggtcatttg aaaccatggg tttgggagga 12900 aggcaaggcc taaatcccgt ctttgttgga aggctcactg tccttgtctt tagagcatca 12960
ttttttttta aactggggta cagtttattt acagtgttgt gtcaatttct gctgtacagc 13020
acagtgaccc agtcatacac atacatacat tctttttctc atactatctt caattttatt 13080
111
ttctgctaag tctgccattt tatcatcacc tcagtttgaa ggacaggata tttagagttt 13140 ataacagctg caggcacagg atgtctccct cacaaaattg gtatttttcc ttccatttct 13260 tcttgcagtt tggctatttc ttgtctgagt tcatctctct ttttaagtgt taaaaagggc 13320 aaggaggatt catgctatgt caacattatg attttttctt ttctatactt gataagagta 13380 tacttttccc aaatgtcatc caacttttca gcatcagttt ggacatggtt ttcttttcaa 13440 ggtggtattt ctctaatgtc acttgaataa caagactcgt tagttctcca ggctacaata 13500 tcctagtctg agtatattct gcatgttaat tctattcagc cacatccata atttaggttt 13560 tattcctgga acacctcact tttttttttt tttttggtct ttttatagcc ataaccatgg 13620 catatggagg ttcccaggct aggggtctaa tctgagcttt agccactggc ccatgccaca 13680 gccacagcca tgccacatct gagccacatc tgtgaccttt tccacagctc acagaaacac 13740 cagatcccta acccactgag tgaggccagg ggtcaaacct gtaacccttc catggttcct 13800 agtcagattc gttcctctgt accacgatgg gaattcctaa tacctcactt atgataacac 13860 attctgaatt atttaggatt ctattatact gcatgtaata gaaatcccaa atagcaaaat 13920 ttgcaactta aggcaggttc ctgtctttac aaaatcatgt tttcctttgc tatatgtgca 13980 ctttgctttc ctctgtgaat tccctttttt gttatatttc tatagctttt ggaaacactt 14040 ttacttattt gggggggcct agatttttaa ccctctcctt gtttttctag aaatagagtt 14100 tataatttta tttcttcatt tacttgatac tttcaagaga ttcccaggaa aaaaattatg 14160 gaaatactgt ctctgtgcct gccaagttca aactaagaat tgtataatct gttttaattc 14220 ttaagcattt atagatgaca aggctttgtg tctgataggg gccagcgaac tcagtaaaga 14280 gggaagatga gaaagataat ggcaagaatt tatccctgaa gtgtagtttt gacaaaccag 14340 tcacaaagag gtctaagaaa ttttggtcac aaagttgttt tgaatcccag gcattttatt 14400 tgcaatgatt gcatatgttc tggaaaggac atctgaacct aagaaatagt tcatttgcat 14460 tgtgttatat tttactaagg tctgagaaat aatcttgaga tgagaatgaa ctctacttct 14520 tcagagtctg gaaggaataa attatgaaaa tgtattaatg cttctttaaa ccatattgta 14580 tatttatcta ttactaaaca aaaagaagta gctctattta tttatttatt tatttattta 14640 tttatgtctt ttgtctcttt agggccacac ctgtggcata tggaggttcc caggctagag 14700 gtccaattgg agatgtagca gccagcctat gccagagcca ccgca 11a2cacg ggatctgagc 14760 gatgggaact ccaaattaat tatttcttat atttgttctt catatattca tttctataga 14940
aagaaataaa tacagattca gttaatgatg gcaggtaaaa gcttaactta ttaatcaaag 15000 gagttaatcc aggcacaaaa attcaattca tggctctctg ttaaaattta ggtataggtt 15060 tagcaggaag aaaaggttag tagatgcaga ctattacatt tagaatggat ggacaatgaa 15120 gtcctactat acagcacagg gaactatatc caatctcttg ggatagaata tgatggaaga 15180 caaaatcaga acaagagagt atatatatat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 15240 gtgtgtgtgt gtgtgactgg gtcaccctgc ggcacagcag aaattggcag aacattgtaa 15300 atcaactata ctttaatagg aaaaatactt ttaagggcta aatttccaat attctaacca 15360 tgtacacaga gtaaatgtca taaggatgcc agtctgtgta gagattgatg tgttactagc 15420 agattcatga aataaaggct gaggatgtag tccccaagtc acttctgagt ggaagaattt 15480 ctcctttgtc ctggactcaa atattttagg ataaaggaaa aaagaagata tttatagaag 15540 ggacttgttt tcaagtactt gacaaaattt caccattaaa gagaaatttg tgggagttcc 15600 catcgtggct cagtggaaac aaatccaact aggaaccatg aggttgtggg tttgatccct 15660 ggcctcactc agtgggttaa ggatccggtg ttgccgtgag ctgtggtgta ggttgcagac 15720 acggttctga tcctgcgttg ctgtggctgt ggctgtggtg taggccagca gcaaacagct 15780 ctgattagac ccctagcctg gaaacctcca tatgccacag gtgcagccct aaaaagacaa 15840 aaaaagagaa aagacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag 15900 aacccccaga ggtatttatt tgtttttgcc ttttttcact gactgttctt tgtttgtttg 15960
tttgagactg atctagaaga ctagagatta caagaaatat ggatttggct cactctaaga 16020 aactgctttc attccaaggt ttgggtctat ccaaaagtgg aatagaatca tatgaatact 16080 agtttatgag tatttagtga gaggaatttc aagctcaaat aatgattcag caagattaaa 16140 ttaaggaggg aattttcctt gtggctgagt gggttaagga cccaatgttg tctctgtgag 16200 gatgtaggtt ccatcctggg ctttgctcat taggttaagg atctggcatt gctgcagctc 16260 agacccagtg ctgccctggt tgtggcttag gccaaagctg cagctccaat tcaatctctg 16320 gcctgggaac ctccatgtgc tacaaggtgc ggccttaaaa ggaaaaaaaa aaaattaaat 16380
113
caaggactca agagtctttc attatttgtg ttgtggaagc tatatttgtt ttaaagtctt 16440
catttttaat ggataagtgg caaaattttc atgctgaggt gatctatagt gttgtaatgc 16560 agaatatagt cagatcttga acattttagg aagttggtga gggccaattg tgtatctgtg 16620 ccatgctgat aagaatgtca agggatcaca agaattcgtg ttatttgaca gcagtcatct 16680 ttaaaaggca tttgagaaag tccaatttca aatgcatttc ctttctttaa aagataaatt 16740 gaagaaaata agtctttatt tcccaagtaa attgaattgc ctctcagtct gttaaaagaa 16800 actcttacct tgatgattgc gctcttaacc tggcaaagat tgtctttaaa atctgagctc 16860 catgtcttct gctttatttc tggtgtgcct ttgactccag attacagtaa atggaggact 16920 gagtataggg ctaaaaagta gagagaatgg atgcatatta tctgtggtct ccaatgtgat 16980 gaatgaagta ggcaaatact caaaggaaag agaaagcatg ctccaagaat tatgggttcc 17040 agaaggcaaa gtcccagaat tgtctccagg gaaggacagg gaggtctaga atcggctaag 17100 cccactgtag gcagaaaaac caagaggcat gaatggcttc cctttctcac ttttcactct 17160 ctggcttact cctatcatga aggaaaatat tggaatcata ttctccctca ccgaaatgct 17220 atttttcagc ccacaggaaa cccaggctgg ttggagggga cattccctgc tctggtcgtg 17280 ttgaagtaca acatggagac acgtggggca ccgtctgtga ttctgacttc tctctggagg 17340 cggccagcgt gctgtgcagg gaactacagt gcggcactgt ggtttccctc ctggggggag 17400 ctcactttgg agaaggaagt ggacagatct gggctgaaga attccagtgt gaggggcacg 17460 agtcccacct ttcactctgc ccagtagcac cccgccctga cgggacatgt agccacagca 17520 gggacgtcgg cgtagtctgc tcaagtgaga cccagggaat gtgttcactt tgttcccatg 17580 ccatgaagag ggtagggtta ggtagtcaca gacatctttt taaagccctg tctccttcca 17640 ggatacacac aaatccgctt ggtgaatggc aagaccccat gtgaaggaag agtggagctc 17700 aacattcttg ggtcctgggg gtccctctgc aactctcact gggacatgga agatgcccat 17760 gttttatgcc agcagcttaa atgtggagtt gccctttcta tcccgggagg agcacctttt 17820 gggaaaggaa gtgagcaggt ctggaggcac atgtttcact gcactgggac tgagaagcac 17880 atgggagatt gttccgtcac tgctctgggc gcatcactct gttcttcagg gcaagtggcc 17940 tctgtaatct gctcaggtaa gagaataagg gcagccagtg atgagccact catgacggtg 18000 ccttaagagt gggtgtacct aggagttccc attgtggctc agtggtaa 11c4a aactcgactg 18060 gtgtaggctg actgctgcag cttcaatttg acccctagcc cgggaatttc cataggccac 18240 acgtgcagca ctaaggaagg aaaaaaagaa aaaaaaaaaa aaagagtggg tgtgcctata 18300 gtgaagaaca gatgtaaaag ggaagtgaaa gggattcccc cattctgagg gattgtgaga 18360 agtgtgccag aatattaact tcatttgact tgttacaggg aaagtaaact tgactttcac 18420 ggacctccta gttacctggt gcttactata tgtcttctca gagtacctga ttcattccca 18480 gcctggttga cccatccccc tatctctatg gctatgttta tccagagcac atctatctaa 18540 cactccagct gatcttcctg acacagctgt ggcaaccctg gatcctttaa ccaactgtgc 18600 caggctggag atcaaaccta agcctctgca gcaacccaag ctgctgcagt cagattttta 18660 accccctgtg ccactgtggg tatctccgat attttgtatc ttctgtgact gagtggtttg 18720 ctgtttgcag ggaaccagag tcagacacta tccccgtgca attcatcatc ctcggaccca 18780 tcaagctcta ttatttcaga agaaaatggt gttgcctgca taggtgagaa tcagtgacca 18840 acctatgaaa atgatctcaa tcctctgaaa tgcattttat tcatgtttta tttcctcttt 18900 gcagggagtg gtcaacttcg cctggtcgat ggaggtggtc gttgtgctgg gagagtagag 18960 gtctatcatg agggctcctg gggcaccatc tgtgatgaca gctgggacct gaatgatgcc 19020 catgtggtgt gcaaacagct gagctgtgga tgggccatta atgccactgg ttctgctcat 19080 tttggggaag gaacagggcc catttggctg gatgagataa actgtaatgg aaaagaatct 19140 catatttggc aatgccactc acatggttgg gggcggcaca attgcaggca taaggaggat 19200 gcaggagtca tctgctcggg taagttctgc acatcacttc gggttacagt gatttaagaa 19260 acaactaagg tggggcaaag ggtagtgagg catatccatc agagcaaatt ccttgaaata 19320 cggactcaga gggaaccatt gtgagattga ggttcccaga ggtgtggatt taatgaatta 19380 gtgttacctc atgtacaagg tagtatacta ccagaaagat aaaaattcag aagcgagttt 19440 gcagcaaaac tcatagggag aacttctttt ataaataata tgaagctgga tatttagtgc 19500 accacctgat gaccacttta ttaataaata aagagttcct gttgtggcgc agcggaaatg 19560 aatccgacaa ataatcatga gtttgcgggt ttgatccctg acctcgctca gtgggttggg 19620 gatctggtgt tgccatgagc tgtggtgtag gtcgcagatg ctgcttggat cctgctttgc 19680
115
tgtggctgtg gtataggctt gtggctacag ctccgatttg accgctagcc tgggaacctc 19740 tttaaaaagg acaagaagaa atatatttgg tgttatattc tacagagaca aagataatca 19860 ccatgcccga ttgatttttc aaggcatata aatgagacgt catgggagca aaaatggtca 19920 taatacaatg cccttgtttt gtgtacatgg taagatttta gaaagcattg tgaggtaaaa 19980 aagtgtactc agttataata tattggggaa aacagtacta tgagaagtaa aaaaatctac 20040 atgccggaag ttattttttt aatgtctctt ttagagtcgc acatgcggca tatggaggtt 20100 cccaggctag gggtcgaatc agagctatag ccactggctt atggcacagc cacaacaaca 20160 ctagatctga gccacatcag cgacctatac tatagctcat ggcaatgcca gatccttaac 20220 ctactgagcc aagccatggg tcaaatccag gtcctcacgg atcctaggca aattcatttc 20280 tgctgagcca cgaagggaac tcctcagaag tgattttgat gttactttct tttcatgaca 20340 aatctggtaa agtacataca catagaaact gaagtgtcag aaagggaaat atttcatttt 20400 aaggtaatgt atacaaaaca gtggttttac catctgagta tctcgctaaa ttttaactat 20460 caaggacaat tgccaaaaaa aaaaaaaaaa gagagagaga gagaacagaa tagggttatg 20520 aagctaaaat cacagggtta tgaagctaaa atcacagtaa tttagggaga aaaaaatcca 20580 aagcatgtaa ttgataaaag gttctgagcc tttgtttgag atttagaatt caacttagaa 20640 ataccggtgg tattttaaag cagtccataa gtataaaatc caaggctaaa aaaccagaag 20700 gtatttgtag aacaaatata ttttaataag ctctaccaag tcatccagaa gctattaaag 20760 aattactggt cactgacata gtgtacctgt tttcaaggcc attcttacat cagaataaag 20820 ggagagcacc ctctgaatct tcagaaaaga tgtgaaagtg ctaattctct atttcatccc 20880 agagttcatg tctctgagac tgatcagtga aaacagcaga gagacctgtg cagggcgcct 20940 ggaagttttt tacaacggag cttggggcag cgttggcaag aatagcatgt ctccagccac 21000 agtgggggtg gtatgcaggc agctaggctg tgcagacaga ggggacatca gccctgcatc 21060 ttcagacaag acagtgtcca ggcacatgtg ggtggacaat gttcagtgtc ctaaaggacc 21120 tgacacacta tggcagtgcc catcatctcc atggaagaag agactggcca gcccctcaga 21180 ggagacatgg atcacatgtg ccagtgagta tccattcttt agcgccactg ttatcttctg 21240 atctacctaa gcagaagttt tataatctgt agttaatccc tattctacct ggatgatggg 21300 attcattctg tttaatttgg tgtgcaggta ttcagcatca gtgatcattt t 1c1c6caaagac 21360 tagtcttttg ttgcactgaa tataaggaga gaagcagtca gaaagatcaa tcctgaatta 21540 tttctccatt ctacatctgt tttaaatttc aaaaaaaaaa attgttatag gtgatttaca 21600 atgtctgtca atttctgctc tacagcaaag tgacccagtt atttacatat acattctgtt 21660 tctcatattt ttaaaccagg agatttctat ctgcctggcg gtttgaggga atttaacatt 21720 atgcatttat gttaacttta ttcacctgat gttttctaag tcatactgag attcttatgc 21780 ccaggatgga atacacctgg tttgctggaa agacatgtgc tttcataaag acgaattttg 21840 gaaaaaatat aaaatttaaa aggcccatta aataagcaaa gttttaagag atttcaaaaa 21900 aaatttcatc tctctctttt cctctttgac ctcttgggca cgttcatctt ctcaaatatg 21960 atcttggtgt ttctgacttt tcagacaaaa taagacttca agaaggaaac actaattgtt 22020 ctggacgtgt ggagatctgg tacggaggtt cctggggcac tgtgtgtgac gactcctggg 22080 accttgaaga tgctcaggtg gtgtgccgac agctgggctg tggctcagct ttggaggcag 22140 gaaaagaggc cgcatttggc caggggactg ggcccatatg gctcaatgaa gtgaagtgca 22200 aggggaatga aacctccttg tgggattgtc ctgccagatc ctggggccac agtgactgtg 22260 gacacaagga ggatgctgct gtgacgtgtt caggtgaggg cagagagtct ggattgagct 22320 tggaagctct ggcagcaaag agagggtggg cggtgacctg cattgggtaa agattggaag 22380 gtccagccta aggatctggt ggtgggggga gacatgatgt ttcagtctga agaatgatga 22440 aaacctgtgt ggttacgcat gggccttcgc cgaggaaagg gacataacta ccatgtatcc 22500 tcctgcagag ggaggaagaa ctaggggatt ctagttttgt gtgggaagga gcagtttact 22560 tggctcagga ggcactaaag gctcagatag gaaacagaga tctgttccat tcttactccc 22620 agaactgatt ctcttctctt ttctcctaca gaaattgcaa agagccgaga atccctacat 22680 gccacaggta tatcaaaaag tttaagaaca tgggacccat tgtctgcatt ttgtggaatc 22740 cctcttatta agacattctg ggtcagaagt tctgaggatt tgacatttac ttcagctatc 22800 tgttatctta cccaagagag ggatggtaac taggaaccca ggtcttttag ctaagacatt 22860 atcacctctt gtgatgttta cttgttctca ggtcgctcat cttttgttgc acttgcaatc 22920 tttggggtca ttctgttggc ctgtctcatc gcattcctca tttggactca gaagcgaaga 22980
117
cagaggcagc ggctctcagg tctgaacaaa attacggtct ctctaatgtt tctatgggag 23040 gagggaacct agaagaggtt taagcagttt ctccgaaaca gggaacaaga attcagagaa 23160 gaaaaggcac attggctgta ctgatgatac ctgcactcgc tatgtatgtt taatggggga 23220 cagtagagaa ttgatagttt agaaggagta tgcttatatg gttctggatg aatcctgtat 23280 ccccccaaac atttattttc tcttactata tacttattac taatttaact cttctgtcaa 23340
gccatgtgct aggttctgaa gatggttcag acttggataa ccaagtgctt ttgttttcat 23400 ggaatttcca gtttagtgga agagataaat atgtaaacaa ataaatgggg gggggggggg 23460 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23520 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23580 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23640 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23700 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23760 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23820 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23880 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23940 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 24000 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg ggggggggtt ggcgggcccc 24060 cctcgaggtc gacggtatcg ataagcttga tatcgaattc gtgagccaga ggacgagact 24120 agagatggat gatgactacg ttatgcttgc actgctgggg aaaagcacac atagggaggg 24180 aacgttttat tatgacccag tccctaacct atgacctctg ttatcagttt tctcaggagg 24240 agagaattct gtccatcaaa ttcaataccg ggagatgaat tcttgcctga aagcagatga 24300 aacggatatg ctaaatccct caggtccgtg ggttctttga ggggctgtag ccctggggtt 24360 cagatcagca gctgcagttg aggttgaggc atgctacttt gcatagcagt agaaagaaat 24420 ctcaactgta ataggaagct tgggatgcat atgaggaaga aaggcaagaa tgaactacaa 24480 attattctta gggaagataa aaattgcagt catggggaga cctctggctg agagggccgt 24540 gattatttct gacagaggga ttatggagta gaatatgatg gcttggacct tttttcacta 24600 aaacaagtca gtcttctcaa aggtagttta gcttttcata tatctttcac 11 a8gtttcttcc 24660
atttcccatt atgtaatgct tctttctctg tctgttgact tctatttaga accagtgcac 24840 taaatctgcc tttaggaaca tacctctgct aggttgcaag aaatatccca ttccccactc 24900 actctgtgaa gactcaatgc ttctcaatat tccttacctc ctgagaggga cttgcctcac 24960 ttctttaatc caagggactc gatttttgcc aaaactaagt caggaaaacc tacataagac 25020 ataggaaaga cttgctgtgc ttcttaaacc ccactgtttg ttttcctaat tgtgaacagt 25080 atttttaaag ttaacaagag agcttctaag gcacttgagg ggagatctga tttatttccc 25140 agtaattatt ttcttccttt cagaaaattc cactgaataa gatggtttta acggatgtgg 25200 gactaatttt tgtgtctaaa tctcttccta tttctggatg aaaaaaagga gaccactctg 25260 aagtacaatg aaaaggaaaa tgggaattat aacctggtga ggtgagtagg aagaatttat 25320 tcatcattgc tgaaaacagg tacattcctt ttgaaagttg agaactcctc tggtattaga 25380 aaaaaaaaaa gaacgtatat acacatatat ttccatgtct atgtttatgt ttgtaaatcc 25440 atattcagaa tatgcaacaa ctttttataa ctatgacttc agtccatctt ttagttacat 25500 atatattcta aacaacaact attgctaaga gaagctgggt aagtaaatgt gaataaatct 25560 tctaaagata ttacaggaag ttcctgctgc ggctcagtgg gttaaagact tgatgtcttt 25620 gtgaagatga gggctcgagc cctggcctca ctcagtgagt taaggatcta gcattgctgt 25680 aagctgcagc gtaggttgca gatagggctc agatccagtg ttgctgtggc tgtggcctca 25740 gttgcagctc tgattcaacc cttaggcgag gaacttccat atgcagcaaa tgtggccatt 25800 aaaaaaaaaa aaaacattat aggagtcatt tcataaaaga gataagacgt ttctatagtt 25860 atatagtgca tactctggta aagatagtat aggatactat aggaatatag aaagcttgcc 25920 tatgaaaatt tgggaagatt gtggaaaaga catctcaaaa tatggcatag aaaagaatca 25980 tatctttgag gaacagtaag tttttcattc aaaaccgtgt attgaacata cttgtggtga 26040 caagtggtgt cctgagtact aaaaattcag tgataaaaga tgctcttgac aaagacatgg 26100 ctgttgaata gaaggtctca ctgtcaatgt gtgggaatta tggacagcct atgtggacac 26160 agggaataga tgagactcta ggctggaagg ctgcattgag cccaataatg aatggtcctg 26220 tctgatatat ttcatgctca tattttattt tagggactat tggggaggtg gtgggttttg 26280
119
gaagattaag ctgaggcaag acacaatcag attgcctttt ataatttact ttcaggagga 26340 cccgcctgcc cttttggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 26460 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggcagca 26520 ccaattttat tattggcggg aataaagaga aaaatgtaat ttcaaagatt gctgttggaa 26580 atgaggggtg tggtagcttt tggagaaagc attctggaga cttctattaa tttttttttt 26640
ttaagtgctt caaagatcct ttgatccaac aattctactc ctaaaaattt cttccataca 26700 gataaagcca tttgtctgta tataacaaat agaagagaat tcctttttgc agccttgtta 26760 gtagtgcccc caaactggaa acaaagtgaa tatcagtcag tggggtagcg gctggaaaaa 26820 ttttagtgca cccaaccaac aaagaaaaac catgcacaaa aattcaataa atatcatctc 26880 acttttgtgt tcatgttatt gaatataatt aaacataatg tttacatcta taaaattatc 26940
atatgtatac atgtaaagaa acattaaaac atttttaaca gactgtaaac ttgaggactg 27000 tgaatgactt ttgattgata atctcaaaca tatggatact attctgatgt aataaataat 27060 gattaaattt tttccctaaa gagtaatcac tactgaatcg ttgcctcaga atcatatgga 27120 ggtgctttta aaaaaggcat ttctgcactg ttgttctctg gaatagaagt aattcttatg 27180 tacactgaag tttgaaaatc attgcattta agtgttctgt tcaggaaagt agtgtgcttt 27240
ttaatatttg tgagtgaatg agtaacacaa tacattatat cacattttaa tgtaattcta 27300 cacatgtgca tatgaagaga aaagtaacat ttttttctat ttatgtcttt agttcagcct 27360
ttaagatacc ttgatgaaga cctggactat tgaatgagca agaatctgcc tcttacactg 27420 aagattacaa tacagtcctc tgtctcctgg tattccaaag actgctgttg aatttctaaa 27480 aaatagattg gtgaatgtga ctactcaaag ttgtatgtaa gactttcaag ggcattaaat 27540 aaaaaagaat attgctgatt cttgttcttg attttctgaa tttctgaatc tcttattggg 27600
cttctaattt aaaaaaaaat atctgggcgc ccgcagatat cgaactcttg ggcagtgtga 27660 ccaaacgaag acatatccaa tcaagcatgc aaatggacca gcccactgta ctagcacgct 27720 gtggcagcca atctgaccga gaaagcagac aaccgcaggg agcaacg 27767
<210> 16
<211> 55
<212> DNA
<213> Sus scrofa 120
<211> 54
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 17
ggtcgccacc atggccatga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcc 54
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 18
ggtcgccacc atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggt 48
<210> 19
<211> 55
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 19
ggtcgccacc atggttgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccat 55
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 20
tgcagggaac tacagtgcgg cactgtggtt tccctcctgg ggg 43
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 21
tgcagggaac tacagtgcgg cactgtaaac cactactact gtggtttccc tcctgggggg 60
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> Sus scrofa
121
<400> 22
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 23
tgcagggaac tacagtgcgg aactactgtg gtttccctcc tggggg 46
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 24
gaaacccagg ctggttggag gggacattcc c 31
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 25
gaaacccagg ctggggacat tccc 24
<210> 26
<211> 13
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 26
aggggacatt ccc 13
<210> 27
<211> 13
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 27
gaaacccatt ccc 13
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 28 122 ggtcgccacc atggtgagca agggcgagga g 31 <212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 29
ggtcgccacc atggctgagc aagggcgagg ag 32
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 30
ggtcgccacc atggtgagag ggcgaggag 29
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 31
ggtcgccacc atggttgagc aagggcgagg ag 32
<210> 32
<211> 48
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 32
ggtcgccacc atggtgagca agggcgagga gaacccaggc tggttgga 48
<210> 33
<211> 49
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 33
tgctgtgcag ggaactacag tgcggcactg tggtttccct cctgggggg 49
<210> 34
<211> 38
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 34
tgctgtgcag ggaactctgt ggtttccctc ctgggggg 123 38 <212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 35
ctgtggtttc cctcctgggg gg 22
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 36
actgtggttt ccctcctggg ggg 23
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 37
tgctgtgcag ggaactacag tgcggcaact gtggtttccc tcctgggggg 50
<210> 38
<211> 10
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 38
tcctgggggg 10
<210> 39
<211> 8
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 39
ctgggggg 8
<210> 40
<211> 52
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 40
agagagcaga gccagcgact cgcccagcga catggggtac ctgccgtttg tg 52 <213> Sus scrofa
<400> 41
agagagcaga gccagcgact cgcccagcga gat 33
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 42
agagagcaga gccagcgact cgcccagcga 30
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 43
agagccagcc tcgcccagca ggggtaccat ggggtacctg ccgtttgtgt 50
<210> 44
<211> 53
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 44
agagagcaga gccagcgact cgcccagcga gcagtgggta cctgccgttt gtg 53
<210> 45
<211> 53
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 45
agagagcaga gccagcgact cgcccagcga tcagtgggta cctgccgttt gtg 53
<210> 46
<211> 53
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 46
agagagcaga gccagcgact cgcccagcga acatggggta cctgccgttt gtg 53
125
<210> 47
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720 atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020 tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgc 1a2g6a cacggttctg 1500 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220
tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640
tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccaggctg gttggagggg acattccctg ctctggtcgt gttgaagtac 3060 aacatggaga cacgtggggc accgtctgtg attctgactt ctctctggag gcggccagcg 3120
127
tgctgtgcag ggaactacag tgcggcactg tggtttccct cctgggggga gctcactttg 3180 tttcactctg cccagtagca ccccgccctg acgggacatg tagccacagc agggacgtcg 3300 gcgtagtctg ctcaagtgag acccagggaa tgtgttcact ttgttcccat gccatgaaga 3360 gggtagggtt aggtagtcac agacatcttt ttaaagccct gtctccttcc aggatacaca 3420 caaatccgct tggtgaatgg caagacccca tgtgaaggaa gagtggagct caacattctt 3480 gggtcctggg ggtccctctg caactctcac tgggacatgg aagatgccca tgttttatgc 3540 cagcagctta aatgtggagt tgccctttct atcccgggag gagcaccttt tgggaaagga 3600 agtgagcagg tctggaggca catgtttcac tgcactggga ctgagaagca catgggagat 3660 tgttccgtca ctgctctggg cgcatcactc tgttcttcag ggcaagtggc ctctgtaatc 3720 tgctcaggta agagaataag ggcagccagt gatgagccac tcatgacggt gccttaagag 3780 tgggtgtacc taggagttcc cattgtggct cagtggtaac aaactcgact ggtatccatg 3840 agggtatggg tttgatccct ggccttgctc aatgggttaa ggatccagca ttgctgtgag 3900 ctgtggtata ggttgcagac tctgctcagg tcccatgttg ctgtgattgt ggtgtaggct 3960 gactgctgca gcttcaattt gacccctagc ccgggaattt ccataggcca cacgtgcagc 4020 actaaggaag gaaaaaaaga aaaaaaaaaa aaaagagtgg gtgtgcctat agtgaagaac 4080 agatgtaaaa gggaagtgaa agggattccc ccattctgag ggattgtgag aagtgtgcca 4140 gaatattaac ttcatttgac ttgttacagg gaaagtaaac ttgactttca cggacctcct 4200 agttacctgg tgcttactat atgtcttctc agagtacctg attcattccc agcctggttg 4260 acccatcccc ctatctctat ggctatgttt atccagagca catctatcta acactccagc 4320 tgatcttcct gacacagctg tggcaaccct ggatccttta accaactgtg ccaggctgga 4380 gatcaaacct aagcctctgc agcaacccaa gctgctgcag tcagattttt aaccccctgt 4440 gccactgtgg gtatctccga tattttgtat cttctgtgac tgagtggttt gctgtttgca 4500 gggaaccaga gtcagacact atccccgtgc aattcatcat cctcggaccc atcaagctct 4560 attatttcag aagaaaatgg tgttgcctgc ataggtgaga atcagtgacc aacctatgaa 4620 aatgatctca atcctctgaa atgcatttta ttcatgtttt atttcctctt tgcagggagt 4680 ggtcaacttc gcctggtcga tggaggtggt cgttgtgctg ggagagtaga ggtctatcat 4740 gagggctcct ggggcaccat ctgtgatgac agctgggacc tgaat 1g2a8tgc ccatgtggtg 4800 caatgccact cacatggttg ggggcggcac aattgcaggc ataaggagga tgcaggagtc 4980 atctgctcgg 4990
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 48
caccggaaac ccaggctggt tgga 24
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 49
aaactccaac cagcctgggt ttcc 24
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 50
caccggaact acagtgcggc actg 24
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 51 129
aaaccagtgc cgcactgtag ttcc 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 52
caccgcagta gcaccccgcc ctgac 25
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 53
aaacgtcagg gcggggtgct actgc 25
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 54
caccgtgtag ccacagcagg gacgt 25
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 55
aaacacgtcc ctgctgtggc tacac 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence 130 caccgccagc ctcgcccagc gacat 25
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 57
aaacatgtcg ctgggcgagg ctggc 25
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 58
caccgcagct gcagcatata tttaa 25
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 59
aaacttaaat atatgctgca gctgc 25
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 60
caccgctttc atttatctga actca 25 <213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 61
aaactgagtt cagataaatg aaagc 25
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 62
caccgttatc tgaactcagg gtccc 25
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 63
aaacgggacc ctgagttcag ataac 25
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 64
caccgctcct cgcccttgct cacca 25
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220> 132 <223> Synthetic oligonucleotide
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 66
caccggacca ggatgggcac caccc 25
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 67
aaacgggtgg tgcccatcct ggtcc 25
<210> 68
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 68
ttgttggaag gctcactgtc cttg 24
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 69
acaactaagg tggggcaaag 20
<210> 70 133 <211> 24
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 70
ttgttggaag gctcactgtc cttg 24
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 71
ggagctcaac attcttgggt cct 23
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 72
ggcaaaattt tcatgctgag gtg 23
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 73
gcacatcact tcgggttaca gtg 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
134
<400> 74
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 75
tacaggtagg agagcctgtt ttg 23
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 76
cccaagtatc ttcagttctg cag 23
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 77
ctcaaaagga tgtaaaccct gga 23
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 78
tgttgatgtg gtttgtttgc cc 22
<210> 79
<211> 23
<212> DNA 135 <213> Artificial sequence
tacaggtagg agagcctgtt ttg 23
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 80
ggaggtctag aatcggctaa gcc 23
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 81
ggctacatgt cccgtcaggg 20
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 82
gcaggccact aggcagatga a 21
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 83
gagctgacac ccaagaagtt cct 136 23 <212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 84
ggctctagag cctctgctaa cc 22
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 85
ggacttgaag aagtcgtgct gc 22
<210> 86
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 86
taatacgact cactataggg agaatggact ataaggacca cgac 44
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 87
gcgagctcta ggaattctta c 21
<210> 88
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
137
<220>
ttaatacgac tcactatagg ctcctcgccc ttgctcacca 40
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 89
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 90
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 90
ttaatacgac tcactatagg aaacccaggc tggttgga 38
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 91
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 92
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 92
ttaatacgac tcactatagg aactacagtg cggcactg 38
138
<210> 93
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 93
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 94
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 94
ttaatacgac tcactatagg ccagcctcgc ccagcgacat 40
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 95
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 96
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 96
ttaatacgac tcactatagg cagctgcagc atatatttaa 40
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide 139
<211> 3484
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 98
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720 atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020 tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320
140
ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggcacattc cctgctctgg tcgtgttgaa gtacaacatg 1560 gagacacgtg gggcaccgtc tgtgattctg acttctctct ggaggcggcc agcgtgctgt 1620 gcagggaact acagtgcggc actgtggttt ccctcctggg gggagctcac tttggagaag 1680 gaagtggaca gatctgggct gaagaattcc agtgtgaggg gcacgagtcc cacctttcac 1740 tctgcccagt agcaccccgc cctgacggga catgtagcca cagcagggac gtcggcgtag 1800 tctgctcaag tgagacccag ggaatgtgtt cactttgttc ccatgccatg aagagggtag 1860 ggttaggtag tcacagacat ctttttaaag ccctgtctcc ttccaggata cacacaaatc 1920 cgcttggtga atggcaagac cccatgtgaa ggaagagtgg agctcaacat tcttgggtcc 1980 tgggggtccc tctgcaactc tcactgggac atggaagatg cccatgtttt atgccagcag 2040 cttaaatgtg gagttgccct ttctatcccg ggaggagcac cttttgggaa aggaagtgag 2100 caggtctgga ggcacatgtt tcactgcact gggactgaga agcacatggg agattgttcc 2160 gtcactgctc tgggcgcatc actctgttct tcagggcaag tggcctctgt aatctgctca 2220 ggtaagagaa taagggcagc cagtgatgag ccactcatga cggtgcctta agagtgggtg 2280 tacctaggag ttcccattgt ggctcagtgg taacaaactc gactggtatc catgagggta 2340 tgggtttgat ccctggcctt gctcaatggg ttaaggatcc agcattgctg tgagctgtgg 2400 tataggttgc agactctgct caggtcccat gttgctgtga ttgtggtgta ggctgactgc 2460 tgcagcttca atttgacccc tagcccggga atttccatag gccacacgtg cagcactaag 2520 gaaggaaaaa aagaaaaaaa aaaaaaaaga gtgggtgtgc ctatagtgaa gaacagatgt 2580 aaaagggaag tgaaagggat tcccccattc tgagggattg tgagaagtgt gccagaatat 2640 taacttcatt tgacttgtta cagggaaagt aaacttgact ttcacggacc tcctagttac 2700 ctggtgctta ctatatgtct tctcagagta cctgattcat tcccagcctg gttgacccat 2760 ccccctatct ctatggctat gtttatccag agcacatcta tctaacactc cagctgatct 2820 tcctgacaca gctgtggcaa ccctggatcc tttaaccaac tgtgccaggc tggagatcaa 2880 acctaagcct ctgcagcaac ccaagctgct gcagtcagat ttttaacccc ctgtgccact 2940 gtgggtatct ccgatatttt gtatcttctg tgactgagtg gtttgctgtt tg 1c41agggaac 3000 ctcaatcctc tgaaatgcat tttattcatg ttttatttcc tctttgcagg gagtggtcaa 3180 cttcgcctgg tcgatggagg tggtcgttgt gctgggagag tagaggtcta tcatgagggc 3240 tcctggggca ccatctgtga tgacagctgg gacctgaatg atgcccatgt ggtgtgcaaa 3300 cagctgagct gtggatgggc cattaatgcc actggttctg ctcattttgg ggaaggaaca 3360 gggcccattt ggctggatga gataaactgt aatggaaaag aatctcatat ttggcaatgc 3420 cactcacatg gttgggggcg gcacaattgc aggcataagg aggatgcagg agtcatctgc 3480 tcgg 3484
<210> 99
<211> 4997
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 99
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720 atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggaca 1a42tga agtcctacta 900 tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220
tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520
143
aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580
tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccaggctg gttggagggg acattccctg ctctggtcgt gttgaagtac 3060 aacatggaga cacgtggggc accgtctgtg attctgactt ctctctggag gcggccagcg 3120 tgctgtgcag ggaactacag tgcggctact actactgtgg tttccctcct ggggggagct 3180 cactttggag aaggaagtgg acagatctgg gctgaagaat tccagtgtga ggggcacgag 3240 tcccaccttt cactctgccc agtagcaccc cgccctgacg ggacatgtag ccacagcagg 3300 gacgtcggcg tagtctgctc aagtgagacc cagggaatgt gttcactttg ttcccatgcc 3360 atgaagaggg tagggttagg tagtcacaga catcttttta aagccctgtc tccttccagg 3420 atacacacaa atccgcttgg tgaatggcaa gaccccatgt gaaggaagag tggagctcaa 3480 cattcttggg tcctgggggt ccctctgcaa ctctcactgg gacatggaag atgcccatgt 3540 tttatgccag cagcttaaat gtggagttgc cctttctatc ccgggaggag caccttttgg 3600 gaaaggaagt gagcaggtct ggaggcacat gtttcactgc actgggactg agaagcacat 3660 gggagattgt tccgtcactg ctctgggcgc atcactctgt tcttcagggc aagtggcctc 3720 tgtaatctgc tcaggtaaga gaataagggc agccagtgat gagccactca tgacggtgcc 3780 ttaagagtgg gtgtacctag gagttcccat tgtggctcag tggtaacaaa ctcgactggt 3840 atccatgagg gtatgggttt gatccctggc cttgctcaat gggttaagga tccagcattg 3900 ctgtgagctg tggtataggt tgcagactct gctcaggtcc catgttgctg tgattgtggt 3960 gtaggctgac tgctgcagct tcaatttgac ccctagcccg ggaatttcca taggccacac 4020 gtgcagcact aaggaaggaa aaaaagaaaa aaaaaaaaaa agagtgggtg tgcctatagt 4080 gaagaacaga tgtaaaaggg aagtgaaagg gattccccca ttctgaggga ttgtgagaag 4140 tgtgccagaa tattaacttc atttgacttg ttacagggaa agtaaact 1tg44 actttcacgg 4200 ctccagctga tcttcctgac acagctgtgg caaccctgga tcctttaacc aactgtgcca 4380 ggctggagat caaacctaag cctctgcagc aacccaagct gctgcagtca gatttttaac 4440 cccctgtgcc actgtgggta tctccgatat tttgtatctt ctgtgactga gtggtttgct 4500 gtttgcaggg aaccagagtc agacactatc cccgtgcaat tcatcatcct cggacccatc 4560 aagctctatt atttcagaag aaaatggtgt tgcctgcata ggtgagaatc agtgaccaac 4620 ctatgaaaat gatctcaatc ctctgaaatg cattttattc atgttttatt tcctctttgc 4680 agggagtggt caacttcgcc tggtcgatgg aggtggtcgt tgtgctggga gagtagaggt 4740 ctatcatgag ggctcctggg gcaccatctg tgatgacagc tgggacctga atgatgccca 4800 tgtggtgtgc aaacagctga gctgtggatg ggccattaat gccactggtt ctgctcattt 4860 tggggaagga acagggccca tttggctgga tgagataaac tgtaatggaa aagaatctca 4920 tatttggcaa tgccactcac atggttgggg gcggcacaat tgcaggcata aggaggatgc 4980 aggagtcatc tgctcgg 4997
<210> 100
<211> 3710
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 100
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactg 1a45gcga ggccagggat 600 atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020
tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220
146
tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640 tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaagggaa 2820 agggattccc ccattctgag ggattgtgag aagtgtgcca gaatattaac ttcatttgac 2880 ttgttacagg gaaagtaaac ttgactttca cggacctcct agttacctgg tgcttactat 2940 atgtcttctc agagtacctg attcattccc agcctggttg acccatcccc ctatctctat 3000 ggctatgttt atccagagca catctatcta acactccagc tgatcttcct gacacagctg 3060 tggcaaccct ggatccttta accaactgtg ccaggctgga gatcaaacct aagcctctgc 3120 agcaacccaa gctgctgcag tcagattttt aaccccctgt gccactgtgg gtatctccga 3180 tattttgtat cttctgtgac tgagtggttt gctgtttgca gggaaccaga gtcagacact 3240 atccccgtgc aattcatcat cctcggaccc atcaagctct attatttcag aagaaaatgg 3300 tgttgcctgc ataggtgaga atcagtgacc aacctatgaa aatgatctca atcctctgaa 3360 atgcatttta ttcatgtttt atttcctctt tgcagggagt ggtcaacttc gcctggtcga 3420 tggaggtggt cgttgtgctg ggagagtaga ggtctatcat gagggctcct ggggcaccat 3480 ctgtgatgac agctgggacc tgaatgatgc ccatgtggtg tgcaaacagc tgagctgtgg 3540 atgggccatt aatgccactg gttctgctca ttttggggaa ggaacagggc ccatttggct 3600 ggatgagata aactgtaatg gaaaagaatc tcatatttgg caatgccact cacatggttg 3660 ggggcggcac aattgcaggc ataaggagga tgcaggagtc atctgctcgg 3710
<210> 101
<211> 3617
<212> DNA
<213> Sus scrofa 147
agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420
tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720 atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020 tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaa 1a48gaca aaaaaagaga 1620 gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220 tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640 tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 gctaaaaagt agagagaatg gattgaaagg gattccccca ttctgaggga ttgtgagaag 2760 tgtgccagaa tattaacttc atttgacttg ttacagggaa agtaaacttg actttcacgg 2820 acctcctagt tacctggtgc ttactatatg tcttctcaga gtacctgatt cattcccagc 2880 ctggttgacc catcccccta tctctatggc tatgtttatc cagagcacat ctatctaaca 2940 ctccagctga tcttcctgac acagctgtgg caaccctgga tcctttaacc aactgtgcca 3000 ggctggagat caaacctaag cctctgcagc aacccaagct gctgcagtca gatttttaac 3060 cccctgtgcc actgtgggta tctccgatat tttgtatctt ctgtgactga gtggtttgct 3120 gtttgcaggg aaccagagtc agacactatc cccgtgcaat tcatcatcct cggacccatc 3180 aagctctatt atttcagaag aaaatggtgt tgcctgcata ggtgagaatc agtgaccaac 3240
149
ctatgaaaat gatctcaatc ctctgaaatg cattttattc atgttttatt tcctctttgc 3300 ctatcatgag ggctcctggg gcaccatctg tgatgacagc tgggacctga atgatgccca 3420 tgtggtgtgc aaacagctga gctgtggatg ggccattaat gccactggtt ctgctcattt 3480 tggggaagga acagggccca tttggctgga tgagataaac tgtaatggaa aagaatctca 3540 tatttggcaa tgccactcac atggttgggg gcggcacaat tgcaggcata aggaggatgc 3600 aggagtcatc tgctcgg 3617
<210> 102
<211> 4979
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 102
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720 atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020
150
tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220
tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640
tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggagga 1c51 tgagtatagg 2700 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccaggctg gttggagggg acattccctg ctctggtcgt gttgaagtac 3060 aacatggaga cacgtggggc accgtctgtg attctgactt ctctctggag gcggccagcg 3120 tgctgtgcag ggaactctgt ggtttccctc ctggggggag ctcactttgg agaaggaagt 3180 ggacagatct gggctgaaga attccagtgt gaggggcacg agtcccacct ttcactctgc 3240 ccagtagcac cccgccctga cgggacatgt agccacagca gggacgtcgg cgtagtctgc 3300 tcaagtgaga cccagggaat gtgttcactt tgttcccatg ccatgaagag ggtagggtta 3360 ggtagtcaca gacatctttt taaagccctg tctccttcca ggatacacac aaatccgctt 3420 ggtgaatggc aagaccccat gtgaaggaag agtggagctc aacattcttg ggtcctgggg 3480 gtccctctgc aactctcact gggacatgga agatgcccat gttttatgcc agcagcttaa 3540 atgtggagtt gccctttcta tcccgggagg agcacctttt gggaaaggaa gtgagcaggt 3600 ctggaggcac atgtttcact gcactgggac tgagaagcac atgggagatt gttccgtcac 3660 tgctctgggc gcatcactct gttcttcagg gcaagtggcc tctgtaatct gctcaggtaa 3720 gagaataagg gcagccagtg atgagccact catgacggtg ccttaagagt gggtgtacct 3780 aggagttccc attgtggctc agtggtaaca aactcgactg gtatccatga gggtatgggt 3840 ttgatccctg gccttgctca atgggttaag gatccagcat tgctgtgagc tgtggtatag 3900 gttgcagact ctgctcaggt cccatgttgc tgtgattgtg gtgtaggctg actgctgcag 3960 cttcaatttg acccctagcc cgggaatttc cataggccac acgtgcagca ctaaggaagg 4020 aaaaaaagaa aaaaaaaaaa aaagagtggg tgtgcctata gtgaagaaca gatgtaaaag 4080 ggaagtgaaa gggattcccc cattctgagg gattgtgaga agtgtgccag aatattaact 4140 tcatttgact tgttacaggg aaagtaaact tgactttcac ggacctccta gttacctggt 4200 gcttactata tgtcttctca gagtacctga ttcattccca gcctggttga cccatccccc 4260 tatctctatg gctatgttta tccagagcac atctatctaa cactccagct gatcttcctg 4320
152
acacagctgt ggcaaccctg gatcctttaa ccaactgtgc caggctggag atcaaaccta 4380 tatctccgat attttgtatc ttctgtgact gagtggtttg ctgtttgcag ggaaccagag 4500 tcagacacta tccccgtgca attcatcatc ctcggaccca tcaagctcta ttatttcaga 4560 agaaaatggt gttgcctgca taggtgagaa tcagtgacca acctatgaaa atgatctcaa 4620 tcctctgaaa tgcattttat tcatgtttta tttcctcttt gcagggagtg gtcaacttcg 4680 cctggtcgat ggaggtggtc gttgtgctgg gagagtagag gtctatcatg agggctcctg 4740 gggcaccatc tgtgatgaca gctgggacct gaatgatgcc catgtggtgt gcaaacagct 4800 gagctgtgga tgggccatta atgccactgg ttctgctcat tttggggaag gaacagggcc 4860 catttggctg gatgagataa actgtaatgg aaaagaatct catatttggc aatgccactc 4920 acatggttgg gggcggcaca attgcaggca taaggaggat gcaggagtca tctgctcgg 4979
<210> 103
<211> 4615
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 103
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720 atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780
153
caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020
tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220
tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtc 1a54tc tttaaaaggc 2460 atattggaat catattctcc ctcaccgaaa tgctattttt cagcccacag gaaacccagg 2640 ctggttggag gggacattcc ctgctctggt cgtgttgaag tacaacatgg agacacgtgg 2700 ggcaccgtct gtgattctga cttctctctg gaggcggcca gcgtgctgtg cagggaacta 2760 cagtgcggca cagtgtggtt tccctcctgg ggggagctca ctttggagaa ggaagtggac 2820 agatctgggc tgaagaattc cagtgtgagg ggcacgagtc ccacctttca ctctgcccag 2880 tagcaccccg ccctgacggg acatgtagcc acagcaggga cgtcggcgta gtctgctcaa 2940 gtgagaccca gggaatgtgt tcactttgtt cccatgccat gaagagggta gggttaggta 3000 gtcacagaca tctttttaaa gccctgtctc cttccaggat acacacaaat ccgcttggtg 3060 aatggcaaga ccccatgtga aggaagagtg gagctcaaca ttcttgggtc ctgggggtcc 3120 ctctgcaact ctcactggga catggaagat gcccatgttt tatgccagca gcttaaatgt 3180 ggagttgccc tttctatccc gggaggagca ccttttggga aaggaagtga gcaggtctgg 3240 aggcacatgt ttcactgcac tgggactgag aagcacatgg gagattgttc cgtcactgct 3300 ctgggcgcat cactctgttc ttcagggcaa gtggcctctg taatctgctc aggtaagaga 3360 ataagggcag ccagtgatga gccactcatg acggtgcctt aagagtgggt gtacctagga 3420 gttcccattg tggctcagtg gtaacaaact cgactggtat ccatgagggt atgggtttga 3480 tccctggcct tgctcaatgg gttaaggatc cagcattgct gtgagctgtg gtataggttg 3540 cagactctgc tcaggtccca tgttgctgtg attgtggtgt aggctgactg ctgcagcttc 3600 aatttgaccc ctagcccggg aatttccata ggccacacgt gcagcactaa ggaaggaaaa 3660 aaagaaaaaa aaaaaaaaag agtgggtgtg cctatagtga agaacagatg taaaagggaa 3720 gtgaaaggga ttcccccatt ctgagggatt gtgagaagtg tgccagaata ttaacttcat 3780 ttgacttgtt acagggaaag taaacttgac tttcacggac ctcctagtta cctggtgctt 3840 actatatgtc ttctcagagt acctgattca ttcccagcct ggttgaccca tccccctatc 3900 tctatggcta tgtttatcca gagcacatct atctaacact ccagctgatc ttcctgacac 3960 agctgtggca accctggatc ctttaaccaa ctgtgccagg ctggagatca aacctaagcc 4020 tctgcagcaa cccaagctgc tgcagtcaga tttttaaccc cctgtgccac tgtgggtatc 4080
155
tccgatattt tgtatcttct gtgactgagt ggtttgctgt ttgcagggaa ccagagtcag 4140 aatggtgttg cctgcatagg tgagaatcag tgaccaacct atgaaaatga tctcaatcct 4260 ctgaaatgca ttttattcat gttttatttc ctctttgcag ggagtggtca acttcgcctg 4320 gtcgatggag gtggtcgttg tgctgggaga gtagaggtct atcatgaggg ctcctggggc 4380 accatctgtg atgacagctg ggacctgaat gatgcccatg tggtgtgcaa acagctgagc 4440 tgtggatggg ccattaatgc cactggttct gctcattttg gggaaggaac agggcccatt 4500 tggctggatg agataaactg taatggaaaa gaatctcata tttggcaatg ccactcacat 4560 ggttgggggc ggcacaattg caggcataag gaggatgcag gagtcatctg ctcgg 4615
<210> 104
<211> 4866
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 104
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720 atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900
156
tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220
tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga 157 aactcttacc 2580 gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccaggctg gttctgtggt ttccctcctg gggggagctc actttggaga 3060 aggaagtgga cagatctggg ctgaagaatt ccagtgtgag gggcacgagt cccacctttc 3120 actctgccca gtagcacccc gccctgacgg gacatgtagc cacagcaggg acgtcggcgt 3180 agtctgctca agtgagaccc agggaatgtg ttcactttgt tcccatgcca tgaagagggt 3240 agggttaggt agtcacagac atctttttaa agccctgtct ccttccagga tacacacaaa 3300 tccgcttggt gaatggcaag accccatgtg aaggaagagt ggagctcaac attcttgggt 3360 cctgggggtc cctctgcaac tctcactggg acatggaaga tgcccatgtt ttatgccagc 3420 agcttaaatg tggagttgcc ctttctatcc cgggaggagc accttttggg aaaggaagtg 3480 agcaggtctg gaggcacatg tttcactgca ctgggactga gaagcacatg ggagattgtt 3540 ccgtcactgc tctgggcgca tcactctgtt cttcagggca agtggcctct gtaatctgct 3600 caggtaagag aataagggca gccagtgatg agccactcat gacggtgcct taagagtggg 3660 tgtacctagg agttcccatt gtggctcagt ggtaacaaac tcgactggta tccatgaggg 3720 tatgggtttg atccctggcc ttgctcaatg ggttaaggat ccagcattgc tgtgagctgt 3780 ggtataggtt gcagactctg ctcaggtccc atgttgctgt gattgtggtg taggctgact 3840 gctgcagctt caatttgacc cctagcccgg gaatttccat aggccacacg tgcagcacta 3900 aggaaggaaa aaaagaaaaa aaaaaaaaaa gagtgggtgt gcctatagtg aagaacagat 3960 gtaaaaggga agtgaaaggg attcccccat tctgagggat tgtgagaagt gtgccagaat 4020 attaacttca tttgacttgt tacagggaaa gtaaacttga ctttcacgga cctcctagtt 4080 acctggtgct tactatatgt cttctcagag tacctgattc attcccagcc tggttgaccc 4140 atccccctat ctctatggct atgtttatcc agagcacatc tatctaacac tccagctgat 4200
158
cttcctgaca cagctgtggc aaccctggat cctttaacca actgtgccag gctggagatc 4260 ctgtgggtat ctccgatatt ttgtatcttc tgtgactgag tggtttgctg tttgcaggga 4380 accagagtca gacactatcc ccgtgcaatt catcatcctc ggacccatca agctctatta 4440 tttcagaaga aaatggtgtt gcctgcatag gtgagaatca gtgaccaacc tatgaaaatg 4500 atctcaatcc tctgaaatgc attttattca tgttttattt cctctttgca gggagtggtc 4560 aacttcgcct ggtcgatgga ggtggtcgtt gtgctgggag agtagaggtc tatcatgagg 4620 gctcctgggg caccatctgt gatgacagct gggacctgaa tgatgcccat gtggtgtgca 4680 aacagctgag ctgtggatgg gccattaatg ccactggttc tgctcatttt ggggaaggaa 4740 cagggcccat ttggctggat gagataaact gtaatggaaa agaatctcat atttggcaat 4800 gccactcaca tggttggggg cggcacaatt gcaggcataa ggaggatgca ggagtcatct 4860 gctcgg 4866
<210> 105
<211> 4867
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 105
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720
159
atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020
tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220
tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctg 16t0 gccatgctga 2400 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640 tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccaggctg gttactgtgg tttccctcct ggggggagct cactttggag 3060 aaggaagtgg acagatctgg gctgaagaat tccagtgtga ggggcacgag tcccaccttt 3120 cactctgccc agtagcaccc cgccctgacg ggacatgtag ccacagcagg gacgtcggcg 3180 tagtctgctc aagtgagacc cagggaatgt gttcactttg ttcccatgcc atgaagaggg 3240 tagggttagg tagtcacaga catcttttta aagccctgtc tccttccagg atacacacaa 3300 atccgcttgg tgaatggcaa gaccccatgt gaaggaagag tggagctcaa cattcttggg 3360 tcctgggggt ccctctgcaa ctctcactgg gacatggaag atgcccatgt tttatgccag 3420 cagcttaaat gtggagttgc cctttctatc ccgggaggag caccttttgg gaaaggaagt 3480 gagcaggtct ggaggcacat gtttcactgc actgggactg agaagcacat gggagattgt 3540 tccgtcactg ctctgggcgc atcactctgt tcttcagggc aagtggcctc tgtaatctgc 3600 tcaggtaaga gaataagggc agccagtgat gagccactca tgacggtgcc ttaagagtgg 3660 gtgtacctag gagttcccat tgtggctcag tggtaacaaa ctcgactggt atccatgagg 3720 gtatgggttt gatccctggc cttgctcaat gggttaagga tccagcattg ctgtgagctg 3780 tggtataggt tgcagactct gctcaggtcc catgttgctg tgattgtggt gtaggctgac 3840 tgctgcagct tcaatttgac ccctagcccg ggaatttcca taggccacac gtgcagcact 3900 aaggaaggaa aaaaagaaaa aaaaaaaaaa agagtgggtg tgcctatagt gaagaacaga 3960 tgtaaaaggg aagtgaaagg gattccccca ttctgaggga ttgtgagaag tgtgccagaa 4020
161
tattaacttc atttgacttg ttacagggaa agtaaacttg actttcacgg acctcctagt 4080 catcccccta tctctatggc tatgtttatc cagagcacat ctatctaaca ctccagctga 4200 tcttcctgac acagctgtgg caaccctgga tcctttaacc aactgtgcca ggctggagat 4260 caaacctaag cctctgcagc aacccaagct gctgcagtca gatttttaac cccctgtgcc 4320 actgtgggta tctccgatat tttgtatctt ctgtgactga gtggtttgct gtttgcaggg 4380 aaccagagtc agacactatc cccgtgcaat tcatcatcct cggacccatc aagctctatt 4440 atttcagaag aaaatggtgt tgcctgcata ggtgagaatc agtgaccaac ctatgaaaat 4500 gatctcaatc ctctgaaatg cattttattc atgttttatt tcctctttgc agggagtggt 4560 caacttcgcc tggtcgatgg aggtggtcgt tgtgctggga gagtagaggt ctatcatgag 4620 ggctcctggg gcaccatctg tgatgacagc tgggacctga atgatgccca tgtggtgtgc 4680 aaacagctga gctgtggatg ggccattaat gccactggtt ctgctcattt tggggaagga 4740 acagggccca tttggctgga tgagataaac tgtaatggaa aagaatctca tatttggcaa 4800 tgccactcac atggttgggg gcggcacaat tgcaggcata aggaggatgc aggagtcatc 4860 tgctcgg 4867
<210> 106
<211> 4991
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 106
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540
162
gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720
atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020
tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct ta 1g63ttgtgtt 2220
tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640 tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccaggctg gttggagggg acattccctg ctctggtcgt gttgaagtac 3060 aacatggaga cacgtggggc accgtctgtg attctgactt ctctctggag gcggccagcg 3120 tgctgtgcag ggaactacag tgcggcaact gtggtttccc tcctgggggg agctcacttt 3180 ggagaaggaa gtggacagat ctgggctgaa gaattccagt gtgaggggca cgagtcccac 3240 ctttcactct gcccagtagc accccgccct gacgggacat gtagccacag cagggacgtc 3300 ggcgtagtct gctcaagtga gacccaggga atgtgttcac tttgttccca tgccatgaag 3360 agggtagggt taggtagtca cagacatctt tttaaagccc tgtctccttc caggatacac 3420 acaaatccgc ttggtgaatg gcaagacccc atgtgaagga agagtggagc tcaacattct 3480 tgggtcctgg gggtccctct gcaactctca ctgggacatg gaagatgccc atgttttatg 3540 ccagcagctt aaatgtggag ttgccctttc tatcccggga ggagcacctt ttgggaaagg 3600 aagtgagcag gtctggaggc acatgtttca ctgcactggg actgagaagc acatgggaga 3660 ttgttccgtc actgctctgg gcgcatcact ctgttcttca gggcaagtgg cctctgtaat 3720 ctgctcaggt aagagaataa gggcagccag tgatgagcca ctcatgacgg tgccttaaga 3780 gtgggtgtac ctaggagttc ccattgtggc tcagtggtaa caaactcgac tggtatccat 3840
164
gagggtatgg gtttgatccc tggccttgct caatgggtta aggatccagc attgctgtga 3900 tgactgctgc agcttcaatt tgacccctag cccgggaatt tccataggcc acacgtgcag 4020 cactaaggaa ggaaaaaaag aaaaaaaaaa aaaaagagtg ggtgtgccta tagtgaagaa 4080 cagatgtaaa agggaagtga aagggattcc cccattctga gggattgtga gaagtgtgcc 4140 agaatattaa cttcatttga cttgttacag ggaaagtaaa cttgactttc acggacctcc 4200 tagttacctg gtgcttacta tatgtcttct cagagtacct gattcattcc cagcctggtt 4260 gacccatccc cctatctcta tggctatgtt tatccagagc acatctatct aacactccag 4320 ctgatcttcc tgacacagct gtggcaaccc tggatccttt aaccaactgt gccaggctgg 4380 agatcaaacc taagcctctg cagcaaccca agctgctgca gtcagatttt taaccccctg 4440 tgccactgtg ggtatctccg atattttgta tcttctgtga ctgagtggtt tgctgtttgc 4500 agggaaccag agtcagacac tatccccgtg caattcatca tcctcggacc catcaagctc 4560 tattatttca gaagaaaatg gtgttgcctg cataggtgag aatcagtgac caacctatga 4620 aaatgatctc aatcctctga aatgcatttt attcatgttt tatttcctct ttgcagggag 4680 tggtcaactt cgcctggtcg atggaggtgg tcgttgtgct gggagagtag aggtctatca 4740 tgagggctcc tggggcacca tctgtgatga cagctgggac ctgaatgatg cccatgtggt 4800 gtgcaaacag ctgagctgtg gatgggccat taatgccact ggttctgctc attttgggga 4860 aggaacaggg cccatttggc tggatgagat aaactgtaat ggaaaagaat ctcatatttg 4920 gcaatgccac tcacatggtt gggggcggca caattgcagg cataaggagg atgcaggagt 4980 catctgctcg g 4991
<210> 107
<211> 4860
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 107
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240
165
ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420
tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720
atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020
tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagat 1t6a6a attaaggagg 1920 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220 tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640 tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccaggctg gttggagggt cctgggggga gctcactttg gagaaggaag 3060 tggacagatc tgggctgaag aattccagtg tgaggggcac gagtcccacc tttcactctg 3120 cccagtagca ccccgccctg acgggacatg tagccacagc agggacgtcg gcgtagtctg 3180 ctcaagtgag acccagggaa tgtgttcact ttgttcccat gccatgaaga gggtagggtt 3240 aggtagtcac agacatcttt ttaaagccct gtctccttcc aggatacaca caaatccgct 3300 tggtgaatgg caagacccca tgtgaaggaa gagtggagct caacattctt gggtcctggg 3360 ggtccctctg caactctcac tgggacatgg aagatgccca tgttttatgc cagcagctta 3420 aatgtggagt tgccctttct atcccgggag gagcaccttt tgggaaagga agtgagcagg 3480 tctggaggca catgtttcac tgcactggga ctgagaagca catgggagat tgttccgtca 3540
167
ctgctctggg cgcatcactc tgttcttcag ggcaagtggc ctctgtaatc tgctcaggta 3600 taggagttcc cattgtggct cagtggtaac aaactcgact ggtatccatg agggtatggg 3720 tttgatccct ggccttgctc aatgggttaa ggatccagca ttgctgtgag ctgtggtata 3780 ggttgcagac tctgctcagg tcccatgttg ctgtgattgt ggtgtaggct gactgctgca 3840 gcttcaattt gacccctagc ccgggaattt ccataggcca cacgtgcagc actaaggaag 3900 gaaaaaaaga aaaaaaaaaa aaaagagtgg gtgtgcctat agtgaagaac agatgtaaaa 3960 gggaagtgaa agggattccc ccattctgag ggattgtgag aagtgtgcca gaatattaac 4020 ttcatttgac ttgttacagg gaaagtaaac ttgactttca cggacctcct agttacctgg 4080 tgcttactat atgtcttctc agagtacctg attcattccc agcctggttg acccatcccc 4140 ctatctctat ggctatgttt atccagagca catctatcta acactccagc tgatcttcct 4200 gacacagctg tggcaaccct ggatccttta accaactgtg ccaggctgga gatcaaacct 4260 aagcctctgc agcaacccaa gctgctgcag tcagattttt aaccccctgt gccactgtgg 4320 gtatctccga tattttgtat cttctgtgac tgagtggttt gctgtttgca gggaaccaga 4380 gtcagacact atccccgtgc aattcatcat cctcggaccc atcaagctct attatttcag 4440 aagaaaatgg tgttgcctgc ataggtgaga atcagtgacc aacctatgaa aatgatctca 4500 atcctctgaa atgcatttta ttcatgtttt atttcctctt tgcagggagt ggtcaacttc 4560 gcctggtcga tggaggtggt cgttgtgctg ggagagtaga ggtctatcat gagggctcct 4620 ggggcaccat ctgtgatgac agctgggacc tgaatgatgc ccatgtggtg tgcaaacagc 4680 tgagctgtgg atgggccatt aatgccactg gttctgctca ttttggggaa ggaacagggc 4740 ccatttggct ggatgagata aactgtaatg gaaaagaatc tcatatttgg caatgccact 4800 cacatggttg ggggcggcac aattgcaggc ataaggagga tgcaggagtc atctgctcgg 4860
<210> 108
<211> 4858
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 108
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120
168
ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420
tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720
atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020
tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactc 1ta69ag aaactgcttt 1800 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220 tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640 tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccaggctg gttggagggc tggggggagc tcactttgga gaaggaagtg 3060 gacagatctg ggctgaagaa ttccagtgtg aggggcacga gtcccacctt tcactctgcc 3120 cagtagcacc ccgccctgac gggacatgta gccacagcag ggacgtcggc gtagtctgct 3180 caagtgagac ccagggaatg tgttcacttt gttcccatgc catgaagagg gtagggttag 3240 gtagtcacag acatcttttt aaagccctgt ctccttccag gatacacaca aatccgcttg 3300 gtgaatggca agaccccatg tgaaggaaga gtggagctca acattcttgg gtcctggggg 3360 tccctctgca actctcactg ggacatggaa gatgcccatg ttttatgcca gcagcttaaa 3420
170
tgtggagttg ccctttctat cccgggagga gcaccttttg ggaaaggaag tgagcaggtc 3480 gctctgggcg catcactctg ttcttcaggg caagtggcct ctgtaatctg ctcaggtaag 3600 agaataaggg cagccagtga tgagccactc atgacggtgc cttaagagtg ggtgtaccta 3660 ggagttccca ttgtggctca gtggtaacaa actcgactgg tatccatgag ggtatgggtt 3720 tgatccctgg ccttgctcaa tgggttaagg atccagcatt gctgtgagct gtggtatagg 3780 ttgcagactc tgctcaggtc ccatgttgct gtgattgtgg tgtaggctga ctgctgcagc 3840 ttcaatttga cccctagccc gggaatttcc ataggccaca cgtgcagcac taaggaagga 3900 aaaaaagaaa aaaaaaaaaa aagagtgggt gtgcctatag tgaagaacag atgtaaaagg 3960 gaagtgaaag ggattccccc attctgaggg attgtgagaa gtgtgccaga atattaactt 4020 catttgactt gttacaggga aagtaaactt gactttcacg gacctcctag ttacctggtg 4080 cttactatat gtcttctcag agtacctgat tcattcccag cctggttgac ccatccccct 4140 atctctatgg ctatgtttat ccagagcaca tctatctaac actccagctg atcttcctga 4200 cacagctgtg gcaaccctgg atcctttaac caactgtgcc aggctggaga tcaaacctaa 4260 gcctctgcag caacccaagc tgctgcagtc agatttttaa ccccctgtgc cactgtgggt 4320 atctccgata ttttgtatct tctgtgactg agtggtttgc tgtttgcagg gaaccagagt 4380 cagacactat ccccgtgcaa ttcatcatcc tcggacccat caagctctat tatttcagaa 4440 gaaaatggtg ttgcctgcat aggtgagaat cagtgaccaa cctatgaaaa tgatctcaat 4500 cctctgaaat gcattttatt catgttttat ttcctctttg cagggagtgg tcaacttcgc 4560 ctggtcgatg gaggtggtcg ttgtgctggg agagtagagg tctatcatga gggctcctgg 4620 ggcaccatct gtgatgacag ctgggacctg aatgatgccc atgtggtgtg caaacagctg 4680 agctgtggat gggccattaa tgccactggt tctgctcatt ttggggaagg aacagggccc 4740 atttggctgg atgagataaa ctgtaatgga aaagaatctc atatttggca atgccactca 4800 catggttggg ggcggcacaa ttgcaggcat aaggaggatg caggagtcat ctgctcgg 4858
<210> 109
<211> 3523
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 109 171
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180
tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420
tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720
atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020
tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 17 a2aaaaaaaaa gaacccccag 1680 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220 tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gagctgtggt ataggttgca gactctgctc 2460 aggtcccatg ttgctgtgat tgtggtgtag gctgactgct gcagcttcaa tttgacccct 2520 agcccgggaa tttccatagg ccacacgtgc agcactaagg aaggaaaaaa agaaaaaaaa 2580 aaaaaaagag tgggtgtgcc tatagtgaag aacagatgta aaagggaagt gaaagggatt 2640 cccccattct gagggattgt gagaagtgtg ccagaatatt aacttcattt gacttgttac 2700 agggaaagta aacttgactt tcacggacct cctagttacc tggtgcttac tatatgtctt 2760 ctcagagtac ctgattcatt cccagcctgg ttgacccatc cccctatctc tatggctatg 2820 tttatccaga gcacatctat ctaacactcc agctgatctt cctgacacag ctgtggcaac 2880 cctggatcct ttaaccaact gtgccaggct ggagatcaaa cctaagcctc tgcagcaacc 2940 caagctgctg cagtcagatt tttaaccccc tgtgccactg tgggtatctc cgatattttg 3000 tatcttctgt gactgagtgg tttgctgttt gcagggaacc agagtcagac actatccccg 3060 tgcaattcat catcctcgga cccatcaagc tctattattt cagaagaaaa tggtgttgcc 3120 tgcataggtg agaatcagtg accaacctat gaaaatgatc tcaatcctct gaaatgcatt 3180 ttattcatgt tttatttcct ctttgcaggg agtggtcaac ttcgcctggt cgatggaggt 3240 ggtcgttgtg ctgggagagt agaggtctat catgagggct cctggggcac catctgtgat 3300
173
gacagctggg acctgaatga tgcccatgtg gtgtgcaaac agctgagctg tggatgggcc 3360 ataaactgta atggaaaaga atctcatatt tggcaatgcc actcacatgg ttgggggcgg 3480 cacaattgca ggcataagga ggatgcagga gtcatctgct cgg 3523
<210> 110
<211> 3603
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 110
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgttgt ggagaattcc acaagaattc gtgttatttg acagcagtca tctttaaaag 540 gcatttgaga aagtccaatt tcaaatgcat ttcctttctt taaaagataa attgaagaaa 600 ataagtcttt atttcccaag taaattgaat tgcctctcag tctgttaaaa gaaactctta 660 tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 720 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 780 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 840 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 900 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 960 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 1020 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 1080 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 1140 gagatgttgt ggagaattcc acaagaattc gtgttatttg acagcagtca tctttaaaag 1200
174
gcatttgaga aagtccaatt tcaaatgcat ttcctttctt taaaagataa attgaagaaa 1260 ccttgatgat tgcgctctta acctggcaaa gattgtcttt aaaatctgag ctccatgtct 1380 tctgctttat ttctggtgtg cctttgactc cagattacag taaatggagg actgagtata 1440 gggctaaaaa gtagagagaa tggatgcata ttatctgtgg tctccaatgt gatgaatgaa 1500 gtaggcaaat actcaaagga aagagaaagc atgctccaag aattatgggt tccagaaggc 1560 aaagtcccag aattgtctcc agggaaggac agggaggtct agaatcggct aagcccactg 1620 taggcagaaa aaccaagagg catgaatggc ttccctttct cacttttcac tctctggctt 1680 actcctatca tgaaggaaaa tattggaatc atattctccc tcaccgaaat gctatttttc 1740 agcccacagg aaacccaggc tggttggagg ggacattccc tgctctcact ttggagaagg 1800 aagtggacag atctgggctg aagaattcca gtgtgagggg cacgagtccc acctttcact 1860 ctgcccagta gcaccccgcc ctgacgggac atgtagccac agcagggacg tcggcgtagt 1920 ctgctcaagt gagacccagg gaatgtgttc actttgttcc catgccatga agagggtagg 1980 gttaggtagt cacagacatc tttttaaagc cctgtctcct tccaggatac acacaaatcc 2040 gcttggtgaa tggcaagacc ccatgtgaag gaagagtgga gctcaacatt cttgggtcct 2100 gggggtccct ctgcaactct cactgggaca tggaagatgc ccatgtttta tgccagcagc 2160 ttaaatgtgg agttgccctt tctatcccgg gaggagcacc ttttgggaaa ggaagtgagc 2220 aggtctggag gcacatgttt cactgcactg ggactgagaa gcacatggga gattgttccg 2280 tcactgctct gggcgcatca ctctgttctt cagggcaagt ggcctctgta atctgctcag 2340 gtaagagaat aagggcagcc agtgatgagc cactcatgac ggtgccttaa gagtgggtgt 2400 acctaggagt tcccattgtg gctcagtggt aacaaactcg actggtatcc atgagggtat 2460 gggtttgatc cctggccttg ctcaatgggt taaggatcca gcattgctgt gagctgtggt 2520 ataggttgca gactctgctc aggtcccatg ttgctgtgat tgtggtgtag gctgactgct 2580 gcagcttcaa tttgacccct agcccgggaa tttccatagg ccacacgtgc agcactaagg 2640 aaggaaaaaa agaaaaaaaa aaaaaaagag tgggtgtgcc tatagtgaag aacagatgta 2700 aaagggaagt gaaagggatt cccccattct gagggattgt gagaagtgtg ccagaatatt 2760 aacttcattt gacttgttac agggaaagta aacttgactt tcacggacct cctagttacc 2820 tggtgcttac tatatgtctt ctcagagtac ctgattcatt cccagcctgg 17 t5tgacccatc 2880 cctaagcctc tgcagcaacc caagctgctg cagtcagatt tttaaccccc tgtgccactg 3060 tgggtatctc cgatattttg tatcttctgt gactgagtgg tttgctgttt gcagggaacc 3120 agagtcagac actatccccg tgcaattcat catcctcgga cccatcaagc tctattattt 3180 cagaagaaaa tggtgttgcc tgcataggtg agaatcagtg accaacctat gaaaatgatc 3240 tcaatcctct gaaatgcatt ttattcatgt tttatttcct ctttgcaggg agtggtcaac 3300 ttcgcctggt cgatggaggt ggtcgttgtg ctgggagagt agaggtctat catgagggct 3360 cctggggcac catctgtgat gacagctggg acctgaatga tgcccatgtg gtgtgcaaac 3420 agctgagctg tggatgggcc attaatgcca ctggttctgc tcattttggg gaaggaacag 3480 ggcccatttg gctggatgag ataaactgta atggaaaaga atctcatatt tggcaatgcc 3540 actcacatgg ttgggggcgg cacaattgca ggcataagga ggatgcagga gtcatctgct 3600 cgg 3603
<210> 111
<211> 4962
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 111
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagc 1c76a tgatgggaac 660 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020
tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220
tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280
177
tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640 tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccaggctg gttggagggg acattccctg ctctggtcgt gttgaagtac 3060 aacatggaga cacgtggggc accgtctgtg attctgactt ctctctggag gcggccagcg 3120 tgctgtgcag ggaactacag tgcgtcactt tggagaagga agtggacaga tctgggctga 3180 agaattccag tgtgaggggc acgagtccca cctttcactc tgcccagtag caccccgccc 3240 tgacgggaca tgtagccaca gcagggacgt cggcgtagtc tgctcaagtg agacccaggg 3300 aatgtgttca ctttgttccc atgccatgaa gagggtaggg ttaggtagtc acagacatct 3360 ttttaaagcc ctgtctcctt ccaggataca cacaaatccg cttggtgaat ggcaagaccc 3420 catgtgaagg aagagtggag ctcaacattc ttgggtcctg ggggtccctc tgcaactctc 3480 actgggacat ggaagatgcc catgttttat gccagcagct taaatgtgga gttgcccttt 3540 ctatcccggg aggagcacct tttgggaaag gaagtgagca ggtctggagg cacatgtttc 3600 actgcactgg gactgagaag cacatgggag attgttccgt cactgctctg ggcgcatcac 3660 tctgttcttc agggcaagtg gcctctgtaa tctgctcagg taagagaata agggcagcca 3720 gtgatgagcc actcatgacg gtgccttaag agtgggtgta cctaggagtt cccattgtgg 3780 ctcagtggta acaaactcga ctggtatcca tgagggtatg ggtttgatcc ctggccttgc 3840 tcaatgggtt aaggatccag cattgctgtg agctgtggta taggttgcag actctgctca 3900 ggtcccatgt tgctgtgatt gtggtgtagg ctgactgctg cagcttcaa 17t8 ttgaccccta 3960 ccccattctg agggattgtg agaagtgtgc cagaatatta acttcatttg acttgttaca 4140 gggaaagtaa acttgacttt cacggacctc ctagttacct ggtgcttact atatgtcttc 4200 tcagagtacc tgattcattc ccagcctggt tgacccatcc ccctatctct atggctatgt 4260 ttatccagag cacatctatc taacactcca gctgatcttc ctgacacagc tgtggcaacc 4320 ctggatcctt taaccaactg tgccaggctg gagatcaaac ctaagcctct gcagcaaccc 4380 aagctgctgc agtcagattt ttaaccccct gtgccactgt gggtatctcc gatattttgt 4440 atcttctgtg actgagtggt ttgctgtttg cagggaacca gagtcagaca ctatccccgt 4500 gcaattcatc atcctcggac ccatcaagct ctattatttc agaagaaaat ggtgttgcct 4560 gcataggtga gaatcagtga ccaacctatg aaaatgatct caatcctctg aaatgcattt 4620 tattcatgtt ttatttcctc tttgcaggga gtggtcaact tcgcctggtc gatggaggtg 4680 gtcgttgtgc tgggagagta gaggtctatc atgagggctc ctggggcacc atctgtgatg 4740 acagctggga cctgaatgat gcccatgtgg tgtgcaaaca gctgagctgt ggatgggcca 4800 ttaatgccac tggttctgct cattttgggg aaggaacagg gcccatttgg ctggatgaga 4860 taaactgtaa tggaaaagaa tctcatattt ggcaatgcca ctcacatggt tgggggcggc 4920 acaattgcag gcataaggag gatgcaggag tcatctgctc gg 4962
<210> 112
<211> 3603
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 112
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt at 1t7t9atgtct 420 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720
atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020
tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040
180
gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220 tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640 tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccaggctg gttggagggg acattccctg ctctggtcgt gttgaagtac 3060 aacatggaga cacgtggggc accgtctgtg attctgactt ctctctggag gcggccagcg 3120 tgctgtgcag ggaactacag tgcgattcat catcctcgga cccatcaagc tctattattt 3180 cagaagaaaa tggtgttgcc tgcataggtg agaatcagtg accaacctat gaaaatgatc 3240 tcaatcctct gaaatgcatt ttattcatgt tttatttcct ctttgcaggg agtggtcaac 3300 ttcgcctggt cgatggaggt ggtcgttgtg ctgggagagt agaggtctat catgagggct 3360 cctggggcac catctgtgat gacagctggg acctgaatga tgcccatgtg gtgtgcaaac 3420 agctgagctg tggatgggcc attaatgcca ctggttctgc tcattttggg gaaggaacag 3480 ggcccatttg gctggatgag ataaactgta atggaaaaga atctcatatt tggcaatgcc 3540 actcacatgg ttgggggcgg cacaattgca ggcataagga ggatgcagga gtcatctgct 3600 cgg 3603
181
<210> 113
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720 atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020 tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgc 1a8g2a cacggttctg 1500 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220
tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640
tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccaggctg gttggagggg acattccctg ctctggtcgt gttgaagtac 3060 aacatggaga cacgtggggc accgtctgtg attctgactt ctctctggag gcagccagcg 3120
183
tgctttgcag ggaaccagag tcagacacta tccccgtgca attcatcatc ctcggaccca 3180 acctatgaaa atgatctcaa tcctctgaaa tgcattttat tcatgtttta tttcctcttt 3300 gcagggagtg gtcaacttcg cctggtcgat ggaggtggtc gttgtgctgg gagagtagag 3360 gtctatcatg agggctcctg gggcaccatc tgtgatgaca gctgggacct gaatgatgcc 3420 catgtggtgt gcaaacagct gagctgtgga tgggccatta atgccactgg ttctgctcat 3480 tttggggaag gaacagggcc catttggctg gatgagataa actgtaatgg aaaagaatct 3540 catatttggc aatgccactc acatggttgg gggcggcaca attgcaggca taaggaggat 3600 gcaggagtca tctgctcgg 3619
<210> 114
<211> 3270
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 114
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720 atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900
184
tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220
tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac ttgttacagg gaaagtaaac 2460 ttgactttca cggacctcct agttacctgg tgcttactat atgtcttctc agagtacctg 2520 attcattccc agcctggttg acccatcccc ctatctctat ggctatgttt 1 a85tccagagca 2580
tcagattttt aaccccctgt gccactgtgg gtatctccga tattttgtat cttctgtgac 2760 tgagtggttt gctgtttgca gggaaccaga gtcagacact atccccgtgc aattcatcat 2820 cctcggaccc atcaagctct attatttcag aagaaaatgg tgttgcctgc ataggtgaga 2880 atcagtgacc aacctatgaa aatgatctca atcctctgaa atgcatttta ttcatgtttt 2940 atttcctctt tgcagggagt ggtcaacttc gcctggtcga tggaggtggt cgttgtgctg 3000 ggagagtaga ggtctatcat gagggctcct ggggcaccat ctgtgatgac agctgggacc 3060 tgaatgatgc ccatgtggtg tgcaaacagc tgagctgtgg atgggccatt aatgccactg 3120 gttctgctca ttttggggaa ggaacagggc ccatttggct ggatgagata aactgtaatg 3180 gaaaagaatc tcatatttgg caatgccact cacatggttg ggggcggcac aattgcaggc 3240 ataaggagga tgcaggagtc atctgctcgg 3270
<210> 115
<211> 7
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 115
tactact 7
<210> 116
<211> 12
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 116
tgtggagaat tc 12
<210> 117
<211> 11
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 117
agccagcgtg c 11
<210> 118
<211> 8532 186
<212> DNA
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720 atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020 tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaac 18a7gc tctgattaga 1560 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740 gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220 tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640 tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccaggctg gttggagctg acatgccctg ctctggtcgt gttgaagtaa 3060 aacatgcaga cacgtggggc tccgtctgtg attctgactt ctctctgcat gcggccaacg 3120 tgctgtgcag ggaactaaat tgcggcgatg cgatttccct ctcggtggga gatcactttg 3180
188
gaaaaggaaa tggactgacc tgggctgaaa aattccagtg tgaggggagc gagacccacc 3240 gcgtagtctg ctcaagtaag agtttactga aaataacact cttaaaatct tgttatgttt 3360 ttattcataa tgtgaatgag tagtagtgga aaataactac cagtttccta agcttataac 3420 ttcgtatagc atacattata cgaagttata agcctgcagg aattctaccg ggtaggggag 3480 gcgcttttcc caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag ccccgctggg cacttggcgc 3540 tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca ccggtaggcg ccaaccggct 3600 ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc ccctagtcag gaagttcccc 3660 cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg aagtagcacg tctcactagt 3720 ctcgtgcaga tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg taggcctttg gggcagcggc 3780 caatagcagc tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc tgggaagggg tgggtccggg 3840 ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc gaaggtcctc cggaggcccg 3900 gcattctgca cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt tctcctcttc ctcatctccg 3960 ggcctttcga cctgcagcca ccatggccat gattgaacag gatggcctgc atgcaggttc 4020 tccagctgcc tgggtggaga gactgtttgg ctatgactgg gcacagcaga ccattggttg 4080 ctctgatgca gcagtgttca gactgtcagc ccagggcagg ccagtcctgt ttgtgaagac 4140 agacctcagt ggggctctca atgagctgca ggatgaggct gccagactct cctggctggc 4200 aacaactggg gtcccctgtg cagctgtcct ggatgtggtc acagaagctg gaagggactg 4260 gctcctgctg ggtgaggtgc ctgggcagga cctcctgtcc tctcacctgg ctccagctga 4320 gaaagtgtca atcatggctg atgccatgag aagactccac accctggacc cagccacctg 4380 cccctttgac caccaggcca agcacaggat tgagagggcc agaaccagga tggaggctgg 4440 cctggtggac caggatgacc tggatgaaga acaccagggc ctggcccctg ctgaactgtt 4500 tgccaggctc aaggcatcca tgccagatgg tgaggacctg gtggtgactc atggggatgc 4560 ctgcctgccc aacatcatgg tggaaaatgg aaggttctct ggcttcattg actgtggcag 4620 gctgggagtg gctgacaggt accaggacat tgccctggca accagggaca ttgcagaaga 4680 gctgggggga gaatgggcag acaggttcct ggtgctctat ggcattgcag cccctgactc 4740 ccagagaatt gccttctaca gactgctgga tgagttcttc taaatcgatt ataatcagcc 4800 ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacc 1tc89 cccctgaacc 4860 gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtgg aaaataacta ccagtttcct aagcttataa 5040 cttcgtatag catacattat acgaagttat aagctagaca aaagtatctt accccaatgg 5100 tagccctgta cccaataaaa gtaggtgttc agtttcatat cctatgaaat accctcttga 5160 tacttttact ttgcatgagg atttagaaga aaaaagtttt actataatcc ttaacttagg 5220 aaattctttt gaattggaaa tgaaacacaa attgcttttc attgatatgc catatgatta 5280 tatgaataaa acatgaaatc ttcatattgg attctagtat atacccaagt aaatattttt 5340 tccctagaag agtgccaagt gtgttaaaac cttttggttt aataaagcag aaaaaaataa 5400 actctaaaaa tcataattaa aaatgaaatg cttttattta tagcaattaa ctacaacatg 5460 tttagactta catactatta aatataatat atttaagatc ccctcatgat aaatatgttc 5520 attattttgt aggctgttga tgcactaata tgtatgtaga ttactttgtg aattgccctt 5580 aataaaattt aaaactttag gctagtaaac ctgtaacact caacttagtt ctgaactatc 5640 tcactattct tttgcaagaa tttacttagg taatgccaac taatttattc caaggccaaa 5700 aagatgacaa tgtcttatat attataaaaa ctaataaaaa ccattttaaa acctagtata 5760 aatttaaagg tacttgctct tctggttcat ctcttctttt gtttacttct gctttcaaaa 5820 acttatttat tgtgaccata ttctttactt ccatttattg ttataattta taagatacta 5880 tacttgcaag caataaatgt tatcttttta gcttttaaat ggtctcattt gaaaagaata 5940 tataattagt aagtcatagc tactttaaat aaaaacttat tctttaagag attaaacact 6000 tctccaagtg atctgttttt ctttaattaa aacgttatta actcccaaaa tgatgttatt 6060 gtttttttat aatcttaaat accaataatt accaggtcta ttttgatttt gatacaggat 6120 aaaaactact attaattact taagaatgtg ttctttttta tatgtaccat tttcatgatc 6180 aaagttggtg atatgactga ggttttgatt attattaaac agatagttaa tatgatatat 6240 tcctcatttt tccaaatgaa aggaaaaatg tcttatatgg aggaaaagat tggggcaggg 6300 ggattagtaa attattactt aaatatctga ataggaggat ttttcaatga aaggataaag 6360 gaagaatgat tgtatcatct gaatctttcc ctccctttcc tggagtttgt cctttcaacc 6420 cagtatacct accactccct tcatcaccta ctttcccatt acagtcccta tgtgttgggt 6480
190
ggtaactatt ttgttttggt gttaatatcc aagtttccct taataacacc tagtgaatgg 6540 atgaagaaag gaagctagcc tctccccttc ctttcctcct gcctctctct ctcttctctg 6660 tcctcgctcc ctttcttccc atcaatattt tcagagcacc tcttatgcgc caggcattgg 6720 gatactcaaa ctggaggaaa caagaaaaaa aaaaaaaaaa ggcgaagacc tcagggaaat 6780 ttatattgct gctatatttt tttgagccta gtgtaaatta aaattcctta atgctgtgcc 6840 ttttaaaaac acaaataagc aaaatagttt atttcttcaa cagttaaatc cttagggtag 6900 gaaagtgatt caggatctat tgctactatt aactcttctt tcattttcac acaggataca 6960 cacaaatccg cttggtgaat ggcaagaccc catgtgaagg aagagtggag ctcaacattc 7020 ttgggtcctg ggggtccctc tgcaactctc actgggacat ggaagatgcc catgttttat 7080 gccagcagct taaatgtgga gttgcccttt ctatcccggg aggagcacct tttgggaaag 7140 gaagtgagca ggtctggagg cacatgtttc actgcactgg gactgagaag cacatgggag 7200 attgttccgt cactgctctg ggcgcatcac tctgttcttc agggcaagtg gcctctgtaa 7260 tctgctcagg taagagaata agggcagcca gtgatgagcc actcatgacg gtgccttaag 7320 agtgggtgta cctaggagtt cccattgtgg ctcagtggta acaaactcga ctggtatcca 7380 tgagggtatg ggtttgatcc ctggccttgc tcaatgggtt aaggatccag cattgctgtg 7440 agctgtggta taggttgcag actctgctca ggtcccatgt tgctgtgatt gtggtgtagg 7500 ctgactgctg cagcttcaat ttgaccccta gcccgggaat ttccataggc cacacgtgca 7560 gcactaagga aggaaaaaaa gaaaaaaaaa aaaaaagagt gggtgtgcct atagtgaaga 7620 acagatgtaa aagggaagtg aaagggattc ccccattctg agggattgtg agaagtgtgc 7680 cagaatatta acttcatttg acttgttaca gggaaagtaa acttgacttt cacggacctc 7740 ctagttacct ggtgcttact atatgtcttc tcagagtacc tgattcattc ccagcctggt 7800 tgacccatcc ccctatctct atggctatgt ttatccagag cacatctatc taacactcca 7860 gctgatcttc ctgacacagc tgtggcaacc ctggatcctt taaccaactg tgccaggctg 7920 gagatcaaac ctaagcctct gcagcaaccc aagctgctgc agtcagattt ttaaccccct 7980 gtgccactgt gggtatctcc gatattttgt atcttctgtg actgagtggt ttgctgtttg 8040 cagggaacca gagtcagaca ctatccccgt gcaattcatc atcctcggac ccatcaagct 8100 ctattatttc agaagaaaat ggtgttgcct gcataggtga gaatcag 1t9g1a ccaacctatg 8160 atgagggctc ctggggcacc atctgtgatg acagctggga cctgaatgat gcccatgtgg 8340 tgtgcaaaca gctgagctgt ggatgggcca ttaatgccac tggttctgct cattttgggg 8400 aaggaacagg gcccatttgg ctggatgaga taaactgtaa tggaaaagaa tctcatattt 8460 ggcaatgcca ctcacatggt tgggggcggc acaattgcag gcataaggag gatgcaggag 8520 tcatctgctc gg 8532
<210> 119
<211> 4538
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 119
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720 atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 19 t2gtgtgtgtg 1020 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220
tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640
193
tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccagctca acattcttgg gtcctggggg tccctctgca actctcactg 3060 ggacatggaa gatgcccatg ttttatgcca gcagcttaaa tgtggagttg ccctttctat 3120 cccgggagga gcaccttttg ggaaaggaag tgagcaggtc tggaggcaca tgtttcactg 3180 cactgggact gagaagcaca tgggagattg ttccgtcact gctctgggcg catcactctg 3240 ttcttcaggg caagtggcct ctgtaatctg ctcaggtaag agaataaggg cagccagtga 3300 tgagccactc atgacggtgc cttaagagtg ggtgtaccta ggagttccca ttgtggctca 3360 gtggtaacaa actcgactgg tatccatgag ggtatgggtt tgatccctgg ccttgctcaa 3420 tgggttaagg atccagcatt gctgtgagct gtggtatagg ttgcagactc tgctcaggtc 3480 ccatgttgct gtgattgtgg tgtaggctga ctgctgcagc ttcaatttga cccctagccc 3540 gggaatttcc ataggccaca cgtgcagcac taaggaagga aaaaaagaaa aaaaaaaaaa 3600 aagagtgggt gtgcctatag tgaagaacag atgtaaaagg gaagtgaaag ggattccccc 3660 attctgaggg attgtgagaa gtgtgccaga atattaactt catttgactt gttacaggga 3720 aagtaaactt gactttcacg gacctcctag ttacctggtg cttactatat gtcttctcag 3780 agtacctgat tcattcccag cctggttgac ccatccccct atctctatgg ctatgtttat 3840 ccagagcaca tctatctaac actccagctg atcttcctga cacagctgtg gcaaccctgg 3900 atcctttaac caactgtgcc aggctggaga tcaaacctaa gcctctgcag caacccaagc 3960 tgctgcagtc agatttttaa ccccctgtgc cactgtgggt atctccgata ttttgtatct 4020 tctgtgactg agtggtttgc tgtttgcagg gaaccagagt cagacactat ccccgtgcaa 4080 ttcatcatcc tcggacccat caagctctat tatttcagaa gaaaatggtg ttgcctgcat 4140 aggtgagaat cagtgaccaa cctatgaaaa tgatctcaat cctctgaaat gcattttatt 4200 catgttttat ttcctctttg cagggagtgg tcaacttcgc ctggtcgatg gaggtggtcg 4260 ttgtgctggg agagtagagg tctatcatga gggctcctgg ggcacc 1a94tct gtgatgacag 4320 ctgtaatgga aaagaatctc atatttggca atgccactca catggttggg ggcggcacaa 4500
ttgcaggcat aaggaggatg caggagtcat ctgctcgg 4538
<210> 120
<211> 101
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 120
Pro Arg Leu Val Gly Gly Asp Ile Pro Cys Ser Gly Arg Val Glu Val
1 5 10 15
Gln His Gly Asp Thr Trp Gly Thr Val Cys Asp Ser Asp Phe Ser Leu
20 25 30
Glu Ala Ala Ser Val Leu Cys Arg Glu Leu Gln Cys Gly Thr Val Val
35 40 45
Ser Leu Leu Gly Gly Ala His Phe Gly Glu Gly Ser Gly Gln Ile Trp
50 55 60
Ala Glu Glu Phe Gln Cys Glu Gly His Glu Ser His Leu Ser Leu Cys
65 70 75 80
Pro Val Ala Pro Arg Pro Asp Gly Thr Cys Ser His Ser Arg Asp Val
85 90 95
Gly Val Val Cys Ser
100
<210> 121
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 121
Leu Arg Leu Val Asp Gly Asp Ser Arg Cys Ala Gly Arg Val Glu Ile
1 5 10 15
Ser Asp Ala His Val Val Cys Gln Lys Leu Gly Cys Gly Val Ala Phe 35 40 45
Asn Ala Thr Val Ser Ala His Phe Gly Glu Gly Ser Gly Pro Ile Trp 50 55 60
Leu Asp Asp Leu Asn Cys Thr Gly Met Glu Ser His Leu Trp Gln Cys 65 70 75 80
Pro Ser Arg Gly Trp Gly Gln His Asp Cys Arg His Lys Glu Asp Ala 85 90 95
Gly Val Ile Cys
100

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Životinja svinje ili ćelija svinje koja sadrži najmanje jednu modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163, pri čemu modifikacija smanjuje podložnost životinje ili ćelije na infekciju virusom reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRSV), u poređenju sa podložnošću životinje ili ćelije koja ne sadrži modifikovanu hromozomsku sekvencu u genu koji kodira protein CD163 na infekciju sa PRRSV i pri čemu modifikovana hromozomska sekvenca sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koju čine:
insercija 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 na istom alelu;
delecija 1506 baznih parova od nukleotida 1.525 do nukleotida 3.030 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
insercija 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
delecija 1280 baznih parova od nukleotida 2.818 do nukleotida 4.097 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
delecija 1373 bazna para od nukleotida 2.724 do nukleotida 4.096 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
delecija 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
delecija 28 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
delecija 1387 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 4.531 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
delecija 1382 bazna para od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113;
delecija 1720 baznih parova od nukleotida 2.440 do nukleotida 4.160 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47; i
delecija 452 bazna para od nukleotida 3.015 do nukleotida 3.466 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47.
2. Životinja ili ćelija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu modifikacija smanjuje podložnost životinje ili ćelije PRRSV virusu tipa 1, PRRSV tipa 2 ili PRRSV virusima i tipa 1 i tipa 2.
3. Životinja ili ćelija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu modifikacija smanjuje podložnost životinje ili ćelije izolatu PRRSV izabranom iz grupe koju čine NVSL 97-7895, KS06-72109, P129, VR2332, CO90, AZ25, MLV-ResPRRS, KS62-06274, KS483 (SD23983), CO84, Lelistad, SD01-08 i njihove kombinacije.
4. Životinja prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, pri čemu je životinja embrion, mlada ili odrasla jedinka.
5. Životinja prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 ili ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, pri čemu je životinja genetički editovana životinja ili pri čemu je ćelija genetički editovana ćelija i pri čemu je životinja ili ćelija genetički editovana upotrebom „homing” endonukleaze (opciono, specifično dizajnirane „homing”endonukleaze).
6. Životinja ili ćelija prema patentnom zahtevu 5, pri čemu „homing” endonukleaza sadrži sistem grupisanih kratkih palindromskih ponovaka na jednakim rastojanjima (CRISPR)/Cas, efektornu nukleazu sličnu aktivatoru transkripcije (TALEN), nukleazu sa cinkanim prstima (ZFN), rekombinazni fuzioni protein, meganukleazu ili njihovu kombinaciju.
7. Životinja prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 ili ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, 5 ili 6, pri čemu modifikovana hromozomska sekvenca dovodi do proizvodnje suštinski nefunkcionalnog proteina CD163 od strane životinje ili ćelije.
8. Životinja svinje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 ili ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 ili 5-7, pri čemu je insercija ili delecija izabrana iz grupe koju čine:
insercija 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 na istom alelu;
delecija 28 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
delecija 452 bazna para od nukleotida 3.015 do nukleotida 3.466 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47;
i njihove kombinacije.
9. Životinja prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 ili ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 ili 5-7, pri čemu:
modifikovana hromozomska sekvenca sadrži inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 na istom alelu, a insercija od 2 bazna para obuhvata inserciju dinukleotida AG; modifikovana hromozomska sekvenca sadrži inserciju 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu insercija od 7 baznih parova sadrži sekvencu TACTACT (SEQ ID NO: 115); ili
modifikovana hromozomska sekvenca sadrži deleciju 1382 bazna para od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113, pri čemu insercija od 11 baznih parova sadrži sekvencu AGCCAGCGTGC (SEQ ID NO: 117).
10. Životinja svinje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 ili ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 ili 5-9, pri čemu životinja ili ćelija sadrži:
(a) inserciju 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD163;
(b) inserciju 7 baznih parova između nukleotida 3.148 i nukleotida 3.149 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i deleciju 1382 baznih parova od nukleotida 3.113 do nukleotida 4.494 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 11 baznih parova koja počinje od nukleotida 3.113 u drugom alelu gena koji kodira protein CD163;
(c) deleciju 1280 baznih parova od nukleotida 2.818 do nukleotida 4.097 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD163;
(d) deleciju 1280 baznih parova od nukleotida 2.818 do nukleotida 4.097 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom gena koji kodira protein CD163; (e) deleciju 1930 baznih parova od nukleotida 488 do nukleotida 2.417 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, pri čemu je delecijom uklonjena sekvenca zamenjena sa insercijom od 12 baznih parova koja počinje od nukleotida 488, i pri čemu postoji dodatna delecija od 129 baznih parova u egzonu 7 od nukleotida 3.044 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD163;
(f) deleciju 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD163;
(g) deleciju 1467 baznih parova od nukleotida 2.431 do nukleotida 3.897 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD163;
(h) deleciju 11 baznih parova od nukleotida 3.137 do nukleotida 3.147 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i inserciju 2 bazna para između nukleotida 3.149 i 3.150 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47, sa delecijom 377 baznih parova od nukleotida 2.573 do nukleotida 2.949 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD163; ili
(i) deleciju 28 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 3.172 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u jednom alelu gena koji kodira protein CD163; i
deleciju 1387 baznih parova od nukleotida 3.145 do nukleotida 4.531 u poređenju sa referentnom sekvencom SEQ ID NO: 47 u drugom alelu gena koji kodira protein CD163.
11. Životinja svinje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10 ili ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 ili 5-10, pri čemu životinja ili ćelija sadrži hromozomsku sekvencu koja je najmanje 80% identična sekvenci SEQ ID NO: 47 u regionima navedene hromozomske sekvence izvan insercije ili delecije.
12. Životinja svinje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11 ili ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 ili 5-11, pri čemu životinja ili ćelija sadrži hromozomsku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 98, 99, 100, 101, 103, 109, 111, 112, 113, 114 ili 119.
13. Ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 ili 5-12, pri čemu je navedena ćelija izabrana iz grupe koja obuhvata ćeliju sperme, jajnu ćeliju ili somatsku ćeliju.
14. Ćelija prema patentnom zahtevu 13, pri čemu ćelija obuhvata jajnu ćeliju, a jajna ćelija obuhvata oplođenu jajnu ćeliju.
15. Ćelija prema patentnom zahtevu 13, pri čemu ćelija obuhvata somatsku ćeliju, a somatska ćelija obuhvata fibroblast.
RS20240750A 2015-08-06 2016-07-22 Svinja i ćelije rezistentne na virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (prrsv) koje imaju modifikovane cd163 gene RS65691B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562202145P 2015-08-06 2015-08-06
PCT/US2016/043467 WO2017023570A1 (en) 2015-08-06 2016-07-22 Pathogen-resistant animals having modified cd163 genes
EP16833514.9A EP3331355B1 (en) 2015-08-06 2016-07-22 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv)-resistant porcine and cells having modified cd163 genes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65691B1 true RS65691B1 (sr) 2024-07-31

Family

ID=57943474

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240750A RS65691B1 (sr) 2015-08-06 2016-07-22 Svinja i ćelije rezistentne na virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (prrsv) koje imaju modifikovane cd163 gene

Country Status (20)

Country Link
US (5) US10091975B2 (sr)
EP (2) EP3331355B1 (sr)
JP (3) JP2018525000A (sr)
CN (1) CN109475107A (sr)
BR (1) BR112018002417A2 (sr)
DK (1) DK3331355T3 (sr)
ES (1) ES2981381T3 (sr)
FI (1) FI3331355T3 (sr)
HR (1) HRP20240908T1 (sr)
HU (1) HUE066989T2 (sr)
LT (1) LT3331355T (sr)
MX (1) MX2018001529A (sr)
PH (1) PH12018500257A1 (sr)
PL (1) PL3331355T3 (sr)
PT (1) PT3331355T (sr)
RS (1) RS65691B1 (sr)
RU (1) RU2018107842A (sr)
SI (1) SI3331355T1 (sr)
SM (1) SMT202400272T1 (sr)
WO (1) WO2017023570A1 (sr)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PH12020500244A1 (en) 2011-05-16 2024-06-24 Univ Missouri Porcine reproductive and respiratory syndrome virus resistant animals
JP2018525000A (ja) 2015-08-06 2018-09-06 ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリＴｈｅ Ｃｕｒａｔｏｒｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ 改変ｃｄ１６３遺伝子を有する病原体抵抗性動物
GB201617559D0 (en) * 2016-10-17 2016-11-30 University Court Of The University Of Edinburgh The Swine comprising modified cd163 and associated methods
US20200377881A1 (en) * 2017-03-24 2020-12-03 President And Fellows Of Harvard College Methods of Genome Engineering by Nuclease-Transposase Fusion Proteins
CN107354170A (zh) * 2017-08-24 2017-11-17 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种基因敲除载体以及制备cd163基因敲除猪成纤维细胞的方法
US12060403B2 (en) 2017-10-16 2024-08-13 Kansas State University Research Foundation Methods and compositions for treating and protecting against porcine reproductive and respiratory syndrome virus
CN107937345B (zh) * 2017-11-16 2019-01-29 山东蓝思种业股份有限公司 一种制备同时敲除cd163基因和cd13基因的猪成纤维细胞的方法
KR102680060B1 (ko) * 2018-04-17 2024-07-02 더 큐레이터스 오브 더 유니버시티 오브 미주리 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 태아를 보호하는 방법
US11160260B2 (en) * 2018-04-17 2021-11-02 The Curators Of The University Of Missouri Methods for protecting porcine fetuses from infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
CN108753832A (zh) * 2018-04-20 2018-11-06 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9编辑大白猪CD163基因的方法
KR102059503B1 (ko) 2018-07-31 2019-12-26 충북대학교 산학협력단 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별을 위한 단일염기다형성 마커 조성물
CN108998406B (zh) * 2018-08-03 2022-05-10 福州大学 一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法
WO2020198541A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 Recombinetics, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) resistant swine
CN110438155A (zh) * 2019-08-15 2019-11-12 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 修饰cd163基因第561位氨基酸的组合物、应用、细胞及基因编辑猪的制备方法
CN110684723B (zh) * 2019-11-21 2021-03-12 东北农业大学 一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用
GB201919294D0 (en) * 2019-12-24 2020-02-05 Eco Animal Health Ltd Antibodies or binding proteins
MX2022013704A (es) * 2020-05-05 2022-12-07 Genus Plc Procedimientos para mejorar la salud de especies porcinas mediante la inactivacion dirigida de cd163.
CN113512534B (zh) * 2020-09-23 2024-04-23 杭州启函生物科技有限公司 用于遗传修饰和靶向的组合物和方法
KR20230087494A (ko) * 2020-10-15 2023-06-16 에이비에스 글로벌, 인코포레이티드 돼지의 성별화된 정액 및 그 사용 방법
CN112094866B (zh) * 2020-11-10 2021-05-11 北京首农未来生物科技有限公司 一种利用SpRY-Cas9系统制备CD163基因编辑猪的方法
JP2024540165A (ja) * 2021-11-01 2024-10-31 シグマ－アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー Ｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓシステムのためのエレクトロポレーションエンハンサー
JP2023129028A (ja) 2022-03-04 2023-09-14 三井化学株式会社 無電解めっき用プライマー組成物、積層体及びその製造方法
CN114774468B (zh) * 2022-04-20 2022-12-20 温氏食品集团股份有限公司 一种等位基因分子标记及抗蓝耳病猪群体组建方法
US20240358007A1 (en) * 2023-04-30 2024-10-31 Vincenzo Michael Biella High Efficiency Beef Cattle Having Modified ACTN3 Genes
CN116671491B (zh) * 2023-07-04 2024-01-23 四川省畜牧科学研究院 一种南江黄羊的种羊选育方法
CN119979720B (zh) * 2025-02-26 2025-09-23 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 猪精液品质相关的分子标记鉴定及其应用

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US789538A (en) 1904-11-11 1905-05-09 Colin E Ham Dumb-bell.
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US5731178A (en) 1990-03-21 1998-03-24 Behringwerke Aktiengesellschaft Attachment-elements for stimulation of eukaryotic expression systems
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5610053A (en) 1993-04-07 1997-03-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expressed genes from cis-acting regulatory sequences in mammalian cells
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6242568B1 (en) 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
CA2681922C (en) 1994-01-18 2012-05-15 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
JP4118327B2 (ja) 1994-08-20 2008-07-16 ゲンダック・リミテッド Ｄｎａ認識のための結合タンパク質におけるまたはそれに関連する改良
GB9417831D0 (en) 1994-09-05 1994-10-26 Biotech & Biolog Scien Res Biological manipulation
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
GB9517779D0 (en) 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
GB9517780D0 (en) 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
EP0821070A1 (en) 1996-07-22 1998-01-28 Carelli, Claude Marcel Henri Pit-1 gene polymorphism and trait selection in animals
US6037525A (en) 1996-08-01 2000-03-14 North Carolina State University Method for reducing expression variability of transgenes in plant cells
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
US5945577A (en) 1997-01-10 1999-08-31 University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells
GB2338237B (en) 1997-02-18 2001-02-28 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6211429B1 (en) 1997-06-18 2001-04-03 The Curators Of The University Of Missouri Complete oocyte activation using an oocyte-modifying agent and a reducing agent
US6087166A (en) 1997-07-03 2000-07-11 Basf Aktiengesellschaft Transcriptional activators with graded transactivation potential
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
ATE466952T1 (de) 1998-03-02 2010-05-15 Massachusetts Inst Technology Poly-zinkfinger-proteine mit verbesserten linkern
US6140815A (en) 1998-06-17 2000-10-31 Dover Instrument Corporation High stability spin stand platform
WO2000022098A1 (en) 1998-10-12 2000-04-20 Geron Bio-Med Limited Porcine oocytes with improved developmental competence
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
AU1128400A (en) 1998-10-22 2000-05-08 Medical College Of Georgia Institute, Inc. Long terminal repeat, enhancer, and insulator sequences for use in recombinant vectors
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
WO2001030965A2 (en) 1999-10-28 2001-05-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of in vivo gene transfer using a sleeping beauty transposon system
DE60023936T2 (de) 1999-12-06 2006-05-24 Sangamo Biosciences Inc., Richmond Methoden zur verwendung von randomisierten zinkfingerprotein-bibliotheken zur identifizierung von genfunktionen
US6689558B2 (en) 2000-02-08 2004-02-10 Sangamo Biosciences, Inc. Cells for drug discovery
US20020061512A1 (en) 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
US20030044787A1 (en) 2000-05-16 2003-03-06 Joung J. Keith Methods and compositions for interaction trap assays
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
US7067317B2 (en) 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
GB0108491D0 (en) 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
US20040224385A1 (en) 2001-08-20 2004-11-11 Barbas Carlos F Zinc finger binding domains for cnn
WO2003055302A1 (en) 2001-12-21 2003-07-10 The Curators Of The University Of Missouri Knockout swine and methods for making the same
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
US7196243B2 (en) 2002-04-03 2007-03-27 Trillium Therapeutics Inc. Transgenic animal containing CD200 and uses therefor
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
CN101405404A (zh) 2002-12-31 2009-04-08 迈特默菲公司 用于推断牛的性状的组合物、方法和系统
WO2004065581A2 (en) 2003-01-15 2004-08-05 Discovery Genomics, Inc. Transposon-insulator element delivery systems
US7985739B2 (en) 2003-06-04 2011-07-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhanced sleeping beauty transposon system and methods for using the same
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US20050153317A1 (en) 2003-10-24 2005-07-14 Metamorphix, Inc. Methods and systems for inferring traits to breed and manage non-beef livestock
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
KR20070002057A (ko) 2004-03-17 2007-01-04 레비비코르 인코포레이션 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스펙션스페라제의 어떠한발현도 결여된 동물로부터 유래된 조직 산물
US7015592B2 (en) 2004-03-19 2006-03-21 Intel Corporation Marking on underfill
DE602005011943D1 (de) 2004-04-08 2009-02-05 Sangamo Biosciences Inc Zusammensetzungen zur behandlung von neuropathischen und neurodegenerativen erkrankungen
AU2005233550B2 (en) 2004-04-08 2010-11-18 Sangamo Therapeutics, Inc. Treatment of neuropathic pain with zinc finger proteins
CA2563064A1 (en) 2004-04-22 2005-11-10 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Transgenic animals and uses thereof
EP1877583A2 (en) 2005-05-05 2008-01-16 Arizona Board of Regents on behalf of the Unversity of Arizona Sequence enabled reassembly (seer) - a novel method for visualizing specific dna sequences
AU2006259137B2 (en) 2005-06-14 2010-04-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Anthranilic acid derivatives
WO2007014275A2 (en) 2005-07-26 2007-02-01 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
EP2037966A2 (en) 2006-05-11 2009-03-25 Ghent University Sialoadhesin-related compositions and methods
JP5266210B2 (ja) 2006-05-25 2013-08-21 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 改変開裂ハーフドメイン
US9428756B2 (en) 2006-08-11 2016-08-30 Dow Agrosciences Llc Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination
MX2009006303A (es) 2006-12-14 2009-10-21 Dow Agrosciences Llc Proteinas de dedo de zinc no canonicas optimizadas.
US8912386B2 (en) * 2007-03-28 2014-12-16 University Of Iowa Research Foundation Transgenic pig model of cystic fibrosis
DK2191271T3 (en) 2007-07-27 2016-04-11 Univ Gent PERMISSIVE CELLS AND APPLICATIONS THEREOF
EP2281050B1 (en) 2008-04-14 2014-04-02 Sangamo BioSciences, Inc. Linear donor constructs for targeted integration
CA2734235C (en) 2008-08-22 2019-03-26 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
US20110023140A1 (en) 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Rabbit genome editing with zinc finger nucleases
US20110016543A1 (en) 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in inflammation
US20110016546A1 (en) 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Porcine genome editing with zinc finger nucleases
KR102122267B1 (ko) 2009-08-14 2020-06-12 레비비코르 인코포레이션 당뇨병 치료를 위한 복수 형질전환 돼지
WO2011100058A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
CN103025344B (zh) 2010-05-17 2016-06-29 桑格摩生物科学股份有限公司 新型dna-结合蛋白及其用途
PH12020500244A1 (en) * 2011-05-16 2024-06-24 Univ Missouri Porcine reproductive and respiratory syndrome virus resistant animals
CN102715132A (zh) * 2012-05-04 2012-10-10 吉林大学 猪繁殖与呼吸综合症病毒受体cd163敲除猪及培育方法
CA2871524C (en) 2012-05-07 2021-07-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
CN105688201A (zh) 2012-05-17 2016-06-22 佐蒂斯有限责任公司 在断奶之前对抗猪繁殖与呼吸综合征（prrs）病毒的有效疫苗接种
GB201313235D0 (en) 2013-07-24 2013-09-04 Univ Edinburgh Antiviral Compositions Methods and Animals
US20150275231A1 (en) 2014-03-31 2015-10-01 Mice With Horns, Llc Method of Preventing or Reducing Virus Transmission in Animals
CN104593422A (zh) * 2015-01-08 2015-05-06 中国农业大学 一种抗蓝耳病克隆猪的制备方法
CA2993435C (en) * 2015-08-06 2025-09-09 The Curators Of The University Of Missouri Animals resistant to pathogens having modified CD163 genes
JP2018525000A (ja) * 2015-08-06 2018-09-06 ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリＴｈｅ Ｃｕｒａｔｏｒｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ 改変ｃｄ１６３遺伝子を有する病原体抵抗性動物
US11160260B2 (en) * 2018-04-17 2021-11-02 The Curators Of The University Of Missouri Methods for protecting porcine fetuses from infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)

Also Published As

Publication number Publication date
EP4361279A2 (en) 2024-05-01
CN109475107A (zh) 2019-03-15
ES2981381T3 (es) 2024-10-08
PL3331355T3 (pl) 2024-08-05
DK3331355T3 (en) 2024-07-08
EP3331355B1 (en) 2024-04-03
EP4361279A3 (en) 2024-07-17
PH12018500257A1 (en) 2018-08-13
JP2024059790A (ja) 2024-05-01
HUE066989T2 (hu) 2024-09-28
LT3331355T (lt) 2024-07-25
US10091975B2 (en) 2018-10-09
BR112018002417A2 (pt) 2018-09-18
HK1256742A1 (en) 2019-10-04
EP3331355A1 (en) 2018-06-13
MX2018001529A (es) 2018-04-24
US20240122164A1 (en) 2024-04-18
WO2017023570A1 (en) 2017-02-09
SI3331355T1 (sl) 2024-10-30
US12219939B2 (en) 2025-02-11
JP2022033771A (ja) 2022-03-02
US10827730B2 (en) 2020-11-10
EP3331355A4 (en) 2019-04-03
SMT202400272T1 (it) 2024-07-09
PT3331355T (pt) 2024-07-12
FI3331355T3 (fi) 2024-06-17
HRP20240908T1 (hr) 2024-10-25
US20210112790A1 (en) 2021-04-22
US20170035035A1 (en) 2017-02-09
JP2018525000A (ja) 2018-09-06
US20190082662A1 (en) 2019-03-21
US20250212855A1 (en) 2025-07-03
RU2018107842A (ru) 2019-09-09
US12225889B2 (en) 2025-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12225889B2 (en) Pathogen-resistant animals having modified CD163 genes
US12433263B2 (en) Methods for protecting porcine fetuses from infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
KR102495662B1 (ko) 변형된 cd163 유전자를 갖는 병원균-내성 동물
KR20210005661A (ko) 변형된 아미노펩티다제 n(anpep) 유전자를 갖는 병원체-내성 동물
AU2025208495A1 (en) Methods for protecting porcine fetuses from infection with virus
RU2778405C2 (ru) Способы защиты плодов свиней от инфицирования вирусом
HK40105681A (en) Pathogen-resistant animals having modified cd163 genes
HK1256742B (en) Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv)-resistant porcine and cells having modified cd163 genes