[go: up one dir, main page]

RS64001B1 - Metode za lečenje infekcije hepatitisom b - Google Patents

Metode za lečenje infekcije hepatitisom b

Info

Publication number
RS64001B1
RS64001B1 RS20230047A RSP20230047A RS64001B1 RS 64001 B1 RS64001 B1 RS 64001B1 RS 20230047 A RS20230047 A RS 20230047A RS P20230047 A RSP20230047 A RS P20230047A RS 64001 B1 RS64001 B1 RS 64001B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
oligonucleotide
hbv
nucleotides
hbsag
oligonucleotides
Prior art date
Application number
RS20230047A
Other languages
English (en)
Inventor
Martin Koser
Marc Abrams
Original Assignee
Dicerna Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=66173915&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS64001(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Dicerna Pharmaceuticals Inc filed Critical Dicerna Pharmaceuticals Inc
Publication of RS64001B1 publication Critical patent/RS64001B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A61K31/522—Purines, e.g. adenine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. hypoxanthine, guanine, acyclovir
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/05—Animals modified by non-integrating nucleic acids, e.g. antisense, RNAi, morpholino, episomal vector, for non-therapeutic purpose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Professional, Industrial, Or Sporting Protective Garments (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ova prijava se odnosi na oligonukleotide i njihovu upotrebu, posebno na upotrebu koja se odnosi na lečenje infekcije hepatitisom B.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Infekcija hroničnim virusom hepatitisa B (HBV) je značajan uzrok morbiditeta i mortaliteta širom sveta. Trenutne terapije HBV-a, kao što su analozi nukleotida, zahtevaju doživotnu terapiju za smanjenje viremije u plazmi, i uglavnom su neefikasne na duži rok. Funkcionalno izlečenje hroničnog HBV-a tradicionalno je najbolji ishod lečenja. Tehnologija RNK interferencije (RNKi) nudi potencijal za farmakološku intervenciju.
[0003] Proteini spoljašnjeg omotača zajednički su poznati kao površinski antigen hepatitisa B (HBsAg). HBsAg se sastoji od tri srodna polipeptida nazvana S, M i L kodirana preklapajućim otvorenim okvirima čitanja (ORF). Najmanji protein omotača je S sa 226 aminokiselina, nazvan S-ORF. M i L se proizvode iz mesta uzvodno od inicijacije translacije i dodaju 55 odnosno 108 aminokiselina, respektivno, S. HBV S, M i L glikoproteini se nalaze u virusnoj ovojnici netaknutih, infektivnih HBV viriona, nazvanih Daneove čestice, i sve tri se proizvode i izlučuju u velikom višku koji formira neinfektivne subvirusne sferične i filamentozne čestice (obe se nazivaju čestice mamci) koje se nalaze u krvi hroničnih HBV pacijenata. Veruje se da obilje HBsAg na površini čestica mamaca inhibira humoralnu imunost i spontani klirens kod pacijenata sa hroničnom HBV infekcijom (CHB).
[0004] WO 2016/077321 odnosi se na RNKi agense, npr. dvolančane RNKi agense, koji ciljaju genom virusa hepatitisa B (HBV), i metode korišćenja takvih RNKi agenasa za inhibiciju ekspresije jednog ili više HBV gena i metode lečenja subjekata koji imaju HBV infekciju i/ili poremećaj povezan sa HBV, npr. hronična infekcija hepatitisom B.
[0005] Huang, 2017, Molekularna terapija-nukleinske kiseline, tom 6, strane 116-132 otkriva pretklinički i klinički napredak terapeutskih agenasa nukleinskih kiselina koji sadrže GalNAc.
[0006] WO 2016/183009 odnosi se na metode i kompozicije za specifičnu inhibiciju antitrombina 3 (AT3) dvolančanom RNK.
KRATAK SAŽETAK PRONALASKA
[0007] Ovaj pronalazak obezbeđuje oligonukleotid za smanjenje ekspresije mRNK površinskog antigena virusa hepatitisa B (HBsAg), pri čemu oligonukleotid sadrži smisleni lanac koji formira dupleks region sa antismislenim lancem, pri čemu se:
smisleni lanac sastoji od sekvence kao što je navedeno u GACAAAAAUCCUCACAAUAAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 9) i koji sadrži
2'-fluoro modifikovane nukleotide na pozicijama 3, 8-10, 12, 13 i 17,
2'-O-metil modifikovane nukleotide na pozicijama 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26 i 31-36, i jednu fosforotioatnu internukleotidnu vezu između nukleotida na pozicijama 1 i 2, pri čemu je svaki od nukleotida -GAAA- sekvence na smislenom lancu konjugovan sa monovalentnim GalNac ostatkom, pri čemu -GAAA- sekvenca sadrži strukturu:
a antismisleni lanac se sastoji od sekvence koja je navedena u UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 6) i sadrži
2'-fluoro modifikovane nukleotide na pozicijama 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 14, 16 i 19,
2'-O-metil modifikovane nukleotide na pozicijama 1, 4, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 18 i 20-22, i pet fosforotioatnih internukleotidnih veza između nukleotida na pozicijama 1 i 2, između nukleotida 2 i 3, između nukleotida na pozicijama 3 i 4, između nukleotida na pozicijama 20 i 21, i između nukleotida na pozicijama 21 i 22, pri čemu 5'-nukleotid antismislenog lanca ima sledeću strukturu:
[0008] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži oligonukleotid prema pronalasku.
[0009] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje in vitro postupak smanjenja ekspresije površinskog antigena virusa hepatitisa B (HBV) (HBsAg) u ćeliji, postupak koji obuhvata isporuku u ćeliju oligonukleotida prema pronalasku ili kompozicije prema pronalasku.
[0010] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje oligonukleotid prema pronalasku ili kompoziciju prema pronalasku za upotrebu u postupku lečenja HBV infekcije kod ispitanika.
[0011] Aspekti otkrića se odnose na poboljšane kompozicije na bazi oligonukleotida i srodne metode za lečenje HBV infekcije kod ispitanika. Otkriće se odnosi na razvoj moćnih oligonukleotida koji proizvode dugotrajno uništavanje ekspresije površinskog antigena HBV (HBsAg). Oligonukleotid indukuje RNK interferenciju (RNKi) posredovano prepoznavanje i uništavanje mRNK koja kodira sve oblike HBsAg u hepatocitima. Ovo uključuje protein preveden iz virusne RNK transkribovane i sa cccDNK i sa HBV DNK koja je integrisana u genom domaćina. Ovde su dati oligonukleotidi dizajnirani da ciljaju na ekspanzivni skup HBsAg transkripata kodiranih HBV genomima u svim poznatim genotipovima. Utvrđeno je da oligonukleotidi koji su ovde otkriveni koji ciljaju HBsAg transkripte u hepatocitima mogu proizvesti stabilno smanjenje ekspresije HBsAg sa visokom specifičnošću koja opstaje u dužem vremenskom periodu (npr. duže od 7 nedelja do nekoliko meseci) nakon davanja ispitaniku (videti, na primer, primere 1 i 3). Otkriveno je da ciljanje ekspresije HBsAg korišćenjem oligonukleotida opisanih ovde dovodi do smanjenja pregenomske RNK (pgRNK) i drugih intermedijara životnog ciklusa virusa. Takođe je otkriveno da određeni RNAi oligonukleotidi koji su ovde otkriveni mogu da sruše HBsAg mRNK transkripte koji potiču ili iz cccDNK ili integrisanog virusa. Otkriveno je da ciljanje ekspresije HBsAg pomoću oligonukleotida otkrivenih ovde smanjuje ekspresiju svih HBV proteina (sa izuzetkom HBx), naime HBcAg, HBeAg i HBV polimeraze, što dovodi do citosolnog zadržavanja proteina jezgra HBV. Štaviše, klirens cirkulišućeg HBsAg koji je rezultat razbijanja mRNK primenom metoda koje su ovde date je klinički povoljan jer omogućava razbijanje imunološke tolerancije HBV uzrokovane visokim nivoima cirkulišućeg HBsAg kod pacijenata sa CHB. Veruje se da je reaktivacija aktivnosti imunsksog sistema protiv HBV infekcije kamen temeljac za postizanje funkcionalnog izlečenja, definisanog kao trajni seroklirens HBsAg.
[0012] Prethodni rad je pokazao da se upotrebom kombinacije RNKi agenasa koji ciljaju na više različitih HBV gena (naime, S, C, P i X gene), ili u nekim slučajevima ciljajući samo transkripte X gena, postiže efikasna inhibicija HBV replikacije i ekspresija gena. Međutim, rezultati dati ovde pokazuju da se upotrebom RNKi oligonukleotida koji ciljaju samo na HBsAg transkripte takođe postiže efikasna inhibicija replikacije HBV i ekspresije gena, što obezbeđuje novi terapeutski pristup lečenju HBV infekcija. Pored direktnog efekta utišavanja virusnih RNK, prekursori HSB(s)-219 sprečavaju lokalizaciju antigena jezgra HBV (HBcAg) u nukleusu. Važno je da ciljanje HBV-X ili oba gena istovremeno ne sprečava lokalizaciju HBcAg u nukleusu. Pretklinički podaci snažno sugerišu da inhibicija lokalizacije u jezgru nukleusa izazvana terapijom RNKi ciljanja na S rezultira značajno poboljšanim trajanjem supresije HBsAg. Posebno se pokazalo da nedostatak lokalizacije HBcAg u nukleusu kod pacijenata korelira sa povoljnim odgovorima na antivirusnu terapiju.
[0013] Neki aspekti sadašnjeg otkrića obezbeđuju oligonukleotide za smanjenje ekspresije mRNK površinskog antigena virusa hepatitisa B (HBsAg), pri čemu oligonukleotid sadrži antismisleni lanac dužine od 19 do 30 nukleotida, pri čemu antismisleni lanac sadrži region komplementarnosti sekvenci HBsAg mRNK kako je navedeno u ACAANAAUCCUCACAAUA (SEQ ID NO: 1).
[0014] Ovde opisani oligonukleotid može dalje da sadrži smisleni lanac dužine od 19 do 50 nukleotida, pri čemu smisleni lanac formira dupleks region sa antismislenim lancem. Ovde opisani smisleni lanac može sadržati region komplementarnosti sa sekvencom kako je navedeno u UUNUUGUGAGGAUUN (SEQ ID NO: 2). Takođe ovde opisani smisleni lanac može sadržati region komplementarnosti sa sekvencom kao što je navedeno u 5'-UUAUUGUGAGGAUUNUUGUC (SEQ ID NO: 3).
[0015] Ovde opisani antismisleni lanac može da sadrži sekvencu kako je navedeno u UUAUUGUGAGGAUUNUUGUCGG (SEQ ID NO: 4). Takođe ovde opisani antismisleni lanac može da se sastoji od sekvence koja je navedena u UUAUUGUGAGGAUUCUUGUCGG (SEQ ID NO: 5). Antismisleni lanac ovog pronalaska se sastoji od sekvence koja je navedena u UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 6).
[0016] Ovde opisani smisleni lanac može da sadrži sekvencu kako je navedeno u ACAANAAUCCUCACAAUAA (SEQ ID NO: 7). Takođe opisan ovde smisleni lanac može da sadrži sekvencu kao što je navedeno u GACAANAAUCCUCACAAUAAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 8). Smisleni lanac ovog pronalaska se sastoji od sekvence koja je navedena u GACAAAAAUCCUCACAAUAAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 9). Takođe opisan ovde smisleni lanac se može sastojati od sekvence koja je navedena u GACAAGAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 10).
[0017] Drugi aspekti ovog otkrića obezbeđuju oligonukleotide za smanjenje ekspresije mRNK površinskog antigena virusa hepatitisa B (HBsAg), pri čemu oligonukleotid sadrži smisleni lanac koji formira dupleks region sa antismislenim lancem, pri čemu smisleni lanac sadrži sekvencu kao što je navedeno u GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 9), pri čemu antismisleni lanac sadrži sekvencu kako je navedeno u UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 6), pri čemu svaki antismisleni i smisleni lanac sadrži jedan ili više 2'-fluoro i 2'-O-metil modifikovanih nukleotida i najmanje jednu fosforotioatnu vezu, pri čemu 4'-ugljenik šećera iz 5' -nukleotid antismislenog lanca sadrži fosfatni analog, i pri čemu je smisleni lanac konjugovan sa jednim ili više N-acetilgalaktozamin (GalNAc) ostataka.
[0018] Ovde su dalje opisani oligonukleotidi za smanjenje ekspresije mRNK površinskog antigena virusa hepatitisa B (HBsAg), pri čemu oligonukleotid sadrži smisleni lanac koji formira dupleks region sa antismislenim lancem, pri čemu: smisleni lanac sadrži sekvencu kao što je navedeno u GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 9) i sadrži 2'-fluoro modifikovane nukleotide na pozicijama 3, 8-10, 12, 13 i 17, 2'-O-metil modifikovane nukleotide na pozicijama 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18 -26, i 31-36, i najmanje jednu fosforotioatnu internukleotidnu vezu, pri čemu je smisleni lanac konjugovan sa jednim ili više N-acetilgalaktozamin (GalNAc) ostataka; a antismisleni lanac sadrži sekvencu kako je navedeno u UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 6) i sadrži 2'-fluoro modifikovane nukleotide na pozicijama 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 14, 16 i 19, 2'-O-metil modifikovane nukleotide na pozicijama 1, 4, 6, 9 , 11, 13, 15, 17, 18 i 20-22, i najmanje tri fosforotioatne internukleotidne veze, pri čemu 4'-ugljenik šećera 5'-nukleotida antismislenog lanca sadrži fosfatni analog.
[0019] Smisleni lanac pronalaska obuhvata fosforotioatnu vezu između nukleotida na pozicijama 1 i 2.
[0020] Antismisleni lanac pronalaska obuhvata pet fosforotioatnih veza između nukleotida na pozicijama 1 i 2, između nukleotida na pozicijama 2 i 3, između nukleotida na pozicijama 3 i 4, između nukleotida na pozicijama 20 i 21 i između nukleotida na pozicijama 21 i 22.
[0021] 5'-nukleotid antismislenog lanca pronalaska ima sledeću strukturu:
[0022] Ovde opisani jedan ili više nukleotida -GAAA- sekvence na smislenom lancu mogu biti konjugovani sa monovalentnim GalNac ostatkom.
[0023] Svaki od nukleotida -GAAA- sekvence na smislenom lancu pronalaska je konjugovan sa monovalentnim GalNac ostatkom. Ovde opisan, -GAAA- motiv može da sadrži strukturu:
pri čemu:
L predstavlja vezu, klik hemijsku ručku ili linker od 1 do 20, uključujući, uzastopno, kovalentno povezane atome po dužini, izabranih iz grupe koju čine supstituisani i nesupstituisani alkilen, supstituisani i nesupstituisani alkenilen, supstituisani i nesupstituisani alkinilen, nesupstituisani heteroalkilen, supstituisani i nesupstituisani heteroalkenilen, supstituisani i nesupstituisani heteroalkinilen, i njihove kombinacije; i
X je O, S ili N.
[0024] Opisan ovde, L može da bude acetalni linker Ovde opisano, X može biti O.
[0025] -GAAA- sekvenca pronalaska sadrži strukturu:
[0026] Ovde opisan smisleni lanac može sadržati na svom 3'-kraju matičnu petlju prikazanu kao: S1-LS2, pri čemu je S1je komplementaran S2, i pri čemu L formira petlju između S1i S2dužine do 6 nukleotida. L je tetrapetlja. Ovde opisano L može da formira petlju između S1i S2dužine 4 nukleotida. L sadrži sekvencu navedenu kao GAAA. Ovde opisanih do 4 nukleotida L matične petlje može svaki ponaosob biti konjugovan sa zasebnim GalNAc.
[0027] Ovde opisani oligonukleotid može da sadrži najmanje jedan modifikovani nukleotid. Ovde opisani modifikovani nukleotid može da sadrži 2'-modifikaciju. Ovde opisana 2'-modifikacija može biti modifikacija izabrana između: +-2'-aminoetila, 2'-fluoro, 2'-O-metila, 2'-O-metoksietila i 2'-dezoksi-2'-fluoro-β-d-arabinonukleinske kiseline. Takođe ovde opisani svi nukleotidi oligonukleotida mogu biti modifikovani nukleotidi. Ovde opisani oligonukleotid može da sadrži najmanje jednu modifikovanu internukleotidnu vezu. Ovde opisana najmanje jedna modifikovana internukleotidna veza može biti fosforotioatna veza.4'-ugljenik šećera 5'-nukleotida antismislenog lanca sadrži fosfatni analog.
[0028] Ovde opisan najmanje jedan nukleotid oligonukleotida može biti konjugovan sa ciljajućim ligandom. Ciljajući ligand pronalaska je N-acetilgalaktozamin (GalNAc) ostatak.
[0029] Ovde su dalje obezbeđene kompozicije koje sadrže oligonukleotid pronalaska i kontrajon, i kompozicije koje sadrže oligonukleotid pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0030] Drugi aspekti ovog pronalaska obezbeđuju in vitro metode za smanjenje ekspresije površinskog antigena virusa hepatitisa B (HBV) u ćeliji, postupak koji sadrži isporuku u ćeliju oligonukleotida ili kompozicije pronalaska. U nekim otelotvorenjima, ćelija je hepatocit. Ovde opisana ćelija može biti in vivo. Ćelija pronalaska je in vitro.
[0031] Drugi aspekti sadašnjeg otkrića obezbeđuju metode lečenja infekcije virusom hepatitisa B (HBV) kod ispitanika, pri čemu postupak obuhvata davanje ispitaniku oligonukleotida ili kompozicije opisane ovde.
[0032] Takođe su opisane metode lečenja HBV infekcije kod ispitanika, metoda koja se sastoji od davanja ispitaniku RNKi oligonukleotida koji selektivno cilja HBsAg mRNK, pri čemu se RNKi oligonukleotid primenjuje u odsustvu lečenja sa RNKi oligonukleotidom koji cilja na ne-površinski antigen koji kodira HBV mRNK transkript. Metode lečenja infekcije HBV kod ispitanika su takođe opisane, metoda koja se sastoji od davanja ispitaniku RNKi oligonukleotida koji selektivno cilja HBsAg mRNK, pri čemu se ispitaniku ne daje RNK i oligonukleotid koji selektivno cilja HBxAg mRNK transkript. Ovde opisani postupak može dalje da obuhvata davanje ispitaniku efektivne količine entekavira.
1
[0033] Drugi aspekt ovog otkrića obezbeđuje oligonukleotide za smanjenje ekspresije mRNK površinskog antigena virusa hepatitisa B (HBsAg), pri čemu oligonukleotid sadrži smisleni lanac koji formira dupleks region sa antismilslenim lancem, pri čemu:
smisleni lanac sadrži sekvencu kako je navedeno u GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 9) i sadrži 2'-fluoro modifikovane nukleotide na pozicijama 3, 8-10, 12, 13 i 17, 2'-O-metil modifikovane nukleotide na pozicijama 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18 -26, i 31-36, i jednu fosforotioatnu internukleotidnu vezu između nukleotida na pozicijama 1 i 2, pri čemu je svaki od nukleotida -GAAA- sekvence na smislenom lancu konjugovan sa monovalentnim GalNac ostatkom, pri čemu se -GAAA- sekvenca sastoji od strukture:
a antismisleni lanac sadrži sekvencu kako je navedeno u UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 6) i sadrži 2'-fluoro modifikovane nukleotide na pozicijama 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 14, 16 i 19, 2'-O-metil modifikovane nukleotide na pozicijama 1, 4, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 18 i 20-22 i pet fosforotioatnih internukleotidnih veza između nukleotida 1 i 2, 2 i 3, 3 i 4, 20 i 21 i 21 i 22, pri čemu 4'- ugljenik šećera 5'-nuklotida antismislenog lanca ima sledeću strukturu:
[0034] Takođe je obezbeđena kompozicija koja sadrži oligonukleotid. U nekim otelotvorenjima, kompozicija dalje sadrži Na+ protivjone.
[0035] Takođe su obezbeđene in vitro metode smanjenja ekspresije površinskog antigena virusa hepatitisa B (HBV) u ćeliji, metoda koja sadrži isporuku u ćeliju oligonukleotida ili kompozicije. U nekim otelotvorenjima, ćelija je hepatocit. Ovde opisana ćelija može biti in vivo. Ćelija pronalaska je in vitro.
[0036] Opisani su postupci lečenja infekcije virusom hepatitisa B (HBV) kod ispitanika, pri čemu postupak sadrži davanje ispitaniku oligonukleotida ili kompozicije. Ovde opisani postupak može dalje da sadrži davanje ispitaniku efektivne količine entekavira.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0037] Prateći crteži, koji su uključeni i čine deo ove specifikacije, ilustruju određena otelotvorenja i zajedno sa pisanim opisom služe da obezbede neograničavajuće primere određenih aspekata kompozicija i metoda koje su ovde otkrivene.
SL. 1 prikazuje primer RNKi ciljnog mesta na šematskom prikazu organizacije genoma HBV. SL. 2 prikazuje procenu pojedinačne doze oligonukleotida za smanjenje ekspresije HBsAg kod HDI miševa.
SL. 3 je grafički prikaz nivoa HBsAg u plazmi u određenom vremenskom periodu tokom određenog režima doziranja sa oligonukleotidom koji cilja na HBsAg. Kao što je prikazano u ovom primeru, oligonukleotid je pokazao pretkliničku potenciju i održavao je snižene nivoe dugo nakon perioda doziranja.
SL. 4 prikazuje grafikone koji prikazuju rezultate mapiranja HBsAg u HeLa ćelijama korišćenjem reporterskog testa. Nemodifikovana siRNK koja cilja poziciju 254 HBV genoma je korišćena kao pozitivna kontrola u navedenim koncentracijama. Komercijalno dostupna utišavač siRNK proizvođača Thermo Fisher služila je kao negativna kontrola za ove eksperimente. Trake grešaka predstavljaju SEM.
SL. 5 prikazuje poređenje očuvanja genotipa koje pokazuje da projektovana neusklađenost u oligonukleotidu koji cilja HBsAg, HBV-219, povećava pokrivenost svih HBV genotipova. SL. Slika 6 ilustruje vektor projektovan za psiCHECK2 reporter testove koristeći HBV genotip A kao sekvencu prototipa.
SL. 7 prikazuje nekoliko primera oligonukleotida projektovanih da procene efekte uvođenja nepodudaranja. Oligonukleotidne sekvence za izvorne i neusklađene niti su prikazane poravnate i sa neusklađenim pozicijama u kutijama. Odgovarajuće reporterske sekvence koje se koriste u psiCHECK2 reporterskim testovima su dalje prikazane.
SL. 8 prikazuje dijagram titracije jedne doze za oligonukleotid procenjen u studijama nepodudaranja, koji pokazuje da se nepodudaranje u lancu vodiča toleriše in vivo.
SL. 9 prikazuje dijagram titracije doze in vivo koji pokazuje da inkorporacija nepodudaranja u oligonukleotidu koji cilja HBsAg ne utiče negativno na in vivo potenciju.
SL. 10 prikazuje primer oligonukleotida koji cilja na HBsAg (HBV(s)-219) sa hemijskim modifikacijama i u dupleks obliku. Tamnija nijansa označava 2'-O-metil ribonukleotid.
Svetlija nijansa ukazuje na 2'-fluoro-dezoksiribonukteotid.
SL. 11A prikazuje rezultate imunohistohemijskog bojenja koji otkrivaju subćelijsku distribuciju antigena jezgra HBV (HBcAg) u hepatocitima.
SL. 11B prikazuje rezultate sekvenciranja RNK koje mapira otkrivene sekvence RNK transkripta u odnosu na HBV pgRNK.
SL. 12A prikazuje vremenski tok ekspresije HBsAg mRNK nakon lečenja prekursorom HBV(s)-219P2 oligonukleotida HBV(s)-219 koji cilja HBsAg mRNK u poređenju sa kontrolom vehikuluma i RNKi oligonukleotidom koji cilja HBxAg iRNK u hidrodinamičkom modelu iRNK (HDI) HBV.
SL. 12B prikazuje vremenski tok ekspresije HBsAg mRNK nakon lečenja prekursorom HBV(s)-219P2 oligonukleotida HBV(s)-219 koji cilja HBsAg mRNK u poređenju sa kontrolom vehikuluma i RNKi oligonukleotidom koji cilja HBxAg mRNK u modelu AAV-HBV.
SL. 13 prikazuje rezultate imunohistohemijskog bojenja koji pokazuju subćelijsku distribuciju HBcAg u hepatocitima dobijenim iz modela AAV-HBV i HDI modela HBV nakon lečenja HBV(s)-219 oligonukleotidom koji cilja HBsAg mRNK u poređenju sa kontrolom vehikuluma i RNKi oligonukleotidom koji cilja HBxAg mRNK (GalXC-HBVX).
1
SL. 14A-14D pokazuju antivirusnu aktivnost HBV(s)-219 prekursora 1 (HBV(s)-219 P1) u modelu PXB-HBV. Kohorte od 9 miševa dobila je 3 nedeljne doze od 0 ili 3 mg/kg HBV(s)-219P1 u slanom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS rastvor), koje su im date potkožno. Šest miševa iz svake kohorte je analizirano ne-terminalnim kontrolnim krvarenjem mandibule u svakoj od naznačenih vremenskih tačaka (Sl.14A i 14B) za serumski HBsAg i serumsku HBV DNK. Dana 28 (počevši od prve doze HBV(s)-219P1), svi preostali miševi su eutanazirani i sakupljene su biopsije jetre za HBV DNK jetre (Sl.14C) i cccDNK jetre (Sl.
14D) pomoću RT-qPCR.
SL. 15A-15C pokazuju da prekursor 2 (HBV(s)-219P2) HBV(s)-219 pojačava antivirusnu aktivnost entekavira. U modelu hidrodinamičke injekcije HBV miša (HDI), pojedinačna doza HBV(s)-219P2 je davana miševima subkutano prvog dana, nakon čega je sledila dnevna oralna doza od 500 ng/kg entekavira (ETV) tokom 14 dana. Cirkulaciono virusno opterećenje (HBV DNK) je mereno qPCR testom (SL.15A). Nivo HBsAg u plazmi je meren ELISA testom (SL.15B). Nivoi HBV mRNK i pgRNK u jetri mereni su qPCR testom (SL.15C). Rezultati pokazuju jasne dodatne efekte kombinovane terapije. Sama ETV terapija ne pokazuje efikasnost protiv cirkulišućih HBsAg ili virusnih RNK jetre. Kodoziranje ETV ne utiče na antivirusnu aktivnost HBV(s)-219P2 mereno pomoću HBsAb ili HBV RNK.
„BLOD“ znači „ispod granice detekcije“ (eng. below limit of detection).
SL. 16A-16B prikazuju poređenje aktivnosti supresije HBsAg GalNac konjugovanog oligonukleotida koji cilja na S antigen (HBV(s)-219P2) ili X antigen (označen kao GalXC-HBVX). Rezultat pokazuje da HBVS-219P2 potiskuje HBsAg duže nego GalXC-HBVX ili ekvimolarna kombinacija oba RNKi agensa. SL.16A prikazuje lokaciju RNKi ciljnog mesta u HBV genomu utiče na kinetiku oporavka HBsAg kod miševa koji eksprimiraju HBV. SL.
16B prikazuje nivo HBsAg u plazmi 2 nedelje nakon doze (levi panel) i 9 nedelja nakon doze (desni panel), što ukazuje da ciljanje na region kodiranja HBVX, bilo sam ili u kombinaciji sa HBV(s)-219P2, rezultira kraćim trajanjem aktivnost. Prikazani su pojedinačni podaci o životinjama. Nekoliko tačaka podataka (najsvetliji sivi krugovi) bilo je ispod granice detekcije.
SL. 17A-17C pokazuju subćelijsku lokaciju antigena jezgra HBV (HBcAg) kod miševa koji eksprimiraju HBV koji su lečeni sa HBV(s)-219P2, GalXC-HBVX ili kombinacijom 1:1. SL.
17A prikazuje reprezentativne hepatocite u presecima jetre dobijene u nedeljama 1, 2, 6, 9 i 13 nakon primene i obojene na HBcAg. SL.17B prikazuje procenat HBcAg-pozitivnih ćelija sa nuklearnim bojenjem u svakoj životinji (n=3/grupi, 50 ćelija prebrojano po životinji, 2 nedelje nakon doziranja). Alternativne sekvence su projektovane su i testirane na ciljanje unutar X i S otvorenih okvira čitanja. SL. Slika 17C prikazuje subćelijsku distribuciju HBcAg u hepatocitima dobijenim 2, 3 i 9 nedelja nakon primene alternativnog RNKi oligo koji cilja ili S antigen i X antigen.
SL. 18 prikazuje informacije o dozi po kohortama za studiju osmišljenu da proceni bezbednost i podnošljivost HBV(s)-219 kod zdravih pacijenata i terapeutsku efikasnost HBV(s)-219 kod HBV pacijenata.
SL. 19A-19B prikazuje hemijsku strukturu HBV(s)-219 i HBV(s)-219P2. (SL.19A) Hemijska struktura za HBV(s)-219. (SL.19B) Hemijska struktura za HBV(s)-219P2.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
[0038] Prema nekim aspektima, pronalazak obezbeđuje potentne oligonukleotide koji su efikasni za smanjenje ekspresije HBsAg u ćelijama, posebno ćelijama jetre (npr. hepatocitima) za lečenje infekcija HBV. Oligonukleotidi koji ciljaju HBsAg iz pronalaska koji su ovde dati projektovani su za isporuku odabranim ćelijama ciljnog tkiva (e.g., hepatociti jetre) za lečenje HBV infekcije u tim tkivima. Shodno tome, u srodnim aspektima, pronalazak obezbeđuje metode lečenja infekcije HBV koje uključuju selektivno smanjenje ekspresije gena površinskog antigena HBV u ćelijama (npr. ćelije jetre).
[0039] Dalji aspekti obelodanjivanja, uključujući opis definisanih termina, dati su u nastavku.
I. Definicije
[0040] Približno: Kako se ovde koristi, termin „približno“ ili „otprilike“ ili „oko“, primenjen na jednu ili više vrednosti od interesa, odnosi se na vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. U određenim otelotvorenjima, termin „približno“ ili „otprilike“ ili „oko“ odnosi se na opseg vrednosti koje spadaju u okvir od 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ili manje u bilo kom smeru (veće ili manje od) navedene referentne vrednosti osim ako nije drugačije navedeno ili na drugi način očigledno iz konteksta (osim kada bi takav broj premašio 100% moguće vrednosti).
1
[0041] Davanje: Kako se ovde koristi, termin "davanje" označava obezbeđivanje supstance (npr. oligonukleotid) ispitaniku na način koji je farmakološki koristan (npr. za lečenje stanja kod ispitanika).
[0042] Azialoglikoproteinski receptor (ASGPR): Kako se ovde koristi, termin "azialoglikoproteinski receptor" ili "ASGPR" se odnosi na bipartitni lektin C-tipa formiran od glavne 48 kDa (ASGPR-1) i manje podjedinice od 40 kDa (ASGPR-2). ASGPR je primarno eksprimiran na sinusoidnoj površini ćelija hepatocita i ima glavnu ulogu u vezivanju, internalizaciji i naknadnom čišćenju cirkulišućih glikoproteina koji sadrže ostatke galaktoze ili N-acetilgalaktozamina (azialoglikoproteine) na krajevima.
[0043] Komplementarno: Kako se ovde koristi, termin "komplementaran" se odnosi na strukturni odnos između dva nukleotida (npr. na dve suprotstavljene nukleinske kiseline ili na suprotstavljene regione jednog lanca nukleinske kiseline), ili između dve sekvence nukleotida, koji dozvoljavaju da dva nukleotida, ili dve sekvence nukleotida, formiraju parove baze jedna sa drugom. Na primer, purinski nukleotid jedne nukleinske kiseline koji je komplementaran pirimidinskom nukleotidu suprotstavljene nukleinske kiseline može da se upari baza zajedno formiranjem vodoničnih veza jedna sa drugom. U nekim otelotvorenjima, komplementarni nukleotidi mogu da vrše uparivanje baze po modelu Watson-Crick ili na bilo koji drugi način koji omogućava formiranje stabilnih dupleksa. U nekim otelotvorenjima, dve nukleinske kiseline mogu imati regione više nukleotida koji su međusobno komplementarni tako da formiraju regione komplementarnosti, kao što je ovde opisano.
[0044] Dezoksiribonukleotid: Kako se ovde koristi, termin "dezoksiribonukleotid" se odnosi na nukleotid koji ima vodonik umesto hidroksila na 2' poziciji svog pentoznog šećera u poređenju sa ribonukleotidom. Modifikovani dezoksiribonukleotid je dezoksiribonukleotid koji ima jednu ili više modifikacija ili supstitucija atoma koji nisu na 2' poziciji, uključujući modifikacije ili supstitucije u šećeru, fosfatnoj grupi ili bazi ili šećera, fosfatne grupe ili baze.
[0045] Dvolančani oligonukleotid: Kako se ovde koristi, izraz "dvolančani oligonukleotid" se odnosi na oligonukleotid koji je u suštini u obliku dupleksa. U nekim otelotvorenjima, komplementarno uparivanje baza dupleks regiona dvolančanog oligonukleotida se formira između antiparalelnih sekvenci nukleotida kovalentno odvojenih lanaca nukleinske kiseline.
1
U nekim otelotvorenjima, komplementarno uparivanje baza dupleks regiona(a) dvolančanog oligonukleotida se formira između antiparalelnih sekvenci nukleotida lanaca nukleinske kiseline koji su kovalentno vezani. U nekim otelotvorenjima, komplementarno uparivanje baza dupleks regiona(a) dvolančanog oligonukleotida se formira od jednog lanca nukleinske kiseline koji je presavijen (npr. preko ukosnice) da bi se obezbedile komplementarne antiparalelne sekvence nukleotida koje se uparuju zajedno. U nekim otelotvorenjima, dvolančani oligonukleotid sadrži dva kovalentno odvojena lanca nukleinske kiseline koji su u potpunosti dupleksirani jedan sa drugim. Međutim, u nekim otelotvorenjima, dvolančani oligonukleotid sadrži dva kovalentno odvojena lanca nukleinske kiseline koji su delimično dupleksirani, npr. koji imaju prepuste na jednom ili oba kraja. U nekim otelotvorenjima, dvolančani oligonukleotid sadrži antiparalelne sekvence nukleotida koje su delimično komplementarne, i prema tome, mogu imati jedno ili više nepodudaranja, što može uključivati unutrašnje nepodudarnosti ili krajnje nepodudarnosti.
[0046] Dupleks: Kako se ovde koristi, termin "dupleks" u odnosu na nukleinske kiseline (npr. oligonukleotidi), odnosi se na strukturu formiranu uparivanjem komplementarnih baza dve antiparalelne sekvence nukleotida.
[0047] Ekscipijent: Kako se ovde koristi, izraz "ekscipijent" se odnosi na ne-terapeutsko sredstvo koje može biti uključeno u kompoziciju, na primer, da obezbedi ili doprinese željenoj konzistenciji ili efektu stabilizacije.
[0048] Hepatocit: Kako se ovde koristi, termin "hepatocit" ili "hepatociti" se odnosi na ćelije parenhimskog tkiva jetre. Ove ćelije čine približno 70-85% mase jetre i proizvode serumski albumin, fibrinogen i protrombinsku grupu faktora zgrušavanja (osim faktora 3 i 4). Markeri za ćelije hepatocitne loze mogu uključivati, ali nisu ograničeni na: transtiretin (Ttr), glutamin sintetazu (Glul), nuklearni faktor hepatocita 1a (Hnf1a) i nuklearni faktor hepatocita 4a (Hnf4a). Markeri za zrele hepatocite mogu uključivati, ali nisu ograničeni na: citokrom P450 (Cip3a11), fumarilacetoacetat hidrolazu (Fah), glukozu 6-fosfat (G6p), albumin (Alb) i OC2-2F8. vidi, na primer, Much et al., (2013), Nature, 494(7436): 247-250.
[0049] Virus hepatitisa B: Kako se ovde koristi, termin "virus hepatitisa B" ili "HBV" odnosi se na mali DNK virus koji pripada porodici Hepadnaviridae i klasifikovan je kao
1
tipska vrsta roda Orthohepadnavirus. Čestice HBV virusa (virioni) se sastoje od spoljašnjeg lipidnog omotača i ikosaedarskog nukleokapsidnog jezgra sastavljenog od proteina.
Nukleokapsid generalno obuhvata virusnu DNK i DNK polimerazu koja ima aktivnost reverzne transkriptaze sličnu retrovirusima. Spoljni omotač HBV sadrži ugrađene proteine koji su uključeni u vezivanje i ulazak virusa u osetljive ćelije. HBV, koji napada jetru, klasifikovan je prema najmanje deset genotipova (A-J) na osnovu sekvence. Generalno, postoje četiri gena kodirana genomom, a ti geni se nazivaju C, P, S i X. Protein jezgra je kodiran genom C (HBcAg), a njegovom početnom kodonu prethodi uzvodni početni kodon AUG unutar okvira iz kojeg se proizvodi protein pre jezgra. HBeAg se proizvodi proteolitičkom obradom proteina pre jezgra. DNK polimeraza je kodirana genom P. Gen S kodira površinski antigen (HBsAg). HBsAg gen je jedan dugački otvoreni okvir za čitanje, ali sadrži tri kodona "početka" (ATG) u okviru koji dele gen na tri dela, pre-S1, pre-S2 i S. Zbog višestrukih početnih kodona, proizvode se polipeptidi tri različite veličine koje zovu veliki, srednji i mali (pre-S1 pre-S2 S, pre-S2 S ili S). Oni mogu imati odnos 1:1:4 (Heermann et al, 1984).
[0050] Proteini virusa hepatitis B (HBV) mogu se organizovati u nekoliko kategorija i funkcija. Polimeraze funkcionišu kao reverzna transkriptaza (RT) za stvaranje virusne DNK od pregenomske RNK (pgRNK), a takođe i kao polimeraza zavisna od DNK za stvaranje kovalentno zatvorene kružne DNK (cccDNK) od virusne DNK. One su kovalentno pričvršćene za 5' kraj minus lanca. Proteini jezgra čine virusni kapsid i izlučeni E antigen. Površinski antigeni su ligandi za internalizaciju hepatocita, a takođe i primarna komponenta avirusnih sferičnih i filamentoznih čestica. Avirusne čestice se proizvode >1000 puta u odnosu na Daneove čestice (infektivni virioni) i mogu delovati kao imunski mamci.
[0051] Površinski antigen virusa hepatitisa B: Kako se ovde koristi, termin "površinski antigen virusa hepatitisa B" ili "HBsAg" se odnosi na protein S-domena kodiran genom S (npr. ORF S) HBV genoma. Čestice virusa hepatitisa B nose virusnu nukleinsku kiselinu u česticama jezgra omotanu sa tri proteina kodirana genom S, a to su proteini velike površine, srednje površine i glavni površinski proteini. Među ovim proteinima, glavni površinski protein je uglavnom oko 226 aminokiselina i sadrži samo S-domen.
1
[0052] Infekcija: Kako se ovde koristi, izraz "infekcija" odnosi se na patogenu invaziju i/ili ekspanziju mikroorganizama, kao što su virusi, kod ispitanika. Infekcija može biti lizogena, na primer, u kojoj virusna DNK miruje u ćeliji. Alternativno, infekcija može biti litična, na primer, u kojoj se virusi aktivno razmnožavaju i izazivaju uništavanje inficiranih ćelija.
Infekcija može, ali ne mora da izazove klinički očigledne simptome. Infekcija može ostati lokalizovana, ili se može širiti, na primer, kroz krv ili limfni sistem ispitanika. Pojedinac koji ima, na primer, HBV infekciju, može se identifikovati detekcijom jednog ili više virusnih opterećenja, površinskog antigena (HBsAg), e-antigena (HBeAg) i raznih drugih testova za otkrivanje HBV infekcije poznatih u tehnici. Testovi za otkrivanje HBV infekcije mogu uključivati testiranje seruma ili uzoraka krvi na prisustvo HBsAg i/ili HBeAg, i opciono dalji skrining na prisustvo jednog ili više virusnih antitela (npr. IgM i/ili IgG) da bi se kompenzovao bilo koji period u kojima antigen HBV može biti na nivou koji ne može da se detektuje.
[0053] Upala jetre: Kako se ovde koristi, termin "upala jetre" ili "hepatitis" odnosi se na fizičko stanje u kojem jetra postaje otečena, nefunkcionalna i/ili bolna, posebno kao rezultat povrede ili infekcije, što može biti posledica izlaganja hepatotoksičnom agensu. Simptomi mogu uključivati žuticu (žutilo kože ili očiju), umor, slabost, mučninu, povraćanje, smanjenje apetita i gubitak težine. Upala jetre, ako se ne leči, može napredovati u fibrozu, cirozu, otkazivanje jetre ili rak jetre.
[0054] Fibroza jetre: Kako se ovde koristi, termin "fibroza jetre" odnosi se na prekomernu akumulaciju proteina ekstracelularnog matriksa u jetri, koji mogu uključivati kolagene (I, III i IV), fibronektin, undulin, elastin, laminin , hijaluronane i proteoglikane koji nastaju usled upale i smrti ćelija jetre. Fibroza jetre, ako se ne leči, može napredovati u cirozu, otkazivanje jetre ili rak jetre.
[0055] Petlja: Kako se ovde koristi, izraz "petlja" se odnosi na neupareni region nukleinske kiseline (npr. oligonukleotid) koji je okružen sa dva antiparalelna regiona nukleinske kiseline koji su dovoljno komplementarni jedan sa drugim, tako da pod odgovarajućim uslovima hibridizacije (npr. u fosfatnom puferu, u ćeliji), dva antiparalelna regiona, koja okružuju neupareni region, hibridizuju se da bi formirali dupleks (koji se naziva „stub“).
1
[0056] Modifikovana internukleotidna veza: Kako se ovde koristi, termin "modifikovana internukleotidna veza" odnosi se na internukleotidnu vezu koja ima jednu ili više hemijskih modifikacija u poređenju sa referentnom internukleotidnom vezom koja sadrži fosfodiestarsku vezu. Ovde opisani, modifikovani nukleotid može biti veza koja se ne pojavljuje u prirodi. Tipično, modifikovana internukleotidna veza daje jedno ili više poželjnih svojstava nukleinskoj kiselini u kojoj je prisutna modifikovana internukleotidna veza. Na primer, modifikovani nukleotid može poboljšati termičku stabilnost, otpornost na degradaciju, otpornost na nukleazu, rastvorljivost, bioraspoloživost, bioaktivnost, smanjenu imunogenost, itd.
[0057] Modifikovani nukleotid: Kako se ovde koristi, termin "modifikovani nukleotid" se odnosi na nukleotid koji ima jednu ili više hemijskih modifikacija u poređenju sa odgovarajućim referentnim nukleotidom odabranim od: adenin ribonukleotida, gvanin ribonukleotida, citozin ribonukleotida, uracilnog ribonukleotida, adenin dezoksiribonukleotida, gvanin dezoksiribonukleotida, citozin dezoksiribonukleotida i timidin dezoksiribonukleotida. U nekim otelotvorenjima, modifikovani nukleotid je nukleotid koji se ne pojavljuje u prirodi. U nekim otelotvorenjima, modifikovani nukleotid ima jednu ili više hemijskih modifikacija u svom šećeru, nukleobazi i/ili fosfatnoj grupi. U nekim otelotvorenjima, modifikovani nukleotid ima jedan ili više hemijskih ostataka konjugovanih sa odgovarajućim referentnim nukleotidom. Tipično, modifikovani nukleotid daje jedno ili više poželjnih svojstava nukleinskoj kiselini u kojoj je prisutan modifikovani nukleotid. Na primer, modifikovani nukleotid može poboljšati termičku stabilnost, otpornost na degradaciju, otpornost na nukleazu, rastvorljivost, bioraspoloživost, bioaktivnost, smanjenu imunogenost, itd.
[0058] Struktura izrezane tetrapetlje: „Struktura izrezane tetrapetlje“ je struktura RNKi oligonukleotida koju karakteriše prisustvo odvojenih smislenih lanaca (lanaca putnika) i antismislenih (vodećih) lanaca, u kojima smisleni lanac ima region komplementarnosti sa antismislenim lancem, i u kojem najmanje jedan od nizova, generalno čulni lanac, ima tetrapetlju konfigurisanu da stabilizuje susedni matični region formiran unutar najmanje jednog lanca.
2
[0059] Oligonukleotid: Kako se ovde koristi, izraz "oligonukleotid" se odnosi na kratku nukleinsku kiselinu, na primer, dužine manje od 100 nukleotida. Oligonukleotid može biti jednolančani ili dvolančani. Oligonukleotid može imati ili ne mora imati dupleks regione. Kao skup neograničavajućih primera, oligonukleotid može biti, ali nije ograničen na, mala interferirajuća RNK (siRNK), mikroRNK (miRNK), kratka RNK ukosnica (shRNK), RNK koja interferira sa supstratom dicera (dsiRNK), antismisleni oligonukleotid, kratka siRNK ili jednolančana siRNK. U nekim otelotvorenjima, dvolančani oligonukleotid je RNKi oligonukleotid.
[0060] Prepust: Kako se ovde koristi, termin "prepust" se odnosi na terminalni(e) nukleotid(e) za uparivanje bez baze koji je rezultat jednog lanca ili regiona koji se proteže izvan kraja komplementarnog lanca sa kojim jedan lanac ili region formira dupleks. Ovde opisani prepust može da sadrži jedan ili više neuparenih nukleotida koji se protežu od dupleks regiona na 5' terminusu ili 3' terminusu dvolančanog oligonukleotida. Ovde opisani prepust može biti 3' ili 5' prepust na antismislenom lancu ili smisleni lanac dvolančanih oligonukleotida.
[0061] Analog fosfata: Kako se ovde koristi, izraz "analog fosfata" se odnosi na hemijski ostatak koji imitira elektrostatička i/ili sterična svojstva fosfatne grupe. U nekim otelotvorenjima, analog fosfata je pozicioniran na 5' terminalnom nukleotidu oligonukleotida umesto 5'-fosfata, koji je često podložan enzimskom uklanjanju. U nekim otelotvorenjima, analog 5' fosfata sadrži vezu otpornu na fosfatazu. Primeri analoga fosfata uključuju 5' fosfonate, kao što su 5' metilenfosfonat (5'-MP) i 5'-(E)-vinilfosfonat (5'-VP). U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid ima analog fosfata na 4'-ugljeničnom položaju šećera (koji se naziva "4'-fosfatni analog") na 5'-terminalnom nukleotidu. Primer analoga 4'-fosfata je oksimetilfosfonat, u kome je atom kiseonika oksimetil grupe vezan za ostatak šećera (npr. na svom 4'-ugljeniku) ili njegov analog. Vidi, na primer, Privremena prijava SAD broj 62/383,207, podneta 2. septembra 2016., i 62/393.401, podneta 12.09.2016. Druge modifikacije su razvijene za 5' kraj oligonukleotida (vidi, npr. WO 2011/133871; US patent br. 8,927,513; i Prakash et al. (2015), Nucleic Acids Res., 43(6):2993-3011).
[0062] Smanjena ekspresija: Kako se ovde koristi, termin "smanjena ekspresija" gena se odnosi na smanjenje količine RNK transkripta ili proteina kodiranog genom i/ili smanjenje količine aktivnosti gena u ćeliji ili ispitaniku, u poređenju sa odgovarajućom referentnom ćelijom ili ispitanikom. Na primer, čin tretiranja ćelije dvolančanim oligonukleotidom (npr. onaj koji ima antismisleni lanac koji je komplementaran sekvenci mRNK HBsAg) može dovesti do smanjenja količine RNK transkripta, proteina i/ili enzimske aktivnosti (npr. kodiran S genom HBV genoma) u poređenju sa ćelijom koja nije tretirana dvolančanim oligonukleotidom. Slično tome, "smanjenje ekspresije" kako se ovde koristi odnosi se na čin koji dovodi do smanjene ekspresije gena (npr. S gen genoma HBV).
[0063] Region komplementarnosti: Kako se ovde koristi, termin "region komplementarnosti" se odnosi na sekvencu nukleotida nukleinske kiseline (npr. dvolančani oligonukleotid) koji je dovoljno komplementaran antiparalelnoj sekvenci nukleotida da omogući hibridizaciju između dve sekvence nukleotida pod odgovarajućim uslovima hibridizacije, npr. u fosfatnom puferu, u ćeliji itd.
[0064] Ribonukleotid: Kako se ovde koristi, termin "ribonukleotid" se odnosi na nukleotid koji ima ribozu kao pentozni šećer, koji sadrži hidroksilnu grupu na svom 2' položaju.
Modifikovani ribonukleotid je ribonukleotid koji ima jednu ili više modifikacija ili supstitucija atoma koji nisu na 2' poziciji, uključujući modifikacije ili supstitucije u ribozi, fosfatnoj grupi ili bazi.
[0065] RNKi oligonukleotid: Kako se ovde koristi, termin "RNKi oligonukleotid" se odnosi ili na (a) dvolančani oligonukleotid koji ima smisleni lanac (putnik) i antismisleni (vodeći) lanac, u kojem antismisleni lanac ili deo antismislenog lanca koristi Argonaut 2 (Ago2) endonukleazu u cepanju ciljne mRNK ili (b) jednolančani oligonukleotid koji ima jedan antismisleni lanac, pri čemu taj antismisleni lanac (ili deo tog antismislenog lanca) koristi Ago2 endonukleazu za cepanje mete mRNK.
[0066] Lanac: Kako se ovde koristi, termin "lanac" se odnosi na jednu neprekidnu sekvencu nukleotida povezanih preko internukleotidnih veza (npr. fosfodiestarske veze, fosforotioatne veze). Ovde opisan, lanac može imati dva slobodna kraja, npr.5'-kraj i 3'-kraj.
[0067] Ispitanik: Kako se ovde koristi, izraz "ispitanik" označava bilo kog sisara, uključujući miševe, zečeve i ljude. U jednom otelotvorenju, ispitanik je čovek ili primat koji nije čovek. Termini „pojedinac“ ili „pacijent“ mogu se koristiti naizmenično sa terminom „ispitanik“.
[0068] Sintetički: Kako se ovde koristi, termin "sintetički" se odnosi na nukleinsku kiselinu ili drugi molekul koji je veštački sintetizovan (npr. koristeći mašinu (npr. sintetizator nukleinske kiseline u čvrstom stanju)) ili koji nije na drugi način izveden iz prirodnog izvora (npr. ćelija ili organizam) koji normalno proizvodi molekul.
[0069] Ciljajući ligand: Kako se ovde koristi, termin "ciljajući ligand" se odnosi na molekul (npr. ugljeni hidrat, amino šećer, holesterol, polipeptid ili lipid) koji se selektivno vezuje za srodni molekul (npr. receptor) tkiva ili ćelije od interesa i koji može da se konjuguje sa drugom supstancom u svrhu usmeravanja druge supstance na tkivo ili ćeliju od interesa. Na primer, ciljajući ligand može biti konjugovan sa oligonukleotidom u svrhu usmeravanja oligonukleotida na specifično tkivo ili ćeliju od interesa. Ciljajući ligand se selektivno vezuje za receptor na površini ćelije. Shodno tome, ciljajući ligand kada je konjugovan sa oligonukleotidom olakšava isporuku oligonukleotida u određenu ćeliju kroz selektivno vezivanje za receptor eksprimiran na površini ćelije i endosomalnu internalizaciju od strane ćelije kompleksa koji sadrži oligonukleotid, ciljajući ligand i receptor. Ovde opisan ciljajući ligand može biti konjugovan sa oligonukleotidom preko linkera koji se cepa posle ili tokom ćelijske internalizacije tako da se oligonukleotid oslobađa od ciljajućeg liganda u ćeliji.
[0070] Tetrapetlja: Kako se ovde koristi, termin "tetrapetlja" se odnosi na petlju koja povećava stabilnost susednog dupleksa formiranog hibridizacijom bočnih sekvenci nukleotida. Povećanje stabilnosti primetno je kao povećanje temperature topljenja (Tm) susednog dupleksa stuba koji je viši od Tmsusednog dupleksa stuba koja se očekuje, u proseku, od skupa petlji uporedive dužine koje se sastoje od nasumično odabranih sekvenci nukleotida. Na primer, tetrapetlja može dati temperaturu topljenja od najmanje 50 °C, najmanje 55 °C, najmanje 56 °C, najmanje 58 °C, najmanje 60 °C, najmanje 65 °C ili najmanje 75 °C u 10 mM NaHPO4na ukosnicu koja sadrži dupleks dužine od najmanje 2 para baza. Tetrapetlja može stabilizovati bazni par u susednom dupleksu stuba interakcijama slaganja. Pored toga, interakcije između nukleotida u tetrapetlji uključuju, ali nisu ograničene na uparivanje baza koje nisu Watson-Crick, interakcije slaganja, vodonične veze i kontaktne
2
interakcije (Cheong et al., Nature 16. avgust 1990; 346(6285):680-2; Heus i Pardi, Science 12. jul 1991; 253(5016):191-4). Ovde opisana tetrapetlja može da sadrži 4 do 5 nukleotida. Ovde opisana tetrapetlja može da sadrži ili se sastoji od tri, četiri, pet ili šest nukleotida, koji mogu ili ne moraju biti modifikovani (npr. koji mobu, ali ne moraju biti konjugovan sa ciljnim ostatkom).
Ovde opisana tetrapetlja se može sastojati od četiri nukleotida. Bilo koji nukleotid se može koristiti u tetrapetlji i standardni IUPAC-IUB simboli za takve nukleotide se mogu koristiti kao što je opisano u Cornish-Bowden (1985) Nucl. Acids Res.13: 3021-3030. Na primer, slovo „N“ može da se koristi u značenju da bilo koja baza može biti u tom položaju, slovo „R“ se može koristiti da pokaže da A (adenin) ili G (gvanin) mogu biti u toj poziciji, i „B“ se može koristiti da pokaže da C (citozin), G (gvanin) ili T (timin) mogu biti u toj poziciji.
Primeri tetrapetlji uključuju UNCG porodicu tetrapetlji (npr. UUCG), GNRA porodica tetrapetlji (npr. GAAA) i CUUG tetrapetlja (Proc Natl Acad Sci USA. novembar 1990;
87(21):8467-71; Antao et al., Nucleic Acids Res.11. novembar 1991; 19(21):5901-5). Primeri DNK tetrapetlji uključuju d(GNNA) porodicu tetrapetlji (npr. d(GTTA)), d(GNRA) familiju tetrapetlji, d(GNAB) familiju tetrapetlji, d(CNNG) familiju tetrapetlji i d(TNCG) familiju tetrapetlji (npr. d(TTCG)). Vidi, na primer: Nakano at al. Biochemistry, 41 (48), 14281-14292, 2002. SHINJI et al. Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL.78; Br.2; STRANA. 731(2000). Tetrapetlja je sadržana u strukturi izrezane tetrapetlje.
[0071] Lečenje: Kako se ovde koristi, izraz "lečenje" se odnosi na čin pružanja nege ispitaniku kome je to potrebno, npr. kroz davanje terapeutskog sredstva (npr. oligonukleotida) ispitaniku, u svrhu poboljšanja zdravlja i/ili dobrobiti ispitanika u odnosu na postojeće stanje (npr. postojeća infekcija HBV) ili da bi se sprečila ili smanjila verovatnoća pojave nekog stanja (npr. sprečavanje fibroze jetre, hepatitisa, karcinoma jetre ili drugog stanja povezanog sa infekcijom HBV). U nekim otelotvorenjima, lečenje uključuje smanjenje učestalosti ili težine najmanje jednog znaka, simptoma ili faktora koji doprinosi nekom stanju (npr. HBV infekcija ili srodno stanje) koje je doživeo ispitanik. Tokom infekcije HBV, ispitanik može da ispolji simptome kao što su žutilo kože i očiju (žutica), tamni urin, ekstremni umor, mučnina, povraćanje i bol u stomaku. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, tretman koji je ovde dat može dovesti do smanjenja učestalosti ili težine jednog ili više takvih simptoma. Međutim, infekcija HBV se može razviti u jedno ili više stanja jetre, kao što su ciroza, fibroza jetre, upala jetre ili karcinom jetre. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, lečenje koji je ovde dato može dovesti do smanjenja učestalosti ili ozbiljnosti, ili sprečiti ili ublažiti, jedno ili više takvih stanja.
II. Inhibitori na bazi oligonukleotida
i. Ciljanje površinskog antigena HBV
[0072] Ovde su dati inhibitori ekspresije površinskog antigena HBV na bazi oligonukleotida koji se mogu koristiti za postizanje terapeutske koristi. Ispitivanjem mRNK površinskog antigena HBV i testiranjem različitih oligonukleotida, razvijeni su potentni oligonukleotidi za smanjenje ekspresije površinskog antigena HBV (HBsAg) za lečenje infekcije HBV.
Oligonukleotidi koji su ovde dati, u nekim otelotvorenjima, projektovani su da ciljaju HBsAg mRNK sekvence koje pokrivaju >95% poznatih HBV genoma u svim poznatim genotipovima. U nekim otelotvorenjima, takvi oligonukleotidi dovode do više od 90% smanjenja HBV pregenomske RNK (pgRNK) i HBsAg mRNK u jetri. U nekim otelotvorenjima, smanjenje ekspresije HBsAg traje duži vremenski period nakon jedne doze ili režima lečenja.
[0073] Shodno tome, oligonukleotidi koji su ovde dati projektovani su tako da imaju regione komplementarnosti sa HBsAg mRNK u svrhu ciljanja transkripta u ćelijama i inhibiranja njihove ekspresije. Region komplementarnosti je generalno odgovarajuće dužine i sadržaja baze da bi se omogućilo otpuštanje oligonukleotida (ili njegovog lanca) na HBsAg mRNK u svrhu inhibicije njegove ekspresije. Ovde opisani region komplementarnosti može biti dugačak najmanje 12, najmanje 13, najmanje 14, najmanje 15, najmanje 16, najmanje 17, najmanje 18, najmanje 19 ili najmanje 20 nukleotida. Ovde opisani oligonukleotid može imati region komplementarnosti sa HBsAg mRNK koji ima dužinu u opsegu od 12 do 30 (npr.12 do 30, 12 do 22, 15 do 25, 17 do 21, 18 do 27, 19 do 27 ili 15 do 30) nukleotida. Ovde opisani oligonukleotid može imati region komplementarnosti sa HBsAg mRNK dužine 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29 ili 30 nukleotida.
[0074] Oligonukleotidi pronalaska koji su ovde dati su projektovani da ciljaju sekvence mRNK koje kodiraju HBsAg. Na primer, opisan je oligonukleotid koji ima antismisleni lanac koji ima region komplementarnosti sa sekvencom koja je određena kao:
ACAANAAUCCUCACAAUA (SEQ ID NO: 1), gde se N odnosi na bilo koji nukleotid (A,
2
G, T ili C). Oligonukleotid pronalaska dalje sadrži smisleni lanac koji formira dupleks region sa antismislenim lancem. Takođe ovde opisan, smisleni lanac može imati region komplementarnosti sa sekvencom koja je navedena kao: UUNUUGUGAGGAUUN (SEQ ID NO: 2). Ovde opisani čulni lanac može sadržati region komplementarnosti sa sekvencom kao što je prikazano u (prikazano 5' do 3'): UUAUUGUGAGGAUUNUUGUC (SEQ ID NO: 3).
[0075] Ovde opisani antismisleni lanac može sadržati, ili se sastojati od, sekvence određene kao: UUAUUGUGAGGAUUNUUGUCGG (SEQ ID NO: 4). Ovde opisani antismisleni lanac može sadržati, ili se sastojati od, sekvence određene kao:
UUAUUGUGAGGAUUCUUGUCGG (SEQ ID NO: 5). Antismisleni lanac pronalaska se sastoji od sekvence koja je navedena kao: UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 6). Ovde opisan smisleni lanac može da sadrži, ili da se sastoji od, sekvence određene kao: ACAANAAUCCUCACAAUAA (SEQ ID NO: 7). Ovde opisan smisleni lanac može da sadrži, ili da se sastoji od, sekvence određene kao:
GACAANAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 8). Smisleni lanac pronalaska sastoji se od niza koji je određen kao:
GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 9). Ovde opisan smisleni lanac može da sadrži, ili da se sastoji od, sekvence određene kao:
GACAAGAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 10).
[0076] Ovde opisan oligonukleotid za smanjenje ekspresije HBsAg mRNK može sadržati smisleni lanac koji formira dupleksni region sa antismislenim lancem, gde smisleni lanac sadrži sekvencu kao što je određenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 7-10, a antismisleni lanac sadrži sekvencu koja je određena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 4-6. Ovde opisan smisleni lanac može da sadrži 2'-fluoro i 2'-O-metil modifikovane nukleotide i najmanje jednu fosforotioatnu internukleotidnu vezu. Smisleni lanac koji je ovde opisan je konjugovan sa N-acetilgalaktozamin (GalNAc) ostatkom. Ovde opisan antismisleni lanac može da sadrži 2'-fluoro i 2'-O-metil modifikovane nukleotide i najmanje jednu fosforotioatnu internukleotidnu vezu. Ovde opisan 4'-ugljenik šećera 5'-nukleotida antismislenog lanca može sadržati analog fosfata. Ovde opisan svaki od antismislenih i smislenih lanaca može sadržati 2'-fluoro i 2'-O-metil modifikovane nukleotide i najmanje jednu fosforotioatnu internukleotidnu vezu, gde 4'-ugljenik šećera 5'-nukleotida antismislenog lanca sadrži fosfatni analog, a smisleni lanac je konjugovan sa N-acetilgalaktozamin (GalNAc) ostatkom.
2
[0077] Ovde opisan smisleni lanac koji sadrži sekvencu kao što je određeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 8-10 može da sadrži 2'-fluoro modifikovane nukleotide na pozicijama 3, 8-10, 12, 13 i 17. Smisleni lanac pronalaska obuhvata 2'-O-metil modifikovane nukleotide na pozicijama 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26 i 31-36. Smisleni lanac pronalaska obuhvata jednu fosforotioatnu internukleotidnu vezu. Smisleni lanac pronalaska obuhvata fosforotioatnu internukleotidnu vezu između nukleotida na pozicijama 1 i 2. Smisleni lanac koji je ovde opisan je konjugovan sa N-acetilgalaktozamin (GalNAc) ostatkom.
[0078] Ovde opisan antismisleni lanac koji sadrži sekvencu kao što je određeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 4-6 može da sadrži 2'-fluoro modifikovane nukleotide na pozicijama 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 14, 16 i 19. Antismisleni lanac pronalaska sadrži 2'-O-metil modifikovane nukleotide na pozicijama 1, 4, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 18 i 20-22. Ovde opisan antismisleni lanac može da sadrži tri fosforotioatne internukleotidne veze. Antismisleni lanac pronalaska obuhvata fosforotioatne internukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, između nukleotida na pozicijama 2 i 3, između nukleotida na pozicijama 3 i 4, između nukleotida na pozicijama 20 i 21 i između nukleotida na pozicijama 21 i 22. Ovde opisan 4'-ugljenik šećera 5'-nukleotida antismislenog lanca može sadržati analog fosfata.
ii. Dvolančani oligonukleotidi
[0079] Postoje različite strukture oligonukleotida koje su korisne za ciljanje ekspresije HBsAg mRNK u metodama ovog otkrića, uključujući RNKi, antismisleni, miRNK, itd. Bilo koja od struktura opisanih ovde ili na drugom mestu može se koristiti kao okvir za inkorporaciju ili ciljanje sekvence opisane ovde. Dvolančani oligonukleotidi za ciljanje ekspresije HBV antigena (npr. putem RNKi putanje) generalno imaju smisleni lanac i antismisleni lanac koji spajaju duplekse jedan sa drugim. U nekim otelotvorenjima, smisleni i antismisleni lanci nisu kovalentno vezani. Međutim, u nekim otelotvorenjima, smisleni i antismisleni lanci su kovalentno vezani.
[0080] U nekim otelotvorenjima, dvolančani oligonukleotidi pronalaska za smanjenje ekspresije HBsAg mRNK ekspresije angažuju RNK interferenciju (RNKi). Na primer, RNKi oligonukleotidi su razvijeni sa svakim lancem veličine 19-25 nukleotida sa najmanje jednim 3' prepustom od 1 do 5 nukleotida (videti, npr. US patent br.8.372.968). Takođe su razvijeni duži oligonukleotidi koje Dicer obrađuje da bi se generisali aktivni RNKi proizvodi (videti,
2
npr. US patent br.8.883.996). Dalji rad proizveo je produžene dvolančane oligonukleotide gde je najmanje jedan kraj najmanje jednog lanca proširen izvan dupleks ciljanog regiona, uključujući strukture u kojima jedan od lanaca uključuje hemodinamički stabilizujuću strukturu tetrapetlje (videti npr. US patente br.8.513.207 i 8.927.705, kao i WO2010033225). Takve strukture mogu uključivati jednolančane ekstenzije (na jednoj ili obe strane molekula) kao i dvolančane ekstenzije.
[0081] Oligonukleotidi koji su ovde dati mogu da se cepaju pomoću Dicer enzima. Takvi oligonukleotidi mogu imati prepust (npr. dužine 1, 2 ili 3 nukleotida) na 3' kraju smislenog lanca. Takvi oligonukleotidi (npr. siRNK) mogu da sadrže vodeći lanac od 21 nukleotida koji je antismisleni za ciljnu RNK i komplementarni lanac putnik, u kome se oba lanca otpuštaju da bi formirali dupleks od 19-bp i 2 nukleotida koji su prepušteni na jednom ili oba 3' kraja. Dostupni su i duži projektovani oligonukleotidi, uključujući oligonukleotide koji imaju vodeći lanac od 23 nukleotida i lanac putnik od 21 nukleotida, gde se na desnoj strani molekula nalazi neutralni kraj (3'-kraj lanca putnika /5'-kraj vodećeg lanaca) i prepust dva nukleotidna 3'-vodeća lanca na levoj strani molekula (5'-kraj lanca putnika/3'-kraj vodećeg lanca). U takvim molekulima postoji dupleks region od 21 baznog para. Vidi, na primer, US9012138, US9012621, i US9193753.
[0082] Oligonukleotidi kako su ovde otkriveni mogu sadržati smislene i antismislene lance od kojih oba imaju dužinu u opsegu od 17 do 26 (npr. 17 do 26, 20 do 25, 19 do 21 ili 21-23) nukleotida. Ovde opisani, smisleni i antismisleni lanci mogu biti jednake dužine. Za oligonukleotide koji imaju smislene i antismislene lance koje su oba u opsegu od 21-23 nukleotida u dužini, 3' ovde opisan prepust na smislenom, antismislenom, ili i smislenom i antismislenom lancu mogu biti dužine 1 ili 2 nukleotida. Ovde opisani oligonukleotidi mogu da imaju vodeći lanac od 23 nukleotida i lanac putnik od 21 nukleotida, gde se na desnoj strani molekula nalazi neutralni kraj (3'-kraj lanca putnika /5'-kraj vodećeg lanaca) i prepust dva nukleotidna 3'-vodeća lanca na levoj strani molekula (5'-kraj lanca putnika/3'-kraj vodećeg lanca). U takvim molekulima postoji dupleks region od 21 baznog para. Ovde opisan oligonukleotid može sadržati smisleni lanac od 25 nukleotida i antismisleni lanac od 27 nukleotida koji, kada deluje na enzim dicer, dovodi do antismislenog lanca koji je ugrađen u sazreli RISC.
2
[0083] Drugi projektovani oligonukleotidi za upotrebu sa kompozicijama i metodama koje su ovde otkrivene uključuju: 16-mer siRNK (videti, npr. Nucleic Acids in Chemistry and Biology. Blackburn (ur.), Royal Society of Chemistry, 2006), shRNK (npr. koji ima 19 bp ili kraće lance; videti npr. Moore et al. Methods Mol. Biol.2010; 629:141-158), neutralne siRNK (npr. dužine 19 bps; videti, npr. Kraynack i Baker, RNA Vol.12, str.163-176 (2006)), asimetrične siRNK (aiRNK; videti, npr. Sun et al., Nat. Biotechnol.26, 1379-1382 (2008)), asimetrične kraće duplekse siRNK (videti, npr. Chang et al., Mol Ther. april 2009; 17(4): 725-32), razgranate siRNK (videti, npr. Hohjoh, FEBS Letters, Vol.557, brojevi 1-3; jan 2004, str.
193-198), jednolančane siRNK (Elsner; Nature Biotechnology 30, 1063 (2012)), kružne siRNK u obliku bučice (videti, npr. Abe at all. J Am Chem Soc 129: 15108-15109 (2007)), i male interno segmentirane interferirajuće RNK (sisiRNK; videti, npr. Bramsen et al., Nucleic Acids Res. sep.2007; 35(17): 5886-5897). Dalji neograničavajući primeri oligonukleotidnih struktura koji se mogu koristiti u nekim otelotvorenjima za smanjenje ili inhibiranje ekspresije HBsAg su mikroRNK (miRNK), kratka RNK (shRNK) i kratka siRNK (videti, npr. Hamilton et al., Embo J., 2002, 21(17): 4671-4679; takođe videti US patentnu prijavu br.
20090099115).
a. Antismisleni lanci
[0084] U nekim otelotvorenjima, antismisleni lanac oligonukleotida se može nazvati "vodeći lanac". Na primer, ako se antismisleni lanac može angažovati sa RNK-indukovanim kompleksom za utišavanje (RISC) i vezati se za protein Argonaut, ili se angažovati ili vezati za jedan ili više sličnih faktora, i za direktno utišavanje ciljnog gena, može se nazvati vodeći lanac. U nekim otelotvorenjima, smisleni lanac komplementaran sa vodećim lancem može da se naziva „lanac putnik“.
[0085] Ovde opisani oligonukleotid koji je ovde dat može sadržati antismisleni lanac koji je dužine do 50 nukleotida (npr. dužine do 30, do 27, do 25, do 21 ili do 19 nukleotida). Ovde opisani oligonukleotid koji je ovde dat može sadržati antismisleni lanac koji ima dužinu najmanje 12 nukleotida (npr. dužine najmanje 12, najmanje 15, najmanje 19, najmanje 21, najmanje 25 ili najmanje 27 nukleotida). Takođe ovde opisan antismisleni lanac oligonukleotida koji je ovde otkriven može imati dužinu u opsegu od 12 do 50 ili od 12 do 30 (npr. 12 do 30, 11 do 27, 11 do 25, 15 do 21, 15 do 27, 17 do 21, 17 do 25, 19 do 27 ili 19 do 30) nukleotida. Ovde opisan antismisleni lanac bilo kog od ovde otkrivenih oligonukleotida
2
može imati dužinu 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ili 50 nukleotida.
[0086] Ovde opisan antismisleni lanac može sadržati region komplementarnosti sa sekvencom kao što je određeno u (prikazano 5' do 3'): AATCCTCACA (SEQ ID NO: 11). Ovde opisan antismisleni lanac može sadržati sekvencu kao što je određeno u (prikazano 5' do 3') UGUGAGGAUU (SEQ ID NO: 12). Ovde opisan antismisleni lanac može sadržati sekvencu kao što je određeno u (prikazano 5' do 3'): TGTGAGGATT (SEQ ID NO: 13).
[0087] Ovde opisani oligonukleotid za smanjenje ekspresije HBsAg mRNK može sadržati antismisleni lanac koji ima region komplementarnosti sa sekvencom kao što je određeno u SEQ ID NO: 11, i jedan ili dva nekomplementarna nukleotida na njegovom 3' terminusu. Ovde opisan antismisleni lanac može da sadrži nukleotidnu sekvencu određenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 4-6.
[0088] Ovde opisani oligonukleotid za smanjenje ekspresije HBsAg mRNK može sadržati antismisleni lanac koji ima region komplementarnosti sa sekvencom kao što je određeno u SEQ ID NO: 11, gde antismisleni lanac nema sekvencu kako je određeno u bilo kom od sledećeg (prikazano 5' do 3'): TATTGTGAGGATTCTTGTCA (SEQ ID NO: 14);
CGGTATTGTGAGGATTCTTG (SEQ ID NO:15); TGTGAGGATTCTTGTCAACA (SEQ ID NO:16); UAUUGUGAGGAUUUUUGUCAA (SEQ ID NO: 17);
UGCGGUAUUGUGAGGAUUCTT (SEQ ID NO: 18);
ACAGCATTGTGAGGATTCTTGTC (SEQ ID NO:19);
UAUUGUGAGGAUUUUUGUCAACA (SEQ ID NO: 20);
AUUGUGAGGAUUUUUGUCAACAA (SEQ ID NO: 21); i UUGUGAGGAUUUUUGUCAACAAG (SEQ ID NO: 22). Ovde opisan antismisleni lanac se može razlikovati od nukleotidne sekvence navedene u SEQ ID NO: 4, 5 ili 6 za ne više od tri nukleotida.
b. Smisleni lanci
[0089] Ovde opisani dvolančani oligonukleotid može ima smisleni lanac koji je dužine do 40 nukleotida (npr. dužine do 40, do 30, do 27, do 25, do 21, do 19, do 17 ili do 12 nukleotida). Ovde opisan oligonukleotid može imati smisleni lanac dužine najmanje 12 nukleotida (npr.
najmanje 12, najmanje 15, najmanje 19, najmanje 21, najmanje 25, najmanje 27, najmanje 30, najmanje 35, ili najmanje 38 nukleotida). Takođe ovde opisani oligonukleotid može imati smisleni lanac u opsegu dužine od 12 do 50 (npr.12 do 40, 12 do 36, 12 do 32, 12 do 28, 15 do 40, 15 do 36, 15 do 32, 15 do 28, 17 do 21, 17 do 25, 19 do 27, 19 do 30, 20 do 40, 22 do 40, 25 do 40 ili 32 do 40) nukleotida. Ovde opisani oligonukleotid može imati smisleni lanac dužine 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 130 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40 nukleotida. Ovde opisani smisleni lanac oligonukleotida može biti duži od 27 nukleotida (npr. 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40 nukleotida). Takođe ovde opisani smisleni lanac oligonukleotida može biti duži od 25 nukleotida (npr.26, 27, 28, 29 ili 30 nukleotida).
[0090] Ovde opisani smisleni lanac može da sadrži matičnu petlju na svom 3'-kraju. Takođe ovde opisan smisleni lanac može da sadrži matičnu petlju na svom 5'-kraju. Ovde opisani lanac koji sadrži matičnu petlju može biti dugačak u opsegu od 2 do 66 nukleotida (npr.2 do 66, 10 do 52, 14 do 40, 2 do 30, 4 do 26, 8 do 22, 12 do 18, 10 do 22, 14 do 26 ili 14 do 30 nukleotida). Ovde opisani lanac koji sadrži matičnu petlju može imati dužinu 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 nukleotida. Ovde opisan stub može da sadrži dupleks dužine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ili 14 nukleotida. Matična petlja pruža molekulu bolju zaštitu od degradacije (npr. enzimska degradacija) i olakšava karakteristike ciljanja za isporuku u ciljnu ćeliju. Na primer, petlja obezbeđuje dodatne nukleotide na kojima se može izvršiti modifikacija bez suštinskog uticaja na aktivnost inhibicije ekspresije gena oligonukleotida. Ovde je opisan oligonukleotid u kome smisleni lanac može da sadrži (npr. na svom 3'-kraju) matičnu petlju određenu kao: S1-L-S2, u kojoj je S1komplementaran sa S2, i u kojoj L formira petlju između S1i S2dužine do 10 nukleotida (npr. dužine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 nukleotida).
[0091] Ovde opisana petlja (L) matične petlje može biti tetrapetlja (npr. unutar strukture izrezane tetrapetlje). Tetrapetlja može da sadrži ribonukleotide, dezoksiribonukleotide, modifikovane nukleotide i njihove kombinacije. Tipično, tetrapetlja ima 4 do 5 nukleotida.
c. Dužina dupleksa
1
[0092] Ovde opisani dupleks formiran između smislenog i antismislenog lanca može imati dužinu od najmanje 12 (npr. najmanje 15, najmanje 16, najmanje 17, najmanje 18, najmanje 19, najmanje 20, ili najmanje 21) nukleotida. Takođe ovde opisan dupleks formiran između smislenog i antismislenog lanca može imati dužinu u opsegu od 12-30 nukleotida (npr. dužinu 12 do 30, 12 do 27, 12 do 22, 15 do 25, 18 do 30, 18 do 22, 18 do 25, 18 do 27, 18 do 30, 19 do 30 ili 21 do 30 nukleotida). Ovde opisani dupleks formiran između smislenog i antismislenog lanca može imati dužinu 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30 nukleotida. Takođe ovde opisani dupleks formiran između smislenog i antismislenog lanca možda ne obuhvata celu dužinu smislenog i/ili antismislenog lanca. Ovde opisani dupleks između smislenog i antismislenog lanca može da se proteže celom dužinom bilo smislenog, bilo antismislenog lanca. Takođe ovde opisan dupleks između smislenog i antismislenog lanca može da se proteže celom dužinom i smislenog i antismislenog lanca.
d. Krajevi oligonukleotida
[0093] Ovde opisani oligonukleotid može sadržati smislene i antismislene lance, tako da postoji 3'-prepust na smislenom ili na antismislenom lancu, ili na oba lanca. Ovde opisani oligonukleotidi koji su ovde dati mogu imati jedan 5' kraj koji je termodinamički manje stabilan u poređenju sa drugim 5' krajem. Može se obezbediti asimetrični oligonukleotid, opisan ovde, koji uključuje neutralni kraj na 3' kraju smislenog lanca i prepust na 3' kraju antismislenog lanca. Takođe ovde opisan 3' prepust na antismislenom lancu može imati dužinu 1-8 nukleotida (npr. dužine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 nukleotida).
[0094] Tipično, oligonukleotid za RNKi ima prepust od dva nukleotida na 3' kraju antismislenog (vodećeg) lanca. Međutim, mogući su i drugi prepusti. Ovde opisani prepust može biti 3' prepust koji ima dužinu između jednog i šest nukleotida, opciono jedan do pet, jedan do četiri, jedan prema tri, jedan do dva, dva do šest, dva do pet, dva do četiri, dva do tri, tri do šest, tri do pet, tri do četiri, četiri do šest, četiri do pet, pet do šest nukleotida, ili jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest nukleotida. Međutim, prepust koji je ovde opisan može biti 5' prepust koji ima dužinu između jednog i šest nukleotida, opciono jedan do pet, jedan do četiri, jedan do tri, jedan do dva, dva do šest, dva do pet, dva do četiri, dva do tri, tri do šest, tri do pet, tri do četiri, četiri do šest, četiri do pet, pet do šest nukleotida, ili jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest nukleotida.
2
[0095] Ovde opisani jedan ili više (npr.2, 3, 4) terminalnih nukleotida 3' kraja ili 5' kraja smislenog i/ili antismislenog lanca mogu biti modifikovani. Na primer, jedan ili dva terminalna nukleotida 3' kraja antismislenog lanca mogu biti modifikovani. Ovde opisan poslednji nukleotid na 3' kraju antismislenog lanca može biti modifikovan, npr. sadrži 2'-modifikaciju, npr. 2'-O-metoksietil. Ovde opisani poslednji jedan ili dva terminalna nukleotida na 3' kraju antismislenog lanca mogu biti komplementarni sa ciljem. Ovde opisani poslednji jedan ili dva nukleotida na 3' kraju antismislenog lanca možda neće biti komplementarni sa ciljem.
[0096] Ovde je opisan dvolančani oligonukleotid koji može imati strukturu izrezane tetrapetlje na 3' kraju smislenog lanca, i dva terminalna nukleotida prepusta na 3' kraju njegovog antismislenog lanca. Dva terminalna nukleotida prepusta mogu biti GG. Tipično, jedan ili oba terminalna GG nukleotida antismislenog lanca nije ili nisu komplementarna sa ciljem.
[0097] Ovde opisani 5' kraj i/ili 3' kraj smislenog ili antismislenog lanca može imati nukleotid sa invertovanom „cap“ strukturom.
[0098] Ovde opisana jedna ili više (npr.2, 3, 4, 5, 6) modifikovanih internukleotidnih veza mogu biti obezbeđene između terminalnih nukleotida 3' kraja ili 5' kraja smislenog i/ili antismislenog lanca. Ovde opisane modifikovane internukleotidne veze mogu biti obezbeđene između nukleotida prepusta na 3' kraju ili 5' kraju smislenog i/ili antismislenog lanca.
e. Nepodudarnosti
[0099] Ovde opisani oligonukleotid može imati jednu ili više (npr.1, 2, 3, 4, 5) nepodudarnosti između smislenog i antismislenog lanca. Ako postoji više od jedne nepodudarnosti između smislenog i antismislenog lanca, one mogu biti postavljene uzastopno (npr. 2, 3 ili više u nizu), ili rasprostranjene po celom regionu komplementarnosti. Ovde opisani 3'-terminus smislenog lanca može da sadrži jedno ili više nepodudaranja. Ovde opisane dve nepodudarnosti mogu biti ugrađene na 3' terminusu smislenog lanca. U nekim otelotvorenjima, nepodudarnost baza ili destabilizacija segmenata na 3'-kraju smislenog lanca oligonukleotida poboljšala je potenciju sintetičkih dupleksa u RNKi, verovatno kroz olakšavanje obrade od strane Dicera.
[0100] Ovde opisani antismisleni lanac može imati region komplementarnosti sa HBsAg transkriptom koji sadrži jednu ili više nepodudarnosti u poređenju sa odgovarajućom sekvencom transkripta. Region komplementarnosti na oligonukleotidu može imati do 1, do 2, do 3, do 4, do 5, itd. nepodudarnosti pod uslovom da zadrži sposobnost formiranja komplementarnih parova baza sa transkriptom pod odgovarajućim uslovima hibridizacije. Alternativno, region komplementarnosti oligonukleotida može imati ne više od 1, ne više od 2, ne više od 3, ne više od 4, ili ne više od 5 nepodudaranja pod uslovom da održava sposobnost formiranja komplementarnih parova baza sa HBsAg mRNK pod odgovarajućim uslovima hibridizacije. U nekim otelotvorenjima, ako postoji više od jedne nepodudarnosti u regionu komplementarnosti, one mogu biti postavljene uzastopno (npr.2, 3, 4, ili više u nizu), ili raspoređene na čitav region komplementarnosti, pod uslovom da oligonukleotid održava sposobnost da formira komplementarne parove baza sa HBsAg mRNK pod odgovarajućim uslovima hibridizacije.
iii. Jednolančani oligonukleotidi
[0101] Ovde opisani oligonukleotidi za smanjenje ekspresije HBsAg kao što je ovde opisano mogu biti jednolančani oligonukleotidi koji su komplementarni sa HBsAg iRNK. Takve strukture mogu uključivati, ali nisu ograničene na, jednolančane RNKi oligonukleotide.
Nedavni napori su pokazali aktivnost jednolančanih RNKi oligonukleotida (videti npr. Matsui et al. (maj 2016), Molecular Therapy, Vol.24(5), 946-955). Međutim, ovde navedeni oligonukleotidi mogu biti antismisleni oligonukleotidi (ASO). Antismisleni oligonukleotid je jednolančani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu koja, kada je napisana u pravcu od 5' do 3', sadrži obrnuti komplement ciljanog segmenta određene nukleinske kiseline i na odgovarajući način je modifikovan (npr. kao gapmer) tako da indukuje cepanje ciljne RNK u ćelijama posredovano RNaseH ili (npr. kao mixmer) tako da inhibira translaciju ciljne mRNK u ćelijama. Antismisleni oligonukleotidi za upotrebu u ovom pronalasku mogu biti modifikovani na bilo koji pogodan način poznat u tehnici uključujući, na primer, način prikazan u US patent br.9.567.587, koji otkriva modifikaciju antismislenog oligonukleotida (uključujući, npr. dužinu, šećerne ostatke nukleobaze (pirimidin, purin) i promene heterocikličkog dela nukleobaze). Dalje, antismisleni molekuli se decenijama koriste za smanjenje ekspresije specifičnih ciljnih gena (videti npr. Bennett et al.; Pharmacology of Antisense Drugs, Annual Review of Pharmacology and Toxicology, Vol.57: 81-105).
4
iv. Modifikacije oligonukleotida
[0102] Oligonukleotidi mogu biti modifikovani na različite načine da bi se poboljšala ili kontrolisala specifičnost, stabilnost, isporuka, biodostupnost, otpornost na degradaciju nukleaze, imunogenost, svojstva izdvajanja baza, distribucija RNK i ćelijski unos i druge karakteristike relevantne za terapeutsku ili istraživačku upotrebu. Videti npr. Bramsen et al., Nucleic Acids Res., 2009, 37, 2867-2881; Bramsen i Kjems (Frontiers in Genetics, 3 (2012): 1-22). Shodno tome, oligonukleotidi ovog pronalaska mogu uključivati jednu ili više pogodnih modifikacija. Ovde opisan modifikovani nukleotid može imati modifikaciju u svojoj bazi (ili nukleobazi), šećeru (npr. riboza, dezoksiriboza) ili fosfatnoj grupi.
[0103] Broj modifikacija na oligonukleotidu i pozicije tih nukleotidnih modifikacija mogu uticati na svojstva oligonukleotida. Na primer, oligonukleotidi se mogu isporučiti in vivo tako što će biti konjugovani sa ili obuhvaćeni lipidnim nanočesticama (LNP) ili sličnim nosačem. Međutim, kada oligonukleotid nije zaštićen LNP ili sličnim nosačem, može biti korisno da bar neki od njegovih nukleotida budu modifikovani. Shodno tome, u bilo kom od oligonukleotida datih ovde, svi ili suštinski svi nukleotidi oligonukleotida mogu biti modifikovani. Ovde opisano, više od polovine nukleotida može biti modifikovano. Ovde opisano, manje od polovine nukleotida može biti modifikovano. Tipično, sa ogoljenom isporukom, svaki šećer je modifikovan na 2'-poziciji. Ove modifikacije mogu biti reverzibilne ili nepovratne.
Oligonukleotid kako je ovde otkriven može imati broj i tip modifikovanih nukleotida dovoljan da izazove željenu karakteristiku (npr. zaštita od enzimske degradacije, sposobnost ciljanja željene ćelije posle in vivo davanja i/ili termodinamička stabilnost).
a. Modifikacije šećera
[0104] Modifikovani šećer (koji se ovde takođe naziva analog šećera) uključuje modifikovani ostatak dezoksiriboze ili riboze, npr. u kojoj se jedna ili više modifikacija dešavaju na poziciji 2', 3', 4' i/ili 5' ugljenika u šećeru. Ovde opisan modifikovani šećer može takođe uključivati alternativne strukture ugljenika koje se ne javljaju u prirodi, kao što su one prisutne u zaključanim nukleinskim kiselinama („LNA“) (videti, npr. Koshkin et al. (1998), Tetrahedron 54, 3607-3630), otključanim nukleinskim kiseline („UNA“) (videti, npr. Snead et al. (2013), Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2, e103), i premoštene nukleinske kiseline („BNA“) (videti, npr. Imanishi i Obika (2002), The Royal Society of Chemistry, Chem. Commun., 1653-1659).
[0105] Ovde opisana modifikacija nukleotida u šećeru može da sadrži 2'-modifikaciju. 2'-modifikacija može biti 2'-aminoetil, 2'-fluoro, 2'-O-metil, 2'-O-metoksietil i 2'-dezoksi-2'-fluoro-β-d-arabinonukleotidna kiselina. Tipično, modifikacija je 2'-fluoro, 2'-O-metil ili 2'-O-metoksietil. Ovde opisana modifikacija u šećeru može da sadrži modifikaciju prstena šećera, koja može da sadrži modifikaciju jednog ili više ugljenika u prstenu šećera. Na primer, modifikacija šećera nukleotida može da sadrži 2'-kiseonik šećera koji je vezan za 1'-ugljenik ili 4'-ugljenik šećera, ili je 2'-kiseonik vezan za 1'-ugljenik ili 4'-ugljenik preko etilenskog ili metilenskog mosta. Ovde opisan modifikovani nukleotid može imati aciklični šećer koji nema vezu 2'-ugljenika prema 3'-ugljeniku. Modifikovani nukleotid može imati tiol grupu, npr. na položaju 4' šećera.
[0106] Terminalna grupa 3'-kraja (npr.3'-hidroksil) može biti fosfatna grupa ili druga grupa, koja se može koristiti, na primer, za vezivanje linkera, adaptera ili oznaka ili za direktnu ligaciju oligonukleotida za drugu nukleinsku kiselinu.
b. 5' Terminalni fosfati
[0107] U nekim otelotvorenjima, 5'-terminalne fosfatne grupe oligonukleotida pojačavaju interakciju sa Argonautom 2. Međutim, oligonukleotidi koji sadrže 5'-fosfatnu grupu mogu biti podložni degradaciji preko fosfataza ili drugih enzima, što može ograničiti njihovu bioraspoloživost in vivo. Ovde opisani oligonukleotidi mogu uključivati analoge 5' fosfata koji su otporni na takvu degradaciju. Analog fosfata može biti oksimetilfosfonat, vinilfosfonat ili malonilfosfonat. Ovde opisan 5' kraj oligonukleotidnog lanca može biti vezan za hemijski ostatak koji oponaša elektrostatička i sterična svojstva prirodne 5'-fosfatne grupe ("fosfatni imitator") (videti, npr. Prakash et al. (2015), Nucleic Acids Res., Nucleic Acids Res.31. mart 2015. 43(6): 2993-3011). Razvijeno je mnogo imitatora fosfata koji se mogu pričvrstiti na 5' kraj (videti npr. US patent br.8.927.513). Druge modifikacije su razvijene za 5' kraj oligonukleotida (videti npr. VO 2011/133871). Ovde opisana hidroksilna grupa može biti vezana za 5' kraj oligonukleotida.
[0108] Ovde opisani oligonukleotid može imati analog fosfata na 4'-ugljeničnom položaju šećera (koji se naziva "4'-fosfatni analog"). Videti, na primer, Privremenu US prijavu broj 62/383.207, pod nazivom 4'-fosfatni analozi i oligonukleotidi koji sadrže iste, podnetu 2. septembra 2016., i 62/393.401, podnetu 12.09.2016, pod nazivom 4'-fosfatni analozi i oligonukleotidi koji sadrže iste. Ovde opisan oligonukleotid koji je ovde dat može da sadrži 4'-fosfatni analog na 5'-terminalnom nukleotidu. Ovde opisan analog fosfata može biti oksimetilfosfonat, u kome je atom kiseonika oksimetil grupe vezan za ostatak šećera (npr. na svom 4'-ugljeniku) ili njegov analog. Ovde opisan 4'-fosfatni analog može biti tiometilfosfonat ili aminometilfosfonat, u kome je atom sumpora tiometil grupe ili atom azota aminometil grupe vezan za 4'-ugljenik šećernog ostatka ili njegovog analoga. Ovde opisan, analog 4'-fosfata može biti oksimetilfosfonat. Oksimetilfosfonat je predstavljen formulom -O-CH2-PO(OH)2ili -O-CH2-PO(OR)2u kojoj je R nezavisno izabran od H, CH3, alkil grupa, CH2CH2CN, CH2OCOC(CH3)3, CH2OCH2CH2Si(CH3)3, ili zaštitne grupe. Ovde opisana alkil grupa može biti CH2CH3. Tipičnije, R se nezavisno bira između H, CH3, ili CH2CH3.
[0109] Ovde opisan fosfatni analog vezan za oligonukleotid može biti metoksi fosfonat (MOP). Ovde opisan fosfatni analog vezan za oligonukleotid može biti 5' mono-metilom zaštićen MOP. Može se koristiti sledeći uridin nukleotid koji sadrži analog fosfata, npr. na prvoj poziciji vodeće (antismislene) niti, opisan ovde:
koji modifikovani nukleotid se naziva [Mefosfonat-4O-mU] ili 5'-metoksi, fosfonat-4'oksi-2'-O-metiluridin.
c. Modifikovane veze između nukleotida
[0110] Ovde opisane modifikacije ili supstitucije fosfata mogu dovesti do oligonukleotida koji sadrži najmanje jednu (npr. najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3 ili najmanje 5) modifikovani veza između nukleotida. Ovde opisan, bilo koji od ovde otkrivenih oligonukleotida može da sadrži 1 do 10 (npr.1 do 10, 2 do 8, 4 do 6, 3 do 10, 5 do 10, 1 do 5, 1 do 3 ili 1 do 2) modifikovanih veza između nukleotida. Ovde opisan, bilo koji od ovde otkrivenih oligonukleotida može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 modifikovanih veza između nukleotida.
[0111] Modifikovana veza između nukleotida može biti fosforotioatna veza, fosforotioatna veza, fosfotriestarska veza, tionoalkilfosfonatna veza, tionoalkilfosfotriestarska veza, fosfororamiditna veza fosfonatna veza ili boranofosfatna veza. Ovde opisana najmanje jedna modifikovana veza između nukleotida bilo kog od oligonukleotida kako je ovde otkrivena može biti fosforotioatna veza.
d. Modifikacije baze
[0112] Ovde opisani oligonukleotidi koji su dati ovde mogu imati jednu ili više modifikovanih nukleobaza. Modifikovane nukleobaze (koje se ovde takođe pominju kao analozi baze) mogu biti vezane na 1' poziciji šećernog ostatka nukleotida. Ovde opisana modifikovana nukleobaza može biti azotna baza. Ovde opisana modifikovana nukleobaza možda ne sadrži atom azota. Videti, npr. Patentna prijava br.20080274462 objavljena u US. Ovde opisan modifikovani nukleotid može da sadrži univerzalnu bazu. Međutim, takođe ovde opisan modifikovani nukleotid možda ne sadrži nukleobazu (abazični).
[0113] Ovde opisana univerzalna baza može biti heterociklični ostatak lociran na 1' poziciji šećernog ostatka nukleotida u modifikovanom nukleotidu, ili ekvivalentnom položaju u supstituciji šećernog ostatka nukleotida koji, kada je prisutan u dupleksu, može biti pozicioniran nasuprot više nego jednog tipa baze bez suštinske promene strukture dupleksa. U poređenju sa referentnom jednolančanom nukleinskom kiselinom (npr. oligonukleotid) koja je potpuno komplementarna sa ciljnom nukleinskom kiselinom, jednolančana nukleinska kiselina koja sadrži univerzalnu bazu može formirati dupleks sa ciljnom nukleinskom kiselinom koja ima niži Tmnego dupleks formiran sa komplementarnom nukleinskom kiselinom. Međutim, u poređenju sa referentnom jednolančanom nukleinskom kiselinom u kojoj je univerzalna baza zamenjena bazom da bi se stvorila jedna nepodudarnost, jednolančana nukleinska kiselina koja sadrži univerzalnu bazu može formirati dupleks sa ciljnom nukleinskom kiselinom koja ima viši Tmnego dupleks formiran sa nukleinskom kiselinom koja sadrži bazu koja se ne poklapa.
[0114] Neograničavajući primeri univerzalno vezujućih nukleotida uključuju inozin, 1-β-D-ribofuranozil-5-nitroindol i/ili 1-β-D-ribofuranozil)-3-nitropirol (US. pat. prijava br.
20070254362 za Quay et al.; Van Aerschot et al., Aciklični analog 5-nitroindazol nukleotida kao dvosmislen nukleozid. Nucleic Acids Res.11. nov.1995;23(21):4363-70; Loakes et al., 3-nitropirol i 5-nitroindol kao univerzalne baze u prajmerima za sekvenciranje DNK i PCR. Nucleic Acids Res.11. jul 1995; 23(13):2361-6; Loakes i Brown, 5-nitroindol kao univerzalni analog baze. Nucleic Acids Res.11. okt.1994;22(20):4039-43.
e. Reverzibilne modifikacije
[0115] Iako mogu da se naprave određene modifikacije za zaštitu oligonukleotida od in vivo sredine pre nego što dođu do ciljnih ćelija, one mogu da smanje snagu ili aktivnost oligonukleotida kada stigne u citosol ciljne ćelije. Mogu se napraviti reverzibilne modifikacije tako da molekul zadrži željena svojstva izvan ćelije, koja se zatim uklanjaju pri ulasku u citosolno okruženje ćelije. Reverzibilna modifikacija se može ukloniti, na primer, delovanjem intracelularnog enzima ili hemijskim uslovima unutar ćelije (npr. kroz redukciju intracelularnim glutationom).
[0116] Reverzibilno modifikovani nukleotid može da sadrži ostatak osetljiv na glutation. Tipično, molekuli nukleinske kiseline su hemijski modifikovani cikličnim disulfidnim delovima da bi se maskirao negativni naboj stvoren difosfatnim vezama unutar nukleotida i poboljšao ćelijski unos i otpornost na nukleazu. Videti objavljenu prijavu u SAD br.
2011/0294869 prvobitno dodeljenu kompaniji Traversa Therapeutics, Inc. („Traversa“), PCT publikaciju br. WO 2015/188197 Solstice Biologics, Ltd. („Solstice“), Meade et al., Nature Biotechnology, 2014, 32:1256-1263 ("Meade"), PCT publikacija br. WO 2014/088920 za Merck Sharp & Dohme Corp. Ova reverzibilna modifikacija difosfatnih veza unutar nukleotida je projektovana da se cepa unutar ćelije, smanjujući okruženje citosola (npr. glutation). Raniji primeri uključuju neutralizovane modifikacije fosfotriestara za koje je prijavljeno da se mogu cepati unutar ćelija (Dellinger et al. J. Am. Chem. Soc.2003,125:940-950).
[0117] Takva reverzibilna modifikacija može omogućiti zaštitu tokom in vivo administracija (na primer, prolaska kroz krv i/ili lizozomalne/endozomalne delove ćelije) gde će oligonukleotid biti izložen nukleazama i drugim teškim uslovima okoline (npr. pH). Kada se otpusti u citosol ćelije u kojoj su nivoi glutationa viši u poređenju sa ekstracelularnim prostorom, modifikacija je obrnuta i rezultat je cepani oligonukleotid. Koristeći reverzibilne ostatke osetljive na glutation, moguće je uvesti sterički veće hemijske grupe u oligonukleotid od interesa u poređenju sa opcijama dostupnim korišćenjem ireverzibilnih hemijskih modifikacija. To je zato što će ove veće hemijske grupe biti uklonjene u citosolu i stoga ne bi trebalo da ometaju biološku aktivnost oligonukleotida unutar citosola ćelije. Kao rezultat, ove veće hemijske grupe mogu biti konstruisane da daju različite prednosti nukleotidu ili oligonukleotidu, kao što su otpornost na nukleaze, lipofilnost, naelektrisanje, termička stabilnost, specifičnost i smanjena imunogenost. Struktura ostatka osetljivog na glutation može biti konstruisana da modifikuje kinetiku njegovog oslobađanja.
[0118] Ovde opisan ostatak osetljiv na glutation može biti vezan za šećer nukleotida. Ovde opisan ostatak osetljiv na glutation može biti vezan za 2'-ugljenik šećera modifikovanog nukleotida. Takođe ovde opisan ostatak osetljiv na glutation može se nalaziti na 5'-ugljeniku šećera, posebno kada je modifikovani nukleotid 5'-terminalni nukleotid oligonukleotida. Ovde opisan ostatak osetljiv na glutation može se nalaziti na 3'-ugljeniku šećera, posebno kada je modifikovani nukleotid 3'-terminalni nukleotid oligonukleotida. Ovde opisan ostatak osetljiv na glutation može da sadrži sulfonil grupu. Videti npr., US Patentnu prijavu br.62/378.635, pod nazivom Kompozicije koje sadrže reverzibilno modifikovane oligonukleotide i njihove upotrebe, koja je podneta 23. avgusta 2016. godine.
v. Ciljajući ligandi
[0119] Može biti poželjno da se oligonukleotidi iz ovog otkrića ciljaju na jednu ili više ćelija ili jedan ili više organa. Takva strategija može pomoći da se izbegnu neželjeni efekti u drugim organima ili se može izbeći neopravdani gubitak oligonukleotida u ćelijama, tkivu ili organima koji ne bi imali koristi od oligonukleotida. Shodno tome, oligonukleotidi koji su ovde otkriveni mogu biti modifikovani da bi se olakšalo ciljanje određenog tkiva, ćelije ili organa, npr. da bi se olakšala isporuka oligonukleotida u jetru. Oligonukleotidi koji su ovde otkriveni mogu biti modifikovani da bi se olakšala isporuka oligonukleotida u hepatocite jetre. Ovde opisani oligonukleotid može da sadrži nukleotid koji je konjugovan sa jednim ili više ciljajućih liganda.
[0120] Ciljajući ligand može da sadrži ugljene hidrate, amino šećer, holesterol, peptid, polipeptid, protein ili deo proteina (npr. antitelo ili fragment antitela) ili lipid. Ovde opisan ciljajući ligand može biti aptamer. Na primer, ciljajući ligand može biti RGD peptid koji se koristi za ciljanje tumorske vaskulature ili ćelija glioma, CREKA peptid za ciljanje tumorske vaskulature ili stome, transferin, laktoferin ili aptamer za ciljanje receptora transferina
4
eksprimiranih na vaskulaturi centralnog nervnog sistema, ili anti-EGFR antitelo za ciljanje EGFR na ćelijama glioma. Ovde opisan ciljani ligand može biti jedan ili više GalNAc ostataka.
[0121] Ovde opisan 1 ili više (npr.1, 2, 3, 4, 5 ili 6) nukleotida oligonukleotida mogu biti konjugovani svaki sa posebnim ciljajućim ligandom. Ovde opisan svaki od 2 do 4 nukleotida oligonukleotida može biti konjugovan sa posebnim ciljajućim ligandom. Ovde opisani ciljajući ligandi mogu biti konjugovani sa 2 do 4 nukleotida na oba kraja smislenog i antismislenog lanca (npr. ligandi su konjugovani na 2 do 4 prepusta nukleotida ili produžetak na 5' ili 3' kraju smislenog ili antismislenog lanca) tako da ciljajući ligandi podsećaju na čekinje četkice za zube, a oligonukleotid podseća na četkicu za zube. Na primer, oligonukleotid može da sadrži matičnu petlju na 5' ili 3' kraju smislenog lanca i 1, 2, 3 ili 4 nukleotida petlje stabla mogu biti pojedinačno konjugovana sa ciljajućim ligandom.
[0122] Može biti poželjno da se oligonukleotid koji smanjuje ekspresiju HBV antigena usmerava u hepatocite jetre ispitanika. Za ovu svrhu može se koristiti bilo koji odgovarajući ostatak koji cilja hepatocite.
[0123] GalNAc je ligand visokog afiniteta za azialoglikoproteinski receptor (ASGPR), koji je prvenstveno eksprimiran na sinusoidnoj površini ćelija hepatocita i ima glavnu ulogu u vezivanju, internalizaciji i naknadnom čišćenju cirkulišućih glikoproteina koji sadrže ostatke terminalne galaktoze ili N-acetilgalaktozamina (azialoglikoproteini). Konjugacija (bilo indirektna ili direktna) GalNAc ostataka sa oligonukleotidima iz ovog otkrića može se koristiti za usmeravanje ovih oligonukleotida na ASGPR eksprimiran na ovim ćelijama hepatocita.
[0124] Ovde opisan oligonukleotid ovog pronalaska može biti konjugovan direktno ili indirektno sa monovalentnim GalNAc. Ovde opisan oligonukleotid može biti konjugovan direktno ili indirektno sa više od jednog monovalentnog GalNAc (tj. je konjugovan sa 2, 3 ili 4 monovalentna GalNAc ostatka, i tipično je konjugovan sa 3 ili 4 monovalentna GalNAc ostatka). Ovde opisan oligonukleotid ovog pronalaska može biti konjugovan sa jednim ili više bivalentnih GalNAc, trovalentnih GalNAc ili tetravalentnih GalNAc ostataka.
[0125] Svaki od ovde opisanih 1 ili više (npr.1, 2, 3, 4, 5 ili 6) nukleotida oligonukleotida može biti konjugovan sa GalNAc ostatkom. Svaki od ovde opisanih 2 do 4 nukleotida petlje (L) matične petlje može biti konjugovan sa zasebnim GalNAc. Ovde opisani ciljajući ligandi mogu biti konjugovani sa 2 do 4 nukleotida na oba kraja smislenog i antismislenog lanca (npr. ligandi su konjugovani na 2 do 4 prepusta nukleotida ili produžetak na 5' ili 3' kraju smislenog ili antismislenog lanca) tako da BalNAc ostaci podsećaju na čekinje četkice za zube, a oligonukleotid podseća na četkicu za zube. Na primer, oligonukleotid može da sadrži matičnu petlju na 5' ili 3' kraju smislenog lanca i 1, 2, 3 ili 4 nukleotida petlje stabla mogu biti pojedinačno konjugovana sa GalNAc ostatkom. Ovde opisani GalNAc ostaci mogu biti konjugovani sa nukleotidom smislenog lanca. Na primer, četiri GalNAc ostatka mogu biti konjugovana sa nukleotidima u tetrapetlji smislenog lanca, gde je svaki GalNAc ostatak konjugovan sa jednim nukleotidom.
[0126] Ovde opisani oligonukleotid može da sadrži monovalentni GalNac vezan za gvanidin nukleotid, što se naziva [ademG-GalNAc] ili 2'-aminodietoksimetanol-Gvanidin-GalNAc, kao što je prikazano u nastavku:
[0127] Ovde opisani oligonukleotid može da sadrži monovalentni GalNac vezan za adenin nukleotid, što se naziva [ademA-GalNAc] ili 2'-aminodietoksimetanol-Adenin-GalNAc, kao što je prikazano u nastavku.
[0128] Primer takve konjugacije je prikazan ispod za petlju koja sadrži od 5' do 3' nukleotidne sekvence GAAA (L = linker, X = heteroatom) tačke vezivanja stabla su prikazane ispod. Takva petlja može biti prisutna, na primer, na pozicijama 27-30 molekula prikazanog na SL.
1A. U hemijskoj formuli, je tačka vezivanja za oligonukleotidni lanac.
[0129] Odgovarajuće metode ili hemija (npr. klik hemija) se može koristiti za povezivanje ciljajućeg liganda sa nukleotidom. Ovde opisan ciljajući ligand može biti konjugovan sa nukleotidom korišćenjem klik linkera. Ovde opisani linker na bazi acetala može se koristiti za konjugovanje ciljajućeg liganda sa nukleotidom bilo kog od oligonukleotida opisanih ovde. Linkeri zasnovani na acetalu su otkriveni, na primer, u publikaciji međunarodne patentne
4
prijave broj WO2016100401 A1, koja je objavljena 23. juna 2016.. Linker može biti labilan linker. Međutim, linker može biti prilično stabilan.
[0130] Primer je prikazan ispod za petlju koja sadrži od 5' do 3' nukleotide GAAA, u kojoj su GalNac ostaci vezani za nukleotide petlje korišćenjem acetalnog linkera. Takva petlja može biti prisutna, na primer, na pozicijama 27-30 molekula prikazanog na SL.10. U hemijskoj formuli, je tačka vezivanja za oligonukleotidni lanac.
III. Formulacije
[0131] Razvijene su različite formulacije da bi se olakšala upotreba oligonukleotida. Na primer, oligonukleotidi se mogu isporučiti ispitaniku ili ćelijskom okruženju korišćenjem formulacije koja minimizira degradaciju, olakšava isporuku i/ili uzimanje, ili obezbeđuje drugu korisnu osobinu oligonukleotida u formulaciji. Ovde su opisane kompozicije koje sadrže oligonukleotide (npr. jednolančani ili dvolančani oligonukleotidi) za smanjenje ekspresije HBV antigena (npr. HBsAg). Takve kompozicije mogu biti na odgovarajući način formulisane tako da kada se daju ispitaniku, bilo u neposredno okruženje ciljne ćelije ili sistemski, dovoljan deo oligonukleotida ulazi u ćeliju da smanji ekspresiju HBV antigena. Bilo koja od različitih pogodnih oligonukleotidnih formulacija može se koristiti za isporuku oligonukleotida za smanjenje HBV antigena kao što je ovde otkriveno. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid pronalaska je formulisan u puferskim rastvorima kao što su fiziološki rastvori puferovani fosfatom, lipozomi, micelarne strukture i kapsidi.
[0132] Formulacije oligonukleotida sa katjonskim lipidima mogu se koristiti da olakšaju transfektovanje oligonukleotida u ćelije. Na primer, katjonski lipidi, kao što su lipofektin, katjonski derivati glicerola i polikationski molekuli (npr. polilizin). Pogodni lipidi uključuju oligofektamin, lipofektamin (Life Technologies), NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, Kolorado) ili FuGene 6 (Roche) koji se svi mogu koristiti prema uputstvima proizvođača.
[0133] Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, formulacija sadrži nanočestice lipida. U nekim otelotvorenjima, ekscipijent sadrži lipozom, lipid, lipidni kompleks, mikrosferu, mikročesticu, nanosferu ili nanočesticu, ili može biti drugačije formulisan za davanje u ćelije, tkiva, organe ili telo ispitanika kome je to potrebno (videti, npr. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22. izdanje, Pharmaceutical Press, 2013).
[0134] U nekim otelotvorenjima, formulacije kako su ovde otkrivene sadrže ekscipijent. U nekim otelotvorenjima, ekscipijent daje kompoziciji poboljšanu stabilnost, poboljšanu apsorpciju, poboljšanu rastvorljivost i/ili terapeutsko poboljšanje aktivnog sastojka. U nekim otelotvorenjima, ekscipijent je agens za puferovanje (npr. natrijum citrat, natrijum fosfat, tris baza ili natrijum hidroksid) ili vehikulum (npr. puferovani rastvor, petrolatum, dimetil sulfoksid ili mineralno ulje). U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid se liofilizuje da bi se produžio njegov vek trajanja, a zatim se pretvara u rastvor pre upotrebe (npr. davanje ispitaniku). Shodno tome, ekscipijent u kompoziciji koja sadrži bilo koji od oligonukleotida opisanih ovde može biti lioprotektant (npr. manitol, laktoza, polietilen glikol ili polivinil pirolidon) ili modifikator temperature kolapsa (npr. dekstran, fikol ili želatin).
[0135] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je formulisana tako da bude kompatibilna sa svojim predviđenim načinom primene. Primeri puteva primene uključuju
4
parenteralni, npr. intravenozna, intradermalna, subkutana, oralna (npr. inhalacija), transdermalna (topikalna), transmukozna i rektalna primena.
[0136] Farmaceutske kompozicije pogodne za injektabilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore (ako su rastvorljivi u vodi) ili disperzije i sterilne prahove za ekstemporalnu pripremu sterilnih rastvora ili disperzija za injektiranje. Za intravensku primenu, pogodni nosači uključuju fiziološki rastvor, bakteriostatsku vodu, Cremophor EL.TM. (BASF, Parsippany, N.J.) ili fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS). Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), i njihove pogodne smeše. U mnogim slučajevima, biće poželjno da se u kompoziciju uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su manitol, sorbitol i natrijum hlorid. Sterilni rastvori za injekcije se mogu pripremiti ugrađivanjem oligonukleotida u potrebnoj količini u odabrani rastvarač sa jednim ili više kombinovanih sastojaka nabrojanih iznad, prema potrebi, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija.
[0137] U nekim otelotvorenjima, kompozicija može da sadrži najmanje oko 0,1% terapeutskog agensa (oligonukleotid pronalaska za smanjenje ekspresije HBV antigena) ili više, iako procenat aktivnog(ih) sastoj(a)ka može biti između oko 1% i oko 80% ili više težine ili zapremine ukupne kompozicije. Faktori kao što su rastvorljivost, biodostupnost, biološki polu-život, način primene, rok trajanja proizvoda, kao i druga farmakološka razmatranja biće razmatrani od strane stručnjaka u oblasti pripreme takvih farmaceutskih formulacija, i u tom smislu, različite doze i režimi lečenja mogu biti poželjni.
[0138] Iako su brojna otelotvorenja usmerena na isporuku bilo kog od oligonukleotida pronalaska usmerenu na jetru, takođe se razmatra ciljanje na druga tkiva.
iv. Način upotrebe
i. Smanjenje ekspresije HBsAg
[0139] U nekim otelotvorenjima, in vitro obezbeđuju se metode za isporuku u ćeliju efikasne količine bilo kog od oligonukleotida pronalaska u svrhu smanjenja ekspresije HBsAg. Ovde date metode su korisne u bilo kom odgovarajućem tipu ćelije. Ćelija je svaka ćelija koja eksprimira HBV antigen (npr. hepatociti, makrofage, ćelije izvedene iz monocita, ćelije
4
kancera prostate, ćelije mozga, endokrinog tkiva, kostne srži, limfnih čvorova, pluća, žučne kese, jetre, duodenuma, tankog creva, pankreasa, bubrega, gastrointestinalnog trakta, bešike, masnog i mekog tkivo i kože). U nekim otelotvorenjima, ćelija je primarna ćelija koja je dobijena od ispitanika i koja je možda prošla kroz ograničen broj prolaza, tako da ćelija u suštini održava svoja prirodna fenotipska svojstva. Ćelija u koju se isporučuje oligonukleotid može biti ex vivo ili in vitro (tj. može biti isporučen u ćeliju u kulturi ili u organizam u kome se ćelija nalazi). U specifičnim otelotvorenjima, in vitro metode su date za isporuku efikasne količine bilo kog od oligonukleotida pronalaska u ćeliju u svrhu smanjenja ekspresije HBsAg isključivo u hepatocitima.
[0140] U nekim otelotvorenjima, oligonukleotidi pronalaska se mogu uvesti korišćenjem odgovarajućih metoda isporuke nukleinske kiseline uključujući ubrizgavanje rastvora koji sadrži oligonukleotide, bombardovanje česticama prekrivenim oligonukleotidima, izlaganje ćelije ili organizma rastvoru koji sadrži oligonukleotide ili elektroporaciju ćelijske membrane u prisustvu oligonukleotida. Mogu se koristiti i druge odgovarajuće metode za isporuku oligonukleotida u ćelije, kao što je transport nosača posredovan lipidima, hemijski posredovan transport i katjonska transfekcija lipozoma kao što je kalcijum fosfat i drugi.
[0141] Posledice inhibicije mogu se potvrditi odgovarajućim testom za procenu jednog ili više svojstava ćelije ili subjekta, ili biohemijskim tehnikama koje procenjuju molekule koji ukazuju na ekspresiju HBV antigena (npr. RNK, protein). U nekim otelotvorenjima, stepen do kojeg oligonukleotid pronalaska smanjuje nivoe ekspresije HBV antigena procenjuje se poređenjem nivoa ekspresije (npr. nivoe mRNK ili proteina) HBV antigena na odgovarajuću kontrolu (npr. nivo ekspresije HBV antigena u ćeliji ili populaciji ćelija kojima oligonukleotid nije isporučen ili kojima je isporučena negativna kontrola). U nekim otelotvorenjima, odgovarajući kontrolni nivo ekspresije HBV antigena može biti unapred određen nivo ili vrednost, tako da kontrolni nivo ne mora da se meri svaki put. Unapred određen nivo ili vrednost može imati različite oblike. U nekim otelotvorenjima, unapred određeni nivo ili vrednost može biti pojedinačna granična vrednost, kao što je medijana ili srednja vrednost.
[0142] Primena oligonukleotida pronalaska dovodi do smanjenja nivoa ekspresije HBsAg u ćeliji. U nekim otelotvorenjima, smanjenje nivoa ekspresije HBsAg može biti smanjenje na 1% ili manje, 5% ili manje, 10% ili manje, 15% ili manje, 20% ili manje, 25% ili manje, 30%
4
ili manje, 35% ili manje, 40% ili manje, 45% ili manje, 50% ili manje, 55% ili manje, 60% ili manje, 70% ili manje, 80% ili manje, ili 90% ili manje u poređenju sa odgovarajućim kontrolnim nivoom antigena HBV. Odgovarajući nivo kontrole može biti nivo ekspresije HBV antigena u ćeliji ili populaciji ćelija koje nisu bile u kontaktu sa oligonukleotidom kao što je ovde opisano. U nekim otelotvorenjima, efekat isporuke oligonukleotida u ćeliju u skladu sa metodom pronalaska se procenjuje nakon konačnog vremenskog perioda. Na primer, nivoi HBV antigena se mogu analizirati u ćeliji najmanje 8 sati, 12 sati, 18 sati, 24 sata; ili najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, četrnaest, dvadeset jedan, dvadeset osam, trideset pet, četrdeset dva, četrdeset devet, pedeset šest, šezdeset tri, sedamdeset, sedamdeset sedam, osamdeset četiri, devedeset jedan, devedeset osam, 105, 112, 119, 126, 133, 140 ili 147 dana nakon uvođenja oligonukleotida u ćeliju.
[0143] U nekim otelotvorenjima, smanjenje nivoa ekspresije HBsAg traje duži vremenski period nakon primene. U nekim otelotvorenjima, smanjenje ekspresije HBsAg koje se može detektovati traje u periodu od 7 do 70 dana nakon primene oligonukleotida opisanog ovde. Na primer, u nekim otelotvorenjima, smanjenje koje se može detektovati traje u periodu od 10 do 70, 10 do 60, 10 do 50, 10 do 40, 10 do 30 ili 10 do 20 dana nakon primene oligonukleotida. U nekim otelotvorenjima, smanjenje koje se može detektovati traje u periodu od 20 do 70, 20 do 60, 20 do 50, 20 do 40 ili 20 do 30 dana nakon primene oligonukleotida. U nekim otelotvorenjima, smanjenje koje se može detektovati traje u periodu od 30 do 70, 30 do 60, 30 do 50 ili 30 do 40 dana nakon primene oligonukleotida. U nekim otelotvorenjima, smanjenje koja se može detektovati traje u periodu od 40 do 70, 40 do 60, 40 do 50, 50 do 70, 50 do 60 ili 60 do 70 dana nakon primene oligonukleotida.
[0144] U nekim otelotvorenjima, smanjenje ekspresije HBsAg koje se može detektovati traje u periodu od 2 do 21 nedelje nakon primene oligonukleotida pronalaska. Na primer, u nekim otelotvorenjima, smanjenje koje se može detektovati traje u periodu od 2 do 20, 4 do 20, 6 do 20, 8 do 20, 10 do 20, 12 do 20, 14 do 20, 16 do 20 ili 18 do 20 nedelja nakon primene oligonukleotida. U nekim otelotvorenjima, smanjenje koje se može detektovati traje u periodu od 2 do 16, 4 do 16, 6 do 16, 8 do 16, 10 do 16, 12 do 16 ili 14 do 16 nedelja nakon primene oligonukleotida. U nekim otelotvorenjima, smanjenje koje se može detektovati traje u periodu od 2 do 12, 4 do 12, 6 do 12, 8 do 12 ili 10 do 12 nedelja nakon primene oligonukleotida. U
4
nekim otelotvorenjima, smanjenje koje se može detektovati traje u periodu od 2 do 10, 4 do 10, 6 do 10 ili 8 do 10 nedelja nakon primene oligonukleotida.
ii. Metode lečenja
[0145] Aspekti otkrića se odnose na metode za smanjenje ekspresije HBsAg (npr. smanjenje ekspresije HBsAg) za lečenje infekcije HBV kod ispitanika. Ovde opisani, postupci mogu da obuhvataju davanje ispitaniku kome je to potrebno efikasne količine bilo kog od oligonukleotida koji su ovde otkriveni. Ovo otkriće obezbeđuje i profilaktičke i terapeutske metode lečenja ispitanika koji je pod rizikom (ili je podložan) infekciji HBV i/ili bolesti ili poremećaju povezanim sa infekcijom HBV.
[0146] U određenim aspektima, pronalazak obezbeđuje metodu za prevenciju kod ispitanika, bolesti ili poremećaja koji su ovde opisani davanjem terapeutskog agensa (npr. oligonukleotida). Ovde opisani ispitanik koji treba da se leči može biti ispitanik koji će imati terapeutske koristi od smanjenja količine HBsAg proteina, na primer, u jetri. Ispitanik u riziku od bolesti ili poremećaja mogu se identifikovati, na primer, na osnovu jednog ili više kombinovanih dijagnostičkih ili prognostičkih testova poznatih u tehnici (npr. identifikacija ciroze jetre i/ili upale jetre). Davanje profilaktičkog sredstva može se desiti pre otkrivanja ili ispoljavanja simptoma karakterističnih za bolest ili poremećaj, tako da se bolest ili poremećaj spreči ili, alternativno, da se odloži njeno napredovanje.
[0147] Ovde opisani postupci tipično uključuju davanje subjektu efikasne količine oligonukleotida, to jest, količine koja može da proizvede željeni terapeutski rezultat.
Terapeutski prihvatljiva količina može biti količina koja je sposobna da leči bolest ili poremećaj. Odgovarajuća doza za bilo kog ispitanika zavisiće od određenih faktora, uključujući veličinu subjekta, površinu tela, starost, konkretnu kompoziciju koja će se davati, aktivni(e) sastojak(e) u kompoziciji, vreme i način primene, opšte zdravlje, i druge lekovi koji se daju istovremeno. Na primer, doza može biti u opsegu od 0,1 mg/kg do 12 mg/kg. Doza takođe može biti u opsegu od 0,5 do 10 mg/kg. Alternativno, doza može biti u opsegu od 1,0 do 6,0 mg/kg. Doza takođe može biti u opsegu od 3,0 do 5,0 mg/kg.
[0148] Ovde opisanom ispitaniku se može davati bilo koja od ovde otkrivenih kompozicija bilo enteralno (npr. oralno, gastričnom sondom za unos, duodenalnom sondom za unos, putem
4
gastrostomije ili rektalno), parenteralno (npr. subkutana injekcija, intravenozna injekcija ili infuzija, intra-arterijska injekcija ili infuzija, intraosealna infuzija, intramuskularna injekcija, intracerebralna injekcija, intracerebroventrikularna injekcija, intratekalno), topikalno (npr. epikutano, inhalaciono, putem kapi za oči, ili kroz sluzokožu), ili direktnom injekcijom u ciljni organ (npr. jetra ispitanika). Tipično, oligonukleotidi opisani ovde se primenjuju intravenozno ili subkutano.
[0149] Kao neograničavajući skup primera, oligonukleotidi trenutnog otkrića bi se tipično davali tromesečno (jednom u tri meseca), dvomesečno (jednom u dva meseca), mesečno ili nedeljno. Na primer, oligonukleotidi se mogu davati svake jedne, dve ili tri nedelje.
Oligonukleotidi se mogu davati svakodnevno.
[0150] U nekim otelotvorenjima, ispitanik koji se leči je ljudski ili ne-humani primat ili drugi ispitanik sisar. Drugi ogledni ispitanici uključuju domaće životinje kao što su psi i mačke; stoku kao što su konji, goveda, svinje, ovce, koze i kokoške; i životinje kao što su miševi, pacovi, zamorci i hrčci.
PRIMERI
Primer 1 Razvoj potentnih oligonukleotidnih inhibitora ekspresije HBsAg
[0151] Površinski antigen HBV je identifikovan kao cilj za terapiju zasnovanu na RNAi za lečenje infekcije HBV. Kao što je prikazano u organizaciji HBV genoma prikazanoj na SL.1, HBsAg je kodiran sa tri molekula RNK transkribovana iz jednog ORF. Oligonukleotidi su projektovani za utišavanje jednog ili više transkripata RNK koji doprinose sklapanju HBsAg (primer ciljnog mesta RNKi označenog sa "X" na SL.1). Projektovan je i procenjen oligonukleotid HBV-254 koji cilja na HBsAg, in vitro i in vivo. HBV-254 je odabran i projektovan na osnovu sposobnosti da se direktno ciljaju transkripti mRNK za četiri HBV RNK vrste. HBV-254 dupleks oligonukleotid korišćen u eksperimentima uključivalo je smisleni lanac sekvence kao što je određeno u (prikazano 5' do 3'):
GUGGUGGACUUCUCUCAAUAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO:23); i antismisleni lanac sekvence kao što je određeno u (prikazano 5' do 3'):
UAUUGAGAGAAGUCCACCACGG (SEQ ID NO: 24).
[0152] Izvršena je procena pojedinačne doze oligonukleotida HBV-254 kod HDI miševa, demonstrirajući sposobnost subkutanog ciljanja virusnog transkripta HBsAg (SL.2). Kao što je prikazano, HBV-254 je sistematski smanjivao nivoe HBsAg kod miševa sa povećanjem doze. Predklinička potentnost je dalje procenjena kod miševa nakon režima doziranja 1×nedeljno×3 u kome je HBV-254 subkutano primenjen u dozi od 3 mg/kg (SL.3). Tačke davanja su označene strelicama na slici. Nivoi HBsAg su praćeni i kod miševa lečenih oligonukleotidom i kod nelečenih kontrolnih miševa tokom perioda od 147 dana. Smanjeni nivoi HBsAg su opstali kod lečenih miševa tokom čitave studije, pri čemu se činilo da se nivoi ekspresije (u odnosu na kontrolu) smiruju na smanjenoj osnovnoj liniji otprilike dva meseca nakon prve doze.
[0153] Dodatni potentni oligonukleotidi koji ciljaju HBsAg su identifikovani pomoću in vitro skrininga korišćenjem psiCHECK reporter testa sa oligonukleotidima u nemodifikovanom obliku tetrapetlje. Rezultati sa tri različite ploče su prikazani na SL.4. Svaki oligonukleotid, uključujući HBV-254, procenjen je u tri koncentracije (1, 10 i 100 pM) u HeLa ćelijama korišćenjem reporterskog testa zasnovanog na fluorescenciji. Rezultati prijavljeni za svaku ploču su dalje prikazani u poređenju sa pozitivnom kontrolom (8, 40 i 200 pM), negativnom kontrolom (1 nM) i lažnom transfekcijom. Oligonukleotidi prikazani označeni kutijama su uvećani za in vivo testiranje, u kojem je utvrđeno da su HBV-219 i HBV-258 najsnažniji oligonukleotidi među HBV-254 i onima identifikovanim skriningom. HBV-219 je pokazao višestruko poboljšanje u potenciji u odnosu na HBV-254 i izabran je za dodatnu evaluaciju.
Primer 2 Analiza očuvanja sekvenci i inženjerskog nepodudaranja za povećanje globalne terapeutske primene
[0154] Nekoliko najmoćnijih oligonukleotida procenjenih u Primeru 1 upoređeno je sa sekvencama genoma za HBV genotipove A-I. Rezultati početne analize očuvanja navedeni su u tabeli 1. Kao što je prikazano, HBV-219 ima relativno nizak procenat očuvanja u ovim genomima. Međutim, procenat očuvanja se značajno povećava (sa 66% na 96%) ako se nepodudaranje (MM) uvede na poziciju 15 vodećeg lanca. Podaci o sekvenci genotipizovanog virusa hepatitisa B (HBV) iz javne baze podataka GenBank korišćeni su za bioinformatičko skladištenje i usklađivanje.
Tabela 1. Početna analiza očuvanja sa gornjim HBV sekvencama
1
[0155] Preduzeta je naknadna analiza očuvanja, koja se fokusirala na nekoliko oligonukleotida iz tabele 1 i uključivala je šire parametre pretrage. Na primer, dok je početna analiza uključivala samo sekvence genoma pune dužine, fokusirana analiza je uključivala sekvence pune dužine i delimične sekvence (>80% identiteta za ciljanje mesta). Pored toga, broj ispitanih genoma porastao je sa 5.628 u početnoj analizi na više od 17.000 genoma u fokusiranoj analizi. Rezultati fokusirane analize bili su u opštem skladu sa trendovima uočenim u početnoj analizi (Tabela 2). Kao što je prikazano - i dalje ilustrovano na SL.5-predviđeno je da će HBV-219 biti neaktivan protiv HBV genotipova B, E, F, H i I osim ako se ne toleriše nepodudaranje na poziciji 15 vodećeg lanca.
Tabela 2. Fokusirana analiza očuvanja
* Procenat očuvanja prijavljen kao (savršen/MM) sa vrednostima <90% prikazanim masnim slovima;
[Ukupan br.]
2
[0156] Sistem reportera psiCHECK-2 sa dvostrukom luciferazom je korišćen za procenu efekata nepodudaranja na odabranoj poziciji u svakom od HBV-217, HBV-219, HBV-254, HBV-255 i HBV-258. Vektor psiCHECK omogućava praćenje promena u ekspresiji ciljnog gena fuzionisanog sa reporterskim genom, gde aktivna RNKi degradira fuzionisanu konstrukciju da bi proizvela odgovarajuće smanjenje reporterskog signala. Dijagram na SL.6 generalno prikazuje vektor koji se koristi u ovim testovima. Izvorna delimična reporterska sekvenca je imala 120 fragmenata baznog para iz genotipa A (GenBank: AM282986.1) oko ciljnih mesta od interesa u S ORF. Izvorne dupleks sekvence oligonukleotida imaju 100% homologiju sa reporterskim plazmidom na odgovarajućim mestima prikazanim na SL.6, dok nepodudarne oligonukleotidne dupleks sekvence imaju jednu nepodudarnost sa reporterskim plazmidom. Izvorne i nepodudarne sekvence za testirane oligonukleotida su prikazane na SL.
7 poravnate sa odgovarajućim primarnim delimičnim reporterskim sekvencama.
[0157] Za primere testova nepodudaranja, testirani oligonukleotidi su uključivali iste obrasce modifikacije. Prema šemi numeracije prikazanoj za svaki oligonukleotid na SL.7, modifikacije su bile sledeće: 5'-metoksi, fosfonat-4'-oksi-2'-O-metiluridin na poziciji 1; 2'-fluoro modifikovani nukleotidi na pozicijama 2, 3, 5, 7, 810, 12, 14, 16 i 19; 2'-O-metil modifikovani nukleotidi na pozicijama 1, 4, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 18 i 20-22; i fosforotioatne internukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, 2 i 3, 3 i 4, 20 i 21 i 21 i 22. Pozicije nepodudaranja su bile različite za svaki izvorni i nepodudarni skup i prikazane su u kutijama na SL.7.
[0158] PsiCHECK2 reporterski testovi sa svakim oligonukleotidom su sprovedeni tokom perioda od tri dana korišćenjem 6 tačaka, 5-strukog serijskog razblaženja počevši od 1 nM transfektovanih u HeLa ćelijama. Prvog dana, 10.000 HeLa ćelija/bunarčiću (96-bunarčića) je zasejano na pločicu sa providnim dnom sa crnim zidovima (80-90% konfluentni). Drugog dana, vektorski DNK i RNKi molekuli su razblaženi u odgovarajućoj količini pti-MEM<®>I medijuma bez seruma i lagano mešani. Nakon laganog mešanja lipofektamina<®>2000, 0,2 µl je razblaženo u 25 µl Opti-MEM<®>I medijuma bez seruma za svaku reakciju. Razblaženje je blago pomešano i inkubirano 5 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon 5-minutne inkubacije, jednake količine razblaženog DNK i RNKi molekula su kombinovane sa razblaženim Lipofectamine® 2000. Kombinovana smeša je blago pomešana i inkubirana 20 minuta na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo formiranje kompleksa. Nakon toga, DNK-RNKi molekul-Lipofectamine® 2000 kompleksi dodati su u svaki bunarčić koji sadrži ćelije i medijum i lagano pomešani ljuljanjem ploče napred-nazad. Ćelije su zatim inkubirane na 37 °C u CO2inkubatoru sve dok ćelije nisu bile spremne za berbu i analizu za ciljni gen. Trećeg dana, 100 µl Dual-Glo reagensa je dodato u svaki bunarčić, pomešano i inkubirano 10 minuta pre očitavanja luminescencije. Još 100 µL Dual-Glo Stop & Glo je dodato u svaki bunarčić, mešano i inkubirano 10 minuta pre očitavanja luminescencije. Krive doza-odgovor su generisane za svaki izvorni i nepodudarni oligonukleotid da bi se procenili efekti nepodudaranja na aktivnost. Vrednosti EC50s određene za svaki oligonukleotid prikazane su u tabeli 3 sa dodatnim specifikacijama.
Tabela 3. Procena nepodudarnosti oligonukleotida koji ciljaju HBsAg
[0159] Kao što pokazuje relativna vrednost EC50s, in vitro krive doza-odgovor za HBV-219 duplekse nisu pokazale gubitak aktivnosti sa jednim nepodudaranjem na poziciji 15 vodećeg lanca. Naknadna in vivo analiza kojom se upoređuje izvorni HBV-219 (ovde označen kao HBV(s)-219P1) i nepodudarni oligonukleotid (ovde označeni kao HBV(s)-219P2) potvrdila je da uvođenje nepodudaranja nije dovelo do gubitka aktivnosti (SL.8). Kao što je prikazano na dijagramu titracije jedne doze prikazanom na SL.9, oligonukleotidni dupleks (HBV(s)-219P2) koji je nepodudaran sa HBV-219 je tolerisan in vivo tokom perioda od 70 dana nakon primene.
4
[0160] SL.10 ilustruje primer modifikovane dupleks strukture za HBV-219 sa ugrađenim nepodudaranjem (ovde označenim kao HBV(s)-219). Prema šemi numeracije prikazanoj za svaki oligonukleotid in SL.7, smisleni lanac obuhvata nukleotide od 1 do 36, a antismisleni lanac obuhvata oligonukleotide 1 do 22, pri čemu je ovaj drugi lanac prikazan numerisan u smeru zdesna nalevo. Dupleksni oblik je prikazan sa urezom između nukleotida na poziciji 36 u smislenom lancu i poziciji 1 u antismislenom lancu. Modifikacije u smislenom lancu bile su sledeće: 2'-fluoro modifikovani nukleotidi na pozicijama 3, 8-10, 12, 13 i 17; 2'-O-metil modifikovani nukleotidi na pozicijama 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26 i 31-36; fosforotioatna internukleotidna veza između nukleotida na pozicijama 1 i 2; 2'-OH nukleotidi na pozicijama 27-30; 2'-aminodietoksimetanol-gvanidin-GalNAc na poziciji 27; i 2'-aminodietoksimetanoladenin-GalNAc na svakoj od pozicija 28, 29 i 30. Modifikacije u antismislenom lancu bile su sledeće: 5'-metoksi, fosfonat-4'-oksi-2'-O-metiluridin fosforotioat na poziciji 1; 2'-fluoro modifikovani nukleotidi na pozicijama 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 14, 16 i 19; 2'-O-metil modifikovani nukleotidi na pozicijama 1, 4, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 18 i 20-22; i fosforotioatne internukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, 2 i 3, 3 i 4, 20 i 21 i 21 i 22. Antismisleni lanac je uključivao ugrađenu nepodudarnost na poziciji 15. Takođe, kao što je prikazano, antismisleni lanac dupleksa je uključivao "GG" prepust koji se proteže između pozicija 21-22.
[0161] Detalji o HBV(s)-219 i dva prethodno navedena prekursora (HBV(s)-219Pl i HBV(s)-219P2) prikazani su u tabeli 4.
Tabela 4. HBV(s)-219 i prekursori
Primer 3: Antivirusna aktivnost prekursora HBV(s)-219
[0162] Procenjeni su efekti lečenja prekursorima HBV(s)-219 na subćelijsku lokalizaciju antigena jezgra HBV (HBcAg). NODscidmiševi su podvrgnuti hidrodinamičkoj injekciji (HDI) dimera od glave ka repu HBV genoma. Tretman oligonukleotidom je započet 2 nedelje nakon HDI. Imunohistohemijsko bojenje hepatocita izolovanih od miševa posle lečenja pokazalo je oštro smanjenje ekspresije antigena jezgra HBV (HBcAg).
[0163] Sekvenciranje RNK je izvršeno da bi se ispitali efekti obaranja HBsAg na ukupnu ekspresiju HBV virusnih transkripata. Hepatociti su izolovani iz HDI miševa četiri dana nakon tri doze jednom nedeljno po 3 mg/kg svaka. Ukupna RNK je ekstrahovana iz hepatocita i podvrgnuta Illumina sekvenciranju korišćenjem HiSeq platforme. SL.11B prikazuje rezultate sekvenciranja RNK u kojima su otkrivene sekvence RNK transkripta mapirane u odnosu na HBV RNK. Ciljno mesto HBV(s)-219 i njegovih prekursora je takođe prikazano, pokazujući da oligonukleotid cilja pgRNK (3,5 kb), S1 (2,4 kb) i S2 (2,1 kb) transkripte. Rezultati pokazuju da je, u poređenju sa kontrolama vehikuluma, tretman sa HBV(s)-219P1 doveo do više od 90% utišavanja svih transkripata HBV virusa.
[0164] Efekti trajanja HBV(s)-219P1 oligonukleotida ispitani su u dva različita mišja modela HBV - HDI modelu, koji je zavisan od cccDNK, i AAV modelu, koji je nezavisan od cccDNK. Analiza vremenskog toka (12 nedelja) ekspresije HBsAg mRNK je izvedena u kontekstu lečenja koji je uključivalo tri doze jednom nedeljno od 3 mg/kg sa HBV(s)-219P1 oligonukleotidom koji cilja HBsAg mRNK u poređenju sa kontrolom vehikuluma i RNKi oligonukleotidom koji cilja HBxAg mRNK u HDI modelu HBV (SL.12A). HBV(s)-219P1 oligonukleotid je proizveo ≥3,9 log redukcije, sa relativno dugim trajanjem aktivnosti koja se održala duže od 7 nedelja; dok je naspram toga oligonukleotid koji cilja HBV(x) proizveo oko 3,0 log redukcije, koja se održala kraće.
[0165] Dalja analiza vremenskog toka (12 nedelja) ekspresije HBsAg mRNK je izvedena u kontekstu lečenja koji je uključivalo tri doze jednom nedeljno od 3 mg/kg sa HBV(s)-219P2 oligonukleotidom koji cilja HBsAg mRNK u poređenju sa kontrolom vehikuluma i RNKi oligonukleotidom koji cilja HBxAg mRNK u modelu AAV-HBV (SL.12B). U ovom modelu, HBV(s)-219P2 oligonukleotid je proizveo uporedivu log redukciju i trajanje kao oligonukleotid koji cilja HBV(x). RNKi oligonukleotid koji cilja HBxAg mRNK korišćen na SL. 12A i 12B ima sekvencu smislenog lanca UGCACUUCGCGUCACCUCUAGCAGCCGAAAGGCUGC i sekvencu antismislenog lanca UAGAGGUGACGCGAAGUGCAGG. Ovaj RNKi oligonukleotid koji cilja HBxAg je ovde označeno kao GalXC-HBVX.
[0166] Imunohistohemijsko bojenje je obavljeno da bi se ispitala subćelijska distribucija HbcAg u hepatocitima dobijenim iz AAV-HBV modela i HDI modela HBV nakon lečenja HBV(s)-219 prekursorskim oligonukleotidima kao što je naznačeno iznad ciljajući HBsAg mRNK u poređenju sa kontrolom vehikuluma i RNKi oligonukleotidom koji cilja HBxAg mRNK, kao što je gore opisano. (SL.13) Rezidualni protein jezgra (HBcAg) nakon lečenja pokazao je značajne razlike u subćelijskoj lokalizaciji između dva RNAi oligonukleotida u HDI modelu, ali ne i u AAV modelu.
Primer 4: Ocena HBV(s)-219P1 u PKSB-HBV himernom modelu humane jetre genotip C [0167] Antivirusna aktivnost HBV(s)-219P1 je procenjena na modelu PXB-HBV, takođe poznatom u HBV literaturi kao himerni model ljudske jetre. Ova tehnologija se zasniva na presađivanju ljudskih hepatocita u miševe sa ozbiljno kompromitovanim imunitetom a zatim korišćenjem genetskog mehanizma trovanju mišjih hepatocita domaćina (Tateno et al., 2015). Ovaj proces dovodi do toga da miševi sadrže jetru dobijenu od > 70% ljudskog tkiva, koja, za razliku od miševa divljeg tipa, može biti inficirana HBV (Li et al., 2014). PKSB-HBV model služi u nekoliko svrha u kontekstu farmakologije HBV(s)-219: (1) da potvrdi da oligonukleotid može da angažuje humanu RNKi mašineriju (RISC) in vivo, (2) da potvrdi da se konfiguracija liganda koji cilja GalNAc može internalizovati u hepatocite preko humanog ASGR in vivo, i (3) da potvrdi efikasnost u pravom modeli infekcije HBV (za razliku od projektovanog modela ekspresije HBV). Uprkos ograničenju da kalemljeni humani hepatociti rezultiraju nepravilnom fiziologijom himerne jetre (Tateno et al., 2015), značajna antivirusna efikasnost se može primetiti u ovom modelu.
[0168] Otprilike 8 nedelja nakon početne infekcije miševa sa HBV genotipa C, plazma je sakupljena za svakog miša da posluži kao osnovno merenje HBsAg. Zatim su kohorte od po 9 miševa (n=3 za PK, n=6 za PD) primile 3 nedeljne subkutane injekcije 0 (PBS) ili 3 mg/kg HBV(s)-219P1. Prvi dan doziranja se smatra danom 0. Neterminalno uzimanje uzoraka krvi vršeno je nedeljno da bi se odredio serumski HBsAg i nivoi cirkulišuće HBV DNK kod svakog miša (SL.14A-14D). Miševi su eutanazirani za uzimanje tkiva sa terminalnim ishodom 28. dana. Uzorci jetre 28. dana su analizirani na nivoe intrahepatične HBV DNK i cccDNK. Značajna antivirusna aktivnost je primećena u svim krajnjim tačkama koje su analizirane za miševe koji su lečeni sa HBV(s)-219P1, uključujući >80% smanjenja HBsAg, kao i značajno smanjenje cirkulišuće HBV DNK, intrahepatične HBV DNK i cccDNK (SL.
14A-14D). Ovi podaci pokazuju da lečenje sa HBV(s)-219 rezultira antivirusnom aktivnošću u inficiranim humanim hepatocitima nakon sistemske primene.
Primer 5: HBV(s)-219P2 pojačava antivirusnu aktivnost entekavira
[0169] Trenutni standard nege, analozi nukleo(s)tida (npr. entekavir) su efikasni u smanjenju genomske DNK cirkulišućeg HBV, ali ne smanjuju cirkulišući HBsAg. Iako ovo dovodi do kontrolisane viremije tokom takvog lečenja, potrebno je doživotno lečenje i retko se postiže funkcionalno izlečenje. RNAi oligonukletoidi koji ciljaju na S antigen utiču i na virusnu polimerazu i na HBsAg protein. U ovoj studiji, kombinovani efekti HBV(s)-219P2 kao monoterapije i kombinovanog lečenja sa entekavirom su istraživani na miševima koji eksprimiraju HBV (HDI model) za antivirusnu aktivnost.
[0170] Miševima je davana dnevna oralna doza od 500 ng/kg Entekavira (ETV) tokom 14 dana. HBV(s)-219P2 je dat jednom subkutano. Cirkulaciono virusno opterećenje (HBV DNK) je mereno qPCR testom (SL.15A), nivo HBsAg u plazmi je meren ELISA testom (SL.15B), a nivoi mRNK i pgRNK HBV jetre mereni su qPCR testom. Kod kombinovane terapije sa HBV(s)-219P2 i ETV primećeni su jasni dodatni efekti. Rezultati pokazuju da sama ETV terapija ne pokazuje efikasnost protiv cirkulišućih HBsAg ili virusnih RNK jetre. Dalje, na antivirusnu aktivnost HBV(s)-219P2 merenu na osnovu HBsAg ili HBV RNK ne utiče kodoziranje ETV (SL.15B-15C).
[0171] Kao što je prikazano na SL.15A-15C, monoterapija entekavirom u dozi od 500 ng/kg PO dnevno tokom 14 dana je rezultirala prosečnom log redukcijom od ~1,6 HBV DNK otkrivene u plazmi u odnosu na miševe lečene slanim rastvorom sa fosfatnim puferom (PBS rastvor) (n=6). Nije primećeno značajno smanjenje ni cirkulišućeg HBsAg, ni virusnih RNK jetre. Monoterapija pojedinačne doze od 1 mg/kg, ili 3 mg/kg SK doze HBV(s)-219P2 na dan 0 rezultirala je prosečnim smanjenjem od 0,8 log ili ~1,8 log redukcije u HBV DNK detektovanoj u plazmi, u odnosu na slani rastvor sa forfanim puferom (PBS rastvor) respektivno (n=7). Monoterapija pojedinačne doze od 6 mg/kg SK HBV(s)-219P2 na dan 0 dovela je do prosečnog smanjenja HBV DNK u plazmi od -2,5 log redukcije, kao i do toga da su nivoi kod dva miša pali ispod granice detekcije (n=7). Monoterapija pojedinačne SK doze HBV(s)-219P2 dana 0 dovela je do dozno-zavisnog smanjenja kako cirkulišućeg HBsAg, tako i virusnih RNK jetre. Kombinovana terapija entekavirom u dozi od 500 ng/kg PO dnevno tokom 14 dana i pojedinačna doza od 1 mg/kg SC HBV(s)-219P2 na dan 0 dovela je do dodatnog smanjenja HBV DNK otkrivene u plazmi u proseku od -2,3 log. Slična smanjenja nivoa HBsAg u plazmi i transkripata virusa jetre kao što je primećeno sa monoterapijom jedne doze od 1 mg/kg SC HBV(s)-219P2, što ukazuje na aditivnost u smanjenju HBV DNK u plazmi, ali ne i cirkulišućeg HBsAg ili transkripta virusa jetre.
Primer 6 Poređenje antivirusne aktivnosti HBV(s)-219P2 i GalXC-HBVX
[0172] U ovoj studiji, miševima koji eksprimiraju HBV (HDI model) su davani HBV(s)-219P2, GalXC-HBVX (ista sekvenca kao kod GalXC-HBVX koji se koriste na SL.12A i 12B), ili kombinacija dva RNAi oligonukleotida i praćen je nivo HBsAg u plazmi dve nedelje ili devet nedelja nakon doze. Kao što je prikazano na SL.16B, slični nivoi supresije HBsAg primećeni su 2 nedelje nakon lečenja jednom zasićenom SC dozom od 9 mg/kg HBV(s)-219P2, GalXC-HBVX ili kombinacijom oba. Produžena supresija HBsAg primećena je kod miševa lečenih sa HBV(s)-219P2 koji cilja na S, dok su miševi lečeni GalXC-HBVX, ili kombinacijom oba, imali značajan oporavak HBsAg 9 nedelja nakon lečenja (n=3).
[0173] Subcelularna lokalizacija centralnog antigena HBV (HBcAg) kod miševa koji eksprimiraju HBV takođe je procenjena kod miševa koji su primali HBV(s)-219P2, GalXC-HBVX ili kombinaciju ova dva RNKi oligonukleotida. Miševi koji eksprimiraju HBV (HDI model) lečeni su jednom zasićenom dozom (9 mg/kg, sk) HBV(s)-219P2, GalXC-HBVX ili kombinacijom 1:1. U vremenskim tačkama naznačenim na SL.17A, delovi jetre su obojeni na HBcAg; prikazani su reprezentativni hepatociti. Kohorte lečene sa HBV(s)-219P2, bilo kao monoterapija ili u kombinaciji sa GalXC-HB VX, imaju nuklearni HBcAg. Kohorte lečene samo sa GalXC-HBVS pokazuju samo citosolnu lokalizaciju HBcAg, prijavljenu kao povoljan prognostički indikator odgovora na lečenje (Huang et al. J. Cell. Mol. Med.2018). Procenat HBcAg-pozitivnih ćelija nuklearnim bojenjem u svakoj životinji je prikazan na SL.
17B (n=3/grupa, 50 ćelija izbrojano po životinji, 2 nedelje nakon doziranja). Da bi se potvrdilo da je efekat na subćelijsku lokalizaciju HBcAg posledica regiona HBV transkriptima, a ne nepoznatog svojstva RNKi sekvence, projektovane su i testirane alternativne sekvence, koje ciljaju unutar X i S otvorenih okvira čitanja (videti SL.17C). HBV-254 je korišćen na SL.17C. Sekvenca HBV-254 je opisana u Primeru 1. Alternativni oligonukleotid koji cilja HBxAg korišćen na SL.17C ima sekvencu smislenog lanca GCACCUCUCUUUACGCGGAAGCAGCCGAAAGGCUGC i antismislenu sekvencu UUCCGCGUAAAGAGAGGUGCGG. Dva alternativna RNKi oligonukleotida imaju različite RNKi ciljne sekvence u S ili X antigenu od RNKi oligonukleotida korišćenih na SL.
16B. Međutim, oni pokazuju isti diferencijalni efekat na nivo HBcAg u plazmi, što ukazuje da je efekat specifičan za ciljanje na S antigen sam po sebi, ali nije specifičan za korišćeni oligonukleotid.
Primer 7 Procena bezbednosti, podnošljivosti kod zdravih ljudi i efikasnosti HBV(s)-219 kod HBV pacijenata
[0174] Ova studija je projektovana da proceni bezbednost i podnošljivost kod zdravih osoba (Grupa A) i efikasnost HBV(s)-219 kod HBV pacijenata (Grupa B). Informacije o dozi po kohorti su prikazane na SL.18. Molekularna struktura HBV(s)-219 je prikazana na SL.10, SL. 19A, a takođe je ilustrovana u nastavku:
Hibridizovan za:
Legenda:
[0175] Kriterijumi za izbor pacijenata su prikazani u nastavku.
Grupa A - Zdravi ispitanici
Kriterijumi za uključivanje:
[0176]
1. Starost od 18 godina (ili starost potrebna za davanje zakonske saglasnosti, šta god je starije) do zaključno sa 65 godina u trenutku potpisivanja informisanog pristanka. 2. Evidentno zdrav u vreme skrininga što je utvrđeno medicinskom procenom, uključujući istoriju bolesti, fizikalni pregled i laboratorijske testove
a. Nema simptoma tekuće bolesti.
b. Nema klinički značajnih abnormalnosti telesne temperature, pulsa, disanja, krvnog pritiska.
c. Nema klinički značajnih kardiovaskularnih ili plućnih bolesti, niti kardiovaskularnih ili plućnih bolesti koje zahtevaju farmakološke lekove. 3. 12-kanalni elektrokardiogram (EKG) u granicama normale ili bez klinički značajnih abnormalnosti na skriningu i 1. dana po mišljenju istraživača.
4. Negativan test za zloupotrebu alkohola ili droga na poseti skrininga 1 i prijemu (dan -1).
5. Nepušači najmanje 5 godina pre posete skrininga 1, sa negativnom koncentracijom kotinina u urinu tokom posete skriningu 1.
1
6. Indeks telesne mase (BMI) u rasponu od 18,0 - 32,0 kg/m2 (uključivo).
7. Muško ili žensko:
a. Učesnici:
Učesnik mora da pristane da koristi kontracepciju tokom perioda lečenja i najmanje dve nedelje nakon poslednje doze intervencije u okviru studije i da se uzdrži od doniranja sperme tokom ovog perioda.
b. Učesnice:
Učesnica ima pravo da učestvuje ako nije trudna, ne doji i ako važi najmanje jedan od sledećih uslova: Nije žena u reproduktivnom periodu, ILI, u zavisnosti od regiona; žena u reproduktivnom periodu koji pristaje da prati smernice za kontracepciju, počevši od upisa u studiju nakon skrininga, nastavljajući tokom celog perioda lečenja i najmanje 12 nedelja nakon doze intervencije u okviru studije.
8. Sposoban za davanje potpisanog informisanog pristanka 1, koji uključuje usaglašenost sa zahtevima i ograničenjima.
Kriterijumi isključenja, grupa A
[0177]
1. Anamneza bilo kog zdravstvenog stanja koje može da ometa apsorpciju, distribuciju ili eliminaciju ispitivanog leka, ili kliničke i laboratorijske procene u ovoj studiji, uključujući (ali ne ograničavajući se na); hroničnu ili rekurentnu bolest bubrega, funkcionalne poremećaje creva (npr. česta dijareja ili konstipacija), bolest gastrointestinalnog trakta, pankreatitis, poremećaje koji izazivaju napade, mukokutane ili muskuloskeletne poremećaje, anamnezu pokušaja suicida ili suicidalnih ideja, ili klinički značajnu depresiju ili drugu neuropsihijatrijsku poremećaju koji zahtevaju farmakološku intervenciju.
2. Slabo kontrolisana ili nestabilna hipertenzija; ili trajni sistolni krvni pritisak > 150 mmHg ili dijastolni krvni pritisak > 95 mmHg prilikom skrininga.
3. Anamneza dijabetesa melitusa lečenog insulinom ili hipoglikemijskim agensima.
4. Anamneza astme koja je zahtevala hospitalizaciju u prethodnih 12 meseci.
5. Dokaz o nedostatku G-6-PD utvrđen rezultatom skrininga u centralnoj laboratoriji studije.
2
6. Trenutno slabo kontrolisana endokrina stanja, sa izuzetkom stanja štitaste žlezde (hiper/hipotireoza, itd.) gde su isključena bilo koja farmakološki tretirana stanja štitaste žlezde.
7. Istorija maligniteta je dozvoljena ako je malignitet učesnika bio u potpunoj remisiji bez hemioterapije i bez dodatnih medicinskih ili hirurških intervencija tokom prethodne tri godine.
8. Istorija alergija na više lekova ili istorija alergijske reakcije na oligonukleotid ili GalNAc.
9. Istorija netolerancije na potkožne injekcije ili značajni ožiljci na abdomenu koji bi potencijalno mogli ometati davanje intervencije u studiji ili procenu lokalne podnošljivosti.
10. Klinički relevantna hirurška istorija.
11. Istorija uporne zloupotrebe etanola (> 40 g etanola/dan) ili upotrebe nedozvoljenih droga u prethodne 3 godine.
12. Klinički značajna bolest u periodu od 7 dana pre primene studijske intervencije. 13. Donacija više od 500 ml krvi u periodu od 2 meseca pre primene studijske intervencije ili donacija plazme u periodu od 7 dana pre skrininga.
14. Značajna infekcija ili poznati inflamatorni proces u toku na skriningu (po mišljenju istraživača).
15. Istorija hronične ili rekurentne infekcije urinarnog trakta (UTI) ili UTI u periodu od mesec dana pre skrininga.
16. Ima planiran elektivni hirurški zahvat tokom sprovođenja ove studije.
17. Upotreba lekova koji se daju na recept u periodu od 4 nedelje pre primene studijske intervencije.
18. Upotreba lekova bez recepta ili biljnih suplemenata, isključujući rutinske vitamine, u roku od 7 dana od prve doze, osim ako se istraživač i sponzor ne slažu da to nije klinički relevantno.
19. Primio je ispitivani lek u periodu od 3 meseca pre doziranja ili je u fazi praćenja u okviru druge kliničke studije pre upisa u studiju.
20. Seropozitivna na HBV, HIV, HCV ili HDV antitela na skriningu (mogu se koristiti rezultati testiranja iz anamneze ako su rađeni u periodu od 3 meseca pre skrininga).
21. Alanin aminotransferaza (ALT), aspartat aminotransferaza (AST), gama-glutamil transferaza (GGT), ukupni bilirubin, alkalna fosfataza (ALP) ili albumin izvan referentnog opsega na skriningu ili na prijemu (dan -1).
22. Abnormalnosti kompletne krvne slike koje istraživač smatra klinički relevantnim i neprihvatljivim; hemoglobin <12,0 g/dl (ekvivalentno 120 g/l); trombociti izvan normalnog opsega.
23. Hemoglobin A1C (HbA1C) > 7%.
24. Bilo koji drugi rezultat sigurnosnog laboratorijskog testa koji istraživač smatra klinički značajnim i neprihvatljivim.
25. Preduzela je ili planira da preduzme značajnu promenu nivoa vežbanja od 48 sati pre ulaska u klinički istraživački centar do kraja studije.
26. Svaki uslov koji bi, po mišljenju istraživača, učinio učesnika nepodobnim za uključivanje ili bi mogao ometati učešće ili završetak studije.
Grupa B Odrasli sa hepatitisom B
Kriterijumi za uključivanje, grupa B
[0178]
1. Starost od 18 godina (ili starost potrebna za davanje zakonske saglasnosti, šta god je starije) do zaključno sa 65 godina u trenutku potpisivanja informisanog pristanka. 2. Hronična infekcija hepatitisom B, dokumentovana na osnovu:
a. kliničke istorije usaglašene sa CHB, zasnovane na kompatibilnim kliničkim informacijama i prethodnoj seropozitivnosti na HBsAg i potencijalno druge HBV serološke markere (HBeAg, HBV DNK).
b. HBsAg u serumu > 1000 IU/ml na skriningu za HBeAg pozitivne pacijente, ili > 500 IU/ml za HBeAg negativne pacijente.
c. HBV DNK u serumu > 20.000 IU/ml na skriningu za pacijente koji nisu bili lečeni, na osnovu rezultata testa TaqMan<™>HBV DNK v2.0 u centralnoj studijskoj laboratoriji.
d. IgM anti-HBc u serumu negativan.
3. Klinička istorija kompatibilna sa kompenzovanom bolešću jetre, bez dokaza o cirozi:
a. Nema istorije krvarenja iz varikoziteta jednjaka ili gastrointestinalnog trakta
4
b. Nema istorije ascita
c. Nema istorije žutice koja se pripisuje hroničnoj bolesti jetre
d. Nema istorije hepatične encefalopatije
e. Nema fizičkih stigma portalne hipertenzije - paukoliki angiom itd.
f. Nema rezultata prethodne biopsije jetre, studija snimanja jetre ili elastografije koji bi ukazivali na cirozu
4. Bez prethodnog lečenja hepatitisa B: bez prethodne antivirusne terapije za hepatitis B (bez prethodnog lečenja koji sadrži HBV nukleotide ili interferon) ILI kontinuirano na terapiji nukleo(t)idima (entekavir ili tenofovir) najmanje 12 nedelja pre posete skriningu, uz zadovoljavajuću toleranciju i usklađenost.
5. ALT u serumu > 60 U/l (muškarci) ili > 38 U/l (žene) (2x ULN od strane American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) HBV guidance criteria, Terrault et al., 2016).
6. 12-kanalni EKG bez klinički značajnih abnormalnosti na skriningu i danu -1 (po mišljenju istraživača).
7. Nema drugog poznatog uzroka bolesti jetre.
8. Nijedno drugo zdravstveno stanje koje zahteva istrajno medicinsko lečenje ili hroničnu ili rekurentnu farmakološku intervenciju, osim dobro kontrolisane hipertenzije i kontrole hiperholesterolemije statinima.
9. BMI u opsegu 18,0 - 32,0 kg/m2 (uključivo).
10. Muško ili žensko
a. Učesnici:
Učesnik mora da pristane da koristi kontracepciju tokom perioda lečenja i 12 nedelja nakon poslednje doze intervencije u okviru studije i da se uzdrži od doniranja sperme tokom ovog perioda.
b. Učesnice:
Učesnica ima pravo da učestvuje ako nije trudna, ne doji i ako važi najmanje jedan od sledećih uslova: Nije ŽENA U REPRODUKTIVNOM PERIODU ILI, u zavisnosti od regiona ŽENA U REPRODUKTIVNOM PERIODU koji pristaje da poštuje smernice za kontracepciju tokom perioda lečenja i najmanje 12 nedelja nakon doze intervencije u okviru studije.
11. Sposobna za davanje potpisanog informisanog pristanka, koji uključuje usaglašenost sa zahtevima i ograničenjima.
Kriterijum za isključenje, grupa B
[0179]
1. Anamneza bilo kog zdravstvenog stanja koje može da ometa apsorpciju, distribuciju ili eliminaciju ispitivanog leka, ili kliničke i laboratorijske procene u ovoj studiji, uključujući (ali ne ograničavajući se na); hroničnu ili rekurentnu bolest bubrega, funkcionalne poremećaje creva (npr. česta dijareja ili konstipacija), bolest gastrointestinalnog trakta, pankreatitis, poremećaje koji izazivaju napade, mukokutane ili muskuloskeletne poremećaje, anamnezu pokušaja suicida ili suicidalnih ideja, ili klinički značajnu depresiju ili drugu neuropsihijatrijsku poremećaju koji zahtevaju farmakološku intervenciju.
2. Slabo kontrolisana ili nestabilna hipertenzija.
3. Anamneza dijabetesa melitusa lečenog insulinom ili hipoglikemijskim agensima.
4. Anamneza astme koja zahteva bolnički prijem u prethodnih 12 meseci.
5. Dokaz o nedostatku G-6-PD utvrđen rezultatom skrininga u centralnoj laboratoriji studije.
6. Trenutno slabo kontrolisana endokrina stanja, sa izuzetkom stanja štitaste žlezde (npr. hiper/hipotireoza, itd.) gde su isključena bilo koja farmakološki tretirana stanja štitaste žlezde.
7. Istorija hronične ili rekurentne infekcije urinarnog trakta ili infekcija urinarnog trakta u periodu od mesec dana pre skrininga.
8. Anamneza hepatocelularnog karcinoma (HCC).
9. Istorija maligniteta osim hepatocelularnog karcinoma je dozvoljena ako je malignitet pacijenta bio u potpunoj remisiji nakon hemioterapije i bez dodatnih medicinskih ili hirurških intervencija tokom prethodne tri godine.
10. Istorija uporne zloupotrebe etanola (> 40 g etanola/dan) ili upotrebe nedozvoljenih droga u prethodne 3 godine.
11. Istorija netolerancije na potkožne injekcije ili značajni ožiljci na abdomenu koji bi potencijalno mogli ometati davanje intervencije u studiji ili procenu lokalne podnošljivosti.
12. Prijem transfuzije u poslednjih 6 nedelja pre terapije ili očekivane transfuzije kroz praćenje nakon ispitivanja.
13. Donirano ili izgubljeno > 500 ml krvi u roku od 2 meseca pre skrininga, ili donacija plazme u roku od 7 dana pre skrininga.
14. Antivirusna terapija (osim entekavira ili tenofovira) u periodu od 3 meseca od skrininga ili lečenje interferonom u poslednje 3 godine.
15. Upotreba u poslednjih 6 meseci (ili očekivana potreba za korišćenjem) antikoagulanasa, sistemski primenjenih kortikosteroida, sistemski primenjenih imunomodulatora ili sistemski primenjenih imunosupresiva.
16. Upotreba lekova koji se izdaju na recept u periodu od 14 dana pre primene studijske intervencije koji bi, po mišljenju glavnog istraživača ili sponzora, ometali sprovođenje studije. Prihvatljivi su lokalni proizvodi bez sistemske apsorpcije, statini (osim rosuvastatina), lekovi za hipertenziju, lekovi koji se nabavljaju bez recepta i lekovi protiv bolova koji se daju na recept ili hormonski kontraceptivi (žene).
17. Depo injekcija ili implantacija bilo kog leka u periodu od 3 meseca pre primene studijske intervencije, sa izuzetkom injekcione/implantabilne kontrole rađanja.
18. Neprekidna upotreba biljnih suplemenata ili sistemskih lekova koji se nabavljaju bez recepta; učesnici moraju biti voljni da prestanu za vreme trajanja studija.
19. Primio je ispitivani lek u periodu od 3 meseca pre doziranja ili je u fazi praćenja u okviru druge kliničke studije pre upisa u studiju.
20. Elastografija jetre (tj. FibroScan®) kPa > 10,5 prilikom skrininga.
21. Sistolni krvni pritisak >150 mmHg i dijastolni krvni pritisak >95 mmHg nakon 10 minuta odmora na leđima, prilikom skrininga.
22. Transaminaze jetre (ALT ili AST) potvrđene > 7 x ULN prilikom skrininga. 23. Istorija uporne ili rekurentne hiperbilirubinemije, osim ako je poznato da je u pitanju Gilbertova bolest ili Dabin-Džonsonov sindrom.
24. Seropozitivni nalaz na antitela na virus humane imunodeficijencije (HIV) ili virus hepatitisa C (HCV) ili virus hepatitisa delta (HDV).
25. Hgb < 12 g/dl (muškarci) ili < 11 g/dl (žene).
26. Serumski albumin <3,5 g/dl prilikom skrininga.
27. Ukupan broj belih krvnih zrnaca < 4000 ćelija/µl ili apsolutni broj neutrofila (ANC) <1800 ćelija/µl prilikom skrininga.
28. Broj trombocita ≤100.000 po µl prilikom skrininga.
29. Međunarodni normalizovani odnos (INR) ili protrombinsko vreme (PT) iznad gornje granice normalnog referentnog opsega (prema lokalnom laboratorijskom referentnom opsegu) prilikom skrininga.
30. Serum BUN ili kreatinin > ULN.
31. Serumska amilaza ili lipaza > 1,25 × ULN.
32. HbAlc u serumu > 7,0%.
33. Vrednost alfa fetoproteina u serumu (AFP) >100 ng/ml. Ako je AFP na skriningu > ULN, ali < 100 ng/ml, pacijent je kvalifikovan ako studija imidžinga jetre ne otkrije nikakve lezije sumnjive na mogući HCC.
34. Bilo koji drugi rezultat sigurnosnog laboratorijskog testa koji istraživač smatra klinički značajnim i neprihvatljivim.
35. Preduzela je ili planira da preduzme značajnu promenu nivoa vežbanja od 48 sati pre ulaska u klinički istraživački centar do kraja studije.
36. Svaki uslov koji bi, po mišljenju istraživača, učinio učesnika nepodobnim za uključivanje ili bi mogao ometati učešće ili završetak studije.
[0180] Otkrivanje koje je ovde ilustrativno opisano može se na odgovarajući način primeniti u odsustvu bilo kog elementa ili elemenata, ili ograničenja koji ovde nisu posebno otkriveni. Tako, na primer, u svakoj instanci ovde bilo koji od termina "sastoji", "koji se u suštini sastoji od" i "sastoji se od" može biti zamenjen sa bilo kojim od druga dva termina. Termini i izrazi koji su upotrebljeni koriste se kao termini za opisivanje, a ne za ograničavanje, i ne postoji namera da se upotrebom takvih termina i izraza isključuju bilo koji ekvivalenti prikazanih i opisanih karakteristika ili njihovih delova, ali se prihvata da su moguće različite modifikacije u okviru obima pronalaska koji je predmet patentnog zahteva. Prema tome, treba razumeti da iako je ovaj pronalazak posebno otkriven u poželjnim otelotvorenjima, stručnjacima u ovoj oblasti mogli bi da pribegnu opcionim karakteristikama, modifikacijama i varijacijama ovde otkrivenih koncepata, i da treba smatrati da su takve modifikacije i varijacije u okviru ovog pronalaska kao što je definisano u opisu i patentnim zahtevima u nastavku.
[0181] Upotreba termina određenog i neodređenog člana i sličnih referenci u kontekstu opisa pronalaska (posebno u kontekstu patentnih zahteva u nastavku) treba da se tumači tako da obuhvata i jedninu i množinu, osim ako nije drugačije naznačeno ovde ili je očigledno u suprotnosti sa kontekstom. Termini „sadrži“, „ima“, „uključujući“ i „obuhvata“ treba da se tumače kao termini otvorenog tipa (i.e., što znači „uključujući, ali ne ograničavajući se na,“) osim ako nije drugačije naznačeno. Navođenje opsega vrednosti ovde je samo namenjeno da služi kao skraćeni metod za pojedinačno upućivanje na svaku zasebnu vrednost koja spada u opseg, osim ako nije drugačije naznačeno ovde, a svaka zasebna vrednost je uključena u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena. Sve metode opisane ovde mogu da se izvode bilo kojim pogodnim redosledom osim ako nije drugačije naznačeno ovde ili je na drugi način očigledno u suprotnosti sa kontekstom. Upotreba bilo kog primera, ili jezika primera (npr. „kao što je“) koji je ovde dat treba samo bolje da pojasni predmetni pronalazak, i ne predstavlja ograničenje opsega pronalaska osim ako se ne tvrdi drugačije. Nijedan tekst u specifikaciji ne treba tumačiti kao naznaku da je element koji nije prijavljen ključan za praktikovanje pronalaska.
[0182] Ovde su opisana otelotvorenja ovog pronalaska, uključujući najbolji način koji je poznat pronalazačima za sprovođenje pronalaska. Varijacije ovih otelotvorenja mogu postati očigledne onima koji su imaju uobičajena znanja u oblasti tehnike nakon čitanja prethodnog opisa.

Claims (15)

  1. Patentni zahtevi 1. Oligonukleotid za smanjenje ekspresije mRNK površinskog antigena virusa hepatitisa B (HBsAg), pri čemu oligonukleotid sadrži čulni lanac koji formira dupleks region sa antismislenim lancem, naznačen time što: se čulni lanac sastoji od sekvence koja je navedena u GACAAAAAUCCUCACAAUAAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO:9) i sadrži 2'-fluoro modifikovane nukleotide na pozicijama 3, 8-10, 12, 13 i 17, 2'-O-metil modifikovane nukleotide na pozicijama 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26 i 31-36, i jednu fosforotioatnu internukleotidnu vezu između nukleotida na pozicijama 1 i 2, pri čemu je svaki od nukleotida -GAAA- sekvence na smislenom lancu konjugovan sa monovalentnim GalNac ostatkom, pri čemu -GAAA- sekvenca sadrži strukturu:
    i antismisleni lanac se sastoji od sekvence kako je navedeno u UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 6) i sadrži 2'-fluoro modifikovane nukleotide na pozicijama 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 14, 16 i 19, 2'-O-metil modifikovane nukleotide na pozicijama 1, 4, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 18 i 20-22, i pet fosforotioatnih internukleotidnih veza između nukleotida na pozicijama 1 i 2, između nukleotida 2 i 3, između nukleotida na pozicijama 3 i 4, između nukleotida na pozicijama 20 i 21, i između nukleotida na pozicijama 21 i 22, pri čemu 5'-nukleotid antismislenog lanca ima sledeću strukturu:
  2. 2. Kompozicija koja sadrži oligonukleotid prema patentnom zahtevu 1.
  3. 3. Kompozicija prema patentnom zahtevu 2 koja sadrži kontrajon.
  4. 4. Kompozicija prema patentnom zahtevu 2 koja sadrži Na+ protivjone.
  5. 5. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 4 koja sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
  6. 6. Kompozicija prema patentnom zahtevu 5, naznačena time što je farmaceutski prihvatljiv nosač rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži vodu.
  7. 7. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 6 koja sadrži ekscipijent.
  8. 8. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 7 koja sadrži slani rastvor puferovan fosfatom.
  9. 9. In vitro postupak smanjenja ekspresije površinskog antigena (HBsAg) virusa hepatitisa B (HBV) u ćeliji, postupak koji sadrži isporuku u ćeliju oligonukleotida prema patentnom zahtevu 1, ili kompozicije prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 8. 1
  10. 10. Postupak prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što je ćelija hepatocit.
  11. 11. Oligonukleotid prema patentnom zahtevu 1 ili kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 8 za upotrebu u postupku lečenja HBV infekcije kod ispitanika.
  12. 12. Oligonukleotid ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačeni time što se oligonukleotid ili kompozicija daje ispitaniku subkutano.
  13. 13. Oligonukleotid ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačeni time što se oligonukleotid ili kompozicija daje ispitaniku intravenozno.
  14. 14. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, koja sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, naznačena time što je farmaceutski prihvatljiv nosač rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži vodu.
  15. 15. Oligonukleotid ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 11-14, naznačeni time što se ispitaniku takođe daje efikasna količina entekavira. 2
RS20230047A 2017-10-20 2018-10-19 Metode za lečenje infekcije hepatitisom b RS64001B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762575358P 2017-10-20 2017-10-20
EP18868404.7A EP3684377B1 (en) 2017-10-20 2018-10-19 Methods for treating hepatitis b infection
PCT/US2018/056801 WO2019079781A2 (en) 2017-10-20 2018-10-19 METHODS OF TREATING HEPATITIS B TYPE INFECTIONS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64001B1 true RS64001B1 (sr) 2023-03-31

Family

ID=66173915

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230047A RS64001B1 (sr) 2017-10-20 2018-10-19 Metode za lečenje infekcije hepatitisom b

Country Status (30)

Country Link
US (5) US10799524B2 (sr)
EP (2) EP4197544A1 (sr)
JP (2) JP7353276B2 (sr)
KR (1) KR102783206B1 (sr)
CN (2) CN118185936A (sr)
AU (1) AU2018351649B2 (sr)
BR (1) BR112020007476A2 (sr)
CA (1) CA3078960A1 (sr)
CL (1) CL2020001061A1 (sr)
CO (1) CO2020005135A2 (sr)
CR (1) CR20200163A (sr)
DK (1) DK3684377T3 (sr)
ES (1) ES2936863T3 (sr)
FI (1) FI3684377T3 (sr)
HR (1) HRP20230023T1 (sr)
HU (1) HUE061122T2 (sr)
IL (4) IL319113A (sr)
LT (1) LT3684377T (sr)
MA (1) MA50264B1 (sr)
MX (1) MX2020004060A (sr)
MY (1) MY201698A (sr)
PE (1) PE20220561A1 (sr)
PH (1) PH12020550591A1 (sr)
PL (1) PL3684377T3 (sr)
PT (1) PT3684377T (sr)
RS (1) RS64001B1 (sr)
SG (1) SG11202003488WA (sr)
SI (1) SI3684377T1 (sr)
UA (1) UA128786C2 (sr)
WO (1) WO2019079781A2 (sr)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202003488WA (en) 2017-10-20 2020-05-28 Dicerna Pharmaceuticals Inc Methods for treating hepatitis b infection
AU2019300324A1 (en) 2018-07-13 2021-01-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for modulating RTEL1 expression
CN114761557B (zh) * 2019-10-02 2024-11-15 迪克纳制药公司 具有最小氟含量的小干扰rna的化学修饰
JP2023506954A (ja) * 2019-12-19 2023-02-20 エフ． ホフマン－ラ ロシュ エージー． Ｂ型肝炎ウイルス感染を処置するためのｓａｒａｆ阻害剤の使用
CN114846140A (zh) * 2019-12-24 2022-08-02 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗hbv的靶向hbv的治疗性寡核苷酸和tlr7激动剂的药物组合
MX2022007909A (es) * 2019-12-24 2022-07-21 Hoffmann La Roche Combinacion farmaceutica de agentes antivirales que actuan sobre hbv y/o un inmunomodulador para el tratamiento de hbv.
US20220056451A1 (en) * 2020-07-27 2022-02-24 Aligos Therapeutics, Inc. Hbv binding oligonucleotides and methods of use
WO2022029209A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotide treatment of hepatitis b patients
WO2022131883A1 (ko) * 2020-12-18 2022-06-23 올릭스 주식회사 HBV 발현을 억제하는 RNAi 제제 및 이의 용도
CN114853829A (zh) * 2021-02-05 2022-08-05 上海拓界生物医药科技有限公司 一种核酸配体、其缀合物、制备方法及用途
CN114621954B (zh) * 2021-04-13 2023-01-31 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的rna抑制剂及其应用
JP7536187B2 (ja) * 2021-04-19 2024-08-19 ノヴォ ノルディスク アー／エス 核内受容体サブファミリー１グループｈメンバー３（ｎｒ１ｈ３）発現を阻害するための組成物および方法
EP4430184A2 (en) 2021-11-11 2024-09-18 F. Hoffmann-La Roche AG Pharmaceutical combinations for treatment of hbv
CA3235672A1 (en) * 2021-11-29 2023-06-01 Shanghai Argo Biopharmaceutical Co., Ltd. Compositions and methods for inhibiting expression of hepatitis b virus (hbv) protein
EP4201947A1 (en) 2021-12-22 2023-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Process for the backbone deprotection of oligonucleotides containing a terminal alkyl phosphonate group
WO2023116764A1 (zh) * 2021-12-23 2023-06-29 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及其用途
US20240309383A1 (en) * 2023-02-24 2024-09-19 Suzhou Sanegene Bio Inc. Small interfering rna targeting hbv and uses thereof
WO2025199466A1 (en) 2024-03-22 2025-09-25 Purdue Research Foundation Liver-specific asialoglycoprotein receptor targeting ligands, conjugates comprising same, and related compositions and methods of use
WO2025242321A1 (en) 2024-05-24 2025-11-27 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.3) Limited Novel use

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040127446A1 (en) 1992-05-14 2004-07-01 Lawrence Blatt Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis B virus and hepatitis C virus replication
EP1309726B2 (en) 2000-03-30 2018-10-03 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
US20040259247A1 (en) 2000-12-01 2004-12-23 Thomas Tuschl Rna interference mediating small rna molecules
US20050159378A1 (en) 2001-05-18 2005-07-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
JP2005508196A (ja) 2001-11-07 2005-03-31 アプレラ コーポレイション 核酸分析の汎用ヌクレオチド
DK2284266T3 (da) 2002-11-14 2014-01-13 Thermo Fisher Scient Biosciences Inc sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53
CN1257284C (zh) * 2003-03-05 2006-05-24 北京博奥生物芯片有限责任公司 一种体外阻断乙肝病毒表达的方法
US20070265220A1 (en) 2004-03-15 2007-11-15 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
US20090018097A1 (en) 2005-09-02 2009-01-15 Mdrna, Inc Modification of double-stranded ribonucleic acid molecules
EP1979485A2 (en) 2006-01-31 2008-10-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Self-complementary parvoviral vectors, and methods for making and using the same
DK2548438T3 (en) * 2006-11-08 2015-10-19 Veritas Bio LLC IN VIVO SUBMITTING DOUBLE-STRENGTH RNA TO A CELL
WO2008146251A2 (en) 2007-05-29 2008-12-04 University Of The Witwatersrand, Johannesburg A primary micro rna expression cassette
PT2341943T (pt) 2008-09-22 2019-02-06 Dicerna Pharmaceuticals Inc Composições e métodos para a inibição específica de expressão génica por dsrna que possui modificações
EP3067359A1 (en) 2008-09-23 2016-09-14 Scott G. Petersen Self delivering bio-labile phosphate protected pro-oligos for oligonucleotide based therapeutics and mediating rna interference
AU2009336191B2 (en) 2008-12-18 2017-08-24 Novo Nordisk A/S Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
WO2010093788A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Multiplex dicer substrate rna interference molecules having joining sequences
US8927513B2 (en) 2009-07-07 2015-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5′ phosphate mimics
JP5892938B2 (ja) * 2009-10-16 2016-03-30 グラクソ グループ リミテッドＧｌａｘｏ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｈｂｖアンチセンス阻害剤
US9725479B2 (en) 2010-04-22 2017-08-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5′-end derivatives
LT2606134T (lt) * 2010-08-17 2019-07-25 Sirna Therapeutics, Inc. Hepatito b viruso (hbv) geno raiškos slopinimas, tarpininkaujant rnr interferencijai naudojant mažą interferuojančią nukleorūgštį (sina)
EP3505528B1 (en) * 2011-04-21 2020-11-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
KR102434346B1 (ko) * 2011-06-30 2022-08-18 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 B형 간염 바이러스의 유전자 발현 저해용 조성물 및 방법
HK1201555A1 (en) 2011-10-25 2015-09-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of gccr expression
WO2014088920A1 (en) 2012-12-06 2014-06-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Disulfide masked prodrug compositions and methods
CA2893824A1 (en) * 2012-12-14 2014-06-19 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of ckap5 by double-stranded rna
CN103333890B (zh) 2012-12-21 2015-04-15 厦门成坤生物技术有限公司 治疗乙型病毒性肝炎的rna干扰制剂
GB201408623D0 (en) * 2014-05-15 2014-07-02 Santaris Pharma As Oligomers and oligomer conjugates
WO2015188197A2 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Solstice Biologics, Ltd. Polynucleotide constructs having bioreversible and non-bioreversible groups
CN104059916A (zh) 2014-06-17 2014-09-24 湖北医药学院附属太和医院 乙肝病毒特异性的microRNA样siRNA序列及其用途
WO2016030863A1 (en) * 2014-08-29 2016-03-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Compounds and methods for treating viral infections
JOP20200092A1 (ar) * 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
DK3234132T3 (da) 2014-12-15 2019-08-26 Dicerna Pharmaceuticals Inc Ligand-modificerede dobbeltstrengede nukleinsyrer
WO2016183009A2 (en) * 2015-05-08 2016-11-17 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of antithrombin 3 (at3) by double-stranded rna
EP3332007A4 (en) 2015-08-07 2019-07-17 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi Therapy Against Infection with Hepatitis B Virus
JOP20170161A1 (ar) 2016-08-04 2019-01-30 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل RNAi للعدوى بفيروس التهاب الكبد ب
KR20230169413A (ko) * 2017-10-13 2023-12-15 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 Ldha의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물
SG11202003488WA (en) 2017-10-20 2020-05-28 Dicerna Pharmaceuticals Inc Methods for treating hepatitis b infection

Also Published As

Publication number Publication date
IL319113A (en) 2025-04-01
CN111372593B (zh) 2024-03-19
PE20220561A1 (es) 2022-04-13
IL282881B1 (en) 2024-06-01
MX2020004060A (es) 2020-07-21
AU2018351649B2 (en) 2025-04-24
KR102783206B1 (ko) 2025-03-20
EP4197544A1 (en) 2023-06-21
MY201698A (en) 2024-03-13
PT3684377T (pt) 2023-01-31
UA128786C2 (uk) 2024-10-23
US11273173B2 (en) 2022-03-15
US11052105B2 (en) 2021-07-06
KR20200083494A (ko) 2020-07-08
CO2020005135A2 (es) 2020-05-15
EP3684377A2 (en) 2020-07-29
WO2019079781A3 (en) 2019-05-23
SG11202003488WA (en) 2020-05-28
EP3684377B1 (en) 2022-12-07
IL282881A (en) 2021-06-30
JP2021500025A (ja) 2021-01-07
US20200171069A1 (en) 2020-06-04
IL274040B1 (en) 2024-04-01
HUE061122T2 (hu) 2023-05-28
RU2020116369A (ru) 2021-11-22
IL312809A (en) 2024-07-01
HRP20230023T1 (hr) 2023-03-17
PL3684377T3 (pl) 2023-04-17
SI3684377T1 (sl) 2023-05-31
US11052104B2 (en) 2021-07-06
IL282881B2 (en) 2024-10-01
CN111372593A (zh) 2020-07-03
EP3684377A4 (en) 2020-12-16
MA50264A (fr) 2020-07-29
IL312809B1 (en) 2025-04-01
US20230000895A1 (en) 2023-01-05
CA3078960A1 (en) 2019-04-25
CR20200163A (es) 2020-11-02
LT3684377T (lt) 2023-03-10
IL274040B2 (en) 2024-08-01
JP7353276B2 (ja) 2023-09-29
US20210283164A1 (en) 2021-09-16
CN118185936A (zh) 2024-06-14
DK3684377T3 (da) 2023-02-13
IL274040A (en) 2020-06-30
AU2018351649A1 (en) 2020-04-23
CL2020001061A1 (es) 2020-10-30
IL312809B2 (en) 2025-08-01
US10799524B2 (en) 2020-10-13
JP2023171403A (ja) 2023-12-01
RU2020116369A3 (sr) 2022-02-28
US20200338109A1 (en) 2020-10-29
PH12020550591A1 (en) 2021-03-01
FI3684377T3 (fi) 2023-01-31
BR112020007476A2 (pt) 2020-10-27
JP7645323B2 (ja) 2025-03-13
ES2936863T3 (es) 2023-03-22
WO2019079781A2 (en) 2019-04-25
MA50264B1 (fr) 2023-03-31
US20200338108A1 (en) 2020-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11273173B2 (en) Methods for treating hepatitis B infection
US20230119360A1 (en) Pharmaceutical combination of a therapeutic oligonucleotide targeting hbv and a tlr7 agonist for treatment of hbv
US20230123601A1 (en) Pharmaceutical combination of antiviral agents targeting hbv and/or an immune modulator for treatment of hbv
RU2780021C2 (ru) Способы лечения инфекции гепатита в
HK40032229A (en) Methods for treating hepatitis b infection
HK40032229B (zh) 治疗乙型肝炎感染的方法