RS65681B1 - Postupci, upotrebe i sastavi za lečenje rifabutinom - Google Patents

Description

Opis

Povezane prijave

Ova prijava zahteva prednost i prioritet privremene prijave patenta SAD serijskih brojeva 62/902,019, podnete 18. septembra 2019, 62/899,257, podnete 12. septembra 2019, 62/941,160, podnete 27. novembra 2019, i 62/977,659, podnete 17. februara 2020.

Tehnička oblast

Predmetni pronalazak otkriva sastav i postupke za aktivaciju receptora ferik-koprogena A. baumannii (FhuE) i upotrebu visokih sistemskih izlaganja rifabutinu (Cmax i AUC) koje su efikasne u lečenju infekcije A. baumannii.

Pozadina

Bakterijske infekcije je često teško lečiti zbog pojave sojeva bakterija rezistentnih na više lekova (MDR) ili ekstenzivno rezistentnih na lekove (XDR). Posbnu zabrinutost izazivaju, prema spisku prioriteta Svetske zdravstvene organizacije,Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa i Enterobacteriaceae spp., rezistentnih na cefalosporine treće generacije, koji pripadaju gram-negativnim patogenima rezistentnim na antimikrobne lekove poznatim pod akronimom „ESKAPE“.

Pacijenti koji pate od infekcije rezistentne na antimikrobne lekove obično su previše bolesni da bi uzimali oralne formulacije antibiotika „zadnje opcije“, tako da je intravenozna (IV) primena jedini postupak davanja zadovoljavajući za obezbeđivanje lečenja antibiotikom. Nažalost, većina antibiotika nije formulisana za IV primenu jer ih je teško ili nemoguće formulisati u rastvorljive oblike.

Rifabutin (takođe poznat kao LM 427 i<Mycobutin®>) je spiro-piperidilrifamicin izveden iz rifamicina-S. Mycobutin<®>je odobrila FDA kao oralnu formulaciju 1992. godine. Kapsule<Mycobutin®>(kapsule od 150 mg) su indikovane za prevenciju bolesti raširenog Mycobacterium avium kompleksa (MAC) kod pacijenata sa uznapredovalom HIV infekcijom. Poznato je da rifabutin ima nisku permeabilnost spoljašnje membrane protiv gram-negativnih patogena, čime je ćelijski unos istog u ESKAPE patogene koji ugrožavaju život ograničen. Tako, formulacije ili alternativni putevi primene rifabutina nisu u potpunosti istraženi, i ta je situacija dodatno otežana njegovom slabom rastvorljivošću.

U blisko povezanim molekulima rifamicina, kao što je rifampin (takođe poznat kao rifampicin), mikrobno ubijanje Micobacterium tuberculosis je povezano sa odnosom površine ispod krivulje koncentracija-vreme i MIC (AUC/MIC), dok je supresija rezistencije povezana sa odnosom vrhunca koncentracije slobodnog lijeka (Cmax) i MIC (Cmax/MIC), a ne sa trajanjem tokom kojeg je koncentracija rifampina bila iznad MIC. Štaviše, trajanje post-antibiotičkog efekta je takođe najbliže povezano sa Cmax/MIC odnosom (videti Gumbo, 2007., Concentrationdependent Mycobacterium tuberculosis killing and prevention of resistance by rifampin, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 51(11): 3781–3788).

Tako, da bi se postiglo ubijanje mikroba i sprečila pojava rezistencije u kliničkom okruženju, potrebne su visoke koncentracije leka u plazmi.

Kod zdravih odraslih dobrovoljaca nominalna terapeutska oralna doza od 300 mg rifabutina daje srednju Cmax od 0,375 mg/l koja se postiže približno 3 sata nakon oralne primene (monografija proizvoda rifabutina). PK rifabutina je linearna nakon jednokratne primene od 300, 450 i 600 mg PO kod zdravih volontera sa Cmax u opsegu od 0,4 do 0,7 mg/l (monografija proizvoda rifabutina). U studiji kod pacijenata zaraženih HIV-om koji su primali preporučenu dnevnu dozu rifabutina (300 mg/dan), koncentracije u plazmi u stabilnom stanju bile su Cmax 0,59 ± 0,33 mg/l, a AUC 8,6 ± 8,2 mg*h/l (Hafner, 1998., Tolerance and pharmacokinetic interactions of rifabutin and clarithromycin in human immunodeficiency virus-infected volunteers, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42(3): 631–639).

Pošto je rifabutin približno 90% vezan za proteine, koncentracije slobodnog leka nakon oralne primene su veoma niske. Kod zdravih odraslih volontera apsorbuje se najmanje 53% oralne doze, dok je apsolutna bioraspoloživost procenjena kod HIV pozitivnih pacijenata u studiji sa višestrukim dozama bila 20% 1. i 12% 28. dana. Niska sistemska izloženost (Cmax i AUC) rifabutinu nakon oralnog doziranja ograničava korisnost rifabutina za lečenje ozbiljnih infekcija kao što su one uzrokovane ESKAPE patogenom Acinetobacter baumannii (Acinetobacter calcoaceticus-baumannii kompleks). Štaviše, oralna primena rifabutina kod pacijenata sa takvim infekcijama verovatno će dovesti do brzog razvoja rezistencije. US 2019/269806 A1 otkriva postupak lečenjaAcinetobacter baumannii uzrokovane infekcije, koji sadrži primenu, intravenoznu ili putem inhalacije, sastava koja sadrži rifabutin.

Sažetak

Pronalazak obezbeđuje sisteme i postupke za povećanu kliničku efikasnost rifabutina protiv A. baumannii. Otkriće novog mehanizma delovanja od strane pronalazača rezultiralo je sposobnošću rifabutina da održi značajno delovanje protiv A. baumannii, istovremeno imajući samo minimalno delovanje protiv drugih gram-negativnih patogena. Pronalazak koristi prednost otkrića receptora ferik-koprogena (FhuE) koji je odgovoran za unos rifabutina, ali ne i blisko srodnog leka rifampina, u ćelije A. baumannii. U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje visok AUC i Cmax primenjenog rifabutina, što omogućuje povećanu kliničku efikasnost putem aktivacije FhuE receptora i, u isto vreme, smanjuje verovatnoću rezistencije – značajan problem u standardnim oralnim formulacijama rifabutina i srodnih lekova. Pronalazači su otkrili da se visoke izloženosti, i posebno Cmax, ne može postići trenutno dostupnim oralnim putem davanja, ali se mogu postići intravenoznom injekcijom ili postupcima poznatim u predmetnoj oblasti za modifikovano oralno oslobađanje ili inhalacijom ako su potrebni lokalno visoki Cmax i AUC.

Tečne formulacije rifabutina su obezbeđene za intravenoznu (IV) primenu, pri čemu su formulacije efikasne protiv Acinetobacter baumannii. Tečne formulacije rifabutina mogu da iskoriste siderofore koji moduliraju receptor ferikkoprogena (FhuE) u membranama bakterijskih ćelija za transport rifabutina kroz membrane bakterijskih ćelija. Ovo pruža neočekivanu kliničku prednost koja je ranije bila nepoznata za oralni rifabutin. Formulacije rifabutina koje su ovde otkrivene su korisne za lečenje bakterijskih infekcija gde je oralna primena antimikrobnog leka nepraktična ili nemoguća. Formulacije i postupci ovog predmetnog pronalaska pružaju medicinskoj zajednici nove tretmane za pacijente onesposobljene bakterijskim infekcijama opasnim po život.

Rifabutin koristi prisustvo siderofora koji moduliraju TonB-zavisne receptore siderofora u ćelijama bakterija. TonB-zavisni Sideroforni receptori mogu biti ferik-koprogen (FhuE) receptori. Poželjni siderofor je onaj koji modulira bakterijski TonB-zavisni receptor siderofora. Na primer, poželjni siderofor može biti bilo koji helator željeza koji posreduje u preuzimanju rifabutina od TonB-zavisnog receptora siderofora. Na primer, siderofor može biti apotransferin ili može biti transferin. Siderofor može nositi kompleks željeza. Siderofor koji nosi željezo može biti transferin.

Rifabutin može da koristi prisustvo siderofora za modulaciju TonB-zavisnog receptora siderofora Acinetobacter baumannii.

Kao što je navedeno, postupci pronalaska se zasnivaju na prepoznavanju da aktivacija FhuE receptora omogućava prodor rifabutina u A. baumannii i, pored toga, da se visok Cmax i AUC rifabutina mogu postići kod pacijenata za efikasno lečenje infekcija uzrokovanih ovim patogenom i za smanjenje verovatnoće razvoja rezistencije. Poželjna formulacija rifabutina sadrži rifabutin u prahu u vodi, rastvarač, i kiselinu za podsticanje rastvaranja rifabutina. Rastvarač može biti prisutan u koncentraciji od oko 25% do oko 75%, od oko 30% do oko 70%, od oko 35% do oko 65%, od oko 40% do oko 60%, od oko 45% do oko 55%, od oko 45% do oko 65%, od oko 50% do oko 65%, od oko 50% do oko 60%, od oko 50% do oko 55%, ili oko 50%. Poželjno, rastvarač i destilovana voda su u odnosu 1:1. Poželjni rastvarači uključuju polioksietilen sorbitan monooleat (Tween 80), sorbitan monooleat polioksietilen sorbitan monolaurat (Tween 20), polietilen glikol (PEG), propilen glikol, N-metil-2-pirolidon (NMP), glicerin, etanol, dimetilacetamid (DMA), dietilen glikol monoetil etar (Transcutol HP), ili dimetil izosorbid (DMI). U poželjnim otelotvorenjima, rastvarač je DMI. Rekonstituisani rastvor pronalaska poželjno sadrži oko 250 mg/ml (1:1 rastvarač/voda) ili oko 166,7 mg/m. (2:1 rastvarač/voda), međutim koncentracije rekonstituisanog rastvora mogu biti i do oko 300 mg/ml. U određenim otelotvorenjima, potreban je više razblažen rastvor i to se dobija dodavanjem više vode u rastvarač. Na primer, rifabutin sa odnosom rastvarač/voda 1:4 rezultiraće rastvorom od oko 50 mg/ml. Takve formulacije su korisne za lečenje različitih stanja koje uzrokuje

A. baumannii, kao što su, ali ne ograničavajući se na, bakterijemija, ventilatorom povezana bakterijska pneumonija (VABP), bolnička bakterijska pneumonija (HABP) i infekcije urinarnog trakta (UTI).

Prema predmetnom pronalasku, rifabutin ima snažno delovanje prema A. baumannii zbog eksploatacije ferik-koprogen (FhuE) receptora A. baumannii. Štaviše, pronalazak obezbeđuje postupke za određivanje podložnost izolata A. baumannii lečenju rifabutinom.

Prema pronalasku, otkrivene intravenozne formulacije postižu kritične Cmax i AUC vrednosti koje se ne mogu postići korišćenjem trenutno dostupnih oralnih formulacija. Ovo obezbeđuje neočekivanu kliničku prednost koja ranije nije bila dostupna za rifabutin. Intravenozna primena rifabutina obezbeđuje novo lečenje za pacijente sa bakterijskim infekcijama opasnim po život, kao što su one koje uzrokuje Acinetobacter baumannii.

Formulacije pronalaska uključuju kiselinu. Rastvor rastvarača može takođe uključivati kiselinu. Kiselina se može dodati u rastvor rastvarača da bi se formirao rastvarač za rekonstituciju. Kiselina može biti u koncentraciji dovoljnoj da uzrokuje rastvaranje rifabutina pri dodavanju rifabutina u rastvarač za rekonstituciju. Kiselina može biti u koncentraciji od oko 1,0% do oko 5,0%, od oko 1,1% do oko 4,9%, od oko 1,2% do oko 4,8%, od oko 1,3% do oko 4,7%, od oko 1,4% do oko 4,6%, od oko 1,5% do oko 4,5%, od oko 1,6% do oko 4,4%, od oko 1,7% do oko 4,3%, od oko 1,8% do oko 4,2%, od oko 1,9% do oko 4,1%, od oko 2,0% do oko 4,0%, od oko 2,1% do oko 3,9%, od oko 2,2% do oko 3,8%, od oko 2,3% do oko 3,7%, od oko 2,4% do oko 3,6%, od oko 2,5% do oko 3,5% , od oko 2,5% do oko 3,4%, od oko 2,5% do oko 3,3%, od oko 2,5% do oko 3,2%, od oko 2,5% do oko 3,1%, od oko 2,5% do oko 3,0%, od oko 2,5% do oko 2,9%, od oko 2,5% do oko 2,8%, od oko 2,5% do oko 2,7%, ili od oko 2,5% do oko 2,6%.

Kiselina može biti hlorovodonična, metansulfonska, fosforna, 1-vinska, dglukuronska, 1-jabučna, d-glukonska, l-mlečna, sirćetna ili l-asparaginska kiselina. Poželjno, kiselina je sirćetna kiselina.

Formulacija koja sadrži kiselinu ima pH od oko 3,0 do oko 10,0, od oko 3,0 do oko 9,0, od oko 3,0 do oko 8,0 od oko 3,0 do oko 7,0, od oko 3,0 do oko 6,0, od oko 4,0 do oko 10,0, od oko 4,0 do oko 9,0, od oko 4,0 do oko 8,0 od oko 4,0 do oko 7,0, od oko 4,0 do oko 6,0, od oko 5,0 do oko 6,0, od oko 5,1 do oko 5,9, od oko 5,2 do oko 5,8, od oko 5,3 do oko 5,7, od oko 5,4 do oko 5,6, od oko 5,5 do oko 5,6, od oko 5,5 do oko 5,7, od oko 5,5 do oko 5,8, od oko 5,5 do oko 5,9, ili pH ≥4,5. Poželjno, pH je od oko 5,0 do oko 6,0.

Intravenozna formulacija rifabutina može se proizvesti procesom koji sadrži pripremu rastvora koji sadrži rastvarač i destilovanu vodu u odnosu 1:1 u prisustvu kiseline pogodne da podstakne rastvaranje pomenutog rifabutina.

Rifabutin može biti prisutan u čvrstom obliku ili u obliku praha koji je rastvorljiv u tečnom medijumu. Rifabutin se može rastvoriti u rastvaraču. Rifabutin može biti rastvorljiv u vodenom rastvoru 50% rastvarača (tj.1: 1 rastvarač-destilovana voda) u prisustvu kiseline.

Kao takav, rifabutin se može rastvoriti u rastvoru za rekonstituciju koji sadrži kiselinu u vodenom rastvoru rastvarača u destilovanoj vodi. Rifabutin se može dodati u rastvarač za rekonstituciju u količini dovoljnoj da proizvede konačni rastvor sa rifabutinom u koncentraciji od oko 150 mg/ml do oko 350 mg/ml, od oko 160 mg/ml do oko 325 mg/ml, od oko 170 mg/ml do oko 300 mg/ml, od oko 180 mg/ml do oko 275 mg/ml, od oko 190 mg/ml do oko 265 mg/ml, od oko 200 mg/ml do oko 255 mg/ml, od oko 210 mg/ml do oko 250, mg/ml, od oko 225 mg/ml do oko 255 mg/ml, od oko 235 mg/ml do oko 255 mg/ml, od oko 245 mg/ml do oko 255, mg/ml, ili od oko 250 mg/ml do oko 255 mg/ml. Poželjno, rastvor rifabutina ili rastvor njegove soli sadrži oko 250 mg/ml rifabutina.

Dodavanjem rifabutina u rastvor za rekonstituciju formira se rekonstituisani rastvor rifabutina. Rekonstituisani rastvor rifabutina ili rastvor njegove soli može biti koncentrovani rastvor koji još nije spreman za parenteralnu primenu.

Koncentrovani rastvor može biti sterilan rastvor.

Rastvori rifabutina iz predmetnog pronalaska su u obliku formulacije za intravenoznu primenu. Rekonstituisani rastvori rifabutina se razblažuju sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem za intravenoznu primenu terapijski efektivne doze rifabutina. Na primer, rekonstituisani rastvor rifabutina se može dodati u farmaceutski prihvatljiv razblaživač da bi se pripremio za sterilizovanu injekciju subjekta. Razblaživač može biti rastvor natrijum hlorida.

Formulacije mogu uključivati rastvarač. U različitim otelotvorenjima, odnos w/v rifabutina prema rastvaraču može biti od oko 4:1 do oko 1:4, od oko 2:1 do oko 1:3, ili od oko 1:1 do oko 1:2. Odnos w/v rifabutina prema rastvaraču može biti oko 4:1, oko 3:1, oko 2:1, oko 1:1, oko 1:2, oko 1:3, ili oko 1:4.

U određenim otelotvorenjima, formulacija se može obezbediti za postizanje sistemskih koncentracija rifabutina od oko 2 mg/l do oko 50,0 mg/l.

Formulacije pronalaska su za intravenoznu primenu. Shodno tome, formulacije pronalaska mogu takođe uključivati farmaceutski prihvatljiv razblaživač. Farmaceutski prihvatljiv razblaživač može biti u koncentraciji dovoljnoj da pacijentu koji pati od infekcije da terapijski efektivnu količinu rifabutina u IV formulaciji. Farmaceutski prihvatljiv razblaživač može biti fiziološki rastvor. Poželjno, razblaživač je 0,9% fiziološki rastvor. Rastvor se može primeniti sa terapeutski efektivnom količinom rifabutina za lečenje pacijenta koji pati od infekcije.

U određenim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje postupak lečenja infekcije A. baumannii. Postupak uključuje primenu na pacijenta sastava koja sadrži rifabutin u dozi dovoljnoj za aktivaciju ferik-koprogen (FhuE) receptora ćelija A. baumannii, da bi se na taj način olakšao prodor navedenog rifabutina u navedene ćelije A. baumannii. Poželjno, sastav se primenjuje intravenozno. Doza može, na primer, da obezbedi AUC i Cmax povezane sa aktivacijom FhuE receptora, poželjno Cmax veći od oko 2 mg/l. Cmax može biti veći od oko 2 mg/l i manji od oko 50 mg/l. U nekim otelotvorenjima, Cmax >2mg/l ali <50 mg/l i AUC >10 mg*h/l i <300 mg*h/l. Može se primeniti rifabutin

Sastav uključuje rifabutin, vodu, rastvarač i kiselinu. Sastav se daje intravenozno u dozi rifabutina koja je najmanje oko 2 mg/kg q24h, 1 mg/kg q12h, ili 0,5 mg/kg q6h. Rastvarač može biti, na primer, polioksietilen sorbitan monooleat (Tween 80), sorbitan monooleat polioksietilen sorbitan monolaurat (Tween 20), polietilen glikol (PEG), propilen glikol, N-metil-2-pirolidon (NMP), glicerin, etanol, dimetilacetamid (DMA), dietilen glikol monoetil etar (Transcutol HP), ili dimetil izosorbid (DMI). Sastav može imati oko 2:1 V/tež. rastvarač:rifabutin. Postupak poželjno uključuje davanje formulacije pacijentu intravenskom injekcijom, na primer, u dozi koja rezultuje sa Cmax od najmanje oko 2 mg/l. Formulacija se može dati u dozi koja rezultira: 2 mg/l <Cmax <50 mg/l; i 10 mg*h/l <AUC <300 mg*h/l. Formulacija se daje u dozi koja je najmanje oko 2 mg/kg q24h, 1mg/kg q12h, ili 0,5 mg/kg q6h.

Aspekti obelodanjivanja obezbeđuju sastav za upotrebu u lečenju infekcije A. baumannii, pri čemu sastav sadrži rifabutin, vodu, rastvarač i kiselinu. Sastav je vodeni rastvor sa visokom koncentracijom rifabutina (npr.2:1 V/tež. rastvarač:rifabutin) koji aktivira ferik-koprogen (FhuE) receptor ćelija A. baumannii, da bi na taj način olakšao prodor navedenog rifabutina u navedene ćelije

A. baumannii. Rastvarač može biti, na primer, polioksietilen sorbitan monooleat (Tween 80), sorbitan monooleat polioksietilen sorbitan monolaurat (Tween 20), polietilen glikol (PEG), propilen glikol, N-metil-2-pirolidon (NMP), glicerin, etanol, dimetilacetamid (DMA), dietilen glikol monoetil etar (Transcutol HP), ili dimetil izosorbid (DMI). U poželjnom otelotvorenju, rastvarač je DMI ili Trascutol HP.

U određenim otelotvorenjima, odnos rastvarača i vode V/V je 1:1 ili 1:2. Kiselina može biti hlorovodonična, metansulfonska, fosforna, L-vinska, D-glukuronska, L-jabučna, D-glukonska, L-mlečna, sirćetna ili L-asparaginska kiselina. U poželjnim otelotvorenjima, kiselina je sirćetna kiselina ili D-glukuronska kiselina. U određenim otelotvorenjima, molarni odnos rifabutina prema kiselini je 1:1.

Poželjno, sastav je obezbeđen kao vodeni rastvor za intravenozno davanje. Sastav je obezbeđen za pacijenta identifikovanog kao inficiranog sa A. baumannii, i sastav uključuje rifabutin za IV davanje u dozi koja je najmanje oko 2 mg/kg q24h, 1 mg/kg q12h, ili 0,5 mg/kg q6h.

U srodnim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje upotrebu rifabutina za proizvodnju leka za lečenje infekcije A. baumannii kod pacijenata. Lek može da obezbedi dozu koja rezultira AUC i Cmax povezanim sa aktivacijom FhuE receptora. Poželjno je da je lek pripremljen za primenu u režimu doziranja koji rezultuje sa Cmax kod pacijenta koja je najmanje oko 2 mg/l. Lek može da sadrži rifabutin, vodu, rastvarač i kiselinu. Rastvarač može biti, na primer, polioksietilen sorbitan monooleat (Tween 80), sorbitan monooleat polioksietilen sorbitan monolaurat (Tween 20), polietilen glikol (PEG), propilen glikol, N-metil-2-pirolidon (NMP), glicerin, etanol, dimetilacetamid (DMA), dietilen glikol monoetil etar (Transcutol HP), ili dimetil izosorbid (DMI). Lek se može obezbediti unutar IV vrećice. Poželjno, lek obezbeđuje dozu koja rezultira sa: 2 mg/l <Cmax <50 mg/l; i 10 mg*h/l <AUC <300 mg*h/l. U određenim otelotvorenjima, lek obezbeđuje dozu rifabutina koja je najmanje oko 2 mg/kg q24h, 1 mg/kg q12h, ili 0,5 mg/kg q6h.

U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupke za pripremu intravenozne formulacije rifabutina. Postupak može uključivati pripremu rastvora koji sadrži rastvarač i destilovanu vodu. Poželjno, rastvor je u odnosu 1:1.

Rastvarač može biti bilo koji rastvarač, ali je poželjno DMI. U rastvor se može dodati kiselina. Kiselina može biti pogodna za podsticanje rastvaranja rifabutina. Kiselina može biti bilo koja kiselina, ali je poželjno sirćetna kiselina. Rifabutin se može uvesti u rastvor koji sadrži kiselinu. Tako kiselina uzrokuje da se rifabutin rastvori u rastvoru.

Rastvor rifabutina se može dodati u farmaceutski prihvatljiv razblaživač. Razblaživač može biti 0,9% fiziološki rastvor. Intravenozna formulacija rifabutina može da sadrži rifabutin, DMI i fiziološki rastvor. Odnos w/v rifabutina prema rastvaraču može biti od oko 4:1 do oko 1:4, od oko 2:1 do oko 1:3, ili od oko 1:1 do oko 1:2. Odnos w/v rifabutina prema rastvaraču može biti oko 4:1, oko 3:1, oko 2:1, oko 1:1, oko 1:2, oko 1:3, ili oko 1:4. Količina i koncentracija rifabutina, DMI i fiziološkog rastvora zavisiće od veličine IV vrećice (u intravenoznim otelotvorenjima) i takve varijacije će biti očigledne osobama sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti da bi postigli željene doze u rasponu od 6–9 mg/kg sa količinom DMI utvrđenom na osnovu gorenavedenih odnosa. Intravenozna formulacija rifabutina može se primenjivati na subjektu kome je potrebno lečenje.

U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupke za povećanje efikasnosti antibiotika. Postupci uključuju modulaciju TonB-zavisnih receptora siderofora u bakterijskoj ćeliji da bi se povećao unos antibiotika. Modulacija receptora siderofora zavisnog od TonB može uključivati primenu IV formulacije antibiotika koja posreduje u transportu antibiotika kroz ćelijsku membranu bakterijske ćelije. TonB-zavisan receptor siderofora može biti FhuE receptor. Primena IV formulacije antibiotika povećava bioraspoloživost antibiotika, čime se povećava unos antibiotika kroz membranu bakterijske ćelije. Antibiotik može biti bilo koji oblik rifabutina koji se može primeniti IV putem. Siderofor može biti vezan za kompleks željeza. Rifabutin se može vezati za siderofor koji nosi željezo ili može da koristi posredovanje TonB-zavisnog receptora siderofora koji nosi željezo da prođe kroz ćelijsku membranu. IV formulacija može biti formulacija bilo koje IV formulacije rifabutina koja je ovde opisana ili doza iste.

U drugom aspektu, pronalazak je tečna formulacija za upotrebu prema patentnim zahtevima. Rifabutin tada može da putuje preko spoljne membrane bakterijske ćelije koja izaziva infekciju i da uništi bakterijsku ćeliju. Bakterijska infekcija može biti bilo koja infekcija koju uzrokuje A. baumannii, kao što je, ali ne ograničavajući se na, bakterijemija, ventilatorom povezana bakterijska pneumonija (VABP), bolnička bakterijska pneumonija (HABP) i infekcije urinarnog trakta (UTI). Formulacija za IV primenu može uključivati farmaceutski prihvatljiv rastvarač. Postupak može uključiti primenu IV formulacije bilo koje formulacije rifabutina koja je ovde opisana na subjektu koji pati od bakterijske infekcije.

Bez vezivanja za teoriju, bilo koja formulacija pronalaska se može koristiti u bilo kojem od postupaka pronalaska.

Otkriveni su postupci za identifikaciju jedinjenja koja imaju antibakterijsko delovanje na Acinetobacter baumannii. Postupci mogu uključiti obezbeđivanje medijuma koji sadrži najmanje kompleks željeza i helator željeza, uvođenje većeg broja ćelija bakterije A. baumannii u medijum i izlaganje medijuma koji sadrži veći broj bakterijskih ćelija jedinjenju. Postupak takođe može uključivati kvantifikaciju mnoštva bakterijskih ćelija korišćenjem bilo kojeg prihvatljivog postupka kvantifikacije bakterija. Identifikovanje smanjenja broja mnoštva bakterijskih ćelija ukazuje na antibakterijsko delovanje jedinjenja.

Do smanjenja broja mnoštva bakterijskih ćelija može doći kada jedinjenje pređe spoljašnju membranu bakterijskih ćelija, čime se uništavaju bakterijske ćelije. Jedinjenje može da prođe spoljašnju membranu u prisustvu kompleksa željeza ili helatora željeza, čime se omogućava unos jedinjenja posredovan Ton-B receptorom siderofora. Receptor može biti FhuE receptor.

Medijum može biti medijum Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 10% fetalni teleći serum ili kombinacija istih. Medijum može biti bilo koji medijum ili može biti bilo koji mediji koji ili sadrže željezo i helator željeza ili omogućavaju dodavanje željeza i helatora željeza medijumu. Kompleks željeza može biti bilo koji kompleks željeza sposoban da se veže za siderofor. Helator željeza može biti bilo koji helator željeza sposoban da pređe membranu bakterijske ćelije. Poželjno, helator željeza je piridoksal izonikotinoil hidrazon (PIH). Helator može biti prisutan u koncentracijama od oko 0,05 mM do 0,25 mM, od oko 0,075 mM do 0,225 mM, od oko 0,1 mM do 0,2 mM od oko 0,125 mM do 0,15 mM. Poželjno, helator željeza je prisutan u količini od oko 0,1 mM.

U drugom aspektu pronalaska, postupci uključuju lečenje bakterijske infekcije kod subjekta. Postupak može uključiti davanje terapijski efektivne količine intravenozne formulacije rifabutina ili njegove soli. Formulacija ima farmaceutski prihvatljiv rastvarač prisutan u odnosu od 4:1 do oko 1:4, od oko 2:1 do oko 1:3, ili od oko 1:1 do oko 1:2 w/v rifabutina prema rastvaraču.

Bakterijska infekcija može biti bilo koja infekcija koju uzrokuje A. baumannii, kao što je, ali ne ograničavajući se na, bakterijemija, ventilatorom povezana bakterijska pneumonija (VABP), bolnička bakterijska pneumonija (HABP) i infekcije urinarnog trakta (UTI). Poželjno, vrsta bakterije je A. baumannii.

Dalje je otkriven in vitro postupak za određivanje podložnosti bakterijske vrste rifabutinu. Postupak može uključivati izlaganje mnoštva bakterijskih ćelija kompleksu željeza, helatoru željeza i rifabutinu. Postupak takođe može uključiti kvantifikaciju većeg broja bakterijskih ćelija i/ili identifikaciju smanjenja broja bakterijskih ćelija. Smanjenje broja bakterijskih ćelija ukazuje na podložnost neke vrste bakterija rifabutinu. Postupak takođe može uključiti primenu rifabutina na subjektu koji pati od bakterijske infekcije te bakterijske vrste.

Drugi aspekti i prednosti pronalaska su očigledni nakon razmatranja sledećeg detaljnog opisa istog.

Kratak opis crteža

SL. 1 je grafikon koji ilustruje kvantifikaciju nivoa ekspresije fhuE u A. baumannii HUMC1 u različitim medijima.

SL. 2 je grafikon delovanja IV primene rifabutina u modelu mišje neutropenične sepse.

SL. 3 prikazuje efekte rifabutina na modelima miša sa neutropenijskom infekcijom pluća sa CD-1 miševima inficiranim sa A. baumannii UNT091.

SL. 4 prikazuje efekte rifabutina na modelima miša sa neutropenijskom infekcijom pluća sa CD-1 miševima inficiranim sa A. baumannii UNT093.

SL.5 obezbeđuje rezultate eksperimenata frakcionisanja doze koji ukazuju na jasnu povezanost reakcije i doze u kojoj su Cmax i AUC kritični za delovanje.

SL. 6 je grafikon koji prikazuje CFU po paru pluća kod miševa inokulisanih sa A. baumannii.

SL. 7 prikazuje shematski prikaz TonB-zavisnog transporta.

SL. 8 prikazuje delovanje antibiotika rifabutina i rifampicina na plazmidom posredovanu ekspresiju FhuE-varijanti u CA-MHB.

Detaljni opis

Otelotvorenja obelodanjivanja obezbeđuju postupke, upotrebe, i sastave za lečenje ili pravljenje leka za lečenje infekcije A. baumannii. Za pozadinu, pogledajte Howard, 2012., Acinetobacter baumannii: An emerging opportunistic pathogen, Virulence 3(3): 243–250 i Peleg, 2008., Acinetobacter baumannii: Emergence of a successful pathogen, Clin Microbiol Rev 21(3): 538– 582. Postupci i sastavi obelodanjivanja deluju kroz aktivaciju receptora ferikkoprogena (FhuE) da bi se olakšao prodor pomenutog rifabutina u navedene ćelije A. baumannii. FhuE receptor se razmatra u Sauer, 1987., Ferric-coprogen receptor FhuE of Escherichia coli: Processing and sequence common to all TonB-dependent outer membrane receptor proteins, J Bact 169(5): 2044–2049.

Postupci poželjno uključuju pribavljanje uzorka od pacijenta za koga se sumnja da ima infekciju; izvođenje testa na uzorku za identifikaciju infekcije A. baumannii kod pacijenta; i obezbeđivanje formulacije rifabutina za lečenje pacijenta koja, kada se primenjuje na pacijenta, maksimizira rezultujuću AUC i Cmax. Postupak može uključivati primenu formulacije rifabutina na pacijenta.

Poželjno, formulacija uključuje rifabutin, vodu, rastvarač i kiselinu. Poželjni rastvarači uključuju polioksietilen sorbitan monooleat (Tween 80), sorbitan monooleat polioksietilen sorbitan monolaurat (Tween 20), polietilen glikol (PEG), propilen glikol, N-metil-2-pirolidon (NMP), glicerin, etanol, dimetilacetamid (DMA), dietilen glikol monoetil etar (Transcutol HP), ili dimetil izosorbid (DMI), ili drugi polarni rastvarač. Formulacija može biti oko 250 mg/ml (1:1 V/V rastvarač/voda) ili oko 166,7 mg/ml (2:1 rastvarač/voda), međutim koncentracije rekonstituisanog rastvora mogu biti i do oko 300 mg/ml. U određenim otelotvorenjima, formulacija se daje pacijentu, na primer, intravenskom injekcijom. Poželjno, IV injekcija rezultira sa Cmax većom od oko 2 mg/l i opciono manjom od oko 50 mg/l. U nekim otelotvorenjima, formulacija sadrži dozu rifabutina sa Cmax >2mg/l ali <50 mg/l i AUC >10 mg*h/l i <300 mg*h/l. Formulacija se može davati u dozi koja je najmanje oko 2 mg/kg q24h, 1 mg/kg q12h, ili 0,5 mg/kg q6h. Referišući se na SL.5, formulacija se poželjno daje putem IV u dozi koja je najmanje oko 2 mg/kg q24h, 1 mg/kg q12h, ili 0,5 mg/kg q6h.

Postupci i sastavi ovog obelodanjivanja iskorištavaju uvid da FhuE receptor siderofora A. baumannii igra važnu ulogu u unosu rifabutina.

SL. 1 pokazuje da je FhuE najmanje 10 puta prekomerno eksprimiran kada se A. baumannii uzgaja u medijumu osiromašenom hranljivim materijama (medij Roswell Park Memorial Institute (RPMI) plus 10% fetalnog telećeg seruma (FCS)) u poređenju sa standardnim uslovima testiranja (kationski podešen Mueller Hinton agar; CA-MHB). Kao što je prikazano u Primerima, delecija FhuE je dovelo do povećanja MIC-a prema rifabutinu u RPMI 10% FCS, međutim, iznenađujuće nije imalo efekta na blisko srodno jedinjenje rifampicin. Ovi rezultati su potvrdili da je FhuE neophodan za moćno delovanje rifabutina u RPMI 10% FCS i ukazali na to da je delovanje rifabutina u ovom medijumu verovatno posledica aktivnog unosa jedinjenja posredovanog FhuE receptorom siderofora A. baumannii.

SL. 2 je grafikon koji ilustruje rezultate efekta rifabutina i rifampina u modelu miša sa neutropeničnom sepsom. Rezultati pokazuju da IV primena rifabutina štiti od sepse sa reakcijom zavisnom od doze pri dozi od 1 mg/kg, dok rifampin pri 10 mg/kg ne podržava moćno delovanje rifabutina uočeno in vitro.

SL. 3 prikazuje efekte rifabutina na modelima miša sa neutropenijskom infekcijom pluća sa CD-1 miševima inficiranim sa A. baumannii UNT091.

SL. 4 prikazuje efekte rifabutina na modelima miša sa neutropenijskom infekcijom pluća sa CD-1 miševima inficiranim sa A. baumannii UNT093.

SL.5 obezbeđuje rezultate eksperimenata frakcionisanja doze koji ukazuju na jasnu povezanost reakcije i doze u kojoj su Cmax i AUC kritični za delovanje.

U poželjnim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje postupke lečenja infekcije A. baumannii primenom rifabutina u količini koja maksimizira AUC i Cmax. Primena se može postići intravenoznom injekcijom ili postupcima poznatim u predmetnoj oblasti za modifikovano oralno oslobađanje ili inhalacijom ako su potrebni lokalno visoki Cmax i AUC.

U određenim otelotvorenjima, rifabutin se primenjuje kao intravenozna formulacija u količini koja maksimizira AUC i Cmax. Ovakvim postupcima, rifabutin će dostići terapeutske koncentracije i smanjiti učestalost razvoja rezistencije. Na primer, u poželjnim otelotvorenjima, Cmax je veći od oko 2 mg/l i manji od oko 50 mg/l.

Obelodanjivanje obezbeđuje sastav za upotrebu u lečenju infekcije A. baumannii, pri čemu sastav sadrži rifabutin, vodu, rastvarač i kiselinu.

Rastvarač može biti polioksietilen sorbitan monooleat (Tween 80), sorbitan monooleat polioksietilen sorbitan monolaurat (Tween 20), polietilen glikol (PEG), propilen glikol, N-metil-2-pirolidon (NMP), glicerin, etanol, dimetilacetamid (DMA), dietilen glikol monoetil etar (Transcutol HP), ili dimetil izosorbid (DMI). Sastav može uključivati između oko 1:1 i 2:1 V/V rastvarača/vode. Najpoželjnije, sastav je obezbeđen unutar IV vrećice. Sastav je obezbeđen za pacijenta identifikovanog kao inficiranog sa A. baumannii i sastav uključuje rifabutin za IV davanje u dozi koja je najmanje oko 2 mg/kg q24h, 1 mg/kg q12h, ili 0,5 mg/kg q6h. Sastav može imati formulaciju koja obezbeđuje dozu rifabutina sa Cmax >2 mg/l ali <50 mg/l i AUC >10 mg*h/l i <300 mg*h/l.

Formulacija je namenjena za intravenoznu primenu.

Dalje je otkrivena upotreba rifabutina za proizvodnju leka za lečenje infekcije A. baumannii kod pacijenta, u kojoj je lek pripremljen za primenu u režimu doziranja koji rezultuje u Cmax kod pacijenta od najmanje oko 2 mg/l. Poželjno, lek sadrži rifabutin, vodu, kiselinu i rastvarač (npr. polioksietilen sorbitan monooleat (Tween 80), sorbitan monooleat polioksietilen sorbitan monolaurat (Tween 20), polietilen glikol (PEG), propilen glikol, N-metil-2-pirolidon (NMP), glicerin, etanol, dimetilacetamid (DMA), dietilen glikol monoetil etar (Transcutol HP), ili dimetil izosorbid). U poželjnom otelotvorenju, rastvarač je DMI ili Trascutol HP. U određenim otelotvorenjima, odnos rastvarača i vode V/V je 1:1 ili 1:2. Kiselina može biti hlorovodonična, metansulfonska, fosforna, L-vinska, D-glukuronska, L-jabučna, D-glukonska, L-mlečna, sirćetna ili L-asparaginska kiselina. U poželjnom otelotvorenju, kiselina je sirćetna kiselina ili D-glukuronska kiselina. U određenim otelotvorenjima, molarni odnos rifabutina prema kiselini je 1: 1.

Najpoželjnije, lek je obezbeđen unutar IV vrećice. U poželjnim otelotvorenjima upotrebe, režim doziranja rezultira u: 2 mg/l <Cmax <50 mg/l; i 10 mg*h/l <AUC <300 mg*h/l. Režim doziranja može poželjno rezultirati dozom koja je najmanje oko 2 mg/kg q24h, 1 mg/kg q12h, ili 0,5 mg/kg q6h.

Primeri

Primer 1

Određeni broj odobrenih lekova je testiran protiv A. baumannii pod standardnim uslovima testiranja (katjonski prilagođen Mueller Hinton agar; CA-MHB) kao i medijumu osiromašenom hranljivim materijama (medij Roswell Park Memorial Institute (RPMI) plus 10% fetalnog telećeg seruma (FCS)).

Antibakterijsko delovanje rifabutina protiv A. baumannii bilo je u velikoj meri pojačano pod nestandardnim uslovima testiranja. Tabela 1 sažima rezultate antimikrobne podložnosti sojeva A. baumannii HUMC1 i UNT091 rezistentnih na karbapenem u standardnim (CA-MHB, Mueller Hinton agar 2) i nestandardnim uslovima ispitivanja. Rezultati pokazuju da su dva soja A. baumannii rezistentna na karbapenem, HUMC1 i UNT091, bila veoma podložna rifabutinu (MIC = 0,002 mg/l) prilikom testiranja u RPMI sa dodatkom 10% FCS, ali su pokazali nisku podložnost rifampinu, meropenemu, cefotaksimenemu, gentamicinu i ciprofloksacinu. Zapanjujući kontrast je to, što su oba soja imala nisku podložnost prema svim testiranim antibioticima (uključujući rifabutin), kada su testirani u standardnim uslovima testiranja (CA-MHB agar).

Postupci ispitivanja u primeru 1, tabela 1.

In vitro delovanje rifabutina, rifampina, meropenema, cefotaksima, gentamicina i ciprofloksacina protiv dva klinička izolata A. baumannii rezistentna na karbapenem u medijumu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sa dodatkom 10% (V/V) fetalnog telećeg seruma (FCS) i analiziran je pod standardnim uslovima ispitivanja minimalne inhibitorne koncentracije (MIC).

Osnovni rastvori rifabutina su pripremljeni na 2 mg/ml u DMSO i čuvani na -20 °C.

U ovom primeru su korišćena dva izolata A. baumannii: HUMC1 (BV374) (Spellberg/Luna Laboratory, Univerzitet Južne Kalifornije, Los Anđeles, Kalifornija) i UNT091-1 (BV378) (UNT Health Science Center, Fort Vort, Teksas). Izolat HUMC1 je hipervirulentni klinički soj rezistentan na lekove izolovan iz infekcije krvotoka. Oba soja su rezistentna na karbapenem i osetljiva na kolistin. Izolati su čuvani na -80 °C kao 20% (V/V) glicerol kulture.

MIC su određivane postupkom mikrodilucije agara u skladu sa smernicama Instituta za kliničke laboratorijske standarde (CLSI) koristeći RPMI sa dodatkom 10% (V/V) ili katjonski prilagođenog Muller Hinton agara (CA-MHB) kao medijuma za ispitivanje. Za pripremu bakterijske inokulanata, 3–5 kolonija bakterijskih sojeva iz prekonoćnog uzgoja na CHROMAgar™ Orientation pločama (CHROMagar™ kat. br. RT412) je suspendovano u 5 ml fiziološkog rastvora. Zamućenost bakterijske suspenzije je podešena na 0,5 McFarland jedinica (jednako optičkoj gustini na 610 nm (OD610) do 0,08–0,1). Ova suspenzija je razblažena 200 puta u RPMI sa dodatkom 10% (V/V) FCS da bi se postigla konačna koncentracija od približno 106 jedinica koje formiraju kolonije (CFU)/ml i korišćena je za inokulaciju mikrotitarskih ploča.

Serijska 2-struka razblaženja antibiotika pripremljena su u posebnoj ploči sa 96 bunarića od polipropilena sa dnom u obliku U (Ratiolab kat. br.

6018111) u RPMI sa dodatkom 10% (V/V) FCS pri 10-strukim konačnim testnim koncentracijama i po 10 µl razblaženja prebačeno je na nove polistirenske mikrotitarske ploče sa dnom u obliku U sa 96 bunarića sa parafilmskim poklopcem ploče.

Ploče su zatim inokulisane sa 90 µl po bunariću pripremljenim bakterijskim suspenzijama korišćenjem višekanalne pipete (Eppendorf), pri čemu je prva kolona sadržavala po 4 otvora za kontrolu rasta (bez antibiotika). Ploče su prekrivene parafilmom i inkubirane na 35 °C tokom 20–24 h, nakon čega je vizuelnom inspekcijom određen MIC i skenirane ploče da bi se zabeležili podaci. MIC je zabeležen kao najniža koncentracija jedinjenja koja je inhibirala rast bakterija vizuelnom inspekcijom. MIC su određivani najmanje u parovima, a u slučaju varijacija, date su veće vrednosti.

Primer 2. FhuE prekomerna ekspresija: Nivo ekspresije FhuE je u različitim medijima procenjen pomoću qRT-PCR na A. baumannii HUMC1 soju.

SL. 1 prikazuje grafikon koji ilustruje kvantifikaciju nivoa ekspresije FhuE u različitim medijima. Kao što je prikazano, FhuE je približno 10 puta prekomerno izražen kada se A. baumannii uzgaja u RPMI 10% FCS ili CA-MHB sa dodatkom 0,1 mM piridoksal izonikotinoil hidrazona (PIH) u poređenju sa CA-MHB. Ovi rezultati ukazuju da je povećano delovanje rifabutina posledica povećane ekspresije FhuE u ovim medijima.

Postupci za merenje nivoa ekspresije FhuE, SL.1.

Ekspresija FhuE je procenjena PCR-om kvantitativne reverzne transkripcije (qRT-PCR). Izolati su uzgajani u određenom agaru na 37 °C do sredine logaritamske faze (optička gustina na 600 nm [OD600] od 0,5), i ukupna RNK je ekstrahovana korišćenjem PureLink RNK mini seta (Ambion) prema preporukama proizvođača. Preostale kontaminacije DNK su uklonjene korišćenjem Turbo DNK-free seta (Ambion). qRT-PCR je izveden korišćenjem GoTaqV 1-Step RT-qPCR System seta (Promega) na CFX96 Touch<™>sistemu za detekciju PCR u realnom vremenu (BioRad). Kao opšteprisutni gen, RNK polimeraza sigma faktor D (rpoD) je kvantifikovan i ekspresija FhuE je normalizovana na onu rpoD-a korišćenjem komparativnog postupka ΔΔCT (gde je CT prag ciklusa).

Primer 3. Delecija FhuE

Da bi se potvrdila uloga aktivacije FhuE u delovanju rifabutina, FhuE je deletovan u sojevima A. baumannii HUMC1 i UNT091.

Tabela 2 sažima MIC rifabutina u RPMI medijumu sa dodatkom 10% (V/V) FCS za FhuE deletovane mutante i njihove roditeljske sojeve. Delecija FhuE je dovela do povećanja MIC prema rifabutinu u RPMI 10% FCS, međutim, iznenađujuće nije imala efekta na blisko srodno jedinjenje rifampicin. Ovi rezultati su potvrdili da je FhuE neophodan za moćno delovanje rifabutina u RPMI 10% FCS i ukazali na to da je delovanje rifabutina u ovom medijumu verovatno posledica aktivnog unosa jedinjenja posredovanog FhuE receptorom siderofora A. baumannii. Podaci iz ovog eksperimenta pokazuju da je rifabutin veoma aktivan protiv A. baumannii zbog novog mehanizma prodiranja u A. baumannii.

Postupci za konstruisanje FhuE delecionog mutanta, tabela 2.

Gen AWC45_RS10145 (HUMC1 genom) koji kodira za FhuE protein je deletovan u A. baumannii sojevima HUMC1 i UNT091 korišćenjem postupka rekombinacije u dva koraka. Fragmenti DNK koji odgovaraju 700-bp uzvodnim i nizvodnim genomskim regionima FhuE amplifikovani su PCR-om i uvedeni u nokaut plazmid pVT77 korišćenjem Gibsonovog sklopa. Dobijeni FhuE nokaut plazmid je prenet u izolate A. baumannii konjugacijom i transkonjuganti su odabrani na LB agar pločama koje sadrže natrijum telurit. Posle prekonoćne selekcije na 37 °C, klonovi su pregledani na integraciju genomskog plazmida pomoću PCR-a, i klonovi koji su sadržavali uzvodni i nizvodni plazmid integracije su korišćeni za kontra-selekciju na LB agar pločama koje sadrže AZT za uklanjanje plazmida iz genoma. Klonovi su pregledani na FhuE deleciju i uklanjanje plazmida pomoću PCR-a, a genomske delecije gena su potvrđene sekvenciranjem DNK (Microsynth AG, Balgach, Švajcarska).

Primer 4. Ekspresija FhuE zasnovana na plazmidu:

Prekomerna ekspresija FhuE je procenjena da bi se utvrdilo da li izaziva unos rifabutina.

Tabela 3 sažima MIC rifabutina u sojevima A. baumannii koji eksprimiraju FhuE u CA-MHB /- 1 mM IPTG. U prisustvu IPTG, MIC rifabutina je bila 1000 puta niža u soju koji nosi plazmid koji eksprimira FhuE u poređenju sa sojem koji je nosio prazan plazmid kao kontrolom. Ovi podaci pokazuju da aktivacija FhuE u A. baumannii dovodi do snažnog delovanja rifabutina prema ovom organizmu.

Postupci za prekomernu ekspresiju FhuE kod A. baumannii, Tabela 3.

FhuE gen (AWC45_RS10145) iz soja A. baumannii HUMC1 kloniran je u prenosilački plazmid E. coli / A. baumannii pVT111 pod kontrolom izopropil-beta-D-1-tiogalaktopiranozidom (IPTG) inducibilnog promotera Ptrc-lacO. Rezultujući plazmid i originalni plazmid pVT111 (kontrola) su prebačeni u soj A. baumannii ATCC-17978 konjugacijom i transkonjuganti su odabrani na LB agar pločama koje sadrže kanamicin. Prisustvo plazmida u prijemnim sojevima A. baumannii je zatim potvrđeno PCR-om.

Primer 5: Učestalost mutacijske rezistencije (FoR) prema rifabutinu

U tabeli 4 su prikazani rezultati FoR za učestalost spontane rezistencije A. baumannii na rifabutin na RPMI 10% FCS agar medijumu. Za soj HUMC1 uočen je FoR zavisan od doze u rasponu od 10<-5>do 10<-9>. Visoke FoR od oko 10<-5>su primećene pri koncentracijama rifabutina od 0,02 i 0,2 mg/l, nakon čega je usledilo postepeno smanjenje na 10<-7>pri 1 mg/l i 10<-9>pri 2 mg/l i 20 mg/l rifabutina. Slični rezultati su dobijeni za sojeve UNT091-1, ACC00445, LAC-4 i UNT238-1.

Pet kliničkih sojeva A. baumannii otkrivaju učestalost mutacione rezistencije zavisnu od doze koja dostiže 10-9 pri koncentracijama rifabutina od ≥2 mg/l. Slične in vitro FoR (10-9) su demonstrirane za druge antibiotike koji se koriste kao standard nege za lečenje infekcija A. baumannii. Rezultati pokazuju da se rifabutin može koristiti za efikasno lečenje infekcija A. baumannii. Važno je da je identifikovano da način primene mora da postigne sistemske koncentracije leka ≥2 mg/l da bi se sprečio brz razvoj rezistencije, dakle koncentracija koja se ne može postići sa trenutno dostupnim oralnim formulacijama.

Postupci za određivanje učestalosti mutacijske rezistencije prema rifabutinu, tabela 4.

Ispitivana je učestalost mutacijske rezistencije A. baumannii (FoR) na rifabutin u medijumu RPMI sa dodatkom 10% (V/V) fetalnog telećeg seruma (FCS).

Osnovni rastvori rifabutina su pripremljeni pri 10 mg/ml u DMSO i čuvani na -20 °C. Klinički izolati A. baumannii su čuvani na -80 °C kao 20% (V/V) u osnovnim glicerol kulturama.

Selekcijske agar ploče su pripremljene korišćenjem RPMI praha (Sigma R7755) rastvorenog pri 10,3 g/l sa agarom pri 15 g/l i kuvane do potpunog topljenja agara. Posle hlađenja medijuma na 45 °C, dodato je 0,3 g/l L-glutamina (Sigma G7513), 25 mM HEPES (Gibco 15630-056) i 10% (V/V) FCS (Gibco 10500-064). Dopunjene su koncentracije od 0,02, 0,1, 1,0, 2,0 i 20,0 mg/l rifabutina i 25 ml medijuma je sipano direktno u petrijeve posude od 9 cm.

Inokulanti kulture su pripremljeni od bakterijske suspenzije NaCl pri 0,5 McFarlanda, razblažene 200 puta u 100 ml RPMI (Sigma R8758) 10% FCS u bocama od 500 ml da bi se dostiglo ~5 × 105 CFU/ml. Bočice su inkubirane 24 h na 37 °C uz mućkanje pri 220 o/min. Posle inkubacije, ćelije su peletirane centrifugiranjem (10 min, 7000 o/min na ST) i ponovo suspendovane u 1 ml PBS. Desetostruko razblažene serije ćelijskih suspenzija su pripremljene u PBS i 100 µl rezultujuće ćelijske suspenzije je inokulisano na gore opisane selekcijske ploče koje sadrže rifabutin, kao i na neselekcijske ploče da bi se odredila ćelijska gustina inokuluma. Posle inkubacije na 35 °C tokom 24 h kolonije su prebrojane, i učestalost rezistencije izračunata je kao odnos između broja kolonija koje rastu na pločama sa antibiotikom i ukupnog broja kolonija inokulanta.

Primer 6: In vivo studije

SL. 2 je grafikon koji ilustruje rezultate efekta rifabutina i rifampina u modelu miša sa neutropeničnom sepsom (n=7). CD-1 miševi su IP inficirani sojem A. baumannii ACC00445 u prisustvu 5% mucina. Miševi su tretirani rifabutinom i rifampinom putem IV primene 1 h i 5 h nakon infekcije. Rezultati pokazuju da IV primena rifabutina štiti od sepse sa reakcijom zavisnom od doze pri dozi od 1 mg/kg, dok rifampin pri 10 mg/kg ne podržava moćno delovanje rifabutina uočeno in vitro.

SL. 3 je grafikon koji ilustruje rezultate efekta rifabutina na modelima miša sa neutropenijskom infekcijom pluća (n=5/dozirana grupa) u kojima su CD-1 miševi intranazalno inficirani sa A. baumannii UNT091. Miševi su tretirani rifabutinom putem IV primene 2 h nakon infekcije.

SL. 4 je grafikon koji ilustruje rezultate efekta rifabutina na modelima miša sa neutropenijskom infekcijom pluća (n=5/dozirana grupa) u kojima su CD-1 miševi intranazalno inficirani sa A. baumannii UNT093. Miševi su tretirani rifabutinom putem IV primene 2 h nakon infekcije.

Posle 24 sata tretmana, miševi su eutanizirani i izmerene su jedinice koje formiraju kolonije u plućima. Rezultati pokazuju da IV primena rifabutina dovodi do snažnog efekta pri dozama <0,5 mg/kg podržavajući moćno delovanje rifabutina uočenu in vitro.

SL. 5 sažima rezultate eksperimenata frakcionisanja doze u mišjem modelu neutropenične infekcije. Rifabutin je primenjivan IV jednom dnevno (q24h), dva puta dnevno (q12h) ili četiri puta u roku od 24 sata (q6h). Rezultati ukazuju na jasnu povezanost reakcije zavisne od doze u kojoj su i Cmax i AUC kritični za delovanje.

Tabela 5 je ciljna izloženost potrebna za lečenje infekcija A. baumannii na osnovu MIC. Procene su zasnovane na modelima efikasnosti i korišćenju sigmoidnog Emax modela sa promenljivim nagibom kako bi se uklopili reakcije na dozu i PK/PD indeks (PDI) da bi se odredile PDI vrednosti rifabutina koje rezultuju 1-log smanjenjem CFU u plućima koristeći verziju GraphPad Prism 5.03 (GraphPad, Inc., San Dijego, Kalifornija). Iz ovih podataka je očigledno da oralna primena rifabutina neće postići izloženosti potrebne za lečenje >90% izolata A. baumannii (MIC ≤1 mg/l).

In vivo studije pokazuju da je IV primena rifabutina podjednako moćna i efektivna in vivo kao in vitro. Dakle, neočekivani nalaz da rifabutin pokazuje snažno delovanje prema A. baumannii u uslovima ograničavanja hranljivih materija (posebno u uslovima ograničavanja željeza) usled aktivacije i unosa u bakterijsku ćeliju preko FhuE siderofornog prenosioca omogućava snažno delovanje kod mišjih modela infekcije. Posebno je IV formulacija rifabutina efikasna protiv infekcija A. baumannii.

SL. 6 je grafikon koji prikazuje CFU po paru pluća kod miševa inokulisanih sojevima A. baumannii. Neutropenične ženke CD-1 miševa (5 po grupi) inokulisane su intranazalno (t = 0 sati) sa ekvivalentnim titratima (6,90 i 6,93 log10 CFU) A. baumannii UNT091-1 divljeg tipa i A. baumannii UNT091-1 ΔFhuE mutanta. Tretman (jedna IV doza) je primenjen 2 sata nakon infekcije, i bakterijsko opterećenje je prijavljeno nakon 26 sati određivanjem CFU/pluća. Nadalje, efekat RBT je bio ublažen kod miševa inficiranih UNT091-1::ΔFhuE sojem koji podržava ulogu fhuE kao posrednika u RBT osetljivosti in vitro i in vivo.

Primer 7: In vitro delovanje rifabutina je određena prema panelu kliničke A. baumannii u prisustvu helatora gvožđa što je dovelo do povećane ekspresije receptora siderofora.

Rifabutin pokazuje snažno in vitro delovanje protiv velikog niza nedavno izolovanih i uglavnom XDR A. baumannii, uključujući izolate nepodložne kolistinu i karbapenemima. Kompleksacija slobodnog željeza pomoću PIH omogućava robusno testiranje podložnosti rifabutinu u standardnom MHA bogatom nutrijentima.

Svi izolati su bili rezistentni na karbapeneme. Rifabutin je pokazao odlično delovanje na A. baumannii sa MIC50/MIC90 od 0,008/1 mg/l u MHA bogatom hranljivim materijama bogatim željezom, uporedivo sa određivanjem tečne MIC korišćenjem RPMI sa dodatkom FCS (MIC50/MIC90 od 0,004/2 mg/l). Nasuprot tome, u standardnom MHA rifabutin je imao samo marginalno delovanje.

Postupci za određivanje in vitro delovanja

Panel od 293 CRAB soja izolovana iz regiona Evrope (n=144), Sjedinjenih Američkih Država (SAD) (n=99) i Azije i Zapadnog Pacifika (n=50) između 2017. i 2019. korišćen je za određivanje MIC rifabutina. Panel sojeva je sadržao izolate sa 10% MDR (n=29), 86% XDR (n=253) i 4% PDR (n=11) fenotipova. Izolati su prikupljeni uglavnom od pacijenata sa pneumonijom (59%), infekcijama krvotoka (28%) i infekcijama kože i mekih tkiva (11%) i kategorisani prema CLSI graničnim tačkama kao XDR kada nisu podložni ≤2 od antimikrobnih klasa opisanih u Magiorakos et al.2011. Ispitivanje podložnosti A. baumannii sa rifabutinom izvedeno je korišćenjem postupka razblaživanja agara na Muller Hinton agaru (MHA) sa dodatkom 0,1 mM piridoksal izonikotinoil hidrazina (PIH), moćnog netoksičnog helatora željeza. Komparativni antibiotici su testirani u CLSI standardnim uslovima.

Primer 8: Modeliranje FhuE TonB efekata na delovanje rifabutina

U komplementarnim testovima, ekspresija FhuE V38P nije bila u stanju da obnovi moćno delovanje rifabutina u poređenju sa ekspresijom divljeg tipa FhuE, što ukazuje da je fizička interakcija između TonB kutije FhuE i TonB mašine za pretvaranje energije potrebna za moćno delovanje rifabutina kao što je prikazano na SL.8. Ovi podaci sugerišu da je vezivanje rifabutina za FhuE potrebno da bi se aktivirala alosterična konformaciona tranzicija FhuE koja omogućava aktivni transport rifabutina i moćno delovanje protiv A. baumannii. SL.

8 prikazuje delovanje antibiotika rifabutina i rifampicina na plazmidom posredovanu ekspresiju FhuE-varijanti u CA-MHB. A. baumannii ATCC-17978 je korišćen kao soj domaćin, ekspresija gena iz plazmida je indukovana sa 1 mM IPTG i plazmid koji nije kodirao za FhuE je korišćen kao kontrola.

Postupci za merenje TonB efekata na delovanje rifabutina

Snažno delovanje rifabutina protiv A. baumannii zavisi od ekspresije TonB-zavisnog transportera (TBDT) FhuE što sugeriše da se rifabutin aktivno translocira preko spoljašnje membrane A. baumannii kroz FhuE. TBDT posredovan aktivni transport zahteva specifično vezivanje supstrata da bi se aktivirala alosterična konformaciona tranzicija transportera što dovodi do regrutacije TonB mašine za pretvaranje energije putem takozvane TonB kutije TBDT-a kao što je prikazano na SL.7. Videti Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J. i Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Annu. Rev. Microbiol.64, 43–60 (2010), uključeno ovde referisanjem. SL.

7 prikazuje shematski prikaz TonB-zavisnog transporta prilagođenog iz Hickman, S. J., Cooper, R. E. M., Bellucci, L., Paci, E. i Brockwell, D. J. Gating of TonB-dependent transporters by substrate-specific forced remodelling. Nat. Commun.8, 1–12 (2017.), uključeno ovde referisanjem. TBDT su takozvani portini sa zatvaranjem čiji je lumen zatvoren N-repnim čep domenom koji sprečava supstrat da pređe preko spoljne membrane. Vezivanje supstrata indukuje alosterično preuređenje čep domena, oslobađajući Ton kutiju u periplazmički prostor, gde regrutuje C-repni domen TonB u kompleks sa ExbB i ExbD da bi formirao mašinu za transdukciju energije. Povezivanje OM i IM putem ovog nekovalentnog kompleksa je potrebno da bi se pokrenulo potpuno ili delimično odvijanje čep domena, omogućavajući prolaz supstratu. TBDT: TonB-zavisan transporter, OM: spoljašnja membrana, IM: unutrašnja membrana, PG: peptidoglikan.

Da bi se istražilo da li se rifabutin aktivno transportuje, generisan je mutant FhuE V38P koji nosi mutaciju u TonB kutiji koja remeti interakciju između FhuE i TonB. Videti Cadieux, N., Bradbeer, C. i Kadner, R. J. Sequence changes in the ton box region of BtuB affect its transport activities and interaction with TonB protein. J. Bacteriol.182, 5954–5961 (2000.); Funahashi, T. et al. Identification and characterization of an outer membrane receptor gene in Acinetobacter baumannii required for utilization of desferricoprogen, rhodotorulic acid, and desferrioxamine B as xenosiderophores. Biol. Pharm. Bull.35, 753–760 (2012).

_____________________

Claims (5)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Sastav za upotrebu u lečenju infekcije A. baumannii, pri čemu sastav sadrži vodu, rastvarač, kiselinu i rifabutin za intravenozno davanje u dozi koja je najmanje oko 2 mg/kg q24h, 1 mg/kg q12h ili 0,5 mg/kg q6h.

2. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što rastvarač izabran iz grupe koja se sastoji od polioksietilen sorbitan monooleata (Tveen 80), sorbitan monooleat polioksietilen sorbitan monolaurata (Tveen 20), polietilen glikola (PEG), propilen glikola, N-metil-2-pirolidona (NMP), glicerina, etanola, dimetilacetamida (DMA), dietilen glikol monoetil etra (Transcutol HP) i dimetil izosorbida (DMI).

3. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što sastav sadrži oko 2:1 rastvarač:rifabutin.

4. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je sastav obezbeđen kao vodeni rastvor za intravenozno davanje.

5. Intravenozna vrećica koja sadrži sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4.