RS64184B1 - Konstrukti antitela za flt3 i cd3 - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na najmanje konstrukt bispecifičnog antitela koji sadrži prvi vezujući domen koji se vezuje za humani FLT3 na površini ciljne ćelije i drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije. Štaviše, pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji kodira konstrukt antitela, vektor koji sadrži navedeni polinukleotid i ćeliju domaćina transformisanu ili transficiranu navedenim polinukleotidom ili vektorom. Nadalje, pronalazak obezbeđuje proces za proizvodnju konstrukta antitela iz pronalaska, medicinsku upotrebu navedenog konstrukta antitela i komplet koji sadrži navedeni konstrukt antitela.

UVOD:

[0002] Akutna mijeloidna leukemija (AML) je heterogena hematološka malignost koja je najčešći tip akutne leukemije dijagnostikovane kod odraslih. AML čini otprilike trećinu svih leukemija, sa procenjenih 14.500 novih slučajeva prijavljenih 2013. godine samo u Sjedinjenim Državama i niskom stopom ukupnog preživljavanja. U proteklih trideset godina došlo je do malog poboljšanja standarda nege pacijenata sa AML. Međutim, nedavni napredak u molekularnoj i ćelijskoj biologiji revolucionisao je naše razumevanje humane hematopoeze, kako u normalnom tako i u stanju bolesti. Identifikovano je nekoliko ključnih aktera koji su uključeni u patogenezu bolesti i mogu se ispitati kao akcione mete. Jedan takav aktivirajući "pokretački" gen koji je najčešće mutiran u približno 30% AML je FLT3.

[0003] Fms-slična tirozin kinaza 3 (FLT3) takođe poznata kao kinaza fetalne jetre 2 (FLK-2), kinaza humanih matičnih ćelija 1 (SCK-1) ili antigen klastera diferencijacije (CD135) je hematopoetski receptor tirozin kinaza koji su klonirale dve nezavisne grupe 1990-ih godina. FLT3 gen, koji se nalazi na hromozomu 13q12 kod ljudi, kodira protein receptor tirozin kinaze klase III koji deli homologiju sa drugim članovima porodice klase III, uključujući receptor faktora matičnih ćelija (c-KIT), receptor faktora koji stimuliše koloniju makrofaga (FMS) i receptor faktora rasta koji potiče od trombocita (PDGFR).

[0004] Nakon vezivanja sa FLT3 ligandom, FLT3 receptor se podvrgava homodimerizaciji čime se omogućava autofosforilacija specifičnih ostataka tirozina u domenu prikrajne membrane i nizvodna aktivacija putem PI3K/Akt, MAPK i STAT5 puteva. FLT3 stoga igra ključnu ulogu u kontroli proliferacije, preživljavanja i diferencijacije normalnih hematopoetskih ćelija.

[0005] Humani FLT3 je eksprimiran u CD34+ CD38- hematopoetskim matičnim ćelijama (HSC), kao i u podskupu dendritskih prekursorskih ćelija. FLT3 ekspresija se takođe može detektovati u multipotentnim progenitorskim ćelijama kao što su CD34+CD38 CD45RA-CD123<niski>obični mijeloidni progenitor (CMP), CD34+CD38+ CD45RA CD123<niski>progenitori granulocita monocita (GMP), i CD34+CD38+CD10+ CD19- ćelije običnog limfoidnog progenitora (CLP). Zanimljivo je da je ekspresija FLT3 skoro odsutna u CD34+CD38-CD45RA-CD123- megakariocitnim eritrocitnim progenitorskim ćelijama (MEP). FLT3 ekspresija je stoga ograničena uglavnom na rane mijeloidne i limfoidne progenitorske ćelije sa nekom ekspresijom u zrelijim ćelijama monocitne loze. Ovaj ograničeni obrazac ekspresije FLT3 je u upadljivoj suprotnosti sa onim FLT3 liganda, koji je eksprimiran u većini hematopoetskih tkiva i prostati, bubrezima, plućima, debelom crevu i srcu. Ovi su promenili obrasce ekspresije, tako da je ekspresija FLT3 korak koji ograničava brzinu u određivanju specifičnosti tkiva signalnih puteva FLT3.

[0006] Najčešća mutacija FLT3 u AML je FLT3 unutrašnje tandem dupliranje (FLT3-ITD) koje je nađeno kod 20 do 38% pacijenata sa citogenetski normalnim AML. FLT3-ITD su formirani kada se deo kodirajuće sekvence domena prikrajne membrane udvostruči i insertuje u orijentaciju ’od glave do repa’. FLT3 mutacije nisu identifikovane kod pacijenata sa hroničnom limfoidnom leukemijom (CLL), ne-Hodžkinovim limfomom i multiplim mijelomom, što ukazuje na jaku specifičnost bolesti za AML. Aktivacija mutiranog FLT3 je generalno zapažena u svim FAB podtipovima, međutim, značajno je povećana kod AML pacijenata sa FAB M5 (monocitna leukemija), dok su FAB podtipovi M2 i M6 (granulocitna ili eritroidna leukemija) značajno ređe povezani sa aktivacijom FLT3, u skladu sa normalnim obrascima ekspresije FLT3. Mali procenat AML pacijenata (5-7%) prisutan je sa pojedinačnim mutacijama aminokiselina u domenu FLT3 tirozin kinaze (FLT3 TKD), najčešće na D835 ili u nekim slučajevima na T842 ili I836, dok još manje pacijenata (~1%) ima mutacije u domenu prikrajne membrane FLT3 koje uključuju ostatke 579, 590, 591 i 594. Pacijenti sa FLT3-ITD mutiranim AML imaju agresivan oblik bolesti koji karakteriše rani relaps i slabo preživljavanje, dok na ukupan opstanak i preživljavanje bez događaja ne utiče značajno prisustvo FLT3-TKD mutacija. Štaviše, AML pacijenti sa FLT3-ITD mutacijom sa istovremenim TET2 ili DNMT3A mutacijama imaju nepovoljan ukupni profil rizika u poređenju sa FLT3-ITD mutiranim AML pacijentima sa TET2 ili DNMT3A divljeg tipa, naglašavajući kliničku i biološku heterogenost AML.

[0007] I FLT3-ITD i FLT3 TKD mutacije indukuju aktivaciju FLT3 nezavisnu od liganda, što dovodi do nizvodne aktivacije Ras/MAPK puta i PI3K/AKT puteva. Međutim, nizvodni signalni putevi povezani sa bilo kojom mutacijom razlikuju se prvenstveno u preferencijalnoj aktivaciji STAT5 od strane FLT3-ITD, što dovodi do povećanog potencijala proliferacije i aberantne regulacije puteva DNK reparacije.

[0008] Nezavisno od statusa mutacije FLT3, fosforilacija FLT3 je očigledna kod više od dve trećine pacijenata sa AML, a FLT3 je eksprimiran u >80% AML blasta i kod -90% svih pacijenata sa AML što ga čini atraktivnom terapijskom metom povezanom sa patogenezom bolesti u velikom broju uzorka. Nekoliko inhibitora malih molekula pojavilo se kao atraktivne terapijske opcije za AML pacijente sa mutacijama FLT3. Prvu generaciju inhibitora tirozin kinaze FLT3 (TKI) karakteriše nedostatak selektivnosti, potentnosti i nepovoljna farmakokinetička svojstva. Noviji i selektivniji agensi su razvijeni za borbu protiv ovog problema; međutim, njihova efikasnost je ograničena pojavom sekundarne otpornosti.

[0009] Nekoliko ranih FLT3 TKI uključivalo je midostaurin (PKC412), lestaurtinib (CEP-701), sunitinib (SUI1248) i sorafinib (BAY 43-9006) između ostalog. Stope odgovora u fazi I i fazi II sa ovim agensima za ciljanje multikinaza kod pacijenata sa recidivom ili refraktornim AML-om su ograničene, verovatno zbog njihove nemogućnosti da postignu efikasnu inhibiciju FLT3 bez toksičnosti koja ograničava dozu. Kvizartinib (AC220) je razvijen kao druga generacija FLT3 TKI sa visokom selektivnošću za FLT3 divlji tip i FLT3-ITD i pokazao je korist posebno u peri-transplantacijskom okruženju kod mlađe kohorte pacijenata. Međutim, sekundarne mutacije u FLT3 identifikovane kod pacijenata sa recidivom koji su primili kvizartinib naglašavaju potrebu za razvojem boljih terapijskih strategija za pacijente sa AML, istovremeno ističući validnost FLT3 kao terapijskog cilja.

[0010] Nekoliko ciljnih agenasa je testirano na AML pacijentima sa ili de novo, recidivirajućom/refraktornom ili sekundarnom bolešću. Epigenetsko utišavanje gena za supresiju tumora igra važnu ulogu u patogenezi AML bolesti, a inhibitori DNK metiltransferaze (DNMT) kao što su azacitadin i decitabin postigli su neki klinički uspeh. Dalje, nedavna identifikacija mutacija koje utiču na posttranslacione modifikacije histona (npr. EZH2 i ASXL1 mutacije) ili metilaciju DNK (npr. DNMT3A, TET2, IDH1/2) u podskupu AML pacijenata dovela je do razvoja različitih terapijskih opcija, uključujući EZH2, DOT1L, IDH1/2 inhibitore zajedno sa HDAC i inhibitorima proteazoma. Međutim, pretkliničke studije mnogih od ovih jedinjenja u AML ćelijama sugerišu da ovi inhibitori mogu menjati fenotip i ekspresiju gena karakteristične za hematopoetsku diferencijaciju umesto da uzrokuju direktnu citotoksičnost AML blasta. Stoga i dalje postoji snažna neispunjena medicinska potreba da se identifikuju novi ciljevi/modaliteti za borbu protiv AML i izazove ciljana liza AML blast ćelija. Drugi terapijski kandidati za AML uključuju inhibitore Aurora kinaze, uključujući AMG 900 i inhibitore polo-sličnih kinaza koje igraju važnu ulogu u progresiji ćelijskog ciklusa.

[0011] Standard nege za AML pacijente ostao je hemoterapija sa transplantacijom matičnih ćelija kada je to izvodljivo. Međutim, pojava recidiva/refraktornih slučajeva kod velike većine lečenih pacijenata zahteva dodatne terapijske modalitete. Identifikacija i opis nekoliko antigena specifičnih za leukemiju, zajedno sa jasnijim razumevanjem imuno posredovanih efekata transplantata protiv leukemije, otvorili su put razvoju imunomodulatornih strategija za borbu protiv hematoloških malignih bolesti, pregledanih u nekoliko članaka.

[0012] Gemtuzumab ozogamicin (GO) je konjugat antitelo-lek usmeren protiv CD33, sveprisutnog markera površine mijeloidne ćelije. GO je povučen sa tržišta nakon randomizovanih ispitivanja koja nisu pokazala poboljšanja u ishodima sa GO terapijom. Međutim, postoji potreba za ponovnom procenom GO u AML i pokrenuto je nekoliko ispitivanja kako bi se detaljno procenila efikasnost i toksičnost GO. Drugi biološki agensi protiv AML uključuju lintuzumab (SGN-33), humanizovano anti-CD33 monoklonsko antitelo ili u nekonjugovanom obliku ili konjugovano sa radioaktivnim bizmutom i SL-401, koji se sastoji od humanog IL-3 u kombinaciji sa nosivošću difteria toksina protiv IL-3 receptora koji je prekomerno eksprimiran u većini AML blasta. Monoklonska antitela sledeće generacije koja ciljaju i tumorski povezani antigen i efektorske citolitičke T-ćelije uključuju AMG 330 (bi-specifični aktivator T-ćelija ili BiTE molekul koji cilja CD33) i MGD006, molekul sa dvostrukim afinitetom za ponovno ciljanje koji se vezuje za CD123 i CD3.

[0013] Nedavni uspeh T-ćelija himernog antigenskog receptora u refraktornoj CLL i akutnoj limfoblastičnoj leukemiji (ALL) otvorio je put ka razvoju mijeloidnih specifičnih CAR-T ćelija, uključujući CD123 CAR-T i CD33 CAR-T terapije. Uloženi su takođe napori u generisanje vakcina na bazi dendritskih ćelija, kao i u kombinaciju sa inhibitorima blokade kontrolnih tačaka kako bi se poboljšali ishodi.

[0014] Generisana su takođe terapijska antitela protiv FLT3. M. Hizmann et al.2012 (Leukemia, vol. 26, no.6, pages 1228-1237) pruža informacije u vezi sa generisanjem, izborom i pretkliničkom karakterizacijom Fc-optimizovanih FLT3 antitela kao što su 4G8 i BV10 za lečenje mijeloidne leukemije. M. Durben et al.2015 (Molecular Therapy, vol.23, no. 4, pages 648-655) odnosi se na karakterizaciju bispecifičnog FLT3 x CD3 antitela koje sadrži anti-FLT3 antitelo 4G8 ili BV10 i npr. anti-CD3 antitelo UCHT-1 za lečenje leukemije.

[0015] Pretpostavlja se da je terapija antitelima efikasnija sa malom verovatnoćom razvoja mehanizama sekundarne rezistencije jer je antitelo usmereno protiv ekstracelularnog domena FLT3, koji je manje sklon mutacijama od intracelularnog domena kinaze. ImClone antitelo, IMC-EB10 je procenjeno kod pacijenata sa recidivom AML u studiji faze I, međutim, studija je prekinuta zbog nedostatka efikasnosti (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00887926). Stoga i dalje postoji hitna potreba da se procene monoklonska antitela druge generacije, uključujući bispecifična antitela za lečenje AML.

[0016] Kako još uvek postoji potreba za dostupnim daljim opcijama za lečenje hematoloških bolesti povezanih sa ekspresijom FLT3, ovde su obezbeđena sredstva i metode za rešavanje ovog problema u obliku konstrukta bispecifičnog antitela koji ima vezujući domen usmeren na FLT3 na površini ciljnih ćelija tumora i drugi vezujući domen usmeren na CD3 na površini T ćelija.

[0017] Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje konstrukt bispecifičnog antitela koji sadrži prvi vezujući domen koji se vezuje za humani FLT3 na površini ciljne ćelije i drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za epitop FLT3 koji je sadržan u ekstracelularnom regionu FLT3 prikazanom u SEQ ID NO: 801-804. U prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje konstrukt antitela koji sadrži prvi vezujući domen koji se vezuje za humani FLT3 na površini ciljne ćelije i drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za epitop FLT3 koji je sadržan u regionu prikazanom u SEQ ID NO: 819, pri čemu navedeni konstrukt antitela je najmanje bispecifičan.

[0018] Treba napomenuti da, kako se ovde koriste, oblici za jedninu uključuju reference na množinu, osim ako kontekst jasno na označava drugačije. Tako, na primer, referenca na

„reagens“ uključuje jedan ili više takvih različitih reagensa, i referenca na „postupak“ uključuje referencu na ekvivalentne korake i postupke koji su poznati osobama sa uobičajenim znanjem i veštinama u struci, koji bi mogli da se modifikuju ili zamene ovde opisanim postupcima.

[0019] Ako nije drugačije naznačeno, pod terminom „najmanje“ koji prethodi nizu elemenata podrazumeva se svaki element u nizu. Osobe sa znanjem i veštinama u struci će prepoznati, ili će moći da utvrde koristeći samo rutinske eksperimente, brojne ekvivalente za specifična otelotvorenja pronalaska koji je ovde opisan.

[0020] Termin „i/ili“ kada se ovde koristi obuhvata značenje „i“, „ili“ i „sve ili bilo koje druge kombinacije elemenata povezanih navedenim terminom“.

[0021] Termin „oko“ ili „približno“, kako se ovde koristi, znači u okviru od ±20%, poželjno u okviru od ±15%, poželjnije u okviru od ±10%, a najpoželjnije u okviru od ±5% date vrednosti ili raspona.

[0022] U ovoj specifikaciji i u zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne nalaže drugačije, podrazumevaće se da reč „sadrži“ i njene varijacije obuhvataju uključivanje navedenog celog broja ili koraka, ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka, ili grupe celih brojeva ili koraka. Kada se ovde koristi, termin „sadrži“ može da se zameni terminom „sastoji se od“ ili „uključuje“ ili ponekada kada se ovde koristi terminom „ima“.

[0023] Kada se ovde koristi, „sastoji se od“ isključuje bilo koji element, korak ili sastojak koji nije naznačen u elementu zahteva. Kada se ovde koristi, „suštinski se sastoji od“ ne isključuje supstance ili korake koji ne utiču materijalno na bazne i nove karakteristike zahteva.

[0024] U svakom slučaju u ovom tekstu, bilo koji od termina „sadrži“, „suštinski se sastoji od“ ili „sastoji se od“ može da se zameni bilo kojim od druga dva termina.

[0025] Termin „konstrukt antitela“ odnosi se na molekul u kome se struktura i/ili funkcija zasnivaju na strukturi i/ili funkciji antitela, npr. molekul imunoglobulina kompletne dužine ili ceo molekul imunoglobulina. Konstrukt antitela je stoga sposoban da se vezuje za svoj specifični cilj ili antigen. Dalje, konstrukt antitela prema pronalasku sadrži minimalne strukturne zahteve za antitelo koji omogućavaju ciljno vezivanje. Ovaj minimalni zahtev može npr. biti definisan prisustvom najmanje tri CDR lakog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i/ili tri CDR teškog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona), poželjno svih šest CDR. Antitela na kojima su zasnovani konstrukti prema pronalasku uključuju, na primer, monoklonska, rekombinantna, himerna, deimunizovana, humanizovana i humana antitela.

[0026] U okviru definicije „konstrukta antitela“ prema pronalasku su antitela kompletne dužine ili cela antitela, takođe uključujući kamelidna antitela i druga imunoglobulinska antitela stvorena biotehnološkim postupcima ili procesima, ili postupcima ili procesima konstruisanja proteina. Ova antitela kompletne dužine mogu biti, na primer, monoklonska, rekombinantna, himerna, deimunizovana, humanizovana i humana antitela. Takođe u okviru definicije

„konstrukta antitela“ nalaze se i fragmenti antitela kompletne dužine, poput VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 ili „r IgG“ („pola antitela“). Konstrukti antitela prema pronalasku mogu takođe biti modifikovani fragmenti antitela, koji se nazivaju i varijante antitela, poput scFv, di-scFv ili bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-zatvarača, scFab, Fab2, Fab3, dijatela, jednolančanih dijatela, tandemskih dijatela (Tandab), tandemskog di-scFv, tandemskog triscFv, „minitela“ prikazanih sledećom strukturom: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2, ((scFv)2-CH3 CH3), ((scFv)2-CH3) ili (scFv-CH3-scFv)2, multitela kao što su trijatela ili tetratela, i antitela sa jednim domenom kao što su nanotela ili antitela sa jednim varijabilnim domenom koja sadrže samo jedan varijabilni domen, koji može biti VHH, VH ili VL, koji specifično vezuje antigen ili epitop nezavisno od drugih V regiona ili domena.

[0027] Vezujući domen može obično da sadrži varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH); međutim, ne mora da sadrži oba. Fd fragmenti, na primer, imaju dva VH regiona i često zadržavaju određenu antigen vezujuću funkciju netaknutog antigen vezujućeg domena. Dodatni primeri za format fragmenata antitela, varijanti antitela ili vezujućih domena uključuju (1) Fab fragment, jednovalentni fragment sa domenima VL, VH, CL i CH1; (2) F(ab')2 fragment, dvovalentni fragment sa dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom na regionu šarke; (3) Fd fragment sa dva VH i CH1 domena; (4) Fv fragment sa VL i VH domenima jednog kraka antitela, (5) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji ima VH domen; (6) izolovani region za određivanje komplementarnosti (CDR) i (7) jednolančani Fv (scFv), pri čemu je poslednje poželjno (na primer, dobijen iz biblioteke scFV). Primeri otelotvorenja konstrukta antitela prema pronalasku su opisani, npr. u WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, WO 2014/144722, WO 2014/151910 i WO 2015/048272.

[0028] Nadalje, definicija termina „konstrukt antitela“ uključuje jednovalentne, dvovalentne i polivalentne/multivalentne konstrukte, te tako monospecifične konstrukte koji se specifično vezuju za samo jednu antigensku strukturu, kao i bispecifične i polispecifične/multispecifične konstrukte koji specifično vezuju više od jedne antigenske strukture, npr. dve, tri ili više, preko različitih vezujućih domena. Štaviše, definicija termina „konstrukt antitela“ uključuje molekule koji se sastoje od samo jednog polipeptidnog lanca, kao i molekule koji se sastoje od više od jednog polipeptidnog lanca, pri čemu lanci mogu biti identični (homodimeri, homotrimeri ili homo oligomeri) ili različiti (heterodimer, heterotrimer ili heterooligomer). Primeri za prethodno identifikovana antitela i njihove varijante ili derivate su opisani, između ostalog, u Harlow and Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) i Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann i Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2. izd.2010 i Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.

[0029] Konstrukti antitela iz predmetnog pronalaska su poželjno „in vitro stvoreni konstrukti antitela“. Ovaj termin se odnosi na konstrukt antitela u skladu sa prethodnom definicijom, gde je ceo varijabilni region ili njegov deo (npr. najmanje jedan CDR) stvoren u neimunskoj selekciji ćelija, npr. in vitro displeju faga, proteinskom čipu, ili bilo kojim drugim postupkom u kome kandidati za sekvence mogu da se testiraju na sposobnost vezivanja za antigen. Ovaj termin stoga poželjno isključuje sekvence koje su stvorene isključivo genomskim preuređenjem u imunskoj ćeliji životinje. „Rekombinantno antitelo“ je antitelo načinjeno korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK ili genetskog inženjeringa.

[0030] Termin „monoklonsko antitelo“ (mAb) ili konstrukt monoklonskog antitela, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije u velikoj meri homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična, osim mogućih mutacija koje se javljaju u prirodi i/ili posttranslacionih modifikacija (npr. izomerizacija, amidacija) koje mogu da se javljaju u malom obimu. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena su na jedno antigensko mesto ili determinantu na antigenu, za razliku od konvencionalnih (poliklonskih) preparata antitela koji obično uključuju različita antitela usmerena na različite determinante (ili epitope). Pored svoje specifičnosti, monoklonska antitela su pogodna jer se sintetišu u kulturi hibridoma, te tako nisu zagađena drugim imunoglobulinima. Odrednica

„monoklonsko“ ukazuje na to da je antitelo dobijeno od suštinski homogene populacije antitela, i ne treba je tumačiti kao zahtev da se antitelo proizvodi bilo kojim određenim postupkom.

[0031] Za pripremu monoklonskih antitela može da se koristi bilo koja tehnika koja daje antitela proizvedena neprekidnim uzgajanjem ćelijskih linija. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti mogu da se stvore postupkom hibridoma koji su prvi opisali Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975), ili mogu da se stvore postupcima rekombinantne DNK (vidite, npr. U.S. patent br. 4,816,567). Primeri daljih tehnika za proizvodnju humanih monoklonskih antitela uključuju tehniku trioma, tehniku hibridoma humane B-ćelije (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) i tehniku EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).

[0032] Hibridomi zatim mogu da se ispitaju koristeći standardne postupke, kao što su test sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA) i analiza površinskom plazmonskom rezonancom (BIACORE™), kako bi se identifikovao jedan ili više hibridoma koji proizvode antitelo koje se specifično vezuje za naznačeni antigen. Bilo koji oblik relevantnog antigena može da se koristi kao imunogen, npr. rekombinantni antigen, njegovi oblici koji se javljaju u prirodi, bilo koje varijante ili fragmenti, kao i njegov antigenski peptid. Površinska plazmonska rezonanca koja se koristi u sistemu BIAcore može da se koristi za povećanje delotvornosti antitela faga koja se vezuju za epitop ciljnog antigena, poput FLT3 ili CD3 epsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).

[0033] Još jedan primer postupka za dobijanje monoklonskih antitela uključuje pretragu biblioteka ekspresije proteina, npr. biblioteka displeja faga ili displeja ribozoma. Displej faga je opisan, na primer, u Ladner et al., U.S. patent br.5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-

1

1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

[0034] Pored upotrebe biblioteka displeja, relevantni antigen može da se koristi za imunizaciju nehumane životinje, npr. glodara (kao što je miš, hrčak, zec ili pacov). U jednom otelotvorenju, nehumana životinja uključuje najmanje deo gena humanog imunoglobulina. Na primer, moguće je konstruisati mišje sojeve sa nedostatkom proizvodnje mišjeg antitela sa velikim fragmentima lokusa humanog Ig (imunoglobulina). Koristeći tehnologiju hibridoma, mogu da se proizvedu i odaberu monoklonska antitela specifična za antigen dobijena iz gena sa željenom specifičnošću. Vidite, npr. XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096 i WO 96/33735.

[0035] Monoklonsko antitelo takođe može da se dobije od nehumane životinje, a zatim da se modifikuje, npr. humanizuje, deimunizuje, načini himernim, itd. koristeći tehnike rekombinantne DNK koje su poznate u struci. Primeri za modifikovane konstrukte antitela uključuju humanizovane varijante nehumanih antitela, „afinitetno sazrelih“ antitela (vidite, npr. Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) i Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) mutante antitela sa izmenjenim efektorskim funkcijama (vidite, npr. US Patent 5,648,260, Kontermann i Dübel (2010), loc. cit. i Little (2009), loc. cit.).

[0036] U imunologiji, afinitetno sazrevanje je proces kojim B ćelije proizvode antitela sa povećanim afinitetom prema antigenu tokom trajanja imunskog odgovora. Uz ponovljenu izloženost istom antigenu, domaćin će proizvesti antitela sa sukcesivno većim afinitetima. Poput prirodnog prototipa, in vitro afinitetno sazrevanje se zasniva na principima mutacije i selekcije. In vitro afinitetno sazrevanje je uspešno korišćeno za optimizaciju antitela, konstrukta antitela i fragmenata antitela. Nasumične mutacije u CDR se uvode koristeći zračenje, hemijske mutagene ili PCR sklonu greškama. Pored toga, genetska raznovrsnost može da se poveća mešanjem lanaca. Dva ili tri kruga mutacije i selekcije koristeći postupke displeja poput displeja faga obično dovodi do fragmenata antitela sa afinitetom u malom nanomolskom opsegu.

[0037] Poželjna vrsta aminokiselinske supstitucione varijacije konstrukta antitela uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Uopšteno, nastale varijante izabrane za dalji razvoj će imati poboljšana biološka svojstva u odnosu na matično antitelo iz kog su stvorene. Prikladan način za stvaranje takvih supstituisanih varijanti uključuje afinitetno sazrevanje koristeći displej faga. Ukratko, nekoliko mesta hipervarijabilnog regiona (npr. 6-7 mesta) je mutirano radi stvaranja svih mogućih aminokiselinskih supstitucija na svakom mestu. Tako stvorene varijante antitela su prikazane na jednovalentan način iz čestica filamentoznog faga kao fuzije sa gen III proizvodom M13 upakovanim u svakoj čestici. Varijante sa prikazom faga su zatim ispitane na biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja) kao što je ovde prikazano. Da bi se identifikovali kandidati za mesta hipervarijabilnih regiona za modifikaciju, ciljana mutageneza sa alaninom može da se obavi da bi se identifikovali ostaci hipervarijabilnog regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno da se analizira kristalna struktura kompleksa antitelo-antigen kako bi se identifikovale tačke kontakta između vezujućeg domena i, npr. humanog FLT3. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za supstituciju prema tehnikama koje su ovde objašnjene. Nakon što su takve varijante stvorene, panel varijanti je podvrgnut skriningu kao što je ovde opisano, i antitela sa superiornim svojstvima u jednom ili više testova mogu da se izaberu za dalji razvoj.

[0038] Monoklonska antitela i konstrukti antitela iz predmetnog pronalaska specifično uključuju „himerna“ antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim od određene vrste ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lanca identičan ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim iz druge vrste ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente antitela, sve dok ispoljavaju željenu biološku aktivnost (U.S. patent br.4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Himerna antitela od interesa ovde uključuju „primatizovana“ antitela koja sadrže antigen vezujuće sekvence varijabilnog domena dobijene od nehumanog primata (npr. majmun Starog sveta, čovekoliki majmun, itd.) i humane sekvence konstantnog regiona. Opisani su različiti pristupi za stvaranje himernih antitela. Vidite npr. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A.

81:6851 , 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., U.S. patent br.4,816,567; Boss et al., U.S. patent br. 4,816,397; Tanaguchi et al., EP 0171496; EP 0173494; i GB 2177096.

[0039] Antitelo, konstrukt antitela, fragment antitela ili varijanta antitela mogu takođe biti modifikovani specifičnom delecijom epitopa humane T ćelije (postupak koji se naziva

„deimunizacija“) pomoću postupaka koji su otkriveni, na primer, u WO 98/52976 ili WO 00/34317. Ukratko, varijabilni domeni teškog i lakog lanca antitela mogu da se analiziraju na peptide koji se vezuju za MHC klasu II; ovi peptidi predstavljaju potencijalne epitope T ćelija (kao što je definisano u WO 98/52976 i WO 00/34317). Za otkrivanje potencijalnih epitopa T ćelija može da se primeni pristup kompjuterskog modelovanja koji se naziva „peptidno nizanje“, i dodatno baza podataka vezujućih peptida humane MHC klase II može da se pretraži na motive prisutne u sekvencama VH i VL, kao što je opisano u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ti motivi se vezuju za bilo koji od 18 velikih DR alotipova MHC klase II, te tako čine potencijalne epitope T ćelija. Otkriveni potencijalni epitopi T ćelija mogu da se eliminišu supstitucijom malog broja aminokiselinskih ostataka u varijabilnim domenima, ili poželjno, pojedinačnim aminokiselinskim supstitucijama. Obično se vrše konzervativne supstitucije. Često, ali ne i uvek, može da se koristi aminokiselina koja je uobičajena za poziciju u sekvenci antitela humane germinativne linije. Sekvence humane germinativne linije su otkrivene, npr. u Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol.227:776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today sveska 16 (5): 237-242; i Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14:4628-4638. V BASE direktorijum pruža sveobuhvatni direktorijum sekvenci varijabilnog regiona humanog imunoglobulina (sastavili su ga Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Te sekvence mogu da se koriste kao izvor humane sekvence, npr. za regione okvira i CDR. Regioni konsenzusa humanog okvira takođe mogu da se koriste, na primer, kao što je opisano u US patentu br.6,300,064.

[0040] „Humanizovana“ antitela, konstrukti antitela, njihove varijante ili fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ili druge antigen vezujuće podsekvence antitela) su antitela ili imunoglobulini većinski humanih sekvenci, koja sadrže (a) minimalne sekvence dobijene od nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela su najvećim delom humani imunoglobulini (prijemno antitelo) u kojima su ostaci iz hipervarijabilnog regiona (takođe CDR) prijemnika zamenjeni ostacima iz hipervarijabilnog regiona nehumane (npr. glodar) vrste (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov, hrčak ili zec, koja ima željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci Fv regiona okvira (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim nehumanim ostacima. Nadalje, „humanizovana antitela“, kako se ovde koriste, mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne mogu naći ni u prijemnom antitelu ni u donorskom antitelu. Ove modifikacije su napravljene da bi se dalje usavršile i optimizovale performanse antitela. Humanizovano antitelo takođe može da sadrži barem deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), obično humanog imunoglobulina. Za

1

više detalja, vidite Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

[0041] Humanizovana antitela ili njihovi fragmenti mogu da se stvore zamenom sekvenci varijabilnog domena Fv koje nisu neposredno uključene u vezivanje antigena sa ekvivalentnim sekvencama iz varijabilnih domena humanog Fv. Primere postupaka za stvaranje humanizovanih antitela ili njihovih fragmenata daju Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; i US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 5,859,205; i US 6,407,213. Ti postupci uključuju izolovanje, obradu i ekspresiju sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju deo ili cele Fv varijabilnih domena imunoglobulina iz najmanje jednog od teškog ili lakog lanca. Takve nukleinske kiseline mogu da se dobiju iz hibridoma koji proizvodi antitelo na unapred utvrđeni cilj, kao što je prethodno opisano, kao i iz drugih izvora. Rekombinantna DNK koja kodira molekul humanizovanog antitela onda može da se klonira u odgovarajući ekspresioni vektor.

[0042] Humanizovana antitela mogu takođe da se proizvedu koristeći transgene životinje, kao što su miševi, koji eksprimiraju gene humanog teškog i lakog lanca, ali su nesposobne da eksprimiraju endogene gene teškog i lakog lanca imunoglobulina miša. Winter opisuje primer postupka CDR graftovanja koji može da se koristi za pripremu humanizovanih antitela koja su ovde opisana (U.S. patent br.5,225,539). Svi CDR-ovi određenog humanog antitela mogu da se zamene barem delom nehumanog CDR-a, ili samo neki od CDR-a mogu da se zamene nehumanim CDR-ima. Potrebno je samo zameniti broj CDR-a potreban za vezivanje humanizovanog antitela za unapred određeni antigen.

[0043] Humanizovano antitelo može da se optimizuje uvođenjem konzervativnih supstitucija, supstitucija sekvence konsenzusa, supstitucija germinativne linije i/ili povratnih mutacija. Takvi izmenjeni molekuli imunoglobulina mogu da se dobiju bilo kojom od nekoliko tehnika koje su poznate u struci (npr. Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, i EP 239400).

[0044] Pojam „humano antitelo“, „konstrukt humanog antitela“ ili „humani vezujući domen“ uključuje antitela, konstrukte antitela i vezujuće domene sa regionima antitela kao što su varijabilni i konstantni regioni ili domeni koji suštinski odgovaraju sekvencama germinativne linije humanog imunoglobulina koje su poznate u struci, uključujući, na primer, one koje opisuju Kabat et al. (1991) (loc. cit.). Humana antitela, konstrukti antitela ili vezujući domeni iz pronalaska mogu da uključuju aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama germinativne linije humanog imunoglobulina (npr. mutacije uvedene nasumičnom mutagenezom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR, a naročito u CDR3. Humana antitela, konstrukti antitela ili vezujući domeni mogu da imaju najmanje jednu, dve, tri, četiri, pet ili više pozicija zamenjenih aminokiselinskim ostatkom koji nije kodiran sekvencom germinativne linije humanog imunoglobulina. Definicija humanih antitela, konstrukata antitela i vezujućih domena kako se ovde koriste takođe razmatra potpuno humana antitela, što uključuje samo neveštački i/ili genetski izmenjene humane sekvence antitela, pošto se one mogu dobiti koristeći tehnologije ili sisteme kao što je Xenomouse.

[0045] U nekim otelotvorenjima, konstrukti antitela iz pronalaska su „izolovani“ ili „suštinski čisti“ konstrukti antitela. Termini „izolovano“ ili „suštinski čisto“, kada se koriste za opisivanje ovde opisanih konstrukata antitela, označavaju konstrukt antitela koji je identifikovan, razdvojen i/ili izolovan iz komponente njegovog proizvodnog okruženja. Poželjno, konstrukt antitela je slobodan ili suštinski slobodan od veza sa svim drugim komponentama iz svog proizvodnog okruženja. Zagađivačke komponente njegovog proizvodnog okruženja, kao što su one nastale iz rekombinantno transficiranih ćelija, predstavljaju supstance koji bi obično ometale dijagnostičke ili terapeutske primene polipeptida, i mogu da uključuju enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvorene supstance. Konstrukti antitela mogu, npr. da čine najmanje oko 5% ili najmanje oko 50% mase ukupnog proteina u datom uzorku. Podrazumeva se da izolovani protein može da čini od 5% do 99,9% mase ukupnog sadržaja proteina, u zavisnosti od okolnosti. Polipeptid može da se proizvede u znatno većoj koncentraciji putem upotrebe inducibilnog promotera ili promotera sa velikom ekspresijom, tako da se proizvodi sa povišenim nivoima koncentracije. Definicija uključuje proizvodnju konstrukta antitela u širokom rasponu organizama i/ili ćelija domaćina koje su poznate u struci. U poželjnim otelotvorenjima, konstrukt antitela biće prečišćen (1) do stepena koji je dovoljan za dobijanje najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne aminokiselinske sekvence upotrebom sekvenatora sa rotirajućom posudom, ili (2) do homogenosti putem SDS-PAGE u neredukujućim ili redukujućim uslovima koristeći Kumasi plavu, ili poželjno srebrnu boju. Međutim, izolovani konstrukt antitela se obično priprema sa najmanje jednim korakom prečišćavanja.

1

[0046] Termin „vezujući domen“ u vezi sa predmetnim pronalaskom ukazuje na domen koji se (specifično) vezuje za dati ciljni epitop ili dato ciljno mesto na ciljnim molekulima (antigenima)/interaguje sa njim/prepoznaje ga, u ovom tekstu: FLT3, odnosno CD3. Struktura i funkcija prvog vezujućeg domena (koji prepoznaje FLT3), a poželjno i struktura i/ili funkcija drugog vezujućeg domena (koji prepoznaje CD3), zasnivaju se na strukturi i/ili funkciji antitela, npr. molekula imunoglobulina koji je kompletne dužine ili ceo. Prema pronalasku, prvi vezujući domen karakteriše prisustvo tri CDR-a lakog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i/ili tri CDR-a teškog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona). Poželjno je da drugi vezujući domen takođe sadrži minimalne strukturne zahteve antitela koji omogućavaju ciljno vezivanje. Još poželjnije, drugi vezujući domen sadrži najmanje tri CDR-a lakog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i/ili tri CDR-a teškog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona). Predviđeno je da se prvi i/ili drugi vezujući domen proizvode ili dobijaju postupcima displeja faga ili pretrage biblioteke, pre nego graftovanjem sekvenci CDR iz prethodno postojećeg (monoklonskog) antitela na konstrukciju.

[0047] Prema predmetnom pronalasku, vezujući domeni su u obliku jednog ili više polipeptida. Takvi polipeptidi mogu da uključuju proteinske delove i neproteinske delove (npr. hemijske linkere ili hemijske biokonjugujuće agense poput glutaraldehida). Proteini (uključujući njihove fragmente, poželjno biološki aktivne fragmente, i peptide, obično sa manje od 30 aminokiselina) sadrže dve ili više aminokiselina međusobno kuplovanih pomoću kovalentne peptidne veze (što daje lanac aminokiselina). Termin „polipeptid“, kako se ovde koristi, opisuje grupu molekula koji se obično sastoje od više od 30 aminokiselina. Polipeptidi mogu dalje da grade multimere, kao što su dimeri, trimeri i viši oligomeri, tj. da se sastoje od više od jednog molekula polipeptida. Molekuli polipeptida koji grade takve dimere, trimere, itd. mogu biti identični ili neidentični. Odgovarajuće strukture višeg reda takvih multimera se, prema tome, nazivaju homo- ili heterodimeri, homo- ili heterotrimeri, itd. Primer za heteromultimer je molekul antitela koji se, u svom prirodnom obliku, sastoji od dva identična laka lanca polipeptida i dva identična teška lanca polipeptida. Termini „peptid“, „polipeptid“ i

„protein“ takođe se odnose na prirodno modifikovane peptide/polipeptide/proteine, pri čemu je modifikacija izvršena, npr. posttranslacionim modifikacijama poput glikozilacije, acetilovanja, fosforilacije, i slično. „Peptid“, „polipeptid“ ili „protein“, kada se ovde upućuje na njega, može takođe biti hemijski modifikovan, recimo pegilovan. Takve modifikacije su dobro poznate u struci, i ovde su opisane u nastavku.

1

[0048] Poželjno, vezujući domen koji se vezuje za FLT3 i/ili vezujući domen koji se vezuje za CD3 je humani vezujući domen. Antitela i konstrukti antitela sa najmanje jednim humanim vezujućim domenom izbegavaju neke od problema povezanih sa antitelima ili konstruktima antitela koji imaju nehumane, recimo glodarske (npr. miša, pacova, hrčka ili zeca), varijabilne i/ili konstantne regione. Prisustvo takvih proteina dobijenih od glodara može dovesti do ubrzanog klirensa antitela ili konstrukata antitela, ili može dovesti do nastajanja imunskog odgovora na antitela ili konstrukta antitela od strane pacijenta. Da bi se izbegla upotreba antitela ili konstrukta antitela dobijenih od glodara, humana ili potpuno humana antitela/konstrukti antitela mogu da se stvore uvođenjem funkcije humanog antitela u glodara tako da glodar proizvodi potpuno humana antitela.

[0049] Sposobnost kloniranja i rekonstrukcije ljudskih lokusa veličine megabaze u YAC i njihovo uvođenje u germinativnu liniju miša pruža moćan pristup razjašnjavanju funkcionalnih komponenti veoma velikih ili grubo mapiranih lokusa, kao i stvaranju korisnih modela ljudskih bolesti. Nadalje, upotreba takve tehnologije za supstituciju mišjih lokusa njihovim humanim ekvivalentima mogla bi da obezbedi uvid u ekspresiju u regulisanje humanih genskih proizvoda tokom razvoja, njihovu komunikaciju sa drugim sistemima i njihovu umešanost u indukciju i razvoj bolesti.

[0050] Važna praktična primena takve strategije je „humanizacija“ mišjeg humoralnog imunskog sistema. Uvođenje lokusa humanog imunoglobulina (Ig) u miševe kod kojih su endogeni Ig geni inaktivirani pruža mogućnost proučavanja mehanizama u osnovi programirane ekspresije i skupa antitela, kao i njihove uloge u razvoju B-ćelija. Nadalje, takva strategija bi mogla da obezbedi idealan izvor za proizvodnju potpuno humanih monoklonskih antitela (mAb) - što je važno dostignuće u ostvarenju potencijalne terapije antitelima kod bolesti čoveka. Očekuje se da će potpuno humana antitela ili konstrukti antitela minimizovati imunogene i alergijske odgovore koji su svojstveni mišjim ili od miša dobijenim mAb, te tako povećati delotvornost i bezbednost primenjenih antitela/konstrukata antitela. Može se očekivati da će upotreba potpuno humanih antitela ili konstrukata antitela pružiti značajnu prednost u lečenju hroničnih i ponavljajućih ljudskih bolesti, poput inflamacije, autoimunosti i kancera, što zahteva ponovljene primene jedinjenja.

1

[0051] Jedan pristup za ostvarenje ovog cilja je bilo konstruisanje mišjih sojeva sa nedostatkom proizvodnje mišjih antitela sa velikim fragmentima lokusa humanog Ig u očekivanju da će takvi miševi proizvoditi veliki repertoar humanih antitela u odsustvu mišjih antitela. Veliki fragmenti humanog Ig bi očuvali veliku raznolikost gena, kao i odgovarajuću regulaciju proizvodnje i ekspresije antitela. Korišćenjem mišjeg mehanizma za diversifikaciju i selekciju antitela i nedostatak imunološke tolerancije na humane proteine, reprodukovani repertoar humanih antitela u ovim sojevima miševa treba da dobije daje antitela visokog afiniteta prema bilo kom antigenu od interesa, uključujući humane antigene. Koristeći tehnologiju hibridoma, lako mogu da se proizvedu i izaberu humana mAb specifična za antigen sa željenom specifičnošću. Ova opšta strategija je pokazana u vezi sa stvaranjem prvih mišjih sojeva XenoMouse (vidite Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)). Sojevi XenoMouse su konstruisani sa veštačkim hromozomima kvasca (YAC) koji sadrže fragmente konfiguracije germinativne linije od 245 kb i 190 kb lokusa humanog teškog lanca, odnosno lokusa kapa lakog lanca, koji sadrže ključne sekvence varijabilnog i konstantnog regiona. Pokazalo se da su humani Ig koji sadrže YAC kompatibilni sa sistemom miša za preuređenje i ekspresiju antitela, i mogli su da supstituišu inaktivirane gene mišjeg Ig. To pokazuje njihova sposobnost da indukuju razvoj B ćelija, da proizvode odrasli humani repertoar potpuno humanih antitela i da stvaraju humana mAb specifična za antigen. Ovi rezultati takođe ukazuju na to da bi uvođenje većih delova lokusa humanog Ig sa većim brojem V gena, dodatnim regulatornim elementima i konstantnim regionima humanog Ig moglo u velikoj meri da rekapitulira potpuni repertoar koji je karakterističan za humani humoralni odgovor na infekciju i imunizaciju. Rad čiji su autori Green et al. nedavno je proširen uvođenjem više od približno 80% repertoara humanih antitela putem uvođenja YAC fragmenata germinativne konfiguracije veličine megabaze iz lokusa humanog teškog lanca, odnosno lokusa kapa lakog lanca. Vidite Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

[0052] Proizvodnja miševa XenoMouse dalje je razmotrena i prikazana u U.S. patentu br.

6,673,986, U.S. br. br. 6,162,963; 6,150,584; 6,114,598; 6,075,181, i 5,939,598 kao i u fundamentalnim US patentnim prijavama i Japanskim patentima br.3068 180 B2, 3068 506 B2, i 3068 507 B2. Vidite takođe Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) i Green i Jakobovits J. Exp. Med.188:483-495 (1998), EP 0463 151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310, i WO 03/47336.

1

[0053] U alternativnom pristupu, drugi, uključujući kompaniju GenPharm International, Inc., koristili su pristup „minilokusa“. U pristupu minilokusa, egzogeni lokus Ig je imitiran uključivanjem delova (pojedinačnih gena) iz lokusa Ig. Tako, jedan ili više gena VH, jedan ili više gena DH, jedan ili više gena JH, konstantni region mi i drugi konstantni region (poželjno gama konstantni region) oblikovani su u konstrukt za inserciju u životinju. Ovaj pristup je opisan u U.S. pat. br.5,545,807 čiji su autori Surani et al. i U.S. pat. br.5,545,806; 5,625,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 5,770,429; 5,789,650; 5,814,318; 5,877,397; 5,874,299; i 6,255,458 svi od autora Lonberg i Kay, U.S. Pat. br. 5,591,669 i 6,023.010 čiji su autori Krimpenfort i Berns, U.S. pat. br.5,612,205; 5,721,367; i 5,789,215 čiji su autori Berns et al., i U.S. pat. br.5,643,763 čiji su autori Choi i Dunn. Ovaj pristup je dalje opisan u GenPharm International US pat. br.5,569,825, 5,789,650, 5,545,806, 5,661,016, 5,814,318, i 5,364,079, kao i u fundamentalnim US patentnim prijavama. Vidite takođe EP 0 546 073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, i WO 98/24884 i U.S. pat. br.5,981,175. Vidite dalje Taylor et al. (1992), Chen et al. (1993), Tuaillon et al. (1993), Choi et al. (1993), Lonberg et al. (1994), Taylor et al. (1994), i Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al. (1996).

[0054] Kirin je takođe pokazao stvaranje humanih antitela iz miševa u koje su, putem mikroćelijske fuzije, uvedeni veliki delovi hromozoma ili celi hromozomi. Vidite Evropske patentne prijave br.773 288 i 843961. Kompanija Xenerex Biosciences razvija tehnologiju za potencijalno stvaranje humanih antitela. U ovoj tehnologiji, SCID miševi su rekonstituisani sa humanim limfnim ćelijama, npr. B i/ili T ćelijama. Miševi su zatim imunizovani antigenom i mogu da stvore imunski odgovor na antigen. Vidite U.S. pat. br. 5,476,996; 5,698,767; i 5,958,765.

[0055] Odgovori humanih antimišjih antitela (HAMA) naveli su industriju da pripremi himerna ili na drugi način humanizovana antitela. Međutim, očekuje se da će se uočiti određeni odgovori humanih anti-himernih antitela (HACA), naročito kod hronične ili multidozne upotrebe antitela. Stoga bi bilo poželjno da se obezbede konstrukti antitela koji sadrže humani vezujući domen na FLT3 i/ili humani vezujući domen na CD3 kako bi se otklonile brige i/ili dejstva HAMA ili HACA odgovora.

[0056] Termini „(specifično) se vezuje za“, „(specifično) prepoznaje“, „(specifično) usmeren na“ i „(specifično) reaguje sa“ znače, prema ovom pronalasku, da vezujući domen interaguje

1

ili specifično interaguje sa datim epitopom ili datim ciljnim mestom na ciljnim molekulima (antigenima), u ovom tekstu: FLT3, odnosno CD3.

[0057] Termin „epitop“ odnosi se na mesto na antigenu za koje se specifično vezuje vezujući domen, kao što je antitelo ili imunoglobulin, ili derivat, fragment ili varijanta antitela ili imunoglobulina. „Epitop“ je antigenski, te se tako termin epitop ovde takođe označava kao

„antigenska struktura“ ili „antigenska determinanta“. Dakle, vezujući domen je „mesto interakcije antigena“. Navedeno vezivanje/interakcija takođe definiše „specifično prepoznavanje“.

[0058] „Epitope“ mogu da grade i uzastopne aminokiseline ili neuzastopne aminokiseline naspramne usled tercijarnog savijanja proteina. „Linearni epitop“ je epitop u kome primarna sekvenca aminokiselina sadrži prepoznati epitop. Linearni epitop obično uključuje najmanje 3 ili najmanje 4, a češće, najmanje 5 ili najmanje 6 ili najmanje 7, na primer, oko 8 do oko 10 aminokiselina u jedinstvenoj sekvenci.

[0059] „Konformacioni epitop“, nasuprot linearnom epitopu, predstavlja epitop u kome primarna sekvenca aminokiselina koja sadrži epitop nije jedina definišuća komponenta epitopa koja je prepoznata (npr. epitop u kome primarna sekvenca aminokiselina nije nužno prepoznata od strane vezujućeg domena). Konformacioni epitop sadrži povećani broj aminokiselina u odnosu na linearni epitop. Što se tiče prepoznavanja konformacionih epitopa, vezujući domen prepoznaje trodimenzionalnu strukturu antigena, poželjno njegovog peptida ili proteina ili fragmenta (u kontekstu predmetnog pronalaska, antigenska struktura za jedan od vezujućih domena je sadržana u proteinu FLT3). Na primer, kada se molekul proteina presavije u trodimenzionalnu strukturu, određene aminokiseline i/ili polipeptidna konstrukcija koja gradi konformacioni epitop postaju naspramne, što omogućava antitelu da prepozna epitop. Postupci za određivanje konformacije epitopa uključuju, ali nisu ograničeni na, rendgensku kristalografiju, spektroskopiju dvodimenzionalnom nuklearnom magnetnom rezonancom (2D-NMR) i spektroskopiju označavanja spina usmerenu na mesto i paramagnetne rezonance elektrona (EPR).

[0060] Postupak za mapiranje epitopa je opisan u nastavku: Kada se region (neprekinuti niz aminokiselina) u humanom proteinu FLT3 razmeni/zameni odgovarajućim regionom nehumanog i neprimatskog antigena FLT3 (npr. mišji FLT3, ali mogu da biti mogući i drugi,

2

poput kokoške, pacova, hrčka, zeca, itd.), očekuje se da će doći do smanjenja vezivanja vezujućeg domena, osim ako vezujući domen nije unakrsno reaktivan sa nehumanim, neprimatskim FLT3 koji se koristi. Navedeno smanjenje je poželjno najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50%, poželjnije najmanje 60%, 70% ili 80%, a najpoželjnije 90%, 95% ili čak 100% u poređenju sa vezivanjem za odgovarajući region u humanom proteinu FLT3, pri čemu je zadato da vezivanje za odgovarajući region u humanom FLT3 iznosi 100%. Predviđeno je da se prethodno navedene himere humanog FLT3 / nehumanog FLT3 eksprimiraju u CHO ćelijama. Takođe je predviđeno da su himere humanog FLT3 / nehumanog FLT3 fuzionisane sa transmembranskim domenom i/ili citoplazmatskim domenom drugog proteina vezanog za membranu, kao što je EpCAM, vidi Primer 1 i 2.

[0061] U alternativnom ili dodatnom postupku za mapiranje epitopa, može da se stvori nekoliko skraćenih verzija ekstracelularnog domena humanog FLT3 kako bi se odredio specifični region koji je prepoznat od strane vezujućeg domena. U ovim skraćenim verzijama, različiti ekstracelularni domeni/poddomeni ili regioni FLT3 su postepeno izbačeni, počevši od N-terminusa. Predviđeno je da skraćene verzije FLT3 koje su stvorene i korišćene u kontekstu predmetnog pronalaska prikazane su tako da skraćene verzije FLT3 mogu biti eksprimirane u CHO ćelijama. Takođe je predviđeno da skraćene verzije FLT3 mogu biti fuzionisane sa transmembranskim domenom i/ili citoplazmatskim domenom drugog proteina vezanog za membranu, kao što je EpCAM. Takođe je predviđeno da skraćene verzije FLT3 mogu da obuhvate domen signalnog peptida na svom N-terminusu, na primer, signalni peptid dobijen od signalnog peptida teškog lanca mišjeg IgG. Pored toga, predviđeno je da skraćene verzije FLT3 mogu da obuhvate v5 domen na svom N-terminusu (nakon signalnog peptida), što omogućava da se potvrdi njihova pravilna ekspresija na ćelijskoj površini. Očekuje se da će doći do smanjenja ili gubitka vezivanja kod tih skraćenih verzija FLT3 koje više ne obuhvataju region FLT3 koje je prepoznat od strane vezujućeg domena. Smanjenje vezivanja je poželjno najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; poželjnije najmanje 60%, 70%, 80%, a najpoželjnije 90%, 95% ili čak 100%, pri čemu je zadato da vezivanje za celi humani FLT3 protein (ili njegov ekstracelularni region ili domen) iznosi 100%, vidi primer 3.

[0062] Dalji postupak za određivanje doprinosa specifičnog ostatka ciljnog antigena prepoznavanju od strane konstrukta antitela ili vezujućeg domena je skeniranje sa alaninom (vidite, npr. Morrison KL & Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. 2001 Jun;5(3):302-7), gde je svaki ostatak koji treba da se analizira zamenjen alaninom, npr. putem mutageneze usmerene na mesto. Alanin se koristi zbog svoje nevoluminozne, hemijski inertne, metil funkcionalne grupe koja svejedno oponaša reference sekundarne strukture koje mnoge druge aminokiseline poseduju. Ponekad mogu da se koriste voluminozne aminokiseline poput valina ili leucina, u slučajevima kada je poželjno očuvanje veličine mutiranih ostataka. Skeniranje sa alaninom je zrela tehnologija koja se već dugo vremena koristi.

[0063] Interakcija između vezujućeg domena i epitopa ili regiona koji sadrži epitop podrazumeva da vezujući domen ispoljava primetan afinitet prema epitopu / regionu koji sadrži epitop na određenom proteinu ili antigenu (u ovom tekstu: FLT3, odnosno CD3) i, uopšteno, ne pokazuje značajnu reaktivnost sa proteinima ili antigenima koji nisu FLT3 ili CD3.

„Primetan afinitet“ uključuje vezivanje sa afinitetom od oko 10<-6>M (KD) ili jačim. Poželjno, smatra se da je vezivanje specifično kada je afinitet vezivanja oko 10<-12>do 10<-8>M, 10<-12>do 10<-9>M, 10<-12>do 10<-10>M, 10<-11>do 10<-8>M, poželjno od oko 10<-11>do 10<-9>M. Može lako da se testira da li vezujući domen specifično reaguje sa ciljem, ili se vezuje za cilj, između ostalog, poređenjem reakcije navedenog vezujućeg domena sa ciljnim proteinom ili antigenom sa reakcijom navedenog vezujućeg domena sa proteinima ili antigenima koji nisu FLT3 ili CD3. Poželjno, vezujući domen iz pronalaska se suštinski ili značajno ne vezuje za proteine ili antigene koji nisu FLT3 ili CD3 (tj. prvi vezujući domen nije sposoban da se vezuje za proteine koji nisu FLT3, a drugi vezujući domen nije sposoban da se vezuje za proteine koji nisu CD3).

[0064] Termin „suštinski/značajno se ne vezuje“ ili „nije sposoban da vezuje“ znači da vezujući domen iz predmetnog pronalaska ne vezuje protein ili antigen koji nije FLT3 ili CD3, tj. ne pokazuje reaktivnost veću od 30%, poželjno ne veću od 20%, poželjnije ne veću od 10%, naročito poželjno ne veću od 9%, 8%, 7%, 6% ili 5% sa proteinima ili antigenima koji nisu FLT3 ili CD3, pri čemu je vezivanje za FLT3, odnosno CD3 zadato na 100%.

[0065] Veruje se da na specifično vezivanje utiču specifični motivi u aminokiselinskoj sekvenci vezujućeg domena i antigena. Dakle, vezivanje se postiže usled njihove primarne, sekundarne i/ili tercijarne strukture, kao i usled sekundarnih modifikacija navedenih struktura. Specifična interakcija mesta interakcije antigena sa njegovim specifičnim antigenom može dovesti do prostog vezivanja navedenog mesta za antigen. Štaviše, specifična interakcija mesta interakcije antigena sa njegovim specifičnim antigenom može umesto toga, ili pored toga, da dovede do iniciranja signala, npr. usled indukcije promene konformacije antigena, oligomerizacije antigena, itd.

[0066] Predmetno obelodanjivanje takođe obezbeđuje konstrukt bispecifičnog antitela koji sadrži prvi vezujući domen koji se vezuje za humani FLT3 na površini ciljne ćelije i drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za epitop FLT3 koji je sadržan u regionu humanog FLT3 koji ima sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 814 (klaster 1) ili SEQ ID NO: 816 (klaster 3).

[0067] Poželjno, prvi vezujući domen konstrukta bispecifičnog antitela iz pronalaska sadrži VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabrane iz grupe koja se sastoji od:

SEQ ID NO: 151-156, SEQ ID NO: 161-166, SEQ ID NO: 171-176, SEQ ID NO: 181-186,

SEQ ID NO: 191-196, SEQ ID NO: 201-206, SEQ ID NO: 211-216, SEQ ID

NO: 221-226,

SEQ ID NO: 231-236, SEQ ID NO: 241-246, SEQ ID NO: 251-256, SEQ ID

NO: 261-266,

SEQ ID NO: 271-276, SEQ ID NO: 281-286, SEQ ID NO: 291-296, SEQ ID

NO: 301-306,

SEQ ID NO: 311-316, SEQ ID NO: 321-326, SEQ ID NO: 331-336, SEQ ID

NO: 341-346,

SEQ ID NO: 351-356, SEQ ID NO: 361-366, SEQ ID NO: 371-376, SEQ ID

NO: 381-386,

SEQ ID NO: 391-396, SEQ ID NO: 401-406, SEQ ID NO: 411-416, SEQ ID

NO: 421-426,

SEQ ID NO: 431-436, SEQ ID NO: 441-446, SEQ ID NO: 451-456, SEQ ID

NO: 461-466,

SEQ ID NO: 471-476, SEQ ID NO: 481-486, SEQ ID NO: 491-496, SEQ ID

NO: 501-506,

SEQ ID NO: 511-516, SEQ ID NO: 521-526, SEQ ID NO: 531-536, SEQ ID

NO: 541-546,

SEQ ID NO: 551-556, SEQ ID NO: 561-566, SEQ ID NO: 571-576, SEQ ID

NO: 581-586,

SEQ ID NO: 591-596, SEQ ID NO: 601-606, SEQ ID NO: 611-616, SEQ ID

NO: 621-626,

2

SEQ ID NO: 631-636, SEQ ID NO: 641-646, SEQ ID NO: 651-656, SEQ ID

NO: 661-666,

SEQ ID NO: 691-696, SEQ ID NO: 701-706, SEQ ID NO: 711-716, SEQ ID

NO: 721-726,

SEQ ID NO: 731-736, SEQ ID NO: 741-746, i SEQ ID NO: 791-796.

[0068] Termin „varijabilan“ odnosi se na delove domena antitela ili imunoglobulina koji ispoljavaju varijabilnost u svojoj sekvenci, i koji su uključeni u određivanje specifičnosti i afiniteta vezivanja konkretnog antitela (tj. „varijabilni domen(i)“). Parovi varijabilnog teškog lanca (VH) i varijabilnog lakog lanca (VL) zajedno grade jedno mesto vezivanja antigena.

[0069] Varijabilnost nije ravnomerno raspoređena u varijabilnim domenima antitela; ona je koncentrisana u poddomenima svakog od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca. Ti poddomeni se nazivaju „hipervarijabilni regioni“ ili „regioni za određivanje komplementarnosti“ (CDR). Očuvaniji (tj. ne-hipervarijabilni) delovi varijabilnih domena se nazivaju regionima „okvira“ (FRM ili FR), i obezbeđuju konstrukciju koja omogućava da šest CDR-a u trodimenzionalnom prostoru grade antigen vezujuću površinu. Svaki varijabilni domen prirodnih teških i lakih lanaca sadrži četiri regiona FRM (FR1, FR2, FR3 i FR4), koji u velikoj meri poprimaju konfiguraciju β-ravni, povezana pomoću tri hipervarijabilna regiona koji grade petlje koje povezuju strukturu β-ravni, a u nekim slučajevima čine njen deo. Hipervarijabilne regione u svakom lancu zajedno drže FRM veoma blisko, pri čemu hipervarijabilni regioni iz drugog lanca doprinose nastanku mesta vezivanja antigena (vidite Kabat et al., loc. cit.).

[0070] Termin „CDR“ i njegova množina „CDR-i“ odnose se na region za određivanje komplementarnosti, od čega tri regiona čine vezujući karakter varijabilnog regiona lakog lanca (CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3) i tri čine vezujući karakter varijabilnog regiona teškog lanca (CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3). CDR-i sadrže većinu ostataka odgovornih za specifične interakcije antitela sa antigenom, i stoga doprinose funkcionalnoj aktivnosti molekule antitela: oni su glavne odrednice specifičnosti antigena.

[0071] Tačne definicijske granice i dužine CDR-a podležu različitim sistemima klasifikacije i numerisanja. CDR-i stoga mogu da se pominju prema Kabatovim, Čotijinim, kontaktnim ili bilo kojim drugim definicijama granica, uključujući ovde opisane sisteme numerisanja. Uprkos različitim granicama, svaki od ovih sistema ima određeni stepen preklapanja u onome što čini takozvane „hipervarijabilne regione“ u varijabilnim sekvencama. Definicije CDR-a prema ovim sistemima mogu stoga da se razlikuju po dužini i ograničenim oblastima u odnosu na susedni region okvira. Vidite, na primer, Kabat (pristup zasnovan na varijabilnosti sekvence između vrsta), Čotija (pristup zasnovan na kristalografskim studijama kompleksa antigenantitelo) i/ili MacCallum (Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; i MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Još jedan standard za karakterizaciju mesta vezivanja antigena je definicija AbM koju koristi softver za modelovanje antitela AbM kompanije Oxford Molecular. Vidite, npr. Protein Sequence and Structure Analysis iz Antibody Variable Domains. U: Antibody Engineering Lab Manual (izd.: Duebel, S. i Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). U meri u kojoj dve tehnike za identifikaciju ostataka definišu regione preklapajućih, ali neidentičnih regiona, one mogu da se kombinuju radi definisanja hibridnog CDR. Međutim, poželjno je numerisanje u skladu sa takozvanim Kabatovim sistemom.

[0072] Obično, CDR-i grade strukturu petlje koja može da se klasifikuje kao kanonska struktura. Termin „kanonska struktura“ se odnosi na konformaciju glavnog lanca koju usvajaju antigen vezujuće (CDR) petlje. Komparativnim strukturnim studijama utvrđeno je da pet od šest antigen vezujućih petlji ima samo ograničen repertoar dostupnih konformacija. Svaka kanonska struktura može da se okarakteriše torzionim uglovima polipeptidnog skeleta. Zato odgovarajuće petlje između antitela mogu da imaju veoma slične trodimenzionalne strukture, uprkos velikoj varijabilnosti aminokiselinske sekvence u većem delu petlji (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin i Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Nadalje, postoji veza između usvojene strukture petlje i aminokiselinskih sekvenci koje je okružuju. Konformacija određene kanonske klase je određena dužinom petlje i aminokiselinskim ostacima koji se nalaze na ključnim pozicijama unutar petlje, kao i unutar očuvanog okvira (tj. izvan petlje). Stoga određena kanonska klasa može da se dodeli na osnovu prisustva tih ključnih aminokiselinskih ostataka.

[0073] Termin „kanonska struktura“ može takođe da uzima u obzir linearnu sekvencu antitela, na primer, kako je katalogizirao Kabat (Kabat et al., loc. cit.). Kabatova šema (sistem) numeracije je široko usvojeni standard za numeraciju aminokiselinskih ostataka varijabilnog domena antitela na konzistentan način, i ona je poželjna šema koja se primenjuje u predmetnom pronalasku, kako je takođe pomenuto u drugom delu ovog teksta. Dodatna strukturna

2

razmatranja takođe mogu da se koriste za određivanje kanonske strukture antitela. Na primer, razlike koje Kabatova numeracija ne odražava u potpunosti mogu da se opišu sistemom čiji su autori Čotija et al. i/ili mogu da se otkriju drugim tehnikama, na primer, kristalografijom i dvoili trodimenzionalnim kompjuterskim modelovanjem. Shodno tome, data sekvenca antitela može da se stavi u kanonsku klasu koja omogućava, između ostalog, identifikaciju odgovarajućih sekvenci osovine (npr. na osnovu želje da se u biblioteku uključe različite kanonske strukture). Kabatova numeracija aminokiselinskih sekvenci antitela i strukturna razmatranja koja su opisali Čotija et al., loc. cit. i njihove implikacije za konstruisanje kanonskih aspekta strukture antitela opisani su u literaturi. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina dobro su poznate u struci. Za pregled struktura antitela, vidite Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, izd. Harlow et al., 1988.

[0074] CDR3 lakog lanca i, naročito, CDR3 teškog lanca mogu da čine najvažnije determinante vezivanja antigena u varijabilnim regionima lakog i teškog lanca. U nekim konstruktima antitela, izgleda da CDR3 teškog lanca predstavlja glavnu oblast kontakta između antigena i antitela. In vitro šeme selekcije u kojima je samo CDR3 promenjen mogu da se koriste za promenu vezujućih svojstava antitela ili za utvrđivanje koji ostaci doprinose vezivanju antigena. Zato je CDR3 obično najveći izvor molekulske raznolikosti u mestu vezivanja antitela. Na primer, H3 može imati samo dva aminokiselinska ostatka ili više od 26 aminokiselina.

[0075] Kod klasičnog antitela ili imunoglobulina kompletne dužine, svaki laki (L) lanac je povezan sa teškim (H) lancem putem jedne kovalentne disulfidne veze, dok su dva H lanca međusobno povezana putem jedne ili više disulfidnih veza u zavisnosti od izotipa H lanca. CH domen najbliži VH obično se označava kao CH1. Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, ali ispoljavaju različite efektorske funkcije, kao što je ćelijski posredovana citotoksičnost i aktivacija komplementa zavisna od antitela. Fc region antitela je sadržan u konstantnim domenima teškog lanca i sposoban je, na primer, da interaguje sa Fc receptorima smeštenim na ćelijskoj površini.

[0076] Sekvenca gena antitela nakon sklapanja i somatske mutacije je veoma raznolika, i procenjuje se da ti različiti geni kodiraju 10<10>različitih molekula antitela (Immunoglobulin Genes, 2. izd., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Shodno tome, imunski sistem obezbeđuje repertoar imunoglobulina. Termin „repertoar“ odnosi se najmanje na jednu

2

sekvencu nukleotida dobijenu u potpunosti ili delimično od najmanje jedne sekvence koja kodira najmanje jedan imunoglobulin. Sekvence mogu nastati preuređivanjem in vivo V, D i J segmenata teškog lanca, i V i J segmenata lakog lanca. Alternativno, sekvence mogu nastati iz ćelije kao odgovor na dato preuređenje, npr. in vitro stimulaciju. Alternativno, deo ili celina sekvenci može da se dobije splajsovanjem DNK, sintezom nukleotida, mutagenezom i drugim postupcima, vidite, npr. U.S. patent 5,565,332. Repertoar može da uključuje samo jednu sekvencu, ili može da uključuje više sekvenci, uključujući sekvence u genetski raznovrsnoj kolekciji.

[0077] Poželjni konstrukt antitela prema pronalasku takođe može da se definiše kao konstrukt bispecifičnog antitela koji sadrži prvi (poželjno humani) vezujući domen koji se vezuje za humani FLT3 na površini ciljne ćelije i drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za isti epitop FLT3 kao antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od FL-1 do FL-52, FL-55 do FL-60 i FL-65, tj. antitelo koje sadrži VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabrane iz grupe koja se sastoji od:

SEQ ID NO: 151-156, SEQ ID NO: 161-166, SEQ ID NO: 171-176, SEQ ID NO: 181-186, SEQ ID NO: 191-196, SEQ ID NO: 201-206, SEQ ID NO: 211-216, SEQ ID NO: 221-226, SEQ ID NO: 231-236, SEQ ID NO: 241-246, SEQ ID NO: 251-256, SEQ ID NO: 261-266, SEQ ID NO: 271-276, SEQ ID NO: 281-286, SEQ ID NO: 291-296, SEQ ID NO: 301-306, SEQ ID NO: 311-316, SEQ ID NO: 321-326, SEQ ID NO: 331-336, SEQ ID NO: 341-346, SEQ ID NO: 351-356, SEQ ID NO: 361-366, SEQ ID NO: 371-376, SEQ ID NO: 381-386, SEQ ID NO: 391-396, SEQ ID NO: 401-406, SEQ ID NO: 411-416, SEQ ID NO: 421-426, SEQ ID NO: 431-436, SEQ ID NO: 441-446, SEQ ID NO: 451-456, SEQ ID NO: 461-466, SEQ ID NO: 471-476, SEQ ID NO: 481-486, SEQ ID NO: 491-496, SEQ ID NO: 501-506, SEQ ID NO: 511-516, SEQ ID NO: 521-526, SEQ ID NO: 531-536, SEQ ID NO: 541-546, SEQ ID NO: 551-556, SEQ ID NO: 561-566, SEQ ID NO: 571-576, SEQ ID NO: 581-586, SEQ ID NO: 591-596, SEQ ID NO: 601-606, SEQ ID NO: 611-616, SEQ ID NO: 621-626, SEQ ID NO: 631-636, SEQ ID NO: 641-646, SEQ ID NO: 651-656, SEQ ID NO: 661-666, SEQ ID NO: 691-696, SEQ ID NO: 701-706, SEQ ID NO: 711-716, SEQ ID NO: 721-726, SEQ ID NO: 731-736, SEQ ID NO: 741-746, i SEQ ID NO: 791-796.

2

[0078] Da li se konstrukt antitela vezuje za isti epitop FLT3 kao drugi konstrukt datog antitela ili ne, može da se odredi, npr., mapiranjem epitopa sa himernim ili skraćenim ciljnim molekulima, npr. kao što je opisano prethodno i u priloženim primerima.

[0079] Poželjni konstrukt antitela prema pronalasku takođe može da se definiše kao konstrukt bispecifičnog antitela koji sadrži prvi (poželjno humani) vezujući domen koji se vezuje za humani FLT3 na površini ciljne ćelije i drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujući domen takmiči u vezivanju sa antitelom izabranim iz grupe koja se sastoji od FL-1 do FL-52, FL-55 do FL-60 i FL-65, tj. antitelo koje sadrži VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabrane iz grupe koju čini prethodno opisano.

[0080] Da li se konstrukt antitela takmiči u vezivanju sa drugim konstruktom datog antitela ili ne, može da se odredi u kompetitivnom testu kao što je kompetitivna ELISA ili kompetitivni test na bazi ćelija. Takođe mogu da se koriste mikročestice (perlice) kuplovane sa avidinom. Slično kao ELISA ploča premazana avidinom, kada reaguje sa biotinilovanim proteinom, svaka od ovih perlica može da se koristi kao supstrat na kome može da se obavi test. Antigen je nanet na perlicu, a zatim je premazan prvim antitelom. Dodaje se drugo antitelo i određuje se svako dodatno vezivanje. Moguće sredstvo za očitavanje uključuje protočnu citometriju.

[0081] U jednom otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela iz pronalaska sadrži VH region izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: 557, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 747, i SEQ ID NO: 797.

2

[0082] U daljem otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela iz pronalaska sadrži VL region izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 748, i SEQ ID NO: 798.

[0083] U drugom otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela iz pronalaska sadrži VH region i VL region izabran iz grupe koja se sastoji od parova VH regiona i VL regiona, kako je prikazano u SEQ ID NO: 157+158, SEQ ID NO: 167+168, SEQ ID NO: 177+178, SEQ ID NO: 187+188, SEQ ID NO: 197+198, SEQ ID NO: 207+208, SEQ ID NO: 217+218, SEQ ID NO: 227+228, SEQ ID NO: 237+238, SEQ ID NO: 247+248, SEQ ID NO: 257+258, SEQ ID NO: 267+268, SEQ ID NO: 277+278, SEQ ID NO: 287+288, SEQ ID NO: 297+298, SEQ ID NO: 307+308, SEQ ID NO: 317+318, SEQ ID NO: 327+328, SEQ ID NO: 337+338, SEQ ID NO: 347+348, SEQ ID NO: 357+358, SEQ ID NO: 367+368, SEQ ID NO: 377+378, SEQ ID NO: 387+388, SEQ ID NO: 397+398. , SEQ ID NO: 407+408, SEQ ID NO: 417+418, SEQ ID NO: 427+428, SEQ ID NO: 437+438, SEQ ID NO: 447+448, SEQ ID NO: 457+458, SEQ ID NO: 467+468, SEQ ID NO: 477+478, SEQ ID NO: 487+488, SEQ ID NO: 497+498, SEQ ID NO: 507+508, SEQ ID NO: 517+518, SEQ ID NO: 527+528, SEQ ID NO: 537+538, SEQ ID NO: 547+548, SEQ ID NO: 557+558, SEQ ID NO: 567+568, SEQ ID NO: 577+578, SEQ ID NO: 587+588, SEQ ID NO: 597+598, SEQ ID NO: 607+608, SEQ ID NO: 617+618, SEQ ID NO: 627+628, SEQ ID NO: 637+638, SEQ ID NO: 647+648, SEQ ID NO: 657+658, SEQ ID NO: 667+668, SEQ ID NO: 697+698, SEQ ID NO: 707+708, SEQ ID NO: 717+718, SEQ ID NO: 727+728, SEQ ID NO: 737+738, SEQ ID NO: 747+748, i SEQ ID NO: 797+798.

2

[0084] U još jednom otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela iz pronalaska sadrži polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249 i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279 i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319 i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349 i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379 i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419 i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449 i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479 i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519 i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549 i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579 i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619 i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649 i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719 i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749 i SEQ ID NO: 799.

[0085] Prethodni prvi vezujući domeni (koji su naznačeni svojim CDR-ima, VH regionom i VL regionom i njihovim kombinacijama) karakterišu se kao vezujući domeni koji se vezuju za epitop FLT3 koji je sadržan u regionu kao što je prikazan u SEQ ID NO: 819.

[0086] Termin „bispecifično“, kako se ovde koristi, odnosi se na konstrukt antitela koji je

„najmanje bispecifičan“, tj. sadrži najmanje prvi vezujući domen i drugi vezujući domen, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za jedan antigen ili cilj (u ovom tekstu: FLT3), i drugi vezujući domen se vezuje za drugi antigen ili cilj (u ovom tekstu: CD3). Prema tome, konstrukti antitela prema pronalasku imaju specifičnosti za najmanje dva različita antigena ili cilja. Termin „konstrukt bispecifičnog antitela“ iz pronalaska takođe obuhvata konstrukte multispecifičnih antitela, kao što su konstrukti trispecifičnog antitela, pri čemu oni obuhvataju tri vezujuća domena, ili konstrukte sa više od tri (npr. četiri, pet...) specifičnosti.

[0087] S obzirom na to da su konstrukti antitela prema pronalasku (najmanje) bispecifični, oni se ne javljaju u prirodi, i izrazito su drugačiji od prirodnih proizvoda. „Bispecifični“ konstrukt antitela ili imunoglobulina je stoga veštačko hibridno antitelo ili imunoglobulin sa najmanje dva različita mesta vezivanja sa različitim specifičnostima. Konstrukti bispecifičnog antitela mogu da se proizvedu različitim postupcima, uključujući fuziju hibridoma ili povezivanje Fab' fragmenata. Vidite, npr. Songsivilai i Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990).

[0088] Najmanje dva vezujuća domena i varijabilna domena konstrukta antitela iz predmetnog pronalaska mogu, ali ne moraju da sadrže peptidne linkere (peptidi spejsera). Termin „peptidni linker“ sadrži prema predmetnom pronalasku aminokiselinsku sekvencu putem koje su aminokiselinske sekvence jednog (varijabilnog i/ili vezujućeg) domena i drugog (varijabilnog i/ili vezujućeg) domena konstrukta antitela iz pronalaska međusobno povezane. Ključna tehnička karakteristika takvog peptidnog linkera je da ne uključuje aktivnost polimerizacije. U odgovarajuće peptidne linkere spadaju oni opisani u U.S. patentima 4,751,180 i 4,935,233 ili WO 88/09344. Peptidni linkeri takođe mogu da se koriste za vezivanje drugih domena ili modula ili regiona (kao što su domeni koji produžavaju poluživot) za konstrukt antitela iz pronalaska.

[0089] U slučaju da se koristi linker, ovaj linker poželjno ima dužinu i sekvencu dovoljnu da se obezbedi da svaki od prvog i drugog domena može, nezavisno jedan od drugog, da zadrži svoju različitu specifičnost vezivanja. Za peptidne linkere koji povezuju najmanje dva vezujuća domena (ili dva varijabilna domena) u konstruktu antitela iz pronalaska, poželjni su peptidni linkeri koji sadrže samo mali broj aminokiselinskih ostataka, npr.12 aminokiselinskih ostataka ili manje. Prema tome, poželjni su peptidni linkeri sa 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ili 5 aminokiselinskih ostataka. Predviđeni peptidni linker sa manje od 5 aminokiselina sadrži 4, 3, 2 ili jednu aminokiselinu, pri čemu su poželjni linkeri bogati Gly. Naročito poželjna

„pojedinačna“ aminokiselina u kontekstu navedenog „peptidnog linkera“ je Gly. U skladu s tim, navedeni peptidni linker može da se sastoji od jedne aminokiseline Gly. Još jedno poželjno otelotvorenje peptidnog linkera je okarakterisano aminokiselinskom sekvencom Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, tj. Gly4Ser (SEQ ID NO: 1), ili njenim polimerima, tj. (Gly4Ser)x, gde je x ceo broj 1 ili veći (npr.2 ili 3). Poželjni linkeri su prikazani u SEQ ID NO: 1-9. Karakteristike navedenog peptidnog linkera, koje uključuju odsustvo promocije sekundarnih struktura, poznate su u struci i opisane su, na primer, u Dall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) i Raag i Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Poželjni su peptidni linkeri koji dalje ne promovišu bilo kakve sekundarne strukture. Međusobno povezivanje navedenih domena može da se osigura, npr. putem genetskog inženjeringa, kao što je opisano u primerima. Postupci za pripremu fuzionisanih i operativno povezanih bispecifičnih jednolančanih konstrukata i njihovu ekspresiju u ćelijama sisara ili u bakterijama su dobro poznati u struci (npr. WO 99/54440 ili Sambrook et al., Molecular Cloning: A

1

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).

[0090] Kao što je ovde prethodno opisano, pronalazak obezbeđuje poželjno otelotvorenje u kome je konstrukt antitela u formatu izabranom iz grupe koja se sastoji od (scFv)2, scFvjednodomenskog mAb, dijatela i oligomera bilo kog od ovih formata.

[0091] Prema posebno poželjnom otelotvorenju, i kao što je dokumentovano u priloženim primerima, konstrukt antitela iz pronalaska je „konstrukt bispecifičnog jednolančanog antitela“, poželjnije bispecifični „jednolančani Fv“ (scFv). Iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirani različitim genima, oni mogu biti spojeni, koristeći rekombinantne postupke, pomoću sintetičkog linkera - kao što je ovde prethodno opisano - koji omogućava da budu napravljeni u vidu jednog proteinskog lanca u kome se VL i VH region sparuju da grade jednovalentni molekul, vidite, npr. Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Ovi fragmenti antitela se dobijaju koristeći konvencionalne tehnike koje su poznate stručnjacima, i fragmenti su ispitani na funkciju na isti način kao cela antitela ili antitela kompletne dužine. Jednolančani varijabilni fragment (scFv) stoga je fuzioni protein varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i lakog lanca (VL) imunoglobulina, obično povezan kratkim linkerskim peptidom od oko deset do oko 25 aminokiselina, poželjno oko 15 do 20 aminokiselina. Linker je obično bogat glicinom radi fleksibilnosti, kao i serinom ili treoninom radi rastvorljivosti, i može da povezuje N-terminus VH sa C-terminusom VL, i obrnuto. Ovaj protein zadržava specifičnost izvornog imunoglobulina, uprkos uklanjanju konstantnih regiona i uvođenju linkera.

[0092] Bispecifični jednolančani molekuli su poznati u struci, i opisani su u WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Löffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Tehnike opisane za proizvodnju jednolančanih antitela (vidite, između ostalog, US patent 4,946,778, Kontermann i Dübel (2010), loc. cit. i Little (2009), loc. cit.) mogu da se prilagode za proizvodnju konstrukata jednolančanih antitela koji specifično prepoznaju izabrani cilj (ciljeve).

[0093] Dvovalentni (takođe se nazivaju divalentni) ili bispecifični jednolančani varijabilni fragmenti (bi-scFv ili di-scFv koji imaju format (scFv)2mogu da se konstruišu povezivanjem

2

dva molekula scFv (npr. linkerima, kao što je ovde prethodno opisano). Ako ova dva molekula scFv imaju istu specifičnost vezivanja, dobijeni molekul (scFv)2će se poželjno nazivati dvovalentan (tj. ima dve valence za isti ciljni epitop). Ako dva molekula scFv imaju različite specifičnosti vezivanja, nastali molekul (scFv)2će se poželjno nazivati bispecifičan. Povezivanje može da se izvrši proizvodnjom jednog peptidnog lanca sa dva VH regiona i dva VL regiona, što daje tandem scFv (vidite, npr. Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244). Druga mogućnost je stvaranje molekula scFv sa linkerskim peptidima koji su previše kratki da se dva varijabilna regiona zajedno presaviju (npr. oko pet aminokiselina), što tera scFv da se dimerizuju. Ova vrsta je poznata kao dijatela (vidite, npr. Hollinger, Philipp et al., (July 1993) Proceedings iz the National Academy iz Sciences iz the United States iz America 90 (14): 6444-8.).

[0094] Prema takođe poželjnom otelotvorenju konstrukta antitela iz pronalaska, teški lanac (VH) i laki lanac (VL) vezujućeg domena koji se vezuje bilo sa ciljnim antigenom FLT3 ili sa CD3 nisu neposredno povezani putem prethodno opisanog peptidnog linkera, već je vezujući domen formiran usled formiranja bispecifičnog molekula, kao što je opisano za dijatelo. Prema tome, VH lanac CD3 vezujućeg domena može biti fuzionisan sa VL FLT3 vezujućeg domena putem takvog peptidnog linkera, dok VH lanac FLT3 vezujućeg domena je fuzionisan sa VL CD3 vezujućeg domena putem takvog peptidnog linkera.

[0095] Jednolančana antitela sadrže samo jedan (monomerni) varijabilni domen antitela koji je sposoban da se selektivno vezuje za specifični antigen, nezavisno od ostalih V regiona ili domena. Prva antitela sa jednim domenom konstruisana su iz antitela teškog lanca koja se mogu naći kod kamelida, i ona se nazivaju VHH fragmenti. Hrskavičave ribe takođe imaju antitela teškog lanca (IgNAR) od kojih mogu da se dobiju antitela sa jednim domenom koja se nazivaju VNARfragmenti. Alternativni pristup je razdvajanje dimernih varijabilnih domena iz uobičajenih imunoglobulina, npr. čoveka ili glodara, na monomere, čime se dobija VH ili VL kao Ab sa jednim domenom. Iako se većina istraživanja antitela sa jednim domenom trenutno zasniva na varijabilnim domenima teškog lanca, pokazalo se da se i nanotela dobijena od lakih lanaca specifično vezuju za ciljne epitope. Primeri za antitela sa jednim domenom nazivaju se sdAb, nanotela ili antitela sa jednim varijabilnim domenom.

[0096] (mAb sa jednim domenom)2je stoga monoklonski konstrukt antitela sačinjen od (najmanje) dva monoklonska antitela sa jednim domenom, koja su pojedinačno izabrana iz grupe koja se sastoji od VH, VL, VHH i VNAR. Linker je poželjno u obliku peptidnog linkera. Slično tome, „scFv-jednodomensko antitelo“ je konstrukt monoklonskog antitela sačinjen od najmanje jednog antitela sa jednim domenom kao što je prethodno opisano, i jednog molekula scFv kao što je prethodno opisano. Ponovo, linker je poželjno u obliku peptidnog linkera.

[0097] Predmetni pronalazak obezbeđuje konstrukt antitela koji sadrži prvi vezujući domen koji se vezuje za humani FLT3 na površini ciljne ćelije i drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za epitop FLT3 koji je sadržan u regionu prikazanom u SEQ ID NO: 819 (klaster 1), pri čemu je konstrukt antitela bar bispecifičan.

[0098] Shodno tome, u daljem aspektu pronalaska, prvi vezujući domen konstrukta bispecifičnog antitela sadrži VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabrane iz grupe koja se sastoji od:

SEQ ID NO: 151-156, SEQ ID NO: 161-166, SEQ ID NO: 171-176, SEQ ID NO: 181-186, SEQ ID NO: 191-196, SEQ ID NO: 201-206, SEQ ID NO: 211-216, SEQ ID NO: 221-226, SEQ ID NO: 231-236, SEQ ID NO: 241-246, SEQ ID NO: 251-256, SEQ ID NO: 261-266, SEQ ID NO: 271-276, SEQ ID NO: 281-286, SEQ ID NO: 291-296, SEQ ID NO: 301-306, SEQ ID NO: 311-316, SEQ ID NO: 321-326, SEQ ID NO: 331-336, SEQ ID NO: 341-346, SEQ ID NO: 351-356, SEQ ID NO: 361-366, SEQ ID NO: 371-376, SEQ ID NO: 381-386, SEQ ID NO: 391-396, SEQ ID NO: 401-406, SEQ ID NO: 411-416, SEQ ID NO: 421-426, SEQ ID NO: 431-436, SEQ ID NO: 441-446, SEQ ID NO: 451-456, SEQ ID NO: 461-466, SEQ ID NO: 471-476, SEQ ID NO: 481-486, SEQ ID NO: 491-496, SEQ ID NO: 501-506, SEQ ID NO: 511-516, SEQ ID NO: 521-526, SEQ ID NO: 531-536, SEQ ID NO: 541-546, SEQ ID NO: 551-556, SEQ ID NO: 561-566, SEQ ID NO: 571-576, SEQ ID NO: 581-586, SEQ ID NO: 591-596, SEQ ID NO: 601-606, SEQ ID NO: 611-616, SEQ ID NO: 621-626, SEQ ID NO: 631-636, SEQ ID NO: 641-646, SEQ ID NO: 651-656, SEQ ID NO: 661-666, SEQ ID NO: 691-696, SEQ ID NO: 701-706, SEQ ID NO: 711-716, SEQ ID NO: 721-726, SEQ ID NO: 731-736, SEQ ID NO: 741-746, SEQ ID NO: 791-796.

[0099] U jednom otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela iz pronalaska sadrži VH region izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 257, SEQ ID

4

NO: 267, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: 557, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 747, i SEQ ID NO: 797.

[0100] U daljem otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela iz pronalaska sadrži VL region izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 748, i SEQ ID NO: 798.

[0101] U drugom otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela iz pronalaska sadrži VH region i VL region izabrane iz grupe koja se sastoji od parova VH regiona i VL regiona kako je prikazano u SEQ ID NO: 157+158, SEQ ID NO: 167+168, SEQ ID NO: 177+178, SEQ ID NO: 187+188, SEQ ID NO: 197+198, SEQ ID NO: 207+208, SEQ ID NO:

217+218, SEQ ID NO: 227+228, SEQ ID NO: 237+238, SEQ ID NO: 247+248, SEQ ID NO: 257+258, SEQ ID NO: 267+268, SEQ ID NO: 277+278, SEQ ID NO: 287+288, SEQ ID NO: 297+298, SEQ ID NO: 307+308, SEQ ID NO: 317+318, SEQ ID NO: 327+328, SEQ ID NO: 337+338, SEQ ID NO: 347+348, SEQ ID NO: 357+358, SEQ ID NO: 367+368, SEQ ID NO: 377+378, SEQ ID NO: 387+388, SEQ ID NO: 397+398. , SEQ ID NO: 407+408, SEQ ID NO: 417+418, SEQ ID NO: 427+428, SEQ ID NO: 437+438, SEQ ID NO: 447+448, SEQ ID NO: 457+458, SEQ ID NO: 467+468, SEQ ID NO: 477+478, SEQ ID NO: 487+488, SEQ ID NO: 497+498, SEQ ID NO: 507+508, SEQ ID NO:

517+518, SEQ ID NO: 527+528, SEQ ID NO: 537+538, SEQ ID NO: 547+548, SEQ ID NO: 557+558, SEQ ID NO: 567+568, SEQ ID NO: 577+578, SEQ ID NO: 587+588, SEQ ID NO: 597+598, SEQ ID NO: 607+608, SEQ ID NO: 617+618, SEQ ID NO: 627+628, SEQ ID NO: 637+638, SEQ ID NO: 647+648, SEQ ID NO: 657+658, SEQ ID NO:

667+668, SEQ ID NO: 697+698, SEQ ID NO: 707+708, SEQ ID NO: 717+718, SEQ ID NO: 727+728, SEQ ID NO: 737+738, SEQ ID NO: 747+748, i SEQ ID NO: 797+798.

[0102] U daljem otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela iz pronalaska sadrži polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799.

[0103] Takođe je predviđeno da ovo obelodanjivanje obezbeđuje konstrukt bispecifičnog antitela koji sadrži prvi vezujući domen koji se vezuje za humani FLT3 na površini ciljne ćelije i drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu prvi vezujući domen se vezuje za epitop FLT3 koji se nalazi unutar regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 821 (klaster 3).

[0104] Prema ovom obelodanjivanju, prvi vezujući domen konstrukta bispecifičnog antitela obuhvata VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 kao u nastavku:

SEQ ID NO: 671-676, SEQ ID NO: 681-686, SEQ ID NO: 751-756, SEQ ID NO: 761-766, SEQ ID NO: 771-776 i SEQ ID NO: 781-786.

[0105] Prvi vezujući domen konstrukta antitela koji je ovde obelodanjen obuhvata VH region prikazan u SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 687, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 777 i SEQ ID NO: 787.

[0106] Prvi vezujući domen konstrukta antitela koji je ovde obelodanjen obuhvata VL region prikazan u SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 778 i SEQ ID NO: 788.

[0107] Prvi vezujući domen konstrukta antitela koji je ovde obelodanjen obuhvata VH region i VL region izabran iz grupe koju čine parovi VH regiona i VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 677+678, SEQ ID NO : 687+688, SEQ ID NO: 757+758, SEQ ID NO: 767+768, SEQ ID NO: 777+778 i SEQ ID NO: 787+788.

[0108] Prvi vezujući domen konstrukta antitela koji je ovde obelodanjen sadrži polipeptid izabran iz grupe koju čine oni prikazani u SEQ ID NO: 679 i SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NO: 779 i SEQ ID NO: 789.

[0109] Drugi konstrukt antitela koji je ovde obelodanjen takođe se može definisati kao konstrukt bispecifičnog antitela koji sadrži prvi (poželjno humani) vezujući domen koji se vezuje za humani FLT3 na površini ciljne ćelije i drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površine T ćelije, pri čemu se prvi vezujući domen takmiči za vezivanje sa antitelom izabranim iz grupe koju čine FL-1 do FL-53, FL-55 do FL-60 i FL-65, tj., antitelo koje sadrži VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabran iz grupe koju čine oni gore opisani.

[0110] T ćelije ili T limfociti su vrsta limfocita (koji je sam tip belih krvnih zrnaca) koji igraju centralnu ulogu u imunitetu posredovanom ćelijama. Postoji nekoliko podskupova T ćelija, od kojih svaka ima različitu funkciju. T ćelije se mogu razlikovati od drugih limfocita, kao što su B ćelije i NK ćelije, prisustvom receptora T ćelija (TCR) na površini ćelije. TCR je odgovoran za prepoznavanje antigena vezanih za glavne molekule kompleksa histokompatibilnosti (MHC) i sastoji se od dva različita proteinska lanca. U 95% T ćelija, TCR se sastoji od alfa (α) i beta (β) lanca. Kada TCR stupi u borbu sa antigenskim peptidom i MHC (peptid/MHC kompleks), T limfocit se aktivira nizom biohemijskih događaja posredovanih asociranim enzimima, koreceptorima, specijalizovanim adapterskim molekulima i aktiviranim ili oslobođenim faktorima transkripcije.

[0111] Kompleks CD3 receptora je proteinski kompleks i sastoji se od četiri lanca. Kod sisara, kompleks sadrži CD3γ (gama) lanac, CD3δ (delta) lanac i dva CD3ε (epsilon) lanca. Ovi lanci se povezuju sa T ćelijskim receptorom (TCR) i takozvanim ζ (zeta) lancem da bi formirali receptor T ćelija CD3 kompleks i generisali aktivacioni signal u T limfocitima. CD3γ (gama), CD3δ (delta) i CD3ε (epsilon) lanci su visoko povezani proteini ćelijske površine superfamilije imunoglobulina koji sadrže jedan ekstracelularni imunoglobulinski domen. Intracelularni repovi molekula CD3 sadrže jedan očuvani motiv poznat kao motiv aktivacije imunoreceptora na bazi tirozina ili skraćeno ITAM, koji je neophodan za signalni kapacitet TCR-a. Molekul CD3 epsilon je polipeptid koji je kod ljudi kodiran CD3E genom koji se nalazi na hromozomu 11. Najpoželjniji epitop CD3 epsilon se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1-27 humanog CD3 epsilon ekstracelularnog domena.

[0112] Preusmerena liza ciljnih ćelija putem regrutovanja T ćelija od strane multispecifičnog, najmanje bispecifičnog, konstrukta antitela uključuje formiranje citolitičke sinapse i isporuku perforina i granzima. Angažovane T ćelije su sposobne za serijsku lizu ciljnih ćelija i na njih ne utiču mehanizmi imunog bekstva koji ometaju obradu i prezentaciju peptidnog antigena, ili diferencijaciju klonskih T ćelija; videti, na primer, WO 2007/042261.

[0113] Citotoksičnost posredovana konstruktima bispecifičnih antitela FLT3xCD3 može se meriti na različite načine. Videti primere 10. Efektorske ćelije mogu biti npr. stimulisane obogaćene (humane) CD8 pozitivne T ćelije ili nestimulisane (humane) mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). Ako su ciljne ćelije porekla makaki majmuna ili eksprimiraju ili su transficirane sa FLT3 makaki majmuna, efektorske ćelije takođe treba da budu porekla makaki, kao što je T ćelijska linija makaki, npr.4119LnPk. Ciljne ćelije treba da eksprimiraju (barem njihov ekstracelularni domen) FLT3, npr. humani ili makaki FLT3. Ciljne ćelije mogu biti ćelijska linija (kao što je CHO) koja je stabilno ili prolazno transficirana sa FLT3, npr. humani ili makaki FLT3. Alternativno, ciljne ćelije mogu biti FLT3 pozitivna prirodna ekspresiona ćelijska linija, kao što su FLT3 pozitivne humane AML ćelijske linije EOL-1, MOLM-13 i MV4-11. Obično se očekuje da vrednosti EC50 budu niže sa ciljnim ćelijskim linijama koje eksprimiraju više nivoe FLT3 na površini ćelije. Odnos efektorske i ciljne ćelije (E:T) je obično oko 10:1, ali takođe može da varira. Citotoksična aktivnost konstrukata bispecifičnih antitela FLT3xCD3 može se meriti u testu oslobađanja 51-hroma (vreme inkubacije od oko 18 sati) ili u testu citotoksičnosti na bazi FACS (vreme inkubacije od oko 48 sati). Moguće su i modifikacije vremena inkubacije testa (citotoksična reakcija). Druge metode merenja citotoksičnosti su dobro poznate stručnjaku i obuhvataju MTT ili MTS testove, testove na bazi ATP uključujući bioluminiscentne testove, sulforodamin B (SRB) test, WST test, klonogeni test i ECIS tehnologiju.

[0114] Citotoksična aktivnost posredovana konstruktima bispecifičnih antitela FLT3xCD3 iz ovog pronalaska se poželjno meri u testu citotoksičnosti na bazi ćelija. Takođe se može meriti u testu oslobađanja 51-hroma. Predstavljena je vrednošću EC50, koja odgovara polovini maksimalne efektivne koncentracije (koncentracija konstrukta antitela koja indukuje citotoksični odgovor na pola puta između bazne linije i maksimuma). Poželjno, EC50vrednost konstrukta bispecifičnih antitela FLT3xCD3 je ≤5000 pM ili ≤4000 pM, poželjnije ≤3000 pM ili ≤2000 pM, još poželjnije ≤1000 pM ili ≤500 pM ili čak poželjnije ≤400 pM ili ≤300 pM, još poželjnije ≤200 pM, još poželjnije ≤100 pM, još poželjnije ≤50 pM, još poželjnije ≤20 pM ili ≤10 pM, a najpoželjnije ≤5 pM.

[0115] Gore navedene vrednosti EC50mogu se meriti u različitim testovima. Stručnjak je svestan da se može očekivati da će vrednost EC50biti niža kada se stimulisane/obogaćene CD8+ T ćelije koriste kao efektorske ćelije, u poređenju sa nestimulisanim PBMC. Štaviše, može se očekivati da su vrednosti EC50niže kada ciljne ćelije eksprimiraju veliki broj ciljnog antigena u poređenju sa pacovima sa niskom ciljnom ekspresijom. Na primer, kada se stimulisane / obogaćene humane CD8+ T ćelije koriste kao efektorske ćelije (i bilo koje FLT3 transficirane ćelije kao što su CHO ćelije ili FLT3 pozitivne humane AML ćelijske linije EOL-1, MOLM-13 i MV4-11 se koriste kao ciljne ćelije), EC50vrednost FLT3 xCD3 konstrukta bispecifičnog antitela je poželjno ≤1000 pM, poželjnije ≤500 pM, još poželjnije ≤250 pM, još poželjnije ≤100 pM, još poželjnije ≤50 pM, još poželjnije ≤10 pM, i najpoželjnije ≤5 pM. Kada se humani PBMC koriste kao efektorske ćelije, EC50vrednost konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 je poželjno ≤5000 pM ili ≤4000 pM (posebno kada su ciljne ćelije FLT3 pozitivne humane AML ćelijske linije EOL-1, MOLM-13 i MV4-11), poželjnije ≤2000 pM (posebno kada su ciljne ćelije FLT3 transficirane ćelije kao što su CHO ćelije), poželjnije ≤1000 pM ili ≤500 pM, još poželjnije ≤200 pM, još poželjnije ≤150 pM, još poželjnije ≤100 pM, i najpoželjnije ≤50 pM, ili niže. Kada se kao efektorske ćelije koristi makaki T ćelijska linija kao što je LnPx4119, a makaki FLT3 transficirana ćelijska linija kao što su CHO ćelije se koristi kao ciljna ćelijska linija, EC50vrednost FLT3 xCD3 konstrukta bispecifičnog antitela je poželjno ≤2000 pM ili ≤1500 pM, poželjnije ≤1000 pM ili ≤500 pM, još poželjnije ≤300 pM ili ≤250 pM, još poželjnije ≤100 pM, i najpoželjnije ≤50 pM.

[0116] Poželjno je da konstrukti FLT3xCD3 bispecifičnih antitela ovog pronalaska ne indukuju / posreduju lizu ili u suštini ne indukuju / posreduju lizu FLT3 negativnih ćelija kao što su CHO ćelije. Termin "ne indukuje lizu", "u suštini ne indukuje lizu", "ne posreduje lizu" ili "ne posreduje u suštini lizu" znači da konstrukt antitela ovog pronalaska ne indukuje ili posreduje lizu od više od 30%, poželjno ne više od 20%, poželjnije ne više od 10%, posebno poželjno ne više od 9%, 8%, 7%, 6% ili 5% FLT3 negativnih ćelija, pri čemu je liza FLT3 pozitivne ćelijske linije humanog karcinoma pluća SHP-77 (vidi gore) postavljena na 100%. Ovo se obično odnosi na koncentracije konstrukta antitela do 500 nM. Kvalifikovana osoba zna kako da izmeri ćelijsku lizu bez daljeg odugovlačenja. Štaviše, ova specifikacija daje specifična uputstva kako meriti ćelijsku lizu.

[0117] Razlika u citotoksičnoj aktivnosti između monomerne i dimerne izoforme pojedinačnih FLT3xCD3 konstrukata bispecifičnih antitela naziva se "razlika u potentnosti". Ova razlika u potentnosti može se npr. izračunati kao odnos između EC50vrednosti monomernog i dimernog oblika molekula, videti Primer 17. Razlike u potentnosti konstrukata bispecifičnih antitela FLT3xCD3 ovog pronalaska su poželjno ≤ 5, poželjnije ≤ 4, još poželjnije ≤ 3, još poželjnije ≤ 2 i najpoželjnije ≤ 1.

[0118] Prvi i/ili drugi (ili bilo koji drugi) vezujući domen(i) konstrukta antitela pronalaska je/su poželjno ukrštene vrste specifične za članove reda sisara primata. Specifični CD3 vezujući domeni su, na primer, opisani u WO 2008/119567. Prema jednom otelotvorenju, prvi i/ili drugi vezujući domen, pored vezivanja za humani FLT3, odnosno humani CD3, će se takođe vezati za FLT3 / CD3 primata, uključujući (ali ne ograničavajući se na) primate novog sveta (kao što su Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus ili Saimiri sciureus), primate

4

starog sveta (kao što su babuni i makaki), gibone, orangutane i ne-humane homininae.

Predviđeno je da se prvi vezujući domen konstrukta antitela pronalaska koji se vezuje za humani FLT3 na površini ciljne ćelije takođe vezuje barem za makaki FLT3, i/ili drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije takođe se vezuje barem za makaki CD3. Poželjni makaki je Macaca fascicularis. Predviđen je i Macaca mulatta (Rhesus).

[0119] U jednom aspektu pronalaska, prvi vezujući domen se vezuje za humani FLT3 i dalje se vezuje za makaki FLT3, kao što je FLT3 Macaca fascicularis, i još poželjnije, za makaki FLT3 eksprimiran na površinskim ćelijama makakija. Poželjni Macaca fascicularis FLT3 je prikazan u SEQ ID NO: 802. Afinitet prvog vezujućeg domena za makaki FLT3 je poželjno ≤15 nM, poželjnije ≤10 nM, još poželjnije ≤5 nM, još poželjnije ≤1 nM, još poželjnije ≤05 nM, još poželjnije ≤0,1 nM, a najpoželjnije ≤0,05 nM ili čak ≤0,01 nM.

[0120] Poželjno je da razlika u afinitetu konstrukata antitela prema pronalasku za vezivanje makaki FLT3 naspram humanog FLT3 [ma FLT3:hu FLT3] (kako je određeno npr. putem BiaCore ili Skačard analize) bude <100, poželjno <20, poželjnije <15, dalje poželjno <10, još poželjnije<8, poželjnije <6 i najpoželjnije <2. Poželjni opsezi za razlike u afinitetu konstrukata antitela prema pronalasku za vezivanje makaki FLT3 naspram humanog FLT3 su između 0,1 i 20, poželjnije između 0,2 i 10, još poželjnije između 0,3 i 6, još poželjnije između 0,5 i 3 ili između 0,5 i 2,5, i najpoželjnije između 0,5 i 2 ili između 0,6 i 2. Pogledajte primere 5.

[0121] U jednom otelotvorenju konstrukta antitela iz pronalaska, drugi vezujući domen se vezuje za humani CD3 epsilon i za Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus ili Saimiri sciureus CD3 epsilon. Poželjno, drugi vezujući domen se vezuje za ekstracelularni epitop ovih CD3 epsilon lanaca. Takođe je predviđeno da se drugi vezujući domen vezuje za ekstracelularni epitop humanog i Macaca CD3 epsilon lanca. Najpoželjniji epitop CD3 epsilon se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1-27 vanćelijskog domena humanog CD3 epsilon. Još preciznije, epitop sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Glu. Callithrix jacchus i Saguinus oedipus su primati novog sveta koji pripadaju porodici Callitrichidae, dok je Saimiri sciureus primat novog sveta koji pripada porodici Cebidae.

[0122] Posebno je poželjno za konstrukt antitela ovog pronalaska da drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije sadrži VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 odabran iz grupe koju čine :

(a) CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 27 iz WO 2008/119567, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 28 iz WO 2008/119567 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 29 u WO 2008/119567;

(b) CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 117 iz WO 2008/119567, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 118 u WO 2008/119567 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 119 u WO 2008/119567; i

(c) CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 153 iz WO 2008/119567, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 154 u WO 2008/119567 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 155 u WO 2008/119567.

[0123] U alternativno poželjnom otelotvorenju konstrukta antitela iz ovog pronalaska, drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije obuhvata VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 izabran iz grupe koju čine:

(a) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 12 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 13 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 14 u WO 2008/119567;

(b) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 30 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 31 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 32 u WO 2008/119567;

(c) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 48 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 49 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 50 u WO 2008/119567;

(d) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 66 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 67 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 68 u WO 2008/119567;

(e) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 84 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 85 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 86 u WO 2008/119567;

(f) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 102 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 103 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 104 u WO 2008/119567;

(g) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 120 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 121 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 122 u WO 2008/119567;

(h) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 138 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 139 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 140 u WO 2008/119567;

(i) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 156 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 157 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 158 u WO 2008/119567; i

(j) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 174 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 175 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 176 u WO 2008/119567.

[0124] Dalje je poželjno za konstrukt antitela ovog pronalaska da drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije sadrži VL region izabran iz grupe koja se sastoji od VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 i SEQ ID NO: 102 (vidi takođe SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 ili 165 u WO 2008/119567).

[0125] Alternativno, poželjno je da drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije obuhvata VH region izabran iz grupe koja se sastoji od VH regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 i SEQ ID NO: 101 (vidi takođe SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 127, 145, 145, 159, 163, 177 ili 181 u WO95/1167).

[0126] Još poželjnije, konstrukt antitela ovog pronalaska karakteriše drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije koja se sastoji od VL regiona i VH regiona izabranog iz grupe koju čine:

[(a) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 17 ili 21 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15 ili 19 iz WO 2008/119567;

4

(b) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 35 ili 39 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 33 ili 37 iz WO 2008/119567;

(c) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 53 ili 57 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 51 ili 55 iz WO 2008/119567;

(d) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 71 ili 75 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 69 ili 73 iz WO 2008/119567;

(e) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 89 ili 93 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 87 ili 91 iz WO 2008/119567;

(f) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 107 ili 111 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 105 ili 109 iz WO 2008/119567;

(g) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 125 ili 129 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 123 ili 127 iz WO 2008/119567;

(h) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 143 ili 147 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 141 ili 145 iz WO 2008/119567;

(i) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 161 ili 165 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 159 ili 163 iz WO 2008/119567; i

(j) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 179 ili 183 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 177 ili 181 iz WO 2008/119567.

[0127] Takođe poželjno u vezi sa konstruktom antitela ovog pronalaska je drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije koja se sastoji od VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 102 i VH regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 101.

[0128] Prema poželjnom otelotvorenju konstrukta antitela iz ovog pronalaska, vezujući domeni i posebno drugi vezujući domen (koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije) imaju sledeći format: parovi VH regiona i VL regiona su u formatu jednolančanog antitela (scFv). VH i VL regioni su raspoređeni po redosledu VH-VL ili VL-VH. Poželjno je da je VH-region pozicioniran na N-terminusu linker sekvence, a VL-region je pozicioniran na C-terminalnom mestu linker sekvence.

[0129] Poželjno otelotvorenje prethodno opisanog konstrukta antitela ovog pronalaska karakteriše drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije koji se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 55, SEQ ID NO : 64, SEQ ID NO : 73, SEQ ID NO : 82, SEQ ID NO : 91, SEQ ID NO : 100 i SEQ ID NO : 103 (vidi takođe SEQ ID NO : 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ili 187 od WO 2008/119567).

[0130] Takođe je predviđeno da konstrukt antitela iz pronalaska ima dodatnu funkciju, pored svoje funkcije da vezuje ciljne molekule FLT3 i CD3. U ovom formatu, konstrukt antitela je trifunkcionalni ili multifunkcionalni konstrukt antitela tako što cilja ciljne ćelije putem vezivanja za FLT3, posreduje citotoksičnu T ćelijsku aktivnost putem vezivanja CD3 i pruža dalju funkciju, kao što je potpuni funkcionalni Fc konstantni domen koji posreduje ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela putem regrutovanja efektorskih ćelija poput NK ćelija, oznake (fluorescentne, itd.), terapeutskog agensa poput toksina ili radionuklida i/ili sredstava za povećanje poluživota u serumu, itd.

[0131] Primeri agensa za produženje serumskog poluživota konstrukta antitela iz pronalaska uključuju peptide, proteine ili domene proteina, koji su fuzionisani ili na drugi način povezani sa konstruktima antitela. Grupa peptida, proteina ili domena proteina uključuje peptide koji se vezuju za druge proteine sa poželjnim farmakokinetičkim profilom u telu čoveka, kao što je serumski albumin (vidite WO 2009/127691). Alternativni koncept takvih peptida koji produžavaju poluživot uključuje peptide koji se vezuju za neonatalni Fc receptor (FcRn, vidite WO 2007/098420), koji takođe mogu da se koriste u konstruktima iz predmetnog pronalaska. Koncept vezivanja većih domena proteina ili kompletnih proteina uključuje npr. fuzionisanje humanog serumskog albumina, varijanti ili mutanta humanog serumskog albumina (vidite WO 2011/051489, WO 2012/059486, WO 2012/150319, WO 2013/135896, WO 2014/072481, WO 2013/075066) ili njegovih domena, kao i fuziju konstantnog regiona imunoglobulina (Fc domena) i njegovih varijanti. Takve varijante Fc domena mogu da se optimizuju/modifikuju kako bi se omogućilo željeno sparivanje dimera ili multimera, kako bi se ukinulo vezivanje Fc receptora (npr. Fcy receptora), ili iz drugih razloga. Dalji koncept poznat u struci za produžavanje poluživota jedinjenja sa malim proteinom u telu čoveka je pegilovanje tih jedinjenja, kao što je konstrukt antitela iz predmetnog pronalaska.

[0132] U poželjnom otelotvorenju, konstrukt antitela prema pronalasku je opisan na sledeći način:

(a) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

4

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799;

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103; i

o po želji His-oznaku, kao što je ona prikazana u SEQ ID NO: 10;

(b) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

● polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO:

4

319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799;

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103;

o po želji peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 104-134; i

o po želji His-oznaku, kao što je ona prikazana u SEQ ID NO: 10;

(c) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu QRFVTGHFGGLX1PANG (SEQ ID NO: 135) pri čemu X1je Y ili H; i

4

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799;

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 137) ili QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 139); i

o po želji His-oznaku, kao što je ona prikazana u SEQ ID NO: 10;

(d) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ

4

ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98, i SEQ ID NO: 101;

peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8;

polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 748, i SEQ ID NO: 798 i serinski ostatak na C-terminusu;

polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 140; i polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO:

4

487, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 527,

SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: 557, SEQ ID NO: 567, SEQ

ID NO: 577, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 607, SEQ ID

NO: 617, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO:

657, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 717,

SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 747, i SEQ ID NO: 797;

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji

od SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ

ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90,

SEQ ID NO: 99, i SEQ ID NO: 102 i serinski ostatak na C-terminusu;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 141;

(e) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji

od SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ

ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO:

89, SEQ ID NO: 98 i SEQ ID NO: 101;

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 748 i SEQ ID NO: 798;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 142; i polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: 557, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 747 i SEQ ID NO: 797;

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 i SEQ ID NO: 102 i serinski ostatak na C-terminusu; [CD3 VL]

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 143;

(f) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

1

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799;

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 i SEQ ID NO: 103; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 144; i polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 145;

(g) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269,

2

SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 146; i polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 147;

(h) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 148; i

polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 149; ili

(i) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629,

4

SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799;

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 150.

(j) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799;

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103;

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9; i

o treći domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 843-850.

[0133] U poželjnom aspektu obelodanjivanja, vezivanje prvog vezujućeg domena za humani FLT3 je smanjeno za FLT3-ligand za ≤25%, poželjno ≤20%, poželjnije ≤15%, dalje poželjno ≤10%, još poželjnije≤8%, poželjnije ≤6% i najpoželjnije ≤2%.

[0134] Kao što je detaljno opisano u Primeru 18, iznenađujuće je utvrđeno da konstrukti koji sadrže FL-53, FL-54, FL-61, F-62, FL-63 i FL-64, koji se svi vezuju za epitopski klaster 3 FLT3, i dalje pokazuju signal vezivanja iznad praga opisanog u Primeru 18, iako to vezivo ima epitop u regionu opisanom za interakciju FLT3-liganda sa FLT3.

[0135] Štaviše, s obzirom na interakciju FLT3 liganda sa regionom klastera epitopa 3, dalje je pretpostavljeno da na vezivo za udaljeniji klaster epitopa, kao što je klaster 1 FLT3, neće uticati konkurencija FLT3 liganda. Međutim, postojao je značajan broj veziva, koji se nisu kvalifikovali za prag od 75%. Vezivo FL-1 do FL-53, FL-55 do FL-60 i FL-65 bilo je u grupi veziva koja nisu osetljiva na konkurenciju liganda FLT3.

[0136] Kao što je prethodno opisano, nekoliko poželjnih konstrukata antitela iz pronalaska modifikovano je fuzijom sa drugim ostatkom, kao što je albumin ili varijante albumina. Ako su ovi fuzioni konstrukti okarakterisani svojim osobinama, kao što je naročito njihov afinitet prema cilju ili citotoksična aktivnost, stručnjak može da očekuje da slični fuzioni konstrukti ili nemodifikovani konstrukti bispecifičnog antitela imaju slična (ili čak bolja) svojstva. Na primer, ako konstrukt bispecifičnog antitela fuzionisan sa albuminom ima primetnu ili željenu citotoksičnu aktivnost ili afinitet prema cilju, može se očekivati da će ista/slična, ili čak i veća citotoksična aktivnost/afinitet prema cilju biti uočeni za isti konstrukt bez albumina.

[0137] Prema drugom poželjnom otelotvorenju, konstrukt bispecifičnog antitela iz pronalaska sadrži (pored dva vezujuća domena) treći domen koji sadrži dva polipeptidna monomera, od kojih svaki sadrži šarku, CH2 i CH3 domen, pri čemu su dva navedena polipeptida (ili polipeptidna monomera) međusobno fuzionisana putem peptidnog linkera. Poželjno je da navedeni treći domen sadrži redom od N- do C-terminusa: šarku-CH2-CH3-linker-šarku-CH2-CH3. Poželjne aminokiselinske sekvence za navedeni treći domen prikazane su u SEQ ID NO: 843-850. Svaki od navedena dva polipeptidna monomera poželjno ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 835-842, ili koja je najmanje 90% identična tim sekvencama. U još jednom poželjnom otelotvorenju, prvi i drugi vezujući domen iz konstrukta bispecifičnog antitela iz pronalaska fuzionisani su sa trećim domenom putem peptidnog linkera koji je, na primer, izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 i 9.

[0138] U skladu sa predmetnim pronalaskom, „šarka“ je region šarke IgG. Ovaj region može da se identifikuje analogno koristeći Kabatovu numeraciju, vidite Kabatove pozicije 223-243. U skladu sa prethodnim, minimalno potrebni za „šarku“ su aminokiselinski ostaci koji odgovaraju delu sekvence IgG1od D231 do P243 prema Kabatovoj numeraciji. Termini CH2 i CH3 odnose se na konstantne regione teškog lanca imunoglobulina 2 i 3. Ti regioni takođe mogu da se identifikuju analogno koristeći Kabatovu numeraciju, vidite Kabatove pozicije 244-360 za CH2 i Kabatove pozicije 361-478 za CH3. Podrazumeva se da postoje određene razlike između imunoglobulina u pogledu njihovog Fc regiona IgG1, Fc regiona IgG2, Fc regiona IgG3, Fc regiona IgG4, Fc regiona IgM, Fc regiona IgA, Fc regiona IgD i Fc regiona IgE (vidite, npr. Padlan, Molecular Immunology, 31(3), 169-217 (1993)). Termin Fc monomer odnosi se na poslednja dva konstantna regiona teškog lanca IgA, IgD i IgG i poslednja tri konstantna regiona teškog lanca IgE i IgM. Fc monomer takođe može da uključuje fleksibilnu šarku koja se nalazi N-terminalno od ovih domena. Za IgA i IgM, Fc monomer može da sadrži J lanac. Za IgG, Fc deo sadrži CH2 i CH3 domene imunoglobulina i šarku između prva dva domena i CH2. Iako granice Fc dela imunoglobulina mogu da se razlikuju, primer za Fc deo teškog lanca humanog IgG koji sadrži funkcionalnu šarku, CH2 i CH3 domen može da se definiše, npr. da sadrži ostatke D231 (domena šarke) do P476 (C-terminusa CH3 domena), odnosno D231 do L476 za IgG4, pri čemu je numeracija prema Kabatu.

[0139] Konstrukt antitela iz pronalaska može stoga da sadrži u smeru od N- do C-terminusa:

(a) prvi vezujući domen;

(b) peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9;

(c) drugi vezujući domen;

(d) peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8 i 9;

(e) prvi polipeptidni monomer trećeg domena (koji sadrži šarku, CH2 i CH3 domen);

(f) peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 852, 853, 854 i 855; i

(g) drugi polipeptidni monomer trećeg domena (koji sadrži šarku, CH2 i CH3 domen).

[0140] Takođe je poželjno da konstrukt antitela iz pronalaska sadrži u smeru od N- do C-terminusa:

● prvi vezujući domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799;

● peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9;

● drugi vezujući domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103 (vidi takođe SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ili 187 iz WO 2008/119567);

● peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8 i 9; i

● treći vezujući domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 843-850.

[0141] U poželjnom otelotvorenju, konstrukt antitela iz predmetnog pronalaska sadrži ili se sastoji od polipeptida prikazanog u SEQ ID NO: 856 do 871.

[0142] U jednom poželjnom otelotvorenju konstrukta antitela pronalaska, konstrukt antitela sadrži ili se sastoji od polipeptida kao što je prikazano u SEQ ID NO: 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868 i 870.

[0143] U jednom alternativno poželjnom otelotvorenju konstrukta antitela pronalaska, konstrukt antitela sadrži ili se sastoji od polipeptida kao što je prikazano u SEQ ID NO: 857, 859, 861, 863, 865, 867, 869 i 871.

[0144] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, konstrukt antitela iz pronalaska, konstrukt antitela sadrži ili se sastoji od polipeptida kao što je prikazano u SEQ ID NO:858, 859, 862, 863, 864 i 865.

[0145] Kovalentne modifikacije konstrukata antitela takođe su obuhvaćene opsegom ovog pronalaska, i uopšteno, ali ne i uvek, vrše se posttranslaciono. Na primer, nekoliko vrsta kovalentnih modifikacija konstrukta antitela je uvedeno u molekul putem reakcije specifičnih aminokiselinskih ostataka konstrukta antitela sa organskim agensom za derivatizaciju koji je sposoban da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili N- ili C-terminalnim ostacima.

[0146] Cisteinil ostaci najčešće reaguju sa α-haloacetatima (i odgovarajućim aminima), poput hlorsirćetne kiseline ili hloracetamida, dajući karboksimetil ili karboksiamidometil derivate. Cisteinil ostaci se takođe derivatizuju reakcijom sa bromtrifluoracetonom, α-brom-β-(5-imidozoil)propionskom kiselinom, hloracetil fosfatom, N-alkil maleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil 2-piridil disulfidom, p-hlormerkuribenzoatom, 2-hlormerkuri-4-nitrizenolom ili hlor-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolom.

[0147] Histidil ostaci se derivatizuju reakcijom sa dietilpirokarbonatom na pH 5,5-7,0, pošto je ovaj agens relativno specifičan za histidil bočni lanac. Para-bromfenacil bromid je takođe koristan; reakcija se poželjno izvodi u 0,1 M natrijum kakodilatu na pH 6,0. Lizinil i amino terminalni ostaci reagiraju sa sukcinskim ili drugim anhidridima karboksilne kiseline. Derivatizacija ovim agensima ima za posledicu preokretanje naelektrisanja lizinil ostataka. Ostali pogodni reagensi za derivatizaciju ostataka koji sadrže alfa-amino grupu uključuju imidoestre, kao što je metil pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; hlorborhidrid; trinitrobenzensulfonsku kiselinu; O-metilizoureju; 2,4-pentandion; i reakciju sa glioksilatom katalizovanu transaminazom.

[0148] Arginil ostaci su modifikovani reakcijom sa jednim ili nekoliko konvencionalnih reagensa, uključujući fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion i ninhidrin. Derivatizacija argininskih ostataka zahteva da se reakcija izvodi u alkalnim uslovima zbog visokog pKa funkcionalne grupe gvanidina. Nadalje, ovi reagensi mogu da reaguju sa grupama lizina kao i sa epsilon-amino grupom arginina.

[0149] Mogu da se naprave specifične modifikacije tirozil ostataka, pri čemu je od naročitog značaja uvođenje spektralnih oznaka u tirozil ostatke putem reakcije sa aromatičnim jedinjenjima diazonijuma ili tetranitrometana. Najčešće se N-acetilimidizol i tetranitrometan koriste za stvaranje O-acetil tirozil vrsta, odnosno 3-nitro derivata. Tirozil ostaci se joduju koristeći<125>I ili<131>I radi pripreme obeleženih proteina za korišćenje u radioimunološkom testu, pri čemu je pogodan prethodno opisani postupak sa hloraminom T.

[0150] Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) selektivno su modifikovane reakcijom sa karbodiimidima (R'-N=C=N--R'), gde su R i R' opciono različite alkil grupe, kao što su 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil) karbodiimid ili 1-etil-3-(4-azonija-4,4-dimetilpentil) karbodiimid. Nadalje, aspartil i glutamil ostaci su pretvoreni u asparaginil i glutaminil ostatke putem reakcije sa jonima amonijaka.

[0151] Derivatizacija sa bifunkcionalnim agensima korisna je za umrežavanje konstrukata antitela iz predmetnog pronalaska sa matricama podloge koje su nerastvorljive u vodi ili površinom radi upotrebe u različitim postupcima. Uobičajeno korišćeni agensi za umrežavanje uključuju, npr. 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidne estre, na primer, estre sa 4-azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalne imidoestre, uključujući disukcinimidil estre kao što je 3,3'-ditiobis(sukcinimidilpropionat) i bifunkcionalne maleimide kao što je bis-N-maleimido-1,8-oktan. Agensi za derivatizaciju, kao što je metil-3-[(pazidizenil)ditio]propioimidat, daju intermedijere koji mogu da se aktiviraju svetlošću koji su sposobni da grade unakrsne veze u prisustvu svetlosti. Alternativno, reaktivne matrice nerastvorljive u vodi, kao što su ugljovodonici aktivirani cijanogen bromidom, i reaktivni supstrati opisani u U.S. pat. br. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440 koriste se za imobilisanje proteina.

[0152] Glutaminil i asparaginil ostaci su često deamidovani do odgovarajućih glutamil, odnosno aspartil ostataka. Alternativno, ovi ostaci su deamidovani u blago kiselim uslovima.

[0153] Ostale modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa ostataka serila ili treonila, metilovanje α-amino grupa bočnih lanaca lizina, arginina i histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, str. 79-86), acetilovanje N-terminalnog amina, i amidaciju bilo koje C-terminalne karboksilne grupe.

[0154] Druga vrsta kovalentne modifikacije konstrukata antitela uključena u opseg ovog pronalaska obuhvata izmenu obrasca glikozilacije proteina. Kao što je poznato u struci, obrasci glikozilacije mogu da zavise od sekvence proteina (npr. prisustvo ili odsustvo određenih aminokiselinskih ostataka za glikozilaciju, razmotreno u nastavku) ili ćelije domaćina ili organizma u kome se protein proizvodi. U nastavku su razmotreni konkretni ekspresioni sistemi.

1

[0155] Glikozilacija polipeptida je obično N-vezana ili O-vezana. N-vezana se odnosi na vezivanje ugljovodoničnog ostatka za bočni lanac asparaginskog ostatka. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, predstavljaju sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljovodoničnog ostatka sa bočnim lancem asparagina. Dakle, prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija odnosi se na vezivanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze za hidroksiaminokiselinu, najčešće serin ili treonin, mada se mogu koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

[0156] Dodavanje mesta glikozilacije u konstrukt antitela se pogodno ostvaruje izmenom aminokiselinske sekvence tako da ona sadrži jednu ili više prethodno opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-vezana mesta glikozilacije). Izmene takođe mogu da se načine dodatkom, ili supstitucijom, jednog ili više serinskih ili treoninskih ostataka u polaznu sekvencu (za O-vezana mesta glikozilacije). Radi jednostavnosti, aminokiselinska sekvenca konstrukta antitela je poželjno izmenjena pomoću promena na nivou DNK, naročito mutacijom DNK koja kodira polipeptid na prethodno izabranim bazama tako da su stvoreni kodoni koji će se prevesti u željene aminokiseline.

[0157] Drugi način za povećanje broja ugljovodoničnih ostataka na konstruktu antitela je putem hemijskog ili enzimskog kuplovanja glikozida sa proteinom. Ovi postupci su korisni po tome što ne zahtevaju proizvodnju proteina u ćeliji domaćinu koja ima sposobnost glikozilacije za N- i O-vezanu glikozilaciju. U zavisnosti od korišćenog načina kuplovanja, šećeri mogu da se vežu za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksilne grupe, (c) slobodne sulfhidrilne grupe kao što su cisteinske, (d) slobodne hidroksilne grupe kao što su serinske, treoninske ili hidroksiprolinske, aromatične ostatke kao što su fenilalanin, tirozin ili triptizan ili (f) amidnu grupu glutamina. Ovi postupci su opisani u WO 87/05330, i u Aplin i Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., str.259-306.

[0158] Uklanjanje ugljovodoničnih ostataka prisutnih na početnom konstruktu antitela može da se ostvari hemijski ili enzimski. Hemijska deglikozilacija zahteva izlaganje proteina jedinjenju trifluormetansulfonske kiseline ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovaj tretman dovodi do cepanja većeg dela šećera, ili svih, osim vezujućeg šećera (N-acetilglukozamin ili N-

2

acetilgalaktozamin), pri čemu polipeptid ostaje netaknut. Hemijsku deglikozilaciju opisali su Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys.259:52 i Edge et al., 1981, Anal. Biochem.

118:131. Enzimsko cepanje ugljovodoničnih ostataka na polipeptidima može da se ostvari upotrebom različitih endo- i egzoglikozidaza, kao što su opisali Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. Glikozilacija na potencijalnim mestima glikozilacije može da se spreči upotrebom jedinjenja tunikamicina, kao što su opisali Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem.

257:3105. Tunikamicin blokira stvaranje proteinskih-N-glikozidnih veza.

[0159] Ostale modifikacije konstrukta antitela su takođe ovde razmotrene. Na primer, druga vrsta kovalentne modifikacije konstrukta antitela obuhvata vezivanje konstrukta antitela sa različitim neproteinskim polimerima, uključujući, bez ograničenja, različite poliole, kao što su polietilen glikol, polipropilen glikol, polioksialkileni, ili kopolimeri polietilen glikola i polipropilen glikola, na način prikazan u U.S. patentima br.4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337. Pored toga, kao što je poznato u struci, aminokiselinske supstitucije mogu da se načine na različitim pozicijama u konstruktu antitela, npr. kako bi se olakšalo dodavanje polimera poput PEG.

[0160] U nekim otelotvorenjima, kovalentne modifikacije konstrukata antitela iz pronalaska obuhvataju adiciju jedne ili više oznaka. Grupa za označavanje može biti kuplovana sa konstruktom antitela putem krakova spejsera različite dužine, kako bi se smanjile potencijalne sterne smetnje. Različiti postupci za obeležavanje proteina su poznati u struci, i mogu da se koriste. Termin „oznaka“ ili „grupa za označavanje“ odnosi se na detektabilnu oznaku. Uopšteno, oznake spadaju u različite klase, u zavisnosti od testa u kome treba da se detektuju - pri čemu sledeći primeri uključuju, ali nisu ograničeni na:

a) izotopske oznake koje mogu biti radioaktivni ili teški izotopi, kao što su radioizotopi ili radionuklidi (npr.<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<89>Zr,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I)

b) magnetne oznake (npr. magnetne čestice)

c) redoks aktivne ostatke

d) optičke boje (uključujući, bez ograničenja, hromofore, fosfore i fluorofore), poput fluorescentnih grupa (npr. FITC, rodamin, lantanid fosfori), hemiluminescentne grupe i fluorofore koji mogu biti „mikromolekularni“ fluorofori ili proteinski fluorofori

e) enzimske grupe (npr. peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza)

f) biotinilovane grupe

g) prethodno utvrđene polipeptidne epitope koje prepoznaje sekundarni reporter (npr. par sekvenci leucinskog zatvarača, mesta vezivanja sekundarnih antitela, metal vezujući domeni, epitopske oznake, itd.)

[0161] Pod „fluorescentnom oznakom“ podrazumeva se bilo koji molekul koji može da se detektuje putem njegovih svojstvenih fluorescentnih karakteristika. Odgovarajuće fluorescentne oznake uključuju, ali nisu ograničene na, fluorescein, rodamin, tetrametilrodamin, eozin, eritrozin, kumarin, metil-kumarine, piren, malahitno zeleno, stilbene, Lucifer žuto, Cascade BlueJ, Teksas crveno, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon zeleno, Alexa-Fluor boje (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade plavo, Cascade žuto i R-fikoeritrin (PE) (molekulske sonde, Eugene, OR), FITC, rodamin i Teksas crveno (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Odgovarajuće optičke boje, uključujući fluorofore, opisane su u Molecular Probes Handbook, autor Richard P. Haugland.

[0162] Odgovarajuće proteinske fluorescentne oznake uključuju, ali nisu ograničene na, zeleni fluorescentni protein, uključujući Renilla, Ptilosarcus ili Aequorea vrste GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank pristupni broj U55762), plavi fluorescentni protein (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Kanada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), pojačani žuti fluorescentni protein (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferazu (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β galaktozidazu (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

85:2603-2607) i Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277,

4

WO99/49019, U.S. patenti br. 5,292,658; 5,418,155; 5,683,888; 5,741,668; 5,777,079; 5,804,387; 5,874,304; 5,876,995; 5,925,558).

[0163] Domeni leucinskog zatvarača su peptidi koji promovišu oligomerizaciju proteina u kojima se nalaze. Leucinski zatvarači su prvobitni identifikovani u nekoliko DNK vezujućih proteina (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), a kasnije su otkriveni u brojnim različitim proteinima. U poznate leucinske zatvarače spadaju prirodni peptidi i njihovi derivati koji se dimerizuju ili trimerizuju. Primeri domena leucinskih zatvarača pogodnih za proizvodnju rastvorljivih oligomernih proteina su opisani u PCT prijavi WO 94/10308, i leucinski zatvarač dobijen od plućnog proteina D surfaktanta (SPD) koji je opisan u Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. Upotreba modifikovanog leucinskog zatvarača koji omogućava stabilnu trimerizaciju heterolognog proteina koji je sa njim fuzionisan opisana je u Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. U jednom pristupu, rekombinantni fuzioni proteini koji sadrže fragment ili derivat FLT3 antitela fuzionisan sa peptidom leucinskog zatvarača eksprimirani su u odgovarajućim ćelijama domaćinima, a rastvorljivi oligomerni fragmenti ili derivati FLT3 antitela koji nastaju izolovani su iz supernatanta kulture.

[0164] Konstrukt antitela iz pronalaska može takođe da sadrži dodatne domene koji su, npr., korisni za izolovanje molekula, ili se odnose na adaptirani farmakokinetički profil molekula. Domeni korisni za izolovanje konstrukta antitela mogu da se izaberu od peptidnih motiva ili sekundarno uvedenih ostataka, koji mogu da se uhvate u postupku izolovanja, npr. na koloni za izolovanje. Neograničavajuća otelotvorenja takvih dodatnih domena sadrže peptidne motive poznate kao Myc-oznaka, HAT-oznaka, HA-oznaka, TAP-oznaka, GST-oznaka, hitinski vezujući domen (CBD-oznaka), maltoza vezujući protein (MBP-oznaka), Flag-oznaka, Strepoznaka i njene varijante (npr. Strepll-oznaka) i His-oznaka. Poželjno je da svi ovde otkriveni konstrukti antitela okarakterisani pomoću identifikovanih CDR-a sadrže domen His-oznake, koji je uopšteno poznat kao ponavljanje uzastopnih His ostataka u aminokiselinskoj sekvenci molekula, poželjno od pet, a poželjnije od šest His ostataka (heksahistidin). His-oznaka može da se nalazi, npr. na N- ili C-terminusu konstrukta antitela, poželjno se nalazi na C-terminusu. Najpoželjnije je da je heksahistidinska oznaka (HHHHHH) (SEQ ID NO:10) vezana peptidnom vezom sa C-terminusom konstrukta antitela prema pronalasku.

[0165] Prvi vezujući domen konstrukta antitela iz predmetnog pronalaska vezuje se za humani FLT3 na površini ciljne ćelije. Aminokiselinske sekvence humanog FLT3 su predstavljene sa SEQ ID NO: 801, 803, 804 i 805. Podrazumeva se da termin „na površini“, u kontekstu predmetnog pronalaska, znači da se vezujući domen specifično vezuje za epitop koji je sadržan u ekstracelularnom domenu FLT3 (FLT3 ECD vidi SEQ ID NO:813), koji je specifično sadržan u regionu kao što je prikazano u SEQ ID NO:819. Prvi vezujući domen prema pronalasku stoga se poželjno vezuje za FLT3 kada je eksprimiran od strane ćelija ili ćelijskih linija koje se prirodno eksprimiraju, i/ili od strane ćelija ili ćelijskih linija transformisanih ili (stabilno/tranzijentno) transficiranih sa FLT3. U poželjnom otelotvorenju, prvi vezujući domen takođe se vezuje za FLT3 kada se FLT3 koristi kao molekul „cilja“ ili „liganda“ u in vitro testu vezivanja poput BIAcore ili Skačardovog testa. „Ciljna ćelija“ može biti bilo koja prokariotska ili eukariotska ćelija koja eksprimira FLT3 na svojoj površini; poželjno, ciljna ćelija je ćelija koja je deo tela čoveka ili životinje, kao što su ćelija raka jajnika, ćelija raka pankreasa, ćelija mezotelioma, ćelija raka pluća, ćelija raka želuca i trostruko negativna ćelija raka dojke.

[0166] Termin „FLT3 ECD“ odnosi se na oblik FLT3 koji je suštinski slobodan od transmembranskih i citoplazmatskih domena FLT3. Stručnjaku će biti jasno da je transmembranski domen identifikovan za polipeptid FLT3 iz predmetnog pronalaska identifikovan u skladu sa kriterijumima koji se rutinski koriste u struci za identifikaciju te vrste hidrofobnog domena. Tačne granice transmembranskog domena mogu da se razlikuju, ali najverovatnije za najviše 5 aminokiselina na bilo kom kraju domena koji je ovde specifično naveden. Poželjni humani FLT3 ECD je prikazan u SEQ ID NO: 813.

[0167] Afinitet prvog vezujućeg domena prema humanom FLT3 je poželjno ≤20 nM, poželjnije ≤10 nM, još poželjnije ≤5 nM, još poželjnije ≤2 nM, još poželjnije ≤1 nM, još poželjnije ≤0,6 nM, još poželjnije ≤0,5 nM, a najpoželjnije ≤0,4 nM. Afinitet može da se izmeri, na primer, u BIAcore testu ili u Skačardovom testu, npr. kako je opisano u primerima. Drugi postupci za određivanje afiniteta takođe su dobro poznati stručnjaku.

[0168] Takođe su razmatrane modifikacije aminokiselinske sekvence ovde opisanih konstrukata antitela. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva konstrukta antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci konstrukata antitela su pripremljene uvođenjem odgovarajućim promena nukleotida u nukleinsku kiselinu konstrukata antitela, ili putem peptidne sinteze. Sve dalje opisane modifikacije aminokiselinske sekvence trebalo bi da daju konstrukt antitela koji i dalje zadržava željenu biološku aktivnost (vezivanje za FLT3 i CD3) nemodifikovanog matičnog molekula.

[0169] Termin „aminokiselina“ ili „aminokiselinski ostatak“ obično se odnosi na aminokiselinu koja ima svoju definiciju poznatu u struci, kao što je aminokiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od: alanina (Ala ili A); arginina (Arg ili R); asparagina (Asn ili N); asparaginske kiseline (Asp ili D); cisteina (Cys ili C); glutamina (Gln ili Q); glutaminske kiseline (Glu ili E); glicina (Gly ili G); histidina (His ili H); izoleucina (He ili I): leucina (Leu ili L); lizina (Lys ili K); metionina (Met ili M); fenilalanina (Phe ili F); prolina (Pro ili P); serina (Ser ili S); treonina (Thr ili T); triptizana (Trp ili W); tirozina (Tyr ili Y); i valina (Val ili V), mada po želji mogu da se koriste i modifikovane, sintetičke ili retke aminokiseline. Uopšteno, aminokiseline mogu da se podele na one koje imaju nepolarni bočni lanac (npr. Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); negativno naelektrisani bočni lanac (npr. Asp, Glu); pozitivno naelektrisani bočni lanac (npr. Arg, His, Lys); ili nenaelektrisani polarni bočni lanac (npr. Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp i Tyr).

[0170] Aminokiselinske modifikacije uključuju, na primer, delecije i/ili insercije i/ili supstitucije ostataka u aminokiselinskoj sekvenci konstrukata antitela. Bilo koja kombinacija delecije, insercije i supstitucije se pravi kako bi se došlo do krajnjeg konstrukta, pod uslovom da krajnji konstrukt ima željene karakteristike. Promene aminokiselina mogu takođe da izmene posttranslacione procese konstrukata antitela, kao što je promena broja ili pozicija mesta glikozilacije.

[0171] Na primer, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselina može da se umetne ili izbaci u svakom od CDR-a (naravno, u zavisnosti od njihove dužine), dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili 25 aminokiselina može da se umetne ili izbaci u svakom od FR-a. Poželjno, insercije aminokiselinskih sekvenci uključuju amino- i/ili karboksi-terminalne fuzije sa dužinom u rasponu od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 sa polipeptidima koji sadrže sto ili više ostataka, kao i insercije unutar sekvence jednog ili više aminokiselinskih ostataka. Inserciona varijanta konstrukta antitela iz pronalaska uključuje fuziju sa N-terminusom ili sa C-terminusom konstrukta antitela enzima ili fuziju sa polipeptidom koja povećava serumski poluživot konstrukta antitela.

[0172] Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju CDR-e teškog i/ili lakog lanca, naročito hipervarijabilne regione, ali se razmatraju i izmene FR u teškom i/ili lakom lancu. Supstitucije su poželjno konzervativne supstitucije kako je ovde opisano.

Poželjno, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselina može biti supstituisano u CDR, dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili 25 aminokiselina može biti supstituisano u regionima okvira (FR), u zavisnosti od dužine CDR ili FR. Na primer, ako sekvenca CDR obuhvata 6 aminokiselina, predviđeno je da su jedna, dve ili tri ove aminokiseline supstituisane. Slično tome, ako CDR sekvenca obuhvata 15 aminokiselina, predviđeno je da su jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest ovih aminokiselina supstituisane.

[0173] Koristan postupak za identifikaciju određenih ostataka ili regiona konstrukata antitela koji su poželjne lokacije za mutagenezu se naziva „ciljana mutageneza sa alaninom“ kao što su opisali Cunningham i Wells u Science, 244: 1081-1085 (1989). Tu se identifikuju ostatak ili grupa ciljnih ostataka u konstruktu antitela (npr. naelektrisani ostaci poput arg, asp, his, lys i glu) i zamenjuju se neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (najpoželjnije alanin ili polialanin) kako bi se uticalo na interakciju aminokiselina sa epitopom.

[0174] Te lokacije aminokiselina, koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije, zatim se obrađuju uvođenjem dodatnih ili drugih varijanti na, ili za, mesta supstitucije. Dakle, dok je mesto ili region za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence unapred određeno, samu prirodu mutacije ne treba unapred odrediti. Na primer, za analizu ili optimizaciju vršenja mutacije na određenom mestu, ciljana mutageneza sa alaninom ili nasumična mutageneza mogu da se obave na ciljnom kodonu ili regionu, i eksprimirane varijante konstrukta antitela se pretražuju za optimalnu kombinaciju željene aktivnosti. Tehnike pravljenja supstitucionih mutacija na prethodno utvrđenim mestima u DNK koja imaju poznatu sekvencu su dobro poznate, na primer, mutageneza M13 prajmera i PCR mutageneza. Skrining mutanata se vrši koristeći testove antigen vezujuće aktivnosti, kao što je vezivanje FLT3 ili CD3.

[0175] Uopšteno, ako su aminokiseline supstituisane u jednom ili više CDR-a ili u svim CDR-ima teškog i/ili lakog lanca, poželjno je da tada dobijena „supstituisana“ sekvenca bude najmanje 60% ili 65%, poželjnije 70% ili 75%, još poželjnije 80% ili 85%, a naročito poželjno 90% ili 95% identična „prvobitnoj“ sekvenci CDR. To znači da od dužine CDR-a zavisi u kojoj meri je identična „supstituisanoj“ sekvenci. Na primer, CDR koji ima 5 aminokiselina je poželjno 80% identičan svojoj supstituisanoj sekvenci kako bi imao najmanje jednu supstituisanu aminokiselinu. Shodno tome, CDR-i konstrukta antitela mogu imati različite stepene identičnosti sa svojim supstituisanim sekvencama, npr. CDRL1 može imati 80%, dok CDRL3 može imati 90%.

[0176] Poželjne supstitucije (ili zamene) su konzervativne supstitucije. Međutim, predviđena je svaka supstitucija (uključujući nekonzervativne supstitucije, ili jednu ili više iz „primera supstitucija“ navedenih u Tabeli 1, dole) sve dok konstrukt antitela zadržava svoju sposobnost da se vezuje za FLT3 preko prvog vezujućeg domena i za CD3 ili CD3 epsilon preko drugog vezujućeg domena i/ili njegovi CDR-i imaju identičnost sa tada supstituisanom sekvencom (najmanje 60% ili 65%, poželjnije 70% ili 75%, još poželjnije 80% ili 85%, a naročito poželjno 90% ili 95% identični „prvobitnoj“ sekvenci CDR).

[0177] Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije“. Ako takve supstitucije dovedu do promene biološke aktivnosti, onda se može uvesti više supstitucionih promena, nazvanih „primeri supstitucija“ u Tabeli 1, ili kako je dalje opisano u pogledu klasa aminokiselina, i proizvodi se ispituju na željene karakteristike.

Tabela 1: Aminokiselinske supstitucije

[0178] Značajne modifikacije bioloških svojstava konstrukta antitela iz predmetnog pronalaska postignute su odabirom supstitucija koje se značajno razlikuju u svom delovanju na održavanje (a) strukture polipeptidnog skeleta u oblasti supstitucije, na primer, kao ravan ili spiralna konformacija, (b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljnom mestu, ili (c) volumena bočnog lanca. Ostaci koji se javljaju u prirodi podeljeni su u grupe na osnovu zajedničkih svojstava bočnog lanca: (1) hidrofobni: norleucin, met, ala, val, leu, ile; (2) neutralni hidrofilni: cys, ser, thr; (3) kiseli: asp, glu; (4) bazni: asn, gln, his, lys, arg; (5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: gly, pro; i (6) aromatični: trp, tyr, phe.

[0179] Nekonzervativne supstitucije podrazumevaju zamenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom. Bilo koji cisteinski ostatak koji nije uključen u održavanje odgovarajuće konformacije konstrukta antitela može biti supstituisan, uopšteno serinom, kako bi se poboljšala oksidaciona stabilnost molekula i sprečilo neispravno umrežavanje. Suprotno tome, antitelu se mogu dodati cisteinske veze da bi se poboljšala njegova stabilnost (naročito kada je antitelo fragment antitela, kao što je fragment Fv).

[0180] Za aminokiselinske sekvence, identičnost sekvence i/ili sličnost se određuje koristeći standardne tehnike koje su poznate u struci, uključujući, bez ograničenja, algoritam za identičnost lokalnih sekvenci čiji su autori Smith i Waterman, 1981, Adv. Appl. Math.2:482, algoritam poravnavanja identiteta sekvence čiji su autori Needleman i Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, postupak traženja sličnosti čiji su autori Pearson i Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad.

Sci. U.S.A. 85:2444, kompjuterizovane implementacije ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u softverskom paketu Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), Best Fit program sekvence čiji su autori Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395, poželjno koristeći zadate postavke, ili inspekcijom. Poželjno, procenat identičnosti se izračunava pomoću FastDB na osnovu sledećih parametara: penal za pogrešno slaganje 1; penal za prazninu 1; penal za veličinu praznine 0,33; i penal za spajanje 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, str.127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

[0181] Primer korisnog algoritma je PILEUP. PILEUP stvara višestruko poravnavanje sekvenci iz grupe srodnih sekvenci koristeći progresivno poravnavanje u parovima. Takođe može da se iscrta grafikon koji pokazuje odnose grupisanja koji se koriste za stvaranje poravnanja. PILEUP koristi pojednostavljenje postupka progresivnog poravnanja čiji su autori Feng i Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360; postupak je sličan onome koji su opisali Higgins i Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. Korisni PILEUP parametri, uključujući zadatu težinu praznine 3,00, zadatu težinu dužine praznine 0,10 i ponderisane krajnje praznine.

[0182] Još jedan primer korisnog algoritma je BLAST algoritam, opisan u: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol.215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res.25:3389-3402; i Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787. Posebno koristan program BLAST je program WU-BLAST-2 koji je preuzet od Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. WU-BLAST-2 koristi nekoliko parametara pretrage, od kojih je većina postavljena na zadate vrednosti. Podesivi parametri su zadati sa sledećim vrednostima: raspon preklapanja = 1, frakcija preklapanja = 0,125, prag reči (T) = II. Parametri HSP S i HSP S2 su dinamičke vrednosti i uspostavlja ih sam program, u zavisnosti od sastava konkretne sekvence i sastava konkretne baze podataka u odnosu na koju se pretražuje sekvenca od interesa; međutim, vrednosti mogu da se prilagode kako bi se povećala osetljivost.

[0183] Dodatni koristan algoritam je BLAST sa prazninama kako su objavili Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. BLAST sa prazninama koristi rezultate supstitucije BLOSUM-62; granični T parametar podešen na 9; postupak sa dva pogotka za aktiviranje ekstenzija bez praznina, dodeljuje dužini praznine k vrednost od 10+k; Xu podešen na 16, i Xg podešen na 40 za fazu pretrage podataka, i na 67 za izlaznu fazu algoritma. Poravnavanja sa prazninama pokreću se rezultatom koji je jednak oko 22 bita.

1

[0184] Uopšteno, aminokiselinska homologost, sličnost ili identičnost između pojedinačnih varijanti CDR su najmanje 60% sa ovde prikazanim sekvencama, a uobičajenije sa poželjno rastućom homologijom ili identičnošću od najmanje 65% ili 70%, poželjnije najmanje 75% ili 80%, još poželjnije najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i skoro 100%. Slično tome, „procenat (%) identičnosti sekvence nukleinske kiseline“ u pogledu sekvence nukleinske kiseline ovde identifikovanih vezujućih proteina definisan je kao procenat nukleotidnih ostataka u kandidatskoj sekvenci koji su identični nukleotidnim ostacima u kodirajućoj sekvenci konstrukta antitela. Specifični postupak koristi BLASTN modul WU-BLAST-2 podešen na zadate parametre, sa rasponom preklapanja i frakcijom preklapanja podešenim na 1, odnosno 0,125.

[0185] Uopšteno, homologost, sličnost ili identičnost sekvence nukleinske kiseline između nukleotidnih sekvenci koje kodiraju pojedinačne varijante CDR i ovde prikazane nukleotidne sekvence je najmanje 60%, a uobičajenije sa poželjno rastućom homologijom ili identičnošću od najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% i skoro 100%. Prema tome, „varijanta CDR“ je ona sa naznačenom homologijom, sličnošću ili identičnošću sa matičnim CDR iz pronalaska, i deli biološku funkciju, uključujući, bez ograničenja, najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% specifičnosti i/ili aktivnosti matičnog CDR.

[0186] U jednom otelotvorenju, procenat identičnosti sa humanom germinativnom linijom konstrukata antitela prema pronalasku je ≥ 70% ili ≥ 75%, poželjnije ≥ 80% ili ≥ 85%, još poželjnije ≥ 90%, i najpoželjnije ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95% ili čak ≥ 96%. Vidite primer 8. Smatra se da je identičnost sa proizvodima gena germinativne linije humanog antitela značajna karakteristika za smanjenje rizika da terapeutski proteini izazovu imunski odgovor na lek kod pacijenta tokom lečenja. Hwang i Foote ("Immunogenicity iz engineered antibodies"; Methods 36 (2005) 3-10) pokazuju da smanjenje nehumanih delova konstrukta antitela za lek dovodi do smanjenja rizika od indukcije antitela na lek kod pacijenata tokom lečenja. Poređenjem iscrpnog broja klinički procenjenih antitela kao lekova i odgovarajućih podataka o imunogenosti, prikazan je trend da humanizacija V-regiona antitela čini protein manje imunogenim (prosečno 5,1% pacijenata) nego antitela koja imaju neizmenjene nehumane V regione (prosečno 23,59% pacijenata). Zato je za proteinske lekove na bazi V-regiona u obliku

2

konstrukata antitela poželjan veći stepen identičnosti sa humanim sekvencama. U svrhu utvrđivanja identičnosti germinativne linije, V regioni VL mogu da se poravnaju sa aminokiselinskim sekvencama V segmenata i J segmenata humane germinativne linije (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) koristeći softver Vector NTI i aminokiselinsku sekvencu izračunatu deljenjem identičnih aminokiselinskih ostataka ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka VL kao procenat. Isto može biti i za VH segmente (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), s tim što se CDR3 VH može usled njegove velike raznolikosti i nedostatka postojećih partnera za poravnanje CDR3 VH humane germinativne linije. Rekombinantne tehnike onda mogu da se koriste za povećanje identičnosti sekvence sa genima germinativne linije humanog antitela.

[0187] U daljem otelotvorenju, konstrukti bispecifičnog antitela iz predmetnog pronalaska ispoljavaju velike prinose monomera u standardnom obimu istraživanja, npr. u standardnom procesu prečišćavanja u dva koraka. Poželjno je da je prinos monomera konstrukata antitela prema pronalasku ≥ 0,25 mg/l supernatanta, poželjnije ≥ 0,5 mg/l, još poželjnije ≥ 1 mg/l, a najpoželjnije ≥ 3 mg/l supernatanta.

[0188] Isto tako, prinos dimernih izooblika konstrukata antitela, te tako i procenat monomera (tj. monomer: (monomer+dimer)) konstrukata antitela može da se odredi. Produktivnost monomernih i dimernih konstrukata antitela i izračunati procenat monomera mogu, npr., da se dobiju u koraku prečišćavanja putem SEC supernatanta kulture iz standardizovane proizvodnje u istraživačkom obimu u obrtnim bocama. U jednom otelotvorenju, procenat monomera konstrukata antitela je ≥ 80%, poželjnije ≥ 85%, još poželjnije ≥ 90%, a najpoželjnije ≥ 95%.

[0189] U jednom otelotvorenju, konstrukti antitela imaju poželjnu stabilnost u plazmi (odnos EC50 sa plazmom i EC50 bez plazme) od ≤ 5 ili ≤ 4, poželjnije ≤ 3,5 ili ≤ 3, još poželjnije ≤ 2,5 ili ≤ 2, a najpoželjnije ≤ 1,5 ili ≤ 1. Stabilnost konstrukata antitela u plazmi može da se testira inkubacijom konstrukta u humanoj plazmi na 37°C tokom 24 sata, nakon čega sledi određivanje EC50 u testu citotoksičnosti sa otpuštanjem 51-hroma. Efektorske ćelije u testu citotoksičnosti mogu da se stimulišu obogaćenim humanim CD8 pozitivnim T ćelijama. Ciljne ćelije mogu npr. biti CHO ćelije transficirane humanim FLT3. Odnos efektorske i ciljne ćelije (E:T) može se odabrati da bude 10:1. Fond humane plazme koji se koristi u tu svrhu potiče iz krvi zdravih davalaca koja je prikupljena špricevima obloženim sa EDTA. Ćelijske komponente su uklonjene centrifugiranjem, i gornja faza plazme je sakupljena i zatim objedinjena. Kao kontrola, konstrukti antitela su razblaženi neposredno pre testa citotoksičnosti u RPMI-1640 medijumu. Stabilnost u plazmi se izračunava kao odnos EC50 (nakon inkubacije plazme) i EC50 (kontrola). Vidite primer 13.

[0190] Dalje je poželjno da je konverzija monomera u dimer konstrukata antitela iz pronalaska mala. Konverzija može da se izmeri pod različitim uslovima, i analizira se hromatografijom visokih performansi na molekulskim sitima. Vidite primer 11. Na primer, inkubacija monomernih izooblika konstrukata antitela može da se obavlja tokom 7 dana na 37°C i pri koncentraciji od, npr.100 µg/ml ili 250 µg/ml u inkubatoru. Pod ovim uslovima, poželjno je da konstrukti antitela iz pronalaska pokazuju procenat dimera koji je ≤5%, poželjnije ≤4%, još poželjnije ≤3%, još poželjnije ≤2,5%, još poželjnije ≤2% , još poželjnije ≤1,5%, a najpoželjnije ≤1% ili ≤0,5% ili čak 0%.

[0191] Takođe je poželjno da konstrukti bispecifičnog antitela iz predmetnog pronalaska pokazuju veoma malu konverziju dimera nakon više ciklusa zamrzavanja/otapanja. Na primer, monomer konstrukta antitela je podešen na koncentraciju od 250 µg/ml, npr. u puferu za generičku formulaciju, i prolazi tri ciklusa zamrzavanja/otapanja (zamrzavanje na -80°C tokom 30 minuta, zatim otapanje tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi), nakon čega sledi SEC visokih performansi radi utvrđivanja procenta prvobitno monomernih konstrukta antitela koji su konvertovani u dimerni konstrukt antitela. Poželjno, procenti dimera konstrukta bispecifičnog antitela su ≤5%, poželjnije ≤4%, još poželjnije ≤3%, još poželjnije ≤2,5%, još poželjnije ≤2%, još poželjnije ≤1,5%, a najpoželjnije ≤1% ili čak ≤0,5%, na primer nakon tri ciklusa zamrzavanja/otapanja.

[0192] Konstrukti bispecifičnog antitela iz predmetnog pronalaska poželjno pokazuju povoljnu termostabilnost sa temperaturom agregacije ≥45°C ili ≥50°C, poželjnije ≥52°C ili ≥54°C, još poželjnije ≥56°C ili ≥57°C, a najpoželjnije ≥58°C ili ≥59°C. Parametar termostabilnosti može da se odredi u pogledu temperature agregacije antitela na sledeći način: Rastvor antitela u koncentraciji od 250 µg/ml prenet je u kivetu za jednokratnu upotrebu i stavljen u uređaj za dinamičko rasipanje svetlosti (DLS). Uzorak je zagrevan od 40°C do 70°C brzinom zagrevanja od 0,5°C/min sa konstantnom akvizicijom merenog radijusa. Povećanje radijusa koje ukazuje na topljenje proteina i agregaciju koristi se za izračunavanje temperature agregacije antitela. Vidite primer 12.

4

[0193] Alternativno, krive temperature topljenja mogu da se odrede diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC) kako bi se utvrdila suštinska biofizička stabilnost proteina konstrukata antitela. Ovi eksperimenti se izvode pomoću VP-DSC uređaja MicroCal LLC (Northampton, MA, U.S.A). Preuzimanje energije uzorka koji sadrži konstrukt antitela je zabeleženo od 20°C do 90°C u poređenju sa uzorkom koji sadrži samo pufer za formulaciju. Konstrukti antitela su podešeni do finalne koncentracije od 250 µg/ml, npr. u radnom puferu za SEC. Za beleženje odgovarajuće krive topljenja, ukupna temperatura uzorka je postepeno povećavana. Pri svakoj temperaturi T beleži se preuzimanje energije uzorka i referenca pufera za formulaciju. Razlika u preuzimanju energije Cp (kcal/mol/°C) uzorka umanjena za referencu se prikazuje u odnosu na odgovarajuću temperaturu. Temperatura topljenja je definisana kao temperatura na prvom maksimumu preuzimanja energije.

[0194] Dalje je predviđeno da FLT3xCD3 konstrukti bispecifičnog antitela iz pronalaska ne reaguju unakrsno (tj. suštinski se ne vezuju za) sa paralozima humanog FLT3 KIT v1 (SEQ ID NO:805), CSF1R v1 (SEQ ID NO: 806), PDGFRA (SEQ ID NO: 807), i/ili NTM v3 (SEQ ID NO: 808). Nadalje, predviđeno je da FLT3xCD3 konstrukti bispecifičnog antitela iz pronalaska ne reaguju unakrsno (tj. suštinski se ne vezuje za njih) sa FLT3 paralozima KIT v1, CSF1R v1, PDGFRA i/ili NTM v3 makaki majmuna/cinomolgusa. Vidite primer 7.

[0195] Takođe je predviđeno da FLT3xCD3 konstrukti bispecifičnog antitela iz pronalaska imaju zamućenost (kako se meri pomoću OD340 nakon koncentrovanja prečišćenog monomernog konstrukta antitela do 2,5 mg/ml i inkubacije preko noći) ≤ 0,2, poželjno ≤ 0,15, poželjnije ≤ 0,12, još poželjnije ≤ 0,1, a najpoželjnije ≤ 0,08. Vidite primer 14.

[0196] U daljem otelotvorenju, konstrukt antitela prema pronalasku je pri stabilnom kiselom pH. Što se konstrukt antitela tolerantnije ponaša pri nefiziološkom pH, kao što je pH 5,5 (pH potreban za pokretanje npr. hromatografije sa razmenom katjona), veće je rekuperovanje konstrukta antitela eluiranog iz jonoizmenjivačke kolone u odnosu na ukupnu količinu nanetog proteina. Izolovanje konstrukta antitela iz jonoizmenjivačke kolone (npr. katjonske) pri pH 5,5 je poželjno ≥ 30%, poželjnije ≥ 40%, poželjnije ≥ 50%, još poželjnije ≥ 60%, još poželjnije ≥ 70%, još poželjnije ≥ 80%, još poželjnije ≥ 90%, još poželjnije ≥ 95%, a najpoželjnije ≥ 99%. Vidite primer 15.

[0197] Dalje je predviđeno da konstrukti bispecifičnog antitela iz predmetnog pronalaska ispoljavaju terapeutsku efikasnost ili antitumorsku aktivnost. To može npr. da se proceni u studiji kako je otkriveno u sledećem primeru modela ksenografta uznapredovalog humanog tumora:

Prvog dana studije, 5x10<6>ćelija humane FLT3 pozitivne ćelijske linije kancera (npr. OVCAR-8) supkutano je injektovano u desni dorzalni bok ženke NOD/SCID miša. Kada srednja zapremina tumora dostigne oko 100 mm<3>, in vitro ekspandirane CD3 pozitivne T ćelije su transplantirane u miševe injekcijom oko 2x10<7>ćelija u peritonealnu šupljinu životinja. Miševi iz kontrolne grupe sa vehikulumom 1 ne dobijaju efektorske ćelije, i koriste se kao netransplantirana kontrola za poređenje sa kontrolnom grupom sa vehikulumom 2 (koja dobija efektorske ćelije) kako bi se pratio uticaj samo T ćelija na rast tumora. Lečenje antitelom počinje kada srednja zapremina tumora dostigne oko 200 mm<3>. Srednja veličina tumora iz svake tretirane grupe na dan početka lečenja ne treba statistički da se razlikuje od bilo koje druge grupe (analiza varijanse). Miševi se leče sa 0,5 mg/kg/dan FLT3xCD3 bispecifičnog konstrukta antitela putem intravenske bolusne injekcije tokom oko 15 do 20 dana. Tumori su mereni kljunastim merilom tokom studije, i napredak je praćen poređenjem zapremina tumora (TV) unutar grupe. Inhibicija rasta tumora T/C [%] određuje se izračunavanjem TV kao T/C% = 100 x (medijana TV analizirane grupe) / (medijana TV kontrolne grupe 2).

[0198] Stručnjak zna kako da modifikuje ili prilagodi određene parametre ove studije, kao što je broj injektovanih tumorskih ćelija, mesto injekcije, broj transplantiranih humanih T ćelija, količina konstrukta bispecifičnog antitela koja treba da se primeni i vremena, pri čemu se dobija značajan i reproduktivan rezultat. Poželjno, inhibicija rasta tumora T/C [%] je ≤ 70 ili ≤ 60, poželjnije ≤ 50 ili ≤ 40, još poželjnije ≤ 30 ili ≤ 20, a najpoželjnije ≤ 10 ili ≤ 5 ili čak ≤ 2,5.

[0199] Pronalazak dalje obezbeđuje polinukleotid/molekul nukleinske kiseline koji kodira konstrukt antitela iz pronalaska.

[0200] Polinukleotid je biopolimer sastavljen od 13 ili više nukleotidnih monomera kovalentno vezanih u lanac. DNK (kao što je kDNK) i RNK (kao što je iRNK) primeri su polinukleotida sa specifičnom biološkom funkcijom. Nukleotidi su organski molekuli koji služe kao monomeri ili podjedinice molekula nukleinske kiseline poput DNK ili RNK. Molekul nukleinske kiseline ili polinukleotid mogu biti dvolančani i jednolančani, linearni i kružni. Poželjno se nalazi u vektoru koji se poželjno nalazi u ćeliji domaćinu. Navedena ćelija domaćin je, npr. nakon transformacije ili transfekcije vektorom ili polinukleotidom iz pronalaska, sposobna da eksprimira konstrukt antitela. U tu svrhu, molekul polinukleotida ili nukleinske kiseline operativno je povezan sa kontrolnim sekvencama.

[0201] Genetski kod je skup pravila po kojima se informacije kodirane u genetskom materijalu (nukleinske kiseline) prevode u proteine. Biološko dekodiranje u živim ćelijama postiže se ribozomom koji povezuje aminokiseline redosledom koji određuje iRNK, koristeći molekule tRNK za prenos aminokiselina i čitanje iRNK tri po tri nukleotida. Kôd definiše kako sekvence ovih tripleta nukleotida, koje se nazivaju kodoni, određuju koje aminokiseline će se dodati sledeće tokom sinteze proteina. Uz neke izuzetke, kodon od tri nukleotida u sekvenci nukleinske kiseline određuje jednu aminokiselinu. Budući da je velika većina gena kodirana potpuno istim kodom, ovaj određeni kod se često naziva kanonskim ili standardnim genetskim kodom. Iako genetski kod određuje sekvencu proteina za dati kodirajući region, drugi genomski regioni mogu da utiču na to kada i gde se ovi proteini proizvode.

[0202] Nadalje, pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži polinukleotid/molekul nukleinske kiseline iz pronalaska.

[0203] Vektor je molekul nukleinske kiseline koji se koristi kao vehikulum za prenos (stranog) genetskog materijala u ćeliju. Termin „vektor“ obuhvata, ali nije ograničen na, plazmide, viruse, kozmide i veštačke hromozome. Uopšteno, konstruisani vektori sadrže mesto replikacije, mesto multikloniranja i selektabilni marker. Sam vektor je uglavnom nukleotidna sekvenca, obično sekvenca DNK, koja sadrži umetak (transgen) i veću sekvencu koja služi kao

„skelet“ vektora. Moderni vektori mogu da obuhvataju dodatne karakteristike osim umetnutog transgena i skeleta: promoter, genetski marker, otpornost na antibiotike, reporterski gen, ciljajuću sekvencu, oznaku za prečišćavanje proteina. Vektori koji se nazivaju ekspresioni vektori (ekspresioni konstrukti) specifično su namenjeni ekspresiji transgena u ciljnoj ćeliji, i uopšteno imaju kontrolne sekvence.

[0204] Termin „kontrolne sekvence“ odnosi se na sekvence DNK koje su neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u konkretnom organizmu domaćinu. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promoter, po izboru operativnu sekvencu i mesto vezivanja ribozoma. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotore, signale poliadenilacije i pojačivače.

[0205] Nukleinska kiselina je „operativno povezana“ kada uđe u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za predsekvencu ili sekretorni lider je operativno povezan sa DNK radi polipeptida koji, ako je eksprimiran kao pretprotein, učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je pozicionirano tako da olakšava translaciju. Generalno, „operativno povezano“ znači da su sekvence DNK koje su povezane uzastopne, i u slučaju sekretornog lidera, uzastopne i u fazi čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju da budu uzastopni. Povezivanje se postiže ligacijom na prikladnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri u skladu s uobičajenom praksom.

[0206] „Transfekcija“ je proces namernog uvođenja molekula nukleinske kiseline ili polinukleotida (uključujući vektore) u ciljne ćelije. Termin se uglavnom koristi za nevirusne postupke u eukariotskim ćelijama. Transdukcija se često koristi za opisivanje virusom posredovanog transfera molekula nukleinske kiseline ili polinukleotida. Transfekcija životinjskih ćelija obično uključuje otvaranje prolaznih pora ili „rupa“ na ćelijskoj membrani, kako bi se omogućilo preuzimanje materijala. Transfekcija može da se obavi koristeći kalcijum fosfat, putem elektroporacije, putem stezanja ćelija ili putem mešanja katjonskog lipida sa materijalom za proizvodnju lipozoma, koji se fuzioniše sa ćelijskom membranom i ostavlja svoj tovar unutra.

[0207] Termin „transformacija“ se koristi da se opiše nevirusni transfer molekula nukleinske kiseline ili polinukleotida (uključujući vektore) u bakterije, a takođe i u neživotinjske eukariotske ćelije, uključujući ćelije biljaka. Transformacija je stoga genetska alteracija bakterijske ili neživotinjske eukariotske ćelije usled neposrednog preuzimanja kroz ćelijske membrane iz njihovog okruženja i naknadne inkorporacije egzogenog genetskog materijala (molekuli nukleinske kiseline). Transformacija može da se izvrši veštačkim putem. Da bi došlo do transformacije, ćelije ili bakterije moraju biti u stanju konkurentnosti, koje može da se javi kao vremenski ograničeni odgovor na uslove okruženja kao što su izgladnjivanje i gustina ćelija.

[0208] Štaviše, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina transformisanu ili transficiranu polinukleotidom/molekulom nukleinske kiseline ili vektorom iz pronalaska.

[0209] Kako se ovde koriste, termini „ćelija domaćin“ ili „ćelija primalac“ treba da uključuju bilo koju pojedinačnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja može biti ili je bila primalac vektora, egzogenih molekula nukleinske kiseline i polinukleotida koji kodiraju konstrukt antitela iz predmetnog pronalaska; i/ili primalac samog konstrukta antitela. Uvođenje odgovarajućeg materijala u ćeliju vrši se transformacijom, transfekcijom, i slično. Termin „ćelija domaćin“ takođe treba da uključuje potomstvo ili potencijalno potomstvo pojedinačne ćelije. Budući da određene modifikacije mogu da se jave u sledećim generacijama usled prirodne, slučajne ili namerne mutacije ili usled uticaja okruženja, takvo potomstvo zapravo ne mora biti u potpunosti identično (morfološki ili genomski ili po ukupnom komplementu DNK) matičnoj ćeliji, ali je i dalje obuhvaćeno terminom kako se ovde koristi. Odgovarajuće ćelije domaćini uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, a takođe uključuju, ali nisu ograničene na, bakterije, ćelije kvasca, ćelije gljiva, biljne ćelije i životinjske ćelije, kao što su ćelije insekata i ćelije sisara, npr. miša, pacova, makaki majmuna ili čoveka.

[0210] Konstrukt antitela iz pronalaska može da se proizvede u bakterijama. Nakon ekspresije, konstrukt antitela iz pronalaska je izolovan iz paste ćelija E. coli u rastvorljivoj frakciji i može da se prečisti, npr. pomoću afinitetne hromatografije i/ili molekulskih sita. Konačno prečišćavanje može se izvesti slično postupku za prečišćavanje antitela eksprimiranih npr. u CHO ćelijama.

[0211] Pored prokariota, eukariotski mikrobi poput filamentoznih gljiva ili kvasca su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju za konstrukt antitela iz pronalaska. Saccharomyces cerevisiae, ili obični pekarski kvasac, najčešće se koristi od nižih eukariotskih mikroorganizama domaćina. Međutim, ovde su uobičajeno dostupni i korisni brojni drugi rodovi, vrste i sojevi, kao što su Schizosaccharomyces pombe, domaćini Kluyveromyces kao što su K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans, i K. marxianus; yarrowia (EP 402 226); Pichia pastoris (EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces kao što je Schwanniomyces occidentalis;, i filamentozne gljive kao što su Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, i domaćini Aspergillus kao što su A. nidulans i A. niger.

[0212] Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog konstrukta antitela iz pronalaska dobijene su iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi i varijante bakulovirusa i odgovarajuće permisivne ćelije domaćini insekata domaćina kao što su Spodoptera frugiperda (gusenica), Aedes aegypti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (vinska mušica) i Bombyx mori. Javno su dostupni različiti sojevi virusa za transfekciju, npr. L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, i takvi virusi mogu da se koriste naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.

[0213] Kao domaćini mogu da se koristi i biljne ćelijske kulture pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza, arabidopsis i duvana. Stručnjacima su poznati klonirajući i ekspresioni vektori korisni u proizvodnji proteina u ćelijskoj kulturi biljaka. Vidite npr. Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750, i Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

[0214] Međutim, najveće interesovanje je postojalo za ćelije kičmenjaka, i propagacija ćelija kičmenjaka u kulturi (kulturi tkiva) postala je rutinska procedura. Primeri za korisne ćelijske linije domaćina sisara su linija bubrega majmuna CV1 transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linija bubrega humanog embriona (293 ili 293 ćelije potklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham et al. J. Gen Virol.36: 59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); sertolijeve ćelije miša (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CVI ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL1587); ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije bubrega psa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane ćelije pluća (W138, ATCC CCL 75); humane ćelije jetre (Hep G2,1413 8065); mišji tumor dojke (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija humanog hepatoma (Hep G2).

[0215] U daljem otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje proces za proizvodnju konstrukta antitela iz pronalaska, pri čemu navedeni proces obuhvata uzgajanje ćelije domaćina iz pronalaska u uslovima koji omogućavaju ekspresiju konstrukta antitela iz pronalaska i izolovanje proizvedenog konstrukta antitela iz kulture.

[0216] Kako se ovde koristi, termin „uzgajanje“ odnosi se na in vitro održavanje, diferencijaciju, rast, proliferaciju i/ili propagaciju ćelija u odgovarajućim uslovima u medijumu. Termin „ekspresija“ obuhvata bilo koji korak uključen u proizvodnju konstrukta antitela iz pronalaska, uključujući, bez ograničenja, transkripciju, posttranskripcionu modifikaciju, translaciju, posttranslacionu modifikaciju i sekreciju.

[0217] Kada se koriste rekombinantne tehnike, konstrukt antitela može da se proizvede intracelularno, u periplazmatičnom prostoru, ili da se neposredno luči u medijum. Ako se konstrukt antitela proizvodi intracelularno, kao prvi korak, uklonjeni su određeni ostaci, bilo ćelije domaćini ili lizirani fragmenti, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) opisuju proceduru za izolovanje antitela koja su izlučena u periplazmatični prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta je odmrznuta u prisustvu natrijum acetata (pH 3,5), EDTA i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 min. Ćelijski ostaci mogu da se uklone centrifugiranjem. Kada se antitelo izlučuje u medijum, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema se uopšteno prvo koncentruju koristeći komercijalno dostupni filter za koncentrovanje proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon jedinice za ultrafiltraciju. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka za inhibiciju proteolize, a antibiotici mogu biti uključeni kako bi se sprečio rast sporednih zagađivača.

[0218] Konstrukt antitela iz pronalaska pripremljen iz ćelija domaćina može da se izoluje ili prečisti koristeći, na primer, hidroksilapatitnu hromatografiju, gel elektroforezu, dijalizu i afinitetnu hromatografiju. Ostale tehnike za prečišćavanje proteina, kao što su frakcionisanje na jonoizmenjivačkoj koloni, taloženje etanolom, reversno fazna HPLC, hromatografija na silika gelu, hromatografija na heparin SEPHAROSE™, hromatografija na anjonskoj ili katjonskoj izmenjivačkoj smoli (kao što je kolona sa poliasparaginskom kiselinom), hromatofokusiranje, SDS-PAGE i taloženje amonijum sulfatom, takođe su dostupne u zavisnosti od antitela koje treba da se izoluje. Kada konstrukt antitela iz pronalaska sadrži CH3 domen, smola Bakerbond ABX (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) korisna je za prečišćavanje.

[0219] Afinitetna hromatografija je poželjna tehnika prečišćavanja. Matrica za koju je vezan afinitetni ligand je najčešće agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne

1

matrice, kao što je staklo sa kontrolisanim porama ili poli (stirendivinil) benzen, omogućavaju veći protok i kraće vreme obrade nego što se može postići sa agarozom.

[0220] Štaviše, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konstrukt antitela iz pronalaska ili konstrukt antitela proizveden prema postupku iz pronalaska. Poželjno je za farmaceutsku kompoziciju pronalaska da homogenost konstrukta antitela bude ≥ 80%, poželjnije ≥ 81%, ≥ 82%, ≥ 83%, ≥ 84%, ili ≥ 85%, dalje poželjno ≥ 86% , ≥87%, ≥88%, ≥89%, ili ≥90%, još poželjnije, ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ili ≥95% i najpoželjnije ≥96%,≥ 97%, ≥ 98% ili ≥ 99%.

[0221] Kako se ovde koristi, termin „farmaceutska kompozicija“ odnosi se na kompoziciju koja je pogodna za primenu na pacijentu, poželjno na ljudskom pacijentu. Naročito poželjna farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska sadrži jedan ili više konstrukata antitela iz pronalaska, poželjno u terapeutski delotvornoj količini. Farmaceutska kompozicija poželjno dalje sadrži odgovarajuće formulacije jednog ili više (farmaceutski delotvornih) nosača, stabilizatora, ekscipijenasa, razblaživača, solubilizatora, surfaktanata, emulgatora, konzervanasa i/ili adjuvanasa. Prihvatljivi sastojci kompozicije su poželjno netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama. Farmaceutske kompozicije iz pronalaska uključuju, ali nisu ograničene na, tečne, zamrznute i liofilizovane kompozicije.

[0222] Kompozicije iz pronalaska mogu da sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač. Uopšteno, kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač“ označava bilo koji ili sve vodene i nevodene rastvore, sterilne rastvore, rastvarače, pufere, npr. fiziološki rastvor puferovanog fosfatom (PBS), vodu, suspenzije, emulzije, kao što su emulzije ulje/voda, različite vrste kvašljivaca, lipozome, medijume za disperziju i premaze, kompatibilne sa farmaceutskom primenom, naročito sa parenteralnom primenom. Upotreba takvih medijuma i agensa u farmaceutskim kompozicijama dobro je poznata u struci, i kompozicije koje sadrže takve nosače mogu da se formulišu pomoću poznatih konvencionalnih postupaka.

[0223] Određena otelotvorenja obezbeđuju farmaceutske kompozicije koje sadrže konstrukt antitela iz pronalaska i dodatno jedan ili više ekscipijenasa, kao što su oni ilustrativno opisani u ovom odeljku i u drugim delovima ovog teksta. Ekscipijensi mogu da se koriste u pronalasku u ovom pogledu u brojne različite svrhe, kao što je podešavanje fizičkih, hemijskih ili bioloških svojstava formulacija, kao što je podešavanje viskoziteta, i/ili u procesima iz pronalaska za

2

poboljšanje delotvornosti ili za stabilizaciju takvih formulacija i procesa od propadanja i kvarenja usled, na primer, stresa koji se javlja tokom proizvodnje, transporta, skladištenja, pripreme pre upotrebe, primene, i posle toga.

[0224] U određenim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija može da sadrži supstance za formulaciju u svrhu modifikacije, održavanja ili očuvanja, npr. pH, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili otpuštanja, adsorpcije ili penetracije kompozicije (vidite REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. izdanje, (A.R. Genrmo, izd.), 1990, Mack Publishing Company). U takvim otelotvorenjima, odgovarajuće supstance za formulaciju mogu da uključuju, ali nisu ograničene na:

● aminokiseline, kao što je glicin, alanin, glutamin, asparagin, treonin, prolin, 2-fenilalanin, uključujući naelektrisane aminokiseline, poželjno lizin, lizin acetat, arginin, glutamat i/ili histidin

● antimikrobne agense, kao što su antibakterijski i antimikotični agensi

● antioksidante, kao što su askorbinska kiselina, metionin, natrijum sulfit ili natrijum hidrogensulfit;

● pufere, puferske sisteme i puferujuće agense koji se koriste za održavanje kompozicije na fiziološkom pH ili malo nižem pH, obično u rasponu pH od oko 5 do oko 8 ili 9; primeri za pufere su borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline, sukcinat, fosfat, histidin i acetat; na primer Tris pufer sa pH oko 7,0-8,5 ili acetatni pufer sa pH oko 4,0-5,5;

● nevodene rastvarače, kao što su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje, i injektabilne organske estre, kao što je etil oleat;

● vodene nosače, uključujući vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferovane medijume;

biorazgradive polimere, kao što su poliestri;

punioce, kao što su manitol ili glicin;

helirajuće agense, kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA);

izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije;

agense za kompleksiranje, kao što su kafein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin)

punioce;

monosaharide; disaharide; i druge ugljene hidrate (poput glukoze, manoze ili dekstrina); ugljeni hidrati mogu biti neredukujući šećeri, poželjno trehaloza, saharoza, oktasulfat, sorbitol ili ksilitol;

proteine (male molekulske mase), polipeptide ili proteinske nosače, kao što su humani ili goveđi serumski albumin, želatin ili imunoglobulini, poželjno ljudskog porekla;

boje i arome;

redukujuće agense koji sadrže sumpor, kao što su glutation, tioktinska kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol i natrijum tiosulfat

razblaživače;

emulgatore;

hidrofilne polimere poput polivinilpirolidona)

kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum;

4

konzervanse, kao što su antimikrobni agensi, antioksidansi, helirajući agensi, inertni gasovi i slično; primeri su: benzalkonijum hlorid, benzoeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid);

metalne komplekse, kao što su kompleksi Zn-protein;

rastvarače i korastvarače (poput glicerina, propilen glikola ili polietilen glikola);

šećere i šećerne alkohole, poput trehaloze, saharoze, oktasulfata, manitola, sorbitola ili ksilitola, stahioze, manoze, sorboze, ksiloze, riboze, mioinizitoze, galaktoze, laktitola, ribitola, mioinizitola, galaktitola, glicerola, ciklolitola (npr. inozitol), polietilen glikola; i polihidroksilnih šećernih alkohola;

suspendujuće agense;

surfaktante ili kvašljivce, kao što su poloksameri, PEG, sorbitan estri, polisorbati kao što su polisorbat 20, polisorbat, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal; surfaktanti mogu biti deterdženti, poželjno sa molekulskom masom >1,2 KD i/ili polietar, poželjno sa molekulskom masom >3 KD; neograničavajući primeri za poželjne deterdžente su Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 i Tween 85; neograničavajući primeri za poželjne polietre su PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 i PEG 5000;

agense za povećanje stabilnosti, kao što su saharoza ili sorbitol;

agense za povećanje toničnosti, kao što su halidi alkalnih metala, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol sorbitol;

vehikulume za parenteralnu primenu, uključujući rastvor natrijum hlorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, mlečni Ringerov rastvor ili fiksna ulja; ● vehikulume za intravensku isporuku, uključujući dopunjivače tečnosti i hranljivih supstanci, dopunjivače elektrolita (kao što su oni na bazi Ringerove dekstroze).

[0225] Stručnjacima je jasno da različiti sastojci farmaceutske kompozicije (npr. oni koji su prethodno navedeni) mogu da imaju različita dejstva, na primer, aminokiselina može da deluje kao pufer, stabilizator i/ili antioksidans; manitol može da deluje kao punilac i/ili agens za povećanje toničnosti; natrijum hlorid može da deluje kao vehikulum za isporuku i/ili agens za povećanje toničnosti; itd.

[0226] Predviđeno je da kompozicija iz pronalaska, pored ovde definisanog polipeptida iz pronalaska, može da sadrži druge biološki aktivne agense, u zavisnosti od nameravane upotrebe kompozicije. Takvi agensi mogu biti lekovi koji deluju na gastrointestinalni sistem, lekovi koji deluju kao citostatici, lekovi koji sprečavaju hiperleukemiju, lekovi koji inhibiraju imunske reakcije (npr. kortikosteroidi), lekovi koji modulišu inflamatorni odgovor, lekovi koji deluju na cirkulatorni sistem i/ili agensi kao što su citokini poznati u struci. Takođe je predviđeno da se konstrukt antitela iz predmetnog pronalaska primenjuje kao zajednička terapija, tj. u kombinaciji sa drugim lekom protiv kancera.

[0227] U određenim otelotvorenjima, stručnjak će odrediti optimalnu farmaceutsku kompoziciju, na primer, u zavisnosti od nameravanog načina primene, formata za isporuku i željene doze. Vidite, na primer, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, gore. U određenim otelotvorenjima, takve kompozicije mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu in vivo otpuštanja i brzinu in vivo klirensa konstrukta antitela iz pronalaska. U određenim otelotvorenjima, primarni vehikulum ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može po prirodi biti vodeni ili nevodeni. Na primer, odgovarajući vehikulum ili nosač može biti voda za injekciju, fiziološki slani rastvor ili veštačka cerebrospinalna tečnost, moguće sa dodatkom drugih supstanci koje su česte u kompozicijama za parenteralnu primenu. Neutralni puferovani fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor pomešan sa sermuskim albuminom predstavljaju dalje primere vehikuluma. U određenim otelotvorenjima, konstrukti antitela iz kompozicija iz pronalaska mogu da se pripreme za skladištenje mešanjem izabrane kompozicije koja ima željeni stepen čistoće sa opcionim agensima za formulaciju (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, gore) u obliku liofilizovane pogače ili vodenog rastvora.

Dalje, u određenim otelotvorenjima, konstrukt antitela iz pronalaska može da se formuliše kao liofilizat koristeći odgovarajuće ekscipijense poput saharoze.

[0228] Kada se razmišlja o parenteralnoj primeni, terapeutske kompozicije za upotrebu prema ovom pronalasku mogu da se obezbede u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora bez pirogena, koji sadrži željeni konstrukt antitela iz pronalaska u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu. Naročito pogodan vehikulum za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je konstrukt antitela iz pronalaska formulisan kao sterilni izotonični rastvor, na odgovarajući način konzervisan. U određenim otelotvorenjima, priprema može da obuhvata formulaciju željenog molekula sa agensom, kao što su injektabilne mikrosfere, biorazgradive čestice, polimerna jedinjenja (kao što je polimlečna kiselina ili poliglikolna kiselina), perlice ili lipozomi, koji može da obezbedi kontrolisano ili produženo otpuštanje proizvoda koji može da se isporuči putem depo injekcije. U određenim otelotvorenjima, takođe može da se koristi hijaluronska kiselina, što ima za posledicu promociju produženog trajanja u cirkulaciji. U određenim otelotvorenjima, implantabilna sredstva za isporuku leka mogu da se koriste za uvođenje željenog konstrukta antitela.

[0229] Dodatne farmaceutske formulacije će biti jasne stručnjacima, uključujući formulacije koje obuhvataju konstrukt antitela iz pronalaska u formulacijama sa produženom ili kontrolisanom isporukom/otpuštanjem. Stručnjacima su takođe poznate tehnike za formulisanje različitih drugih sredstava za produženu ili kontrolisanu isporuku, kao što su lipozomski nosači, biorazgradive mikročestice ili porozne perlice i depo injekcije. Vidite, na primer, Međunarodnu patentnu prijavu WO9315722 koja opisuje kontrolisano otpuštanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih kompozicija. Preparati sa produženim otpuštanjem uključuju polupropustljive polimerne matrice u vidu oblikovanih proizvoda, npr. filmova ili mikrokapsula. Matrice sa produženim otpuštanjem mogu da uključuju poliestre, hidrogelove, polilaktide (kako je otkriveno u U.S. pat. 3,773,919 i Evropskoj publikaciji patentne prijave br. EP 058481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L glutamat (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli (2-hidroksietilmetakrilat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 i Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etilen vinil acetat (Langer et al., 1981, gore) ili poli-D(-)-3-hidroksibuternu kiselinu (Evropska publikacija patentne prijave br. EP 133,988). Kompozicije sa produženim otpuštanjem takođe mogu da sadrže lipozome koji mogu da se pripreme bilo kojim od nekoliko postupaka koji su poznati u struci. Vidite, npr. Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 82:3688-3692; Evropske publikacije patentne prijave br. EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.

[0230] Konstrukt antitela takođe može biti uhvaćen u mikrokapsulama koje su pripremljene, na primer, tehnikama koacervacije ili putem interfacijalne polimerizacije (na primer, hidroksimetilceluloza ili želatinske mikrokapsule, odnosno poli (metilmetakrilatne) mikrokapsule), u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule), ili u makroemulzijama. Takve tehnike su otkrivene u Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, Oslo, A., izd., (1980).

[0231] Farmaceutske kompozicije koje se koriste za in vivo primenu su obično obezbeđene kao sterilni preparati. Sterilizacija može da se postigne filtracijom kroz sterilne membrane za filtraciju. Kada je kompozicija liofilizovana, sterilizacija upotrebom ovog postupka može da se obavi pre ili posle liofilizacije i rekonstituisanja. Kompozicije za parenteralnu primenu mogu da se čuvaju u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Parenteralne kompozicije se obično stavljaju u ambalažu koja ima sterilni pristup, na primer, kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probije hipodermičnom iglom za injekciju.

[0232] Još jedan aspekt pronalaska obuhvata samopuferujući konstrukt antitela iz formulacija pronalaska, koje mogu da se koristi kao farmaceutske kompozicije, kako je opisano u Međunarodnoj patentnoj prijavi WO 06138181A2 (PCT/US2006/022599). Dostupna su različita izlaganja o supstancama za stabilizaciju i formulaciju proteina i postupcima koji su korisni u tom pogledu, poput Arakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., "Physical stabilization iz proteins in aqueous solution" u: RATIONAL DESIGN IZ STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), i Randolph et al., "Surfactant-protein interactions", Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002), vidite posebno delove koji se odnose na ekscipijense i njihove procese za samopuferujuće formulacije proteina, naročito za proteinske farmaceutske proizvode i procese za veterinarsku i/ili humanu medicinsku upotrebu.

[0233] Soli mogu da se koriste u skladu sa određenim otelotvorenjima pronalaska, na primer, radi podešavanja jonske jačine i/ili izotoničnosti formulacije i/ili za poboljšanje rastvorljivosti i/ili fizičke stabilnosti proteina ili drugih sastojaka kompozicije prema pronalasku. Kao što je dobro poznato, joni mogu da stabilizuju nativno stanje proteina putem vezivanja za naelektrisane ostatke na površini proteina i zaštitom naelektrisanih i polarnih grupa u proteinu i smanjenjem jačine njihovih elektrostatičkih interakcija, interakcija privlačenja i odbijanja. Joni takođe mogu da stabilizuju denaturisano stanje proteina putem vezivanja, naročito za denaturisane peptidne veze (--CONH) proteina. Štaviše, jonska interakcija sa naelektrisanim i polarnim grupama u proteinu takođe može da smanji međumolekulske elektrostatičke interakcije, te stoga sprečava ili smanjuje agregaciju i nerastvorljivost proteina.

[0234] Jonske vrste se značajno razlikuju po svom dejstvu na proteine. Razvijen je niz kategorijskih rangiranja jona i njihovih dejstava na proteine, koja mogu da se koriste u formulisanju farmaceutskih kompozicija u skladu sa pronalaskom. Jedan od primera je Hofmajsterova serija, koja rangira jonske i polarne nejonske rastvorene supstance po njihovom dejstvu na konformacionu stabilnost proteina u rastvoru. Stabilizujuće rastvorene supstance se nazivaju „kosmotropne“. Destabilizujuće rastvorene supstance se nazivaju „haotropne“. Kosmotropi se obično koriste u visokim koncentracijama (npr. > 1 molarni amonijum sulfat) za taloženje proteina iz rastvora („isoljavanje“). Haotropi se obično koriste za denaturaciju i/ili za rastvaranje proteina („dosoljavanje“). Relativna efikasnost jona za „isoljavanje“ i

„dosoljavanje“ definiše njihov položaj u Hofmajsterovoj seriji.

[0235] Slobodne aminokiseline mogu da se koriste u formulacijama konstrukata antitela iz pronalaska u skladu sa različitim otelotvorenjima pronalaska kao punioci, stabilizatori i antioksidansi, kao i za druge standardne primene. Lizin, prolin, serin i alanin mogu da se koriste za stabilizaciju proteina u formulaciji. Glicin je koristan u liofilizaciji kako bi se osigurala pravilna struktura i svojstva pogače. Arginin može biti koristan za inhibiciju agregacije proteina, kako u tečnim, tako i u liofilizovanim formulacijama. Metionin je koristan kao antioksidans.

[0236] Polioli uključuju šećere, npr. manitol, saharozu i sorbitol, i polihidroksilne alkohole kao što su, na primer, glicerol i propilen glikol, i, za potrebe predmetnog razmatranja, polietilen glikol (PEG) i srodne supstance. Polioli su kosmotropni. Oni su korisni stabilizatori u tečnim i u liofilizovanim formulacijama za zaštitu proteina od fizičkih i hemijskih procesa razgradnje. Polioli su takođe korisni za podešavanje toničnosti formulacija. U poliole korisne za odabrana otelotvorenja pronalaska spadaju manitol, koji se obično koristi za osiguravanje strukturne stabilnosti pogače u liofilizovanim formulacijama. On osigurava strukturnu stabilnost pogače.

Obično se koristi sa lioprotektantom, npr. saharozom. Sorbitol i saharoza su među poželjnim agensima za podešavanje toničnosti i kao stabilizatori za zaštitu od stresova zamrzavanja i otapanja tokom transporta ili pripreme rasutih sastojaka tokom proizvodnog procesa. Redukujući šećeri (koji sadrže slobodne aldehidne ili keto grupe), kao što su glukoza i laktoza, mogu da glikoziluju površinske ostatke lizina i arginina. Zato oni uopšteno nisu među poželjnim poliolima za upotrebu prema pronalasku. Pored toga, šećeri koji grade takve reaktivne vrste, poput saharoze, koja se hidrolizuje do fruktoze i glukoze u kiselim uslovima, i zatim ugrožava glikozilaciju, nisu među poželjnim poliolima iz pronalaska u tom pogledu. PEG je koristan za stabilizaciju proteina i kao krioprotektant, i može da se koristi u pronalasku u tom pogledu.

[0237] Otelotvorenja konstrukta antitela iz formulacija pronalaska dalje sadrže surfaktante. Molekuli proteina mogu biti podložni adsorpciji na površinama i denaturaciji i naknadnoj agregaciji na međupovršinama vazduh-tečnosti, čvrsta supstanca-tečnost i tečnost-tečnost. Ovo dejstvo je obično obrnuto proporcionalno koncentraciji proteina. Ove štetne interakcije uopšteno su obrnuto proporcionalne koncentraciji proteina i obično su pogoršane fizičkom agitacijom, kao što je ona nastala tokom transporta i rukovanja proizvodom. Surfaktanti se rutinski koriste za sprečavanje, minimizovanje ili smanjenje površinske adsorpcije. Korisni surfaktanti u ovom pronalasku u ovom pogledu uključuju polisorbat 20, polisorbat 80, druge estre masnih kiselina sorbitan polietoksilata i poloksamer 188. Surfaktanti se takođe često koriste za kontrolu konformacione stabilnosti proteina. Upotreba surfaktanata u ovom pogledu je specifična za proteine, pošto bilo koji dati surfaktant obično stabilizuje neke proteine i destabilizuje druge.

[0238] Polisorbati su podložni oksidativnoj razgradnji, i često u isporuci sadrže dovoljne količine peroksida da izazovu oksidaciju bočnih lanaca ostataka proteina, posebno metionina. Shodno tome, polisorbate treba koristiti pažljivo, a kada se koriste, treba ih upotrebljavati u najnižim delotvornim koncentracijama. U tom pogledu, polisorbati oličavaju opšte pravilo da ekscipijensi treba da se koriste u najnižim delotvornim koncentracijama.

[0239] Otelotvorenja konstrukta antitela iz formulacija pronalaska dalje sadrže jedan ili više antioksidanasa. Štetna oksidacija proteina do određene mere može da se spreči u farmaceutskim formulacijama održavanjem odgovarajućih nivoa kiseonika i temperature okruženja i izbegavanjem izlaganja svetlosti. Antioksidativni ekscipijensi mogu takođe da se koriste za sprečavanje oksidacione razgradnje proteina. U korisne antioksidanse u tom pogledu spadaju redukujući agensi, čistači kiseonika/slobodnih radikala i helatori. Antioksidansi za upotrebu u terapeutskim formulacijama proteina prema pronalasku su poželjno rastvorljivi u vodi i zadržavaju svoju aktivnost tokom roka trajanja proizvoda. EDTA je u tom pogledu poželjni antioksidans prema pronalasku. Antioksidansi mogu da oštete proteine. Na primer, redukcioni agensi, kao što je naročito glutation, mogu da ometaju intramolekulske disulfidne veze. Dakle, antioksidansi za upotrebu u pronalasku su izabrani da, između ostalog, eliminišu ili u dovoljnoj meri smanje mogućnost da oštete proteine u formulaciji.

[0240] Formulacije prema pronalasku mogu da sadrže jone metala koji su kofaktori proteina i koji su neophodni za formiranje koordinacionih kompleksa proteina, kao što je cink neophodan za formiranje određenih insulinskih suspenzija. Joni metala takođe mogu da inhibiraju neke procese koji razgrađuju proteine. Međutim, joni metala takođe katalizuju fizičke i hemijske procese koji razgrađuju proteine. Joni magnezijuma (10-120 mM) mogu da se koriste za inhibiciju izomerizacije asparaginske kiseline u izoasparaginsku kiselinu. Ca<+2>joni (do 100 mM) mogu da povećaju stabilnost humane dezoksiribonukleaze. Mg<+2>, Mn<+2>i Zn<+2>, međutim, mogu da destabilizuju rhDNazu. Slično tome, Ca<+2>i Sr<+2>mogu da stabilizuju faktor VIII, on može biti destabilisan putem Mg<+2>, Mn<+2>i Zn<+2>, Cu<+2>i Fe<+2>, a njegovo taloženje može da se poveća putem jona Al<+3>.

[0241] Otelotvorenja konstrukta antitela iz formulacija pronalaska dalje sadrže jedan ili više konzervanasa. Konzervansi su neophodni pri razvoju višedoznih parenteralnih formulacija koje uključuju više od jednog vađenja iz iste ambalaže. Njihova primarna funkcija je inhibicija mikrobnog rasta i osiguravanje sterilnosti proizvoda tokom roka trajanja ili perioda upotrebe lekovitog proizvoda. Uobičajeni konzervansi uključuju benzil alkohol, fenol i m-krezol. Iako konzervansi imaju dugu istoriju upotrebe sa parenteralnim preparatima malog molekula, razvoj proteinskih formulacija koje sadrže konzervanse može biti težak. Konzervansi gotovo uvek imaju destabilizujuće dejstvo (agregacija) na proteine, i to je postao glavni faktor u ograničenju njihove upotrebe u višedoznim proteinskim formulacijama. Do danas je većina proteinskih lekova formulisana samo za jednokratnu upotrebu. Međutim, kada su višedozne formulacije moguće, one imaju dodatnu prednost što predstavljaju pogodnost za pacijenta, i povećanu tržišnu prođu. Dobar primer je humani hormon rasta (hGH) kada je razvoj formulacija sa konzervansima doveo do komercijalizacije u pogodnijem obliku višedozne olovke za injekciju. Trenutno su na tržištu dostupna najmanje četiri takva sredstva u obliku olovke koja sadrže

1

formulacije hGH sa konzervansima. Norditropin (tečnost, Novo Nordisk), Nutropin AQ (tečnost, Genentech) i Genotropin (liofilizovani - uložak sa dve komore, Pharmacia & Upjohn) sadrže fenol, dok je Somatrope (Eli Lilly) formulisan sa m-krezolom. Prilikom formulacije i razvoja doznih oblika sa konzervansima treba uzeti u obzir nekoliko aspekata. Mora biti optimizovana delotvorna koncentracija konzervansa u lekovitom proizvodu. To zahteva ispitivanje određenog konzervansa u doznom obliku sa rasponima koncentracija koji daju antimikrobnu delotvornost bez ugrožavanja stabilnosti proteina.

[0242] Kao što se moglo očekivati, razvoj tečnih formulacija koje sadrže konzervanse je izazovniji od liofilizovanih formulacija. Liofilizovani proizvodi mogu da se liofilizuju bez konzervansa i da se rekonstituišu sa razblaživačem koji sadrži konzervans u trenutku upotrebe. To skraćuje vreme u kojem je konzervans u kontaktu sa proteinom, značajno smanjujući povezane rizike po stabilnost. Kod tečnih formulacija, delotvornost i stabilnost konzervansa treba održavati tokom celog roka trajanja proizvoda (oko 18 do 24 meseca). Važno je napomenuti da delotvornost konzervansa treba pokazati u konačnoj formulaciji koja sadrži aktivni lek i sve pomoćne komponente.

[0243] Konstrukti antitela koji su ovde otkriveni mogu takođe da se formulišu kao imunolipozomi. „Lipozom“ je mala vezikula koja se sastoji od različitih vrsta lipida, fosfolipida i/ili surfaktanta koji je koristan za isporuku leka sisaru. Komponente lipozoma su obično raspoređene u dvoslojnoj formaciji, slično rasporedu lipida bioloških membrana. Lipozomi koji sadrže konstrukt antitela se pripremaju postupcima koji su poznati u struci, kao što je opisano u Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al. , Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); US pat. br. 4,485,045 i 4,544,545; i WO 97/38731. Lipozomi sa povećanim vremenom cirkulacije otkriveni su u US patentu br. 5,013,556. Posebno korisni lipozomi mogu da se dobiju postupkom reversno faznog uparavanja sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidil holin, holesterol i fosfatidil etanolamin derivatizovan pomoću PEG (PEG-PE). Lipozomi se istiskuju kroz filtere sa definisanom veličinom pora kako bi se dobili lipozomi željenog prečnika. Fab' fragmenti konstrukta antitela iz predmetnog pronalaska mogu da se konjuguju sa lipozomima, kako je opisano u Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) reakcijom disulfidne razmene. Hemoterapeutski agens je opciono sadržan u lipozomu. Vidite Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).

2

[0244] Kada je farmaceutska kompozicija formulisana, ona može da se čuva u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca, kristal, ili kao dehidratisani ili liofilizovani prah. Takve formulacije mogu da se čuvaju u obliku koji je spreman za upotrebu ili u obliku (npr. liofilizovanom) koji se rekonstituiše pre primene.

[0245] Biološka aktivnost ovde definisane farmaceutske kompozicije može da se odredi, na primer, testovima citotoksičnosti, kako je opisano u sledećim primerima, u WO 99/54440 ili od strane autora Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).

„Delotvornost“ ili „in vivo delotvornost“, kako se ovde koristi, odnosi se na odgovor na terapiju farmaceutskom kompozicijom iz pronalaska, koristeći, npr. standardizovane NCI kriterijume odgovora. Uspešnost ili in vivo delotvornost terapije koristeći farmaceutsku kompoziciju iz pronalaska, odnosi se na delotvornost kompozicije za nameravanu svrhu, tj. na sposobnost kompozicije da izazove željeno dejstvo, tj. iscrpljivanje patoloških ćelija, npr. ćelija tumora. In vivo delotvornost može da se prati postojećim standardnim postupcima za odgovarajuće bolesti, uključujući, bez ograničenja, broj belih krvnih zrnaca, diferencijalne dijagnoze, fluorescentno aktivirano ćelijsko sortiranje, aspiraciju koštane srži. Pored toga, mogu da se koriste različiti klinički hemijski parametri specifični za bolest i drugi ustaljeni standardni postupci. Nadalje, mogu da se koriste kompjuterizovana tomografija, rendgen, nuklearna magnetna rezonantna tomografija (npr. za procenu odgovora na bazi kriterijuma Nacionalnog instituta za kancer [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr;17(4):1244]), skeniranje pozitronskom emisionom tomografijom, broj belih krvnih zrnaca, diferencijalne dijagnoze, fluorescentno aktivirano ćelijsko sortiranje, aspiracija koštane srži, biopsija/histologija limfnih čvorova i različiti klinički hemijski parametri specifični za limfome (npr. laktat dehidrogenaza) i drugi ustaljeni standardni postupci.

[0246] Još jedan veliki izazov u razvoju lekova kao što je farmaceutska kompozicija iz pronalaska je predvidljiva modulacija farmakokinetičkih svojstava. U tu svrhu može da se uspostavi farmakokinetički profil kandidata za lek, tj. profil farmakokinetičkih parametara koji utiču na sposobnost konkretnog leka da leči određeno stanje. Farmakokinetički parametri leka koji utiču na sposobnost leka da leči određenu bolest uključuju, bez ograničenja: poluživot, obim distribucije, hepatički metabolizam prvog prolaza i stepen vezivanja krvnog seruma. Na delotvornost datog lekovitog agensa može da utiče svaki od prethodno navedenih parametara.

[0247] „Poluživot“ znači vreme u kome je 50% primenjenog leka eliminisano putem bioloških procesa, npr. metabolizma, izlučivanja, itd. Pod „hepatičkim metabolizmom prvog prolaza“ misli se na sklonost leka da se metaboliše prilikom prvog kontakta sa jetrom, tj. tokom prvog prolaska kroz jetru. „Obim distribucije“ označava stepen zadržavanja leka u različitim odeljcima organizma, npr., poput intracelularnih i ekstracelularnih prostora, tkiva i organa, itd., i distribuciju leka u tim odeljcima. „Stepen vezivanja krvnog seruma“ označava sklonost leka da interaguje sa proteinima krvnog seruma, kao što je albumin, i vezuje se za njih, što dovodi do smanjenja ili gubitka biološke aktivnosti leka.

[0248] Farmakokinetički parametri takođe uključuju bioraspoloživost, vreme kašnjenja (Tlag), Tmax, brzinu apsorpcije, više javljanja i/ili Cmax za datu količinu primenjenog leka.

„Bioraspoloživost“ označava količinu leka u komponenti krvi. „Vreme kašnjenja“ označava kašnjenje između primene leka i njegove detekciju i merljivosti u krvi ili plazmi. „Tmax“ je vreme nakon kog se dostiže maksimalna koncentracija leka u krvi, a „Cmax“ je koncentracija u krvi koja se maksimalno ostvaruje za dati lek. Svi parametri utiču na vreme za dostizanje koncentracije leka u krvi ili tkivu koja je potrebna za njegovo željeno dejstvo. Farmakokinetički parametri konstrukta bispecifičnog antitela koji ispoljavaju unakrsnu specifičnost za vrste, koja može da se utvrdi u pretkliničkom ispitivanju životinja na primatima koji nisu šimpanze, takođe su prikazani, npr. u publikaciji autora Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).

[0249] Jedno otelotvorenje obezbeđuje konstrukt antitela iz pronalaska ili konstrukt antitela proizveden prema procesu iz pronalaska za upotrebu u prevenciji ili lečenju hematološkog kancera ili metastatskog kancera.

[0250] Ovde opisane formulacije su korisne kao farmaceutske kompozicije u lečenju, ublažavanju i/ili prevenciji patološkog zdravstvenog stanja kao što je ovde opisano kod pacijenta kojem je to potrebno. Termin „lečenje“ se odnosi i na terapeutsko lečenje i na profilaktičke ili preventivne mere. Lečenje obuhvata upotrebu ili primenu formulacije na telu, izolovanom tkivu ili ćeliji pacijenta koji ima bolest/poremećaj, simptom bolesti/poremećaja, ili predispoziciju za bolest/poremećaj, sa svrhom izlečenja, lečenja, ublažavanja, uklanjanja,

4

izmene, popravljanja, poboljšanja ili uticaja na bolest, simptome bolesti ili predispozicije za bolest.

[0251] Termin „poboljšanje“, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koje poboljšanje bolesti pacijenta koji ima tumor ili kancer ili metastatski kancer, kako je navedeno u nastavku, putem primene konstrukta antitela prema pronalasku na ispitaniku kome je to potrebno. Takvo poboljšanje takođe može biti u vidu usporavanja ili zaustavljanja progresije tumora ili kancera ili metastatskog kancera pacijenta. Termin „prevencija“, kako se ovde koristi, znači izbegavanje javljanja ili ponovnog javljanja tumora ili kancera ili metastatskog kancera kod pacijenta kako je navedeno u nastavku, putem primene konstrukta antitela prema pronalasku na ispitaniku kome je to potrebno.

[0252] Termin „bolest“ se odnosi na bilo koje stanje kojem bi koristilo lečenje konstruktom antitela ili farmaceutskom kompozicijom koji su ovde opisani. To uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući ona patološka stanja koja čine sisara predisponiranim za datu bolest.

[0253] „Neoplazma“ je abnormalni rast tkiva, koji obično, ali ne i uvek, stvara masu. Kada se takođe formira masa, ona se obično naziva „tumor“. Neoplazme ili tumori mogu biti ili benigni, potencijalno maligni (predkancerozni) ili maligni. Maligne neoplazme se obično nazivaju kancer. One obično napadaju i uništavaju okolno tkivo i mogu da grade metastaze, tj. šire se na druge delove, tkiva ili organe tela. Stoga pojam „metastatski kancer“ obuhvata metastaze na drugim tkivima ili organima osim prvobitnog tumora. Limfomi i leukemije su limfoidne neoplazme. Za svrhe predmetnog pronalaska, oni su takođe obuhvaćeni terminima „tumor“ ili

„kancer“.

[0254] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, bolest hematološkog kancera je AML i bolest metastatskog kancera može biti izvedena iz prethodnog.

[0255] Poželjne bolesti tumora ili karcinoma u vezi sa ovim pronalaskom su izabrane iz grupe koju čine kancer dojke, karcinoid, kancer grlića materice, kolorektalni kancer, kancer endometrijuma, kancer želuca, kancer glave i vrata, mezoteliom, kancer jetre, kancer pluća, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer kože, kancer bubrega i kancer želuca. Još poželjnije, tumorska ili kancerska bolest, koja je poželjno bolest solidnog tumora, može biti izabrana iz grupe koju čine kancer jajnika, pankreasa, mezoteliom, kancer pluća, kancer želuca i trostruko negativan kancer dojke. Metastatska kancerska bolest može biti izvedena iz bilo čega od prethodnog.

[0256] Termini „ispitanik kome je to potrebno“ ili onaj „kome je potrebno lečenje“ obuhvataju one koji već imaju poremećaj, kao i one kod kojih se poremećaj može sprečiti. Ispitanik kome je to potrebno ili „pacijent“ uključuje ljudske ili druge ispitanike sisare koji dobijaju profilaktičko ili terapeutsko lečenje.

[0257] Konstrukt antitela iz pronalaska će uopšteno biti konstruisan za specifične načine i postupke primene, za specifične doze i učestalost primene, za specifično lečenje specifičnih bolesti, sa rasponima bioraspoloživosti i upornosti, između ostalog. Supstance iz kompozicije su poželjno formulisane u koncentracijama koje su prihvatljive na mestu primene.

[0258] Formulacije i kompozicije tako mogu da se konstruišu u skladu sa pronalaskom za isporuku putem bilo kog odgovarajućeg načina primene. U kontekstu predmetnog pronalaska, načini primene uključuju, ali nisu ograničeni na

● lokalnu primenu (poput epikutane, inhalacije, nazalne, oftalmičke, aurikularne / auralne, vaginalne, mukozne);

● enteralnu primenu (poput oralne, gastrointestinalne, sublingvalne, sublabijalne, bukalne, rektalne); i

● parenteralnu primenu (poput intravenske, intraarterijske, intraosealne, intramuskularne, intracerebralne, intracerebroventrikularne, epiduralne, intratekalne, supkutane, intraperitonealne, ekstraamniotske, intraartikularne, intrakardijalne, intradermalne, intralezione, intrauterine, intravezikalne, intravitrealne, transdermalne, intranazalne, transmukozne, intrasinovijalne, intraluminalne).

[0259] Farmaceutske kompozicije i konstrukti antitela iz ovog pronalaska naročito su korisni za parenteralnu primenu, npr. supkutanu ili intravensku isporuku, na primer putem injekcije kao što je bolusna injekcija, ili putem infuzije kao što je kontinuirana infuzija. Farmaceutske kompozicije mogu da se primenjuju koristeći medicinsko sredstvo. Primeri medicinskih sredstava za primenu farmaceutskih kompozicija opisani su u U.S. patentima br. 4,475,196; 4,439,196; 4,447,224; 4,447, 233; 4,486,194; 4,487,603; 4,596,556; 4,790,824; 4,941,880; 5,064,413; 5,312,335; 5,312,335; 5,383,851; i 5,399,163.

[0260] Konkretno, predmetni pronalazak omogućava neprekinutu primenu odgovarajuće kompozicije. Kao neograničavajući primer, neprekinuta ili suštinski neprekinuta, tj. kontinuirana primena može da se ostvari sistemom male pumpe koji pacijent nosi za doziranje priliva terapeutskog agensa u telo pacijenta. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konstrukt antitela iz pronalaska može da se primeni koristeći navedene sisteme pumpi. Takvi sistemi pumpi su uopšteno poznati u struci, i obično se oslanjaju na periodičnu zamenu uložaka koji sadrže terapeutski agens za infuziju. Prilikom zamene uloška u takvom sistemu pumpi može doći do privremenog prekida inače neprekinutog protoka terapeutskog agensa u telo pacijenta. U takvom slučaju, i dalje bi se smatralo da faza primene pre zamene uloška i faza primene nakon zamene uloška spadaju u farmaceutska sredstva i postupke iz pronalaska koji čine

„neprekinutu primenu“ takvog terapeutskog agensa.

[0261] Kontinuirana ili neprekinuta primena konstrukata antitela iz pronalaska može biti intravenska ili supkutana putem sredstva za isporuku tečnosti ili sistema male pumpe koji obuhvata mehanizam za pogon tečnosti, za pogon tečnosti iz rezervoara i pokretački mehanizam za pokretanje mehanizma za pogon. Sistemi pumpi za supkutanu primenu mogu da obuhvataju iglu ili kanilu za probijanje pacijentove kože i isporuku odgovarajuće kompozicije u pacijentovo telo. Navedeni sistemi pumpi mogu biti neposredno učvršćeni ili zakačeni za kožu pacijenta nezavisno od vene, arterije ili krvnog suda, čime se omogućava neposredan kontakt između sistema pumpi i kože pacijenta. Sistem pumpi može biti zakačen za pacijentovu kožu tokom 24 sata pa sve do nekoliko dana. Sistem pumpi može biti male veličine sa rezervoarom za male zapremine. Kao neograničavajući primer, zapremina rezervoara za odgovarajuću farmaceutsku kompoziciju koja se primenjuje može biti između 0,1 i 50 ml.

[0262] Kontinuirana primena takođe može biti transdermalna putem flastera koji se nosi na koži i periodično menja. Stručnjak je upoznat sa sistemima flastera za isporuku leka koji su odgovarajući za ovu svrhu. Treba imati u vidu da je transdermalna primena posebno pogodna za neprekinutu primenu, pošto zamena prvog potrošenog flastera može pogodno da se obavi istovremeno sa postavljanjem novog, drugog flastera, na primer na površini kože odmah pored prvog potrošenog flastera i neposredno pre uklanjanja prvog potrošenog flastera. Ne javljaju se problemi vezani za prekid protoka ili kvar napajanja. Ako je farmaceutska kompozicija liofilizovana, liofilizovana supstanca se prvo rekonstituiše u odgovarajućoj tečnosti pre primene. Liofilizovana supstanca može biti rekonstituisana, npr., u bakteriostatskoj vodi za injekciju (BWFU), fiziološkom slanom rastvoru, fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS), ili u istoj formulaciji u kojoj je protein bio pre liofilizacije.

[0263] Kompozicije iz predmetnog pronalaska mogu da se primene na ispitaniku u pogodnoj dozi koja može da se odredi, npr. pomoću studija eskalacije doze putem primene rastućih doza konstrukta antitela iz pronalaska koji ispoljava ovde opisanu unakrsnu specifičnost između vrsta za primate koji nisu šimpanze, na primer makaki majmune. Kao što je prethodno prikazano, konstrukt antitela iz pronalaska koji ispoljava ovde opisanu unakrsnu specifičnost između vrsta može pogodno da se koristi u identičnom obliku u pretkliničkom testiranju kod primata koji nisu šimpanze i kao lek kod ljudi. Nadležni lekar i klinički faktori određuju dozni režim. Kao što je dobro poznato u medicinskoj struci, doze za bilo kog pacijenta zavise od brojnih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela, starost, konkretno jedinjenje koje se primenjuje, pol, vreme i način primene, opšte zdravstveno stanje, i druge lekove koji se istovremeno primenjuju.

[0264] Termin „delotvorna doza“ je definisan kao količina koja je dovoljna za postizanje ili barem delimično postizanje željenog dejstva. Termin „terapeutski delotvorna doza“ je definisan kao količina koja je dovoljna za lečenje ili barem delimično zaustavljanje bolesti i njenih komplikacija kod pacijenta koji već boluje od bolesti. Količine ili doze delotvorne za ovu primenu će zavisiti od stanja koje se leči (indikacija), isporučenog konstrukta antitela, terapeutskog konteksta i ciljeva, težine bolesti, prethodne terapije, pacijentove kliničke istorije i odgovora na terapeutski agens, načina primene, veličine (telesna težina, površina tela ili veličina organa) i/ili pacijentovog stanja (starost i opšte zdravlje) i opšteg stanja pacijentovog imunskog sistema. Odgovarajuća doza može da se prilagodi u skladu sa procenom nadležnog lekara tako da može da se primeni na pacijentu jednom ili u nizu primena, i kako bi se ostvarilo optimalno terapeutsko dejstvo.

[0265] Tipična doza može da se kreće od oko 0,1 µg/kg do oko 30 mg/kg ili više, u zavisnosti od prethodno spomenutih faktora. U specifičnim otelotvorenjima, doza može biti u rasponu od 1,0 µg/kg do oko 20 mg/kg, opciono od 10 µg/kg do oko 10 mg/kg ili od 100 µg/kg do oko 5 mg/kg.

[0266] Terapeutski delotvorna količina konstrukta antitela iz pronalaska poželjno dovodi do smanjenja težine simptoma bolesti, povećanja učestalosti ili trajanja perioda bez simptoma bolesti ili prevencije oštećenja ili invaliditeta usled bolesti. U lečenju tumora koji eksprimiraju FLT3, terapeutski delotvorna količina konstrukta antitela iz pronalaska, npr. anti-FLT3/anti-CD3 konstrukta antitela, poželjno inhibira ćelijski rast ili tumorski rast za najmanje oko 20%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80% ili najmanje oko 90% u odnosu na nelečene pacijente. Sposobnost jedinjenja da inhibira rast tumora može da se proceni na životinjskom modelu koji predviđa delotvornost kod humanih tumora.

[0267] Farmaceutska kompozicija može da se primeni kao jedini terapeutski agens ili u kombinaciji sa dodatnim terapijama kao što su, po potrebi, antikancerske terapije, npr. drugi proteinski i neproteinski lekovi. Ovi lekovi mogu da se primene istovremeno sa kompozicijom koja sadrži konstrukt antitela iz pronalaska kako je ovde definisan, ili zasebno pre ili posle primene navedenog konstrukta antitela u vremenski definisanim intervalima i dozama.

[0268] Termin „delotvorna i netoksična doza“, kako se ovde koristi, odnosi se na podnošljivu dozu konstrukta antitela iz pronalaska koja je dovoljno velika da izazove iscrpljivanje patoloških ćelija, eliminaciju tumora, smanjenje tumora ili stabilizaciju bolesti, bez, ili u suštini bez, značajnih toksičnih dejstava. Takve delotvorne i netoksične doze mogu da se odrede, npr. studijama sa eskalacijom doze koje su opisane u struci, i treba da budu manje od doze koja indukuje teška neželjena dejstva (toksičnost koja ograničava dozu, DLT).

[0269] Termin „toksičnost“, kako se ovde koristi, odnosi se na toksična dejstva leka manifestovana kao neželjena dejstva ili teška neželjena dejstva. Ova neželjena dejstva mogu da se odnose na uopšteni nedostatak podnošljivosti leka i/ili na nedostatak lokalne podnošljivosti nakon primene. Toksičnost takođe može da uključuje teratogena ili kancerogena dejstva izazvana lekom.

[0270] Termin „bezbednost“, „in vivo bezbednost“ ili „podnošljivost“, kako se ovde koristi, definiše primenu leka bez izazivanja teških neželjenih dejstava neposredno posle primene (lokalna podnošljivost) i tokom dužih vremenskih perioda korišćenja leka. „Bezbednost“, „in vivo bezbednost“ ili „podnošljivost“ mogu da se procene, npr. u redovnim intervalima tokom lečenja i perioda praćenja. Merenja uključuju kliničku procenu, npr. manifestovanje u organima i proveru laboratorijskih abnormalnosti. Može da se izvrši klinička procena, i odstupanja od normalnih nalaza se beleže/kodiraju prema NCI-CTC i/ili MedDRA standardima. Manifestovanje u organima može da uključuje kriterijume kao što su alergija/imunologija, krv/koštana srž, srčana aritmija, koagulacija i slično, kako je prikazano npr. u Zajedničkim terminološkim kriterijumima za neželjena dejstva v3.0 (CTCAE).

[271] Laboratorijski parametri koji mogu da se testiraju uključuju, na primer, hematologiju, biohemijsku analizu, profil koagulacije i analizu urina i ispitivanje ostalih telesnih tečnosti kao što su serum, plazma, limfoidna ili spinalna tečnost, likvor, i slično. Bezbednost stoga može da se proceni, npr. fizikalnim pregledom, tehnikama snimanja (tj. ultrazvuk, rendgen, CT snimanje, snimanje magnetnom rezonancom (MR), drugim merenjima sa tehničkim uređajima (tj. elektrokardiogram), putem vitalnih znakova, merenjem laboratorijskih parametara i beleženjem neželjenih događaja. Na primer, neželjeni događaji kod primata koji nisu šimpanze u upotrebama i postupcima prema pronalasku mogu da se ispitaju histopatološkim i/ili histohemijskim postupcima.

[0272] Prethodni termini se takođe navode, npr. u Preclinical safety evaluation of biotechnologyderived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997.

[0273] U daljem otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži konstrukt antitela iz pronalaska, konstrukt antitela proizveden prema procesu iz pronalaska, polinukleotid iz pronalaska, vektor iz pronalaska i/ili ćeliju domaćina iz pronalaska.

[0274] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin „komplet“ znači dve ili više komponenti, od kojih jedna odgovara konstruktu antitela, farmaceutskoj kompoziciji, vektoru ili ćeliji domaćinu iz pronalaska, upakovanih zajedno u ambalaži, prijemnom sudu, ili na drugi način. Komplet zato može da se opiše kao skup proizvoda i/ili sredstava dovoljnih za ostvarenje određenog cilja, koji može da se prodaje kao jedna celina.

1

[0275] Komplet može da sadrži jedan ili više prijemnih sudova (kao što su bočice, ampule, ambalaža, špricevi, boce, kese) bilo kog odgovarajućeg oblika, veličine i materijala (poželjno su vodootporni, npr. plastika ili staklo), koji sadrže konstrukt antitela ili farmaceutsku kompoziciju iz predmetnog pronalaska u odgovarajućoj dozi za primenu (vidite gore). Komplet može dodatno da sadrži uputstvo za upotrebu (npr. u obliku listića ili instrukcija za upotrebu), sredstva za primenu konstrukta antitela iz predmetnog pronalaska, kao što je špric, pumpa, infuzor, i slično, sredstva za rekonstituisanje konstrukta antitela iz pronalaska i/ili sredstva za razblaženje konstrukta antitela iz pronalaska.

[0276] Pronalazak takođe obezbeđuje komplete za jednodozne jedinice primene. Komplet iz pronalaska može takođe da sadrži prvi prijemni sud koji sadrži osušeni / liofilizovani konstrukt antitela, i drugi prijemni sud koji sadrži vodenu formulaciju. U određenim otelotvorenjima ovog pronalaska, obezbeđeni su kompleti koji sadrže prethodno napunjene špriceve sa jednom komorom i više komora (npr. špricevi za tečnosti i liošpricevi).

Slike prikazuju:

[0277]

Slika 1:

(a) Šematska struktura monomernog FLT3 proteina i (b) kristalna struktura FLT3 homodimera u interakciji sa FLT3LG homodimerom.

Slika 2

Šematska struktura himernih humanih/mišjih FLT3 molekula koji se koriste za karakterizaciju veziva klastera epitopa

Slika 3:

Šematska struktura skraćenih FLT3 konstrukata koji se koriste za karakterizaciju veziva epitopskog klastera

Slika 4:

Test za analizu konkurencije FLT3 veziva pronalaska sa FLT3-ligandom za FLT3 vezivanje.

CHO-humane FLT3 ćelije su inkubirane sa ili bez 10 µg/ml FLT3 liganda tokom 30 minuta (bez koraka ispiranja). Dodati su scFv periplazmatski preparati i inkubirani 30 min. Detekcija je obavljena korišćenjem mišjeg anti-FLAG PE-konjugovanog kozjeg

1 1

anti-mišjeg i medijane fluorescencije detektovane pomoću FACS (medijana (+ ligand) / medijana (bez liganda) * 100%) ;Slika 5: ;FACS analiza vezivanja određenih bispecifičnih jednolančanih konstrukata unakrsne specifičnosti za vrste za CHO ćelije transficirane humanim FLT3, humanom CD3+ T ćelijskom linijom HPBaLL, CHO ćelijama transficiranim sa makaki FLT3 i CD3+ T ćelijskom linijom makaki LnPk 4119. Crvena linija predstavlja ćelije inkubirane sa 2 µg/ml prečišćenog monomernog proteina koji se zatim inkubira sa mišjim anti-I2C antitelom i PE obeleženim kozjim antimišjim IgG antitelom za detekciju. Crna linija histograma odražava negativnu kontrolu: ćelije inkubirane samo sa anti-I2C antitelom kao i sa PE obeleženim detekcionim antitelom (videti primer 6). ;Slika 6: ;Citotoksična aktivnost indukovana određenim jednolančanim konstruktima specifičnim za različite vrste preusmerene na humane PBMC sa osiromašenim CD56 kao efektorske ćelije i CHO ćelije transficirane sa humanim FLT3 kao ciljnim ćelijama. (Primer 9) ;Slika 7: ;Unakrsno reaktivno vezivanje za CD3, FLT3 i njegove izoforme.5 µg/ml BiTE protein: 4°C 60 min; 2 µg/ml anti-I2C-Ab 3E5.A5: 4°C 30 min; kozji anti-mišji-PE 1:100: 4°C 30 min ;Slika 8: ;Ne-vezivanje za ParAloge i netransficirani CHO.5 µg/ml BiTE protein: 4°C 60 min; 2 µg/ml anti-I2C-Ab 3E5.A5: 4°C 30 min; kozji anti-mišji-PE 1:100: 4°C 30 min Slika 9: ;Mapiranje epitop klastera - Klaster E1 ;Slika 10: ;FLT3 scFc konstrukata antitela su aktivni korišćenjem nestimulisanog humanog PBMC protiv humanih FLT3-transficiranih CHO ćelija u odsustvu i prisustvu FLT3LG (FLT3 liganda) ;;Primeri: ;;[0278] Sledeći primeri ilustruju pronalazak. Ove primere ne treba tumačiti kao ograničenje opsega ovog pronalaska. Predmetni pronalazak je ograničen samo patentnim zahtevima. ;;;1 2 ;Primer 1 ;;Stvaranje CHO ćelija koje eksprimiraju divlji tip i himerni FLT3 ;;[0279] FLT3 antigen može biti podeljen u šest različitih poddomena ili regiona koje definišu, za svrhe primera 1 i 2. Aa sekvenca ovih pet poddomena je prikazana u SEQ ID NO: 814-818. ;;[280] Stvoreni su sledeći molekuli; vidite i Sliku 1: ;;; ;;; [0281] Za stvaranje CHO/HEK ćelija koje eksprimiraju humani, mišji i himerni ExtraCelluIrDomain (ECD), odgovarajuće kodirajuće sekvence za humani FLT3, mišji FLT3 i osam himernih humanih/mišjih FLT3 verzija (vidite gore) klonirane su u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Za ekspresiju na ćelijskoj površini humanog i mišjeg FLT3, korišćen je originalni signalni peptid. Svi postupci kloniranja su izvedeni u skladu sa standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3. izdanje, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Za svaki konstrukt, odgovarajući plazmid je transficiran u CHO ćelije sa nedostatkom DHFR za eukariotsku ekspresiju, kako je opisao Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. ;;;1 ;[0282] Ekspresija humanog, himernog i mišjeg FLT3 na CHO ćelijama je verifikovana u FACS testu. ;;Primer 2 ;;Mapiranje epitopa konstrukata anti-FLT3 antitela ;;[0283] Ćelije transficirane humanim, mišjim FLT3 i sa molekulima himernog humanog FLT3 (vidite primer 1) obojene su sirovim, nerazblaženim periplazmatičnim ekstraktom koji sadrži konstrukt bispecifičnog FLT3xCD3 antitela (gde je CD3 vezujući domen označen sa I2C) fuzionisan sa humanim albuminom (varijanta 1), u PBS-u/1,5%FCS. Vezani molekuli su detektovani interno razvijenim mišjim monoklonskim antitelom na CD3 vezujući domen (50 µl), zatim antimišjim IgG Fc-gama-PE (1:100, 50 µl; Jackson Immunoresearch br. 115-116-071). Sva antitela su razblažena u PBS-u / 1,5% FCS. Kao negativna kontrola, ćelije su inkubirane sa PBS-om / 2% FCS umesto periplazmatičnog ekstrakta. Uzorci su izmereni protočnom citometrijom. ;;[0284] Regioni koje su prepoznati odgovarajućim vezujućim domenima FLT3 su naznačeni u tabeli sekvenci (Tabela 2). Gubitak FACS signala u odgovarajućim himernim FLT3 konstruktima koji sadrže klaster mišjih epitopa je očitan za relevantnost odgovarajućeg klastera za vezivanje. Odgovarajući rezultati u tabeli 2 su u skladu sa rezultatima prema primeru 3. ;;Primer 3 ;;Generisanje CHO ćelija koje eksprimiraju divlji tip i skraćeni FLT3 ;;[0285] Ekstracelularni domen antigena FLT3 može se podeliti na različite poddomene ili regione, odnosno epitop klaster E1 do E6 koji su definisani, sledećim pozicijama aminokiselina: ;;; ;;;; 1 4 ; ;;; [0286] Za konstrukciju skraćenih molekula FLT3 koji se koriste za mapiranje epitopa (vidi sliku 3), sekvence odgovarajućih sedam humanih regiona, kao i pet kombinacija dva susedna humana regiona (vidi gore) zamenjeni su odgovarajućim regionima iz mišjeg FLT3. Štaviše, V5 oznaka (GKPIPNPLLGLDST) je fuzionisana preko "GGGGS" linkera sa C-terminusom himernih molekula. Konačne sekvence himernog molekula su prikazane u SEQ ID NO: 827-834. Pored toga, konstruisani su humani FLT3 pune dužine (SEQ ID NO: 801) i FLT3 pune dužine javanskog makakija (SEQ ID NO: 802), a oba sa V5 oznakom (GKPIPNPLLGLDST) fuzionisana preko "GGGGS" linkera sa svojim C-terminusom. ;;[0287] Za generisanje CHO dhfr- ćelija koje eksprimiraju gore navedene konstrukte, odgovarajuće sekvence kodiranja su klonirane u plazmid označen pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). CHO ćelije transficirane sa humanim FLT3, ali bez oznake V5, takođe su generisane. Sve procedure kloniranja su sprovedene u skladu sa standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Za svaki konstrukt, odgovarajući plazmid je transficiran u DHFR-deficijentne CHO ćelije za eukariotsku ekspresiju, kao što je opisano od strane Kaufman RJ (1990) Methods Enzymol.185, 537-566. Ekspresija konstrukata na CHO ćelijama je verifikovana pomoću monoklonskog mišjeg IgG2a anti-v5 tag antitela (1 µg/ml; AbD Serotec, # MCA 1360). Vezano monoklonsko antitelo je detektovano sa anti-mišjim IgG Fc-gama-PE. Kao negativna kontrola, ćelije su inkubirane sa antitelom izotip kontrole umesto prvog antitela. Uzorci su mereni protočnom citometrijom. ;;[0288] Rezultati ove analize prikazani su za obelodanjeni vezivač FLT3 u tabeli 2. Ti rezultati su u skladu sa analizom mapiranja epitopa prema primeru 2 ;;;1 ; ;;;; ;;; Primer 4 ;;Određivanje afiniteta antitela za humani i cyno FLT3 zasnovano na Biacore ;;[0289] Eksperimenti za Biacore analizu su izvršeni koristeći rekombinantne humane /cyno FLT3-ECD fuzione proteine sa albuminom kako bi se odredilo vezivanje cilja konstrukata antitela. ;;[0290] Detaljno, CM5 senzorski čipovi (GE Healthcare) imobilisani su sa približno 600-800 RU odgovarajućeg rekombinantnog antigena koristeći acetatni pufer pH 4,5 prema uputstvu ;;;1 ;proizvođača. Uzorci konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 su naneti u serijskim razblaženjima sa sledećim koncentracijama: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM i 3,13 nM razblaženje u HBS-EP radnom puferu (GE Healthcare). Protok je bio 30 µl/min tokom 3 minuta, zatim je nanet HBS-EP radni pufer tokom 8 minuta do 20 minuta pri protoku od 30 µl/ml. Regeneracija čipa je izvedena upotrebom rastvora 10 mM glicina 10 mM NaCl pH 1,5. Skupovi podataka su analizirani pomoću softvera BiaEval. Uopšteno, izvedena su dva nezavisna eksperimenta. Štaviše, vezivanje konstrukata bispecifičnih antitela za humani CD3 i CD3 makaki majmuna je potvrđeno u Biacore testu. ;;Primer 5 ;;Skačardova analiza afiniteta konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 prema FLT3 čoveka i makakija na ciljnim antigen pozitivnim ćelijama i određivanje razlike u afinitetu između vrsta ;;FLT3 ;;[0291] Afiniteti konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 prema CHO ćelijama transficiranim sa FLT3 čoveka ili makakija takođe su određeni Skačardovom analizom kao najpouzdanijim postupkom za merenje potencijalnih razlika u afinitetu između FLT3 čoveka i makakija. Kod Skačardove analize, izvode se eksperimenti zasićenog vezivanja koristeći jednovalentni detekcioni sistem za precizno određivanje jednovalentnog vezivanja konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 za odgovarajuću ćelijsku liniju. ;;[0292] 2 × 10<4>ćelija odgovarajuće ćelijske linije (CHO ćelijska linija koja eksprimira rekombinantni humani FLT3, CHO ćelijska linija koja eksprimira rekombinantni FLT3 makakija) inkubirano je sa 50 µl trostrukih serija razblaženja (dvanaest razblaženja sa 1:2) odgovarajućeg konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 (do dostizanja zasićenja), počevši od 10-20 nM, nakon čega sledi 16 h inkubacije na 4°C uz mešanje i jedan rezidualni korak ispiranja. Ćelije su zatim inkubirane još jedan sat sa 30 µl rastvora CD3xALEXA488 konjugata. Nakon jednog koraka ispiranja, ćelije su ponovo suspendovane u 150 µl FACS pufera koji sadrži 3,5% formaldehida, inkubirane su još 15 minuta, centrifugirane, ponovo suspendovane u FACS puferu i analizirane koristeći FACS Cantoll uređaj i FACS Diva softver. Podaci su dobijeni iz dva nezavisna skupa eksperimenata, pri čemu svaki koristi triplikate. Odgovarajuća ;;;1 ;Skačardova analiza je izračunata radi ekstrapolacije maksimalnog vezivanja (Bmax). Određene su koncentracije konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 na polovini maksimalnog vezivanja, odražavajući odgovarajuće KD. Vrednosti trostrukih merenja su iscrtane kao hiperbolične krive i kao krive u obliku slova „S“ kako bi se prikazali odgovarajući rasponi koncentracije od minimalnog do optimalnog vezivanja. ;;Primer 6 ;;Bispecifično vezivanje i unakrsna reaktivnost između vrsta ;;[0293] Da bi se potvrdilo vezivanje za humani FLT3 i CD3 i za cyno FLT3 i CD3, konstrukti bispecifičnog antitela ispitani su protočnom citometrijom koristeći ;;● CHO ćelije transficirane humanim FLT3 (SEQ ID NO: 801), sa izooblikom humanog FLT3 (izooblik humanog FLT3 (T227M) vidi SEQ ID NO: 803 i izooblik humanog FLT3-ITD vidi SEQ ID NO:804), odnosno FLT3 makakija (SEQ ID NO: 802), ;● ćelijske linije EOL-1, MOLM-13 i MV4-11 humanog AML pozitivne na FLT3 (ali su takođe moguće druge FLT3 pozitivne humane ćelijske linije) ;● HPB-all ćelijsku liniju T ćelijske leukemije koja eksprimira CD3 (DSMZ, Braunschweig, ACC483), i ;● LnPx 4119 T ćelijsku liniju koja eksprimira CD3 cinomolgusa ;;[0294] Za protočnu citometriju, 200.000 ćelija odgovarajućih ćelijskih linija inkubirano je 60 min na 4°C sa 50 µl prečišćenog konstrukta bispecifičnog antitela u koncentraciji od 5 µg/ml. Ćelije se dva puta isprane u PBS-u / 2% FCS i zatim inkubirane sa interno razvijenim mišjim antitelom (2 µg/ml) specifičnim za CD3 vezujući deo konstrukta bispecifičnog antitela tokom 30 minuta na 4°C. Nakon ispiranja, vezana mišja antitela su detektovana kozjim antimišjim Fcy-PE (1:100) tokom 30 minuta na 4°C. Uzorci su izmereni protočnom citometrijom. Kao negativna kontrola korišćene su netransficirane CHO ćelije. ;;;1 ; ;;; ;;; ;; Primer 7 ;Potvrda odsustva vezivanja za humane paraloge ;;1 ;[0295] Paralozi humanog FLT3 KIT v1(SEQ ID NO: 805), CSF1R v1 (SEQ ID NO: 806), PDGFRA (SEQ ID NO: 807) i NTM v3 (SEQ ID NO: 808) su stabilno transficirani u CHO ćelije. Sekvenca paraloga korišćena u predmetnom primeru je identifikovana u spisku sekvenci. ;;Tabela 4a: Identičnost paraloga sa FLT3 preko cele dužine proteinske sekvence ;;; ;;; Tabela 4b: Identičnost paraloga sa FLT3 preko ECD proteinske sekvence ;;; ;;; [296] Ekspresija proteina je potvrđena u FACS analizama sa specifičnim antitelima. Ispitivanje protočnom citometrijom je izvršeno kako je opisano u primeru 6. ;;Primer 8 ;;Identičnost sa humanom germinativnom linijom ;;[0297] Da bi se analizirala identičnost / sličnost sekvence konstrukta antitela sa genima humanog antitela germinativne linije, FLT3 vezujući domeni su poravnati na sledeći način: Poravnat je kompletan VL sa svim CDR; kompletan VH sa CDR 1 i 2, ali bez CDR3 poravnat je naspram gena humanog antitela germinativne linije (Vbase). Više detalja možete pronaći u specifikaciji ove prijave. ;;Primer 9 ;;Citotoksična aktivnost ;;;11 ;[0298] Potentnost konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 iz pronalaska za preusmeravanje efektorskih T ćelija na ciljne ćelije koje eksprimiraju FLT3 analizirana je u pet in vitro testova citotoksičnosti: ;;● Potentnost konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 za preusmeravanje stimulisanih humanih CD8+ efektorskih T ćelija na CHO ćelije transficirane humanim FLT3 merena je u 18-časovnom testu otpuštanja 51-hroma. ;;● Potentnost konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 za preusmeravanje stimulisanih humanih CD8+ efektorskih T ćelija na FLT3 pozitivne EOL-1, MOLM-13 i MV4-11 ćelijske linije (ali su takođe moguće druge FLT3 pozitivne humane ćelijske linije) humanog AML merena je u 18-časovnom testu otpuštanja 51-hroma . ;;● Potentnost konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 za preusmeravanje T ćelija u nestimulisanim humanim PBMC na CHO ćelije transficirane sa FLT3 merena je u 48-časovnom testu citotoksičnosti na bazi FACS. ;;Efektorske ćelije: nestimulisani humani PBMC (CD14-/CD56-). Ciljne ćelije: EOL-1. Odnos efektora i ciljne ćelije (E:T): 10:1. BiTE protein kao što je naznačeno ;;; ;;; [0299] Efektorske ćelije: nestimulisani humani PBMC (CD14-/CD56-). Ciljne ćelije: MV4-11. Odnos efektora i ciljne ćelije (E:T): 10:1. BiTE protein kao što je naznačeno. ;;; ; ;;; ● Potentnost konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 za preusmeravanje T ćelija u nestimulisanim humanim PBMC na FLT3 pozitivne humane ćelijske linije EOL-1, MOLM-13 i MV4-11 (ali su takođe moguće druge FLT3 pozitivne humane ćelijske linije) merena je u 48-časovnom testu citotoksičnosti na bazi FACS. ;;● Da bi se potvrdilo da su unakrsno reaktivni konstrukti bispecifičnog antitela FLT3xCD3 sposobni da preusmeravaju T ćelije makakija na CHO ćelije transficirane sa FLT3 makakija, obavljen je 48-časovni test citotoksičnosti na bazi FACS sa T ćelijskom linijom makakija kao efektorskim T ćelijama. ;;[0300] Efektorske ćelije: nestimulisani humani PBMC (CD14-/CD56-). Ciljne ćelije: mac FLT3 transficirane CHO ćelije. Odnos efektora prema ciljnoj ćeliji (E:T): 10:1. BiTE protein kao što je naznačeno. ;;; ;;; ● Potentnost konstrukata bispecifičnog antitela FLT3xCD3 u preusmeravanju T ćelija u nestimulisane humane PBMC humane CHO ćelije transficirane sa FLT3 u odsustvu i prisustvu FLT3 liganda merena je u 48-časovnom testu citotoksičnosti na bazi FACS. Efektorske ćelije: nestimulisani humani PBMC (CD14-/CD56-). Ciljne ćelije: hu FLT3 transficirane CHO ćelije. Odnos efektora i ciljne ćelije (E:T): 10:1. BiTE protein kao što je naznačeno. ;;; ; ;;; Primer 10.1 ;;Analiza otpuštanja hroma sa stimulisanim humanim T ćelijama ;;[0301] Stimulisane T ćelije obogaćene CD8<+>T ćelijama dobijene su kako je opisano u nastavku. Petrijeva posuda (prečnika 145 mm, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) premazana je komercijalno dostupnim anti-CD3 specifičnim antitelom (OKT3, Orthoclone) u finalnoj koncentraciji od 1 µg/ml tokom 1 sata na 37°C. Nevezani protein je uklonjen jednim korakom ispiranja PBS-om. 3 - 5 × 10<7>humanih PBMC je dodato u prethodno premazanu Petrijevu posudu u 120 ml RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom / 10% FCS / IL-2 20 U/ml (Proleukin®, Chiron) i stimulisano tokom 2 dana. Trećeg dana, ćelije su sakupljene i jednom isprane sa RPMI 1640. IL-2 je dodat do finalne koncentracije od 20 U/ml i ćelije su ponovo uzgajane jedan dan u istom medijumu za uzgajanje ćelija kao gore. CD8<+>citotoksični T limfociti (CTL) obogaćeni su iscrpljivanjem CD4<+>T ćelija i CD56<+>NK ćelija koristeći Dynal perlice prema proizvođačevom protokolu. ;CHO ciljne ćelije transficirane sa cyno FLT3 ili humanim FLT3 dva puta su isprane PBS-om i obeležene sa 11,1 MBq<51>Cr u konačnoj zapremini od 100 µl RPMI sa 50% FCS tokom 60 minuta na 37°C. Obeležene ciljne ćelije su zatim isprane 3 puta sa 5 ml RPMI i potom korišćene u testu citotoksičnosti. Test je obavljen u ploči sa 96 bunarčića sa ukupnom zapreminom od 200 µl sa dodatkom RPMI uz odnos E:T od 10:1. Korišćena je početna koncentracija od 0,01 - 1 µg/ml prečišćenog konstrukta bispecifičnog antitela i njegova trostruka razblaženja. Vreme ;;;11 ;inkubacije za test je bilo 18 sati. Citotoksičnost je određena kao relativne vrednosti otpuštenog hroma u supernatantu u odnosu na razliku maksimalne lize (dodavanje Triton-X) i spontane lize (bez efektorskih ćelija). Sva merenja su obavljena u četiri primerka. Merenje aktivnosti hroma u supernatantima izvedeno je u gama brojaču Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Köln, Nemačka). Analiza rezultata je izvršena pomoću Prism 5 za Windows (verzija 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, SAD). EC50 vrednosti izračunate pomoću programa za analizu iz sigmoidalnih kriva odgovora i doze korišćene su za poređenje citotoksične aktivnosti. ;;Primer 10.2 ;;Potentnost za preusmeravanje stimulisanih humanih efektorskih T ćelija na CHO ćelije transficirane humanim FLT3 ;;[0302] Citotoksična aktivnost konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 analizirana je u testu citotoksičnosti sa otpuštanjem 51-hroma (<51>Cr) koristeći CHO ćelije transficirane humanim FLT3 kao ciljne ćelije i stimulisane humane CD8+ T ćelije kao efektorske ćelije. Eksperiment je izveden kako je opisano u primeru 10.1. ;;Primer 10.3 ;;Potentnost za preusmeravanje stimulisanih humanih efektorskih T ćelija na humane ćelijske linije pozitivne na FLT3 ;;[0303] Citotoksična aktivnost konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 analizirana je u testu citotoksičnosti sa otpuštanjem 51-hroma (<51>Cr) koristeći EOL-1, MOLM-13 i MV4-11 ćelijske linije humanog AML pozitivne na FLT3 kao izvor ciljnih ćelija i stimulisane humane CD8+ T ćelije kao efektorske ćelije. Test je izveden kako je opisano u primeru 10.1. ;;Primer 10.4 ;;Analiza citotoksičnosti zasnovana na FACS sa nestimulisanim humanim PBMC ;;Izolovanje efektorskih ćelija ;[0304] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) čoveka pripremljene su gradijentnim centrifugiranje sa fikolom iz obogaćenih preparata limfocita (frakcija leukocita i trombocita), koji su sporedni proizvod banaka krvi koje sakupljaju krv za transfuziju. Lokalna banka krvi je obezbedila frakcije leukocita i trombocita, a PBMC su pripremljene na dan sakupljanja krvi. Nakon gradijentnog centrifugiranja sa fikolom i opsežnog ispiranja Dulbekovim PBS-om (Gibco), preostali eritrociti su uklonjeni iz PBMC putem inkubacije sa eritrocitnim puferom za lizu (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 100 µM EDTA). Trombociti su uklonjeni putem supernatanta nakon centrifugiranja PBMC na 100 x g. Preostali limfociti uglavnom obuhvataju B i T limfocite, NK ćelije i monocite. PBMC su držane u kulturi na 37°C/5% CO2u RPMI medijumu (Gibco) sa 10% FCS (Gibco). ;;Iscrpljivanje CD14<+>i CD56<+>ćelija ;;[0305] Za iscrpljivanje CD14<+>ćelija, korišćene su humane CD14 MicroBeads (Milteny Biotec, MACS, br.130-050-201),a za iscrpljivanje NK ćelija humane CD56 MicroBeads (MACS, br. ;130-050-401). PBMC su prebrojane i centrifugirane tokom 10 min na sobnoj temperaturi sa 300 x g. Supernatant je odbačen, i ćelijski pelet resuspendovan u MACS puferu za izolovanje [80 µl/ 10<7>ćelija; PBS (Invitrogen, br.20012-043), 0,5% (V/V) FBS (Gibco, br.10270-106), 2 mM EDTA (Sigma-Aldrich, br. E-6511)]. CD14 MicroBeads i CD56 MicroBeads (20 µl/10<7>ćelija) dodate su i inkubirane tokom 15 minuta na 4-8°C. Ćelije su isprane MACS puferom za izolovanje (1-2 ml/10<7>ćelija). Nakon centrifugiranja (vidite gore), supernatant je odbačen i ćelije su ponovu suspendovane u MACS puferu za izolovanje (500 µl/10<8>ćelija). Zatim su izolovane CD14/CD56 negativne ćelije koristeći LS kolone (Miltenyi Biotec, br.130-042-401). PBMC bez CD14+/CD56+ ćelija su uzgajane u RPMI kompletnom medijumu, tj. RPMI1640 (Biochrom AG, br. FG1215) sa dodatkom 10% FBS (Biochrom AG, br. S0115), 1x neesencijalnih aminokiselina (Biochrom AG, br. K0293), 10 mM Hepes pufera (Biochrom AG, br. L1613), 1 mM natrijum piruvata (Biochrom AG, br. L0473) i 100 U/ml penicilina/streptomicina (Biochrom AG, br. A2213) na 37°C u inkubatoru sve dok je to potrebno. ;;Obeležavanje ciljne ćelije ;;;11 ;[0306] Za analizu ćelijske lize u testovima protočne citometrije, fluorescentna membranska boja DiOC18(DiO) (Molecular Probes, br. V22886) korišćena je za obeležavanje CHO ćelija transficiranih humanim FLT3 ili FLT3 makakija kao ciljnih ćelija i za njihovo razlikovanje od efektorskih ćelija. Ukratko, ćelije su sakupljene, isprane jednom PBS-om i podešene na 10<6>ćelija/ml u PBS-u sa 2% (V/V) FBS i membranskom bojom DiO (5 µl/10<6>ćelija). Nakon inkubacije tokom 3 minute na 37°C, ćelije su dva puta isprane u kompletnom RPMI medijumu, i broj ćelija je podešen na 1,25 × 10<5>ćelija/ml. Vitalnost ćelija je određena koristeći 0,5% (V/V) izotonični rastvor EosinG (Roth, br.45380). ;;Analiza na bazi protočne citometrije ;;[0307] Ovaj test je osmišljen da kvantifikuje lizu CHO ćelija transficiranih sa cyno ili humanim FLT3 u prisustvu serijskih razblaženja konstrukta bispecifičnog antitela FLT3. Pomešane su jednake zapremine DiO-obeleženih ciljnih ćelija i efektorskih ćelija (tj. PBMC bez CD14<+>ćelija), što daje odnos E:T ćelija od 10:1.160 µl ove suspenzije je prebačeno u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića. Dodato je 40 µl serijskih razblaženja konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 i bispecifičnog antitela za negativnu kontrolu (konstrukt bispecifičnog antitela na bazi CD3 koji prepoznaje nevažan ciljni antigen) ili RPMI kompletnog medijuma kao dodatna negativna kontrola. Citotoksična reakcija posredovana bispecifičnim antitelom je nastavljena 48 sati u 7% CO2humidifikovanom inkubatoru. Ćelije su zatim prebačene u novu ploču sa 96 bunarčića, i gubitak integriteta membrane ciljne ćelije je praćen dodatkom propidijum jodida (PI) u finalnoj koncentraciji od 1 µg/ml. PI je membranski nepropusna boja koja se obično isključuje iz vijabilnih ćelija, dok je mrtve ćelije preuzimaju i postaju prepoznatljive putem fluorescentne emisije. ;;[0308] Uzorci su izmereni protočnom citometrijom na instrumentu FACSCanto II i analizirani pomoću softvera FACSDiva (oba od kompanije Becton Dickinson). Ciljne ćelije su identifikovane kao DiO-pozitivne ćelije. PI-negativne ciljne ćelije su klasifikovane kao žive ciljne ćelije. Procenat citotoksičnosti je izračunat prema sledećoj formuli: ;; ;; n = broj događaja ;;;11 ;[0309] Koristeći softver GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego), procenat citotoksičnosti je prikazan u odnosu na odgovarajuće koncentracije konstrukta bispecifičnog antitela. Krive odgovora na dozu su analizirane logističkim regresionim modelima sa četiri parametra za procenu sigmoidalnih krivih odgovora na dozu sa fiksnim nagibom, i izračunate su vrednosti EC50. ;;Primer 10.5 ;;Potentnost za preusmeravanje nestimulisanih humanih PBMC na CHO ćelije transficirane humanim FLT3 ;;[0310] Citotoksična aktivnost konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 analizirana je u testu citotoksičnosti na bazi FACS, koristeći CHO ćelije transficirane humanim FLT3 kao ciljne ćelije, i nestimulisane humane PBMC kao efektorske ćelije. Test je izveden kako je prethodno opisano u primeru 8.4. ;;Primer 10.6 ;;Potentnost za preusmeravanje nestimulisanog humanog PBMC na ćelijske linije humanog karcinoma jajnika pozitivne na FLT3 ;;[0311] Citotoksična aktivnost konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 nadalje je analizirana u testu citotoksičnosti na bazi FACS koristeći FLT3-pozitivne ćelijske linije humanog AML EOL-1, MOLM-13 i MV4-11 kao izvor ciljnih ćelija i nestimulisane humane PBMC kao efektorske ćelije. Test je izveden kako je prethodno opisano u primeru 8.4. ;;Primer 10.7 ;;Potentnost za preusmeravanje T ćelija makakija na CHO ćelije koje eksprimiraju FLT3 makakija ;;[0312] Konačno, citotoksična aktivnost konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 analizirana je u testu citotoksičnosti na bazi FACS koristeći CHO ćelije transficirane sa FLT3 makakija (cyno) kao ciljne ćelije, a 4119LnPx T ćelijsku liniju makakija (Knappe et al. Blood ;;;11 ;95:3256-61 (2000)) kao izvor efektorskih ćelija. Obeležavanje ciljnih CHO ćelija transficiranih sa FLT3 makakija i analiza citotoksične aktivnosti na bazi protočne citometrije obavljeni su kao što je prethodno opisano. ;;Primer 11 ;;Konverzija monomera u dimer nakon (i) tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja i (ii) 7 dana inkubacije pri 250 µg/ml ;;[0313] Konstrukt bispecifičnog monomernog antitela FLT3xCD3 je podvrgnut različitim stresnim uslovima, a zatim SEC visokih performansi, kako bi se odredio procenat prvobitno monomernih konstrukta antitela koji su konvertovani u konstrukte dimernog antitela. ;;(i) 25 µg konstrukta monomernog antitela je podešeno na koncentraciju od 250 µg/ml sa generičkim puferom za formulaciju i zatim zamrznuto na -80°C tokom 30 minuta, i odmrzavano tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja, sadržaj dimera je određen pomoću HP-SEC. ;;(ii) 25 µg konstrukta monomernog antitela je podešeno na koncentraciju od 250 µg/ml sa generičkim puferom za formulaciju, i inkubirano na 37°C tokom 7 dana. Sadržaj dimera je određen pomoću HP-SEC. ;;[0314] SEC kolona visoke rezolucije TSK Gel G3000 SWXL (Tosoh, Tokyo-Japan) povezana je na Äkta Purifier 10 FPLC (GE Lifesciences) opremljen automatskim uzorkivačem A905. Pufer za uravnoteženje kolone i radni pufer sastojao se od 100 mM KH2PO4 - 200 mM Na2SO4 podešenog na pH 6,6. Rastvor antitela (25 µg proteina) nanet je na uravnoteženu kolonu i eluacija je obavljena pri protoku od 0,75 ml/min sa maksimalnim pritiskom od 7 MPa. Čitav ciklus je praćen prema optičkoj apsorbanci na 280, 254 i 210 nm. Analiza je obavljena integracijom pika signala od 210 nm zabeleženog u radnom listu za procenu ciklusa softvera Äkta Unicorn. Sadržaj dimera je izračunat deljenjem površine dimernog pika sa ukupnom oblašću monomernog i dimernog pika. ;;Primer 12 ;;;11 ;Termostabilnost ;;[0315] Temperatura agregacije antitela je određena na sledeći način: 40 µl rastvora konstrukta antitela sa 250 µg/ml preneto je u kivetu za jednokratnu upotrebu i stavljeno u uređaj za dinamično rasipanje svetlosti DynaPro Nanostar kompanije Wyatt (Wyatt). Uzorak je zagrevan od 40°C do 70°C, brzinom zagrevanja 0,5°C/min sa konstantnom akvizicijom merenog radijusa. Povećanje radijusa koji ukazuje na topljenje proteina i agregaciju korišćeno je u softverskom paketu isporučenom sa DLS uređajem za izračunavanje temperature agregacije konstrukta antitela. ;;Primer 13 ;;Stabilnost nakon 24 sata inkubacije u ljudskoj plazmi ;;[0316] Prečišćeni konstrukti bispecifičnog antitela inkubirani su u odnosu 1:5 u objedinjenoj humanoj plazmi na 37°C tokom 96 sati u finalnoj koncentraciji od 2-20 µg/ml. Nakon inkubacije u plazmi, konstrukti antitela su upoređeni u testu otpuštanja 51-hroma sa stimulisanim obogaćenim humanim CD8+ T ćelijama i CHO ćelijama transficiranim humanim FLT3 sa početnom koncentracijom 0,01-0,1 µg/ml i sa odnosom efektorske i ciljne ćelije (E:T) od 10:1 (test kao što je opisan u primeru 8.1). Kao kontrola su uključeni neinkubirani, sveže odmrznuti konstrukti bispecifičnog antitela. ;;Primer 14 ;;Zamućenost pri koncentraciji antitela od 2500 µg/ml ;;[0317] 1 ml rastvora prečišćenog konstrukta antitela sa koncentracijom od 250 µg/ml koncentrovan je centrifugalnim koncentratorom do 2500 µg/ml. Nakon 16 h skladištenja na 5°C, zamućenost rastvora antitela je određena merenjem optičke apsorpcije OD340 nm u odnosu na generički pufer za formulaciju. ;;Primer 15 ;;Homogenost proteina putem katjonsko izmenjivačke hromatografije visoke rezolucije ;;;11 ;[0318] Homogenost proteina konstrukta antitela analizirana je pomoću katjonsko izmenjivačke hromatografije visoke rezolucije CIEX. ;;[0319] 50 µg monomera konstrukta antitela je razblaženo sa 50 ml vezujućeg pufera A (20 mM natrijum dihidrogen fosfat, 30 mM NaCl, 0,01% natrijum oktanat, pH 5,5), i 40 ml ovog rastvora je naneto na BioPro SP-F kolonu od 1 ml (YMC, Nemačka) povezanu na uređaj Äkta Micro FPLC (GE Healthcare, Nemačka). Nakon vezivanja uzorka, obavljen je korak ispiranja dodatnim vezujućim puferom. Za eluaciju proteina, linearni rastući gradijent soli upotrebom pufera B (20 mM natrijum dihidrogen fosfat, 1000 mM NaCl, 0,01% natrijum oktanat, pH 5,5) do 50% procenta pufera B nanet je na 10 zapremina kolona. Čitav ciklus je praćen prema optičkoj apsorbanci na 280, 254 i 210 nm. Analiza je obavljena integracijom pika signala od 280 nm zabeleženog u radnom listu za procenu ciklusa softvera Äkta Unicorn. ;;Primer 16 ;;Površinska hidrofobnost izmerena pomoću HIC butila ;;[0320] Površinska hidrofobnost konstrukta bispecifičnih antitela prema pronalasku ispitana je u hromatografiji hidrofobne interakcije HIC u protočnom režimu. ;;[0321] 50 µg monomera konstrukta antitela je razblaženo generičkim puferom za formulaciju do finalne zapremine od 500 µl (10 mM limunska kiselina, 75 mM lizin HCl, 4% trehaloza, pH 7,0) i naneto na FF kolonu butil sefaroze od 1 ml (GE Healthcare, Nemačka) povezanu na sistem Äkta Purifier FPLC (GE Healthcare, Nemačka). Čitav ciklus je praćen prema optičkoj apsorbanci na 280, 254 i 210 nm. Analiza je obavljena integracijom pika signala od 280 nm zabeleženog u radnom listu za procenu ciklusa softvera Äkta Unicorn. Ponašanje pri eluiranju je procenjeno poređenjem površine i brzine uspona i pada proteinskog signala, čime se ukazuje na jačinu interakcije BiTE fuzije albumina sa matricom. ;;Primer 17 ;;Razlika u potentnosti između monomernog i dimernog izooblika konstrukta bispecifičnih antitela ;;;12 ;[0322] Da bi se utvrdila razlika u citotoksičnoj aktivnosti između monomernog i dimernog izooblika pojedinačnih konstrukta bispecifičnog antitela FLT3xCD3 (koja se naziva razlika u potentnosti), 18-časovni test citotoksičnosti sa otpuštanjem hroma-51 je sproveden kao što je ovde prethodno opisano (primer 10.1) sa prečišćenim monomerom i dimerom konstrukta bispecifičnog antitela. Efektorske ćelije su stimulisane obogaćenim humanim CD8+ T ćelijama. Ciljne ćelije su CHO ćelije transficirane sa hu FLT3. Odnos efektora i ciljne ćelije (E:T) bio je 10:1. Razlika u potentnosti je izračunata kao odnos između vrednosti EC50. ;;; ;;; Primer 18 ;;Konkurencija FLT3 liganda u vezivanju FLT3 veziva za njegov cilj ;;[0323] Ovaj test je sproveden kako bi se ispitalo da li bi rastvorljivi FLT3 ligand poremetio vezivanje anti-FLT3 vezujućih domena za FLT3. ;;[0324] Da bi se verifikovalo vezivanje humanog FLT3 liganda za CHO ćelije transficirane humanim FLT3, ćelije su inkubirane sa humanim FLT3 ligandom tokom 30 minuta na 4°C. ;Vezani FLT3 ligand je detektovan sa anti-HIS antitelom (5 µg/ml; AbD Serotec) praćen antimišjim IgG Fc-gama-PE (1:100; Jackson Immunoresearch # 115-116-071). Kao negativne kontrolne ćelije su inkubirane sa PBS/2%FCS umesto CD27. ;;[0325] Da bi se testirala konkurencija/zamena veziva FLT3 ligandom FLT3, CHO ćelije koje su transficirane sa humanim FLT3 inkubirane su sa ili bez liganda FLT3 tokom 30 minuta na 4°C (ligand 10 µg/FLT3). Nakon toga ćelije nisu isprane, već direktno obojene FLT3 vezivom (scFv). Vezani scFv su detektovani sa mišjim monoklonskim anti-FLAG M2 antitelima (1 µg/ml; Sigma F1804), a zatim anti-mišjim IgG Fc-gama-PE (1:100; Jackson Immunoresearch # 115-116-071). Kao negativna kontrola, ćelije su inkubirane sa nespecifičnim scFv umesto sa FLT3 scFv. FLT3 ligand i sva antitela su razblažena u PBS sa 2%FCS. ;;[0326] Za procenu podataka, medijana fluorescencije je detektovana putem FACS. Gubitak više od 25% signala kao rezultat konkurencije sa FLT3 ligandom shvaćen je kao značajan uticaj na vezivanje. Ovo se može shvatiti kao značajna sterna interakcija za isti domen FLT3. Sva veziva iznad praga od 75% ;;(medijana [+ ligand] / medijana [bez liganda]* 100 ≥ 75%)

(što važi za FL-1 do FL-65) identifikovana su kao neosetljiva za konkurenciju FLT3 liganda. Interakcija FLT3 liganda sa njegovim receptorom u literaturi je opisano da se odvija u regionu koji odgovara epitopskom klasteru 3. Stoga se očekivalo da će sva veziva koja su identifikovana u našem skriningu biti specifična za epitopski klaster 3, kao i ona za susedni klaster 2 i 4, biti značajno pogođena u signalu medijane fluorescencije konkurencijom sa FLT3 ligandom. Očekivanja su generalno bila tačna. Iznenađujuće, FL-53, FL-54, FL-61, F-62, FL-63 i FL-64, koji se svi vezuju za epitopski klaster 3, i dalje su pokazali signal iznad praga.

[0327] Štaviše, s obzirom na interakciju FLT3 liganda sa regionom klastera epitopa 3, dalje je pretpostavljeno da vezivo za udaljeniji klaster epitopa, kao što je klaster 1 od FLT3, neće biti pod uticajem konkurencije FLT3 liganda. Međutim, postojao je značajan broj veziva, koji se nisu kvalifikovali za prag od 75%. Vezivo FL-1 do FL-53, FL-55 do FL-60 i FL-65 bilo je u grupi veziva koja nisu osetljiva na konkurenciju liganda FLT3.

nci

ve

sek

ak

pis

5:S

a

el

Tab

Claims (20)

Patentni zahtevi

1. Konstrukt antitela koji sadrži prvi vezujući domen koji se vezuje za humani FLT3 na površini ciljne ćelije i drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za epitop FLT3 koji je sadržan u regionu prikazanom u SEQ ID NO: 819, pri čemu pomenuti konstrukt antitela je najmanje bispecifičan.

2. Konstrukt antitela prema zahtevu 1, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za humani i FLT3 makaki majmuna.

3. Konstrukt antitela prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je konstrukt antitela u formatu izabranom iz grupe koja se sastoji od (scFv)2, scFv-jednodomenskog mAb, diatela i oligomera tih formata.

4. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih zahteva,

pri čemu prvi vezujući domen sadrži VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabrane iz grupe koja se sastoji od:

SEQ ID NO: 151-156, SEQ ID NO: 161-166, SEQ ID NO: 171-176, SEQ ID NO:

181-186, SEQ ID NO: 191-196, SEQ ID NO: 201-206, SEQ ID NO: 211-216, SEQ

ID NO: 221-226, SEQ ID NO: 231-236, SEQ ID NO: 241-246, SEQ ID NO: 251-256,

SEQ ID NO: 261-266, SEQ ID NO: 271-276, SEQ ID NO: 281-286, SEQ ID NO:

291-296, SEQ ID NO: 301-306, SEQ ID NO: 311-316, SEQ ID NO: 321-326, SEQ

ID NO: 331-336, SEQ ID NO: 341-346, SEQ ID NO: 351-356, SEQ ID NO: 361-366,

SEQ ID NO: 371-376, SEQ ID NO: 381-386, SEQ ID NO: 391-396, SEQ ID NO:

401-406, SEQ ID NO: 411-416, SEQ ID NO: 421-426, SEQ ID NO: 431-436, SEQ

ID NO: 441-446, SEQ ID NO: 451-456, SEQ ID NO: 461-466, SEQ ID NO: 471-476,

SEQ ID NO: 481-486, SEQ ID NO: 491-496, SEQ ID NO: 501-506, SEQ ID NO:

511-516, SEQ ID NO: 521-526, SEQ ID NO: 531-536, SEQ ID NO: 541-546, SEQ

ID NO: 551-556, SEQ ID NO: 561-566, SEQ ID NO: 571-576, SEQ ID NO: 581-586,

SEQ ID NO: 591-596, SEQ ID NO: 601-606, SEQ ID NO: 611-616, SEQ ID NO:

621-626, SEQ ID NO: 631-636, SEQ ID NO: 641-646, SEQ ID NO: 651-656, SEQ

ID NO: 661-666, SEQ ID SEQ ID NO: 691-696, SEQ ID NO: 701-706, SEQ ID NO: 711-716, SEQ ID NO: 721-726, SEQ ID NO: 731-736, SEQ ID NO: 741-746, i SEQ ID NO: 791-796.

5. Konstrukt antitela prema zahtevu 4, pri čemu prvi vezujući domen sadrži VH region izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO:

167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ

ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO:

257, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 297, SEQ

ID NO: 307, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO:

347, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 387, SEQ

ID NO: 397, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO:

437, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 477, SEQ

ID NO: 487, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO:

527, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: 557, SEQ ID NO: 567, SEQ

ID NO: 577, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO:

617, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ

ID NO: 667, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO:

727, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 747 i SEQ ID NO: 797.

6. Konstrukt antitela prema zahtevu 4 ili 5, pri čemu prvi vezujući domen sadrži VL region izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 748 i SEQ ID NO: 798.

7. Konstrukt antitela prema bilo kom od zahteva 4 do 6, pri čemu prvi vezujući domen sadrži VH region i VL region izabran iz grupe koja se sastoji od parova VH regiona i VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 157+158, SEQ ID NO: 167+168,

SEQ ID NO: 177+178, SEQ ID NO: 187+188, SEQ ID NO: 197+198, SEQ ID NO:

207+208, SEQ ID NO: 217+218, SEQ ID NO: 227+228, SEQ ID NO: 237+238, SEQ

ID NO: 247+248, SEQ ID NO: 257+258, SEQ ID NO: 267+268, SEQ ID NO:

277+278, SEQ ID NO: 287+288, SEQ ID NO: 297+298, SEQ ID NO: 307+308, SEQ

ID NO: 317+318, SEQ ID NO: 327+328, SEQ ID NO: 337+338, SEQ ID NO:

347+348, SEQ ID NO: 357+358, SEQ ID NO: 367+368, SEQ ID NO: 377+378, SEQ

ID NO: 387+388, SEQ ID NO: 397+398. , SEQ ID NO: 407+408, SEQ ID NO:

417+418, SEQ ID NO: 427+428, SEQ ID NO: 437+438, SEQ ID NO: 447+448, SEQ

ID NO: 457+458, SEQ ID NO: 467+468, SEQ ID NO: 477+478, SEQ ID NO:

487+488, SEQ ID NO: 497+498, SEQ ID NO: 507+508, SEQ ID NO: 517+518, SEQ

ID NO: 527+528, SEQ ID NO: 537+538, SEQ ID NO: 547+548, SEQ ID NO:

557+558, SEQ ID NO: 567+568, SEQ ID NO: 577+578, SEQ ID NO: 587+588, SEQ

ID NO: 597+598, SEQ ID NO: 607+608, SEQ ID NO: 617+618, SEQ ID NO:

627+628, SEQ ID NO: 637+638, SEQ ID NO: 647+648, SEQ ID NO: 657+658, SEQ

ID NO: 667+668, SEQ ID NO: 697+698, SEQ ID NO: 707+708, SEQ ID NO:

717+718, SEQ ID NO: 727+728, SEQ ID NO: 737+738, SEQ ID NO: 747+748 i SEQ ID NO: 797+798.

8. Konstrukt antitela prema bilo kom od zahteva 4 do 7, pri čemu prvi vezujući domen sadrži polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od onih opisanih u SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID

24

NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749 i SEQ ID NO: 799.

9. Konstrukt antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu se drugi vezujući domen vezuje za humani CD3 epsilon i za CD3 epsilon Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus ili Saimiri sciureus.

10. Konstrukt antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 9, koji sadrži

a) polipeptid koji sadrži sledećim redom počevši od N-terminusa

● polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749 i SEQ ID NO: 799;

• peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9; i

● polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103; i

● opciono His-oznaka, kao ona prikazana u SEQ ID NO: 10;

(b) polipeptid koji sadrži sledećim redom počevši od N-terminusa:

● polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799;

● peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9;

● polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103

● opciono peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9;

● polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 104-134; i

● opciono His-oznaku, kao ona koja je prikazana u SEQ ID NO 10;

(c) polipeptid koji sadrži sledećim redom počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu QRFVTGHFGGLX1PANG (SEQ ID NO: 135), pri čemu X1je Y ili H; i

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID

24

NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799;

• peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9;

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 i SEQ ID NO: 103;

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 137) ili QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 139); i

• opciono His-oznaku, kao što je ona prikazana u SEQ ID NO 10;

(d) polipeptid koji sadrži sledećim redom počevši od N-terminusa

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98, i SEQ ID NO: 101;

• peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8; • polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 458, SEQ ID

24

NO: 468, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 508,

SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 548, SEQ ID

NO: 558, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 598,

SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 638, SEQ ID

NO: 648, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 708,

SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 748 i SEQ ID NO: 798 i serin ostatak na C-terminusu;

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 140; i polipeptid koji sadrži sledećim redom počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od

SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID

NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 237,

SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 277, SEQ ID

NO: 287, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 327,

SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 367, SEQ ID

NO: 377, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 417,

SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 457, SEQ ID

NO: 467, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 507,

SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 547, SEQ ID

NO: 557, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 597,

SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 637, SEQ ID

NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 707,

SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 747 i SEQ ID NO: 797;

• peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8; • polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99, i SEQ ID NO: 102 i serin ostatak na C-terminusu;

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 141;

(e) polipeptid koji sadrži sledećim redom počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53,

24

SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98, i SEQ ID NO: 101;

• peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8; • polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od

SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID

NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 238,

SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 278, SEQ ID

NO: 288, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 328,

SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 368, SEQ ID

NO: 378, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 418,

SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 458, SEQ ID

NO: 468, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 508,

SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 548, SEQ ID

NO: 558, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 598,

SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 638, SEQ ID

NO: 648, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 708,

SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 748 i SEQ ID NO: 798;

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 142; i polipeptid koji sadrži sledećim redom počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od

SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID

NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 237,

SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 277, SEQ ID

NO: 287, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 327,

SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 367, SEQ ID

NO: 377, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 417,

SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 457, SEQ ID

NO: 467, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 507,

SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 547, SEQ ID

NO: 557, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 597,

SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 637, SEQ ID

NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 707,

24

SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 747 i SEQ ID NO: 797;

• peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8; • polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99, i SEQ ID NO: 102 i serin ostatak na C-terminusu;

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 143;

(f) polipeptid koji sadrži sledećim redom počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od

SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID

NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799;

• peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9; i

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 i SEQ ID NO: 103; i

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 144; i polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 145;

(g) polipeptid koji sadrži sledećim redom počevši od N-terminusa:

24

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od

SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID

NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799; i

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 146; i polipeptid koji sadrži sledećim redom počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55,

SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:

100, i SEQ ID NO: 103; i

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 147;

(h) polipeptid koji sadrži sledećim redom počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od

SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID

NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599,

2

SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799; i

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 148; i polipeptid koji sadrži sledećim redom počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55,

SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:

100, i SEQ ID NO: 103; i

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 149;

(i) polipeptid koji sadrži sledećim redom počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od

SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID

NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799;

• peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9; i

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55,

SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:

100, i SEQ ID NO: 103; i

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 150; ili

2 1

(j) polipeptid koji sadrži sledećim redom počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od

SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID

NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, i SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 279, i SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 319, i SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, i SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, i SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 419, i SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 449, i SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 479, i SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 519, i SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 549, i SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 579, i SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, i SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, i SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, i SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, i SEQ ID NO: 799;

• peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9; i

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55,

SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:

100, i SEQ ID NO: 103;

• peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 1-9; i

• treći domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 843-850.

11. Konstrukt antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 10, koji sadrži ili se sastoji od polipeptida kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NO: 856 do 871.

12. Konstrukt antitela prema zahtevu 1, koji sadrži ili se sastoji od polipeptida kao što je prikazano u SEQ ID NO: 862.

2 2

13. Polinukleotid koji kodira konstrukt antitela kako je definisano u bilo kom od prethodnih zahteva.

14. Vektor koji se sastoji od polinukleotida kako je definisano u zahtevu 13.

15. Ćelija domaćin transformisana ili transficirana polinukleotidom kako je definisan u zahtevu 13 ili vektorom kako je definisan u zahtevu 14.

16. Postupak za proizvodnju konstrukta antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 12, a navedeni proces obuhvata kultivaciju ćelije domaćina kako je definisano u zahtevu 15, pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju konstrukta antitela kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 12 i rekuperaciju proizvedenog konstrukta antitela iz kulture.

17. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konstrukt antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 12, ili proizvedenu prema postupku iz zahteva 16.

18. Konstrukt antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 12, ili proizveden prema postupku iz zahteva 16, za upotrebu u prevenciji ili lečenju hematološkog kancera ili metastatskog kancera.

19. Konstrukt antitela za upotrebu prema zahtevu 18, pri čemu hematološki kancer je AML ili metastatski kancer izveden iz bilo kog od gore navedenih.

20. Komplet koji sadrži konstrukt antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 12, konstrukt antitela proizveden prema procesu iz zahteva 16, polinukleotid kako je definisan u zahtevu 13, vektor kako je definisan u zahtevu 14 i/ili ćeliju domaćina kako je definisana u zahtevu 15.

2

Sažetak

Predmetno obelodanjivanje se odnosi na konstrukt bispecifičnog antitela koji se sastoji od prvog vezujućeg domena koji se vezuje za humani FLT3 na površini ciljne ćelije i drugog vezujućeg domena koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije. Štaviše, obelodanjivanje obezbeđuje polinukleotid koji kodira konstrukt antitela, vektor koji sadrži navedeni polinukleotid i ćeliju domaćina transformisanu ili transficiranu navedenim polinukleotidom ili vektorom. Štaviše, obelodanjivanje obezbeđuje proces za proizvodnju konstrukta antitela obelodanjivanja, medicinsku upotrebu navedenog konstrukta antitela i komplet koji sadrži navedeni konstrukt antitela.

2 4