RS64065B1 - Monoklonska antitela protiv klaudina-18 za lečenje kancera - Google Patents

Description

Opis

[0001] Terapije za lečenje kancera na bazi antitela potencijalno imaju veću specifičnost i manje sporedne efekte u poređenju sa uobičajenim lekovima. Razlog je to što antitela precizno razlikuju normalne i neoplastične ćelije, kao i činjenica da njihov način delovanja počiva na manje toksičnim imunološkim antitumorskim mehanizmima kao što su aktivacija komplementa i mobilisanje citotoksičnih imunih ćelija.

[0002] Ciljna mesta za terapije bazirane na primeni antitela treba da poseduju određene kvalitete koji su osnov za dobro razlikovanje normalnih i neoplastičnih ćelija. Očigledno, ciljno mesto koje je ograničeno isključivo na tumorske ćelije i koje je potpuno nedetektabilno na normalnim tkivima idealno je za razvijanje efikasnih i bezbednih terapijskih antitela. U drugom aspektu, visok nivo preterane ekspresije može biti osnov za terapijski prozor i niske sporedne efekte, kao na primer u slučaju receptora tipa 2 za humani faktor rasta epiderma (HER-2) koji, kao rezultat amplifikacije gena, predstavlja dobro ciljno mesto za antitelo trastuzumab (Herceptin).

[0003] Druga ciljna mesta za antitela za lečenje tumora koja su već odobrena ili su u kliničkoj fazi razvijanja, imaju posebne kvalitete koji se ne zasnivaju na količinski preteranoj ekspresiji ciljnih molekula na tumorskim ćelijama. U slučaju antitela na proteoglikan MUC-1, peptidni ponavljajući epitop osovine cilja manje je glikozilovan u tumorskim ćelijama i, kao takav, drugačiji je u odnosu na svog normalnog ekvivalenta. U slučaju antitela na CD20 (rituksimab), CD52 (Campath-1H) i CD22 (epratuzumab), ciljna mesta za antitela imaju uporedive nivoe ekspresije na tumorskim ćelijama i normalnim limfocitima. U ovakvim slučajevima, ablacija normalnih ćelija antitelima može da se toleriše, s obzirom na to da matične ćelije negativne na ciljno mesto obnavljaju normalnu populaciju limfocita. Drugi primeri diferencijalnog pristupanja ciljnim mestima antitela su karcinoembrionski antigen (CEA) i karboanhidraza IX (CA9). Oba antigena eksprimiraju se u normalnom epitelu debelog creva i bubrega, respektivno. Međutim, radioaktivno obeležena imidžing-antitela prave dobru razliku između tumorskog i normalnog tkiva, a citotoksična antitela se dobro tolerišu. Ovo je najverovatnije zbog ograničenosti ekspresije CA9 i CEA na lumensku stranu normalnog epitelnog tkiva, gde IgG antitela nemaju pristup. Adhezioni molekul epitelnih ćelija (Ep-CAM) takođe pripada ovoj kategoriji. Kao homotipski molekul ćelijske adhezije za epitelne ćelije, lokalizovan je u međućelijskom prostoru. Zanimljivo, dok su visokoafinitetna anti-Ep-CAM antitela veoma toksična, antitela srednjeg afiniteta dobro se tolerišu. Ovo sugeriše da je moguć pristup Ep-CAM cilju na normalnim ćelijama, ali i ukazuje da kinetika vezivanja antitela može otvoriti terapijski prozor.

[0004] Jedna mogućnost je ta da drugi proteini specifični za epitelne ćelije, uključeni u međućelijske adhezije, mogu takođe biti privlačni za pristupe bazirane na primeni antitela, s obzirom na to da mogu da budu teško dostupni za antitela u slučaju dobro struktuiranih epitela, ali postaju izloženi kada su na tumorskim ćelijama. Autori navoda su dakle analizirali proteine uključene u organizaciju arhitekture epitelnog tkiva, u smislu njihove pogodnosti da budu ciljna mesta za terapijska antitela. Protein koji je posebno privukao pažnju autora navoda je klaudin-18.

[0005] Molekul klaudin 18 (CLD18) (Genbank pristupni broj: splajsna varijanta 1 (CLD18A1): NP_057453, NM_016369 i splajsna varijanta 2 (CLD18A2): NM_001002026, NP_001002026) integrisani je transmembranski protein sa molekulskom težinom od približno 27,9 / 27,72 kD. Klaudini su integrisani membranski proteini lokalizovani u čvrstim spojevima epitela i endotela. Čvrsti spojevi organizuju mrežu međusobno povezanih traka sačinjenih od unutarmembranskih čestica, između susednih ćelija. U čvrstim spojevima, okludin i klaudini su najistaknutije transmembranske proteinske komponente. Zahvaljujući snažnim međućelijskim adhezionim svojstvima, oni formiraju primarnu barijeru koja sprečava i kontroliše paraćelijski transport rastvoraka i ograničava lateralnu difuziju membranskih lipida i proteina, kako bi se održala polarizovanost ćelije. Proteini koji formiraju čvrste spojeve kritični su za organizovanje arhitekture epitelnog tkiva. Autori navoda su pretpostavili da su u dobro strukturiranim epitelima takvi proteini teško dostupni antitelima, ali da na tumorskim ćelijama postaju izloženi.

[0006] CLD18 četiri puta prolazi kroz membranu i, prema tome, ima 4 hidrofobna regiona. Autori navoda su dobili podatke koji ukazuju na to da CLD18 pokazuje nekoliko različitih konformacija prema kojima se antitela odnose selektivno. Jedna konformacija (CLD18-konformacija-1) podrazumeva da su formirana sva četiri hidrofobna regiona koja služe kao regularni transmembranski domeni (TM) i dve ekstracelularne petlje (petlja 1 ograničena hidrofobnim regionom 1 i hidrofobnim regionom 2; petlja 2 ograničena hidrofobnim regionima 3 i 4), kako je opisano za veliku većinu članova porodice klaudina. Druga konformacija (CLD18-konformacija-2) podrazumeva da, kao što je opisano za PMP22, koji je drugi član familije proteina koji četiri puta prolaze kroz membranu (Taylor et al., J. Neurosc. Res.62:15-27, 2000), drugi i treći hidrofobni domen ne prolaze u potpunosti kroz plazminu membranu, tako da je deo (petljaD3) između prvog i četvrtog transmembranskog domena izvan ćelije. Treća konformacija (CLD18-konformacija-3) podrazumeva veliki ekstracelularni domen od dva unutrašnja hidrofobna regiona, ograničen prvim i četvrtim hidrofobnim regionom koji služe kao regularni transmembranski domeni. Zbog prisustva klasičnog N-glikozilacionog mesta u petljiD3, topološke varijante klaudina-18, CLD18 topologija-2 i CLD18 topologija-3, nose dodatno ekstracelularno N-glikozilaciono mesto.

[0007] Drugi nivo kompleksnosti molekulu CLD18 dodaje prisustvo dve različite splajsne varijante koje su opisane kod miša i čoveka (Niimi, Mol. Cell. Biol.21:7380-90, 2001). Splajsne varijante CLD18A1 i CLD18A2 razlikuju se po prvoj 21 amino-kiselini na N-kraju, gde se nalazi prvi TM i petlja1, dok je primarna proteinska sekvenca na C-kraju identična.

[0008] CLD18A1 eksprimira se selektivno na normalnom epitelu pluća i želuca, dok se CLD18A2 eksprimira samo na ćelijama želuca (Niimi, Mol. Cell. Biol.21:7380-90, 2001). Što je najvažnije, CLD18A2 ograničen je na diferencirane kratkoživeće ćelije epitela želuca, ali ga nema u oblasti želudačnih matičnih ćelija. Korišćenjem senzitivnog RT-PCR, autori navoda su pokazali da nijedna od ove dve varijante ne može da se detektuje ni u jednom drugom normalnom ljudskom organu, ali se u velikoj meri eksprimiraju u nekoliko tipova kancera, uključujući tumore želuca, jednjaka, pankreasa i pluća, kao i humane ćelijske linije kancera. U tom smislu, pozivamo se na primer na WO2004/047863 i EP1790664, od kojih prvi takođe opisuje monoklonska antitela koja se vezuju za CLD18A1 i CLD18A2. Ekspresija je najizraženija u adenokarcinomskim podtipovima ovih indikacija.

[0009] Molekulska težina proteina razlikuje se kod nekih kancera i susednog normalnog tkiva. Protein veće molekulske težine, zapažen u zdravom tkivu, može da se prevede u protein molekulske težine sa kojom se sreće u kanceru tako što se lizat tkiva tretira deglikozilujućim jedinjenjem PNGazom F. Ovo sugeriše da je CLD18 manje N-glikozilovan u kanceru nego u njegovom normalnom tkivnom ekvivalentu. Ova strukturna razlika verovatno daje izmenjeni epitop. Klasični N-glikozilovani motiv je na poziciji ak 116 u okviru petljaD3-domena molekula.

[0010] Termini "CLD18" i "varijanta CLD18" u skladu sa navodima, obuhvataju (i) CLD18 splajsne varijante, (ii) CLD18 N-glikozilovane varijante, (iii) CLD18 konformacione varijante, (iv) CLD18 slobodne i homotipski/heterotipski asocirane varijante lokalizovane u međućelijskim čvrstim spojevima i (v) CLD18 varijante povezane sa kancerom i CLD18 varijante nepovezane sa kancerom.

[0011] Molekularne i funkcionalne karakteristike CLD18 čine da ovaj molekul bude veoma zanimljiv kao cilj za terapiju kancera koja se bazira na primeni antitela. Posebno, to su (i) odsustvo CLD18 iz većine normalnih tkiva od značaja za toksičnost, (ii) ograničenost ekspresije varijante CLD18A2 na nadoknadivu populaciju ćelija kao što su diferencirane ćelije želuca koje mogu da se nadoknade pomoću cilj-negativnih matičnih ćelija želuca, (iii) naznake moguće diferencijalne glikozilacije normalnih i neoplastičnih ćelija i (iv) prisustvo različitih konformacionih topologija. Štaviše, uloga CLD18 kao proteina čvrstih spojeva može dalje da doprinese dobrom terapijskom okviru. Zbog toga što tumorske ćelije eksprimiraju klaudine, ali često ne obrazuju klasične čvrste spojeve homotipskim i heterotipskim udruživanjem klaudina kao u normalnom epitelnom tkivu, tumorske ćelije mogu posedovati znatan pul slobodnog klaudina koji je pristupačan za vezivanje ekstracelularnih antitela i imunoterapiju. Moguće je da su u zdravom epitelu vezujući epitopi klaudina unutar čvrstih spojeva zaštićeni od pristupa takvih antitela.

[0012] Osim toga, visoka ekspresija na plazma membrani primećena prema navodima, ne samo za primarne tumore, već i za metastaze izvedene iz primarnih tumora koji eksprimiraju CLD18A2, posebno tumora želuca, čini CLD18A2-specifična antitela vrednim sredstvom za prevenciju, lečenje i/ili dijagnozu metastaze kancera, posebno metastaze koja potiče od tumora želuca, kao što je metastaza u limfnim čvorovima, peritonealna metastaza i Krukenbergovi tumori.

[0013] Cilj navoda je obezbeđivanje antitela korisnih za lečenje bolesti u kojima se eksprimira CLD18, kao što su tumorske bolesti. Ovde opisana antitela korisna su takođe za dijagnostikovanje takvih bolesti.

REZIME

[0014] Predmetni navodi, u glavnim crtama, obezbeđuju antitela koja su korisna kao terapijska sredstva za lečenje i/ili prevenciju bolesti udruženih sa ćelijama koje eksprimiraju CLD18, uključujući bolesti povezane sa tumorima kao što su kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća, kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer jajnika, kancer debelog creva, kancer jetre, kancer glave i vrata i kancer žučne kesice i njihove metastaze, posebno metastazu kancera želuca, kao što su Krukenbergovi tumori peritonealna metastaza i metastaza u limfnim čvorovima.

[0015] U jednom aspektu, navodi se odnose na antitelo koje ima sposobnost da se veže za CLD18. Poželjno, antitelo ima sposobnost vezivanja za CLD18 eksprimiran na površini ćelije i poželjno se vezuje za jedan ili više epitopa koji se nalaze unutar ekstracelularnih delova CLD18, poželjno unutar prvog ekstracelularnog domena (pozicije aminokiselina 29 do 78 u CLD18). Poželjno, antitelo iz učenja se vezuje za jedan ili više peptida izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 151, 153, 155, 156 i 157. Poželjno, antitelo se vezuje za ćelije kancera, posebno ćelije pomenutih tipova kancera gore i, poželjno, ne vezuje se suštinski za nekancerozne ćelije. Poželjno, vezivanje pomenutog antitela za ćelije koje eksprimiraju CLD18, kao što su ćelije kancera, posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLD18. Poželjno, antitelo se vezuje za CLD18A1 i CLD18A2 i poželjnije vezuje se za CLD18A2, ali ne za CLD18A1. Poželjno, antitela prema navodima se vezuju za i specifična su za petlju 1 ili petlju 2 CLD-konformacije-1. U daljim poželjnim primerima izvođenja, antitelo navoda se vezuje za i specifično je za petlju D3 CLD-konformacije-2 i, naročito, vezuje se na, ili oko potencijalnog N-glikozilacionog mesta na poziciji 116 unutar petlje D3. U sledećim primerima izvođenja, antitelo prema navodima je specifično za neglikozilovani oblik potencijalnog N-glikozilacionog mesta na poziciji 116 unutar petlje D3.

[0016] Poželjno, vezivanje antitela prema navodima za CLD18A2 uključuje jednu ili više aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od Ala na poziciji 42, Asn na poziciji 45 i Glu na poziciji 56 u CLD18A2 (SEQ ID NO:2). Poželjno je da se antitela prema navodima ne vezuju za varijante CLD18A2 ili njihove fragmente, pri čemu su jedna ili više, poželjno sve aminokiseline na ovim pozicijama zamenjene drugom aminokiselinom, posebno onim aminokiselinama koje se nalaze na odgovarajućim pozicijama unutar CLD18A1 (SEQ ID NO:8) (Ala42Ser, Asn45Gln i Glu56Gln).

[0017] Ubijanje ćelija od strane antitela prema navodima je poželjno indukovano vezivanjem antitela za CLD18 eksprimiranog od strane navedenih ćelija, poželjnije vezivanjem antitela za CLD18A2 eksprimiranog od strane navedenih ćelija. U jednom primeru izvođenja, vezivanje antitela prema navodima za CLD18A1 eksprimiranog od strane navedenih ćelija ne indukuje ubijanje navedenih ćelija. Takvo ubijanje ćelija može da se koristi u terapijske svrhe, kao što je ovde opisano. Konkretno, ubijanje ćelija može da se koristi za lečenje ili prevenciju kancera, posebno metastaze kancera i metastatskog širenja ćelija kancera.

[0018] Ćelije koje eksprimiraju CLD18 su, poželjno, ćelije kancera i, posebno, odabrane su iz grupe koja se sastoji od tumorogenih ćelija kancera želuca, jednjaka, pankreasa, pluća, jajnika, debelog creva, jetre, glave i vrata i žučne kesice.

[0019] Poželjno, antitelo prema navodima posreduje u ubijanju ćelija indukcijom lize posredovane preko citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC), lize posredovane preko ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), apoptoze, homotipske adhezije i/ili fagocitoze, poželjno indukcijom CDC posredovane lize i/ili ADCC posredovane lize.

[0020] U jednom primeru izvođenja antitelo navoda ne indukuje lizu ćelija posredovanu preko CDC.

[0021] Poželjno, ADCC-posredovana liza ćelija odvija se u prisustvu efektorskih ćelija koje se, u posebnim primerima izvođenja, biraju iz grupe koja se sastoji od monocita, mononuklearnih ćelija, NK ćelija i PMN ćelija, a fagocitozu obavljaju makrofage.

[0022] Antitelo prema navodima može da bude monoklonsko, himerno, humano ili humanizovano antitelo, ili fragment antitela i može da se bira iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, poželjno IgG2a i IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, sekretornog IgA, IgD i IgE antitela.

[0023] Prema svim aspektima navoda, CLD18 je, poželjno, humani CLD18, poželjno humani CLD18A2 i, poželjno, CLD18A2 ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO:2, a CLD18A1 poželjno ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO:8.

[0024] U posebno poželjnim primerima izvođenja, antitelo prema navodima vezuje se za nativne epitope CLD18 prisutnog na površini živih ćelija. U drugim poželjnim primerima izvođenja, antitelo prema navodima specifično je za ćelije kancera, poželjno za ćelije kancera želuca.

[0025] U određenim primerima izvođenja navoda, CLD18 eksprimira se na površini ćelija.

[0026] Antitela prema navodima mogu da se dobiju postupkom koji uključuje korak imunizovanja životinje proteinom ili peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:2, 4, 6, 16, 18, 20, 21-23, 26-31, 151, 153 i 155-157 ili imunogenim fragmentom ili derivatom istih, ili nukleinskom kiselinom ili ćelijom-domaćinom koja eksprimira pomenuti protein ili peptid, ili imunogeni fragment ili derivat istog. Poželjno, antitelo navoda specifično je za gore pomenute proteine, peptide ili njihove imunogene fragmente ili derivate. U kontekstu proteina ili peptida koji se koristi u imunizaciji, derivat se odnosi na varijantu takvog proteina ili peptida koji ima ista ili slična imunogena svojstva kao protein ili peptid iz kojeg je izveden. Posebno, derivat proteina ili peptida kada se koristi u imunizaciji za proizvodnju antitela, posebno monoklonskih antitela, obezbeđuje antitela koja imaju istu specifičnost kao i antitela dobijena kada se protein ili peptid koristi u imunizaciji. Na primer, takav derivat može da uključuje deleciju, supstituciju ili adiciju jedne ili više aminokiselina. Konkretno, može da uključuje adiciju jedne ili više aminokiselina kao što je cistein na N-kraju ili C-kraju ili na oba kraja, ili zamenu cisteinskih ostataka serinskim ostacima. Ovde predstavljeni podaci otkrivaju aminokiseline unutar CLD18 koje nisu kritične za vezivanje antitela. Shodno tome, CLD proteini, peptidi, njihovi imunogeni fragmenti ili njihovi derivati, kako je ovde opisano, korišćeni za imunizaciju, mogu da sadrže jednu ili više supstitucija aminokiselina na navedenim pozicijama aminokiselina koje nisu kritične za vezivanje antitela.

[0027] U posebno poželjnom primeru izvođenja, antitelo prema navodima je proizvedeno pomoću klona koji ima pristupni br. DSM ACC2737 (182-D1106-055), DSM ACC2738 (182-D1106-056), DSM ACC2739 (182-D1106-057), DSM ACC2740 (182-D1106-058), DSM ACC2741 (182-D1106-059), DSM ACC2742 (182-D1106-062), DSM ACC2743 (182-D1106-067), DSM ACC2745 (182-D758-035), DSM ACC2746 (182-D758-036), DSM ACC2747 (182-D758-040), DSM ACC2748 (182-D1106-061), DSM ACC2808 (182-D1106-279), DSM ACC2809 (182-D1106-294) ili DSM ACC2810 (182-D1106-362).

[0028] U jednom primeru izvođenja, antitelo prema navodima povezano je sa terapijskim sredstvom kao što je toksin, radioizotop, lek, ili citotoksično sredstvo.

[0029] U dodatnom aspektu navodi se odnose na hibridom sposoban da proizvodi antitelo prema navodima. Poželjni hibridomi su oni koji imaju pristupni br. DSM ACC2737 (182-D1106-055), DSM ACC2738 (182-D1106-056), DSM ACC2739 (182-D1106-057), DSM ACC2740 (182-D1106-058), DSM ACC2741 (182-D1106-059), DSM ACC2742 (182-D1106-062), DSM ACC2743 (182-D1106-067), DSM ACC2745 (182-D758-035), DSM ACC2746 (182-D758-036), DSM ACC2747 (182-D758-040), DSM ACC2748 (182-D1106-061), DSM ACC2808 (182-D1106-279), DSM ACC2809 (182-D1106-294) ili DSM ACC2810 (182-D1106-362).

[0030] Antitela prema navodima u ovom tekstu označavaju se prema oznaci antitela, npr. 182-D758-035, i/ili prema klonu koji proizvodi antitelo, npr.26D12.

[0031] Navodi se takođe odnose na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo navoda i/ili njegov konjugat sa terapeutskim sredstvom i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0032] U sledećem aspektu, navodi se odnose na postupak za inhibiciju rasta i/ili ubijanja ćelije koja eksprimira CLD18, poželjno CLD18A2, koji sadrži dovođenje u kontakt ćelije sa efikasnom količinom antitela prema navodima i/ili njegovog konjugata sa terapeutskim sredstvom. CLD18 je poželjno eksprimiran na površini navedene ćelije.

[0033] U sledećem aspektu, navodi se odnose na postupak za lečenje ili prevenciju bolesti ili poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CLD18, poželjno CLD18A2 koji sadrži primenu na subjekta antitela prema navodima, njegovog konjugata sa terapeutskim sredstvom ili farmaceutske kompozicije koja sadrži antitelo prema navodima ili njegov konjugat sa terapeutskim sredstvom. Poželjno, bolest ili poremećaj je bolest povezana sa tumorom i naročito primeri izvođenja su izabrani iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, kancera pankreasa, kancera pluća, kancera jajnika, kancera debelog creva, kancera jetre, kancera glave i vrata i kancera žučne kesice i metastaza koje od njih potiču. CLD18 je poželjno eksprimiran na površini navedenih ćelija.

[0034] Poželjno, antitela prema navodima imaju sposobnost da razlikuju CLD18-varijante eksprimirane od strane različitih ćelijskih tipova uključujući ćelije kancera i nemaligne ćelije. U naročito poželjnom primeru izvođenja, antitela prema navodima imaju sposobnost da se vežu za CLD18A2, dok se ne vezuju za CLD18A1, ili se vezuju za CLD18A1 sa nižom specifičnošću u poređenju sa vezujućom specifičnošću za CLD18A2.

[0035] Termin "vezivanje", prema navodima, poželjno se odnosi na specifično vezivanje. "Specifično vezivanje" znači da se sredstvo kao što je antitelo jače vezuje za cilj kao što je epitop, za koji je specifično, u poređenju sa vezivanjem za drugi cilj. Sredstvo se vezuje jače za prvi cilj nego za drugi cilj ako se za prvi cilj vezuje sa konstantom disocijacije (KD) koja je niža od konstante disocijacije za drugi cilj. Poželjno, konstanta disocijacije (KD) za cilj za koji se sredstvo specifično vezuje više je od 10 puta, poželjno više od 20 puta, poželjnije više od 50 puta, još poželjnije više od 100 puta, 200 puta, 500 puta ili 1000 puta niža nego konstanta disocijacije (KD) za cilj za koji se sredstvo ne vezuje specifično.

[0036] Poželjno, antitela prema navodima imaju konstantu disocijacije za CLD18, poželjno CLD18A2 koja je 10<-6>M ili manja, poželjno 10<-7>M ili manja, poželjno 10<-8>M ili manja, ili poželjno 10<-9>M ili manja. Poželjno, antitela prema navodima imaju konstantu disocijacije za CLD18, poželjno CLD18A2 koja je u opsegu od 10<-8>do 10<-9>M.

[0037] Antitela prema navodima posreduju u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLD18, poželjno CLD18A2, vezivanjem za CLD18 koji je, poželjno, eksprimiran na površini pomenutih ćelija. U jednom primeru izvođenja, antitela prema navodima indukuju komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. najmanje oko 20-40% CDC-posredovane lize, poželjno oko 40-50% CDC-posredovane lize i, poželjnije, više od 50% CDC-posredovane lize ćelija koje eksprimiraju CLD18. Takva antitela predstavljena su u ovom tekstu sledećim antitelima kao primerima: 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 163E12, 175D10, 45C1, 125E1, ch-163E12 i ch-175D10. Alternativno ili dodatno u odnosu na indukovanje CDC, antitela prema navodima mogu da indukuju ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) ćelija koje eksprimiraju CLD18, u prisustvu efektorskih ćelija (npr., monociti, mononuklearne ćelije, NK ćelije i PMN). Takva antitela predstavljena su u ovom tekstu sledećim antitelima kao primerima: 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 42E12, 163E12, 175D10, 45C1 i 125E1. Antitela prema navodima mogu da imaju sposobnost da indukuju apoptozu ćelija koje eksprimiraju CLD18, da indukuju homotipsku adheziju ćelija koje eksprimiraju CLD18 i/ili da indukuju fagocitozu ćelija koje eksprimiraju CLD18, u prisustvu makrofaga. Antitela prema navodima mogu imati jednu ili više od prethodno navedenih funkcionalnih svojstava. Poželjno, antitela prema navodima indukuju CDC-posredovanu lizu i ADCC-posredovanu lizu ćelija koje eksprimiraju CLD18 i, poželjnije, indukuju ADCC-posredovanu lizu ćelija koje eksprimiraju CLD18, dok ne indukuju CDC-posredovanu lizu pomenutih ćelija. Primeri ćelija ciljnih za antitela predmetnih navoda uključuju, ali se ne ograničavaju na ćelije kancera koje eksprimiraju CLD18, poželjno CLD18A2, kao što su tumorogene ćelije kancera želuca, pankreasa, jednjaka i pluća. U posebno poželjnom primeru izvođenja, ubijanje ćelija posredovano antitelima prema navodima je CLD18A2-specifično, tj. antitela prema navodima posreduju u ubijanju ćelija, poželjno u CDC- i/ili ADCC-posredovanoj lizi ćelija koje eksprimiraju CLD18A2, ali ne posreduju u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLD18A1, a ne eksprimiraju CLD18A2. Antitela opisana gore mogu da se koriste za posredovanje u ubijanju tumorskih ćelija prilikom lečenja ili prevencije kancera kao što su kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća, kancer jajnika, kancer debelog creva, kancer jetre, kancer glave i vrata i kancer žučne kesice i/ili njihove metastaze.

[0038] Antitela prema navodima mogu da se razvrstaju u različite klase na osnovu svojih osobina vezivanja i sposobnosti da posreduju u efektorskoj funkciji na ćelijama koje eksprimiraju CLD18. Antitela prema navodima mogu da se razvrstaju prema svojim:

•osobinama vezivanja i/ili efektorskim funkcijama posredovanim na ćelijama koje eksprimiraju ili CLD18A1 ili CLD18A2 (razlikovanje splajsnih varijanti CLD18),

•osobinama vezivanja i/ili efektorskim funkcijama posredovanim na ćelijama koje eksprimiraju ili glikozilovane ili neglikozilovane varijante CLD18 (razlikovanje varijanti CLD18 sa i bez N-glikozilacije),

•osobinama vezivanja i/ili efektorskim funkcijama posredovanim na ćelijama kancera ili na normalnim tipovima ćelija (razlikovanje varijanti CLD18 koje eksprimiraju tumorske ćelije ili normalne nemaligne ćelije),

•osobinama vezivanja za CLD18-epitope maskirane formiranjem čvrstih spojeva,

•sposobnostima da indukuju formiranje agregata CLD18 na živim ćelijama i

•sposobnostima da se vezuju za nehumanu varijantu CLD18, posebno varijantu CLD18 miševa, pacova, zečeva i primata.

[0039] Antitela prema navodima mogu imati jednu ili više sledećih osobina, pri čemu se poziva na specifične primere antitela prema navodima opisane u ovom tekstu (24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43A11, ch-45C1, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2, ch-175D10):

a) vezivanje za CLD18A2 kao i za CLD18A1 (npr. 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 61C2 i 41C6)

b) vezivanje za CLD18A2, ali ne i za CLD18A1 (npr. 26B5, 37G11, 38G5, 42E12 i 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43A11, ch-45C1, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2, ch-175D10)

c) vezivanje za CLD18 koji prirodno eksprimiraju tumorske ćelije, ali ne i za CLD18 koji prirodno eksprimiraju ćelije koje nisu kancerske ili tkiva kao što su ćelije želuca i pluća (npr. 26B5, 75B8, 24H5, 39F11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10)

1

d) posredovanje u CDC-indukovanom ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLD18A2, ali ne i ćelija koje eksprimiraju CLD18A1 (npr. 26D12, 28D10, 37H8 i 39F11, 163E12, ch-125E1, ch-163E12, ch-175D10)

e) posredovanje u ADCC-indukovanom ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLD18 (npr.

26B5, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 47D12 i 61C2, ch-163E12, ch-175D10)

f) posredovanje u ADCC-indukovanom ubijanju, ali ne i u CDC-indukovanom ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLD18 (npr.37G11, 42E12 i 43A11)

g) posredovanje u ADCC-indukovanom ubijanju i CDC-indukovanom ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLD18A2 (npr.37H8, 38H3, 39F11, ch-163E12, ch-175D10).

[0040] Kako je u ovom tekstu pokazano primerima, antitela prema navodima dalje obuhvataju molekule koji se

a) vezuju za diferencirane ćelije normalnog želuca, ali ne i za matične ćelije želuca (npr.

39F11)

b) ne vezuju za normalno želudačno tkivo ni za druge normalne organe, nego isključivo za ćelije kancera (npr.26B5)

c) vezuju za epitop koji obuhvata neglikozilovani Asn na poziciji 116 CLD18

d) vezuju za humani, kao i za mišji CLD18, čime se omogućava temeljno sprovođenje pretkliničkih studija toksičnosti na miševima.

[0041] Antitela prema navodima mogu da potiču iz različitih vrsta uključujući, ali se ne ograničavajući na miša, pacova, zeca, zamorca i čoveka. Antitela prema navodima takođe uključuju himerne molekule u kojima je konstantni region antitela izveden iz jedne vrste, poželjno čoveka, kombinovan sa antigen-vezujućim mestom poreklom iz druge vrste. Pored toga, antitela prema navodima uključuju humanizovane molekule u kojima su antigen-vezujuća mesta antitela izvedena iz nehumanih vrsta kombinovana sa konstantnim regionima i regionima okvira humanog porekla.

[0042] Antitela prema navodima obuhvataju poliklonska i monoklonska antitela i uključuju IgG2a (npr. IgG2a, κ, λ), IgG2b (npr. IgG2b, κ, λ), IgG3 (npr. IgG3, κ, λ) i IgM antitela. Međutim, drugi izotipovi antitela takođe su obuhvaćeni navodima, uključujući antitela IgG1, IgA1, IgA2, sekretorno IgA, IgD i IgE antitelo. Antitela mogu biti cela antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, uključujući, na primer, Fab, F(ab’)2, Fv, jednolančane Fv fragmente ili bispecifična antitela. Pored toga, antigen-vezujući fragmenti uključuju vezujući domenimunoglobulinske fuzione proteine koji sadrže (i) polipeptid vezujućeg domena (npr. varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca) fuzionisan sa polipeptidom zglobnog regiona imunoglobulina, (ii) CH2 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa zglobnim regionom i (iii) CH3 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa CH2 konstantnim regionom. Takvi fuzioni proteini vezujućeg domena imunoglobulina objavljeni su detaljnije u US2003/0118592 i US 2003/0133939.

[0043] Antitela prema predmetnim navodima poželjno disociraju od CLD18 sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od približno 1-100 nM ili manjom.

[0044] Poželjno, antitela prema navodima ne reaguju unakrsno sa srodnim ćelijskim površinskim antigenima i ne inhibiraju njihovu funkciju.

[0045] U poželjnim primerima izvođenja, antitela prema predmetnim navodima mogu da se karakterišu jednom ili većim brojem navedenih osobina:

a) specifičnošću za CLD18, posebno, specifičnošću za CLD18A2;

b) afinitetom vezivanja za CLD18, posebno CLD18A2, od oko 100 nM ili manje, poželjno, oko 5-10 nM ili manje i, poželjnije, oko 1-3 nM ili manje,

c) sposobnošću da posreduju u visokom nivou CDC na CD55/59 negativnim ili CD55/59 pozitivnim ćelijama;

d) sposobnošću da inhibiraju rast ćelija koje eksprimiraju CLD18;

e) sposobnošću da indukuju apoptozu ćelija koje eksprimiraju CLD18;

f) sposobnošću da indukuju homotipsku adheziju ćelija koje eksprimiraju CLD18; g) sposobnošću da indukuju ADCC ćelija koje eksprimiraju CLD18 u prisustvu efektorskih ćelija;

h) sposobnošću da produže preživljavanje subjekta koji nosi tumorske ćelije koje eksprimiraju CLD18;

i) sposobnošću da odstrane ćelije koje eksprimiraju CLD18;

j) sposobnošću da odstrani ćelije koje eksprimiraju niske nivoe CLD18 i/ili

k) sposobnošću da agregiraju CLD18 na površini živih ćelija.

[0046] Anti-CLD18 antitela prema predmetnim navodima mogu da se derivatizuju, vežu ili koeksprimiraju sa drugim vezujućim specifičnostima. U posebnom primeru izvođenja, navodi obezbeđuju bispecifični ili multispecifični molekul koji uključuje najmanje jednu prvu vezujuću specifičnost za CLD18 (npr., anti-CLD18 antitelo ili mimetik istog) i drugu vezujuću specifičnost za efektorsku ćeliju, kao što je vezujuća specifičnost za Fc receptor (npr., Fc-gama receptor, kao što je Fc-gama RI, ili neki drugi Fc receptor) ili T-ćelijski receptor, npr., CD3.

[0047] Prema tome, predmetni navodi uključuju bispecifične i multispecifične molekule koji se vezuju i za CLD18 i za Fc receptor ili T-ćelijski receptor, npr. CD3. Primeri Fc receptora su receptor za IgG, Fc-gama receptor (FcγR), npr. FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD16). Drugi Fc receptori, npr. IgA receptori (npr., FcαRI), takođe mogu biti ciljani. Fc receptor je poželjno lociran na površini efektorske ćelije, npr., monocita, makrofaga ili aktivirane mononuklearne ćelije. U poželjnom primeru izvođenja, bispecifični i multispecifični molekuli vezuju se za Fc receptor na mestu koje je različito od Fc za imunoglobulin (npr., IgG ili IgA). Prema tome, vezivanje bispecifičnih i multispecifičnih molekula ne blokira se fiziološkim nivoima imunoglobulina.

[0048] U još jednom aspektu, anti-CLD18 antitela prema navodima su derivatizovana, vezana za ili koeksprimirana sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom (npr., Fab’ fragment). Na primer, antitelo prema navodima može biti funkcionalno povezano (npr., hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnim udruživanjem ili na drugi način) sa jednim ili više drugih molekulskih entiteta, kao što su drugo antitelo (npr. da se proizvede bispecifično ili multispecifično antitelo), citotoksin, ćelijski ligand ili antigen (npr. da se proizvede imunokonjugat kao što je imunotoksin). Antitelo prema predmetnim navodima može biti povezano sa drugim terapijskim komponentama, npr., radioizotopom, antikancerskim lekom sa malim molekulom, rekombinantnim citokinom ili hemokinom. Prema tome, predmetni navodi obuhvataju veliki broj različitih konjugata antitela, bispecifičnih i multispecifičnih molekula i fuzionih proteina, koji se vezuju za ćelije koje eksprimiraju CLD18 i koji mogu da se koriste za usmeravanje drugih molekula ka takvim ćelijama.

[0049] U daljem aspektu, navodi takođe predviđaju CLD18-vezujuće proteine koji potiču iz neimunoglobulinskih domena, posebno jednolančane proteine. Takvi vezujući proteini i postupci za njihovu proizvodnju opisani su, na primer, u Binz et al. (2005) Nature Biotechnology 23 (10): 1257-1268. Podrazumeva se da se ovde dati navodi u vezi sa imunoglobulinima ili vezujućim molekulima izvedenim iz imunoglobulina shodno tome takođe primenjuju na vezujuće molekule koji potiču iz neimunoglobulinskih domena. Konkretno, korišćenjem takvih vezujućih molekula koji potiču iz neimunoglobulinskih domena moguće je blokirati CLD18 ćelija koje eksprimiraju pomenuti ciljni molekul, i na taj način dovesti do terapijskih efekata, kao što je ovde opisano za antitela prema navodima, posebno inhibiciju proliferacije tumorskih ćelija. Iako nije obavezno, moguće je preneti efektorske funkcije antitela na takve neimunoglobulinske vezujuće molekule, npr. fuzijom sa Fc regionom antitela.

[0050] U još jednom aspektu, navodi obezbeđuju kompozicije, npr., farmaceutske i dijagnostičke kompozicije/kitove, koji sadrže farmaceutski prihvatljivi nosač formulisan sa jednim antitelom ili kombinacijom antitela prema navodima. U posebnom primeru izvođenja, kompozicija uključuje kombinaciju antitela koja se vezuju za različite epitope, ili koja poseduju različite

1

funkcionalne karakteristike kao to su indukovanje CDC i/ili ADCC i indukovanje apoptoze. U ovom primeru izvođenja navoda, antitela mogu da se koriste u kombinaciji, npr., kao farmaceutska kompozicija koja uključuje dva ili više anti-CLD18 monoklonskih antitela. Na primer, anti-CLD18 antitela koja imaju različite ali komplementarne aktivnosti, mogu da se kombinuju u okviru jedne terapije da bi se postigao željeni terapijski efekat. U poželjnom primeru izvođenja, kompozicija uključuje anti-CLD18 antitelo koje posreduje u CDC, kombinovano sa drugim anti-CLD18 antitelom koje indukuje apoptozu. U drugom primeru izvođenja, kompozicija uključuje anti-CLD18 antitelo koje posreduje u visoko efikasnom ubijanju ciljnih ćelija u prisustvu efektorskih ćelija, kombinovano sa drugim anti-CLD18 antitelom koje inhibira rast ćelija koje eksprimiraju CLD18.

[0051] Predmetni navodi takođe uključuju simultanu ili sekvencijalnu primenu dva ili više anti-CLD18 antitela prema navodima, pri čemu je najmanje jedno od pomenutih antitela himerno anti-CLD18 antitelo i najmanje još jedno antitelo je humano anti-CLD18 antitelo, antitela se vezuju za iste ili različite epitope CLD18. Poželjno, himerno CLD18 antitelo prema navodima primenjuje se prvo, zatim sledi primena humanog anti-CLD18 antitela prema navodima, pri čemu se humano anti-CLD18 antitelo poželjno primenjuje tokom dužeg vremenskog perioda, tj. kao terapija održavanja.

[0052] Antitela, imunokonjugati, bispecifični i multispecifični molekuli i kompozicije prema predmetnim navodima mogu da se koriste u različitim postupcima inhibiranja rasta ćelija koje eksprimiraju CLD18, naročito CLD18A2 i/ili selektivnog ubijanja ćelija koje eksprimiraju CLD18, naročito CLD18A2 dovođenjem u kontakt ćelija i efikasne količine antitela, imunokonjugata, bispecifičnog/multispecifičnog molekula ili kompozicije, tako da se ćelijski rast inhibira i/ili ćelija bude ubijena. U jednom primeru izvođenja, postupak obuhvata ubijanje ćelije koja eksprimira CLD18, izborno u prisustvu efektorskih ćelija, na primer putem CDC, apoptoze, ADCC, fagocitoze ili putem kombinacije dva ili više od ovih mehanizama. Ćelije koje eksprimiraju CLD18 koje mogu da se inhibiraju ili ubiju korišćenjem antitela prema navodima, uključuju ćelije kancera kao što su tumorogene ćelije želuca, pankreasa, jednjaka, pluća, jajnika, debelog creva, jetre, glave i vrata i žučne kesice.

[0053] Prema tome, antitela prema predmetnim navodima mogu da se koriste za lečenje i/ili prevenciju različitih bolesti vezanih sa ćelijama koje eksprimiraju CLD18, primenom antitela kod pacijenata obolelih od takvih bolesti. Primeri bolesti koje mogu da se leče (npr., poboljšaju) ili preveniraju, uključuju, ali se ne ograničavaju na tumorogene bolesti. Primeri tumorogenih bolesti koje mogu da se leče i/ili preveniraju uključuju kancer želuca, kancer pankreasa, kancer jednjaka, kancer pluća, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer jetre, kancer glave i vrata i kancer žučne kesice i njihove metastaze.

[0054] U posebnom primeru izvođenja navoda, subjekat na koga se primenjuje antitelo dodatno se leči hemoterapeutskim sredstvom, zračenjem ili sredstvom koje moduliše, npr., pojačava ili inhibira ekspresiju ili aktivnost Fc receptora, npr. Fc-gama receptora, kao što je citokin. Tipični citokini za primenu tokom lečenja uključuju faktor stimulacije kolonija granulocita (G-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita i makrofaga (GM-CSF), interferon γ (IFN-γ) i faktor nekroze tumora (TNF). Tipična terapijska sredstva uključuju, između ostalih, antineoplastična sredstva kao što su doksorubicin, cisplatin, taksotere, 5-fluorouracil, metotreksat, gemzitabin i ciklofosfamid.

[0055] U još jednom aspektu, navodi se odnose na strategiju imunizacije za imunizaciju nehumanih životinja kao što su miševi sa humanim CLD18 ili njegovim peptidnim fragmentom, poželjno CLD18A2 ili njegovim peptidnim fragmentom da bi se dobila antitela. Poželjni peptidi za imunizaciju su oni koji se biraju iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:2, 4, 6, 16, 18, 20-23, 26-31, 151, 153 i 155-157, ili peptidi koji sadrže navedene sekvence. Prema tome, u poželjnim primerima izvođenja, antitela prema navodima su ona koja se dobijaju imunizacijom, uz korišćenje peptida odabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:2, 4, 6, 16, 18, 20-23, 26-31, 151, 153 i 155-157, ili upotrebom peptida koji sadrže navedene sekvence. Po analogiji, antitela na CLD18 mogu da se stvore u transgenim nehumanim životinjama kao što su transgeni miševi. Transgena nehumana životinja može biti transgeni miš koji ima genom koji sadrži transgen teškog lanca i transgen lakog lanca koji kodiraju celo antitelo ili deo antitela.

[0056] Divlji tipovi kao i transgene nehumane životinje mogu da se imunizuju prečišćenim ili obogaćenim preparatom CLD18 antigena i/ili nukleinskom kiselinom i/ili ćelijama koje eksprimiraju CLD18 ili peptidni fragment istog. Poželjno, nehumana životinja je sposobna da proizvodi multiple izotipove humanih monoklonskih antitela na CLD18 (npr., IgG, IgA i/ili IgM) prolazeći V-D-J rekombinaciju i izotipsko prekopčavanje. Izotipsko prekopčavanje može da se obavi klasičnim ili neklasičnim izotipskim prekopčavanjem.

[0057] Prema tome, u još jednom aspektu, navodi obezbeđuju izolovane B-ćelije iz nehumane životinje kao što su opisane u prethodnom tekstu. Izolovane B-ćelije mogu zatim da se imortalizuju fuzijom sa imortalizovanom ćelijom da bi se obezbedio izvor (npr., hibridom) antitela prema navodima. Takvi hibridomi (tj., koji produkuju antitela prema navodima) takođe su u okviru obima ovih navoda.

[0058] Kako je ovde pokazano primerima, antitela prema navodima mogu da se dobiju direktno iz hibridoma koji eksprimiraju antitelo, ili mogu da se kloniraju i rekombinantno eksprimiraju u

1

ćeliji-domaćinu (npr., CHO ćelija, ili limfocitna ćelija). Drugi primeri ćelija-domaćina su mikroorganizmi kao E. coli i gljivice kao kvasac. Alternativno, antitela mogu da se proizvedu rekombinantno u transgenoj nehumanoj životinji ili biljci.

[0059] Poželjne ćelije hibridoma za produkovanje antitela prema navodima su one koje su sekvencionirane ili deponovane pri DSMZ (Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Nemačka; nova adresa: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Nemačka), sa sledećim oznakama i pristupnim brojevima:

a. 182-D1106-055, pristupni br. DSM ACC2737, deponovano 19. oktobra 2005.

b. 182-D1106-056, pristupni br. DSM ACC2738, deponovano 19. oktobra 2005.

c. 182-D1106-057, pristupni br.. DSM ACC2739, deponovano 19. oktobra 2005.

d. 182-D1106-058, pristupni br. DSM ACC2740, deponovano 19. oktobra 2005.

e. 182-D1106-059, pristupni br. DSM ACC2741, deponovano 19. oktobra 2005.

f. 182-D1106-062, pristupni br. DSM ACC2742, deponovano 19. oktobra 2005.

g. 182-D1106-067, pristupni br. DSM ACC2743, deponovano 19. oktobra 2005.

h. 182-D758-035, pristupni br. DSM ACC2745, deponovano 17. novembra 2005.

i. 182-D758-036, pristupni br. DSM ACC2746, deponovano 17. novembra 2005.

j. 182-D758-040, pristupni br. DSM ACC2747, deponovano 17. novembra 2005.

k. 182-D1106-061 pristupni br. DSM ACC2748, deponovano 17. novembra 2005.

l. 182-D1106-279, pristupni br. DSM ACC2808, deponovano 26. oktobra 2006.

m. 182-D1106-294, pristupni br. DSM ACC2809, deponovano 26. oktobra 2006.

n. 182-D1106-362, pristupni br. DSM ACC2810, deponovano 26. oktobra 2006.

[0060] Poželjna antitela prema navodima su ona koja su proizvedena i dobijena iz gore opisanih hibridoma; tj. 37G11 u slučaju 182-D1106-055, 37H8 u slučaju 182-D1106-056, 38G5 u slučaju 182-D1106-057, 38H3 u slučaju 182-D1106-058, 39F11 u slučaju 182-D1106-059, 43A11 u slučaju 182-D1106-062, 61C2 u slučaju 182-D1106-067, 26B5 u slučaju 182-D758-035, 26D12 u slučaju 182-D758-036, 28D10 u slučaju 182-D758-040, 42E12 u slučaju 182-D1106-061, 125E1 u slučaju 182-D1106-279, 163E12 u slučaju 182-D1106-294 i 175D10 u slučaju 182-D1106-362; i njihove himerizovane i humanizovane forme.

[0061] U poželjnim primerima izvođenja, antitela, posebno himerizovane forme antitela prema navodima, uključuju antitela koja sadrže konstantni region teškog lanca (CH) koji uključuje aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz konstantnog regiona humanog teškog lanca kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena kao SEQ ID NO: 46 ili 150 ili fragment istih. U sledećim poželjnim primerima izvođenja, antitela, posebno himerizovane forme antitela prema navodima, uključuju antitela koja sadrže konstantni region lakog lanca (CL) koji uključuje

1

aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz konstantnog regiona humanog lakog lanca kao što je aminokiselinska sekvenca prikazana kao SEQ ID NO: 41 ili 148 ili fragment istih. U posebno poželjnom primeru izvođenja, antitela, posebno himerizovane forme antitela prema navodima, uključuju antitela koja sadrže CH sa aminokiselinskom sekvencom izvedenom iz humanog CH kao što je aminokiselinska sekvenca prikazana kao SEQ ID NO: 46 ili 150 ili fragment istih i koja sadrži CL sa aminokiselinskom sekvencom izvedenom iz humanog CL kao što je aminokiselinska sekvenca prikazana kao SEQ ID NO: 41 ili 148 ili fragment istih.

[0062] CH koji uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 46 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 45. CH koji uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 150 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 149. CL koji uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 41 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 40. CL koji uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 148 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 147.

[0063] U nekim poželjnim primerima izvođenja, himerizovani oblici antitela uključuju antitela koja sadrže teški lanac koji podrazumeva aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120 i fragmenta istih i/ili sadrže laki lanac koji podrazumeva aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 i fragmenta istih.

[0064] U nekim poželjnim primerima izvođenja, himerizovani oblici antitela uključuju antitela koja sadrže kombinaciju teškog lanca i lakog lanca odabranu između sledeći mogućnosti (i) do (ix):

(i) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 115 ili fragment iste i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 122 ili fragment iste,

(ii) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 116 ili fragment iste i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 121 ili fragment iste,

(iii) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 117 ili fragment iste i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 123 ili fragment iste,

1

(iv) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 119 ili fragment iste i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 126 ili fragment iste,

(v) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 118 ili fragment iste i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 125 ili fragment iste,

(vi) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 120 ili fragment iste i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 124 ili fragment iste,

(vii) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 120 ili fragment iste i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 127 ili fragment iste,

(viii) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 120 ili fragment iste i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 128 ili fragment iste, i

(ix) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 120 ili fragment iste i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 129 ili fragment iste.

[0065] "Fragment" ili "fragment aminokiselinske sekvence", kako se koristi gore, odnosi se na deo sekvence antitela, tj. na sekvencu koja predstavlja sekvencu antitela skraćenu na N- i/ili C-kraju, koja, kada zamenjuje pomenutu sekvencu antitela u antitelu, zadržava osobine vezivanja pomenutog antitela za CLD18 i, poželjno, funkcije pomenutog antitela koje su opisane u ovom tekstu, npr. CDC-posredovana liza ili ADCC-posredovana liza. Poželjno. fragment aminokiselinske sekvence sadrži najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% aminokiselinskih ostataka iz pomenute aminokiselinske sekvence. Fragment aminokiselinske sekvence odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 i 129 poželjno, odnosi se na pomenutu sekvencu, pri čemu su sa N-kraja uklonjene 17, 18, 19, 20, 21, 22 ili 23 aminokiseline. Fragmenti aminokiselinskih sekvenci opisani ovde, mogu biti kodirani respektivnim fragmentima sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju pomenute aminokiselinske sekvence.

[0066] Teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 115 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 100. Teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 116 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske

1

kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 101. Teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 117 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 102. Teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 119 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 104. Teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 118 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 103. Teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 120 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 105.

[0067] Laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 122 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 107. Laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 121 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 106. Laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 123 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 108. Laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 126 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 111. Laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 125 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 110. Laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 124 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 109. Laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 127 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 112. Laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 128 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 113. Laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 129 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 114.

[0068] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo prema navodima uključuje varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 132, 133, 134, 135, 136, 137 i fragmenta istih.

1

[0069] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo prema navodima uključuje varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 i fragmenta istih.

[0070] U nekim poželjnim primerima izvođenja, antitelo prema navodima uključuje kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) odabaranu između sledećih mogućnosti (i) do (ix):

(i) VH uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 132 ili fragment iste i VL uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 139 ili fragment iste,

(ii) VH uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 133 ili fragment iste i VL uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 138 ili fragment iste,

(iii) VH uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 134 ili fragment iste i VL uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 140 ili fragment iste,

(iv) VH uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 136 ili fragment iste i VL uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 143 ili fragment iste,

(v) VH uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 135 ili fragment iste i VL uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 142 ili fragment iste,

(vi) VH uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 137 ili fragment iste i VL uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 141 ili fragment iste,

(vii) VH uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 137 ili fragment iste i VL uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 144 ili fragment iste,

(viii) VH uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 137 ili fragment iste i VL uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 145 ili fragment iste,

(ix) VH uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 137 ili fragment iste i VL uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 146 ili fragment iste.

2

[0071] VH koji uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 132 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 55. VH koji uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 133 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 56. VH koji uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 134 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 57. VH koji uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 136 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 59. VH koji uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 135 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 58. VH koji uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 137 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 60.

[0072] VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 139 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 62. VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 138 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 61. VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 140 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 63. VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 143 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 66. VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 142 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 65. VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 141 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 64. VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 144 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 67. VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 145 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 68. VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 146 može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja podrazumeva sekvencu nukleinske kiseline prikazanu kao SEQ ID NO: 69.

[0073] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo prema navodima uključuje VH koji sadrži set regiona koji određuju komplementarnost (CDR) CDR1, CDR2 i CDR3 odabran između sledećih primera izvođenja (i) do (vi):

(i) CDR1: pozicije 45-52 SEQ ID NO: 115, CDR2: pozicije 70-77 SEQ ID NO: 115, CDR3: pozicije 116-125 SEQ ID NO: 115,

(ii) CDR1: pozicije 45-52 SEQ ID NO: 116, CDR2: pozicije 70-77 SEQ ID NO: 116, CDR3: pozicije 116-126 SEQ ID NO: 116,

(iii) CDR1: pozicije 45-52 SEQ ID NO: 117, CDR2: pozicije 70-77 SEQ ID NO: 117, CDR3: pozicije 116-124 SEQ ID NO: 117,

(iv) CDR1: pozicije 45-52 SEQ ID NO: 118, CDR2: pozicije 70-77 SEQ ID NO: 118, CDR3: pozicije 116-126 SEQ ID NO: 118,

(v) CDR1: pozicije 44-51 SEQ ID NO: 119, CDR2: pozicije 69-76 SEQ ID NO: 119, CDR3: pozicije 115-125 SEQ ID NO: 119 i

(vi) CDR1: pozicije 45-53 SEQ ID NO: 120, CDR2: pozicije 71-78 SEQ ID NO: 120, CDR3: pozicije 117-128 SEQ ID NO: 120.

[0074] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo prema navodima uključuje VL koji sadrži set regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3, odabran između sledećih primera izvođenja (i) do (ix):

(i) CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 121, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 121, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 121,

(ii) CDR1: pozicije 49-53 SEQ ID NO: 122, CDR2: pozicije 71-73 SEQ ID NO: 122, CDR3: pozicije 110-118 SEQ ID NO: 122,

(iii) CDR1: pozicije 47-52 SEQ ID NO: 123, CDR2: pozicije 70-72 SEQ ID NO: 123, CDR3: pozicije 109-117 SEQ ID NO: 123,

(iv) CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 124, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 124, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 124,

(v) CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 125, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 125, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 125,

(vi) CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 126, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 126, CDR3: pozicije 115-122 SEQ ID NO: 126,

(vii) CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 127, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 127, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 127,

(viii) CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 128, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 128, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 128 i

(ix) CDR1: pozicije 47-52 SEQ ID NO: 129, CDR2: pozicije 70-72 SEQ ID NO: 129, CDR3: pozicije 109-117 SEQ ID NO: 129.

[0075] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo prema navodima uključuje kombinaciju VH i VL od kojih svaki sadrži set regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3, odabran između sledećih primera izvođenja (i) do (ix):

(i) VH: CDR1: pozicije 45-52 SEQ ID NO: 115, CDR2: pozicije 70-77 SEQ ID NO: 115, CDR3: pozicije 116-125 SEQ ID NO: 115, VL: CDR1: pozicije 49-53 SEQ ID NO: 122, CDR2: 71-73 SEQ ID NO: 122, CDR3: pozicije 110-118 SEQ ID NO: 122,

(ii) VH: CDR1: pozicije 45-52 SEQ ID NO: 116, CDR2: pozicije 70-77 SEQ ID NO: 116, CDR3: pozicije 116-126 SEQ ID NO: 116, VL: CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 121, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 121, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 121,

(iii) VH: CDR1: pozicije 45-52 SEQ ID NO: 117, CDR2: pozicije 70-77 SEQ ID NO: 117, CDR3: pozicije 116-124 SEQ ID NO: 117, VL: CDR1: pozicije 47-52 SEQ ID NO: 123, CDR2: pozicije 70-72 SEQ ID NO: 123, CDR3: pozicije 109-117 SEQ ID NO: 123,

(iv) VH: CDR1: pozicije 44-51 SEQ ID NO: 119, CDR2: pozicije 69-76 SEQ ID NO: 119, CDR3: pozicije 115-125 SEQ ID NO: 119, VL: CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 126, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 126, CDR3: pozicije 115-122 SEQ ID NO: 126,

(v) VH: CDR1: pozicije 45-52 SEQ ID NO: 118, CDR2: pozicije 70-77 SEQ ID NO: 118, CDR3: pozicije 116-126 SEQ ID NO: 118, VL: CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 125, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 125, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 125,

(vi) VH: CDR1: pozicije 45-53 SEQ ID NO: 120, CDR2: pozicije 71-78 SEQ ID NO: 120, CDR3: pozicije 117-128 SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 124, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 124, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 124,

(vii) VH: CDR1: pozicije 45-53 SEQ ID NO: 120, CDR2: pozicije 71-78 SEQ ID NO: 120, CDR3: pozicije 117-128 SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 127, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 127, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 127,

(viii) VH: CDR1: pozicije 45-53 SEQ ID NO: 120, CDR2: pozicije 71-78 SEQ ID NO: 120, CDR3: pozicije 117-128 SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 128, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 128, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 128 i (ix) VH: CDR1: pozicije 45-53 SEQ ID NO: 120, CDR2: pozicije 71-78 SEQ ID NO: 120, CDR3: pozicije 117-128 SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: pozicije 47-52 SEQ ID NO: 129, CDR2: pozicije 70-72 SEQ ID NO: 129, CDR3: pozicije 109-117 SEQ ID NO: 129.

2

[0076] U sledećim poželjnim primerima izvođenja, antitelo prema navodima, poželjno, sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR), poželjno najmanje CDR3 varijabilni region, varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL) monoklonskog antitela protiv CLD18, poželjno, ovde opisanog monoklonskog antitela protiv CLD18 i, poželjno, sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR), poželjno najmanje CDR3 varijabilni region, varijabilnih regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnih regiona lakog lanca (VL) ovde opisanih. U jednom primeru izvođenja, pomenuti jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR), biraju se iz seta regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3, koji su opisani u ovom tekstu. U posebno poželjnom primeru izvođenja, antitelo prema navodima, poželjno, sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL) monoklonskog antitela protiv CLD18, poželjno ovde opisanog monoklonskog antitela protiv CLD18 i, poželjno, sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnih regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnih regiona lakog lanca (VL), ovde opisanih.

[0077] U jednom primeru izvođenja, antitelo prema navodima koje sadrži jedan ili više CDR, set CDR ili kombinaciju setova CDR, kako je ovde opisano, sadrži pomenute CDR zajedno sa njihovim umetnutim okvirnim regionima. Poželjno, porcija će takođe uključivati najmanje oko 50% prvog i četvrtog okvirnog regiona, jednog ili oba, 50% koji su C-terminalnih 50% prvog okvirnog regiona i N-terminalnih 50% četvrtog okvirnog regiona. Konstruisanje antitela prema predmetnim navodima napravljenih tehnikama rekombinantne DNK može za rezultat imati uvođenje ostataka N- ili C-terminalno od varijabilnih regiona, kodiranih linkerima uvedenim da olakšaju kloniranje ili druge manipulativne korake, uključujući uvođenje linkera za povezivanje varijabilnih regiona prema navodima sa drugim proteinskim sekvencama, uključujući imunoglobulinske teške lance, druge varijabilne domene (na primer u produkciji diatela) ili proteinske obeleživače.

[0078] U jednom primeru izvođenja antitelo prema navodima koje sadrži jedan ili više CDR, set CDR ili kombinaciju setova CDR, kako je ovde opisano, sadrži pomenute CDR u okvirnom regionu humanog antitela.

[0079] U ovom tekstu, pozivanje na antitelo koje sadrži, u pogledu teškog lanca istog, poseban lanac, ili poseban region ili sekvencu, poželjno, odnosi se na situaciju u kojoj svi teški lanci pomenutog antitela sadrže pomenuti poseban lanac, region ili sekvencu. Ovo se na odgovarajući način primenjuje i na laki lanac antitela.

[0080] Predmetni navodi se takođe odnose na nukleinske kiseline koje sadrže gene ili sekvence nukleinske kiseline kodirajuće za antitela ili njihove delove, npr. lanac antitela, kako je opisan u ovom tekstu. Nukleinske kiseline mogu biti sadržane u vektoru, npr., plazmidu, kozmidu, virusu, bakteriofagu ili drugom vektoru koji se koristi npr. konvencionalno u genetskom inženjeringu. Vektor može uključivati i druge gene kao što su markerski geni koji omogućavaju selekcionisanje vektora u pogodnoj ćeliji-domaćinu i pod pogodnim uslovima. Pored toga, vektor može uključivati ekspresione kontrolne elemente koji omogućavaju pravilnu ekspresiju kodirajućih regiona u odgovarajućim domaćinima. Takvi kontrolni elementi poznati su stručnjaku i mogu uključivati promotor, splajsnu kasetu i kodon koji inicira translaciju.

[0081] Poželjno, nukleinska kiselina prema navodima je operativno vezana za gornje ekspresione kontrolne sekvence, što omogućava ekspresiju u eukariotskim ili prokariotskim ćelijama. Kontrolni elementi koji osiguravaju ekspresiju u eukariotskim ili prokariotskim ćelijama dobro su poznati stručnjacima u oblasti.

[0082] Postupci konstruisanja molekula nukleinskih kiselina prema predmetnim navodima, za konstruisanje vektora koji sadrže gornje molekule nukleinskih kiselina, uvođenja vektora u odgovarajuće odabrane ćelije-domaćine, izazivanja ili postizanja ekspresije, dobro su poznati u postojećem stanju tehnike.

[0083] Sledeći aspekt predmetnih navoda se odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu ili vektor kao što je ovde otkriven.

[0084] Druge osobine i prednosti ovih navoda biće očigledni iz detaljnog opisa i zahteva koji slede.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0085]

Sl. 1 pokazuje imunofluorescentnu analizu HEK293 ćelija transfektovanih sa CLD18A2 koji je kuplovan sa zelenim fluorohromom i koji je reagovao sa serumom miša posle DNK-imunizacije sa SEQ ID NO: 15 fuzionisane sa pomoćnim epitopom.

Sl. 2 pokazuje Western blot analizu HEK293 ćelija transfektovanih sa CLD18A2-myc (SEQ ID NO: 3) i netransfektovanih HEK293 ćelija, sa monoklonskim mišjim anti-c-myc antitelom 9E11 (Serotec, CRL MCA2200).

Sl. 3 pokazuje imunofluorescentnu analizu uz korišćenje CHO ćelija transfektovanih sa CLD18A2 i poliklonskog zečjeg anti-CLD18 antitela (Zymed, CRL 38-8000).

2

Sl. 4A i B pokazuju vezivanje supernatanata hibridoma 24H5 i 85A3 za HEK293 ćelije prolazno transfektovane humanim CLD18A2 i fluorescentnim markerom, kako je određeno protočnom citometrijom. Slika 4C pokazuje vezivanje supernatanta hibridoma 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10 za HEK293 ćelije stabilno transfektovane humanim CLD18A2 i kontraobojene propidijum-jodidom.

Sl. 5 pokazuje vezivanje supernatanata hibridoma 24H5 (A), 9E8 (B), 26B5 (C) i 19B9 (D) za HEK293 ćelije prolazno transfektovane fluorescentnim markerom i humanim CLD18A2 ili CLD18A2-Myc ili CLD18A2-HA, analizirano protočnom citometrijom.

Sl. 6A i B pokazuju vezivanje supernatanata hibridoma 37H8, 43A11, 45C1 i 163E12 za HEK293 ćelije stabilno transfektovane humanim CLD18A2 ili CLD18A1, određeno protočnom citometrijom.

Sl. 7 pokazuje imunofluorescentnu analizu CLD18A2 izoforma-specifičnog monoklonskog antitela 37G11, bojenjem HEK293 ćelija transfektovanih sa CLD18A2 (A, C) i CLD18A1 (B, D), respektivno, pod nativnim uslovima (A, B) i uslovima fiksacije paraformaldehidom (C, D).

Sl. 8 pokazuje imunofluorescentnu analizu CLD18 monoklonskog antitela 26B5, bojenjem HEK293 ćelija transfektovanih sa CLD18A2 (A, C) i CLD18A1 (B, D), respektivno, pod nativnim uslovima (A, B) i uslovima fiksacije paraformaldehidom (C, D).

Sl. 9. RT-PCR ćelijskih linija. RT-PCR analiza sa CLD18A2-specifičnim prajmerima pokazuje jasnu ekspresiju u 4/5 testiranih ćelijskih linija.

Sl. 10 pokazuje imunofluorescentnu analizu DAN-G ćelija (subklon F2) i poliklonskog zečjeg anti-CLD18 antitela (Zymed, CRL 38-8000).

Sl. 11 pokazuje imunofluorescentnu analizu KATO-III ćelija (subklon 3B9 4D5) i poliklonskog zečjeg anti-CLD18 antitela (Zymed, CRL 38-8000).

Sl. 12A pokazuje imunofluorescentnu analizu SNU-16 ćelija (subklon G5) poliklonskim zečjim anti-CLD18 antitelom (Zymed, CRL 38-8000). Sl. 12B pokazuje imunofluorescentnu analizu KATO-III ćelija monoklonskim antitelima prema navodima.

Sl. 13 pokazuje površinsku ekspresiju CLD18 na KATO-III i NUGC-4 ćelijama, analizirano bojenjem ćelija monoklonskim antitelima 61C2 i 163E12, zatim analizirano protočnom citometrijom.

2

Sl. 14. Proteinsko poravnavanje humanog CLD18A1 (NP_057453), humanog CLD18A2 (NP_001002026), mišjeg CLD18A1 (NP_062789) i mišjeg CLD18A2 (AAL15636).

Sl. 15 A i B pokazuju vezivanje supernatanata hibridoma 38G5, 38H3, 37G11, 45C1 i 163E12, respektivno, za HEK293 ćelije prolazno transfektovane fluorescentnim markerom i mišjim CLD18A1 ili mišjim CLD18A2, analizirano protočnom citometrijom.

Sl. 16. Imunohistohemijske analize poliklonskim AB p105. Imunohistohemijsko bojenje subsetova normalnih tkiva (želudac, pluća, koštana srž i prostata) potvrđuje specifičnost za želudačno tkivo (A). Ekspresija je detektovana i u karcinomima želuca (gornji red) i karcinomima pluća (B). Samo diferencirane ćelije, ali ne i matične ćelije, eksprimiraju CLD18A2 (C).

Sl. 17. Imunohistohemijske analize monoklonskim AB 39F11D7

(A) Specifična ekspresija proteina detektovana je u normalnoj mukozi želuca, dok su sva druga normalna testirana tkiva bila negativna.

(B) Jaka ekspresija CLD18A2 nađena je kod karcinoma želuca i pluća.

Sl. 18. Imunohistohemijske analize monoklonskim AB 26B5 (A), 175D10 (B), 43A11 (C), 163E12 (D) i 45C1 (E). Sva antitela pokazuju jako bojenje HEK293-CLD18A2 ksenograftskih tumora i uzoraka kancera želuca, ali ne i HEK293-lažno kontrolno transfektovanih tumora.

Sl. 19 je grafikon kojim se upoređuje procenat mrtvih ćelija posle indukcije CDC pomoću 85A3, 28D10, 24H5 ili 26D12, HEK293 ćelija stabilno transfektovanih humanim CLD18A2, uz korišćenje protočne citometrije.

Sl. 20 je grafikon kojim se upoređuje procenat specifične lize ćelija posle indukovanja CDC pomoću 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12 ili 61C2, adherentnih CHO ćelija stabilno transfektovanih humanim CLD18A2 ili humanim CLD18A1, određeno merenjem fluorescencije.

Sl. 21 pokazuje koncentraciono-zavisno indukovanje CDC CHO ćelija stabilno transfektovanih humanim CLD18A2, pomoću 75B8 (A), 28D10 (B) ili 37H8 (C), određeno merenjem fluorescencije.

Sl. 22 pokazuje lizu HEK293-CLD18A2 ćelija pomoću 26B5, 37H8, 38G5, 47D12 i 61C2, respektivno, u prisustvu MNC.

2

Sl. 23 pokazuje lizu HEK293-CLD18A1 ćelija pomoću 26B5, 37H8, 38G5, 47D12 i 61C2, respektivno, u prisustvu MNC.

Sl. 24 pokazuje inhibiciju rasta tumora postignutu antitelima prema navodima u ksenograftskom modelu ranog lečenja, sa HEK293-CLD18A2 ćelijama.

Sl. 25A i B pokazuju produženo preživljavanje postignuto lečenjem antitelima prema navodima u dva ksenograftska modela ranog lečenja, sa HEK293-CLD18A2 ćelijama.

Sl. 26 pokazuje produženo preživljavanje postignuto antitelima prema navodima u ksenograftskom modelu kasnog lečenja, sa HEK293-CLD18A2 ćelijama.

Sl. 27A pokazuje inhibiciju rasta tumora postignutu antitelima prema navodima u ksenograftskom modelu ranog lečenja. Sl. 27B pokazuju produženo preživljavanje postignuto antitelima prema navodima u ksenograftskom modelu ranog lečenja. Korišćene su DAN-G ćelije koje endogeno eksprimiraju CLD18A2.

Sl. 28 pokazuje ekspresiju CLD18A2 iRNK u tkivima miša. RT-PCR istraživanja sa CLD18A2-specifičnim prajmerima nisu pokazala značajnu ekspresiju ni u jednom normalnom testiranom tkivu, izuzev želuca. Analizirana su sledeća normalna tkiva: 1: tanko crevo, 2: slezina, 3: koža, 4: želudac, 5: pluća, 6: pankreas, 7: limfni čvor, 8: timus, 9: negativna kontrola.

Sl. 29 pokazuje ekspresiju CLD18 u normalnom želucu. Imunohistohemijska analiza želuca miša CLD18-specifičnim antitelom pokazuje konzervirani obrazac ekspresije. Dok površinski epitel i dublje kripte eksprimiraju CLD18 na površini ćelija, centralni vratni region je CLD18-negativan.

Sl. 30 pokazuje bojenje tkiva želuca miša hematoksilinom i eozinom. Pokazani su opšti izgled (A) i detalji (B) želuca 37G11-tretiranih miševa, u poređenju sa kontrolnim mišem (C i D) koji je bio tretiran samo PBS-om.

Sl. 31A i B pokazuju protočno-citometrijsko bojenje HEK293 ćelija stabilno transfektovanih humanim CLD18A1 i A2, respektivno, kao i endogeno eksprimirajućih KATO-III ćelija antitelima prema navodima (43A11, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10).

Sl. 32 pokazuje CDC na CLD18A2-eksprimirajućim ćelijama, posredovanu himernim antitelima prema navodima.

2

Sl. 33 pokazuje ADCC na KATO-III ćelijama, posredovanu himernim antitelima prema navodima.

Sl. 34 prikazuje produženo preživljavanje postignuto lečenjem himernim antitelima ch-175D10 i ch-163E12 u ksenograftskom modelu ranog lečenja.

Sl. 35 pokazuje produženje preživljavanja postignuto lečenjem himernim antitelima ch-175D10 i ch-163E12 u ksenograftskom modelu kasnog lečenja.

Sl. 36 prikazuje eksperimente mapiranja epitopa sa antitelima ch-175D10 i ch163E12. Analizirana je aminokiselinska sekvenca prvog ekstracelularnog domena CLD18A2 bez modifikacija (gornji red, bez izmene Cys-Ser) ili sa izmenom cistein-serin (donji red, izmena Cys-Ser).

Sl. 37 prikazuje tri različita modela savijanja proteina za prvi ekstracelularni domen CLD18A2.

Sl. 38A, B i C pokazuju vezivanje ch-175D10, ch-163E12 i ch-125E1 za ćelije HEK293 koje su prolazno transfektovane fluorescentnim markerom i mišjim CLD18A1 / CLD18A2 ili humanim CLD18A1 / CLD18A2, analizirano protočnom citometrijom. Analizirane su samo transfektovane ćelije, a mrtve ćelije su isključene iz analize PI bojenjem.

Sl. 39 pokazuje visok nivo ekspresije CLD18A2 na plazma membrani kod primarnih tumora želuca i metastaza kancera želuca. Neselektivni uzorak primarnog kancera želuca i metastaza kancera želuca (Krukenbergovi tumori i limfni čvorovi) obojeni su GC182-specifičnim zečjim antiserumom. Imunohistohemiju, kao i procenu intenziteta bojenja (neg, slabo=1, umereno=2, jako=3) i proporcije tumorskih ćelija koje pokazuju bojenje plazma membrane (0-100%), uradili su profesionalni klinički patolozi. Svaki krug predstavlja nezavisni uzorak tumora. Uočen je statistički značajan povećan intenzitet bojenja u metastazama (p=0.034, Fišerov egzaktni test).

DETALJAN OPIS

[0086] Antitela opisana u ovom tekstu mogu biti izolovana monoklonska antitela koja se specifično vezuju za epitop prisutan na CLD18, poželjno epitop smešten u ekstracelularnim domenima CLD18, konkretno, u prvom ekstracelularnom domenu. Izolovana monoklonska antitela obuhvaćena predmetnim navodima uključuju IgA, IgG1-4, IgE, IgM i IgD antitela. U jednom primeru izvođenja, antitelo je IgG1 antitelo, preciznije IgG1, kapa ili IgG1, lambda

2

izotip. U drugom primeru izvođenja, antitelo je IgG3 antitelo, preciznije IgG3, kapa ili IgG3, lambda izotip. U još jednom primeru izvođenja, antitelo je IgG4 antitelo, preciznije IgG4, kapa ili IgG4, lambda izotip. U još jednom primeru izvođenja, antitelo je IgA1 ili IgA2 antitelo. U još jednom primeru izvođenja, antitelo je IgM antitelo.

[0087] U jednom primeru izvođenja, navodi se odnose na antitela koja se specifično vezuju za ćelije koje eksprimiraju CLD18 i, poželjno, (i) vezuju se za ćelije koje eksprimiraju CLD18A2 i (ii) ne vezuju se za ćelije koje ne eksprimiraju CLD18A2, ali eksprimiraju CLD18A1. Antitela prema navodima poželjno (i) posreduju u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLD18A2 i (ii) ne posreduju u ubijanju ćelija koje ne eksprimiraju CLD18A2, ali eksprimiraju CLD18A1.

[0088] U drugom primeru izvođenja, navodi se odnose na antitela koja se (i) vezuju za tumorske ćelije koje eksprimiraju CLD18, (ii) ne vezuju za CLD18-eksprimirajuće ćelije normalne mukoze želuca, i/ili (iii) ne vezuju za CLD18-eksprimirajuće ćelije nekancerskog plućnog tkiva.

[0089] Navodi takođe uključuju antitela koja (i) posreduju u ubijanju tumorskih ćelija koje eksprimiraju CLD18, (ii) ne posreduju u ubijanju CLD18-eksprimirajućih ćelija normalne mukoze želuca i/ili (iii) ne posreduju u ubijanju CLD18-eksprimirajućih ćelija nekancerskog tkiva pluća.

[0090] U posebnim primerima izvođenja, antitela prema navodima (i) vezuju se za epitop na CLD18A2 koji nije prisutan na CLD18A1, poželjno SEQ ID NO: 21, 22 i 23, (ii) vezuju se za epitop lokalizovan na CLD18A2-petlja1, poželjno SEQ ID NO: 28, (iii) vezuju se za epitop lokalizovan na CLD18A2-petlji2, poželjno SEQ ID NO: 30, (iv) vezuju se za epitop lokalizovan na CLD18A2-petljiD3, poželjno SEQ ID NO: 31, (v) vezuju se za epitop, koji obuhvata CLD18A2-petlju1 i CLD18A2-petljuD3, (vi) vezuju se za neglikozilovani epitop lokalizovan CLD18A2-petljiD3, poželjno SEQ ID NO: 29 ili (vii) vezuju se za epitop prisutan u humanom i mišjem CLD18 (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 i SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, respektivno).

[0091] U posebno poželjnim primerima izvođenja, antitela prema navodima vezuju se za epitop na CLD18A2 koji nije prisutan na CLD18A1.

[0092] Antitela prema navodima uključuju potpuno humana antitela. Takva antitela mogu da se proizvedu u nehumanoj transgenoj životinji, npr., transgenom mišu, sposobnoj da proizvede multiple izotipove humanih monoklonskih antitela na CLD18, obavljanjem V-D-J rekombinacije i izotipskog prekopčavanja. Takva transgena životinja može biti i transgeni zec za produkovanje poliklonskih antitela, kako je objavljeno u US 2003/0017534.

[0093] Vezivanje antitela prema navodima za CLD18 antigen može da posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLD18 (npr. tumorske ćelije), npr. aktivacijom sistema komplementa. Ubijanje ćelija koje eksprimiraju CLD18 može da se javi pomoću jednog ili više sledećih mehanizama: citotoksičnost za ćelije koje eksprimiraju CLD18 zavisna od komplementa (CDC); apoptoza ćelija koje eksprimiraju CLD18; fagocitoza ćelija koje eksprimiraju CLD18 od strane efektorskih ćelija; ili citotoksičnost efektorskih ćelija za ćelije koje eksprimiraju CLD18 zavisna od antitela.

[0094] Da bi se predmetni navodi lakše razumeli, najpre će biti definisani određeni termini. Dodatne definicije biće iznete tokom detaljnog opisa.

DEFINICIJE TERMINA

[0095] Termin "CLD18" odnosi se na klaudin-18 i obuhvata sve varijante, uključujući CLD18A1 i CLD18A2, konformacije, izoforme, specijes-homologe CLD18, koje ćelije prirodno eksprimiraju ili koje eksprimiraju ćelije transfektovane CLD18 genom. Poželjno, "CLD18" odnosi se na humani CLD18, posebno humani CLD18A2 i/ili humani CLD18A1, poželjnije humani CLD18A2. Humani CLD18A2 se prvenstveno odnosi na (i) nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira amino sekvencu SEQ ID NO: 2 kao što je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 1 ili (ii) protein koji sadrži aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 2, i uključuje sve njihove varijante, konformacije, izoforme i homologe vrsta koje ćelije prirodno eksprimiraju ili ih eksprimiraju ćelije transfektovane genom CLD18A2. Humani CLD18A1 se prvenstveno odnosi na (i) nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira amino sekvencu SEQ ID NO: 8, kao što je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 7 ili (ii) protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, i uključuje sve njihove varijante, konformacije, izoforme i homologe vrsta koje ćelije prirodno eksprimiraju ili ih eksprimiraju ćelije transfektovane genom CLD18A1.

[0096] "Varijante CLD18" takođe uključuju oblik CLD18 koji se u suštini sastoji od ekstracelularnog domena ili ektodomena CLD18. "Ekstracelularni domen" ili "ektodomen" CLD18 se odnosi na oblik CLD18 polipeptida koji je u suštini bez transmembranskih i citoplazmatskih domena. Treba imati na umu da su svi transmembranski domeni identifikovani u CLD18 polipeptidima prema ovim navodima identifikovani prema kriterijumima koji se obično koriste u ovoj oblasti za identifikaciju hidrofobnih domena ovog tipa. Tačne granice transmembranskog domena mogu da variraju, ali najverovatnije za ne više od oko 5 aminokiselina na oba kraja domena prvobitno identifikovanog u ovom dokumentu. Prema tome, opciono, ekstracelularni domen CLD18 polipeptida može da sadrži od oko 5 ili manje aminokiselina sa obe strane granice transmembranskog domena/ekstracelularnog domena

1

identifikovane u primerima ili specifikaciji i takvi polipeptidi, sa ili bez odgovarajućeg signalnog peptida, kao i nukleinska kiselina koja ih kodira, su obuhvaćeni ovim navodima.

[0097] Termin "varijanta CLD18" obuhvata (i) CLD18 splajsne varijante, (ii) CLD18-posttranslaciono modifikovane varijante, posebno uključujući varijante sa različitim statusom N-glikozilacije, (iii) CLD18 konformacione varijante, posebno uključujući CLD18-konformaciju-1, CLD18-konformaciju-2 i CLD18-konformaciju-3, (iv) CLD18 slobodne i homotipski/heterotipski asocirane varijante lokalizovane u okviru međućelijskih čvrstih spojeva, (v) CLD18 varijante povezane sa kancerom i varijante koje nisu povezane sa kancerom.

[0098] Termin "raft" odnosi se na membranske mikrodomene bogate sfingolipidima i holesterolom, locirane u spoljašnjem monosloju plazmine membrane ćelije. Sposobnost nekih proteina da se udružuju u okviru takvih domena i sposobnost da formiraju "agregate" ili "fokalne agregate", mogu uticati na funkciju proteina. Na primer, translokacija molekula CLD18 u takve strukture, posle vezivanja antitelima prema predmetnim navodima, stvara veliku gustinu CLD18 antigen-antitelo kompleksa u plazminoj membrani. Tako velika gustina CLD18 antigen-antitelo kompleksa može da omogući efikasnu aktivaciju sistema komplementa tokom CDC.

[0099] Termini "konformacija" i "topologija" opisuju kako je integrisani membranski molekul pozicioniran u membrani na površini ćelije i, posebno, koji njegov region je ekstracelularni i, prema tome, pristupačan za antitela. CLD18, na primer, može da postoji u tri različite konformacije koje najverovatnije zavise od toga da li je preovlađujuće u vidu homomera ili heteromera i da li je integrisan u supramolekularne strukture čvrstih spojeva ili je "slobodan". Ova različita stanja za rezultat imaju to da su antitelima dostupni različiti epitopi.

[0100] U skladu sa navodima, "bolest" se odnosi na svako patološko stanje, uključujući kancer, posebno one forme kancera koje su opisane u ovom tekstu. Svako pozivanje na kancer ili konkretne oblike kancera u ovom tekstu takođe uključuje metastazu tog kancera.

[0101] Pod "tumorom" podrazumeva se abnormalna grupa ćelija ili tkivo, koji rastu brzom nekontrolisanom proliferacijom ćelija i nastavljaju da rastu i pošto prestane delovanje stimulusa koji su inicirali novi rast. Tumori pokazuju delimično ili potpuno odsustvo strukturne organizovanosti i funkcionalne koordinisanosti sa normalnim tkivom i obično formiraju zasebnu masu tkiva koja može biti benigna ili maligna.

[0102] Pod "metastazom" podrazumeva se širenje ćelija kancera sa mesta nastanka u druge delove tela. Formiranje metastaza je veoma kompleksan proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije ekstracelularnog matriksa, probijanja ćelija kroz endotelne bazalne membrane radi ulaska u telesne šupljine i sudove i zatim, posle transportovanja krvotokom, infiltracije ciljnih organa. Konačno, rast novog tumora na ciljnom mestu, zavisi od

2

angiogeneze. Metastaziranje tumora često se zapaža čak i posle uklanjanja primarnog tumora jer tumorske ćelije ili komponente mogu da zaostanu i razviju metastatski potencijal. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza", prema navodima, odnosi se na "udaljenu metastazu", što označava metastazu udaljenu od primarnog tumora i regionalnog sistema limfnih čvorova. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza" prema navodima se odnosi na metastaze u limfnim čvorovima. Jedan poseban oblik metastaza koji se može lečiti korišćenjem antitela prema navodima je metastaza koja potiče iz kancera želuca kao primarnog mesta. U poželjnim primerima izvođenja, takva metastaza kancera želuca su Krukenbergovi tumori, peritonealna metastaza i/ili metastaza u limfnim čvorovima.

[0103] Krukenbergov tumor je neuobičajen metastatski tumor jajnika koji čini 1% do 2% svih tumora jajnika. Prognoza za Krukenbergov tumor je i dalje veoma loša, i ne postoji uspostavljena procedura za lečenje Krukenbergovih tumora. Krukenbergov tumor je metastatski adenokarcinom prstenastih ćelija jajnika. U većini slučajeva Krukenbergovog tumora (70%) primarno mesto razvoja je želudac. Sledeća primarna mesta razvoja po učestalosti su karcinomi debelog creva, slepog creva i dojke (uglavnom invazivni lobularni karcinom). Prijavljeni su retki slučajevi Krukenbergovog tumora koji potiče od karcinoma žučne kese, bilijarnog trakta, pankreasa, tankog creva, Vaterove ampule, grlića materice i mokraćne bešike/urahusa. Interval između dijagnoze primarnog karcinoma i naknadnog otkrivanja zahvaćenosti jajnika je obično 6 meseci ili manje, ali su zabeleženi i duži intervali. U mnogim slučajevima, primarni tumor je veoma mali i može da ostane neotkriven. Istorija prethodnog karcinoma želuca ili drugog organa može da se dobije u samo 20% do 30% slučajeva.

[0104] Krukenbergov tumor je primer selektivnog širenja kancera, najčešće duž ose želudacjajnik. Istorijski gledano, ovaj put širenja tumora je privukao pažnju mnogih patologa, posebno kada je otkriveno da neoplazme želuca selektivno metastaziraju u jajnike bez uticaja na druga tkiva. Put metastaziranja karcinoma želuca do jajnika je dugo ostao nepoznanica, ali je sada očigledno da je najverovatniji put metastaziranja retrogradni limfni put.

[0105] Žene sa Krukenbergovim tumorima su neobično mlade za pacijente sa metastatskim karcinomom, budući da su obično u petoj deceniji života, sa prosečnom starošću od 45 godina. Ovako mladi uzrast pacijenata može delimično da se poveže sa povećanom učestalošću karcinoma prstenastih ćelija želuca kod mladih žena. Uobičajeni simptomi su obično povezani sa zahvaćenošću jajnika, od kojih su najčešći bol u stomaku i distenzija (uglavnom zbog obično bilateralnih i često velikih masa jajnika). Preostali pacijenti imaju nespecifične gastrointestinalne simptome ili nemaju simptome. Pored toga, Krukenbergov tumor je navodno povezan sa virilizacijom koja je rezultat proizvodnje hormona u stromi jajnika. Ascites je prisutan u 50% slučajeva i obično se u njemu otkrivaju maligne ćelije.

[0106] Krukenbergovi tumori su bilateralni u više od 80% prijavljenih slučajeva. Jajnici su obično asimetrično uvećani, sa boseliranom konturom. Površine preseka su žute ili bele; obično čvrste, iako su povremeno cistične. Važno je da je kapsularna površina jajnika sa Krukenbergovim tumorima obično glatka i bez adhezija ili peritonealnih naslaga. Treba napomenuti da su drugi metastatski tumori jajnika obično povezani sa površinskim implantatima. Ovo može da objasni zašto makroskopska morfologija Krukenbergovog tumora može da dovede do zablude da je u pitanju primarni tumor jajnika. Međutim, bilateralna priroda Krukenbergovog tumora ukazuje na njegovu metastatsku prirodu.

[0107] Kod pacijenata sa Krukenbergovim tumorima ukupna stopa mortaliteta je veoma visoka. Većina pacijenata umire u roku od 2 godine (medijana preživljavanja je 14 meseci). Nekoliko studija je pokazalo da je prognoza loša kada se primarni tumor identifikuje nakon otkrivanja metastaza na jajnicima, a prognoza je lošija ako primarni tumor ostane neotkriven.

[0108] Optimalna strategija lečenja Krukenbergovih tumora još uvek nije jasno utvrđena u literaturi. Ne postoji adekvatan odgovor na pitanje da li treba izvršiti hiruršku resekciju. Hemoterapija ili radioterapija nemaju značajan uticaj na prognozu kod pacijenata sa Krukenbergovim tumorima.

[0109] Termin "lečenje bolesti" uključuje lečenje, skraćivanje trajanja, poboljšanje, prevenciju, usporavanje ili inhibiranje napredovanja ili pogoršanja, ili prevenciju ili odlaganje početka bolesti ili njenih simptoma.

[0110] U skladu sa navodima, uzorak može biti bilo koji uzorak koristan prema predmetnim navodima, posebno biološki uzorak kao što je uzorak tkiva, uključujući telesne tečnosti i/ili ćelijski uzorak, a može se dobiti na uobičajen način, npr. biopsijom tkiva, uključujući ubodnu ("punch") biopsiju i uzimanjem krvi, bronhijalnog aspirata, sputuma, urina, fecesa i drugih telesnih tečnosti. U skladu sa navodima, termin "biološki uzorak" uključuje i frakcije bioloških uzoraka.

[0111] Termin "antitelo" odnosi se na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, ili antigen vezujući deo istog. Termin "antitelo" takođe uključuje sve rekombinantne forme antitela, posebno ovde opisanih antitela, npr., antitela koja se eksprimiraju u prokariotima, neglikozilovana antitela i antigen-vezujuće fragmente antitela i derivate, kako je dole opisano. Svaki teški lanac sastavljen je od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Svaki laki lanac sastavljen je od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantnog

4

regiona lakog lanca. VH i VL regioni dalje mogu da se podele u regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), između kojih se nalaze regioni koji su konzervativniji, označeni kao okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL sastavljen je od tri CDR i 4 FR, aranžirana od amino-kraja ka karboksi-kraju sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva domaćina ili za faktore, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (C1q) klasičnog sistema komplementa.

[0112] Termin "humanizovano antitelo" odnosi se na molekul koji ima antigen-vezujuće mesto koje je suštinski izvedeno iz imunoglobulina iz nehumane vrste, pri čemu je preostala struktura imunoglobulinskog molekula zasnovana na strukturi i/ili sekvenci humanog imunoglobulina. Antigen-vezujuće mesto može da sadrži ili kompletan varijabilni domen fuzionisan sa konstantnim domenima ili samo regione koji određuju komplementarnost (CDR) graftovane u odgovarajuće okvirne regione u varijabilnim domenima. Antigen-vezujuća mesta mogu da budu divljeg tipa ili modifikovana pomoću jedne ili više aminokiselinskih supstitucija, npr. modifikovana da više liče na humane imunoglobuline. Neki primeri izvođenja humanizovanih antitela zadržavaju cele CDR sekvence (na primer humanizovano mišje antitelo koje sadrži svih šest CDR antitela miša). Drugi primeri izvođenja imaju jedan ili više CDR koji su izmenjeni u odnosu na originalno antitelo.

[0113] Termin "himerno antitelo" odnosi se na ona antitela u kojima je jedan deo svake aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca homolog sa odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene vrste ili koja pripadaju određenoj klasi, dok je preostali segment lanca homolog sa odgovarajućim sekvencama drugih. Tipično, varijabilni region i lakog i teškog lanca, imitira varijabilne regione antitela poreklom iz jedne vrste sisara, dok su konstantni delovi homologi sa sekvencama antitela poreklom iz druge. Jedna vidna prednost ovakvih himernih formi je ta da varijabilni region može konvencionalno da se izvede iz danas poznatih izvora, korišćenjem lako dostupnih B-ćelija ili hibridoma iz nehumanih organizamadomaćina, u kombinaciji sa konstantnim regionima izvedenim iz, na primer, humanih ćelijskih preparata. Dok varijabilni region ima prednost lake pripreme i izvor ne utiče na specifičnost, konstantni region će, pošto je human, manje verovatno izazvati imuni odgovor humanog subjekta kada se antitela injektiraju, nego kada bi konstantni region bio iz nehumanog izvora.

[0114] Termin "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "vezujući deo"), kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen. Pokazano je da antigen-vezujuća funkcija antitela može da se obavi fragmentima antitela ili antitelom pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih terminom "antigen-vezujući deo" antitela uključuju (i) Fab fragmente, monovalentne fragmente koji se sastoje od VL, VH, CL i CH domena; (ii) F(ab’)2fragmente, bivalentne fragmente koji uključuju dva Fab fragmenta spojena disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragmente koji se sastoje od VH i CH domena; (iv) Fv fragmente koji se sastoje od VL i VH domena jedne ručice antitela, (v) dAb fragmente (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), koji se sastoje od VH domena; (vi) izolovane regione koji određuju komplementarnost (CDR) i (vii) kombinacije dva ili više izolovanih CDR koji opciono mogu biti spojeni sintetskim linkerom. Pored toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana pomoću dva odvojena gena, oni se mogu spojiti korišćenjem rekombinantnih postupaka, sintetskim linkerom koji im omogućava da se sintetišu kao jedan proteinski lanac u kome su VH i VL region spareni da formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); vidi npr., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Namera je da i takva jednolančana antitela budu obuhvaćena terminom "antigen-vezujući deo" antitela. Sledeći primer je vezujući domen-imunoglobulinski fuzioni protein koji sadrži (i) polipeptid vezujućeg domena koji je fuzionisan sa polipeptidom zglobnog regiona imunoglobulina, (ii) CH2 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa zglobnim regionom i (iii) CH3 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa CH2 konstantnim regionom. Polipeptid vezujućeg domena može biti varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. Vezujući domen-imunoglobulinski fuzioni proteini objavljeni su dalje u US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Ovi fragmenti antitela dobijeni su korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima u oblasti, a fragmenti se ispituju u pogledu svoje upotrebljivosti na isti način kao da su intaktna antitela.

[0115] Termin "epitop" označava proteinsku determinantu sposobnu da veže antitelo, pri čemu se termin "vezivanje" u ovom tekstu, poželjno, odnosi na specifično vezivanje. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula kao što su bočni lanci aminokiselina ili šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi razlikuju se po tome što se u prisustvu denaturišućih rastvarača gubi vezivanje za prve, ali ne i za druge.

[0116] Termin "diskontinuirani epitop", kako se koristi u ovom tekstu, označava konformacioni epitop na proteinskom antigenu koji se formira od najmanje dva regiona koji su u primarnoj sekvenci proteina razdvojeni.

[0117] Termin "bispecifični molekul" treba da uključi svako sredstvo, npr., protein, peptid ili proteinski ili peptidni kompleks, sa dve različite vezujuće specifičnosti. Na primer, molekul može da se veže ili da interaguje sa (a) antigenom na površini ćelije i (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije. Namera je da termin "multispecifični molekul" ili "heterospecifični molekul" obuhvati svako sredstvo, npr., protein, peptid ili proteinski ili peptidni kompleks, sa više od dve različite vezujuće specifičnosti. Na primer, molekul može da se veže ili da interaguje sa (a) antigenom na površini ćelije, (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije i (c) najmanje još jednom komponentom. Prema tome, navodi uključuju, ali se ne ograničavaju na bispecifične, trispecifične, tetraspecifične i druge multispecifične molekule koji su usmereni prema CLD18 i drugim ciljevima kao što su Fc receptori na efektorskim ćelijama. Termin "bispecifična antitela" uključuje i diatela. Diatela su bivalentna bispecifična antitela u kojima su VH i VL domen eksprimirani u jednom polipeptidnom lancu, ali uz korišćenje linkera koji je suviše kratak da bi dozvolio da dođe do sparivanje između dva domena na istom lancu, zbog čega domeni moraju da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvaraju dva antigen-vezujuća mesta (vidi npr., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).

[0118] Navodi takođe uključuju derivate ovde opisanih antitela. Termin "derivati antitela" odnosi se na svaku modifikovanu formu antitela, npr., konjugat antitela i drugog sredstva ili antitela. Kako se koristi u ovom tekstu, antitelo je "izvedeno iz" određene sekvence klicine linije ako je antitelo dobijeno iz sistema, imunizacijom životinje ili pretraživanjem biblioteke gena, i pri čemu je odabrano antitelo najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%, još poželjnije najmanje 96%, 97%, 98% ili 99% identično po aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom genom imunoglobulina klicine linije. Tipično, antitelo izvedeno iz određene sekvence klicine linije pokazivaće ne više od 10 aminokiselinskih razlika, poželjnije ne više od 5 ili još poželjnije ne više od 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinske razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu koju kodira gen imunoglobulina klicine linije.

[0119] Kako se koristi u ovom tekstu, termin "heteroantitela" odnosi se na dva ili više antitela, njihove derivate ili antigen-vezujuće regione povezane zajedno, od kojih najmanje dva imaju različite specifičnosti. Ove različite specifičnosti obuhvataju specifičnost vezivanja za Fc receptor na efektorskoj ćeliji i specifičnost vezivanja za antigen ili epitop na ciljnoj ćeliji, npr., ćeliji tumora.

[0120] Antitela opisana u ovom tekstu mogu biti humana antitela. Termin "humano antitelo" kako se koristi u ovom tekstu, treba da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih sekvenci imunoglobulina klicine linije. Humana antitela prema navodima mogu da sadrže aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim sekvencama imunoglobulina klicine linije (npr., mutacije uvedene slučajnom ili usmerenom mutagenezom in vitro, ili somatska mutacija in vivo).

[0121] Termin "monoklonsko antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na preparat molekula antitela čiji je sastav jednomolekulski. Monoklonsko antitelo pokazuje jednu vezujuću specifičnost i afinitet za određeni epitop. U jednom primeru izvođenja, monoklonska antitela se proizvode pomoću hibridoma, koji uključuje B-ćeliju dobijenu iz nehumane životinje, npr., miša, fuzionisanu sa imortalizovanom ćelijom.

[0122] Termin "rekombinantno antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, uključuje sva antitela koja su pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana rekombinantno, npr. (a) antitela izolovana iz životinje (npr., miša) koja je transgena ili transhromozomska u pogledu imunoglobulinskih gena, ili iz hibridoma pripremljenog od toga, (b) antitela izolovana iz ćelijedomaćina transformisane da eksprimira antitelo, npr., iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke antitela i (d) antitela pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana bilo kojim drugim načinom koji uključuje splajsovanje imunoglobulinskih genskih sekvenci sa drugim DNK sekvencama.

[0123] Termin "transfektom", kako se koristi u ovom tekstu, uključuje rekombinantne eukariotske ćelije-domaćine koje eksprimiraju antitelo, npr. CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293 ćelije, HEK293T ćelije, biljne ćelije ili ćelije gljivica, uključujući ćelije kvasca.

[0124] Kako se koristi u ovom tekstu, "heterologo antitelo" definiše se u odnosu na transgeni organizam koji produkuje takvo antitelo. Termin se odnosi na antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu ili kodirajuću sekvencu nukleinske kiseline koja odgovara nađenoj u organizmu koji nije transgeni organizam i koja je obično izvedena iz vrste različite od transgenog organizma.

[0125] Kako se koristi u ovom tekstu, "heterohibridno antitelo" odnosi se na antitelo koje ima laki i teški lanac poreklom iz različitih organizama. Na primer, heterohibridno antitelo je antitelo koje ima humani teški lanac udružen sa lakim lancem miša.

[0126] Ovde opisana antitela su, poželjno, izolovana. "Izolovano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, treba da označava antitelo koje je suštinski slobodno od drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CLD18 suštinski je bez antitela koja se specifično vezuju za molekul različit od CLD18). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu humanog CLD18 može, međutim, unakrsno reagovati sa drugim srodnim antigenima, npr., iz drugih vrsta (npr., CLD18 specijes-homolozi). Pored toga, izolovano antitelo suštinski može da ne sadrži drugi ćelijski materijal i/ili hemikalije. U jednom primeru izvođenja prema navodima, kombinacija "izolovanih" monoklonskih antitela odnosi se na antitela koja imaju različite specifičnosti i koja su kombinovana u dobro definisanoj kompoziciji.

[0127] U skladu sa navodima, termin "vezivanje" poželjno se odnosi na "specifično vezivanje". Kako se ovde koristi, "specifično vezivanje" odnosi se na antitelo koje se vezuje za unapred poznati antigen. Tipično, vezuje se sa afinitetom koji odgovara KD od oko 1 x 10<-7>M ili manje, i vezuje se za unapred poznati antigen sa afinitetom koji odgovara KD koja je najmanje dva reda veličine niža od afiniteta za vezivanje sa nespecifičnim antigenom (npr., BSA, kazein) različitim od unapred poznatog antigena ili blisko srodnog antigena.

[0128] Termin "KD" (M), kako se koristi u ovom tekstu, treba da označi ravnotežnu konstantu disocijacije za određenu interakciju antitelo-antigen.

[0129] Kako se ovde koristi, "izotip" se odnosi na klasu antitela (npr., IgM ili IgG1) koja je kodirana genima konstantnog regiona teškog lanca.

[0130] Kako se ovde koristi, "izotipsko prekopčavanje" odnosi se na fenomen kojim se klasa, ili izotip antitela menja iz jedne Ig klase u neku drugu Ig klasu.

[0131] Termin "sreće se prirodno", kako se koristi u ovom tekstu kada se primenjuje na objekat, odnosi se na činjenicu da objekat može da se nađe u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse), koja može da se izoluje iz izvora u prirodi i koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji, jeste ona koja se sreće prirodno.

[0132] Termin "rearanžiran", kako se ovde koristi, odnosi se na konfiguraciju lokusa teškog lanca ili lakog lanca imunoglobulina, gde je V segment pozicioniran neposredno uz D-J ili J segment, u konformaciji koja kodira suštinski kompletan VH ili VL domen, respektivno. Rearanžirani imunoglobulinski (antitelo) genski lokus može da se identifikuje upoređivanjem sa DNK klicine linije; rearanžirani lokus imaće najmanje jedan rekombinovani heptamerni/nonamerni homologi element.

[0133] Termin "nerearanžiran" ili "konfiguracija klicine linije", kako se ovde koristi u odnosu na V segment, označava konfiguraciju u kojoj V segment nije rekombinovan tako da bude neposredno uz D ili J segment.

[0134] Termin "molekul nukleinske kiseline", kako se ovde koristi, treba da obuhvati DNK molekule i RNK molekule. Molekul nukleinske kiseline može da bude jednolančani ili dvolančani, ali poželjno je dvolančana DNK.

[0135] Nukleinske kiseline opisane prema navodima, poželjno su izolovane. Termin "izolovana nukleinska kiselina", prema navodima podrazumeva da je nukleinska kiselina (i) amplifikovana in vitro, na primer lančanom reakcijom polimeraze (PCR), (ii) rekombinantno proizvedena kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer, sečenjem i gel-elektroforetskim frakcionisanjem ili (iv) sintetisana, na primer, hemijskom sintezom. Izolovana nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja je dostupna za manipulaciju tehnikama rekombinantne DNK.

[0136] Nukleinske kiseline mogu, u skladu sa navodima, biti prisutne same ili u kombinaciji sa drugim nukleinskim kiselinama koje mogu biti homologe ili heterologe. U poželjnim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je funkcionalno povezana sa ekspresionim kontrolnim sekvencama koje mogu biti homologe ili heterologe u odnosu na pomenutu nukleinsku kiselinu. Termin "homolog" podrazumeva da je nukleinska kiselina i prirodno funkcionalno povezana sa ekspresionom kontrolnom sekvencom, a termin "heterolog" podrazumeva da nukleinska kiselina nije prirodno povezana sa ekspresionom kontrolnom sekvencom.

[0137] Nukleinska kiselina, npr. nukleinska kiselina koja eksprimira RNK i/ili protein ili peptid i ekspresiona kontrolna sekvenca "povezane" su funkcionalno jedna sa drugom ako su kovalentno povezane jedna sa drugom na takav način da je ekspresija ili transkripcija pomenute nukleinske kiseline pod kontrolom ili uticajem pomenute ekspresione kontrolne sekvence. Ako nukleinska kiselina treba da se prevede u funkcionalni protein, onda, s tim što je ekspresiona kontrolna sekvenca funkcionalno vezana uz kodirajuću sekvencu, indukcija pomenute ekspresione kontrolne sekvence za rezultat ima transkripciju pomenute nukleinske kiseline bez prouzrokovanja pomeranja okvira u kodirajućoj sekvenci ili pomenuta kodirajuća sekvenca ne može da bude prevedena u željeni protein ili peptid.

[0138] Termin "ekspresiona kontrolna sekvenca", u skladu sa navodima, uključuje promotore, mesta vezivanja ribozoma, pojačivače i druge kontrolne elemente koji regulišu transkripciju gena ili translaciju RNK. U posebnim primerima izvođenja prema navodima, ekspresiona kontrolna sekvenca može da bude regulisana. Tačna struktura ekspresionih kontrolnih sekvenci može da varira u funkciji vrste ili tipa ćelije, ali generalno, sadrži 5’-netranskribujuću i 5’ i 3’ netranslatujuće sekvence koje su uključene u inicijaciju transkripcije i translacije, respektivno, kao što su TATA boks, sekvenca za dodavanje kape, CAAT sekvenca i slično. Određenije, 5’ netranskribujuće ekspresione kontrolne sekvence sadrže promotorski region koji uključuje promotorsku sekvencu za kontrolu transkripcije funkcionalno povezane nukleinske kiseline. Ekspresione kontrolne sekvence mogu takođe da sadrže pojačivačke sekvence ili ushodne aktivatorske sekvence.

[0139] U skladu sa navodima, termin "promotor" ili "promotorski region", odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja je locirana ushodno (5’) u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline koja se eksprimira, i koja kontroliše ekspresiju sekvence tako što obezbeđuje prepoznavanje i mesto za vezivanje RNK-polimeraze. "Promotorski region" može uključivati i druga mesta

4

prepoznavanja i vezivanja drugih faktora uključenih u regulaciju transkripcije gena. Promotor može da kontroliše transkripciju prokariotskog ili eukariotskog gena. Pored toga, promotor može da bude "inducibilan" i može da inicira transkripciju u odgovoru na indukujuće sredstvo ili može da bude "konstitutivan" ako transkripcija nije pod kontrolom indukujućeg sredstva. Gen koji je pod kontrolom inducibilnog promotora ne eksprimira se ili se eksprimira u maloj meri u odsustvu indukujućeg agensa. U prisustvu indukujućeg agensa gen je "uključen" ili je nivo transkripcije povećan. Ovo se odvija, obično, vezivanjem specifičnog transkripcionog faktora.

[0140] Promotori koji su poželjni prema navodima, uključuju promotore za SP6, T3 i T7 polimerazu, humani U6 RNK promotor, CMV promotor i njihove arteficijalne hibridne promotore (npr. CMV), pri čemu su deo ili delovi fuzionisani sa delom ili delovima promotora gena drugih ćelijskih proteina kao što su npr. humana GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza), i uključuju ili ne uključuju jedan ili više dodatnih introna.

[0141] U skladu sa navodima, termin "ekspresija" koristi se u najopštijem smislu i podrazumeva produkciju RNK ili RNK i proteina/peptida. Obuhvata i parcijalnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Pored toga, ekspresija može da se odvija prolazno ili stabilno.

[0142] U poželjnom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline je, prema navodima, prisutan u vektoru, kada je pogodno, sa promotorom koji kontroliše ekspresiju nukleinske kiseline. Termin "vektor" koristi se u svom najopštijem značenju i obuhvata svaki intermedijarni prenosnik nukleinske kiseline koji omogućava da pomenuta nukleinska kiselina bude, na primer, introdukovana u prokariotski i/ili eukariotsku ćeliju i, ako je pogodno, ugrađena u genom. Vektori ove vrste se, poželjno, repliciraju i/ili eksprimiraju u ćelijama. Vektori uključuju plazmide, fagmide, bakteriofage ili virusne genome. Termin "plazmid", kako se ovde koristi, odnosi se uopšteno na konstrukt ekstrahromozomskog materijala, obično cirkularni DNK dupleks, koji može da se replicira nezavisno od hromozomske DNK.

[0143] Kao vektor za ekspresiju antitela može se upotrebiti tip vektora u kome su teški lanac i laki lanac antitela prisutni u različitim vektorima, ili tip vektora u kojem su teški lanac i laki lanac prisutni u istom vektoru.

[0144] Ovde data uputstva koja se odnose na specifične sekvence nukleinskih kiselina i aminokiselinske sekvence, npr. one pokazane u listi sekvenci, treba shvatiti kao da se odnose i na modifikacije pomenutih specifičnih sekvenci koje za rezultat imaju sekvence koje su funkcionalno ekvivalentne pomenutim specifičnim sekvencama, npr. aminokiselinske sekvence koje pokazuju osobine identične ili slične osobinama specifičnih aminokiselinskih sekvenci i sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju aminokiselinske sekvence koje pokazuju osobine identične ili slične osobinama aminokiselinskih sekvenci kodiranih specifičnim sekvencama nukleinske kiseline. Jedna važna osobina je da se zadrži vezivanje antitela za njegov cilj ili da se očuvaju efektorske funkcije antitela. Poželjno, sekvenca modifikovana u odnosu na specifičnu sekvencu, kada zamenjuje specifičnu sekvencu u antitelu, zadržava osobinu vezivanja pomenutog antitela za CLD18 i, poželjno, funkcije pomenutog antitela, kako je ovde opisano, npr. CDC-posredovanu lizu ili ADCC-posredovanu lizu.

[0145] Stručnjaci u oblasti razumeće da posebno u sekvencama CDR, hipervarijabilni i varijabilni regioni mogu da budu modifikovani bez gubitka sposobnosti vezivanja za CLD18. Na primer, CDR regioni biće ili identični ili visoko homologi sa regionima antitela koji su ovde specifikovani. Pod "visoko homologi" misli se na to da se mogu načiniti 1 do 5 supstitucija, poželjno od 1 do 4, npr. 1 do 3 ili 1 ili 2 supstitucije u CDR. Pored toga, hipervarijabilni i varijabilni regioni mogu da se modifikuju tako da pokazuju suštinsku homologiju sa regionima antitela koji su ovde specifično objavljeni.

[0146] Treba razumeti da specifične nukleinske kiseline opisane ovde, uključuju i nukleinske kiseline modifikovane da bi se optimizovala upotreba kodona u određenoj ćeliji-domaćinu ili organizmu. Razlike u korišćenju kodona među organizmima mogu da dovedu do različitih problema koji se tiču heterologe genske ekspresije. Optimizacija kodona menjanjem jednog ili više nukleotida originalne sekvence može za rezultat imati optimizaciju ekspresije nukleinske kiseline, posebno optimizaciju efikasnosti translacije u homologom ili heterologom domaćinu u kojem se pomenuta nukleinska kiselina eksprimira. Na primer, ako se nukleinske kiseline poreklom iz čoveka, koje kodiraju konstantne regione i/ili okvirne regione antitela koriste prema predmetnim navodima, npr. za pripremanje himernih ili humanizovanih antitela, može biti poželjno da se pomenute nukleinske kiseline modifikuju da bi se izvršila optimizacija upotrebe kodona, posebno ako pomenute nukleinske kiseline, opciono fuzionisane sa heterologim nukleinskim kiselinama kao što su nukleinske kiseline izvedene iz drugih organizama, kako je ovde opisano, treba da se eksprimiraju u ćelijama organizma koji je različit od ljudskog, kao što je organizam miša ili hrčka. Na primer, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju konstantne regione humanog lakog i teškog lanca, npr. one prema SEQ ID NO: 40 i 45, respektivno, mogu da se modifikuju tako da uključe jednu ili više, poželjno najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 i poželjno do 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 ili 100 ili više nukleotidnih zamena koje za rezultat imaju optimizaciju upotrebe kodona, ali nemaju za rezultat promenu aminokiselinske sekvence. Takve nukleotidne zamene, poželjno odnose se na zamene nukleotida u SEQ ID NO: 40 i 45, respektivno, odabrane iz zamena pokazanih u narednim poravnavanjima SEQ ID NO: 40 i 45, respektivno, sa njihovim modifikovanim parnjacima i nemaju za rezultat promene u kodiranoj aminokiselinskoj sekvenci ili se odnose na odgovarajuće zamene na odgovarajućim pozicijama u drugim sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju konstantne regione humanog lakog i teškog lanca, respektivno. Poželjno, sve zamene pokazane u narednim poravnanjima SEQ ID NO: 40 i 45, respektivno sa njihovim modifikovanim parnjacima koje ne rezultuju promenom kodirane aminokiselinske sekvence efikasne su u sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju konstantne regione humanog lakog i teškog lanca, respektivno.

[0147] Poravnavanje SEQ ID NO: 40 i SEQ ID NO: 147:

[0148] Poravnavanje SEQ ID NO: 45 i SEQ ID NO: 149:

4

[0149] Pored toga, prema predmetnim navodima može biti poželjno modifikovati aminokiselinske sekvence opisane u ovom tekstu, posebno one konstantnih regiona humanog teškog lanca, da bi se sekvenca prilagodila željenom alotipu, npr. alotipu koji se nalazi u kavkazoidnoj populaciji. Takve modifikacije se, poželjno, biraju iz grupe koja se sastoji od sledećih aminokiselinskih zamena unutar SEQ ID NO: 46 ili su na odgovarajućim pozicijama unutar drugih konstantnih regiona humanog teškog lanca: K93R, D235E i L237M. Poželjno, sve ove modifikacije uključene su u aminokiselinske sekvence konstantnih regiona humanog teškog lanca.

[0150] U skladu sa navodima, termin "odgovarajuće pozicije" odnosi se na nukleotide ili aminokiselinske ostatke koji su prilikom poravnavanja sekvenci dve nukleinske kiseline ili dve proteinske sekvence postavljeni jedan naspram drugog.

[0151] Poželjno, stepen identičnosti između specifične sekvence nukleinske kiseline opisane ovde i sekvence nukleinske kiseline koja je modifikovana u odnosu na, ili koja je varijanta pomenute specifične sekvence nukleinske kiseline, iznosiće najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90% ili najpoželjnije najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Što se tiče varijanti nukleinske kiseline CLD18, poželjno je da se stepen identiteta daje za region od najmanje oko 300, najmanje oko 400, najmanje oko 450, najmanje oko 500, najmanje oko 550, najmanje oko 600, najmanje oko 650, najmanje oko 700, najmanje oko 750, ili najmanje oko 780 nukleotida. U poželjnim primerima izvođenja, stepen identičnosti je dat za celu dužinu referentne sekvence nukleinske kiseline, kao što su sekvence nukleinske kiseline date u listi sekvenci. Poželjno, dve sekvence su sposobne da se hibridizuju i formiraju stabilan dupleks jedna sa drugom, uz poželjno odvijanje hibridizacije pod uslovima koji dopuštaju specifičnu hibridizaciju između polinukleotida (strogo kontrolisani uslovi). Strogo kontrolisani uslovi opisani su, na primer, u Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ili Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York i odnose se, na primer, na hibridizaciju na 65°C, u hibridizacionom puferu (3.5 x SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% polivinilpirolidon, 0.02% goveđi serum albumin, 2.5 mM NaH2PO4(pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA). SSC je 0.15 M natrijumhlorid/0.15 M natrijum-citrat, pH 7. Posle hibridizacije, membrana na koju je preneta DNK opere se, na primer, u 2 x SSC na sobnoj temperaturi, a zatim u 0.1-0.5 x SSC/0.1 x SDS na temperaturi do 68°C.

[0152] Poželjno, stepen sličnosti, poželjno identičnosti između specifične ovde opisane aminokiselinske sekvence i aminokiselinske sekvence koja je modifikovana u odnosu na, ili koja

4

je varijanta pomenute specifične aminokiselinske sekvence, npr. između aminokiselinskih sekvenci koje pokazuju suštinsku homologiju, iznosiće najmanje 70%, poželjno najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90% ili najpoželjnije najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Što se tiče varijanti CLD18 polipeptida, stepen sličnosti ili identičnosti je dat poželjno za region od najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 180, najmanje oko 200, najmanje oko 220, najmanje oko 240, najmanje oko 250 ili 260 aminokiselina. U poželjnim primerima izvođenja, stepen sličnosti ili identičnosti je dat za celu dužinu referentne aminokiselinske sekvence kao što su sekvence aminokiselina date u listi sekvenci.

[0153] Sve modifikovane sekvence ili varijante sekvenci koje su opisane iznad, obuhvaćene su predmetnim navodima.

[0154] "Sličnost sekvence" označava procenat amino-kiselina koje su ili identične ili predstavljaju konzervativne aminokiselinske supstitucije. "Identičnost sekvence" između dve polipeptidne sekvence ili sekvence nukleinskih kiselina ukazuje na procenat amino-kiselina ili nukleotida koji su u sekvencama identični.

[0155] "Procenat identičnosti" dobija se posle najboljeg poravnavanja, ovaj procenat je čisto statistički i različitosti između dve sekvence distribuirane su nasumično i čitavom njihovom dužinom. Upoređivanja dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence konvencionalno se obavlja upoređivanjem tih sekvenci posle njihovog optimalnog poravnavanja, pomenuto upoređivanje vrši se po segmentima ili pomoću "prozora poređenja" da bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sekvencione sličnosti. Optimalno poravnavanje sekvenci da bi se vršilo njihovo upoređivanje može da se izvede, pored ručnog načina, putem algoritma lokalne homologije Smith-a i Waterman-a, 1981, Ads App. Math. 2, 482, putem algoritma lokalne homologije Neddleman-a i Wunsch-a, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, putem postupaka traženja sličnosti Pearson-a i Lipman-a, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili kompjuterskim programima koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[0156] Procenat identičnosti izračunava se određivanjem broja identičnih pozicija u dve sekvence koje se porede, deljenjem tog broja brojem upoređivanih pozicija i množenjem dobijenog rezultata sa 100, tako da se dobije procenat identičnosti između te dve sekvence.

[0157] "Konzervativne supstitucije" mogu se napraviti, na primer, na bazi sličnosti prirode polarnosti, naelektrisanja, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti, i/ili amfipatične prirode obuhvaćenih ostataka. Na primer: (a) nepolarne (hidrofobne) amino-kiseline uključuju alanin,

4

leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan i metionin; (b) polarne neutralne aminokiseline uključuju glicin, serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin i glutamin; (c) pozitivno naelektrisane (bazne) amino-kiseline uključuju arginin, lizin i histidin; i (d) negativno naelektrisane (kisele) amino-kiseline uključuju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu. Supstitucije tipično mogu da se naprave unutar grupa (a)-(d). Pored toga, glicin i prolin mogu da se supstituišu jedna drugom na osnovu njihove sposobnosti da narušavaju α-helikse. Neke poželjne supstitucije mogu da se načine između sledećih grupa: (i) S i T; (ii) P i G; i (iii) A, V, L i I. S obzirom na poznati genetički kod i tehnike sinteze DNK, obučeni naučnik lako može da konstruiše DNK koje kodiraju konzervativne aminokiselinske varijante.

[0158] Predmetni navodi uključuju antitela u kojima su načinjene promene u Fc regionu da bi se izmenile funkcionalne ili farmakokinetičke osobine antitela. Takve promene za rezultat mogu da imaju smanjenje ili povećanje vezivanja C1q i CDC ili vezivanja FcγR i ADCC. Supstitucije mogu, na primer, da se naprave u jednoj ili više aminokiselinskih ostataka konstantnog regiona teškog lanca, što dovodi do promena efektorske funkcije, uz zadržavanje sposobnosti vezivanja za antigen u poređenju sa modifikovanim antitelom, videti US 5,624,821 i US 5,648,260.

[0159] In vivo poluživot antitela može da se poboljša modifikovanjem epitopa za receptor spasavanja konstantnog domena Ig ili Ig-sličnog konstantnog domena, tako da molekul ne sadrži intaktni CH2 domen ili intaktni Fc region Ig, videti US 6,121,022 i US 6,194,551. In vivo poluživot može još da se poveća pravljenjem mutacija u Fc regionu, npr., supstituisanjem leucina treoninom na poziciji 252, supstituisanjem serina treoninom na poziciji 254 ili supstituisanjem fenilalanina treoninom na poziciji 256, videti US 6,277,375.

[0160] Pored toga, obrazac glikozilacije antitela može da se modifikuje kako bi se promenila efektorska funkcija antitela. Na primer, antitela mogu da se eksprimiraju u transfektomu koji ne dodaje fukoznu jedinicu normalno prikačenu za Asn na poziciji 297 Fc regiona, da bi se pojačao afinitet Fc regiona za Fc-receptore, što će, dalje, za rezultat imati povećanu ADCC antitela u prisustvu NK ćelija, videti Shield et al. (2002) JBC, 277: 26733. Pored toga, može da se napravi modifikacija galaktozilacije da bi se modifikovala CDC.

[0161] Alternativno, u drugom primeru izvođenja, mogu da se uvedu mutacije nasumično duž cele ili dela sekvence koja kodira anti-CLD18 antitelo, npr. saturacionom mutagenezom i dobijena modifikovana anti-CLD18 antitela mogu da se pretražuju u pogledu vezujuće aktivnosti.

[0162] Termin "rekombinantna ćelija-domaćin " (ili jednostavno "ćelija-domaćin"), kako se ovde koristi, treba da označi ćeliju u koju je uveden rekombinantni ekspresioni vektor. Treba shvatiti da takvi termini označavaju ne samo određenu subjekatsku ćeliju nego i potomstvo te ćelije.

4

Zbog toga što određene modifikacije mogu da se dese u kasnijim generacijama, zbog mutacija ili uticaja sredine, takvo potomstvo u stvari ne mora biti identično sa roditeljskom ćelijom, ali je i dalje obuhvaćeno terminom "ćelija-domaćin", kako se koristi u ovom tekstu. Rekombinantne ćelije-domaćini uključuju na primer, transfektome, npr. CHO ćelije, NS/0 ćelije i limfocitne ćelije.

[0163] Kako se ovde koristi, termin "subjekt" uključuje svaku humanu ili nehumanu životinju. Termin "nehumana životinja" obuhvata sve vertebrate, npr., sisare i nesisare, kao što su nehumani primati, ovca, pas, krava, pilići, vodozemci, reptili, itd.

[0164] Termin "transgena životinja" odnosi se na životinju koja ima genom koji sadrži jedan ili više transgena, poželjno transgena teškog i/ili lakog lanca, ili transhromozome (integrisane ili neintegrisane u prirodnu genomsku DNK životinje), i koja je, poželjno, sposobna da eksprimira transgene. Na primer, transgeni miš može da ima transgen humanog lakog lanca i transgen humanog teškog lanca ili transhromozom humanog teškog lanca, tako da miš proizvodi humana anti-CLD18 antitela kada se imunizuje CLD18 antigenom i/ili ćelijama koje eksprimiraju CLD18. Transgen humanog teškog lanca može da se integriše u hromozomsku DNK miša, kao u slučaju transgenih miševa, npr., HuMAb miševi, npr. HCo7 ili HCo12 miševi, ili transgen humanog teškog lanca može da se održava ekstrahromozomski, kao u slučaju transhromozomskih (npr., KM) miševa, kao što je opisano u WO 02/43478. Takvi transgeni i transhromozomski miševi mogu biti u stanju da proizvode multiple izotipove humanih monoklonskih antitela na CLD18 (npr., IgG, IgA i/ili IgE) prolazeći V-D-J rekombinaciju i izotipsko prekopčavanje.

[0165] "Smanjiti" ili "inhibirati", kako se ovde koristi, znači sposobnost da se izazove ukupno smanjenje, poželjno od 5% ili veće, 10% ili veće, 20% ili veće, poželjnije od 50% ili veće, a najpoželjnije od 75% ili veće, nivoa, npr. nivoa proliferacije ćelija.

Mehanizmi delovanja mAb

[0166] Iako se u tekstu koji sledi razmatraju mehanizmi na kojima počiva terapijska efikasnost antitela prema navodima, on ne treba da se razume kao da na bilo koji način ograničava navode.

[0167] Ovde opisana antitela poželjno interaguju sa komponentama imunog sistema, poželjno preko ADCC ili CDC. Antitela prema navodima mogu da se koriste i za usmeravanje "korisnog tereta" (npr., radioizotopi, lekovi ili toksini) za direktno ubijanje tumorskih ćelija ili mogu da se koriste sinergistički sa tradicionalnim hemoterapeutskim sredstvima, napadajući tumore komplementarnim mehanizmima dejstva koji mogu uključivati antitumorske imune odgovore koji mogu biti kompromitovani usled sporednih citotoksičnih dejstava hemoterapeutika na T-

4

limfocite. Međutim, antitela prema navodima takođe mogu da ispolje efekat jednostavno vezivanjem za CLD18 na površini ćelije, i da time npr., blokiraju proliferaciju ćelija.

Ćelijama posredovana citotoksičnost zavisna od antitela

[0168] ADCC opisuje sposobnost efektorskih ćelija, posebno limfocita, da usmrte druge ćelije, kako je ovde opisano, što poželjno zahteva da ciljna ćelija bude markirana antitelom.

[0169] ADCC se, poželjno, dešava kada se antitela vežu za antigene na tumorskim ćelijama, a Fc domeni antitela zauzmu Fc receptore (FcR) na površini imunih efektorskih ćelija. Identifikovano je nekoliko familija Fc receptora, a specifične populacije ćelija karakteristično eksprimiraju definisane Fc receptore. ADCC može da se posmatra kao mehanizam direktnog indukovanja varijabilnog stepena neposredne destrukcije tumora koja vodi do prikazivanja antigena i indukovanja odgovora T-ćelija usmerenog ka tumoru. Poželjno, in vivo indukovanje ADCC dovešće do odgovora T-ćelija usmerenog ka tumoru i odgovora antitelima poreklom iz domaćina.

Citotoksičnost zavisna od komplementa

[0170] CDC je drugi postupak ubijanja ćelija koji može da se usmeri pomoću antitela. IgM je najefikasniji izotip za aktivaciju komplementa. IgG1 i IgG3 takođe su veoma efikasni u usmeravanju CDC preko klasičnog puta aktivacije komplementa. Poželjno, u ovoj kaskadi, formiranje kompleksa antigen-antitelo za rezultat ima otkrivanje multiplih mesta za vezivanje C1q u blizini CH2 domena učestvujućih molekula antitela, kao što su molekuli IgG (C1q je jedna od tri subkomponente komplementa C1). Poželjno, ova otkrivena mesta za vezivanje C1q preobražavaju ranije niskoafinitetnu interakciju C1q-IgG u visokoafinitetnu, što pokreće kaskadu događaja u koje je uključen niz drugih proteina komplementa i dovodi do proteolitičkog oslobađanja agenasa C3a i C5a koji su hemotaksični/aktivirajući agensi za efektorske ćelije. Poželjno, kaskada komplementa završava se formiranjem kompleksa koji napada membranu, stvara pore u ćelijskoj membrani koje olakšavaju slobodan prolaz vode i rastvoraka u ćeliju i iz nje.

Proizvodnja antitela

[0171] Antitela prema navodima mogu da se proizvedu različitim tehnikama uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonskih antitela npr., standardnu tehniku hibridizacije somatskih ćelija prema Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Iako su postupci hibridizacije somatskih ćelija poželjni, u principu mogu da se upotrebe i druge tehnike za

4

proizvodnju monoklonskih antitela, npr., virusna ili onkogena transformacija B-limfocita ili tehnike prikazivanja fagima, uz korišćenje biblioteke gena antitela.

[0172] Poželjni životinjski sistem za pripremanje hibridoma koji izlučuju monoklonska antitela je sistem miša. Proizvodnja hibridoma u mišu veoma je dobro ustanovljen postupak. Protokoli imunizacije i tehnike izolacije imunizovanih splenocita za fuziju, poznate su u struci. Fuzioni partneri (npr., mišje mijeloma ćelije) i fuzioni postupci, takođe su poznati.

[0173] Drugi poželjni životinjski sistemi za pripremanje hibridoma koji sekretuju monoklonska antitela su sistem pacova i sistem zeca (npr. opisano u Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), vidi takođe Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol.124: 295 (2005)).

[0174] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, humana monoklonska antitela usmerena protiv CLD18 mogu da se generišu korišćenjem transgenih ili transhromozomskih miševa koji nose delove humanog imunog sistema umesto sistema miša. Ovi transgeni i transhromozomski miševi uključuju miševe poznate kao HuMAb miševi i KM miševi, respektivno, i u ovom tekstu kolektivno su označeni kao "transgeni miševi". Proizvodnja humanih antitela u takvim transgenim miševima može da se obavi kao što je opisano za CD20 u WO2004035607.

[0175] Još jedna strategija za stvaranje monoklonskih antitela je da se geni koji kodiraju antitela direktno izoluju iz limfocita koji proizvode antitela definisane strategije npr. vidi Babcock et al., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy. Za detalje o inženjeringu rekombinantnih antitela vidi takođe Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 i Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.

Imunizacije

[0176] Za generisanje antitela na CLD18, miševi mogu da se imunizuju peptidima konjugovanim sa nosačem, izvedenim iz CLD18 sekvence, obogaćenim preparatom rekombinantno eksprimiranog CLD18 antigena ili fragmentima istih i/ili ćelijama koje eksprimiraju CLD18, kako je opisano. Alternativno, miševi mogu da se imunizuju sa DNK koja kodira humani CLD18 pune dužine (npr. SEQ ID NO: 1) ili njegov fragment, posebno SEQ ID NO: 15, 17 i 19. Ako se desi da imunizacija uz korišćenje prečišćenog ili obogaćenog preparata CLD18 antigena ne rezultuje antitelima, miševi mogu da se imunizuju i ćelijama koje eksprimiraju CLD18, npr., ćelijskom linijom, da bi se pokrenuli imuni odgovori.

[0177] Tokom protokola imunizacije, imuni odgovor može da se prati uz pomoć uzoraka plazme i seruma uzetih iz repne vene ili retroorbitalnim krvarenjem. Miševi sa dovoljnim titrima anti-CLD18 imunoglobulina mogu da se uzmu za fuzije. Miševi mogu da se intraperitonealno ili intravenski injektiraju ćelijama koje eksprimiraju CLD18, 3 dana pre žrtvovanja i da im se ukloni slezina da bi se povećala stopa hibridoma koji sekretuju specifična antitela.

Generisanje hibridoma koji proizvode monoklonska antitela

[0178] Da bi se generisali hibridomi koji proizvode monoklonska antitela na CLD18, splenociti i ćelije limfnog čvora iz imunizovanih miševa mogu da se izoluju i fuzionišu sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je ćelijska linija mišjeg mijeloma. Dobijeni hibridomi tada mogu da se pretražuju u pogledu produkcije antigen-specifičnih antitela. Pojedinačne komorice pretražuju se, pomoću ELISA testa, na hibridome koji sekretuju antitelo. Imunofluorescentnom i FACS analizom, uz korišćenje ćelija koje eksprimiraju CLD18, mogu da se identifikuju antitela sa specifičnošću za CLD18. Hibridomi koji izlučuju sekretuju antitelo mogu da se ponovo zaseju, ponovo pretraže i, ako su i dalje pozitivni na anti-CLD18 monoklonska antitela, mogu da se subkloniraju postupkom graničnog razblaženja. Stabilni subklonovi zatim mogu da se kultivišu in vitro, da bi se u medijumu za kulturu tkiva generisalo antitelo za karakterizaciju.

Generisanje transfektoma koji proizvode monoklonska antitela

[0179] Antitela prema navodima mogu da se proizvedu i u transfektoma ćeliji-domaćinu, korišćenjem na primer kombinacije tehnika rekombinantne DNK i postupaka transfekcije gena, kao što je dobro poznato u struci (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

[0180] Na primer, u jednom primeru izvođenja, gen (geni) od interesa, npr., geni antitela, mogu da se vežu u ekspresioni vektor kao što je eukariotski ekspresioni plazmid, npr. onaj korišćen u GS genskom ekspresionom sistemu, objavljen u WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338841 ili kao što su drugi ekspresioni sistemi, dobro poznati u struci. Prečišćeni plazmid sa kloniranim genima antitela može da se uvede u eukariotske ćelije-domaćine kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293T ćelije ili HEK293 ćelije ili, alternativno, druge eukariotske ćelije kao što su ćelije poreklom iz biljaka, ćelije gljivica ili ćelije kvasca. Postupci koji se koriste za uvođenje ovih gena mogu biti postupci opisani u struci kao što su elektroporacija, korišćenje lipofektina, lipofektamina ili drugi. Posle uvođenja ovih gena antitela, ćelije koje eksprimiraju antitelo mogu da se identifikuju i selekcionišu. Ove ćelije predstavljaju transfektome kojima zatim može da se pojača nivo ekspresije i poveća produkcija antitela. Rekombinantna antitela mogu da se izoluju i prečiste iz supernatanata ovih kultura i/ili ćelija. Alternativno, klonirani geni antitela mogu da se eksprimiraju u drugim ekspresionim sistemima, uključujući prokariotske ćelije kao što su mikroorganizmi, npr. E. coli. Pored toga, antitela mogu da se proizvedu u transgenim

1

nehumanim životinjama npr. u mleku ovaca i zečeva, ili u kokošjim jajima, ili transgenim biljkama; vidi npr. Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; i Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem.380: 825-839.

Upotreba parcijalnih sekvenci antitela za ekspresiju intaktnih antitela (tj. humanizacija i himerizacija)

a) Himerizacija

[0181] Mišja monoklonska antitela mogu da se kod ljudi upotrebljavaju kao terapijska antitela kada se obeleže toksinima ili radioaktivnim izotopima. Neobeležena mišja antitela za čoveka su visoko imunogena kada se ponavljano primenjuju, što dovodi do redukcije terapijskog efekta. Glavna imunogenost posredovana je konstantnim regionima teškog lanca. Imunogenost mišjih antitela u čoveku može da se smanji ili potpuno izbegne ako se respektivna antitela himerizuju ili humanizuju.

[0182] Himerna antitela su antitela, čiji su različiti delovi izvedeni iz različitih vrsta životinja, npr. ona koja imaju varijabilni region poreklom iz mišjeg antitela i konstantni region humanog imunoglobulina. Himerizacija antitela postiže se spajanjem varijabilnih regiona teškog i lakog lanca antitela miša sa konstantnim regionom humanog teškog i lakog lanca (npr. kao što je opisano u Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). U poželjnom primeru izvođenja, himerna antitela generišu se spajanjem konstantnog regona humanog kapa-lakog lanca sa varijabilnim regionom lakog lanca miša. U takođe poželjnom primeru izvođenja, himerna antitela mogu da se generišu spajanjem konstantnog regona humanog lambda-lakog lanca sa varijabilnim regionom lakog lanca miša. Poželjni konstantni regioni teškog lanca za generisanje himernih antitela su IgG1, IgG3 i IgG4. Drugi poželjni konstantni regioni teškog lanca za generisanje himernih antitela su IgG2, IgA, IgD i IgM.

b) Humanizacija

[0183] Antitela interaguju sa ciljnim antigenima pretežno preko aminokiselinskih ostataka koji se nalaze na šest regiona koji određuju komplementarnost (CDR) teških i lakih lanaca. Zbog toga, aminokiselinske sekvence unutar CDR u većoj meri se razlikuju među pojedinim antitelima nego sekvence izvan CDR. Pošto su CDR sekvence odgovorne za većinu interakcija antiteloantigen, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja imitiraju osobine specifičnih antitela koja se sreću u prirodi konstruisanjem ekspresionih vektora koji uključuju CDR sekvence iz specifičnih antitela koja se prirodno sreću graftovane u okvirne sekvence iz različitih antitela sa

2

različitim osobinama (vidi, npr., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; i Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Takve okvirne sekvence mogu da se dobiju iz javnih baza podataka DNK koje uključuju genske sekvence antitela klicine linije. Ove sekvence klicine linije razlikovaće se od zrelih genskih sekvenci antitela jer neće uključivati potpuno asemblirane varijabilne gene koji se formiraju V-(D)-J spajanjem tokom sazrevanja B-ćelija. Genske sekvence klicine linije će se takođe razlikovati od sekvenci visokoafinitetnog antitela sekundarnog repertoara, individualno, ravnomerno duž varijabilnog regiona. Na primer, somatske mutacije su relativno retke u aminoterminalnom delu okvirnog regiona 1 i u karboksi-terminalnom delu okvirnog regiona 4. Pored toga, mnoge somatske mutacije ne menjaju značajno vezujuća svojstva antitela. Zbog toga nije neophodno dobiti celu DNK sekvencu određenog antitela da bi se ponovo kreiralo intaktno rekombinantno antitelo koje ima osobine vezivanja slične kao originalno antitelo (vidi WO 99/45962). Parcijalne sekvence teškog i lakog lanca koje presecaju CDR regione tipično su dovoljne za ovu svrhu. Parcijalna sekvenca se koristi da se odredi koji varijabilni i spojni genski segmenti klicine linije doprinose varijabilnim genima rekombinovanog antitela. Sekvenca klicine linije se tada koristi da popuni nedostajuće delove varijabilnih regiona. Liderske sekvence teškog i lakog lanca odsecaju se tokom sazrevanja proteina i ne doprinose osobinama finalnog antitela. Da bi se dodale nedostajuće sekvence, klonirane cDNK sekvence mogu da se kombinuju sa sintetskim oligonukleotidima putem ligacije ili PCR amplifikacije. Alternativno, čitav varijabilni region može da se sintetiše kao set kratkih, preklapajućih oligonukleotida i kombinuje PCR amplifikacijom da se stvori potpuno sintetizovan klon varijabilnog regiona. Ovaj proces ima određene prednosti kao što su eliminacija ili inkluzija određenih restrikcionih mesta, ili optimizacija određenih kodona.

[0184] Nukleotidne sekvence transkripta teškog i lakog lanca iz hibridoma koriste se za dizajniranje preklapajućeg seta sintetskih oligonukleotida za stvaranje sintetskih V sekvenci sa identičnim kapacitetom kodiranja amino-kiselina kao prirodne sekvence. Sintetske sekvence teškog i kapa lanca mogu da se razlikuju od prirodnih sekvenci na tri načina: nizovi ponovljenih nukleotidnih baza prekinuti su da bi se olakšala sinteza oligonukleotida i PCR amplifikacija; optimalna mesta inicijacije translacije inkorporisana su prema Kozak-ovim pravilima (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870); i HindIII mesta konstruisana su ushodno od mesta inicijacije translacije.

[0185] Za varijabilne regione lakog i teškog lanca, optimizovane kodirajuće i odgovarajuće nekodirajuće, lančane sekvence razložene su u 30-50 nukleotida približno na sredini odgovarajućeg nekodirajućeg oligonukleotida. Tako, za svaki lanac, oligonukleotidi mogu da se sklope u preklapajuće dvolančane setove koji premošćuju segmente od 150-400 nukleotida. Pulovi se zatim koriste kao matrice za proizvodnju produkata PCR-amplifikacije od 150 do 400 nukleotida. Tipično, jedan oligonukleotidni set varijabilnog regiona razložiće se u dva pula koji se zasebno amplifikuju da bi se generisala dva preklapajuća PCR proizvoda. Ovi preklapajući proizvodi se zatim kombinuju PCR amplifikacijom da formiraju kompletni varijabilni region. Može biti poželjno i da se u PCR amplifikaciju uključi preklapajući fragment konstantnog regiona teškog ili lakog lanca da bi se stvorili fragmenti koji mogu lako da se kloniraju u ekspresione vektorske konstrukte.

[0186] Rekonstruisani varijabilni regioni himerizovanog ili humanizovanog teškog i lakog lanca zatim se kombinuju sa kloniranim sekvencama promotora, lidera, inicijatora translacije, konstantnog regiona, 3' netranslatujućom sekvencom, poliadenilacionom sekvencom i sekvencom terminacije transkripcije, da se formiraju ekspresioni vektorski konstrukti. Ekspresioni konstrukti teškog i lakog lanca mogu da se kombinuju u jednom vektoru, kotransfektuju, serijski transfektuju ili zasebno transfektuju u ćelije-domaćine koje se zatim fuzionišu da formiraju ćeliju-domaćina koja eksprimira oba lanca. Plazmidi koji se upotrebljavaju za konstruisanje ekspresionih vektora za humani IgGκ opisani su dole. Plazmidi su konstruisani tako da PCR amplifikovane cDNK sekvence V teškog i V kapa lakog lanca mogu da se koriste za rekonstrukciju kompletnih minigena teškog i lakog lanca. Ovi plazmidi mogu da se koriste za ekspresiju kompletno humanih, ili himernih IgG1, kapa ili IgG4, kapa antitela. Slični plazmidi mogu da se konstruišu za ekspresiju drugih izotipova teškog lanca, ili za ekspresiju antitela koja sadrže lambda lake lance.

[0187] Prema tome, u sledećem aspektu navoda, strukturne osobine anti-CLD18 antitela prema navodima koriste se za kreiranje strukturno srodnih humanizovanih anti-CLD18 antitela koja zadržavaju najmanje jednu funkcionalnu osobinu antitela prema navodima kao što je vezivanje za CLD18. Preciznije, jedan ili više CDR regiona mišjih monoklonskih antitela mogu da se rekombinantno kombinuju sa poznatim humanim okvirnim regionima i CDR, da bi se kreirala dodatna, rekombinantno konstruisana humanizovana anti-CLD18 antitela prema navodima.

Vezivanje za ćelije koje eksprimiraju antigen

[0188] Sposobnost antitela da se vezuje za CLD18 može da se odredi korišćenjem standardnih testova vezivanja, kao što su oni navedeni u primerima (npr., ELISA, Western Blot, imunofluorescencija i protočno-citometrijska analiza).

Karakterizacija vezivanja antitela

4

[0189] Za prečišćavanje anti-CLD18 antitela, odabrani hibridomi mogu da rastu u dvolitarskim flakonima opremljenim mešalicom, za prečišćavanje monoklonskih antitela. Alternativno, anti-CLD18 antitela mogu da se proizvedu u biorekatorima baziranim na dijalizi. Supernatanti mogu da se filtriraju i, ako je neophodno, koncentruju pre afinitetne hromatografije sa protein G-sefarozom ili protein A-sefarozom. Eluirani IgG mogu da se prekontrolišu pomoću gel elektroforeze i tečne hromatografije visokih performansi da bi se osigurala čistoća. Puferski rastvor može da se zameni PBS-om, a koncentracija može da se odredi pomoću OD280, uz korišćenje koeficijenta ekstinkcije 1.43. Monoklonska antitela mogu da se podele u alikvote i uskladište na -80°C.

[0190] Da bi se odredilo da li se odabrana anti-CLD18 monoklonska antitela vezuju za jedinstvene epitope, može da se koristi usmerena mutageneza ili mutageneza usmerena na više mesta.

Određivanje izotipa

[0191] Za određivanje izotipa prečišćenih antitela, mogu da se sprovedu izotipski ELISA testovi uz korišćenje različitih komercijalnih kitova (npr. Zymed, Roche Diagnostics). Komorice mikrotitarskih ploča oblažu se anti-mišjim Ig. Posle blokiranja, ploče reaguju sa monoklonskim antitelima ili prečišćenim izotipskim kontrolama, na sobnoj temperaturi, tokom dva sata. Komorice zatim reaguju sa mišjim IgG1, IgG2a, IgG2b ili IgG3, IgA ili sa mišjim IgM-specifičnim peroksidaza-konjugovanim probama. Posle ispiranja, ploče se razvijaju pomoću ABTS supstrata (1 mg/ml) i analiziraju na OD od 405-650. Alternativno, može da se koristi IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, kat. br. 1493027), prema uputstvu proizvođača.

Analiza protočnom citometrijom

[0192] Da bi se pokazalo prisustvo anti-CLD18 antitela u serumima imunizovanih miševa ili vezivanje monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju CLD18, može da se koristi protočna citometrija. Ćelijske linije koje eksprimiraju CLD18, prirodno ili posle transfekcije, i negativne kontrole koje ne eksprimiraju CLD18 (gajene pod standardnim uslovima rasta) mogu da se pomešaju sa različitim koncentracijama monoklonskih antitela u supernatantima hibridoma ili u PBS koji sadrži 1% FBS, i mogu da se inkubiraju na 4°C, 30 min. Posle ispiranja, anti-IgG antitelo obeleženo pomoću APC ili Alexa647 može da se veže za CLD18-vezano monoklonsko antitelo pod istim uslovima kao pri vezivanju primarnih antitela. Uzorci se analiziraju protočnom citometrijom pomoću FACS instrumenta koji koristi svetlo i osobine bočnog rasipanja na pojedinačnim živim ćelijama. Da bi se razlikovala CLD18-specifična monoklonska antitela od nespecifičnih vezujućih sredstava, u jednom merenju, može da se upotrebi postupak kotransfekcije. Ćelije koje su prolazno transfektovane plazmidima koji kodiraju CLD18 i fluorescentni marker boje se kako je gore opisano. Transfektovane ćelije detektuju se na različitim kanalima fluorescencije u odnosu na ćelije obojene antitelima. Kako većina transfektovanih ćelija eksprimira oba transgena, CLD18-specifična monoklonska antitela vezuju se preferencijalno za ćelije koje eksprimiraju fluorescentni marker, dok se nespecifična antitela vezuju u sličnom odnosu za netransfektovane ćelije. Alternativni test koji koristi fluorescentnu mikroskopiju može da se koristi dodatno ili umesto testa protočnom citometrijom. Ćelije mogu da se boje na isti način kao što je gore opisano i da se analiziraju pomoću fluorescentne mikroskopije.

[0193] Proteini čvrstih spojeva teže da se internalizuju ako se međućelijski kontakt određenih adherentnih ćelija sa susednim ćelijama izgubi npr. odvajanjem ćelija. Ekspresija CLD18 na površini ćelije može da se optimizuje a) podešavanjem uslova kulture npr. kultivisanjem pri većoj gustini ćelija na standardizovani način, korišćenjem blagog sredstva za razdvajanje (npr.2 mM EDTA/PBS ili akutaza), obrađivanjem na sobnoj temperaturi i dodavanjem inhibitora endocitoze (npr. natrijum-azid) ili aktivatora transkripcije ili translacije CLD18 i b) selekcionisanjem i kloniranjem ćelija koje održavaju visoke nivoe CLD18 na površini ćelije, npr. selekcionisanjem antibioticima u relaciji sa transfektovanim ćelijama, imunomagnetnim ili FACS sortiranjem ćelija ili kloniranjem postupkom graničnog razblaženja.

Imunofluorescentna mikroskopija

[0194] Da bi se pokazalo prisustvo anti-CLD18 antitela u serumima imunizovanih miševa ili vezivanje monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju CLD18, može se koristiti analiza imunofluorescentnom mikroskopijom. Na primer, ćelijske linije koje eksprimiraju CLD18, spontano ili posle transfekcije, i negativne kontrole koje ne pokazuju ekspresiju CLD18 gaje se na pločicama sa komorama, pod standardnim uslovima u DMEM/F12 medijumu koji je dopunjen dodavanjem 10% fetalnog telećeg seruma (FCS), 2 mM L-glutamina, 100 IU/ml penicilina i 100 μg/ml streptomicina. Posle toga ćelije se fiksiraju metanolom ili paraformaldehidom, ili se ostave netretirane. Ćelije zatim reaguju sa monoklonskim antitelima na CLD18, 30 min. na 25°C. Posle ispiranja, ćelije reaguju sa Alexa555-obeleženim anti-mišjim IgG sekundarnim antitelom (Molecular Probes), pod istim uslovima. Ćelije se zatim ispituju fluorescentnom mikroskopijom.

[0195] Ukupni ćelijski nivoi CLD18 mogu se uočiti posle fiksiranja ćelija u metanolu ili paraformaldehidu i permeabilizacije pomoću Triton-a X-100. U živim ćelijama i nepermeabilizovanim ćelijama fiksiranim u paraformaldehidu može da se ispituje površinska lokalizacija CLD18. Dodatno upućivanje CLD18 ka čvrstim spojevima može da se analizira istovremenim bojenjem pomoću markera kao što je ZO-1. Pored toga, mogu da se ispituju efekti vezivanja antitela i lokalizacija CLD18 unutar ćelijske membrane.

Western Blot

[0196] Anti-CLD18 IgG mogu dalje da se testiraju u pogledu reaktivnosti sa antigenom CLD18, pomoću Western Blott-a. Ukratko, ćelijski ekstrakti ćelija koje eksprimiraju CLD18 i odgovarajuće negativne kontrole pripreme se i izlože elektroforezi na natrijum-dodecilsulfat (SDS) poliakrilamidnom gelu. Posle elektroforeze, razdvojeni antigeni prenose se na nitrocelulozne membrane, blokiraju se i ispituju monoklonskim antitelima koja se testiraju. IgG vezivanje detektuje se korišćenjem anti-mišjeg IgG obeleženog peroksidazom i razvijanjem pomoću ECL supstrata.

Imunohistohemija

[0197] Anti-CLD18 mišji IgG dalje mogu da se testiraju u pogledu reaktivnosti sa CLD18 antigenom pomoću imunohistohemije, na način koji je dobro poznat obučenoj osobi, npr. korišćenjem kriopreseka fiksiranih paraformaldehidom ili acetonom, ili preseka tkiva ukalupljenog u parafin, fiksiranog paraformaldehidom, poreklom iz nekancerskog tkiva ili uzoraka kancerskog tkiva dobijenih od pacijenata tokom rutinskih procedura, ili iz miševa koji su nosili ksenograftske tumore inokulirane ćelijskim linijama koje spontano (npr. DAN-G, SNU-16 ili KATO-III) ili posle transfekcije (npr. HEK293) eksprimiraju CLD18. Za imunobojenje, antitela reaktivna na CLD18 mogu da se inkubiraju, što je praćeno inkubiranjem sa kozjim antimišjim ili kozjim anti-zečjim antitelima (DAKO) obeleženim peroksidazom rena, prema uputstvu prodavca.

Aktivnost antitela u fagocitozi i ubijanju ćelija in vitro

[0198] Pored specifičnog vezivanja za CLD18, anti-CLD18 antitela mogu da se testiraju i u pogledu sposobnosti da posreduju u fagocitozi i ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLD18. Testiranje aktivnosti monoklonskih antitela in vitro predstavljaće inicijalni skrining pre testiranja u in vivo modelima.

Ćelijama posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC):

[0199] Ukratko, polimorfonuklearne ćelije (PMN), NK ćelije, monociti, mononuklearne ćelije ili druge efektorske ćelije iz zdravih donora mogu da se prečiste centrifugiranjem na gradijentu gustine Ficoll Hypaque-a, što je praćeno lizom kontaminirajućih eritrocita. Isprane efektorske ćelije suspenduju se u RPMI koji je dopunjen 10% fetalnim telećim serumom inaktiviranim toplotom ili alternativno 5% humanim serumom inaktiviranim toplotom i pomešaju sa ciljnim ćelijama obeleženim sa<51>Cr, koje eksprimiraju CLD18, u različitim odnosima efektorskih ćelija prema ciljnim ćelijama. Alternativno, ciljne ćelije se obeleže ligandom za pojačanje fluorescencije (BATDA). Visoko fluorescentni helat europijuma sa pojačavajućim ligandom, koji se oslobađa iz mrtvih ćelija meri se fluorometrom. U drugoj alternativnoj tehnici koristi se transfekcija ciljnih ćelija luciferazom. Dodata lucifer-žuta boja može da se oksidiše samo vijabilnim ćelijama. Prečišćeni anti-CLD18 IgG zatim se dodaju u različitim koncentracijama. Humani IgG koji nije od značaja, koristi se kao negativna kontrola. Test se obavlja tokom 4 do 20 sati, na 37°C, zavisno od tipa upotrebljenih efektorskih ćelija. Uzorci se testiraju u pogledu citolize merenjem oslobađanja<51>Cr ili prisustva helata EuTDA u supernatantu kulture. Alternativno, luminiscencija nastala oksidacijom lucifer-žutog može da bude mera vijabilnosti ćelija.

[0200] Anti-CLD18 monoklonska antitela mogu da se testiraju i u različitim kombinacijama, da bi se odredilo da li se citoliza pojačava u prisustvu više monoklonskih antitela.

Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC):

[0201] Korišćenjem različitih poznatih tehnika, monoklonska anti-CLD18 antitela mogu da se testiraju u pogledu sposobnosti da posreduju u CDC. Na primer, serum za komplement može da se dobije iz krvi na način poznat obučenoj osobi. Da bi se odredila CDC aktivnost mAbs, mogu se koristiti različiti postupci. Može da se meri, na primer, oslobađanje<51>Cr, ili može da se procenjuje porast propustljivosti membrane korišćenjem propidijum-jodidnog (PI) ekskluzionog testa. Ukratko, ciljne ćelije se isperu i 5 x 10<5>ćel./ml inkubira se u prisustvu različitih koncentracija mAb, 10-30 min. na sobnoj temperaturi ili na 37°C. Zatim se dodaju serum ili plazma do finalne koncentracije od 20% (zapr./zapr.) i ćelije se inkubiraju na 37°C, 20-30 min. Sve ćelije iz svakog uzorka mogu da se dodaju u rastvor PI u epruveti za FACS. Mešavina se zatim odmah analizira protočnom citometrijom pomoću FACSArray bioanalizatora.

[0202] U alternativnom testu, indukovanje CDC može da se odredi na adherentnim ćelijama. U jednom primeru izvođenja ovog testa, ćelije se zaseju 24 h pre testa pri gustini od 3 x 10<4>ćelija po komorici, na mikrotitarskim pločama sa ravnim dnom, za kulturu tkiva. Sledećeg dana, ukloni se medijum za rast i ćelije se inkubiraju sa antitelima, u triplikatima. Kontrolne ćelije se inkubiraju sa medijumom za rast ili sa medijumom za rast koji sadrži 0.2% saponina, za određivanje pozadinske lize i maksimalne lize, respektivno. Posle 20 min. inkubacije na sobnoj temperaturi, supernatanti se uklone i ćelijama se doda 20% (zapr./zapr.) humane plazme ili seruma u DMEM (prethodno zagrejanih na 37°C) i vrši se inkubacija narednih 20 min. na 37°C. Sve ćelije iz svakog uzorka dodaju se u rastvor propidijum-jodida (10 μg/ml). Zatim se supernatanti zamene PBS-om sa 2.5 μg/ml etidijum-bromida i fluorescentna emisija posle ekscitacije na 520 nm, meri se na 600 nm korišćenjem Tecan Safire. Procenat specifične lize izračunava se na sledeći način: % specifične lize = (fluorescencija uzorka - pozadinska fluorescencija)/ (fluorescencija maksimalne lize - pozadinska fluorescencija) x 100.

Inhibicija proliferacije ćelija pomoću monoklonskih antitela

[0203] Da bi se testirala sposobnost iniciranja apoptoze, monoklonska anti-CLD18 antitela mogu, na primer, da se inkubiraju sa CLD18-pozitivnim tumorskim ćelijama, npr., SNU-16, DAN-G, KATO-III ili CLD18-transfektovanim tumorskim ćelijama, na 37°C, oko 20 sati. Ćelije se sakupe, isperu u aneksin V-vezujućem puferu (BD biosciences) i inkubiraju sa aneksinom V konjugovanim sa FITC ili APC (BD biosciences), 15 min. u mraku. Sve ćelije iz svakog uzorka dodaju se u rastvor PI (10 μg/ml u PBS) u epruveti za FACS i odmah ispituju pomoću protočne citometrije (kao gore). Alternativno, opšta inhibicija ćelijske proliferacije monoklonskim antitelima može da se detektuje komercijalno dostupnim kitovima. DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, kat. br. AD0200) je neizotopski imunotest baziran na merenju inkorporacije 5-bromo-2’-deoksiuridina (BrdU) tokom sinteze DNK proliferišućih ćelija, na mikropločama. Inkorporisani BrdU detektuje se korišćenjem monoklonskog antitela obeleženog europijumom. Da bi se omogućila detekcija antitela, ćelije se fiksiraju i DNK denaturiše korišćenjem Fix rastvora. Nevezana antitela se isperu i doda se DELFIA induktor da bi se joni europijuma disocirali od obeleženih antitela u rastvor, gde formiraju visokofluorescentne helate sa komponentama DELFIA induktora. Izmerena fluorescencija - upotrebljena vremenski razložena fluorometrija u detekciji - proporcionalna je sintezi DNK u ćelijama u svakoj komorici.

Pretkliničke studije

[0204] Monoklonska antitela koja se vezuju za CLD18 mogu da se testiraju i u in vivo modelu (npr. u imunodeficijentnim miševima koji nose ksenograftovane tumore inokulisane ćelijskim linijama koje eksprimiraju CLD18, npr. DAN-G, SNU-16 ili KATO-III, ili posle transfekcije, npr. HEK293), da bi se odredila efikasnost u kontroli rasta tumorskih ćelija koje eksprimiraju CLD18.

[0205] In vivo studije posle ksenograftovanja CLD18-eksprimirajućih tumorskih ćelija u imunokompromitovane miševe ili druge životinje, može da se obavi korišćenjem antitela prema navodima. Antitela mogu da se primene na miševima koji nemaju tumor, što je praćeno injektiranjem tumorskih ćelija, da bi se merili efekti antitela u prevenciji formiranja tumora ili simptoma povezanih sa tumorom. Antitela mogu da se primene na miševima koji nose tumor, da bi se odredila terapijska efikasnost respektivnih antitela u redukciji rasta tumora, metastaza i simptoma povezanih sa tumorom. Primena antitela može da se kombinuje sa primenom drugih supstanci kao što su citostatički lekovi, inhibitori faktora rasta, blokatori ćelijskog ciklusa, inhibitori angiogeneze ili druga antitela, kako bi se odredila sinergistička efikasnost i potencijalna toksičnost kombinacija.

[0206] Za analiziranje toksičnih sporednih efekata posredovanih antitelima prema navodima, životinje mogu da se inokulišu antitelima ili kontrolnim reagensima i detaljno ispitaju u pogledu simptoma koji su možda povezani sa terapijom antitelima na CLD18. Mogući sporedni efekti in vivo primene antitela na CLD18 posebno uključuju toksičnost na tkiva koja eksprimiraju CLD18, uključujući želudac i pluća. Antitela koja prepoznaju CLD18 kod ljudi i drugih vrsta, npr. miševa, posebno su korisna za predviđanje potencijalnih sporednih efekata posredovanih primenom monoklonskih antitela na CLD18 kod ljudi.

Mapiranje epitopa

[0207] Mapiranje epitopa prepoznatih antitelima prema navodima može da se obavi kako je opisano detaljno u "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology)", Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 i u "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.

I. Bispecifični/multispecifični molekuli koji se vezuju za CLD18

[0208] U još jednom primeru izvođenja prema navodima, antitela na CLD18 mogu da se derivatizuju ili povežu sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom (npr., Fab’ fragmentom) da se stvori bispecifični ili multispecifični molekul koji se vezuje za više vezujućih mesta ili ciljnih epitopa. Na primer, antitelo prema navodima može da se funkcionalno poveže (npr. hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili na drugi način) sa jednim ili više drugih vezujućih molekula, kao što su drugo antitelo, peptid ili vezujući mimetik.

[0209] Prema tome, predmetni navodi uključuju bispecifične i multispecifične molekule koji sadrže najmanje jednu prvu vezujuću specifičnost za CLD18 i drugu vezujuću specifičnost za drugi ciljni epitop. U posebnom primeru izvođenja navoda, drugi ciljni epitop je Fc receptor, npr. humani Fc-gamaRI (CD64) ili humani Fc-alfa receptor (CD89), ili T-ćelijski receptor, npr. CD3. Prema tome, navodi uključuju bispecifične i multispecifične molekule sposobne da se vežu i za efektorske ćelije koje eksprimiraju Fc-gamaR, Fc-alfaR ili Fc-epsilonR (npr. monociti, makrofagne polimorfonuklearne ćelije (PMN)) i za ciljne ćelije koje eksprimiraju CLD18. Ovi bispecifični i multispecifični molekuli mogu da efektorskim ćelijama prikazuju ćelije koje eksprimiraju CLD18 kao ciljne, i mogu da pokrenu aktivnosti efektorskih ćelija koje su posredovane Fc receptorom, kao što su fagocitoza CLD18-eksprimirajućih ćelija, ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), oslobađanje citokina ili stvaranje superoksid anjona.

[0210] Pored anti-Fc vezujuće specifičnosti i anti-CLD18 vezujuće specifičnosti, bispecifični i multispecifični molekuli prema navodima mogu da uključuju i treću vezujuću specifičnost. U jednom primeru izvođenja, treća vezujuća specifičnost je anti-pojačavajući faktor-deo (EF), npr. molekul koji se vezuje za površinski protein uključen u citotoksičnu aktivnost i time povećava imuni odgovor protiv ciljne ćelije. "Anti-pojačavajući faktor-deo" može da bude antitelo, funkcionalni fragment antitela ili ligand koji se vezuje za dati molekul, npr., antigen ili receptor i tako dovodi do pojačanja efekta vezujućih determinanti za Fc receptor ili ciljni ćelijski antigen. "Anti-pojačavajući faktor-deo" može da se vezuje za Fc receptor ili ciljni ćelijski antigen. Alternativno, "anti-pojačavajući faktor-deo" može da se veže za entitet različit od entiteta za koji su vezane prva i druga specifičnost. Na primer, "anti-pojačavajući faktor-deo" može da se veže za citotoksičnu T-ćeliju (npr., preko CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ili drugu imunu ćeliju, što za rezultat ima pojačani imuni odgovor protiv ciljne ćelije).

[0211] U jednom primeru izvođenja, bispecifični i multispecifični molekuli prema navodima sadrže, kao vezujuću specifičnost, najmanje jedno antitelo, uključujući, npr., Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, ili jednolančani Fv. Antitelo može da bude i lakolančani ili teškolančani dimer, ili bilo koji minimalni fragment istog, kao što je Fv ili jednolančani konstrukt, kako je opisano u Ladner et al., US 4,946,778. Antitelo takođe može da bude vezujući domen-imunoglobulinski fuzioni protein, kako je objavljeno u US2003/0118592 i US 2003/0133939.

[0212] U jednom primeru izvođenja, bispecifični i multispecifični molekuli prema navodima sadrže vezujuću specifičnost za Fc-gamaR ili Fc-alfaR prisutan na površini efektorske ćelije i dugu vezujuću specifičnost za antigen ciljne ćelije, npr., CLD18.

[0213] U jednom primeru izvođenja, vezujuća specifičnost za Fc receptor obezbeđena je monoklonskim antitelom čije vezivanje se ne blokira humanim imunoglobulinom G (IgG). Kako se koristi u ovom tekstu, termin "IgG receptor" odnosi se na bilo koji od osam gena za gamalanac, lociranih na hromozomu 1. Ovi geni uključuju ukupno dvanaest transmembranskih ili

1

solubilnih receptorskih izoformi koje su grupisane u tri Fc-gama receptorske klase: Fc-gamaRI (CD64), Fc-gamaRII (CD32) i Fc-gamaRIII (CD 16). U jednom poželjnom primeru izvođenja, Fc-gama receptor je humani visokoafinitetni Fc-gamaRI.

[0214] Proizvodnja i karakterizacija ovih poželjnih monoklonskih antitela opisane su u Fanger et al. WO 88/00052 i u US 4,954,617. Ova antitela vezuju se za epitop Fc-gamaRI, Fc-gamaRII ili Fc-gamaRIII na mestu koje je različito od Fcγ vezujućeg mesta receptora i tako, njihovo vezivanje nije suštinski blokirano fiziološkim nivoima IgG. Specifična anti-Fc-gamaRI antitela korisna u ovim navodima su mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 i mAb 197. U drugim primerima izvođenja, anti-Fcγ receptorsko antitelo je humanizovani oblik monoklonskog antitela 22 (H22). Proizvodnja i karakterizacija H22 antitela opisane su u Graziano, R. F. et al. (1995) J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 i WO 94/10332. Ćelijska linija koja proizvodi H22 antitelo deponovana je u Američkoj kolekciji tipova kultura, 4. novembra 1992., pod oznakom HA022CL1 i ima pristupni br. CRL 11177.

[0215] U drugim poželjnim primerima izvođenja, vezujuća specifičnost za Fc receptor obezbeđena je antitelom koje se vezuje za humani IgA receptor, npr., Fc-alfa receptor (FcalphaRI (CD89)), čije vezivanje, poželjno, nije blokirano humanim imunoglobulinom A (IgA). Termin "IgA receptor" treba da uključi genski proizvod jednog alfa-gena (Fc-alfaRI) lociranog na hromozomu 19. Poznato je da ovaj gen kodira nekoliko alternativno splajsovanih transmembranskih izoformi od 55 do 110 kDa. Fc-alfaRI (CD89) konstitutivno se eksprimira na monocitima/makrofagima, eozinofilnim i neutrofilnim granulocitima, ali ne na neefektorskim populacijama ćelija. Fc-alfaRI ima srednji afinitet za IgA1 i IgA2, koji se povećava posle izlaganja citokinima kao što su G-CSF ili GM-CSF (Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). Četiri Fc-alfaRI-specifična monoklonska antitela, identifikovana kao A3, A59, A62 i A77, koja se vezuju za Fc-alfaRI izvan IgA ligand-vezujućeg domena, opisana su ranije (Monteiro, R. C. et al. (1992) J. Immunol.148: 1764).

[0216] Fc-alfaRI i Fc-gamaRI poželjni su receptori okidači za upotrebu u navodima zbog toga što (1) eksprimiraju se primarno na imunim efektorskim ćelijama, npr., monocitima, PMN, makrofagima i dendritskim ćelijama; (2) eksprimiraju se na visokim nivoima (npr., 5000-100000 po ćeliji); (3) medijatori su citotoksičnih aktivnosti (npr., ADCC, fagocitoza); (4) posreduju u pojačanoj prezentaciji antigena, uključujući sopstvene antigene, koji su im ciljevi.

[0217] U drugom primeru izvođenja, bispecifični molekul se sastoji od dva monoklonska antitela prema navodima koja imaju komplementarne funkcionalne aktivnosti, npr. jedno antitelo pretežno funkcioniše tako što indukuje CDC, a drugo antitelo pretežno funkcioniše tako što indukuje apoptozu.

2

[0218] "Antitelo specifično za efektorsku ćeliju", kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo ili funkcionalni fragment antitela koji se vezuju za Fc receptor na efektorskim ćelijama. Poželjna antitela za upotrebu u predmetnim navodima vezuju se za Fc receptor efektorske ćelije na mestu koje nije zauzeto endogenim imunoglobulinom.

[0219] Kako se ovde koristi, termin "efektorska ćelija" odnosi se na imunu ćeliju koja je uključena u efektorsku fazu imunog odgovora, nasuprot kognitivnoj fazi i fazi aktivacije imunog odgovora. Primeri imunih ćelija obuhvataju ćelije mijeloidnog ili limfoidnog porekla, npr., limfocite (npr., B-ćelije i T-ćelije, uključujući citolitičke T-ćelije (CTL), ćelije ubice, ćelije prirodne ubice, makrofage, monocite, eozinofile, neutrofile, polimorfonuklearne ćelije, granulocite, mastocite i bazofile. Neke efektorske ćelije eksprimiraju specifične Fc receptore i obavljaju specifične imune funkcije. U poželjnim primerima izvođenja, efektorska ćelija je sposobna da indukuje ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), npr., neutrofil je sposoban da indukuje ADCC. Na primer, monociti, makrofagi koji eksprimiraju FcR uključeni su u specifično ubijanje ciljnih ćelija i prezentaciju antigena drugim komponentama imunog sistema, ili vezivanje za ćelije koje prezentuju antigene. U drugim primerima izvođenja, efektorska ćelija može da fagocituje ciljni antigen, ciljnu ćeliju ili mikroorganizam. Ekspresija određenog FcR na efektorskoj ćeliji može da se reguliše humoralnim faktorima kao što su citokini. Na primer, nađeno je da je ekspresija Fc-gamaRI pozitivno regulisana interferonom gama (IFN-γ). Ova pojačana ekspresija povećava citotoksičnu aktivnost ćelija koje nose FcgamaRI, prema ciljevima. Efektorska ćelija može da fagocitira ili lizira ciljni antigen ili ciljnu ćeliju.

[0220] "Ciljna ćelija" označiće ćeliju nepoželjnu za subjekta (npr., čoveka ili životinju), koja je ciljna za antitelo prema navodima. U poželjnim primerima izvođenja, ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira ili u preterano eksprimira CLD18. Ćelije koje eksprimiraju CLD18, tipično, uključuju tumorske ćelije.

[0221] Bispecifični i multispecifični molekuli prema predmetnim navodima mogu da se naprave korišćenjem hemijskih tehnika (vid npr., D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807), tehnika "polidoma" (vidi, US 4,474,893, Reading), ili tehnika rekombinantne DNK.

[0222] Posebno, bispecifični i multispecifični molekuli prema predmetnim navodima mogu da se pripreme konjugovanjem konstituentnih vezujućih specifičnosti, npr., anti-FcR i anti-CLD18 vezujućih specifičnosti, korišćenjem postupaka poznatih u struci. Na primer, svaka vezujuća specifičnost bispecifičnog i multispecifičnog molekula može da se generiše zasebno i da se one zatim konjuguju jedna sa drugom. Kada su vezujuće specifičnosti proteini ili peptidi, za kovalentnu konjugaciju mogu da se koriste različita sredstva za kuplovanje ili unakrsno povezivanje. Primeri sredstava za unakrsno povezivanje uključuju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetil-tioacetat (SATA), 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoevu kiselinu) (DTNB), ofenilendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP) i sulfosukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (sulfo-SMCC) (vidi npr., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648). Drugi postupci uključuju one opisane u Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No.

78,118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229: 81-83) i Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Poželjna sredstva za konjugovanje su SATA i sulfo-SMCC, oba se mogu nabaviti kod Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[0223] Kada su vezujuće specifičnosti antitela, mogu se konjugovati putem sulfhidrilnog povezivanja C-kraja zglobnih regiona dva teška lanca. U posebno poželjnom primeru izvođenja, zglobni region je pre konjugacije modifikovan tako da sadrži neparan broj sulfhidrilnih grupa, poželjno jednu.

[0224] Alternativno, obe vezujuće specifičnosti mogu da budu kodirane u istom vektoru i da se eksprimiraju i sklapaju u istoj ćeliji-domaćinu. Ovaj postupak je posebno koristan kada je bispecifični i multispecifični molekul mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab’)2ili ligand x Fab fuzioni protein. Bispecifični i multispecifični molekul prema navodima, npr., bispecifični molekul, može da bude jednolančani molekul, npr. jednolančano bispecifično antitelo, jednolančani bispecifični molekul koji sadrži jedno jednolančano antitelo i vezujuću determinantu ili jednolančani bispecifični molekul koji sadrži dve vezujuće determinante. Bispecifični i multispecifični molekuli mogu da budu i jednolančani molekuli ili mogu da sadrže najmanje dva jednolančana molekula. Postupci za pripremanje bi- i multispecifičnih molekula opisani su na primer u US 5,260,203; US 5,455,030; US 4,881,175; US 5,132,405; US 5,091,513; US 5,476,786; US 5,013,653; US 5,258,498; i US 5,482,858.

[0225] Vezivanje bispecifičnih ili multispecifičnih molekula za njihove specifične ciljeve može da se potvrdi imunoenzimskim testom (ELISA), radioimunoesejom (RIA), FACS analizom, biološkim testom (npr., inhibicija rasta), ili Western Blot testom. Svaki od ovih testova uopšteno, detektuje prisustvo kompleksa protein-antitelo od posebnog interesa, korišćenjem obeleženog reagensa (npr., antitelo) specifičnog za kompleks od interesa. Na primer, kompleksi FcR-antitelo mogu da se detektuju korišćenjem npr., antitela vezanog za enzim ili fragmenta antitela koji prepoznaju i specifično se vezuju za komplekse FcR-antitelo. Alternativno, kompleksi mogu da se detektuju korišćenjem bilo kojeg od većeg broja drugih imunotestova. Na primer, antitelo može da se radioaktivno obeleži i upotrebi u radioimunoeseju (RIA) (vidi, na primer, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay

4

Techniques, The Endocrine Society, March, 1986). Radioaktivni izotop može da se detektuje na načine kao što su upotreba γ-brojača ili scincilacionog brojača, ili autoradiografijom.

II. Imunokonjugati

[0226] U drugom aspektu, predmetni navodi opisuju anti-CLD18 antitelo konjugovano sa terapijskom komponentom ili sredstvom, npr. citotoksinom, lekom (npr., imunosupresor) ili radioizotopom. Takvi konjugati ovde su označeni kao "imunokonjugati". Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više citotoksina označavaju se kao "imunotoksini". Citotoksin ili citotoksično sredstvo uključuje svako sredstvo koje je štetno i, naročito, koje ubija ćelije. Primeri uključuju taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum-bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksiantracin-dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i njihove analoge i homologe.

[0227] Pogodna terapijska sredstva za formiranje imunokonjugata prema navodima uključuju, ali se ne ograničavaju na antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, fludarabin, 5-fluorouracil-dekarbazin), alkilirajuća sredstva (npr., mehloretamin, tioepahlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C i cis-dihlorodiamin-platina (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr., daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr., daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin i antramicin (AMC)) i anti-mitotička sredstva (npr., vinkristin i vinblastin). U poželjnom primeru izvođenja, terapijsko sredstvo je citotoksično sredstvo ili radiotoksično sredstvo. U drugom primeru izvođenja, terapijsko sredstvo je imunosupresor. U još jednom primeru izvođenja, terapijsko sredstvo je GM-CSF. U poželjnom primeru izvođenja, terapijsko sredstvo je doksorubicin, cisplatin, bleomicin sulfat, karmustin, hlorambucil, ciklofosfamid ili ricin A.

[0228] Antitela prema predmetnim navodima mogu da se konjuguju i sa radioizotopom, npr., jod-131, itrijum-90 ili indijum-111, da bi se stvorila citotoksična radiofarmaceutska sredstva za lečenje poremećaja vezanih sa CLD18, kao što je kancer. Konjugati antitela prema navodima mogu da se koriste za modifikovanje datog biološkog odgovora, a lekovita komponenta ne treba da se shvati kao ograničenje klasičnih hemijskih terapijskih sredstava. Na primer, lekovita komponenta može da bude protein ili peptid sa željenom biološkom aktivnošću. Takvi proteini mogu uključivati, na primer, enzimski aktivni toksin, ili njegov aktivni fragment, npr. abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa ili toksin difterije; protein kao faktor nekroze tumora ili interferonγ; ili modifikatore biološkog odgovora kao što su, na primer, limfokini, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), faktor stimulacije kolonija granulocita i makrofaga ("GM-CSF"), faktor stimulacije kolonija granulocita ("G-CSF"), ili drugi faktori rasta.

[0229] Tehnike konjugovanja takvih terapijskih komponenti sa antitelima, dobro su poznate, vidi, npr., Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", u Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp.475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) i Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).

[0230] U još jednom primeru izvođenja, antitela prema navodima prikačena su za linker-helator, npr., tiuksetan, što omogućava da se antitelo konjuguje sa radioizotopom.

III. Farmaceutske kompozicije

[0231] U drugom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju kompoziciju, npr., farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedno ili kombinaciju antitela prema predmetnim navodima. Farmaceutske kompozicije mogu da se formulišu sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima, kao i sa bilo kojim drugim poznatim adjuvansima i ekscipijentima, u skladu sa konvencionalnim tehnikama kao što su one objavljene u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. U jednom primeru izvođenja, kompozicije uključuju kombinaciju više (npr., dva ili više) izolovanih antitela prema navodima koja deluju različitim mehanizmima, npr., jedno antitelo koje pretežno deluje indukovanjem CDC, u kombinaciji sa drugim antitelom koje deluje indukovanjem apoptoze.

[0232] Farmaceutske kompozicije prema navodima mogu da se primene i u kombinovanoj terapiji, tj., kombinovane sa drugim sredstvima. Na primer, kombinovana terapija može da uključi kompoziciju prema predmetnim navodima sa najmanje jednim antiinflamatornim sredstvom ili najmanje jednim imunosupresivnim sredstvom. U jednom primeru izvođenja, takva terapijska sredstva uključuju jedno ili više antitinflamatornih sredstava kao što su steroidni lekovi ili NSAID (nesteroidni antiinflamatorni lek). Poželjna sredstva uključuju, na primer, aspirin i druge salicilate, Cox-2 inhibitore, kao rofekoksib (Vioxx) i celekoksib (Celebrex), NSAID kao ibuprofen (Motrin, Advil), fenoprofen (Nalfon), naproksen (Naprosyn), sulindak (Clinoril), diklofenak (Voltaren), piroksikam (Feldene), ketoprofen (Orudis), diflunizal (Dolobid), nabumeton (Relafen), etodolak (Lodine), oksaprozin (Daypro) i indometacin (Indocin).

[0233] U drugom primeru izvođenja, terapijska sredstva uključuju sredstva koja dovode do slabljenja ili funkcionalne inaktivacije regulatornih T-ćelija kao što su niske doze ciklofosfamida, anti-CTLA4 antitela, anti-IL2 ili anti-IL2-receptorska antitela.

[0234] U još jednom primeru izvođenja, takva terapijska sredstva uključuju jedan ili više hemoterapeutika kao što su derivati Taxol-a, taksoter, gemcitabin, 5-fluorouracil, doksorubicin (Adriamycin), cisplatin (Platinol), ciklofosfamid (Cytoxan, Procytox, Neosar). U drugom primeru izvođenja, antitela prema predmetnim navodima mogu da se primene u kombinaciji sa hemoterapeutskim sredstvima koja poželjno pokazuju terapijsku efikasnost kod pacijenata koji pate od kancera želuca, jednjaka, pankreasa i pluća.

[0235] U još jednom primeru izvođenja, antitela prema navodima mogu da se primene zajedno sa radioterapijom i/ili autologom transplantacijom perifernih matičnih ćelija ili transplantacijom koštane srži.

[0236] U još jednom primeru izvođenja, antitela prema navodima mogu da se primene u kombinaciji sa jednim ili više antitela koja se biraju između anti-CD25 antitela, anti-EPCAM antitela, anti-EGFR, anti-Her2/neu i anti-CD40 antitela.

[0237] U još jednom primeru izvođenja, antitela prema navodima mogu da se primene u kombinaciji sa anti-C3b (i) antitelom sa ciljem pojačanja aktivacije komplementa.

[0238] Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljivi nosač" uključuje bilo koji i sve, rastvarače, disperzione medijume, sredstva za prekrivanje, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije, i slično, koja su fiziološki kompatibilna. Poželjno, nosač je pogodan za intravensku, intramuskularnu, subkutanu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr., injektiranjem ili infuzijom). U zavisnosti od puta primene, aktivno jedinjenje, tj., antitelo, bispecifični i multispecifični molekul može da se obloži materijalom da bi se jedinjenje zaštitilo od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu da inaktiviraju jedinjenje.

[0239] "Farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na so koja čuva željenu biološku aktivnost predmetnog jedinjenja i ne doprinosi neželjenim toksičnim efektima (videti npr., Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci.66: 1-19).

[0240] Primeri takvih soli uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuju one koje su izvedene iz netoksičnih neorganskih kiselina kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforasta i slično, kao i iz netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil-supstituisane alkanske kiseline, hidroksi-alkanske kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline i slično. Bazne adicione soli uključuju one koje su izvedene iz zemno-alkalnih metala kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, kao i iz netoksičnih organskih amina kao što su N,N’-dibenziletilen-diamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i slično.

[0241] Kompozicija prema predmetnim navodima može da se primeni različitim postupcima koji su poznati u struci. Kao što će obučeni stručnjak razumeti, put i/ili način primene variraće u zavisnosti od željenih rezultata. Aktivna jedinjenja mogu da se pripreme sa nosačima koji će zaštiti jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što su formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i mikroinkapsulirane sisteme za dostavu. Mogu da se koriste biodegradabilni, biokompatibilni polimeri, kao na primer, etilen-vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina. Postupci za pripremanje takvih formulacija uglavnom su poznati stručnjacima u oblasti. Vidi, npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0242] Da bi se jedinjenje prema navodima primenilo određenim putevima primene, može biti neophodno da se jedinjenje obloži ili primeni zajedno sa materijalom koji sprečava njegovu aktivaciju. Na primer, jedinjenje može da se na subjektu primeni u odgovarajućem nosaču, na primer lipozomima, ili razblaživaču. Farmaceutski prihvatljivi razblaživači uključuju slani rastvor i vodene puferske rastvore. Lipozomi uključuju "voda-u-ulju-u-vodi" CGF emulzije kao i konvencionalne lipozome (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).

[0243] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za primenu ex tempore sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance poznata je u struci. Ako su konvencionalni medijum ili sredstvo kompatibilni sa aktivnim jedinjenjem, njihova upotreba u farmaceutskim kompozicijama prema navodima ima se u vidu. Dodatna aktivna jedinjenja takođe mogu da se inkorporišu u kompozicije.

[0244] Terapijske kompozicije tipično moraju biti sterilne i stabilne pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može da se formuliše kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoko koncentrisanje leka. Nosač može da bude rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilenglikol i tečni polietilen-glikol, i slično) i njihove pogodne mešavine. Dobra fluidnost može da se održi na primer, korišćenjem sredstva za oblaganje kao što je lecitin, održavanjem željene veličine čestica u slučaju disperzije i korišćenjem surfaktanata. U mnogim slučajevima biće poželjno u kompoziciju uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere, polialkohole, npr. manitol, sorbitol, ili natrijum-hlorid. Produženo apsorbovanje injektabilnih kompozicija može da se postigne ako se u kompoziciju uključi sredstvo koje odlaže apsorpciju, na primer, monostearatnih soli i želatin.

[0245] Sterilni injektabilni rastvori mogu da se pripreme tako što se potrebna količina aktivnog jedinjenja inkorporiše u odgovarajući rastvarač, uz jedan ili kombinaciju gore navedenih sastojaka, kako je potrebno, što je praćeno sterilizacionom mikrofiltracijom.

[0246] Obično, disperzije se pripremaju inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u sterilni prenosnik koji sadrži bazni disperzioni medijum i druge potrebne sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremanje sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni postupci pripreme su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija), koji daju prah aktivnog sastojka plus neki dodatni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora istog.

[0247] Dozni režimi podešavaju se tako da obezbede optimalni željeni odgovor (npr., terapijski odgovor). Na primer, može da se primeni jedan bolus, može da se primeni nekoliko podeljenih doza tokom vremena ili doza može proporcionalno da se smanjuje ili povećava, prema zahtevima terapijske situacije. Posebna je prednost formulisati parenteralne kompozicije u doznoj jediničnoj formi za laku primenu i ujednačenost doziranja. Dozna jedinična forma, kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na fizički zasebne jedinice pripremljene u vidu pojedinačnih doza za subjekta koji treba da se leči; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja, izračunatu tako da se postigne željeni terapijski efekat, udruženu sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija doznih jediničnih formi prema navodima diktirana je i direktno zavisi od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapijskog efekta koji treba da se postigne i (b) ograničenja, svojstvenih struci spravljanja takvog aktivnog jedinjenja za lečenje, osetljivosti pojedinaca.

[0248] Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanata uključuju: (1) antioksidante rastvorljive u vodi kao što su askorbinska kiselina, cistein-hidrohlorid, natrijum-bisulfat, natrijummetabisulfit, natrijum-sulfit i slično; (2) antioksidante rastvorljive u ulju kao što su askorbilpalmitat, butilisani hidroksianizol (BHA), butilisani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil-galat, alfa-tokoferol i slično; i (3) metal-helirajuća sredstva kao što su limunska kiselina, etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slično.

[0249] Za terapijske kompozicije, formulacije prema predmetnim navodima uključuju one koje su pogodne za oralnu, nazalnu, površinsku (uključujući bukalnu i sublingvalnu), rektalnu, vaginalnu i/ili parenteralnu primenu. Formulacije mogu konvencionalno biti prisutne u jediničnoj doznoj formi i mogu biti pripremljene nekim od postupaka poznatih u farmaceutskoj struci. Količina aktivnog sastojka koja se kombinuje sa nosačkim materijalom da se proizvede jedna dozna forma, variraće u zavisnosti od subjekta koji se leči i određenog načina primene. Količina aktivnog sastojka koji će se kombinovati sa nosačkim materijalom da bi se proizvela jedna dozna forma, obično će biti ona količina kompozicije koja proizvodi terapijski efekat.

[0250] Uopšteno, od sto procenata, ova količina biće u opsegu od oko 0.01 procenta do oko devedeset devet procenata aktivnog sastojka, poželjno od oko 0.1 procenta do oko 70 procenata, najpoželjnije od oko 1 procenta do oko 30 procenata.

[0251] Formulacije prema predmetnim navodima pogodne za vaginalnu primenu uključuju takođe pesare, tampone, kremove, gelove, paste, pene ili formulacije u spreju koje sadrže nosače koji su u struci poznati kao pogodni. Dozne forme za površinsku ili transdermalnu primenu kompozicija prema ovim navodima uključuju praškove, sprej, masti, paste, kremove, losione, gelove, rastvore, flastere i inhalante. Aktivno jedinjenje može da se, pod sterilnim uslovima, pomeša sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i sa nekim prezervansom, puferom ili propelantima koji mogu biti potrebni.

[0252] Fraze "parenteralna primena" i "primenjen parenteralno", kako se ovde koriste, označavaju način primene različit od crevne i površinske primene, obično injekcijom, i koji uključuje, bez ograničavanja, intravensku, intramuskularnu, intrarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.

[0253] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji mogu da se upotrebe u farmaceutskim kompozicijama prema navodima uključuju vodu, etanol, poliole (npr. glicerol, propilen-glikol, polietilen-glikol i slično) i njihove pogodne mešavine, biljna ulja, npr. maslinovo ulje i injektabilne organske estre kao etil-oleat. Dobra fluidnost može da se održava na primer, upotrebom materijala za oblaganje kao što je lecitin, održavanjem željene veličine čestica u slučaju disperzija i korišćenjem surfaktanata.

[0254] Ove kompozicije mogu da sadrže i adjuvanse kao što su prezervansi, sredstva za vlaženje, emulgujuća sredstva i dispergujuća sredstva. Prevencija prisustva mikroorganizama može da se osigura postupcima sterilizacije i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstava kao što su na primer, paraben, hlorobutanol, fenol-sorbinska kiselina i slično. Isto tako, može biti poželjno da se u kompozicije uključe izotonična sredstva kao što su šećeri, natrijumhlorid i slično. Pored toga, produžena apsorpcija injektabilne farmaceutske forme može da se postigne uključivanjem sredstava koja odlažu apsorpciju, kao što su aluminijum-monostearat i želatin.

[0255] U jednom primeru izvođenja, monoklonska antitela prema navodima primenjuju se u kristalnom vidu, subkutanom injekcijom, videti Yang et al. (2003) PNAS, 100 (12): 6934-6939. Kada se jedinjenja prema predmetnim navodima primenjuju kao farmaceutici, kod ljudi i životinja, mogu se davati sami ili u vidu farmaceutske kompozicije koja sadrži, na primer, 0.01 do 99.5% (poželjnije, 0.1 do 90%) aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0256] Bez obzira na odabrani put primene, jedinjenja prema predmetnim navodima koja mogu da se koriste u pogodnoj hidratisanoj formi, i/ili farmaceutske kompozicije prema predmetnim navodima formulišu se u farmaceutski prihvatljive dozne forme konvencionalnim postupcima poznatim stručnjacima u oblasti.

[0257] Aktuelni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama prema predmetnim navodima mogu da variraju tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapijskog odgovora kod određenog pacijenta, kompoziciju i način primene, bez toksičnosti po pacijenta. Odabrani dozni nivo zavisiće od različitih farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost određenih kompozicija prema predmetnim navodima koje su upotrebljene, puta primene, vremena primene, stope ekskrecije određenog upotrebljenog jedinjenja, starosti, pola, težine, opšteg zdravstvenog stanja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči i sličnih faktora koji su dobro poznati u medicinskoj struci.

[0258] Uobičajeno obučen lekar ili veterinar, lako će odrediti i prepisati potrebnu efikasnu količinu farmaceutske kompozicije. Na primer, lekar ili veterinar može da počne sa dozama jedinjenja prema navodima upotrebljenim u farmaceutskoj kompoziciji u nivou koji je niži od potrebnog za postizanje željenog terapijskog efekta, a zatim da postepeno povećava dozu dok se ne dostigne željeni efekat. Uopšteno, pogodna dnevna doza kompozicije prema navodima biće ona količina jedinjenja koja je najniža, a proizvodi terapijski efekat. Ta efikasna doza će uglavnom zavisiti od faktora koji su opisani gore. Poželjno je da primena bude intravenska, intramuskularna, intraperitonealna ili subkutana, poželjno proksimalno od ciljnog mesta. Po želji, efikasna dnevna doza terapijske kompozicije može da se primeni u vidu dve, tri, četiri, pet, šest ili više manjih doza primenjenih zasebno u odgovarajućim intervalima tokom dana, opciono u jediničnim doznim formama. Iako je moguće da se jedinjenja prema predmetnim navodima primenjuju sama, poželjno je primenjivati ih u vidu farmaceutske formulacije (kompozicije).

1

[0259] U jednom primeru izvođenja, antitela prema navodima mogu da se primene infuzijom, poželjno sporom infuzijom tokom dugog perioda, npr. dužeg od 24 sata, da bi se smanjili sporedni toksični efekti. Primena može takođe da se obavi kontinuiranom infuzijom tokom 2 do 24 sata, npr. od 2 do 12 sati. Takav režim može da se ponovi jednom ili više puta ako je potrebno, na primer, posle 6 meseci ili 12 meseci. Doza može da se odredi ili podesi merenjem količine cirkulišućeg monoklonskog anti-CLD18 antitela u biološkom uzorku, posle primene, korišćenjem antiidiotipskih antitela koja ciljaju anti-CLD18 antitela.

[0260] U još jednom primeru izvođenja, antitela se primenjuju terapijom održavanja, npr., jednom nedeljno, tokom perioda od 6 meseci ili dužeg.

[0261] U još jednom primeru izvođenja, antitela prema navodima mogu da se primene po režimu koji uključuje jednu infuziju antitela protiv CLD18, praćenu infuzijom antitela na CLD18 konjugovanog sa radioizotopom. Režim može da se ponovi npr., 7 do 9 dana kasnije.

[0262] Terapijske kompozicije mogu da se primene medicinskim uređajima koji su poznati u struci. Na primer, u poželjnom primeru izvođenja, terapijska kompozicija prema navodima može da se primeni pomoću hipodermalnog uređaja bez igle, kao što je uređaj objavljen u US 5,399,163; US 5,383,851; US 5,312,335; US 5,064,413; US 4,941,880; US 4,790,824; ili US 4,596,556. Primeri dobro poznatih implantata i modula korisnih u predmetnim navodima uključuju one opisane u: US 4,487,603, koji objavljuje implantabilnu mikroinfuzionu pumpu za oslobađanje leka kontrolisanom brzinom; US 4,486,194 koji objavljuje terapijski uređaj za primenu lekova kroz kožu; US 4,447,233 koji objavljuje infuzionu pumpu za dostavljanje leka sa preciznom brzinom infuzije; US 4,447,224 koji objavljuje implantabilne infuzione aparate sa varijabilnim protokom za kontinuiranu dostavu leka; US 4,439,196 koji objavljuje osmotski sistem za dostavu leka koji ima više odeljaka; i US 4,475,196 koji objavljuje sistem za osmotsku dostavu leka.

[0263] Mnogi drugi ovakvi implantati, dostavni sistemi i moduli, poznati su stručnjacima u oblasti. U nekim formama, antitela prema navodima mogu da se formulišu da se osigura ispravna distribucija in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (BBB) zadržava mnoga visokohidrofilna jedinjenja. Da bi se osiguralo da terapijska jedinjenja prema navodima prođu BBB (ako se to želi), ona mogu da se formulišu na primer, u lipozome. Za postupke izrade lipozoma vidi, npr., US 4,522,811; US 5,374,548; i US 5,399,331. Lipozomi mogu sadržati jednu ili više komponenti koje se selektivno transportuju u specifične ćelije ili organe i tako pojačavaju ciljanu dostavu leka (vidi, npr., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Primeri komponenti za ciljanu dostavu uključuju folat ili biotin (vidi US 5,416,016 za Low et al.); manozide (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); antitela (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS

2

Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); i receptor za surfaktantni protein A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134).

[0264] U jednom primeru izvođenja navoda, terapijska jedinjenja prema navodima formulišu se u lipozome. U poželjnijem primeru izvođenja, lipozomi uključuju ciljno delujuću komponentu. U najpoželjnijem primeru izvođenja, terapijska jedinjenja u lipozomima dostavljaju se bolusnom injekcijom, na mestu proksimalno od željenog područja, npr., mesta tumora. Kompozicija mora da bude fluidna u meri koja obezbeđuje lako uvlačenje u špric. Ona mora biti stabilna u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora se čuvati od kontaminirajućeg delovanja mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice.

[0265] U sledećem primeru izvođenja, antitela prema navodima mogu da se formulišu tako da se spreči ili smanji njihov transport kroz placentu. Ovo može da se uradi postupcima poznatim u struci, npr., PEGilacijom antitela ili korišćenjem F(ab)2’ fragmenata. Za dalja uputstva videti "Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: 177-190; i "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol.74: 279-283.

[0266] "Terapijski efikasna doza" za lečenje tumora može da se meri objektivnim odgovorom tumora, koji može da bude kompletan ili delimičan. Kompletan odgovor (CR) definiše se kao odsustvo kliničkih, radioloških ili drugih dokaza o bolesti. Delimični odgovor (PR) rezultat je redukcije ukupne veličine tumora veće od 50%. Srednje vreme do progresije, mera je koja karakteriše dužinu objektivnog odgovora tumora.

[0267] "Terapijski efikasna doza" za lečenje tumora može da se meri i sposobnošću da se stabilizuje napredovanje bolesti. Sposobnost jedinjenja da inhibira kancer može da se proceni u životinjskom model-sistemu koji je prediktivan u pogledu efikasnosti u humanim tumorima. Alternativno, osobina kompozicije može da se proceni ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira rast ćelija ili apoptozu, uz pomoć in vitro testova koji su poznati iskusnom stručnjaku. Terapijski efikasna količina terapijskog jedinjenja može da smanji veličinu tumora ili da na drugi način ublaži simptome kod subjekta. Uobičajeno obučeni stručnjak u oblasti moći će da odredi tu količinu na osnovu faktora kao što su veličina subjekta, jačina simptoma kod subjekta i određena odabrana kompozicija ili put primene.

[0268] Kompozicija mora biti sterilna i fluidna u meri da može da se dostavi pomoću šprica. Pored vode, nosač može da bude izotonični puferisani slani rastvor, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen-glikol i tečni polietilen-glikol, i slično) i pogodne mešavine istih. Dobra fluidnost može da se održi, na primer, korišćenjem sredstava za oblaganje kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i korišćenjem surfaktanata. U mnogim slučajevima poželjno je u kompoziciju uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere, polialkohole, npr. manitol ili sorbitol i natrijum-hlorid. Produženo apsorbovanje injektabilnih kompozicija može da se ostvari ako se u kompoziciju uključi sredstvo koje odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum-monostearata ili želatina.

[0269] Kada je aktivno jedinjenje na odgovarajući način zaštićeno, kako je gore opisano, jedinjenje može da se primeni oralno, na primer sa inertnim razblaživačem ili asimilabilnim jestivim nosačem.

IV. Upotrebe i postupci prema navodima

[0270] Antitela (uključujući imunokonjugate, bispecifična/multispecifična antitela, kompozicije i druge ovde opisane derivate) prema predmetnim navodima imaju brojne terapijske upotrebe koje obuhvataju lečenje poremećaja vezanih za ćelije koje eksprimiraju CLD18. Na primer, antitela mogu da se primene na ćelije u kulturi, npr., in vitro ili ex vivo, ili na humane subjekte, npr., in vivo, da bi se lečili ili prevenirali različiti poremećaji, npr. oni koji su opisani u ovom tekstu. Kako se ovde koristi, termin "subjekt" treba da obuhvati čoveka i nehumane životinje koji odgovaraju na antitela protiv CLD18. Poželjni subjekti uključuju humane pacijente koji imaju poremećaje koji mogu da se koriguju ili ublaže ubijanjem obolelih ćelija, preciznije, ćelija koje se odlikuju izmenjenim obrascem ekspresije CLD18 u poređenju sa normalnim ćelijama.

[0271] Terapijski efekat u lečenjima o kojima je ovde reč, postiže se, poželjno, preko funkcionalnih osobina antitela prema navodima da posreduju u ubijanju ćelija npr. indukcijom lize posredovane preko citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC), lize posredovane preko ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), apoptoze, homotipske adhezije i/ili fagocitoze, poželjno indukcijom CDC posredovane lize i/ili ADCC posredovane lize.

[0272] Na primer, u jednom primeru izvođenja, antitela prema predmetnim navodima mogu da se koriste za lečenje subjekta koji ima tumorogeni poremećaj, npr., poremećaj koji se karakteriše prisustvom tumorskih ćelija koje eksprimiraju CLD18, uključujući, na primer, kancer želuca. Primeri tumorogenih bolesti koja mogu da se leče i/ili preveniraju obuhvataju sve CLD18-eksprimirajuće kancere i tumorske entitete, uključujući kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća, kancer jajnika, kancer dojke, kolorektalni kancer, kancer jetre, kancer žučne kesice i kancer glave i vrata. Ovi kanceri mogu da budu u ranom, srednjem ili odmaklom stadijumu, npr. u stadijumu metastaza.

[0273] Farmaceutske kompozicije i postupci lečenja, opisani prema navodima, mogu takođe da se koriste za imunizaciju ili vakcinaciju, da bi se prevenirala ovde opisana bolest.

4

[0274] U drugom primeru izvođenja, antitela prema navodima mogu da se koriste za detektovanje nivoa CLD18 ili određenih formi CLD18, ili nivoa ćelija koje sadrže CLD18 na površini svoje membrane, ti nivoi zatim mogu da se povežu sa određenim bolestima ili simptomima bolesti, kao što je opisano gore. Alternativno, antitela mogu da se koriste da iscrpe ili interaguju sa funkcijom CLD18-eksprimirajućih ćelija, ukazujući na ove ćelije kao na važne medijatore bolesti. Ovo može da se postigne dovođenjem u kontakt uzorka ili kontrolnog uzorka sa anti-CLD18 antitelom, pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela i CLD18. Svi kompleksi koji se formiraju između antitela i CLD18 detektuju se i upoređuju u uzorku i kontrolnom uzorku, tj. referentnom uzorku.

[0275] Antitela prema navodima mogu da se inicijalno testiraju in vitro u pogledu svoje vezujuće aktivnosti udružene sa terapijskom ili dijagnostičkom upotrebom. Na primer, antitela mogu da se testiraju korišćenjem testa protočne citometrije, kako je gore opisano.

[0276] Pored toga, može da se testira aktivnost antitela u pokretanju najmanje jedne efektorom posredovane aktivnosti efektorske ćelije, uključujući inhibiranje rasta i/ili ubijanje ćelija koje eksprimiraju CLD18. Na primer, može da se testira sposobnost antitela da pokrenu CDC i/ili apoptozu. Protokoli za testiranje CDC, homotipske adhezije, grupisanja molekula ili apoptoze, opisani su u ovom tekstu.

[0277] Antitela prema navodima mogu da se koriste da in vivo ili in vitro ispolje jednu ili više od sledećih bioloških aktivnosti: da inhibiraju rast i/ili diferencijaciju ćelija koje eksprimiraju CLD18; da ubiju ćelije koje eksprimiraju CLD18; da posreduju u fagocitozi ili ADCC ćelija koje eksprimiraju CLD18, u prisustvu efektorskih ćelija; da posreduju u CDC ćelija koje eksprimiraju CLD18, u prisustvu komplementa; da posreduju u apoptozi ćelija koje eksprimiraju CLD18; da indukuju homotipsku adheziju; i/ili da indukuju translokaciju u lipidne raftove po vezivanju sa CLD18.

[0278] U posebnom primeru izvođenja, antitela mogu da se koriste in vivo ili in vitro za lečenje, prevenciju ili dijagnostikovanje različitih bolesti povezanih sa CLD18. Primeri bolesti povezanih sa CLD18 uključuju, između ostalih, kancere kao što su kancer želuca, kancer pankreasa, kancer jednjaka, kancer pluća i kancere kao što su oni navedeni gore.

[0279] CLD18A2 se eksprimira i u diferenciranim normalnim želudačnim ćelijama. Mogući antitelima indukovani klinički sporedni efekti ubijanja ovih ćelija, mogu da se smanje ili izbegnu paralelnom primenom lekova koji štite želudac, kao što su antacidi ili inhibitori želudačnih protonskih pumpi, npr. omeprazol ili slični lekovi.

[0280] Pogodni putevi primene kompozicija antitela prema navodima in vivo i in vitro dobro su poznati u struci i može ih odabrati uobičajeno obučeni stručnjak.

[0281] Kako je gore opisano, anti-CLD18 antitela prema navodima mogu da se primene zajedno sa jednim ili više terapijskih sredstava, npr., citotoksičnim sredstvom, radiotoksičnim sredstvom, antiangiogenim sredstvom ili imunosupresivnim sredstvom, da bi se smanjilo indukovanje imunih odgovora protiv antitela prema navodima. Antitelo može da se veže za sredstvo (kao imunokompleks) ili može da se primeni zasebno od sredstva. U drugom slučaju (zasebna primena), antitelo može da se primeni pre, posle ili istovremeno sa sredstvom, ili može da se primeni paralelno sa drugim poznatim terapijama, npr., antikancerskom terapijom, npr., zračenjem. Takva terapijska sredstva uključuju, između ostalih, antineoplastična sredstva kao što su ona gore navedena. Paralelna primena anti-CLD18 antitela prema predmetnim navodima sa hemoterapeutskim sredstvima obezbeđuje dva antikancerska sredstva koja, delujući različitim mehanizmima, ostvaruju citotoksični efekat na tumorskim ćelijama. Takva paralelna primena može da reši probleme koji nastaju usled razvoja rezistencije na lekove ili promene u antigenosti tumorskih ćelija koje bi ih učinile nereaktivnim na antitelo.

[0282] U drugom posebnom primeru izvođenja navoda, subjekt na kome se primenjuje antitelo dodatno se leči antiangiogenim sredstvom, uključujući antitela koja ciljaju VEGF ili VEGFR jednim ili više dodatnih hemijskih jedinjenja koja inhibiraju angiogenezu. Pretretman ili paralelna primena ovih lekova mogu poboljšati prodiranje antitela u tumorsku masu.

[0283] U drugom posebnom primeru izvođenja prema navodima, subjekt na kome se primenjuje antitelo dodatno se leči jedinjenjem koje inhibira signalizaciju receptorima za faktore rasta, uključujući monoklonska antitela koja se vezuju za EGFR receptor, kao i hemijska jedinjenja koja inhibiraju signalizaciju iniciranu EGFR, Her1 ili Her2/neu receptorom.

[0284] Ciljno-specifične efektorske ćelije, npr., efektorske ćelije vezane za kompozicije (npr. antitela, multispecifične i bispecifične molekule) prema navodima takođe mogu da se upotrebe kao terapijska sredstva. Efektorske ćelije za ciljanje mogu da budu humani leukociti kao što su makrofagi, neutrofili ili monociti. Druge ćelije su eozinofili, ćelije prirodne ubice i druge ćelije koje nose IgG ili IgA receptore. Po želji, efektorske ćelije mogu da se dobiju iz subjekta koji se leči. Ciljno-specifične efektorske ćelije mogu da se primene u vidu suspenzije ćelija u fiziološki prihvatljivom rastvoru. Broj primenjenih ćelija može da bude reda veličine 10<8>do 10<9>, ali variraće u zavisnosti od terapijske svrhe. Uglavnom, količina će biti dovoljna da se dobije lokalizacija na ciljnoj ćeliji, npr., tumorskoj ćeliji koja eksprimira CLD18 i da dođe do ubijanja ćelije, npr., fagocitozom. Putevi primene takođe mogu da variraju.

[0285] Terapija ciljno-specifičnim efektorskim ćelijama može da se sprovede zajedno sa drugim tehnikama za uklanjanje ciljnih ćelija. Na primer, antitumorska terapija koja koristi kompozicije prema navodima i/ili efektorske ćelije naoružane ovim kompozicijama, može da se koristi zajedno sa hemoterapijom. Dodatno, kombinovana imunoterapija može da se koristi za usmeravanje različitih citotoksičnih efektorskih populacija prema uklanjanju tumorskih ćelija. Na primer, anti-CLD18 antitela vezana za anti-Fc-RI ili anti-CD3 mogu da se koriste zajedno sa IgG- ili IgA-receptor-specifičnim vezujućim sredstvima.

[0286] Bispecifični i multispecifični molekuli prema navodima mogu da se koriste za modulisanje nivoa Fc-gamaR ili Fc-alfaR na efektorskim ćelijama, npr., pokrivanjem ili eliminisanjem receptora na površini ćelije. Mešavine anti-Fc receptora takođe mogu da se koriste za tu svrhu.

[0287] Kompozicije (npr., antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokonjugati) prema navodima koje imaju komplement-vezujuća mesta, npr. delovi IgG1, -2, ili -3 ili IgM, koja se vezuju sa komplementom, mogu takođe da se koriste u prisustvu komplementa. U jednom primeru izvođenja, ex vivo tretman populacije ćelija koje uključuju ciljne ćelije, vezujućim sredstvom prema navodima i odgovarajućim efektorskim ćelijama, može da se dopuni dodavanjem komplementa ili seruma koji sadrži komplement. Fagocitoza ciljnih ćelija obloženih vezujućim sredstvom prema navodima može da se poboljša vezivanjem proteina komplementa. U drugom primeru izvođenja, ciljne ćelije obložene kompozicijama prema navodima mogu da se liziraju komplementom. U još jednom primeru izvođenja, kompozicije prema navodima ne aktiviraju komplement.

[0288] Kompozicije prema navodima mogu da se primene i zajedno sa komplementom. Prema tome, unutar obima navoda su kompozicije koje sadrže antitela, multispecifične ili bispecifične molekule i serum ili komplement. Ove kompozicije predstavljaju prednost zato što je komplement smešten blizu antitela, multispecifičnih ili bispecifičnih molekula.

[0289] Alternativno, antitela, multispecifični ili bispecifični molekuli prema navodima i komplement ili serum, mogu da se primene zasebno. Vezivanje kompozicija prema predmetnim navodima za ciljne ćelije može da dovede do translokacije kompleksa CLD18 antigen-antitelo u lipidne raftove na ćelijskoj membrani. Ta translokacija stvara visoku koncentraciju kompleksa antigen-antitelo koji mogu efikasno da aktiviraju i/ili pojačaju CDC.

[0290] Takođe unutar obima predmetnih navoda su kitovi koji sadrže kompozicije antitela prema navodima (npr., antitela i imunokonjugati) i uputstva za upotrebu. Kit može još da sadrži jedan ili više dodatnih reagenasa kao što je imunosupresivni reagens, citotoksično sredstvo ili radiotoksično sredstvo, ili jedno ili više dodatnih antitela prema navodima (npr., antitelo koje ima komplementarnu aktivnost).

[0291] U skladu sa tim, na pacijentima koji se leče kompozicijama prema navodima može dodatno da se primeni (pre, istovremeno, ili posle primene antitela prema navodima) drugo terapijsko sredstvo kao što je citotoksično ili radiotoksično sredstvo, koje pojačava ili naglašava terapijski efekat antitela prema navodima.

[0292] U drugim primerima izvođenja, subjekat može dodatno da se leči sredstvom koje moduliše, npr., pojačava ili inhibira ekspresiju ili aktivnost Fc-gama ili Fc-alfa receptora, na primer, subjekt se leči citokinom. Poželjni citokini uključuju faktor stimulacije kolonija granulocita (G-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ) i faktor nekroze tumora (TNF). Druga važna sredstva za povećanje terapijske efikasnosti antitela i farmaceutskih kompozicija opisanih ovde jesu β-glukani koji su homopolisaharidi granatih glukoznih ostataka i proizvode ih različite biljke i mikroorganizmi, na primer, bakterije, alge, gljivice, kvasci i plesni. Fragmenti β-glukana koje proizvode mikroorganizmi mogu takođe da se koriste. Poželjno, β-glukan je polimer β(1,3)glukoze, pri čemu bar neke od osovinskih glukoznih jedinica npr.3-6% osovinskih glukoznih jedinica, poseduju ogranke kao što su β(1,6).

[0293] U posebnom primeru izvođenja, navodi obezbeđuju postupke za detektovanje prisustva CLD18 antigena u uzorku ili merenje količine CLD18 antigena, mogu uključivati dovođenje u kontakt uzorka i kontrolnog uzorka sa antitelom koje se specifično vezuje za CLD18, pod uslovima koji dopuštaju formiranje kompleksa između antitela ili njegovog dela i CLD18. Formiranje kompleksa se zatim detektuje, pri čemu je razlika u formiranju kompleksa između uzorka i kontrolnog uzorka pokazatelj prisustva CLD18 antigena u uzorku.

[0294] U još jednom primeru izvođenja, navodi obezbeđuju postupak za detektovanje prisustva ili određivanje količine ćelija koje eksprimiraju CLD18 in vivo ili in vitro. Postupak sadrži (i) primenu, kod subjekta, kompozicije prema navodima konjugovane sa detektabilnim markerom; (ii) izlaganje subjekta načinima detektovanja pomenutog detektabilnog markera da bi se identifikovala područja koja sadrže ćelije koje eksprimiraju CLD18.

[0295] Postupci koji su gore opisani korisni su posebno za dijagnostikovanje bolesti povezanih sa CLD18 i/ili lokalizovanje bolesti povezanih sa CLD18, kao što su kancerske bolesti. Poželjno, količina CLD18, poželjno CLD18-A2 u uzorku koja je viša od količine CLD18, poželjno CLD18-A2, u kontrolnom uzorku ukazuje na prisustvo bolesti povezane sa CLD18 kod subjekta, preciznije, čoveka iz kojeg je uzorak uzet.

[0296] U još jednom primeru izvođenja imunokonjugati prema navodima mogu biti korišćeni za ciljno delovanje jedinjenja (npr., terapeutska sredstva, obeleživači, citotoksini, imunosupresanti radiotoksina, itd.) na ćelije koje imaju CLD18 eksprimiran na njihovoj površini vezivanjem takvih jedinjenja za antitelo. Na taj način, navodi takođe obezbeđuju postupke za lokalizaciju ex vivo ili in vitro ćelija koje eksprimiraju CLD18, kao što su cirkulišuće tumorske ćelije.

[0297] Predmetni navodi su dalje ilustrovani sledećim primerima koje ne treba razumeti kao ograničavajuće za obim navoda.

PRIMERI

1. Generisanje mišjih antitela protiv CLD18

a. Imunizacije:

[0298] Balb/c ili C57/BL6 miševi imunizuju se eukariotskim ekspresionim vektorima koji kodiraju humane CLD18 fragmente (SEQ ID NO: 15, 16; 17, 18). 50 μg ili 25 μg plazmidne DNK injektira se u kvadriceps (intramuskularno, i.m.) na dane 1 i 10, da bi se stvorila monoklonska antitela Seta1 ili, alternativno, na dane 1 i 9, 1 i 11 ili 1, 16 i 36, da bi se stvorila monoklonska antitela Seta2, u prisustvu adjuvanasa, na primer CpG (za detalje vidi Tab. 1b). CpG kao i ćelije transfektovane samo sa CLD18A2 (SEQ ID NO: 1) ili kotransfektovane dodatno sa RNK kodirajućom za mišji solubilni CD40L, injektirani su intarmuskularno, PEI-Man injektiran je intramuskularno ili intraperitonealno. Prisustvo antitela usmerenih protiv humanog CLD18 u serumima miševa praćeno je imunofluorescentnom mikroskopijom između dana 16 i 43, zavisno od specifičnog upotrebljenog protokola imunizacije. Imunofluorescencija je određivana korišćenjem HEK293 ćelija prolazno transfektovanih nukleinskom kiselinom koja kodira fuzioni konstrukt koji sadrži humani CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) i fluorescentni reporter-protein. Miševima sa detektabilnim imunim odgovorima (Sl.1) pojačani su odgovori tri dana pre splenektomije, da bi se stvorila monoklonska antitela Seta1, ili su miševima imuni odgovori pojačavani tri dana, tri i dva dana, ili su pojačavani imuni odgovori četiri, tri i dva dana pre splenektomije, da bi se stvorila monoklonska antitela Seta2, intraperitonealnim injektiranjem 5 x 10<7>ili alternativno 1 x 10<8>HEK293 ćelija prolazno transfektovanih nukleinskom kiselinom koja kodira humani CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) (za detalje vidi Tab. 1b). U Tab. 1a upotrebljeni protokoli imunizacije odnose se na respektivna antitela.

Tab. 1a: Protokoli imunizacije upotrebljeni za stvaranje monoklonskih antitela

b. Generisanje hibridoma koji produkuju humana monoklonska antitela na CLD18:

[0299] Mišji splenociti izoluju se i fuzionišu PEG-om sa ćelijskm linijom mišjeg mijeloma, po standardnim protokolima. Dobijeni hibridomi se zatim pretražuju u pogledu produkcije imunoglobulina sa CLD18-specifičnošću, uz korišćenje HEK293 ćelija transfektovanih nukleinskom kiselinom koja kodira humani CLD18, FACS analizom.

[0300] Suspenzije pojedinačnih ćelija slezinskih limfocita iz imunizovanih miševa, fuzionišu se sa P3X63Ag8U.1 nesekretujućim mišjim mijeloma-ćelijama (ATCC, CRL 1597), u odnosu 2:1, korišćenjem 50% PEG (Roche Diagnostics, CRL 738641). Ćelije se zaseju na mikrotitarske ploče sa ravnim dnom, pri gustini od približno 3 x 10<4>ćel./komorici, što je praćeno približno dvonedeljnom inkubacijom u selektivnom medijumu, sa 10% fetalnim goveđim serumom, 2% hibridoma fuzijom i klonirajućim suplementom (HFCS, Roche Diagnostics, CRL 1 363 735) plus 10 mM HEPES, 0.055 mM 2-merkaptoetanol, 50 μg/ml gentamicina i 1x HAT (Sigma, CRL H0262). Posle 10 do 14 dana, pojedinačni komorice se pretražuju protočnom citometrijom na prisustvo anti-CLD18 monoklonskih antitela. Hibridomi koji sekretuju antitela ponovo se zaseju, ponovo pretražuju i, ako su i dalje pozitivni za anti-CLD18 monoklonska antitela,

1

subkloniraju postupkom graničnog razblaženja. Stabilni subklonovi se zatim kultivišu in vitro da bi se stvorile male količine antitela u medijumu za kulturu tkiva, za karakterizaciju. Odabere se najmanje jedan klon od svakog hibridoma, koji zadržava reaktivnost roditeljskih ćelija (FACS-om). Devet fiola ćelijskih banaka generisano je za svaki klon i uskladišteno u tečnom azotu.

c. Selekcija monoklonskih antitela koja se vezuju za CLD18:

[0301] Da bi se odredio izotip antitela, sprovodi se izotipski ELISA test. Mišji monoAB ID Kit (Zymed, CRL 90-6550) ili, alternativno, IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, kat. br. 1493027), upotrebljava se za određivanje Ig-ske subklase identifikovanih CLD18-reaktivnih monoklonskih antitela.

[0302] Određeno kao Set1, generisano je devetnaest ćelijskih linija hibridoma, šest iz fuzije ćelija iz C57/BL6 miša imunizovanog sa CLD18A2-petljaD3 (SEQ ID NO: 17, 18), trinaest iz fuzije ćelija iz Balb/c miša imunizovanog sa CLD18A2-petlja1 (SEQ ID NO: 15, 16), koje eksprimiraju sledeća antitela:

24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9

24H5: mišje monoklonsko IgG2b, κ antitelo, 182-D758-034

26B5: mišje monoklonsko IgG2a, κ antitelo, 182-D758-035, DSM ACC2745

26D12: mišje monoklonsko IgG3, κ antitelo, 182-D758-036, DSM ACC2746

28D10: mišje monoklonsko IgG3, κ antitelo, 182-D758-040, DSM ACC2747

37G11: mišje monoklonsko IgG2a, κ antitelo, 182-D1106-055, DSM ACC2737 37H8: mišje monoklonsko IgG3, κ antitelo, 182-D1106-056, DSM ACC2738

38G5: mišje monoklonsko IgG3, κ antitelo, 182-D1106-057, DSM ACC2739

38H3: mišje monoklonsko IgG3, κ antitelo, 182-D1106-058, DSM ACC2740

39F11: mišje monoklonsko IgG3, κ antitelo, 182-D1106-059, DSM ACC2741

41C6: mišje monoklonsko IgG2a, κ antitelo, 182-D1106-060

42E12: mišje monoklonsko IgG2a, κ antitelo, 182-D1106-061, DSM ACC2748 43A11: mišje monoklonsko IgG2a, κ antitelo, 182-D1106-062, DSM ACC2742 44E10: mišje monoklonsko IgG3, κ antitelo, 182-D1106-063

47D12: mišje monoklonsko IgG3, κ antitelo, 182-D 1106-064

61C2: mišje monoklonsko IgG2b, κ antitelo, 182-D1106-067, DSM ACC2743

75B8: mišje monoklonsko IgM, κ antitelo, 182-D756-001

85A3: mišje monoklonsko IgM, κ antitelo, 182-D756-002

9E8: mišje monoklonsko IgM, κ antitelo, 182-D758-011

2

19B9: mišje monoklonsko IgM, κ antitelo, 182-D758-024

[0303] Određeno kao Set2, generisano je pet ćelijskih linija hibridoma, jedna iz fuzije ćelija iz Balb/c miša imunizovanog sa CLD18A2-petljaD3 (SEQ ID NO: 17, 18) i CLD18A2-petljaD1 (SEQ ID NO: 15, 16), četiri iz fuzije ćelija iz Balb/c miša imunizovanog sa CLD18A2-petljaD1 (SEQ ID NO: 15, 16), koje eksprimiraju sledeća antitela:

45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10

45C1: mišje monoklonsko IgG2a, κ antitelo, 182-D758-187

125E1: mišje monoklonsko IgG2a, κ antitelo, 182-D1106-279, DSM ACC2808 163E12: mišje monoklonsko IgG3, κ antitelo, 182-D1106-294, DSM ACC2809 166E2: mišje monoklonsko IgG3, κ antitelo, 182-D1106-308

175D10: mišje monoklonsko IgG1, κ antitelo, 182-D1106-362, DSM ACC2810

2. Produkcija monoklonskih antitela

[0304] Produkcija i prečišćavanje monoklonskih antitela reaktivnih na CLD18:

Da bi se proizvele količine u mg antitela za funkcionalnu karakterizaciju, hibridoma ćelije selekcionišu se u bioreaktorima baziranim na dijalizi (CELLine CL1000, Integra, Chur, CH) pri 2 x 10<6>ćel./ml. Jednom nedeljno sakuplja se supernatant koji sadrži antitelo. Mišje monoklonsko antitelo prečišćava se uz korišćenje Melon Gel (Pierce, Rockford, USA) i koncentruje precipitacijom amonijum-sulfatom ili, alternativno, prečišćava se pomoću ProteinA, korišćenjem FPLC. Koncentracija i čistoća antitela određuju se putem BCA-testa, a čistoća se proverava natrijum-dodecilsulfatnom gel-elektroforezom i Coomassi-bojenjem.

3. Vezujuće karakteristike monoklonskih antitela

a. Kontrola kvaliteta transfektanata WB-om, IF-om:

[0305] Da bi se generisale CLD18A2-eksprimirajuće ćelije, HEK293 ili CHO ćelije transfektuju se nukleinskim kiselinama koje kodiraju CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) ili CLD18A2-myc (SEQ ID NO: 3,4).

[0306] HEK293 ćelije transfektuju se CLDN18A2-myc (SEQ ID NO: 3, 4) ili ostave netransfektovane. Dvadeset četiri sata posle transfekcije, ćelije se sakupe, liziraju i podvrgnu elektroforezi na natrijum-dodecilsulfatnom gelu. Gel se blotuje i boji mišjim anti-myc antitelom. Posle inkubiranja sa anti-mišjim antitelom obeleženim peroksidazom, blot se razvije pomoću ECL reagensa i vizuelizuje korišćenjem LAS-3000 sistema za analizu slike (Fuji). Samo u transfektovanim ćelijama, a ne i u negativnoj kontroli, zapažaju se trake sa molekulskom težinom očekivanom za CLD18-myc (Sl.2).

[0307] CHO ćelije transfektuju se sa CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) i rastu na pločicama sa komorom, 24 h. Ćelije se fiksiraju metanolom i boje zečjim poliklonskim antitelom protiv CLD18, pri 1 μg/ml, 60 min. na 25°C. Posle ispiranja, ćelije se boje pomoću Alexa488-obeleženog kozjeg anti-zečjeg IgG (Molecular Probes) i analiziraju fluorescentnom mikroskopijom. Sl. 3 pokazuje transfektovane CHO ćelije koje eksprimiraju CLD18 na ćelijskoj membrani, kao i netransfektovane ćelije. Ove heterologo CLD18-eksprimirajuće ćelije koriste se u sledećim testovima za ispitivanje specifičnosti vezivanja antitela.

b. Selekcija monoklonskih antitela koja se vezuju za CLD18/Primarne pretrage protočnom citometrijom:

[0308] HEK293 ćelije su kotransfektovne ekspresionim vektorima koji kodiraju humani CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) i fluorescirajućim reporter-proteinom, 40 h pre testa ili su, alternativno, korišćene HEK293 ćelije koje stabilno eksprimiraju humani CLD18A2 (HEK293-CLD18A2) i kontrastno obojene propidijum-jodidom (PI). Posle odvajanja ćelija korišćenjem 2mM EDTA/PBS, ćelije se isperu kompletnim medijumom za rast i zaseju pri gustini od približno 1-5 x 10<5>ćel./komorici na mikrotitarske ploče sa U-dnom. Ćelije se inkubiraju 30 min. na 4° C sa supernatantom hibridoma, što je praćeno sa dva koraka ispiranja pomoću 1% toplotom inaktiviranog FBS/PBS i na kraju inkubacijom sa APC- ili Alexa647-konjugovanim anti-mišjim IgG specifičnim sekundarnim antitelom. Posle dva koraka ispiranja, kotransfektovane ćelije fiksiraju se pomoću CellFIX (BD Biosciences). Vezivanje se ispituje protočnom citometrijom, uz korišćenje BD FACSArray. Ekspresija fluorescentnog markera nanosi se na horizontalnu osu, prema vezivanju antitela na vertikalnoj osi. Detektovano je da se sva mišja antitela 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10 vezuju specifično za površinu ćelija koje eksprimiraju fluorescentni marker (Sl.4, ćelije u Q2) kako je za primer pokazano za supernatante hibridoma koji sadrže monoklonska antitela 24H5 (Sl.4A, ćelije u Q2), 85A3 (Sl.4B), 175D10, 125E1, 163E12, 166E2 i 45C1 (Sl.4C, ćelije u Q1).

c. Upoređivanje antitela koja se vezuju za Myc- ili HA-markirani CLD18A2:

[0309] Vršeno je dalje specifikovanje karakteristika identifikovanih CLD18-specifičnih monoklonskih antitela. Dakle, analizirano je vezivanje monoklonskih antitela za CLD18A2

4

mutante, kreirane insertovanjem obeleživača epitopa. CLD18A2-HA (SEQ ID NO: 6) sadrži HA-epitopski obeleživač u CLD18A2-petlja1, dok CLD18A2-Myc (SEQ ID NO: 4) sadrži Mycepitopski obeleživač umetnut u CLD18A2-petlja2. Kako insertovanje ovih obeleživača dovodi do destrukcije epitopa, identifikovana antitela mogu da se grupišu prema gubitku sposobnosti vezivanja za neki od mutanata. HEK293 ćelije prolazno kotransfektovane fluorescentnim obeleživačem i humanim CLD18A2, ili fluorescentnim obeleživačem i CLD18A2-HA, ili fluorescentnim markerom i CLD18A2-Mycm inkubirane su sa supernatantima hibridoma koji sadrže CLD18-specifična monoklonska antitela, 30 min. na 4°C, što je praćeno inkubacijom sa Alexa647-konjugovanim anti-mišjim IgG sekundarnim antitelom. Pre analize na BD FACSArray, ćelije su bile fiksirane korišćenjem CellFIX-a. Kao što je za primer pokazano za 24H5, 9E8, 26B5 i 19B9 na Sl. 5, na osnovu svojih vezujućih karakteristika, monoklonska antitela mogu da se razdvoje u četiri različite grupe: (i) antitela koja se vezuju za nemodifikovani CLD18A2 kao i za CLD18A2-HA i CLD18A2-Myc, npr. 24H5, (Sl.5A), ili (ii) antitela koja se ne vezuju za CLD18A2-HA, npr.9E8, (Sl.5B), ili (iii) antitela koja se ne vezuju za CLD18A2-Myc, npr. 26B5, (Sl. 5C), ili (iv) antitela koja se ne vezuju za CLD18A2-HA ni za CLD18A2-Myc, npr. 19B9, (Sl.5D).

d. Upoređivanje vezivanja antitela za humane transfektante CLD18A1 i CLD18A2 pomoću protočne citometrije:

[0310] Specifičnost vezivanja identifikovanih monoklonskih antitela na CLD18A2 izoforme, analizirano je protočnom citometrijom. HEK293 ćelije koje stabilno eksprimiraju humani CLD18A2 (HEK293-CLD18A2) i HEK293 koje stabilno eksprimiraju humani CLD18A1 (SEQ ID NO: 7, 8) (HEK293-CLD18A1) inkubirane su 30 min. na 4°C sa supernatantima hibridoma koji sadrže monoklonska antitela, što je praćeno inkubacijom sa Alexa647-konjugovanim antimišjim IgG sekundarnim antitelom i fiksacijom ćelija ili, alternativno, bez fiksacije, ali uz PI kontrabojenje. Vezivanje je procenjivano protočnom citometrijom uz korišćenje BD FACSArray. Sl. 6 pokazuje primere za dve grupe monoklonskih antitela koja su identifikovana iz panela koji sadrži 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10: (i) monoklonska antitela 43A11, 45C1 i 163E12 vezuju se specifično za humani CLD18A2 ali ne za humaniCLD18A1 (Sl. 6A,B) i (ii) monoklonsko antitelo 37H8 vezuje se za obe humane izoforme (Sl.6A).

e. Upoređivanje vezivanja antitela za humane transfektante CLD18A1 i CLD18A2 pomoću imunofluorescentne mikroskopije:

[0311] HEK293 ćelije prolazno su transfektovane ekspresionim vektorom koji kodira fuzioni protein CLD18A1 (SEQ ID NO: 8) ili CLD18A2 (SEQ ID NO: 2) sa fluorescentnim reporterom i gajene su na pločicama sa komorom. Ćelije su bojene, nefiksirane ili posle fiksacije paraformaldehidom, supernatantima kulture tkiva

[0312] sa monoklonskim antitelom, 30 min. na 37°C. Posle ispiranja, ćelije su bojene Alexa555-obeleženim anti-mišjim Ig antitelom (Molecular Probes). Vezivanje antitela procenjivano je fluorescentnom mikroskopijom. Kako je pokazano na Sl. 7, antitelo 37G11 specifično je reagovalo sa CLD18A2 (Sl. 7A), ali ne i sa CLD18A1 (Sl. 7B). Nasuprot tome, antitelo 26B5 bilo je reaktivno i sa CLD18A2 i sa CLD18A1 (Sl.8).

[0313] Za antitela 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, zapažena je jasna razlika između bojenja živih ćelija i ćelija fiksiranih paraformaldehidom. Antitela su formirala uniformno membransko obojenje kada su ćelije bile fiksirane (Sl. 7C, 8C, 8D). Nasuprot tome, inkubacija živih ćelija sa ovim antitelima dovela je do nastanka proteinskih klastera, što se videlo kao "pegav" obrazac bojenja (Sl. 7A, 8A, 8B). Ovo pokazuje da se sva antitela vezuju za nativne epitope, kako je nađeno na površini živih ćelija.

f. Determinisanje endogeno eksprimirajućih ćelijskih linija:

[0314] CLD18A2 gen-specifični prajmerski par (SEQ ID NO: 11, 12) upotrebljen je u RT-PCR analizama za pretragu ćelijskih linija u pogledu ekspresije CLD18A2. Nađeno je da ćelijske linije humanog želudačnog karcinoma NCI-SNU-16 (ATCC CRL-5974), NUGC-4 (JCRB0834) i KATO-III (ATCC HTB-103) i ćelijske linije humanog adenokarcinoma pankreasa DAN-G (DSMZ ACC249) pokazuju veliku endogenu ekspresiju CLD18 (Sl. 9). Ekspresija je potvrđena na proteinskom nivou, pomoću bojenja zečjim poliklonskim serumom protiv CLD18.

g. Bojenje endogeno eksprimirajućih ćelijskih linija CLD18-specifičnim antitelima i imunofluorescentna analiza:

[0315] DAN-G, SNU-16, NUGC-4 i KATO-III ćelije rasle su na pločicama sa komorom, pod standardnim uslovima. Ćelije su bile nefiksirane ili, alternativno, fiksirane metanolom i bojene respektivnim antitelima. Za antitela 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9 bilo je zapaženo bojenje površine ćelija, kako je za primer pokazano na Sl.10, 11 i 12A. Za antitela 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10 testirano je prepoznavanje nativnog epitopa, i bojenje površine ćelije zapaženo je na nefiksiranim ćelijama, kako je pokazano na Sl. 12B. Podgrupe antitela pokazale su homogeno bojenje ćelijske membrane ili pretežno na površinama ćelija okrenutim jedna ka drugoj ili na slobodnim delovima membrane koji nisu okrenuti ka drugim ćelijama. Druga antitela bojila su diskretne fokuse ili agregate na ćelijskoj membrani, što je, zajedno, pokazalo da se respektivna antitela vezuju za različite epitope, uključujući epitope koji su maskirani homotipskom ili heterotipskom asocijacijom CLD18, kao i CLD18 epitope dostupne u prethodno formiranim čvrstim spojevima.

h. Bojenje endogeno eksprimirajućih ćelijskih linija ispitivano protočnom citometrijom:

[0316] Površinska ekspresija konstitutivno eksprimiranog CLD18A2 na KATO-III i NUGC-4 živim ćelijama, analizirana je protočnom citometrijom. Kao primer prikazane su KATO-III i NUGC-4 ćelije obojene monoklonskim antitelom 61C2 ili 163E12, što je bilo praćeno inkubacijom sa Alexa647-konjugovanim anti-mišjim IgG sekundarnim antitelom i fiksacijom ćelija ili, alternativno, bez fiksacije. Vezivanje je procenjivano protočnom citometrijom uz korišćenje BD FACSArray. Sl. 13 pokazuje jako vezivanje 61C2 za najmanje 70.3% KATO-III ćelija i 163E12 za CLD18A2 na KATO-III i NUGC-4 ćelijama.

i. Poravnavanje sekvenci mišjeg i humanog CLD18A1 i CLD18A2:

[0317] Humani CLD18A2 (NP_ 001002026) i humani CLD18A1 (NP_057453), u poređenju sekvenci, razlikuju se u N-kraju, a mišje CLD18 varijante (NP_062789 i AAL15636) pokazuju visoku homologiju i mesta varijacije sekvence između molekula (vidi Sl.14).

j. Reaktivnost antitela sa mišjim CLD18A1 i mišjim CLD18A2 analizirana protočnom citometrijom:

[0318] Vezivanje identifikovanih monoklonskih antitela za mišji CLD18A2 i CLD18A1 analizirano je protočnom citometrijom. HEK293 ćelije, prolazno kotransfektovane fluorescentnim markerom i mišjim CLD18A2 (SEQ ID NO: 33, 35) ili fluorescentnim markerom i mišjim CLD18A1 (SEQ ID NO: 36, 37), inkubirane su sa supernatantima hibridoma koji sadrže humana CLD18-specifična monoklonska antitela 38G5, 38H3, 37G11, 45C1 i 163E12, respektivno, 30 min. na 4°C, što je praćeno inkubacijom sa Alexa647-konjugovanim anti-mišjim IgG sekundarnim antitelom i fiksacijom ćelija. Vezivanje je procenjivano protočnom citometrijom uz korišćenje BD FACSArray. Sl. 15 pokazuje tri različita profila vezivanja: 38G5 i 45C1 ne vezuju se ni za jednu od mišjih CLD18 izoformi, 37G11 i 163E12 vezuju se za mišji CLD18A2, ali ne i za mišji CLD18A1 i 38H3 vezuje se za mišji CLD18A1 i CLD18A2. Ova antitela su vredna sredstva za određivanje potencijalne toksičnosti CLD18 monoklonskih antitela u pretkliničkim studijama.

[0319] Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da monoklonska antitela prema navodima 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10 generisana protiv CLD18, pokazuju različite vezujuće karakteristike prema različitim epitopima i topologijama humanog CLD18.

[0320] Kombinacija različitih osobina opisana u primerima 3b, c, d, e, g, h, i j, može da se koristi za razvrstavanje monoklonskih antitela u različite klase.

4. Imunohistohemija (IHC)

[0321] Antitelo specifično za CLD18A2-epitop, generisano imunizovanjem sa peptidom SEQ ID NO: 21, upotrebljeno je za imunohistohemijsku karakterizaciju ekspresije CLD18A2. Preseci tkiva ukalupljenog u parafin, poreklom iz široke lepeze normalnih i tumorskih tkiva, upotrebljeni su za analiziranje ekspresije i lokalizacije proteina. Nije zapažena značajna ekspresija u tkivu nijednog normalnog organa osim želuca (vidi Tab. 2, Sl. 16A). Nasuprot tome, ekspresija CLD18A2 potvrđena je imunohistohemijski u različitim kancerima, uključujući kancer želuca i kancer pluća (Sl.16B).

[0322] Interesantno, ekspresija CLD18A2 proteina u želudačnoj mukozi ograničena je na terminalno diferencirane ćelije želudačnog epitela u bazalnom regionu i regionu jamica. Nasuprot tome, ćelije u vratnom regionu želudačne mukoze, posebno želudačne matične ćelije u regionu istmusa, koje obnavljaju čitavu mukozu, ne eksprimiraju CLD18A2 (Sl.16C).

Tab. 2: Ekspresija CLD18A2 u normalnim i tumorskim tkivima, prema analizi pomoću

IHC:

Tip tkiva Rezultat

Nadbubreg -Mokraćna bešika -Ćelije krvi -Koštana srž -Dojka -Debelo crevo -Endotel -Jednjak

Tip tkiva Rezultat

Jajovod -Srce -Bubreg (glomerulus, tubuli) -

Jetra -Pluća -

Limfni čvor -

Jajnik -

Pankreas -Paratireoidea -Hipofiza -Placenta -Prostata -Koža -Slezina -

Želudac<+>

Poprečno-prugasti mišić -Testis -Timus -Tireoidea -Ureter -Materica (grlić, endometrijum) -

[0323] Monoklonsko antitelo 39F11 upotrebljeno je za specifične imunohistohemijske studije CLD18A2. Kao što je pokazano na Sl. 17A, nije detektovana značajna reaktivnost ni u jednom normalnom testiranom tkivu, izuzev želuca (Sl.17A), dok su karcinomi želuca i karcinomi pluća bili jako pozitivni (Sl.17B).

[0324] Druga grupa antitela prema navodima pokazuje za kancer specifičan obrazac bojenja kada se vezuje za tkivo kancera želuca, ali ne pokazuje reaktivnost sa normalnim tkivom želuca. Ovakav obrazac bojenja pokazan je na Sl.18A, sa monoklonskim antitelom 26B5.

[0325] Imunohistohemija je upotrebljena za specifičnu analizu 175D10 (Sl. 18B), 43A11 (Sl.

18C), 163E12 (Sl.18D) i 45C1 (Sl.18E), na presecima poreklom iz HEK293 tumorskih ćelijskih linija: HEK293 tumorske ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju humani CLD18A2 (HEK293CLD18A2) ili CLD18A1 (HEK293-CLD18A1) ili su transfektovane ekspresiono- kontrolnim plazmidom koji sadrži samo gen za rezistenciju na antibiotike, za selektovanje (HEK293-mock), ksenograftovane su u miševe da formiraju solidne tumore. Ekspresija nije bila detektabilna u mock-transfektovanim HEK293-ksenograftskim tumorima. Nasuprot tome, jako i homogeno bojenje membrane zapaženo je u HEK293-CLD18A2 ksenograftskim tumorima i u uzorcima karcinoma želuca.

5. Komplement-zavisna citotoksičnost (CDC)

a. CDC indukovana monoklonskim antitelima Seta1 kako je izmereno protočnom citometrijom:

[0326] Plazma za lizu komplementom pripremljena je uzimanjem krvi od zdravih dobrovoljaca u S-Monovette-EDTA vakutajnere (Sarstedt, Nürmbrecht, Germany), posle čega je centrifugirana na 600 g, 20 min. Plazma se uzme i uskladišti na -20°C.

[0327] U prvom setu eksperimenata, supernatanti hibridoma se analiziraju u pogledu sposobnosti da indukuju citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) usmerenu protiv HEK293 ćelija koje stabilno eksprimiraju humani CLD18A2 (HEK293-CLD18A2). Ćelije su inkubirane sa supernatantima hibridoma koji sadrže monoklonska antitela 85A3, 28D10, 24H5 ili 26D12, respektivno, 20 min. na sobnoj temperaturi. Posle centrifugiranja (5 min. na 450 g), supernatant se ukloni i 20% humane plazme u DMEM (prethodno zagrejane na 37°C) doda se ćelijama, zatim vrši inkubacija još 20 min. na 37°C. Posle toga, ćelijska liza se određuje na FACS korišćenjem postupaka bojenja propidijum-jodidom (PI). PI se doda u finalnoj koncentraciji od 2.5 μg/ml. Za protočnu citometriju, BD FACSArray koristi se protočni citometar (BD Biosciences, Mountain View, CA). Najmanje 10000 događaja uzima se za analizu, uz isključivanje ćelijskog detritusa, podešavanjem praga prednjeg i bočnog rasipanja (FCS). Procenat liziranih ćelija (PI-pozitivnih ćelija) pokazan je na Slici 19. Monoklonska antitela 85A3, 28D10 i 26D12 indukovala su lizu 33.5%, 38.2% i 39.2% HEK293-CLD18A2 ćelija, respektivno, dok je CDC posredovana 24H5 bila samo 19.3%.

b. CDC indukovana monoklonskim antitelima Seta1:

[0328] U drugom setu eksperimenata, analizirana je specifičnost monoklonskih antitela da indukuju CDC ćelija koje eksprimiraju CLD18A2. Dakle, set antitela koja se ili vezuju specifično za humani CLD18A2, ili se vezuju i za humani CLD18A1, testiran je u pogledu CDC-indukcije protiv CHO ćelija stabilno transfektovanih humanim CLD18A2 (CHO-CLD18A2) ili humanim CLD18A1 (CHO-CLD18A1). CHO-CLD18A2 i CHO-CLD18A1 ćelije zasejane su 24 h pre testa, pri gustini od 3 x 10<4>ćel./komorici, na mikrotitarskim pločama za kulturu tkiva, sa ravnim dnom. Sledećeg dana ukloni se medijum za rast i ćelije se, u triplikatima, inkubiraju sa supernatantima hibridoma podešenim na koncentraciju od 10 μg/ml, koji sadrže monoklonska antitela 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12 i 61C2, respektivno. Kontrolne ćelije inkubirane su sa medijumom za rast ili medijumom za rast koji sadrži 0.2% saponina, za određivanje pozadinske lize i maksimalne lize, respektivno. Posle 20 min. inkubacije na sobnoj temperaturi, supernatant se ukloni i 20% humana plazma u DMEM (prethodno zagrejana na 37°C) doda se ćelijama i vrši se inkubacija još 20 min. na 37°C. Zatim se supernatanti zamene PBS-om koji sadrži 2.5 μg/ml etidijum-bromida i meri se fluorescentna emisija posle ekscitacije na 520 nm, korišćenjem Tecan Safire. Procenat specifične lize računa se na sledeći način: % specifične lize = (fluorescencija uzorka - pozadinska fluorescencija)/(fluorescencija maksimalne lize - pozadinska fluorescencija) x 100. Sl. 20 pokazuje da monoklonska antitela 26D12, 28D10, 37H8, 38H3 i 39F11 posreduju u visokoj, monoklonsko antitelo 38G5 posreduje u srednjoj, monoklonska antitela 41C6 i 61C2 posreduju u niskoj i monoklonska antitela 24H5, 37G11, 42E12, 43A11, 44E10 i 47D12 ne posreduju u CDC protiv CHO-CLD18A2 ćelija. Nasuprot tome, nijedno od antitela nije sposobno da indukuje CDC protiv CHO-CLDA1 ćelija, iako se 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 41C6, 47D12 i 61C2 takođe vezuju za CLD18A1, kako je određeno protočnom citometrijom i imunofluorescencijom.

c. Titracija monoklonskih antitela i CDC uz korišćenje monoklonskih antitela Seta1:

[0329] Da bi se izmerila sposobnost anti-CLD18 antitela da u niskim koncentracijama indukuju CDC, sproveden je eksperiment u kome su titrovana tri različita antitela. CHO-CLD18A2 ćelije koje rastu na mikrotitarskim pločama, inkubirane su sa različitim koncentracijama 75B8 (100, 30, 10, 3 i 1 μg/ml), 37H8 (10, 3.3 i 1 μg/ml) i 28D10 (10, 1 i 0.1 μg/ml), respektivno, 20 min. na sobnoj temperaturi. Supernatant je uklonjen i ćelijama je dodata 20% humana plazma u DMEM (prethodno zagrejana na 37°C) i vršena je inkubacija još 20 min. na 37°C. Pre analiziranja pomoću Tecan Safire, supernatanti su zamenjeni PBS-om koji sadrži 2.5 μg/ml etidijum-bromida. Slike 21A-C pokazuju procenat specifične lize u funkciji koncentracije antitela. Monoklonsko antitelo 75B8 indukuje lizu 31.0% CHO-CLD18A2 ćelija pri koncentraciji od 10 μg/ml, što pada na 6.2% pri koncentraciji od 1 μg/ml (Sl. 21A), dok monoklonska antitela 28D10 i 37H8 i dalje indukuju 39% i 26.5% specifične lize pri koncentraciji od 1 μg/ml (Sl.21B, C), respektivno.

d. CDC indukovana monoklonskim antitelima Seta2 kako je izmereno protočnom citometrijom:

1

[0330] Serum za lizu komplementom pripremljen je uzimanjem krvi od zdravih dobrovoljaca u Serum-Monovette-EDTA vakutajnere (Sarstedt, Nürmbrecht, Germany), koja se zatim centrfugira na 600 g, 20 min. Serum se uzme i uskladišti na -20°C. Kontrolni serum se pre skladištenja inaktivira zagrevanjem na 56°C, 30 min.

[0331] Supernatanti hibridoma analiziraju se u pogledu svoje sposobnosti da indukuju citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) protiv KATO-III ćelija koje endogeno eksprimiraju humani CLD18A2. Ćelije se inkubiraju sa sirovim ili prečišćenim supernatantima hibridoma koji sadrže monoklonska antitela 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10, respektivno, 30 min. na 37°C. Ćelijama se doda 20% humani serum u RPMI i inkubira se još 30 min. na 37°C. Posle toga, liza ćelija određuje se na FACS, korišćenjem postupka bojenja propidijum-jodidom (PI). PI se doda u finalnoj koncentraciji od 2.5 μg/ml. Za protočnu citometriju, koristi se BD FACSArray protočni citometar (BD Biosciences, Mountain View, CA). Najmanje 10000 događaja uzima se za analizu, uz isključivanje ćelijskog detritusa, podešavanjem praga prednjeg i bočnog rasipanja (FSC/SSC). Specifična liza izračunava se prema sledećoj formuli: specifična liza = (%PI-pozitivnih ćelija u uzorku - %PI-pozitivnih ćelija u uzorku sa serumom inaktiviranim toplotom). Velika CDC posredovana liza zapažena je naročito za 163E12.

6. Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC)

[0332] Supernatanti hibridoma analizirani su u pogledu svoje sposobnosti da indukuju ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) protiv HEK293 ćelija koje stabilno eksprimiraju humani CLD18A2 (HEK293-CLD18A2) ili humani CLD18A1 (HEK293-CLD18A1).

a. Obogaćivanje mononuklearnih ćelija humane periferne krvi: Humana krv zdravih donora razblaži se dva puta u fosfatnom puferu (PBS) i krvne ćelije se nanesu na Ficoll (Lymphocyte Separation Medium 1077 g/ml, PAA Laboratories, kat. br. J15-004). Mononuklearne ćelije periferne krvi (MNC) sakupe se iz međufaze, isperu i resuspenduju u RPMI 1640 medijumu za kulturu dopunjenom sa 10% fetalnim goveđim serumom koji je inaktiviran zagrevanjem, 2 mM L- glutaminom.

b. Postavka ADCC: Ciljne ćelije su obeležene ligandom za pojačavanje fluorescencije (BADTA, Perkin Elmer cytotoxicity assay kit DELFIA EuTDA Cytotoxicity Reagents, kat. br. AD0116), 30 minuta. Posle ekstenzivnog ispiranja u RPMI-10 dopunjenom 10 mM probenecidom (Sigma, kat. br. P8761), 10-20 mM HEPES-om i 10% fetalnim goveđim serumom koji je inaktiviran zagrevanjem, koncentracija ćelija se podesi na 1 x 10<5>ćelija/ml. Obeležene ciljne ćelije, efektorske ćelije (MNC) i supernatanti koji sadrže

2

monoklonska antitela dovedena do koncentracije od 10 μg/ml, nanesu se na mikrotitarske ploče sa komoricama sa zaobljenim dnom. Za izolovane efektorske ćelije, korišćen je odnos efektora prema ciljnom mestu (E:T) od 100:1 (nisu pokazani podaci za 50:1 i 25:1). Posle inkubacije (2 sata, 37°C), testovi se prekidaju centrifugiranjem i fluorescentni ligand, oslobođen iz duplikata, meri se preko europijuma, u fluorometru sa vremenskim razlaganjem. Procenat ćelijske citotoksičnosti izračunava se korišćenjem sledeće formule: % specifične lize = (izbrojano eksperimentalno oslobađanje - izbrojano spontano oslobađanje) / (izbrojano maksimalno oslobađanje - izbrojano spontano oslobađanje) x 100, sa maksimalnim oslobađanjem fluorescencije liganda određenim dodavanjem Triton X-100 (0.25% finalna koncentracija) ciljnim ćelijama, i spontanim oslobađanjem merenim u odsustvu antitela i efektorskih ćelija. Slika 22 pokazuje da monoklonska antitela 26B5, 37H8, 38G5, 47D12 i 61C2 posreduju u ADCC protiv HEK293-CLD18A2 ćelija. Nasuprot tome, ova antitela ne indukuju značajnu ili indukuju samo malu citotoksičnost na CLD18A1 ciljevima koji pokazuju CLD18A2 specifičnu ADCC (Slika 23).

7. Inhibicija proliferacije

[0333] Prečišćena mišja monoklonska antitela analizirana su u pogledu svoje sposobnosti da inhibiraju ćelijski rast KATO-III ćelija koje endogeno eksprimiraju humani CLD18A2.

[0334] 1x10<4>ciljnih ćelija koje endogeno eksprimiraju CLD18A2 (KATO-III) kultivišu se u prisustvu približno 10 μg monoklonskih antitela.

[0335] DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, kat. br. AD0200) je neizotopski imunotest baziran na merenju ugrađivanja 5-bromo-2’-deoksiuridina (BrdU) tokom DNK sinteze proliferišućih ćelija, na mikropločama. Ugrađeni BrdU detektuje se korišćenjem monoklonskog antitela obeleženog europijumom. Da bi se omogućila detekcija antitela, ćelije se fiksiraju i DNK denaturiše korišćenjem Fix rastvora. Nevezano antitelo se ispere i doda se DELFIA Inducer, da se joni europijuma disociraju od obeleženog antitela u rastvor, gde formiraju visokofluorescentne helate sa komponentama DELFIA Inducer. Izmerena fluorescencija - u detekciji upotrebljena fluorimetrija sa vremenskim razlaganjem - proporcionalna je DNK sintezi u ćelijama svake komorice.

[0336] Jaka inhibicija proliferacije zapažena je sa mišjim antitelima 125E1, 163E12, 45C1, 37G11, 37H8, 28D10 i 166E2, respektivno. Umerena inhibicija proliferacije zapažena je sa mišjim antitelima 43A11, 175D10, 42E12, 26D12, 61C2 i 38H3, respektivno.

8. Performanse u terapijskim ksenograftskim modelima kod miša

[0337] Terapijski potencijal identifikovanih monoklonskih antitela koja se specifično vezuju za CLD18A2 izučavan je u terapijskim ksenograftskim modelima.

a. Rano lečenje CLD18A2-visokoeksprimirajućih tumora kod miševa

[0338] SCID miševi su subkutano inokulisani sa 1 x 10<7>HEK293 ćelija koje stabilno eksprimiraju visoke nivoe humanog CLD18A2 (HEK293-CLD18A2). Nivoi ekspresije humanog CLD18A2 u HEK293-CLD18A2 ćelija uporedivi su sa nivoima ekspresije u primarnim kancerima želuca kod pacijenata. Svaka grupa eksperimentalnog tretmana sastojala se od 10 miševa (broj miševa po grupi n=10). Lečenje miševa počelo je 3 dana posle inokulacije tumora.

200 μg prečišćenih supernatanata hibridoma, koji su predstavljali mišja monoklonska antitela 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 39F11, 42E12, 43A11, 38H3 ili 61C2, injektirano je jednom nedeljno, tokom 4 nedelje, intravenski. Alternativno, 200 μg prečišćenih supernatanata hibridoma koji su sadržali mišja monoklonska antitela 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 ili 175D10, primenjivano je dva puta nedeljno, tokom 6 nedelja, naizmenično intravenskim ili intraperitonealnim injektiranjem. Rast tumora tretiranih miševa praćen je dva puta nedeljno (zapremina tumora = dužina x širina x širina podeljeno sa 2, izraženo u mm<3>). Miševi su žrtvovani ukoliko je tumor dostigao zapreminu od 500 mm<3>ili u slučaju jake bolesti. Sl. 24 primer je snažne inhibicije rasta HEK293-CLD18A2 tumorskih ćelija antitelima prema navodima. Sl. 25A i 25B pokazuju produženo preživljavanje postignuto tretmanom antitelima prema navodima, u ksenograftskom modelu ranog lečenja, uz korišćenje HEK293-CLD18A2 ćelija.

b. Kasno otpočinjanje lečenja uznapredovalih tumora koji snažno eksprimiraju CLD18A2 kod miševa

[0339] Isti model tumorskog ksenografta baziran na HEK293-CLD18A2 ćelijama, dizajniran je kao protokol za kasno otpočinjanje lečenja, nasuprot ranom lečenju koje je opisano gore. Na dan 27 posle inokulacije tumorskih ćelija, miševi su nasumično raspoređeni u testne grupe od kojih je svaka sadržala 5-6 miševa i terapija je otpočela sa 200 μg prečišćenih supernatanata hibridoma koji su sadržali mišja monoklonska antitela 43A11, 163E12 i 175D10, respektivno. Antitela su primenjivana dva puta nedeljno tokom 6 nedelja, naizmeničnim intravenskim i intraperitonealnim injektiranjem. I u ovom modelu je pokazano da antitela prema navodima inhibiraju rast tumora. Za nekoliko antitela ovo je za rezultat imalo produženo preživljavanje (Sl.

26).

c. Rano lečenje tumora koji eksprimiraju niske nivoe CLD18A2

4

[0340] SCID miševima subkutano je injektirano 2 x 10<5>ćelija DAN-G tumorske ćelijske linije, ćelijske linije infiltrirajućeg humanog adenokarcinoma pankreasa koja konstitutivno eksprimira CLD18A2 protein na niskom nivou. Tretman miševa (10 po grupi) otpočeo je 3 dana posle graftovanja tumora: 200 μg prečišćenih supernatanata hibridoma, koji su sadržali mišja monoklonska antitela 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 ili 175D10, primenjivano je dva puta nedeljno, tokom 6 nedelja, naizmeničnim intravenskim i intraperitonealnim injektiranjem. Zbog agresivnog i brzog rasta tumora pankreasne DAN-G tumorske ćelijske linije in vivo, kod miševa se razvila tumorska kaheksija i umrli su posle nekoliko dana. Iako je, zbog toga, prozor za merenje terapijskih efekata bio uzan, inhibicija rasta tumora i produženo preživljavanje posredovani antitelima prema navodima zapaženi su i u ovom modelu (Sl.27A i 27B).

d. Antitela prema navodima ne daju sporedne efekte kod miševa

[0341] Mišji CLD18A2-specifični prajmerski par (s: CTA CCA AGG GCT ATG GCG TTC, as: GCA CCG AAG GTG TAC CTG GTC) korišćen je u RT-PCR analizama za amplifikaciju cDNK poreklom iz široke lepeze normalnih tkiva miša (vidi Sl.28).

[0342] Ekspresija mišjeg CLD18A2 nije detektovana ni u jednom testiranom normalnom tkivu izuzev želuca (vidi Sl. 28). Pored toga, CLD18A2-specifično antitelo koje unakrsno reaguje sa humanim i mišjim CLD18A2, korišćeno je za imunohistohemijsku analizu ekspresije CLD18A2 u velikoj lepezi normalnih mišjih tkiva (vidi Tab. 3). Izuzev normalnog tkiva želuca, sva normalna tkiva koja su bila testirana nisu pokazala ekspresiju CLD18A2. Kao i u slučaju humanog CLD18A2, autori navoda su i za mišje ekvivalente našli da, dok ćelije površinskog epitela i dubljih kripti eksprimiraju CLD18A2 na svojoj površini, centralni vratni region je CLD18A2-negativan (vidi Sl.29 A-C). Uzevši zajedno, tkivna distribucija CLD18A2 izgleda da je identična kod čoveka i miša.

Tab. 3: Ekspresija CLD18 u normalnim tkivima miša kako je analizirano imunohistohemijom Tkivo Ekspresija CLD18

Mali mozak -Veliki mozak -Debelo crevo -Jednjak -

Srce -

Bubreg -

Jetra -

Pluća -

Limfni čvor -Jajnik -Pankreas -Skeletni mišić -Slezina -

Želudac<+>

Timus -Bešika -

[0343] Dalje su ispitivani potencijalni sporedni efekti posredovani antitelima 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10, kod miševa. Za sva ova antitela ranije je bilo pokazano FACS-analizom da reaguju sa mišjim CLD18A2, kao i sa humanim proteinom.

[0344] Nije bilo vidnih sporednih efekata zapaženih kod miševa tokom i posle tretmana ovim antitelima, a nije bilo ni bilo kakvih histomorfoloških korelata toksičnosti zapaženih u želudačnoj mukozi miševa tretiranih antitelima, u poređenju sa netretiranim (PBS-om tretiranih) miševima (vid Sliku 30).

e. Rano lečenje tumora koji snažno eksprimiraju CLD18A2 kod miševa sa himernim monoklonskim antitelima

[0345] Slično primeru 8a, ali korišćenjem himernih monoklonskih antitela, procenjeno je rano lečenje tumora koji snažno eksprimiraju CLD18A2 kod miševa sa antitelima prema navodima. Ukratko, SCID miševi su subkutano inokulisani sa 1 x 10<7>HEK293 ćelija koje stabilno eksprimiraju visoke nivoe humanog CLD18A2 (HEK293-CLD18A2). Svaka eksperimentalna grupa tretmana sastojala se od 10 miševa. Terapija miševa je počela 3 dana nakon inokulacije tumora. Dva puta nedeljno tokom 6 nedelja, naizmeničnim intravenskim i intraperitonalnim injekcijama, primenjivano je po 200 µg prečišćenih supernatanta ćelijske kulture HEK293T ćelija koje su prolazno transfektovane tako da proizvode himerna monoklonska antitela ch-163E12 ili ch-175D10 (uporediti sa primerom 9, dole). Mogla se primetiti snažna inhibicija rasta tumorskih ćelija HEK293-CLD18A2 pomoću himernih antitela prema navodima. Sl. 34 prikazuje produženje preživljavanja pomoću lečenja himernim antitelima prema navodima u ksenograftskom modelu ranog lečenja korišćenjem ćelija HEK293-CLD18A2.

f. Kasno otpočinjanje lečenja uznapredovalih tumora sa visokom ekspresijom CLD18A2 kod miševa sa himernim monoklonskim antitelima

[0346] Isti ksenograftski model tumora zasnovan na ćelijama HEK293-CLD18A2 kao što je gore opisano je dizajniran kao protokol za kasni početak terapije za razliku od ranog lečenja opisanog gore. Osmog dana nakon inokulacije tumorskih ćelija miševi su nasumično raspoređeni u test grupe od kojih je svaka sadržala 9 miševa i terapija je započeta sa 200 µg prečišćenih supernatanata ćelijske kulture ćelija HEK293T koje su prolazno transfektovane tako da proizvode himerna monoklonska antitela ch-163E12 ili ch-175D10 (uporediti sa primerom 9, dole). Antitela su davana dva puta nedeljno tokom 6 nedelja naizmenično intravenskom i intraperitonealnom injekcijom. Takođe se u ovom modelu pokazalo da himerna antitela prema navodima inhibiraju rast tumora. Kod nekoliko himernih antitela ovo je rezultiralo produženjem preživljavanja (sl.35).

9. Himerizacija antitela

a. Generisanje himernih monoklonskih antitela miš/čovek

[0347] Ukupna RNK i njena jednolančana cDNK, pripremljene su iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) čoveka i iz slezine čoveka, standardnim postupcima poznatim stručnjacima u oblasti, na primer korišćenjem RNeasy Midi Kit (Qiagen) i Superscript II reverzne transkriptaze (Invitrogen).

[0348] Konstantni region humanog kapa lakog lanca amplifikuje se na osnovu PBMC cDNK, pomoću PCR. Smisleni oligomer (SEQ ID NO:38) dodaje BamHI restrikciono mesto na 5’ kraj konstantnog regiona i menja originalnu sekvencu nukleinske kiseline 5’-CGAACT-3’ koja kodira prve dve amino-kiseline (Arg-Thr) konstantnog regiona, u 5’-CGTACG-3’, stvarajući BsiWI restrikciono mesto, bez promene aminokiselinske sekvence. Besmisleni oligomer (SEQ ID NO: 39) uključio je stop kodon i dodao NotI restrikciono mesto na 3’ kraju amplifikovanog konstantnog regiona. PCR proizvod, kao i standardni ekspresioni vektor (na primer pcDNA3.1(+), Invitrogen), redom se inkubiraju sa BamHI i NotI restrikcionim enzimima. Vektor se dodatno tretira alkalnom fosfatazom iz creva teleta, da bi se sprečila recirkulacija. Konstantni region se konačno poveže u vektor, tako da svaka naredna fuzija varijabilnog regiona ispred konstantnog regiona sada bude moguća preko HindIII restrikcionog mesta (5’-AAGCTT-3’) iz višestruko-klonirajućeg mesta preostalog vektora i preko BsiWI restrikcionog mesta (5’-CGTACG-3’) generisanog proizvodom PCR-a. Sekvenca konstantnog regiona humanog kapa lakog lanca insertovana u vektor, navedena je kao SEQ ID NO:40, aminokiselinska sekvenca humanog kapa konstantnog regiona navedena je kao SEQ ID NO:41.

[0349] Konstantni region humanog gama-1 teškog lanca amplifikovan je iz cDNK slezine PCR-om. 5’ fosforilisani smisleni oligomer (SEQ ID NO:42) stavljen je preko prirodnog ApaI restrikcionog mesta, lociranog 11 nukleotida nishodno od početka konstantnog regiona i dodato je HindIII restrikciono mesto na 5’-kraju amplifikovanog dela konstantnog regiona. 5’-fosforilisani besmisleni oligomer (SEQ ID NO: 43) uključuje stop kodon i dodaje NotI restrikciono mesto na 3’- kraju tako amplifikovanog konstantnog regiona. Tako napravljeni PCR proizvod ima tup kraj i fosforilisan je na 5’-kraju. Potvrđeno je da amplifikovani gamakonstantni region pripada potklasi IgG1, uz korišćenje PCR sa diskriminišućim besmislenim oligomerom (SEQ ID NO: 44) i sekvencionisanja. Standardni ekspresioni vektor (na primer pcDNA3.1(+)/Hygro, Invitrogen) sa rezistencijom na antibiotike (na primer higromicin) različitom od one koju ima vektor upotrebljen za ekspresiju lakog lanca (na primer neomicin), inkubiran je sa PmeI restrikcionim enzimom da bi se potpuno uklonilo višestruko klonirajuće mesto, ostavljajući tupe krajeve. Vektor se dodatno tretira alkalnom fosfatazom iz creva teleta da bi se sprečila recirkulacija. Konstantni region se konačno veže u vektor tako da svaka buduća fuzija varijabilnog regiona ispred konstantnog regiona sada bude moguća preko HindIII restrikcionog mesta (5’-AAGCTT-3’) i preko ApaI restrikcionog mesta (5’-GGGCCC-3’), oba stvorena sa PCR proizvodom. Pravilna orijentacija konstantnog regiona u vektoru, tj. pogodna za prethodeći promotor vektora, potvrđena je sekvencionisanjem. Zbog pozicije ApaI restrikcionog mesta, svaka amplifikacija varijabilnog regiona u ovu svrhu treba da uključi prvih 11 nukleotida sekvence humanog gama-1 konstantnog regiona, pored sekvence ApaI mesta. Sekvenca tako amplifikovanog konstantnog regiona humanog gama-1 teškog lanca insertovana u vektor, navedena je kao SEQ ID NO:45, aminokiselinska sekvenca tako eksprimiranog konstantnog regiona humanog gama-1 teškog lanca navedena je kao SEQ ID NO: 46.

[0350] Odgovarajuće svojim mišjim parnjacima, himerna monoklonska antitela nazvana su dodavanjem prefiksa "ch-" npr. ch-43A11, ch-163E12, ch-125E1, ch-166E2, ch-175D10, ch-45C1.

[0351] Amplifikacija mišjih varijabilnih regiona lakih i teških lanaca obavlja se u skladu sa "step-out PCR" postupkom opisanim u Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No.

6). U tu svrhu, ukupna RNK se priprema iz monoklonskih ćelijskih linija hibridoma (vidi Tab.

4), standardnim postupcima poznatim stručnjacima u oblasti, na primer korišćenjem RNeasy Mini Kit (Qiagen). Jednolančana cDNK pripremi se prema postupku "promene obrasca", takođe opisanom u Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 6, 1558). Pored (dT)30 oligomera (SEQ ID NO: 47), ona uključuje i DNK/RNK hibridni oligomer (SEQ ID NO: 48) koji služi kao 5’ adaptor za prekopčivanje obrasca tokom polimerizacije cDNK lanca. U ovom adaptorskom oligomeru, poslednja tri nukleotida su ribo- umesto dezoksiribonukleotidi. "Stepout PCR" koja sledi, koristi besmisleni oligomer usmeren ka konstantnom regionu mišjeg kapalanca ili konstantnom regionu potklasa 1, 2a ili 3 gama-lanaca (SEQ ID NO: 49 do 52, respektivno). IgG potklasa mišjeg monoklonskog antitela proizvedenog hibridoma ćelijskim linijama analizira se prethodno imunološki pomoću IsoStrip (vidi Primer 1) i pogodni besmisleni oligomer se odabere u skladu sa tim (vidi Tab. 4). Prajmerski miks koji je služio kao smisleni oligomer u "step-out PCR", sadržao je dva oligomera navedena kao SEQ ID NO: 53 i 54. Neke ćelijske linije hibridoma eksprimiraju više od jednog teškog ili lakog lanca (pored lanaca eksprimiranih ćelijskim linijama mijeloma upotrebljenih za stvaranje hibridoma). Tabela 4 zbirno prikazuje SEQ ID NO kloniranih i sekvencionisanih varijabilnih regiona lanaca mišjih antitela (SEQ ID NO: 55 do 69 i SEQ ID NO: 132 do 146) i kloniranih i sekvencionisanih lanaca himernih antitela pune dužine (SEQ ID NO: 100 do 129).

[0352] Identifikovani mišji varijabilni regioni zatim su amplifikovani PCR-om izostavljajući 5’ UTR 3’mišji konstantni region, dodajući restrikciona mesta na krajeve, što će omogućiti subkloniranje u pripremljene ekspresione vektore koji nose humane konstantne regione. Pored toga, smisleni oligomeri obezbeđuju konsenzusnu Kozak-ovu sekvencu (5’-GCCGCCACC-3’ ili 5’-AGCCACC-3’), a besmisleni oligomeri za varijabilne regione teškog lanca uključuju prvih 11 nukleotida humanog gama-1 konstantnog regiona pored ApaI restrikcionog mesta (vidi Tab. 4, SEQ ID NO: 70 do 99). Varijabilni regioni kapa-lakog lanca klonirani su korišćenjem HindIII i BsiWI restrikcionih enzima, varijabilni regioni gama-teškog lanca zahtevali su HindIII i ApaI restrikcione enzime. Varijabilni region teškog gama-lanca monoklonskog antitela 45C1 sadržao je unutrašnje HindIII restrikciono mesto - ovde je umesto toga korišćen kompatibilni BsaI enzim (vidi SEQ ID NO: 80). SEQ ID NO: 100 do 114 pokazuju sekvence nukleinskih kiselina dobijenih himerizovanih antitela (vidi Tab. 4). SEQ ID NO: 115 do 129 pokazuju aminokiselinske sekvence u skladu sa tim eksprimiranih himerizovanih antitela (vidi Tab.4).

b. Generisanje i proizvodnja himernih antitela protiv CLD18

[0353] Generisane su ćelijske linije sisara koje proizvode himerna antitela sa CLD18 specifičnošću. Ćelijske linije izvedene su iz HEK293T ćelija (ATCC CRL-11268). Jedan dan pre transfekcije, 2.5 x 10<7>ćelija zasejano je u posudi za kulturu tkiva dimenzija 14.5 cm i kultivisano u 20 ml kompletnog medijuma, ili alternativno 1x10<7>ćelija zasejano je u posudi za kulturu tkiva dimenzija 10 cm i kultivisano u 10 ml kompletnog medijuma, ili alternativno 0.6 x 10<6>ćelija zasejano je u komoricu na ploči za kulturu tkiva sa 12 komorica i kultivisano u 2-3 ml kompletnog medijuma (kompletni medijum: DMEM:F12 medijum dopunjen 10% FBS, bez

1

antibiotika). Preporučena gustina ćelija u vreme transfekcije treba da bude 90% konfluence. Neposredno pre transfekcije, medijum se zameni svežim. HEK293T ćelije transfektuju se transfekcionim reagensima, npr. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) ili alternativno Polyethylenimine (Sigma-Aldrich, 408727). Kao primer za transfekciju HEK293T ćelija, ukupna količina DNK od 110 μg ili 296 μg upotrebljena je za posude za kulturu tkiva dimenzija 14.5 cm, a odnos sredstva za transfekciju prema DNK bio je 1:2.5 i 1:12 za Lipofectamine 2000 i PEI, respektivno. 24 h posle transfekcije medijum je zamenjen GMP-pogodnim medijumom, npr. X-Vivo 15 (Cambrex) ili hemijski definisanim medijumom kao što je Pro293a (Cambrex), bez seruma. Transfektovane HEK293T ćelije koje proizvode himerna monoklonska antitela protiv CLD18, bile su kultivisane sledećih 96 h. Sakupljeni su sirovi supernatanti, sterilno filtrirani i prečišćeni na protein A-sefarozi. Koncentracija antitela određivana je pomoću BCA testa i čistoća je proveravana natrijum-dodecilsulfatnom gel-elektroforezom i Coomassie-bojenjem.

c. Vezujuće karakteristike himernih monoklonskih antitela

[0354] Vezujuća specifičnost kloniranih i generisanih himernih monoklonskih antitela na CLD18A2 analizirana je protočnom citometrijom, kako je opisano u Primeru 3. HEK293 žive ćelije koje stabilno eksprimiraju humani CLD18A2 (HEK293-CLD18A2) i HEK293 ćelije koje stabilno eksprimiraju humani CLD18A1 (SEQ ID NO: 7, 8) (HEK293-CLD18A1), inkubirane su 30 min. na 4°C, sa prečišćenim HEK293T supernatantima ćelijske kulture, koji sadrže himerna monoklonska antitela, što je praćeno inkubacijom sa APC-konjugovanim F(ab’)2fragmentom kozjeg antihumanog IgG Fcγ sekundarnog antitela i kontrabojenjem pomoću PI. Vezivanje je procenjivano protočnom citometrijom uz korišćenje BD FACSArray.

[0355] Slično tome, CLD18A2-endogeno eksprimirajuće humane tumorske ćelijske linije, na primer KATO-III i NUGC-4 ćelije, analizirane su protočnom citometrijom.

[0356] Sl. 31A i B pokazuju analize protočnom citometrijom himernih antitela ch-43A11, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2 i ch-175D10. Sva ona pokazuju prepoznavanje nativnog epitopa i ispoljavaju specifično i snažno vezivanje za CLD18A2-, ali ne i za CLD18A1-eksprimirajuće ćelije.

d. Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC)

[0357] Serum za lizu komplementom pripremljen je uzimanjem krvi od zdravih dobrovoljaca u Serum-Monovette vakutejnere (Sarstedt, Nürmbrecht, Germany), koja je zatim centrifugirana na 600 g, 20 min. Serum je sakupljen i uskladišten na -20°C. Kontrolni serum je inaktiviran zagrevanjem na 56°C, 30 min. pre skladištenja.

1 1

[0358] Himerna antitela predmetnih navoda prečišćena na protein A-sefarozi, analizirana su u pogledu svoje sposobnosti da indukuju komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC) protiv KATO-III ćelija koje endogeno eksprimiraju humani CLD18A2, kao i stabilno transfektovanih CHO-CLD18A2 ćelija. Ćelije su inkubirane sa monoklonskim antitelima ch-163E12, ch-166E2 i ch-175D10, respektivno, u finalnoj koncentraciji od 2.5 μg/ml do 35 μg/ml, 30 min. na 37°C. Ćelijama je dodat 20% humani serum u RPMI i izvršena je inkubacija sledećih 30 min. na 37°C. Posle toga, mrtve i žive ćelije razlikovane su pomoću bojenja PI u finalnoj koncentraciji od 2.5 μg/ml i procenat ćelijske lize posredovane antitelima određivan je protočnom citometrijom. Za analizu protočnom citometrijom korišćen je BD FACSArray protočni citometar (BD Biosciences, Mountain View, CA). Najmanje 10000 događaja uzeto je za analizu, uz isključivanje ćelijskog detritusa podešavanjem praga prednjeg i bočnog rasipanja (FSC/SSC). Specifična liza izračunava se prema sledećoj formuli: specifična liza = (% PI-pozitivnih ćelija u uzorku - % PI-pozitivnih ćelija u uzorku sa serumom inaktiviranim toplotom). Specifična liza posredovana CDC pokazana je za nekoliko antitela. Sva tri antitela pokazala su veliku CDC na CHO-CLD18A2 ćelijama (Slika 32). Na KATO-III ćelijama antitela ch-163E12 i ch-175D10 indukovala su snažnu CDC.

e. Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC)

[0359] FPLC-prečišćena himerna antitela prema navodima analizirana su u pogledu svoje sposobnosti da indukuju ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) protiv KATO-III ćelija koje endogeno eksprimiraju humani CLD18A2.

[0360] Humana krv uzeta od zdravih donora dva puta je razblažena u fosfatnom puferu (PBS) i krvne ćelije su nanete u sloju na Ficoll (1077 g/ml, Pharmacia). Posle centrifugiranja, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) sakupljene su iz međufaze, isprane i resuspendovane u X-Vivo-15 medijumu za kulturu dopunjenom 5% toplotom inaktiviranim humanim serumom.

[0361] 15 h pre testa, KATO-III ćelije transfektovane su luciferazom i zasejane u koncentraciji od 5 x 10<4>ćelija/komorici, na bele mikroploče.

[0362] Za test, efektorske ćelije (PBMC, pripremljene kako je gore opisano) u odnosu efektor prema cilju (E:T) od 20:1 i FPLC-prečišćena himerna antitela dodata su i inkubirana 2-3 h na 37°C, 5% CO2. Finalna koncentracija antitela u komorici bila je 50 μg/ml. Posle 2-3 h preinkubacije dodato je lucifer-žuto (BD Biosciences, San Jose USA), 1 mg/ml. Luminiscencija koja nastaje kao rezultat oksidacije lucifer-žutog luciferazom vijabilnih ćelija merena je kontinuirano do 6 h, pomoću čitača mikroploča (Infinite200, Tecan, Switzerland). Procenat

1 2

ćelijske citotoksičnosti izračunavan je korišćenjem sledeće formule: % specifične lize = 100-((izmerena luminiscencija uzorka - izmerena spontana luminiscencija)/(izmerena maksimalna luminiscencija - izmerena spontana luminiscencija) x 100), uz to što je spontana luminiscencija određena dodavanjem Triton-a X-100 (0.2% finalna koncentracija), i merenjem maksimalnog signala u odsustvu antitela.

[0363] Korišćenjem ovog testa pokazano je da monoklonska antitela ch-163E12 i ch-175D10 posreduju u jakoj ADCC na KATO-III ćelijama (Sl.33).

f. Inhibicija proliferacije

[0364] FPLC-prečišćena himerna antitela prema navodima analizirana su u pogledu svoje sposobnosti da inhibiraju rast KATO-III ćelija koje endogeno eksprimiraju humani CLD18A2.

[0365] Ciljne ćelije (KATO-III) kultivisane su u prisustvu himernih respektivni antitela (vidi inhibicija proliferacije mišjih antitela, Primer 7). Pokazano je da FPLC-prečišćena himerna antitela ch-163E12 i ch-166E2 inhibiraju proliferaciju ćelija.

10. Selekcija antitela kao vodećih kandidata za kliničku upotrebu

[0366] Idealni vodeći kandidati za kliničku upotrebu mogu pokrivati širok opseg terapijskih i dijagnostičkih primena (vidi i odeljak IV - Upotrebe i postupci prema navodima). U skladu sa navodima, obezbeđena su antitela usmerena prema CLD18-A2. Pokazano je da antitela obezbeđena u skladu sa navodima nude širok spektar osobina vezanih za specifičnost, sposobnost da indukuju CDC i ADCC i inhibiciju proliferacije ćelija koje eksprimiraju CLD18, posebno tumorskih ćelija. Štaviše, pokazano je da himerizacija antitela može da dovede do sticanja dodatnih Fc-zavisnih efektorski funkcija koje nisu prisutne kod roditeljskog mišjeg molekula. Na primer, ovde je pokazano da antitelo 175D10 sa mišjim IgG1 ne indukuje citotoksičnost zavisnu od komplementa (vidi Primer 5), dok ch-175D10 sa humanim IgG1 indukuje specifičnu lizu tumorskih ćelija koje konstitutivno eksprimiraju CLD18 (vidi Tab. 5 i Tab. 6).

[0367] Antitela obezbeđena u skladu sa predmetnim navodima mogu da se razvrstaju u određene klase prema svojim osobinama vezivanja i prema sposobnosti da posreduju u efektorskim funkcijama koje se ostvaruju na ćelijama koje eksprimiraju CLD18. Od antitela obezbeđenih prema predmetnim navodima mogu da se odaberu vodeći kandidati za kliničku primenu na osnovu njihovih funkcionalnih karakteristika. Pregled osobina odabranih mišjih i himernih antitela prema navodima dat je u Tab.5 i Tab.6, respektivno.

1

[0368] Vodeći kandidati za kliničku primenu prema navodima mogu imati jednu ili više od sledećih osobina:

a) vezivanje za humani CLD18A2 ali ne i za humani CLD18A1 (npr. 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10, i ch-43A11, ch-45C1, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2 i ch-175D10). Na primer, vidi slike 6A i 6B.

b) vezivanje za mišji CLD18A2 ali ne i za mišji CLD18A1 (npr.125E1, 163E12, 166E2 i 175D10). Na primer, vidi slike 15A i 15B.

c) vezivanje za CLD18 koji prirodno eksprimiraju tumorske ćelije (npr. 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10, i ch-45C1, ch-43A11, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2 i ch-175D10). Na primer, vidi sliku 13

d) vezivanje za CLD18 u zonama međućelijskog kontakta (npr. 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10). Na primer, vidi slike 12A i 12B.

e) posredovanje u CDC-indukovanom ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLD18 (npr.45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10, i ch-163E12 i ch-175D10). Na primer, vidi sliku 32. f) posredovanje u ADCC-indukovanom ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLD18 (npr. ch-163E12 i ch-175D10). Na primer, vidi sliku 33.

g) inhibiranje proliferacije ćelija koje eksprimiraju CLD18 (npr. 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10, i ch-163E12 i ch-166E2).

h) inhibiranje rasta tumora u ksenograftskim modelima sa ćelijama koje eksprimiraju CLD18 (npr. 43A11, 125E1, 163E12, 166E2, i 175D10). Na primer, vidi sliku 24.

i) produžavanje preživljavanja u ksenograftskim modelima sa ćelijama koje eksprimiraju CLD18 (npr. 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10). Na primer, vidi sliku 25B.

Pregled osobina za selekciju vodećeg kandidata dat kao primer

[0369]

Tabela 5: antitela miša

1 4

Tabela 6: himerna antitela

11. Analiza epitopa

[0370] Mapiranje epitopa koje prepoznaju antitela prema navodima može se izvesti kao što je detaljno opisano u "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) autora Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 i u "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 autora Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.

[0371] Ukratko, za mapiranje epitopa, skeniranje peptida može da se sprovede pomoću sintetičkih preklapajućih peptida (dobijenih SPOT-sintezom) koji potiču iz aminokiselinske sekvence antigena. Membrana sa peptidnom mapom se ispira pomoću TBS, blokira smešom 10% mleko/Tween 20-TBS i inkubira sa antitelima prema navodima, konjugovanim sa peroksidazom, preko noći na 4°C razblaženim u smeši 5% mleko/Tween 20-TBS, nakon čega sledi ispiranje pomoću Tween20-TBS i TBS, razvijanje sa npr. ECL Lumi-Light (Roche) i detekcija na Lumi Imager.

a. Molekularna analiza epitopa

[0372] Prvi ekstracelularni domen (ECD1) humanog CLD18 pokazuje visok stepen homologije između obe izoforme sa samo 8 pozicija u aminokiselinskoj sekvenci koje čine razliku (videti sl.

14).

[0373] Odabrana su monoklonska antitela koja selektivno prepoznaju samo izoformu CLD18A2 specifičnu za želudac (videti primer 1). Kako bi se odredile kritične aminokiseline među onima koje se razlikuju u obe izoforme, u CLD18 proteinima su izvršene aminokiselinske supstitucije zamenom aminokiselina u jednoj izoformi onima koje se nalaze na odgovarajućim pozicijama u drugoj izoformi. Konkretno, generisano je osam varijanti, pri čemu je u svakoj varijanti jedna od osam aminokiselina u CLD18A2 ECD1 koja se razlikuje od aminokiselinske sekvence CLD18A1 zamenjena aminokiselinom koja se nalazi na odgovarajućoj poziciji u CLD18A1. Generisane su tri varijante CLD18A2, pri čemu su u svakoj varijanti 2 aminokiseline zamenjene

1

aminokiselinama koje se nalaze na odgovarajućim pozicijama u CLD18A1: druga i treća, treća i četvrta, i četvrta i peta aminokiselina od tih 8 aminokiselina. Odgovarajućih 11 konstrukata za drugu izoformu CLD18A1 generisano je zamenom odgovarajućih aminokiselina u CLD18A1 onima koje se nalaze u CLD18A2.

[0374] Izmenjeni CLD18 proteini su generisani mutagenezom nukleinske kiseline koja kodira odgovarajuću CLD18 izoformu i kloniranjem mutantnih nukleinskih kiselina u standardni ekspresioni vektor.

[0375] Smanjeno vezivanje ispitivanih antitela za generisane varijante CLD18A2 i povećano vezivanje za generisane varijante CLD18A1 praćeno je analizom protočne citometrije. Nemodifikovani divlji tipovi CLD18A1 i CLD18A2 su takođe uključeni u analizu.

[0376] U tom cilju, HEK293 ćelije su prolazno transfektovane nukleinskim kiselinama koje kodiraju divlji tip CLD18A1 ili CLD18A2 ili njihove mutantne varijante da bi se dobile ćelije koje eksprimiraju humani CLD18A1 ili CLD18A2. Transfektanti su inkubirani sa ispitivanim antitelima prema navodima i karakteristike vezivanja su analizirane protočnom citometrijom.

[0377] Mišje monoklonsko antitelo 44 E4 D3 F11 (182-D1106-179, IgG2a, κ) prepoznaje i CLD18A1 i CLD18A2 na površini ćelije. Antitelo ch-175D10 je pokazalo snažno, specifično vezivanje za divlji tip CLD18A2 (videti tab.7). Antitelo ch-175D10 se ne vezuje za varijante 3, 4 i 6 CLD18A2 koje imaju sledeće supstitucije aminokiselina: varijanta 3: A42S; varijanta 4: N45Q; varijanta 6: E56Q. Takođe nije primećeno vezivanje za dvostruke varijante CLD18A2 koje sadrže najmanje jednu od pojedinačnih aminokiselinskih supstitucija varijanti 3 i 4.

1

b. Mapiranje epitopa putem skeniranja peptida

[0378] Kako bi se identifikovao i mapirao epitop koji prepoznaju antitela prema navodima, urađeno je skeniranje peptida pomoću sintetičkih preklapajućih peptida (dobijenih SPOT-sintezom) koji potiču iz aminokiselinske sekvence prvog ekstracelularnog domena CLD18A2. Sve sekvence antigena sintetizovao je Jerini AG, Berlin, Nemačka kao linearne 15-merne peptide (sa preklapanjem od 11 aminokiselina) koji su zatim ispitani na vezivanje sa antitelima prema navodima. Dodatno, svi cisteini linearnih peptida su supstituisani serinima kako bi se izbeglo formiranje disulfidnih veza između linearnih peptida. Himerna monoklonska antitela prema navodima su konjugovana sa peroksidazom prema uputstvima proizvođača (Pierce, EZ-Link Plus Activated Peroxidase Kit) i inkubirana sa selekcijom peptida. Specifično prepoznavanje epitopa CLD18A2 praćeno je luminiscencijom. U tab. 8 prikazan je intenzitet vezivanja himernih monoklonskih antitela ch-175D10 i ch-163E12 za sintetičke peptide koji potiču iz aminokiselinske sekvence prvog ekstracelularnog domena CLD18A2.

[0379] Oba antitela ch-175D10 i ch-163E12 prepoznaju diskontinuirani (konformacioni) epitop sa najmanje dva vezujuća mesta, što ukazuje na to da su ključni aminokiselinski ostaci raspoređeni na dva ili više vezujućih regiona koji su u primarnoj strukturi proteina razdvojeni.

1

Nakon savijanja, ovi vezujući regioni dolaze u kontakt na površini proteina da bi se formirao kompozitni epitop. Snažno vezivanje antitela ch-175D10 za peptide 1 i 7 u kojima cistein nije zamenjen, ali slabo vezivanje za peptid 7 koji sadrži serine umesto dva cisteina, ukazuje na centralnu ulogu cisteina u prepoznavanju epitopa i verovatno u savijanju proteina (sl.36). Podaci do kojih su autori navoda došli sugerišu tri različita modela savijanja proteina za prvi ekstracelularni domen CLD18A2 koji sadrži epitop za oba himerna antitela (sl. 37). Prvi model prikazan na sl. 37 predstavlja linearni peptid 7 koji sadrži oba cisteina, drugi model pokazuje intramolekularnu disulfidnu vezu koja rezultuje petljom, a treći model opisuje dva cisteina koji formiraju dve intermolekularne disulfidne veze.

12. Određivanje afiniteta antitela

[0380] Za određivanje konstanti vezivanja putem Scatchard analize, vezivanje antitela prema navodima za humani CLD18A2 može da se titrira na HEK293 ćelijama koje stabilno eksprimiraju CLD18A2 i analizira protočnom citometrijom. Humana ili himerna antitela prema navodima mogu da se detektuju "sendvič“ analizom upotrebom nekonjugovanog mišjeg-antihumanog IgG i FITC-konjugovanog kozjeg-anti-mišjeg IgG. Svaki korak inkubacije antitela može da se izvede 30 minuta na 4°C nakon čega slede 2 ispiranja u FACS puferu. Mišja antitela prema navodima mogu da se detektuju direktno sa sekundarnim kozjim-anti-mišjim antitelom konjugovanim sa FITC. Za kvantitativno određivanje vezanih antitela prema navodima može da bude neophodna detekcija antitela prema navodima "sendvič“ analizom korišćenjem sekundarnih i tercijarnih antitela uz upotrebu kompleta QIFIKIT (DAKO, Glostrup, Danska). Sa ovim kompletom broj vezanih antitela može da se odredi protočnom citometrijom prema uputstvima proizvođača. Moguće je dobiti striktno linearni odnos srednjeg intenziteta fluorescencije i vezanog IgG. Podaci mogu da se analiziraju pomoću Scatchardovog grafikona i određivanjem KD direktno iz krivih vezivanja. Konstante disocijacije mogu da se izračunaju prema Krause et al., Behring Inst. Mitt.87: 56-67, 1990 i Nauendorf et al., Int J. Cancer 100: 101-120, 2002.

[0381] Prema navodima, konstante disocijacije za antitela prema navodima su određene testom vezivanja na bazi protočne citometrije korišćenjem ćelija HEK293-CLD18A2 koje stabilno eksprimiraju CLD18A2. Scatchard analiza podataka o vezivanju ćelija dala je opseg konstanti disocijacije od 10<-8>M do 10<-9>M za mišje i himerno antitelo 175D10 i 163E12. Konstante disocijacije su izračunate prema Krause et al., Behring Inst. Mitt.87: 56-67, 1990. i Nauendorf et al., Int J Cancer 100:101-120, 2002.

13. Ortologna unakrsna reaktivnost

1

[0382] Vezivanje za humani i mišji CLD18A2 i CLD18A1 je analizirano protočnom citometrijom. HEK293 ćelije prolazno ko-transfektovane fluorescentnim markerom i mišjim CLD18A2 (SEQ ID NO: 33, 35), ili fluorescentnim markerom i mišjim CLD18A1 (SEQ ID NO: 36, 37), ili fluorescentnim markerom i humanim CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2), ili fluorescentnim markerom i humanim CLD18A1 (SEQ ID NO: 7, 8) su inkubirane sa ch-175D10, ch-163E12 i ch-125E1 tokom 30 minuta na 4°C, nakon čega su inkubirane sa sekundarnim antihumanim IgG antitelom vezanim za alofikocijanin (30 min. 4°C).

[0383] Sl. 38 prikazuje profil vezivanja za antitela ch-175D10, ch-163E12 i ch-125E1. Ova antitela predstavljaju korisno sredstvo za određivanje potencijalne toksičnosti CLD18 monoklonskih antitela u pretkliničkim studijama, kao što je opisano u primeru 3j za njihove mišje ekvivalente.

14. CLD18A2 ispoljava visok nivo ekspresije na plazma membrani u primarnim tumorima želuca i metastazama kancera želuca

[0384] Neselektivni uzorci primarnog kancera želuca i metastaza kancera želuca (Krukenbergovi tumori i limfni čvorovi) su obojeni GC182-specifičnim zečjim antiserumom. Imunohistohemiju, kao i procenu intenziteta bojenja (neg, slabo=1, umereno=2, jako=3) i proporcije tumorskih ćelija koje pokazuju bojenje plazma membrane (0-100%), uradili su profesionalni klinički patolozi; videti sl. 39. Na sl. 39, svaki krug predstavlja nezavisni uzorak tumora. Statistički značajno povećanje intenziteta bojenja primećeno je kod metastaza (p=0.034, Fišerov egzaktni test).

1

Claims (18)

Patentni zahtevi

1. Postupak za detektovanje metastatskih kancerskih ćelija kancera želuca, koji obuhvata dovođenje u kontakt uzorka dobijenog iz Krukenbergovog tumora ili uzorka dobijenog iz limfnih čvorova, i kontrolnog uzorka, sa antitelom koje se specifično vezuje za klaudin-18 splajsne varijante 2 (CLD18A2), pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela i CLD18A2, naznačen time, što povećana količina formiranja kompleksa u uzorku ukazuje na metastatske ćelije u uzorku.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što metastatske kancerske ćelije predstavljaju ćelije Krukenbergovog tumora.

3. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo i/ili konjugat koji sadrži navedeno antitelo kuplovano sa terapijskim sredstvom i farmaceutski prihvatljiv nosač, za upotrebu u postupku za lečenje metastaze kancera želuca,

naznačena time, što navedeno antitelo ima sposobnost vezivanja za CLD18A2 i posredovanja u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLD18A2 indukovanjem lize posredovane citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC) ili indukovanjem lize posredovane ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC) i/ili inhibicijom proliferacije ćelija koje eksprimiraju CLD18A2.

4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačena time, što se navedeno antitelo vezuje za klaudin-18 splajsne varijante 1 (CLD18A1) i CLD18A2.

5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačena time, što se navedeno antitelo vezuje za CLD18A2, ali ne i za CLD18A1.

6. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3-5, naznačena time, što se navedeno ubijanje ćelija i/ili inhibicija proliferacije indukuju vezivanjem navedenog antitela za CLD18A2 koji eksprimiraju navedene ćelije.

7. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3-6, naznačena time, što se navedeno ubijanje ćelija i/ili inhibicija proliferacije ne indukuju vezivanjem navedenog antitela za CLD18A1 koji eksprimiraju navedene ćelije.

8. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3-7, naznačena time, što navedeno antitelo ne indukuje CDC-posredovanu lizu navedenih ćelija.

9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3-8, naznačena time, što se navedena ADCC-posredovana liza odvija u prisustvu efektorskih ćelija odabranih iz grupe koja se sastoji od monocita, mononuklearnih ćelija, NK ćelija i PMN ćelija.

10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3-9, naznačena time, što je navedeno antitelo monoklonsko, himerno ili humanizovano antitelo, ili antigenvezujući fragment antitela.

11. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3-10, naznačena time, što je navedeno antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG2a i IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, sekretornog IgA, IgD, i IgE antitela.

12. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3-11, naznačena time, što CLD18A2 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 2.

13. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 4-12, naznačena time, što CLD18A1 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 8.

14. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3-13, naznačena time, što je navedeno antitelo specifično za ćelije kancera želuca.

15. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3-14, naznačena time, što se navedeni CLD18A2 eksprimira na površini navedenih ćelija.

16. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo koje se vezuje za CLD18A2 i/ili konjugat koji sadrži navedeno antitelo kuplovano sa terapijskim sredstvom, i farmaceutski prihvatljiv nosač, za upotrebu u postupku za lečenje metastaze kancera želuca,

naznačena time, što navedeno antitelo proizvodi klon deponovan pod pristupnim br. DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 ili DSM ACC2810.

17. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3-16, naznačena time, što je navedeno terapijsko sredstvo toksin, radioizotop, lek ili citotoksično sredstvo.

18. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3-17, naznačena time, što je navedena metastaza kancera želuca metastaza u limfnim čvorovima.