RS64937B1 - Postupci i kompozicije za dijagnozu i lečenje kancera - Google Patents

Description

Opis

[0001] Kancer predstavlja značajan zdravstveni problem širom sveta i još uvek je među vodećim uzročnicima smrti.

[0002] Kancer jajnika je kancerogena izraslina nastala od jajnika. Kancer jajnika je peti vodeći uzročnik smrti izazvanih kancerom kod žena i vodeći uzrok smrti među ginekološkim kancerima. Žena tokom života ima rizik od oko 1.5% da oboli od kancera jajnika, što ga čini drugim najčešćim ginekološkim malignitetom.

[0003] Na dijagnozu kancera jajnika može se pomisliti na osnovu neuobičajenog nalaza pri fizičkom pregledu (uključujući pregled karlice), testa krvi (tačnije testa na CA-125) ili na osnovu proučavanja medicinskih snimaka. Dijagnoza se može potvrditi hirurškom procedurom kojom se ispituje abdominalna šupljina, uzima biopsija i traže kancerske ćelije u abdominalnoj tečnosti. Lečenje obično uključuje hemioterapiju i operativno lečenje, a ponekad i terapiju zračenjem.

[0004] Povećani rizik za kancer jajnika postoji kod starijih žena i kod onih koje u prvom ili drugom stepenu srodstva imaju rođaku sa tim oboljenjem. Nasledne forme kancera jajnika mogu biti izazvane mutacijama u specifičnim genima (najčešće BRCA1 i BRCA2). Infertilne žene i one sa stanjem koje se naziva endometrioza, one koje nikada nisu bile trudne i one koje u postmenopauzi koriste estrogensku supstitucionu terapiju, pod povišenim su rizikom. Upotreba oralnih kontraceptivnih pilula predstavlja zaštitni faktor. Rizik je takođe snižen kod žena kojima su jajovodi blokirani hirurškim putem (podvezivanje jajovoda).

[0005] Kancer jajnika obično ima lošu prognozu. On je nesrazmerno smrtonosan jer nedostaje bilo kakav test za ranu detekciju ili skrining, što znači da se najveći broj slučajeva ne dijagnostikuje pre nego što dostigne odmakle stadijume. Više od 60% pacijenata kod kojih se otkrije ovaj kancer već ima stadijum III ili stadijum IV, kada se kancer već proširio izvan jajnika. Ćelije kancera jajnika oslobađaju se u tečnost prirodno prisutnu u abdominalnoj šupljini. Ove ćelije mogu da se usade u druge abdominalne (peritonealne) strukture, uključujući matericu, mokraćnu bešiku, debelo crevo i omotač zida debelog creva (omentum). Ove ćelije mogu početi da formiraju nove tumorske izrasline još i pre nego što se uopšte posumnja na kancer.

[0006] Stopa petogodišnjeg preživljavanja za sve stadijume kancera jajnika je 45.5%. Za slučajeve u kojima je dijagnoza postavljena rano tokom bolesti, kada je kancer još uvek ograničen na primarno mesto, stopa petogodišnjeg preživljavanja je 92.7%.

[0007] Glavne kategorije tumora jajnika su sledeće: epitelni tumori koji čine oko 75% svih tumora jajnika, i 90-95% maligniteta jajnika; stromalni tumori polnih traka, koji čine oko 5-10% svih neoplazmi jajnika; tumori germinativnih ćelija koji čine oko 15-20% svih neoplazmi jajnika; tumorske metastaze koje čine oko 5% maligniteta jajnika, i obično nastaju od kancera dojke, kolona, endometrijuma, želuca i cerviksa. Kancer jajnika najčešće se formira na površini jajnika (što rezultuje epitelnim kancerom jajnika) ili u jajnim ćelijama (što rezultuje tumorom germinativnih ćelija).

[0008] Epitelno-stromalni tumor površinskog epitela, poznat i kao karcinom epitela jajnika, najčešći je tip kancera jajnika. Epitelno-stromalni tumori površinskog epitela su klasa neoplazmi jajnika koje mogu biti benigne ili maligne. Misli se da su neoplazme ove grupe poreklom od epitela na površini jajnika (modifikovani peritoneum) ili od ektopičnog tkiva endometrijuma ili jajovoda (tuba). Epitelno-stromalni tumori površinskog epitela uključuju serozni tumor, endometrioidni tumor i mucinozni cistadenokarcinom.

[0009] Kancer pluća je oboljenje koje se odlikuje nekontrolisanim rastom ćelija u tkivu pluća. Ovaj rast može dovesti do metastaza koje predstavljaju invaziju susednog tkiva i vanplućnu infiltraciju. Kancer pluća, najčešći uzrok smrti povezane sa kancerom kod muškaraca i drugi najčešći kod žena (posle kancera dojke), odgovoran je za 1.3 miliona smrtnih slučajeva godišnje, širom sveta.

[0010] Tumori pluća uključuju epidermoidne kancere i adenokarcinome. Veliku većinu kancera pluća predstavljaju karcinomi – maligniteti koji nastaju od epitelnih ćelija. Kancer pluća može se okarakterisati na osnovu pet histopatoloških kriterijuma. Razlikuju se skvamozni epitelni karcinom, adenokarcinom, krupnoćelijski karcinom, adenoskvamozni karcinom i sitnoćelijski karcinom pluća (small cell lung carcinoma, SCLC). Prva četiri se u literaturi navode kao ne-SCLC (NSCLC).

[0011] Nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC) se ponekad leči hirurški, dok sitnoćelijski karcinom (SCLC) obično bolje odgovara na hemioterapiju i zračenje.

[0012] Kancer pluća može se videti na rendgenu grudnog koša i pomoću kompjuterizovane tomografije (computed tomography, CT sken). Dijagnoza se potvrđuje biopsijom. Ona se obično izvodi bronhoskopijom ili biopsijom koja je vođena pomoću CT. Lečenje i prognoza zavise od histološkog tipa kancera, stadijuma (stepena proširenosti), i statusa performansi pacijenta. Mogući načini lečenja uključuju hirurško lečenje, hemioterapiju i terapiju zračenjem. Uz lečenje, stopa petogodišnjeg preživljavanja je 14%.

[0013] Imunski sistem ima sposobnost da prepozna i uništi ćelije putem dva odvojena modaliteta: urođeni i adaptivni imunitet. Urođena komponenta sastoji se od makrofaga, ćelija prirodnih ubica (natural killer, NK), monocita i granulocita. Ove ćelije identifikuju molekulske obrasce uključene u transformaciju ćelija i oslobađaju različite citokine i zapaljenske medijatore. Urođeni odgovor nema sposobnost pamćenja stranih antigena, što je osobina prisutna kod adaptivnog imunskog odgovora. Ova druga komponenta imunskog sistema odlikuje se i specifičnošću prema stranim antigenima, koja joj je data prisutnošću receptora na limfocitima. Antigen-prezentujuće ćelije (antigen presenting cells, APC) takođe imaju ulogu u adaptivnom odgovoru – one zahvataju strane antigene i prezentuju ih limfocitima u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti. CD4+ T ćelije nose receptore koji prepoznaju antigene u kontekstu MHC molekula klase II, što im onda omogućava da oslobađaju citokine i dalje aktiviraju CD8+ limfocite (CTL) ili B ćelije. CTL su deo imuniteta posredovanog ćelijama i sposobni su da eliminišu ćelije prezentovane u kontekstu MHC molekula klase I, apoptozom ili ćelijskom lizom posredovanom perforinom. Opšte je prihvaćeno da imunitet posredovan ćelijama igra vitalnu ulogu u antitumorskom odgovoru.

[0014] B ćelije su uključene u oslobađanje imunoglobulina i kao takve su deo humoralnog imunskog sistema.

[0015] Ako se pravilno usmere i pojačaju, imunske funkcije se mogu terapijski iskoristiti za kontrolu, pa čak i iskorenjivanje malignih lezija. Genetičke i epigenetičke promene uključene u karcinogenezu stvaraju antigene koje imunski sistem prepoznaje analogno antigenima mikroba.

[0016] U struci postoji potreba za genetičkim markerima i ciljevima tumora kao što su tumori jajnika i tumori pluća, posebno adenokarcinomi jajnika i bronhiolarni adenokarcinomi, i metastatski tumori nastali od njih, što dopušta osmišljavanje specifičnih, pouzdanih i osetljivih dijagnostičkih i terapijskih pristupa ovim bolestima.

[0017] Učenje se odnosi na lečenje i dijagnozu tumora kao što su tumori jajnika i tumori pluća, posebno adenokarcinomi jajnika i bronhiolarni adenokarcinomi, i metastatski tumori nastali od njih. Konkretno, učenje se odnosi na identifikaciju molekulskih struktura koje su prisutne na tumorima kao što su tumori jajnika i tumori pluća, koje mogu poslužiti kao ciljevi za dijagnostičke i terapijske pristupe ovim bolestima.

[0018] U dokumentu stanja tehnike Osani et al.2007. opisuju se ćelije kancera dojke, koje se karakterišu ekspresijom klaudina-6 i saopštava se da negativna regulacija klaudina-6 može doprineti pojačanoj tumorogenosti ćelija kancera dojke. Hong et al. 2005. opisuju pozitivnu regulaciju ekspresije CLDN6 u adipogenezi. U EP 2011886 opisuju se različite in silico analize koje sugerišu da je genska ekspresija CLDN6 pozitivno regulisana u različitim tumorskim tkivima. Konačno, Lu et al.2004 pokazuju da se gesnka ekspresija CLDN6 nije detektovana u tkivima tumora jajnika.

Kratak opis pronalaska

[0019] Predmetni pronalazak definisan je priloženim patentnim zahtevima.

Kratak opis učenja

[0020] Predmetna objava obezbeđuje učenja koja u nekim pogledima prevazilaze objavu pronalaska kao takvog, koji je definisan isključivo priloženim patentnim zahtevima. Učenja su obezbeđena da bi smestila sadašnji pronalazak u širi tehnički kontekst i da bi ilustrovala mogući tehnički razvoj u vezi sa njim. Takve dodatne tehničke informacije koje nisu unutar obima priloženih patentnih zahteva nisu deo pronalaska. Posebno, pojmove "primer izvođenja", "pronalazak", i "aspekt" ne treba tumačiti kao da se nužno odnose na zahtevani pronalazak, osim ako je predmet pronalaska o kojem je reč unutar obima patentnih zahtva

[0021] Predmetno učenje odnosi se na identifikaciju sekvenci nukleinskih kiselina i aminokiselina koje su karakteristične za tumorska tkiva kao što su tumorska tkiva jajnika i pluća, i koje predstavljaju ciljeve za terapiju ili dijagnozu tumorskog oboljenja kod subjekta.

[0022] Ove sekvence obuhvataju proteine identifikovane u plazminoj membrani ćelija i kojima se može pristupiti preko vanćelijskog regiona, tako da sekvence mogu biti korisne za pripremanje tumorskih vakcina, uključujući profilaktičke i terapijske vakcine.

[0023] Nukleinske kiseline za koje je u skladu sa učenjem identifikovano da se eksprimiraju u tumorskim ćelijama uključuju sekvencu nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 1 iz liste sekvenci ili varijantu navedene sekvence nukleinske kiseline. Poželjno, nukleinske kiseline za koje je u skladu sa učenjem identifikovano da se eksprimiraju u tumorskim ćelijama, kodiraju peptid koji sadrži sekvencu amino-kiselina prema SEQ ID NO: 2 iz liste sekvenci ili varijantu pomenute sekvence amino-kiselina. Ove nukleinske kiseline se u ovom tekstu nazivaju i "nukleinske kiseline udružene sa tumorom" ili jednostavno "tumorske nukleinske kiseline".

[0024] U drugom aspektu, učenje se odnosi na peptide kodirane tumorskim nukleinskim kiselinama identifikovanim u skladu sa učenjem, ovde nazvane i "antigeni povezani sa tumorom" ili jednostavno "tumorski antigeni". Prema tome, tumorski antigeni identifikovani u skladu sa učenjem sadrže aminokiselinsku sekvencu kodiranu nukleinskom kiselinom koja uključuje sekvencu nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 1 iz liste sekvenci ili varijantom navedene sekvence nukleinske kiseline. Poželjno, tumorski antigeni identifikovani u skladu sa učenjem sadrže aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 2 iz liste sekvenci ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence.

[0025] U jednom aspektu, u specifikaciji se pominju peptidi koji sadrže aminokiselinske sekvence izvedene iz sekvenci tumorskih antigena identifikovanih u skladu sa učenjem, ovde oznečeni i kao "tumorski antigenski peptidi". Poželjno, tumorski antigenski peptidi učenja, kada se koriste sami ili povezani sa imunogenim nosačem, sposobni su da stimulišu ćelijski odgovor protiv ćelija koje se karakterišu prezentacijom tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, u kontekstu klase I MHC i/ili da pobude antitela koja se specifično vezuju za tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem. Poželjni tumorski antigenski peptidi mogu biti prezentovani, direktno ili posle obrade, sa klasom I MHC molekula. Poželjno, tumorski antigenski peptidi u skladu sa učenjem su peptidi koji se prezentuju sa MHC klase I i/ili klase II ili mogu da se obrade da bi prozveli peptide koji se prezentuju sa MHC klase I i/ili klase II. Poželjno, tumorski antigenski peptidi u skladu sa učenjem sadrže aminokiselinsku sekvencu koja suštinski odgovara aminokiselinskoj sekvenci fragmenta tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem. Poželjno, navedeni fragment tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem je peptid koji se prezentuje sa MHC klase I i/ili klase II ili je imunogen koji je sposoban da podstakne vezivanje antitela za navedeni fragment. Poželjno, tumorski antigenski peptid u skladu sa učenjem sadrži aminokiselinsku sekvencu koja suštinski odgovara aminokiselinskoj sekvenci tog fragmenta i obrađena je tako da proizvede taj fragment, tj. peptid koji se prezentuje sa MHC klase I i/ili klase II, izveden iz tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, ili imunogen izveden iz tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, koji je sposoban da podstakne vezivanje antitela za navedeni fragment. Prema tome, tumorski antigenski peptid u skladu sa učenjem sadrži aminokiselinsku sekvencu koja suštinski odgovara aminokiselinskoj sekvenci fragmenta tumorskog antigena, koja sadrži aminokiselinsku sekvencu kodiranu nukleinskom kiselinom koja uključuje sekvencu nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 1 iz liste sekvenci ili varijantu navedene sekvence nukleinske kiseline i poželjno sadrži aminokiselinsku sekvencu koja suštinski odgovara aminokiselinskoj sekvenci fragmenta tumorskog antigena, koja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 2 iz liste sekvenci ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence. U jednom primeru izvođenja, tumorski antigenski peptid u skladu sa učenjem sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili variijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta.

[0026] U predmetnoj specifikaciji opisuje se lečenje i/ili dijagnoza tumorskog oboljenja ciljanjem tumorskih nukleinskih kiselina ili tumorskih antigena. Ovi postupci obezbeđuju selektivnu detekciju ćelija i/ili iskorenjivanje ćelija koje eksprimiraju te tumorske nukleinske kiseline i/ili tumorske antigene, svodeći time na najmanju meru neželjene efekte na normalne ćelije koje ne eksprimiraju te tumorske nukleinske kiseline i/ili tumorske antigene. Prema tome, oboljenja poželjna za lečenje ili dijagnozu su ona u kojima se eksprimiraju jedna ili više tumorskih nukleinskih kiselina i/ili tumorskih antigena identifikovanih u skladu sa učenjem, na primer tumorska oboljenja, posebno kancerska oboljenja kao što su ona opisana u ovom tekstu.

[0027] U skladu sa učenjem, posebno pogodan za ciljanje tumorskih antigena identifikovanih prema učenju je deo tumorskih antigena koji odgovara netransmembranskoj porciji, posebno vanćelijskoj porciji tumorskih antigena ili se sastoji od nje. U jednom primeru izvođenja, navedeni deo ili porcija uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. Prema tome, entiteti upotrebljeni u skladu sa učenjem, koji su sposobni za vezivanje sa tumorskim antigenima identifikovanim u skladu sa predmetnim učenjem su poželjno sposobni za vezivanje sa delom tumorskih antigena identifikovanih u skladu sa učenjem koji odgovara netransmembranskoj porciji, posebno vanćelijskoj porciji tumorskih antigena, ili se sastoji od nje. U jednom primeru izvođenja, navedeni deo ili porcija uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. Slično tome, peptidi i nukleinske kiseline upotrebljeni u skladu sa učenjem za indukovanje imunskog odgovora, sa specifičnošću za tumorske antigene identifikovane u skladu sa predmetnim učenjem, poželjno indukuju specifičnost za deo tumorskih antigena identifikovanih u skladu sa učenjem, koji odgovara netransmembranskoj porciji, posebno vanćelijskoj porciji tumorskih antigena, ili se sastoji od nje. U jednom primeru izvođenja, navedeni deo ili porcija uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. Poželjno, navedeni peptidi sadrže sekvencu koja suštinski odgovara delu tumorskih antigena identifikovanih u skladu sa učenjem, koji odgovara netransmembranskoj porciji, posebno vanćelijskoj porciji tumorskih antigena ili se sastoji od nje, i navedene nukleinske kiseline kodiraju te peptide. U jednom primeru izvođenja, navedeni deo ili porcija sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili varijantu pomenute amniniselinske sekvence ili fragmenta.

[0028] Jedan aspekt ovog učenja odnosi se na terapije za lečenje tumorskih oboljenja, posebno tumora jajnika i tumora pluća, koje uključuju primenu inhibitora ekspresije i/ili aktivnosti tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem opisanim u ovoj specifikaciji.

[0029] U ovom aspektu, predmetno učenje odnosi se na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži inhibitor ekspresije i/ili aktivnosti tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem. U jednom primeru izvođenja, navedeni inhibitor je specifičan za tumorsku nukleinsku kiselinu identifikovanu u skladu sa učenjem. U drugom primeru izvođenja, navedeni inhibitor je specifičan za tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem. U skladu sa učenjem, izraz "inhibira ekspresiju i/ili aktivnost" uključuje potpunu ili suštinski potpunu inhibiciju ekspresije i/ili aktivnosti i smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti. Poželjno, navedena inhibicija ekspresije tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem može se desiti inhibiranjem proizvodnje ili smanjenjem nivoa transkripta, tj. mRNK, koja kodira tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem, npr. inhibiranjem transkripcije ili indukovanjem razgradnje transkripta, i/ili inhibiranjem proizvodnje tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, npr. inhibiranjem translacije transkripta koji kodira tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem. Poželjno, navedena inhibicija ekspresije i/ili aktivnosti tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa predmetnim učenjem snižava rast tumorskih ćelija i/ili indukuje smrt tumorskih ćelija i, prema tome, ima tumor-inhibirajući ili tumor-razarajući efekat.

[0030] U posebnom primeru izvođenja, inhibitor ekspresije tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem je inhibitorna nukleinska kiselina (npr., anti-sense oligonukleotid, ribozim, iRNK, siRNK ili DNK koja ih kodira) koja se selektivno hibridizuje i specifična je za tumorsku nukleinsku kiselinu identifikovanu u skladu sa učenjem, čime inhibira (npr., snižava) njenu transkripciju i/ili translaciju.

[0031] Inhibitorne nukleinske kiseline ovog učenja uključuju oligonukleotide koji imaju sekvence u antisense orijentaciji u odnosu na ciljne nukleinske kiseline. Dužina pogodnih inhibitornih nukleotida tipično varira od pet do nekoliko stotina nukleotida, tipičnije dugi su oko 20-70 nukleotida ili manje, još tipičnije dugi su oko 10-30 nukleotida. Ovi inhibitorni oligonukleotidi mogu se primeniti kao slobodne (ogoljene) nukleinske kiseline ili u protektovanim formama, npr., inkapsulirani u lipozome. Upotreba lipozomskih ili drugih protektovanih formi može biti povoljna jer može povećati stabilnost in vivo i tako olakšati dostavu na ciljna mesta.

[0032] Isto tako, ciljna tumorska nukleinska kiselina može se upotrebiti za dizajniranje ribozima koji cilja sečenje odgovarajućih mRNK u tumorskim ćelijama. Slično tome, ovi ribozimi mogu se primeniti u slobodnoj (ogoljenoj) formi ili uz korišćenje dostavnih sistema koji pojačavaju stabilnost i/ili ciljanje, npr., uz korišćenje lipozoma.

[0033] Isto tako, ciljna tumorska nukleinska kiselina može se upotrebiti za dizajniranje siRNK koje mogu inhibirati (npr., sniziti) ekspresiju tumorske nukleinske kiseline. siRNK mogu se primeniti u slobodnoj (ogoljenoj) formi ili uz korišćenje dostavnih sistema koji pojačavaju stabilnost i/ili ciljanje, npr., uz korišćenje lipozoma. Isto tako, mogu se primeniti u formi prekursora ili kodirajućih DNK.

[0034] siRNK poželjno sadrži sense RNK lanac i antisense RNK lanac, pri čemu sense i antisense RNK lanci formiraju dvostruki lanac RNK, i pri čemu sense RNK lanac sadrži nukleotidnu sekvencu koja je suštinski identična sa ciljnom sekvencom od oko 19 do oko 25 kontinuiranih nukleotida u tumorskoj nukleinskoj kiselini identifikovanoj u skladu sa učenjem, poželjno mRNK koja kodira ciljni tumorski antigen.

[0035] U još jednom primeru izvođenja, inhibitor aktivnosti tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem je antitelo koje se specifično vezuje za navedeni tumorski antigen. U jednom primeru izvođenja, navedeno antitelo se specifično vezuje za peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. Vezivanje antitela za tumorski antigen može interferirati sa funkcijom tumorskog antigena, npr. tako što inhibira vezujuće aktivnosti ili katalitičke aktivnosti.

[0036] Isto tako, predmetno učenje u specifikaciji opisuje terapije za lečenje tumorskih oboljenja, koje uključuju primenu liganda ciljnog molekula, tj. tumorske nukleinske kiseline ili tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem. U tom pogledu, može se primeniti nukleinska kiselina koja se selektivno hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom ili se može primeniti antitelo koje se specifično vezuje za ciljni antigen, prikačeno za terapijsku efektorsku komponentu, npr., radioobeleživače, citotoksine, citotoksične enzime, i slično, u cilju selektivnog ciljanja i ubijanja ćelija koje eksprimiraju ove ciljeve, npr. tumorskih ćelija. U jednom primeru izvođenja, navedeno antitelo se specifično vezuje za peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta.

[0037] U ovom aspektu, predmetno učenje opisuje u specifikaciji farmaceutsku kompoziciju koja sadrži ligand tumorske nukleinske kiseline ili tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, navedeni ligand je povezan sa jednom ili više terapijskih efektorskih komponenti. Poželjno, navedeni ligand je specifičan za navedenu tumorsku nukleinsku kiselinu ili tumorski antigen. U jednom primeru izvođenja, navedeni ligand tumorske nukleinske kiseline ili tumorskog antigena snižava rast tumorskih ćelija i/ili indukuje smrt tumorskih ćelija i, prema tome, ima tumor-inhibirajući ili tumor-razarajući efekat.

[0038] Prema još jednom aspektu učenja, identifikacija tumorskih nukleinskih kiselina i tumorskih antigena omogućava razvoj specifičnih imunoterapija baziranih na napadanju tumorskih ćelija koje nose identifikovane antigene, čime se odlaže ili prevenira razvoj tumorskog oboljenja ili iskorenjuju tumorske ćelije. Imunoterapija obuhvata različite intervencije i tehnike čiji je zajednički cilj pobuđivanje imunskih odgovora koji će uništiti tumorske ćelije. Mogući su različiti pristupi u korišćenju ovih nukleinskih kiselina i antigena, kako je i opisano u nastavku ovog teksta. Pristupi u imunoterapiji kancera mogu se podeliti u kategoriju aktivnih i pasivnih. Aktivna imunoterapija može uključivati direktnu imunizaciju pacijenata antigenima ili nukleinskim kiselinama koje kodiraju te antigene, u pokušaju pojačavanja imunskih odgovora protiv tumora. Pasivna imunoterapija odnosi se na primenu imunskih reagenasa sa ciljem direktnog učešća u antitumorskim odgovorima. Predmetno učenje razmatra oba pristupa.

[0039] U ovom aspektu, učenje se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedno ili više sredstava odabranih iz grupe koja se sastoji od (i) peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena, ili derivat navedenog peptida, (ii) nukleinske kiseline koja kodira peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena, ili derivat navedene nukleinske kiseline, (iii) ćelije-domaćina koja kodira peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena, (iv) virusa koji kodira peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena, (v) ćelije koja prezentuje peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, ili derivat navedenog peptida, (vi) antitelo ili T-ćelijski receptor koji se vezuje za peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena, (vii) imunoreaktivne ćelije senzitizovane in vitro da prepozna peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena, i (viii) efektorske ćelije (ili matične ćelije) transdukovane nukleinskom kiselinom koja kodira T-ćelijski receptor

1

koji prepoznaje peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena.

[0040] U jednom primeru izvođenja, peptid prema (i) je specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II ili koji se može obraditi tako da proizvede specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II, poželjno specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I. Poželjno, navedeni peptid ima sekvencu koja suštinski odgovara fragmentu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I, ili se može obraditi tako da proizvede peptidni fragment koji ima tu sekvencu. Poželjno, navedeni peptid je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv tumora koji se karakteriše prezentovanjem tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem sa klasom I MHC i/ili je sposoban da stimuliše humoralni imunski odgovor protiv tumora koji se karakteriše ekspresijom tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem. U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta.

[0041] U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina prema (ii) kodira specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II ili kodira peptid koji može da se obradi tako da proizvede specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II, poželjno specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I. Poželjno, navedeni peptid ima sekvencu koja suštinski odgovara fragmentu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I ili može da se obradi tako da proizvede peptidni fragment koji ima tu sekvencu. Poželjno, navedeni peptid je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv tumora koji se karakteriše prezentovanjem tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem sa klasom I MHC i/ili je sposoban da stimuliše humoralni imunski odgovor protiv tumora koji se karakteriše ekspresijom tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem. U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. Takva nukleinska kiselina može biti prisutna u plazmidu ili ekspresionom vektoru i može biti funkcionalno povezana sa promotorom.

[0042] U jednom primeru izvođenja, ćelija-domaćin prema (iii) kodira specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II, ili kodira peptid koji može da se obradi tako da proizvede specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II, poželjno specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I. Poželjno, navedeni peptid ima sekvencu koja suštinski odgovara fragmentu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I, ili može da se obradi da proizvede peptidni fragment koji ima tu sekvencu. Poželjno, navedeni peptid je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv tumora koji se karakteriše prezentovanjem tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, sa klasom I MHC i/ili je sposoban da stimuliše humoralni imunski odgovor protiv tumora koji se karakteriše ekspresijom tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem. U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. Ćelija-domaćin može biti rekombinantna ćelija i može da sekretuje kodirani peptid ili proizvod njegove obrade, može da ga eksprimira na površini i poželjno može dodatno da eksprimira MHC molekul koji se vezuje sa pomenutim peptidom ili proizvodom njegove obrade i poželjno prezentuje navedeni peptid ili proizvod njegove obrade na ćelijskoj površini. U jednom primeru izvođenja, ćelija-domaćin eksprimira MHC molekul endogeno. U još jednom primeru izvođenja, ćelija-domaćin eksprimira MHC molekul i/ili peptid ili proizvod njegove obrade na rekombinantan način. Ćelija-domaćin je poželjno neproliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija-domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, posebno dendritska ćelija, monocit ili makrofag.

[0043] U jednom primeru izvođenja, virus prema (iv) kodira specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II ili kodira peptid koji može da se obradi tako da proizvede specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II, poželjno specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I. Poželjno, navedeni peptid ima sekvencu koja suštinski odgovara fragmentu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I, ili može da se obradi tako da proizvede peptidni fragment koji ima tu sekvencu. Poželjno, navedeni peptid je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv tumora koji se karakteriše prezentovanjem tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, sa klasom I MHC i/ili je sposoban da stimuliše humoralni imunski odgovor protiv tumora koji se karakteriše ekspresijom tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem. U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci, ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta.

[0044] U jednom primeru izvođenja, ćelija prema (v) endogeno eksprimira MHC molekul. U još jednom primeru izvođenja, ćelija rekombinantno eksprimira MHC molekul i/ili peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem. Poželjno, ćelija prezentuje peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, ili derivat navedenog peptida, sa MHC molekulima na svojoj površini. Poželjno, prezentovani peptid je peptid koji ima sekvencu koja suštinski odgovara fragmentu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, koja se prezentuje sa MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I. Ćelija je poželjno neproliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija je antigen-prezentujuća ćelija kao što je dendritska ćelija, monocit ili makrofag. Prema tome, u poželjnom primeru izvođenja, ćelija prema (v) je antigen-prezentujuća ćelija koja sadrži tumorski antigenski peptid kako je opisano u ovom tekstu prezentovan sa klasom I MHC.

[0045] U jednom primeru izvođenja, antitelo prema (vi) je monoklonsko antitelo. U dodatnim primerima izvođenja, antitelo je himerno, humano ili humanizovano antitelo, ili je fragment antitela ili sintetsko antitelo. Antitelo može biti povezano sa terapijskom efektorskom komponentom ili detektabilnim obeleživačem. Poželjno, antitelo ili T-ćelijski receptor prema (vi) vezuje se za sekvencu u peptidu koja suštinski odgovara fragmentu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem. U jednom primeru izvođenja, navedeno antitelo ili T-ćelijski receptor vezuje se za peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta.

[0046] Poželjno, ćelija prema (vii) vezuje se za sekvencu u peptidu, koja suštinski odgovara fragmentu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, fragment se poželjno prezentuje sa MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I. U jednom primeru izvođenja, ćelija prema (vii) može da se dobije postupkom koji uključuje korake (a) obezbeđivanja uzorka koji sadrži imunoreaktivne ćelije dobijene od pacijenta ili druge individue iste vrste, posebno zdrave individue, ili individue različite vrste, (b) dovođenja u kontakt navedenog uzorka sa ćelijama koje prezentuju peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja suštinski odgovara fragmentu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, ili derivat navedenog peptida, pod uslovima koji favorizuju proizvodnju CTL protiv navedenog peptida, i (c) uvođenja CTL u pacijenta, u količini odgovarajućoj za liziranje ćelija koje eksprimiraju tumorski antigen i poželjno ga prezentuju sa klasom I MHC, na primer tumorskih ćelija.

1

[0047] U jednom primeru izvođenja, postupak uključuje kloniranje T-ćelijskog receptora dobijenih CTL i transfer nukleinske kiseline koja kodira T-ćelijski receptor u efektorske ćelije kao što su CTL ili nezreli CTL, dobijeni od navedenog pacijenta ili druge individue iste vrste, posebno zdrave individue, ili individue različite vrste, efektorske ćelije tako primaju željenu specifičnost i mogu se uvesti u pacijenta. Efektorske ćelije prema (viii) mogu se proizvesti na ovaj način.

[0048] Vakcinacija uz korišćenje gore opisanih sredstava može obezbediti epitope koji se prezentuju sa MHC klase II, koji su sposobni da podstaknu odgovor CD4+ pomažućih T ćelija i/ili odgovor CD8+ T ćelija protiv tumorskih antigena identifikovanih u skladu sa učenjem, posebno ako se eksprimiraju u ćelijama kao što su tumorske ćelije. Alternativno ili dodatno, vakcinacija uz korišćenje sredstava kako je opisano gore može obezbediti epitope koji se prezentuju sa MHC klase I, koji su sposobni da podstaknu odgovor CD8+ T ćelija protiv tumorskih antigena identifikovanih u skladu sa učenjem, posebno ako se eksprimiraju u ćelijama kao što su tumorske ćelije. Pored toga, vakcinacija uz korišćenje sredstava kako je opisano gore može pobuditi antitela specifična za tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem.

[0049] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija predmetnog učenja je terapijska ili profilaktička antitumorska vakcina koja poželjno sadrži još i imunomodulatorno sredstvo, ili nukleusnu kiselinu koja kodira isto. U jednom primeru izvođenja, imunomodulatorno sredstvo je agonist pozitivno kostimulatornog molekula, npr., Ig-fuzioni protein koji je sposoban da utiče na kostimulaciju CTL. U drugom primeru izvođenja, kostimulatorno sredstvo je antagonist negativno kostimulatornog molekula, npr., antitelo koje je sposobno da snizi inhibiciju CTL kostimulacije. U poželjnom primeru izvođenja, imunomodulatorno sredstvo je anti-CTLA4 antitelo.

[0050] Farmaceutska kompozicija učenja može sadržati farmaceutski prihvatljiv nosač i može opciono sadržati jedan ili više adjuvanasa, stabilizera itd.

[0051] U drugom aspektu, učenje opisano u specifikaciji uključuje upotrebu sredstava i kompozicija učenja za profilaktičko i/ili terapijsko lečenje tumorskih oboljenja.

[0052] U jednom aspektu, učenje obezbeđuje terapijske i profilaktičke postupke lečenja pacijenta koji ima tumorsko oboljenje ili je pod rizikom da razvije tumorsko oboljenje. U jednom aspektu, učenje obezbeđuje postupke za inhibiranje rasta tumora. U jednom aspektu, učenje obezbeđuje postupke za indukovanje smrti tumorskih ćelija.

[0053] Poželjno, tumorsko oboljenje je kancersko oboljenje, poželjno odabrano iz grupe koja se sastoji od kancera jajnika, posebno adenokarcinoma jajnika i teratokarcinoma jajnika, kancera pluća, uključujući sitnoćelijski kancer pluća (SCLC) i nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), posebno karcinom pluća skvamoznih ćelija i adenokarcinom, kancera želuca, kancera dojke, kancera jetre, kancera pankreasa, kancera kože, posebno karcinoma bazalnih ćelija i karcinoma skvamoznih ćelija, malignog melanom, kancera glave i vrata, posebno malignog pleomorfnog adenoma, sarkoma, posebno sinovijalnogi sarkoma i karcinosarkoma, kancera žučnih kanala, kancera mokraćne bešike, posebno karcinoma prelaznih ćelija i papilarnogi karcinoma, kancera bubrega, posebno karcinoma bubrežnih ćelija uključujući karcinom svetlih ćelija bubrega i papilarni karcinom ćelija bubrega, kancera kolona, kancera tankog creva, uključujući kancer ileuma, posebno adenokarcinom tankog creva i adenokarcinom ileuma, embrionalnog karcinoma testisa, horikarcinoma placente, kancera cerviksa, kancera testisa, posebno testisnog seminoma, testisnog teratoma i embrionskog kancera testisa, i kancera materice, i njihovih metastatskih formi. U jednom primeru izvođenja, kancersko oboljenje se bira iz grupe koja se sastoji od kancera jajnika, kancera pluća, metastatskog kancera jajnika i metastaskog kancera pluća. Poželjno, kancer jajnika je karcinom ili adenokarcinom. Poželjno, kancer pluća je karcinom ili adenokarcinom, i poželjno je bronhiolarni kancer kao što je bronhiolarni karcinom ili bronhiolarni adenokarcinom. U jednom primeru izvođenja, tumorska ćelija je čelija tog kancera.

[0054] Poželjno, sredstva i kompozicije opisani u ovom tekstu primenjuju se na takav način da se terapijski aktivna supstanca ne dostavlja ili suštinski ne dostavlja tkivu ili organu, gde ćelije, kada tkivo ili organ ne sadrži tumore, suštinski eksprimiraju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem i/ili tumorsku nukleinsku kiselinu identifikovanu u skladu sa učenjem, na primer tkivo placente. U tom cilju, sredstva i kompozicije opisani u ovom tekstu mogu se primeniti lokalno. Poželjno, sredstva i kompozicije dostavljaju se u jajnik i/ili pluća.

[0055] Prema različitim primerima izvođenja, postupci učenja uključuju primenu inhibitora ekspresije i/ili aktivnosti tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, liganda tumorske nukleinske kiseline ili tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem i/ili jednog ili više imunoterapijskih sredstava, kako je opisano u ovom tekstu. U jednom primeru izvođenja, postupci uključuju primenu farmaceutske kompozicije opisane u ovom tekstu kod pacijenta i poželjno vakcinisanje pacijenta antitumorskom vakcinom opisanom u ovom tekstu. Bilo koji od velikog broja različitih postupaka vakcinisanja poznatih u struci može se koristiti u skladu sa predmetnim učenjem. Antitumorske vakcine učenja su poželjno sposobne da indukuju ili promovišu aktivnost CTL protiv tumora koji se karakteriše prezentacijom tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, sa klasom I MHC. One se mogu koristiti u kombinaciji sa adjuvansima koji olakšavaju stimulaciju imunskog sistema delujući

1

na T ćelije direktno ili preko APC. Adjuvansi uključuju imunomodulatorne supstance koje imaju pozitivan imunomodulatorni efekat, kako je opisano u ovom tekstu.

[0056] U različitim primerima izvođenja, postupci učenja uključuju stimulaciju antitumorskog odgovora CTL protiv tumorskih ćelija koje eksprimiraju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem i poželjno prezentuju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem sa klasom I MHC, inhibiciju rasta tumorskih ćelija koje eksprimiraju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem i poželjno prezentuju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem, sa klasom I MHC, i/ili indukciju smrti ćelija koje eksprimiraju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem i poželjno prezentuju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem, sa klasom I MHC.

[0057] U jednom aspektu, učenje obezbeđuje inhibitora ekspresije i/ili aktivnosti tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, liganda tumorske nukleinske kiseline ili tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem i/ili jedno ili više imunoterapijskih sredstava kako je ovde opisano za upotrebu u ovde opisanim postupcima lečenja. U jednom primeru izvođenja, učenje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju kako je ovde opisano za upotrebu u postupcima lečenja opisanim u ovom tekstu.

[0058] Lečenja zasnovana na ciljanju tumorskih nukleinskih kiselina ili tumorskih antigena, kao što su ovde opisane imunoterapije, mogu se kombinovati sa hirurškom resekcijom i/ili zračenjem i/ili tradicionalnom hemioterapijom.

[0059] Drugi cilj učenja je obezbediti postupke za dijagnozu, detekciju ili praćenje, tj. određivanje regresije, progresije, toka i/ili početka tumorskog oboljenja. Poželjno, navedeni postupci uključuju korišćenje liganda kao što su monoklonska antitela i nukleinskokiselinske probe koje se specifično vezuju za ciljni molekul. Pogodni ciljni molekuli su (i) tumorska nukleinska kiselina identifikovana u skladu sa učenjem, (ii) tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem ili tumorski antigenski peptid izveden iz njega, (iii) antitelo protiv tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili iz njega izvedenog tumorskog antigenskog peptida, (iv) T ćelija koja prepoznaje tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem ili iz njega izveden tumorski antigenski peptid i/ili (v) ćelija koja prezentuje tumorski antigenski peptid izveden iz tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, sa klasom I ili klasom II MHC, poželjno klasom I MHC. Takvi postupci mogu da se koriste za otkrivanje da li subjekt ima ili je pod (povećanim) rizikom da razvije tumorsko oboljenje, ili, na primer, da li je režim lečenja efikasan.

[0060] Prema tome, specifikacija opisuje postupke za dijagozu, detekciju ili praćenje tumorakog oboljenja, koji uključuju detekciju i/ili određivanje količine jednog ili više

1

parametara odabranih iz grupe koja se sastoji od (i) nukleinske kiseline koja sadrži nukleinskokiselinsku sekvencu tumorske nukleinske kiseline identifikovane u skladu sa učenjem / nukleinske kiseline koja kodira peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, (ii) peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena, (iii) antitela koje se vezuje za peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena, (iv) T ćelije koja prepoznaje peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena i/ili (v) ćelije koja prezentuje peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, sa klasom I ili klasom II MHC, poželjno klasom I MHC, u biološkom uzorku izolovanom iz pacijenta, poželjno iz pacijenta koji ima tumorsko oboljenja, koji je suspektan ili je oboleo od tumorskog oboljenja ili ima potencijal za tumorsko oboljenje.

[0061] U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina prema (i) kodira peptid koji se obrađuje tako da proizvede specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II, poželjno, specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I.

[0062] U jednom primeru izvođenja, peptid prema (ii) je specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II ili koji se može obraditi tako da proizvede specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II, poželjno, specifičan tumorski antigenski peptid koji se prezentuje sa MHC klase I.

[0063] Poželjno, T ćelija prema (iv) prepoznaje sekvencu u peptidu koja suštinski odgovara fragmentu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, koji se prezentuje sa MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I.

[0064] U jednom primeru izvođenja, ćelija prema (v) na svojoj površini prezentuje peptid sa MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I.Ćelija je poželjno neproliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija je antigen-prezentujuća ćelija kao što je dendritska ćelija, monocit ili makrofag. Prema tome, u poželjnom primeru izvođenja, ćelija prema (v) je antigenprezentujuća ćelija koja sadrži tumorski antigenski peptid kako je opisano u ovom tekstu, prezentovan sa klasom I MHC. U drugom primeru izvođenja, ćelija je tumorska ćelija.

[0065] U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina prema (i) ili peptid prema (ii) detektuju se ili im se određuje količina in situ u ćeliji, poželjno tumorskoj ćeliji. U jednom primeru

1

izvođenja, peptid prema (ii) detektuje se ili mu se određuje količina in situ na površini ćelije, bilo da je inkorporisan u ćelijsku membranu, bilo da je u kompleksu sa MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I.

[0066] Poželjno, tumorsko oboljenje koje treba da se dijagnostikuje, detektuje ili prati korišćenjem postupaka učenja je kancersko oboljenje, poželjno odabrano iz grupe koja se sastoji od kancera jajnika, posebno adenokarcinoma jajnika i teratokarcinoma jajnika, kancera pluća, uključujući sitnoćelijski kancer pluća (SCLC) i nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), posebno karcinom skvamoznih ćelija pluća i adenokarcinom, kancera želuca, kancera dojke, kancera jetre, kancera pankreasa, kancera kože, posebno karcinoma bazalnih ćelija i karcinoma skvamoznih ćelija, malignog melanoma, kancera glave i vrata, posebno malignog pleomorfnog adenoma, sarkoma, posebno sinovijalnog sarkoma i karcinosarkoma, kancera žučnih kanala, kancera mokraćne bešike, posebno karcinoma prelaznih ćelija i papilarnog karcinoma, kancera bubrega, posebno karcinoma bubrežnih ćelija, uključujući karcinom svetlih ćelija bubrega i papilarni karcinom ćelija bubrega, kancera kolona, kancera tankog creva, uključujući kancer ileuma, posebno adenokarcinom tankog creva i adenokarcinom ileuma, embrionalnog kanrcinoma testisa, horikarcinoma placente, kancera cerviksa, kancera testisa, posebno testisnog seminoma, testisni teratoma i embrionskog kancera testisa, i kancera materice, i njihovih metastatskih formi.

[0067] U jednom primeru izvođenja postupka za dijagnozu, detekciju ili praćenje tumorskog oboljenja u skladu sa učenjem, biološki uzorak i/ili kontrolni/referentni uzorak je iz tkiva ili organa koji odgovara tkivu ili organu koji treba da se dijagnostikuje, detektuje ili prati u pogledu pogođenosti tumorskim oboljenjem; npr. tumorsko oboljenje koje treba da se dijagnostikuje, detektuje ili prati je kancer jajnika i biološki uzorak i/ili kontrolni/referentni uzorak je tkivo jajnika. Takva tkiva i organi opisani su u ovom tekstu, na primer, u vezi sa različitim tumorskim oboljenjima i kancerima.

[0068] U jednom primeru izvođenja postupka za dijagnozu, detekciju ili praćenje tumorskog oboljenja, biološki uzorak je iz tkiva ili organa u kojem ćelije, kada tkivo ili organ ne sadrže tumore, suštinski ne eksprimiraju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem i/ili tumorsku nukleinsku kiselinu identifikovanu u skladu sa učenjem. Poželjno, navedeno tkivo je tkivo različito od tkiva placente. Poželjno, navedeno tkivo je tkivo jajnika, pluća, dojke, dvanaestopalačnog creva, kože, kolona, jetre, limfnog čvora, želuca, slezine, bubrega, jednjaka, pankreasa, endometrijuma, mozga, žučne kese, mokraćne bešike, ileuma, nadbubrežne žlezde, rektuma i skeletnog mišića, poželjno tkivo jajnika ili tkivo pluća.

1

[0069] U skladu sa učenjem, tumorski antigen i/ili tumorska nukleinska kiselina se suštinski ne eksprimiraju ako je nivo ekspresije niži u odnosu na ekspresiju u ćelijama placente ili tkivu placente i/ili je niži u odnosu na ekspresiju u ćelijama tumora jajnika i/ili ćelijama tumora pluća ili tkivu tumora jajnika i/ili tkivu tumora pluća. Poželjno, nivo ekspresije je niži od 10%, poželjno niži od 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% ili 0.05% ili još niži, u poređenju sa gornjim ćelijama ili tkivima. Poželjno, tumorski antigen i/ili nukleinska kiselina se suštinski ne eksprimiraju ako je nivo ekspresije ispod granice detekcije.

[0070] Postupci za dijagnozu, detekciju ili praćenje dopuštaju kvantitativnu i/ili kvalitativnu evaluaciju, npr., apsolutno i/ili relativno merenje ciljnih molekula, npr. nivoa ekspresije tumorske nukleinske kiseline ili tumorskog antigena.

[0071] Načini za obavljanje navedene detekcije i/ili određivanja količine opisani su u ovom tekstu i biće očigledni stručnjaku.

[0072] Poželjno, detekcija i/ili određivanje količine u postupcima učenja uključuju (i) dovođenje biološkog uzorka u kontakt sa sredstvom koje se specifično vezuje za nukleinsku kiselinu, peptid, antitelo, T ćeliju ili ćeliju koju treba detektovati i/ili čiju količinu treba odrediti, i (ii) detektovanje formiranja i/ili određivanje količine kompleksa između sredstva i nukleinske kiseline, peptida, antitela, T ćelije ili ćelije koju treba detektovati ili čiju količinu treba odrediti.

[0073] Tipično, nivo ciljnog molekula u biološkom uzorku upoređuje se sa referentnim nivoom, pri čemu odstupanje od navedenog referentnog nivoa ukazuje na prisustvo i/ili stadijum tumorskog oboljenja kod subjekta. Referentni nivo može biti nivo određen u kontrolnom uzorku (npr. uzorku zdravog tkiva ili subjekta) ili može biti srednji nivo kod zdravih subjekata. "Odstupanje" od navedenog referentnog nivoa označava svaku značajnu promenu, na primer povećanje ili smanjenje za najmanje 10%, 20% ili 30%, poželjno za najmanje 40% ili 50%, ili čak i više. Poželjno, prisustvo nukleinske kiseline, peptida, antitela, T ćelije i/ili ćelije u navedenom biološkom uzorku ili količina nukleinske kiseline, peptida, antitela, T ćelije i/ili ćelije u biološkom uzorku koja je povećana u odnosu na referentni nivo ukazuje na prisustvo tumorskog oboljenja.

[0074] Tipično, detekcija i/ili određivanje količine u postupcima učenja uključuje upotrebu obeleženih liganda koji se specifično vezuju za ciljni molekul, npr. obeležena nukleinskokiselinska proba koja se hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom i/ili obeleženo antitelo ili njegov fragment/derivat koji se specifično vezuje sa ciljnim peptidom.

[0075] U skladu sa učenjem, detekcija nukleinske kiseline ili određivanje količine nukleinske kiseline može se izvesti korišćenjem poznatih postupaka detekcije nukleinske kiseline kao što su postupci koji uključuju hibridizaciju ili tehnike amplifikacije nukleinske kiseline. U jednom

1

primeru izvođenja, transkripti mRNK se detektuju ili se njihova količina određuje pomoću RT-PCR ili Northern blot analize.

[0076] Takvi postupci detekcije nukleinske kiseline mogu uključivati upotrebu oligonukleotida koji se hibridizuju sa ciljnim nukleinskim kiselinama. Dužina pogodnih oligonukleotida tipično varira od pet do nekoliko stotina nukleotida, tipičnije dužina iznosi oko 20-70 nukleotida ili kraće, još tipičnije dužina iznosi oko 10-30 nukleotida.

[0077] U skladu sa učenjem, detekcija peptida ili određivanje količine peptida može se izvesti na više načina, uključujući, ali ne ograničavajući se na imunodetekciju korišćenjem antitela koje se specifično vezuje za navedeni peptid. Poželjno, antitelo se vezuje za sekvencu koja suštinski odgovara fragmentu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem. U jednom primeru izvođenja, navedena sekvenca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci, ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta.

[0078] Postupci za korišćenje antitela za detektovanje peptida dobro su poznati i uključuju ELISA, testove kompetitivnog vezivanja i slično. Uopšteno, u takvim testovima koristi se antitelo ili fragment antitela koji se specifično vezuje za ciljni peptid, direktno ili indirektno vezano za obeleživač koji omogućava detekciju, npr. indikatorski enzimi, radioobeleživači, fluorofore ili paramagnetne čestice.

[0079] U skladu sa učenjem, detekcija antitela ili određivanje količine antitela mogu se izvesti korišćenjem peptida koji se specifično vezuje za navedeno antitelo.

[0080] T ćelije mogu se izolovati iz pacijentove periferne krvi, limfnih čvorova, uzoraka tkiva kao što su ona dobijena biopsijom ili resekcijom, ili drugih izvora. Testovi reaktivnosti mogu se izvesti na primarnim T ćelijama ili drugim odgovarajućim derivatima. Na primer, T ćelije se mogu fuzionisati kako bi nastali hibridomi. Testovi za merenje odgovora T ćelija poznati su u struci, i uključuju testove proliferacije i testove oslobađanja citokina.

[0081] U jednom primeru izvođenja, T ćelija koja prepoznaje peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena je CTL koji odgovara na tumorski antigen.

[0082] CTL se mogu detektovati i njihova količina odrediti na više načina, uključujući, ali ne ograničavajući se na sledeće poželjne primere izvođenja. U jednom primeru izvođenja, CTL se direktno boje korišćenjem odgovarajućeg fluorescentnog tumorskog antigenskog peptida/MHC tetramera. U drugom primeru izvođenja koristi se "TRAP" test ("T-cell recognition of APCs by protein transfer", "prepoznavanje APC T ćelijom transferom proteina") (vidi, na primer, Beadling et al. Nature Medicine 12:1208 (2006)). U drugom primeru izvođenja, detekcija T

2

ćelija u uzorcima krvi izvodi se korišćenjem postupaka navedenih u Yuan et al. (Cytotherapy 8:498, 2006). Testovi i indeksi za detektovanje reaktivnih T ćelija su poznati i uključuju, ali se ne ograničavaju na upotrebu IFN-gama ELISPOT i bojenja IFN-gama unutarćelijskog citokina.

[0083] U struci su poznati različiti drugi postupci za određivanje da li će klon T ćelija odgovoriti na određeni antigenski peptid. Tipično se peptid dodaje u suspenziju T ćelija na period od jednog do tri dana. Odgovor T ćelija može se meriti proliferacijom, npr. preuzimanjem obeleženog timidina, ili oslobađanjem citokina, npr. IL-2. Za otkrivanje prisustva oslobođenih citokina dostupni su različiti testovi.

[0084] Testovi citotoksičnosti T ćelija mogu se koristiti za detekciju citotoksičnih T ćelija sa specifičnošću za tumorske antigene. U jednom primeru izvođenja, citotoksične T ćelije se testiraju u pogledu sposobnosti da ubiju ciljne ćelije koje prezentuju tumorski antigenski peptid sa molekulima MHC klase I. Ciljne ćelije koje prezentuju tumorski antigenski peptid mogu se obeležiti i dodati u suspenziju T ćelija iz pacijentovog uzorka. Citotoksičnost se može meriti kvantifikovanjem oslobađanja obeleživača iz liziranih ćelija. Kontrole za spontano i potpuno oslobađanje mogu biti uključene u test.

[0085] Ćelija koja prezentuje peptid može se detektovati i njena količina odrediti testiranjem njene sposobnosti da indukuje ćelijski odgovor, npr. aktiviraa T ćelije, ili merenjem ćelijske lize pomoću CTL specifičnih za takvu ćeliju.

[0086] Prisustvo navedene nukleinske kiseline, navedenog peptida, navedenog antitela, navedene T ćelije i/ili navedene ćelije koja treba da se detektuje i/ili čija količina treba da se odredi i/ili količina navedene nukleinske kiseline, navedenog peptida, navedenog antitela, navedene T ćelije i/ili navedene ćelije, koja je povećana u poređenju sa referentnim nivoom, npr. u poređenju sa pacijentom bez tumorskog oboljenja, može ukazivati na prisustvo ili rizik (tj. potencijal) za razvoj tumorskog oboljenja kod navedenog pacijenta. U jednom primeru izvođenja, prisustvo navedene nukleinske kiseline, navedenog peptida, navedenog antitela, navedene T ćelije i/ili navedene ćelije koju treba detektovati i/ili čiju količinu treba odrediti i/ili količina navedene nukleinske kiseline, navedenog peptida, navedenog antitela, navedene T ćelije i/ili navedene ćelije, koja je povećana u poređenju sa referentnim nivoom, npr. u poređenju sa pacijentom bez tumorskog oboljenja, može ukazivati na prisustvo ili rizik od metastatskog kancera kao što je metastatski kancer jajnika ili metastatski kancer pluća.

[0087] U jednom primeru izvođenja, biološki uzorak je iz tkiva ili organa gde ćelije, kada tkivo ili organ ne sadrže tumore, suštinski ne eksprimiraju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem i/ili tumorsku nukleinsku kiselinu identifikovanu u skladu sa učenjem. Naznačavanje prisustva ili rizika za tumorsko oboljenje kod pacijenta postupcima učenja može ukazivati na to da tumorsko oboljenje postoji u navedenom tkivu ili organu ili da je navedeno tkivo ili organ pod rizikom za navedeno tumorsko oboljenje.

[0088] U jednom primeru izvođenja, biološki uzorak je iz tkiva ili organa gde ćelije, kada tkivo ili organ ne sadrže tumore, suštinski ne eksprimiraju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem i/ili tumorsku nukleinsku kiselinu identifikovanu u skladu sa učenjem i tkivo ili organ su opciono već dijagnostikovani kao zahvaćeni tumorskim oboljenjem, npr. vizuelnim pregledom ili testiranjem ćelija navedenog tkiva ili organa u kulturi. U ovom primeru izvođenja, prisustvo navedene nukleinske kiseline, navedenog peptida, navedenog antitela, navedene T ćelije i/ili navedene ćelije koju treba detektovati i/ili čiju količinu treba odrediti i/ili količina navedene nukleinske kiseline, navedenog peptida, navedenog antitela, navedene T ćelije i/ili navedene ćelije, koja je povećana u poređenju sa referentnim nivoom, npr. u poređenju sa pacijentom koji nema tumorsko oboljenje, može ukazivati na to da je tumorsko oboljenje metastatski kancer jajnika ili metastatski kancer pluća. Poželjni biološki uzorci za takvo testiranje mogu sadržati tkivo za koje se zna da je podložno takvim metastatskim kancerima. Takva tkiva opisana su u ovom tekstu.

[0089] Naznačavanje prisustva ili rizika za metastatski kancer jajnika ili metastatski kancer pluća kod pacijenta postupcima učenja takođe može ukazivati na prisustvo ili rizik od kancera jajnika i kancera pluća kod navedenog pacijenta.

[0090] Postupci za dijagnozu, detekciju ili praćenje tumorskog oboljenja učenja takođe uključuju primere izvođenja u kojima je detekcijom ili određivanjem količine navedene nukleinske kiseline, navedenog peptida, navedenog antitela, navedene T ćelije i/ili navedene ćelije moguće proceniti i/ili prognozirati metastatsko ponašanje tumorskog oboljenja, pri čemu, poželjno, prisustvo navedene nukleinske kiseline, navedenog peptida, navedenog antitela, navedene T ćelije i/ili navedene ćelije i/ili količina navedene nukleinske kiseline, navedenog peptida, navedenog antitela, navedene T ćelije i/ili navedene ćelije, koja je povećana u poređenju sa referentnim nivoom, npr. nivoom kod pacijenta bez navedene bolesti ili bez metastaze navedene bolesti, može ukazivati na metastatsko ponašanje tumorskog oboljenja ili rizik za metastatsko ponašanje tumorskog oboljenja.

[0091] U jednom primeru izvođenja, biološki uzorak je iz tkiva ili organa gde ćelije, kada tkivo ili organ ne sadrže tumore, suštinski ne eksprimiraju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem i/ili tumorsku nukleinsku kiselinu identifikovanu u skladu sa učenjem. U jednom primeru izvođenja, tumorsko oboljenje je u navedenom tkivu ili organu.

[0092] Postupci praćenja u skladu sa učenjem poželjno uključuju detekciju i/ili određivanje količine jednog ili više parametara pomenutih gore u prvom uzorku u prvoj vremenskoj tački i u drugom uzorku u drugoj vremenskoj tački, pri čemu se regresija, progresija, tok i/ili pojava tumorskog oboljenja mogu odrediti upoređivanjem dva uzorka.

[0093] Količina navedene nukleinske kiseline, navedenog peptida, navedenog antitela, navedene T ćelije i/ili navedene ćelije, koja je smanjena u biološkom uzorku u poređenju sa biološkim uzorkom uzetim ranije od pacijenta, može ukazivati na regresiju, pozitivan tok, npr. uspešno lečenje, odnosno smanjeni rizik za pojavu tumorskog oboljenja kod navedenog pacijenta.

[0094] U jednom primeru izvođenja, biološki uzorak je iz tkiva ili organa gde ćelije, kada tkivo ili organ ne sadrže tumore, suštinski ne eksprimiraju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem i/ili tumorsku nukleinsku kiselinu identifikovanu u skladu sa učenjem. U jednom primeru izvođenja, tumorsko oboljenje je u navedenom tkivu ili organu.

[0095] Količina navedene nukleinske kiseline, navedenog peptida, navedenog antitela, navedene T ćelije i/ili navedene ćelije, koja je povećana u biološkom uzorku u poređenju sa biološkim uzorkom uzetim ranije od pacijenta, može ukazivati na progresiju, negativan tok, npr. neuspešno lečenje, recidiv ili metastatsko ponašanje, nastanak ili rizik od nastanka tumorskog oboljenja kod navedenog pacijenta.

[0096] U jednom primeru izvođenja, biološki uzorak je iz tkiva ili organa gde ćelije, kada tkivo ili organ ne sadrže tumore, suštinski ne eksprimiraju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem i/ili tumorsku nukleinsku kiselinu identifikovanu u skladu sa učenjem. U jednom primeru izvođenja, tumorsko oboljenje je u navedenom tkivu ili organu.

[0097] U posebnom aspektu, učenje se odnosi na postupak za detekciju, tj. određivanje pozicije ili mesta tumorskog oboljenja, npr. posebnog tkiva ili organa. U jednom primeru izvođenja navedeni postupak uključuje primenu antitela koje se vezuje za tumorski antigen identifikovan u skladu sa predmetnim učenjem i koje je povezano sa detektabilnim obeleživačem, kod pacijenta. U jednom primeru izvođenja, navedeno antitelo vezuje se za peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. Antitelo može biti monoklonsko antitelo. U daljim primerima izvođenja, antitelo je himerno, humano ili humanizovano antitelo, fragment antitela ili sintetsko antitelo.

[0098] Obeležavanje tkiva ili organa u navedenom pacijentu može ukazati na prisustvo ili rizik za tumorsko oboljenje u navedenom tkivu ili organu.

[0099] U jednom primeru izvođenja, tkivo ili organ je tkivo ili organ u kojem ćelije, kada tkivo ili organ ne sadrže tumore, suštinski ne eksprimiraju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem i/ili tumorsku nukleinsku kiselinu identifikovanu u skladu sa učenjem.

2

[0100] U jednom primeru izvođenja, tkivo ili organ je tkivo ili organ u kojem ćelije, kada tkivo ili organ ne sadrže tumore, suštinski ne eksprimiraju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem i/ili tumorsku nukleinsku kiselinu identifikovanu u skladu sa učenjem i tkivo ili organ su već dijagnostikovani da su pogođeni tumorskim oboljenjem, npr. vizuelnim pregledom ili testiranjem ćelija navedenog tkiva ili organa u kulturi. U ovom primeru izvođenja, obeležavanje tkiva ili organa može ukazati da je tumorsko oboljenje metastatski kancer jajnika ili metastatski kancer pluća.

[0101] Naznačavanje prisustva ili rizika za metastatski kancer jajnika ili metastatski kancer pluća u tkivu ili organu postupcima učenja može takođe ukazati na prisustvo ili rizik za kancer jajnika i kancer pluća kod pacijenta.

[0102] Poželjno tumorsko oboljenje u postupcima za dijagnozu, detekciju ili praćenje tumorskog oboljenja učenja je tumorsko oboljenje tkiva različitog od tkiva placente. Poželjno, navedeno tkivo je tkivo jajnika, pluća, dojke, dvanaestopalačnog creva, kože, kolona, jetre, limfnih čvorova, želuca, slezine, bubrega, jednjaka, pankreasa, endometrijuma, mozga, žučne kese, mokraćne bešike, ileuma, nadbubrežne žlezde, rektuma i skeletnih mišića, poželjno tkivo jajnika ili tkivo pluća. U još jednom aspektu, tumorsko oboljenje je odabrano iz grupe koja se sastoji od kancera jajnika, kancera pluća, metastatskog kancera jajnika i metastatskog kancera pluća.

[0103] Pozitivna dijagnoza tumorskog oboljenja i/ili metastatskog tumorskog oboljenja i/ili recidiva tumorskog oboljenja kako je opisano gore, korišćenjem postupaka predmetnog učenja može ukazati na tumorsko oboljenje i/ili metastatsko tumorsko oboljenje i/ili recidiv tumorskog oboljenja koji podležu postupcima lečenja opisanim u ovom tekstu.

[0104] Cirkulišuće tumorske ćelije (circulating tumor cells, CTC) bile su u ultraniskim koncentracijama zapažene u perifernoj krvi pacijenata sa kancerima epitelnog porekla. Pokazano je da broj ovih ćelija korelira sa ishodom za kohorte pacijenata sa metastatskim kancerom čija je bolest u progresiji u vreme uzorkovanja. Neka saopštenja sugerišu prognostičku ulogu cirkulišućih tumorskih ćelija kod pacijenata obolelih od kancera kolona. Posledično, instrument za merenje cirkulišućih tumorskih ćelija mogao bi biti vredan dijagnostički alat.

[0105] Tumorske nukleinske kiseline i tumorski antigeni identifikovani u skladu sa predmetnim učenjem korisni su u postupcima za detektovanje cirkulišućih tumorskih ćelija u pacijentu. Postupci mogu ukazati na prisustvo metastatskog kancera ili ranog stadijuma kancera. U jednom aspektu postupka, prisustvo cirkulišućih tumorskih ćelija u uzorku ukazuje na verovatnoću recidiva kancera kod sisarskog subjekta. U još jednom aspektu postupka, prisustvo cirkulišućih tumorskih ćelija u uzorku ukazuje na status remisije kod sisarskog subjekta.

[0106] Prema tome, predmetno učenje odnosi se na postupak za detektovanje cirkulišućih tumorskih ćelija kod pacijenta, koji uključuje detekciju i/ili određivanje količine (i) nukleinske kiseline koja sadrži nukleinskokiselinsku sekvencu tumorske nukleinske kiseline identifikovane u skladu sa učenjem / nukleinsku kiselinu koja kodira peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem i/ili (ii) peptida koji sadrži amnikiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz pomenutog tumorskog antigena u biološkom uzorku koji sadrži ili je suspektan da sadrži diseminovane ili cirkulišuće tumorske ćelije ili metastatske tumorske ćelije izolovane iz navedenog pacijenta. Poželjno, pacijent je pacijent koji ima tumorsko oboljenje, koji je suspektan da ima tumorsko oboljenje ili koji ima potencijal za tumorsko oboljenje.

[0107] Prema tome, u postupcima za detektovanje cirkulišućih tumorskih ćelija učenja, tumorske nukleinske kiseline identifikovane u skladu sa učenjem i/ili tumorski antigeni identifikovani u skladu sa učenjem ili tumorski antigenski peptidi izvedeni iz njih koriste se kao ciljni molekuli za identifikovanje ćelija koje se karakterišu prisustvom navedenih ciljnih molekula. Za ove ćelije je verovatno da predstavljaju cirkulišuće tumorske ćelije.

[0108] U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina ili peptid se detektuje ili se njen kvalitet određuje in situ u ćeliji, poželjno tumorskoj ćeliji. U jednom primeru izvođenja, peptid se detektuje ili se njegova količina određuje in situ na površini ćelije, ili kada je inkorporisan u ćelijsku membranu ili je u kompleksu sa MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I. Načini za obavljanje navedene detekcije i/ili određivanje količine takvih ciljnih molekula opisani su u ovom tekstu i biće očigledni stručnjaku.

[0109] Biološki uzorak koji sadrži ili je suspektan da sadrži diseminirane ili cirkulišuće tumorske ćelije ili metastatske tumorske ćelije uključuje, na primer, krv, serum, abdominalnu tečnost, kostnu srž, sputum, bronhijalni aspirat, i/ili bronhijalni ispirak.

[0110] U jednom aspektu postupka, prisustvo navedene nukleinske kiseline prema (i) i/ili navedenog peptida prema (ii) u navedenom biološkom uzorku ili količina navedene nukleinske kiseline i/ili navedenog peptida u navedenom biološkom uzorku, koja je povišena u poređenju sa referentnim nivoom, ukazuje na prisustvo cirkulišućih tumorskih ćelija kod navedenog pacijenta.

[0111] U jednom aspektu postupka, prisustvo cirkulišućih tumorskih ćelija u uzorku može ukazati na prisustvo rizika za tumorsko oboljenje, posebno metastatsko tumorsko oboljenje kod

2

pacijenta. U još jednom aspektu, prisustvo cirkulišućih tumorskih ćelija u uzorku može ukazati na prisustvo rizika za rani stadijum tumorskog oboljenja kod pacijenta. U još jednom aspektu, prisustvo cirkulišućih tumorskih ćelija kod navedenog pacijenta može ukazati na prisustvo rizika za tumorsko oboljenje odabrano iz grupe koja se sastoji od kancera jajnika, kancera pluća, metastatskog kancera jajnika i metastatskog kancera pluća.

[0112] U posebnim primerima izvođenja, postupci učenja omogućavaju procenu i/ili prognozu uspeha terapije kancera koja je primenjena ili će biti primenjena. U jednom aspektu postupka, prisustvo cirkulišućih tumorskih ćelija u uzorku može ukazati na prisustvo ili rizik za tumorsku metastazu ili recidiv tumora kod pacijenta. U još jednom aspektu postupka, prisustvo cirkulišućih tumorskih ćelija u uzorku može ukazati na status remisije tumora kod pacijenta.

[0113] Detekcija cirkulišućih tumorskih ćelija korišćenjem postupaka za detekciju cirkulišućih tumorskih ćelija učenja može ukazivati na tumorsko oboljenje i/ili metastatsko tumorsko oboljenje i/ili recidiv tumorskog oboljenja koje je podložno ovde opisanim postupcima lečenja.

[0114] U detaljnijem aspektu, prisustvo cirkulišućih tumorskih ćelija u uzorku može ukazivati na prisustvo ili rizik od kancera uključujući, ali ne ograničavajući se na, limfom, mijelom, neuroblastom, kancer dojke, kancer jajnika, kancer pluća, rabdomiosarkom, sitnoćelijske tumore pluća, primarne tumore mozga, kancer želuca, kancer kolona, kancer pankreasa, kancer mokraćne bešike, kancer testisa, kancer štitne žlezde, neuroblastom, kancer jednjaka, kancer genitourinarnog trakta, kancer cerviksa, kancer endometrijuma, kancer nadbubrežne žlezde ili kancer prostate.

[0115] Poželjno, takav test za cirkulišuće tumorske ćelije izvodi se upotrebom antitela usmerenih prema ciljnim peptidima, pri čemu su navedena antitela detektabilno obeležena. U jednom posebnom primeru izvođenja, takav test za cirkulišuće tumorske ćelije izvodi se korišćenjem imunofluorescentnih testova, putem monoklonskih antitela usmerenih prema ciljnim peptidima i poželjno se izvodi na perifernoj krvi pacijenata. U jednom primeru izvođenja, navedena antitela vezuju se za peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci, ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta.

[0116] Prisustvo cirkulišućih tumorskih ćelija u krvi može se korelisati sa metastatskim tumorskim oboljenjem ili rizikom za metastatsko tumorsko oboljenje, i sa lošim ishodom i nižom stopom preživljavanja.

[0117] Najpouzdaniji trenutno dostupni postupak za detekciju CTC je automatizovana digitalna mikroskopija (automated digital microscopy, ADM) uz korišćenje analize slike za prepoznavanje imunohistohemijski obeleženih tumorskih ćelija. ADM je, međutim, nepovoljna

2

zbog svoje veoma spore brzine skeniranja od 800 ćelija/sec. Kraeft et al, Clin Cancer Res 10: 3020-8, 2004. Brzina skeniranja ADM ograničena je latencijom povezanom sa velikim brojem koraka pri skeniranju uzorka, zbog ograničenog vidnog polja.

[0118] Da bi se zaobišlo ovo ograničenje brzine, razvijeno je nekoliko tehnologija obogaćenja signala CTC kako bi se snizio ukupan broj ćelija koje treba skenirati. Do sada najuspešniji od ovih pristupa obogaćenja signala je imunomagnetno obogaćivanje (immunomagnetic enrichment, IME). Smirnov et al, Cancer Res 65: 4993-7, 2005; Allard et al, Clin Cancer Res 10: 6897-904, 2004; Cristofanilli et al, N EnglJ Med 351: 781-91, 2004. U većini implementacija IME, monoklonska antitela konjugovana sa malim magnetnim perlicama ciljaju adhezioni molekul epitelnih ćelija, Ep-CAM. Perlicama se zatim manipuliše u magnetnom polju da bi se postiglo obogaćenje.

[0119] Još jedan aspekt učenja odnosi se na postupak detekcije metastatskih ćelija kancera jajnika ili metastatskih ćelija kancera pluća kod pacijenta, koji uključuje detekciju i/ili određivanje količine (i) nukleinske kiseline koja sadrži nukleinskokiselinsku sekvencu tumorske nukleinske kiseline identifikovane u skladu sa učenjem / nukleinsku kiselinu koja kodira peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem i/ili (ii) peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena u biološkom uzorku izolovanom iz tkiva ili organa navedenog pacijenta koji ima tumor u kojem ćelije, kada tkivo ili organ ne sadrže tumore, suštinski ne eksprimiraju navedenu nukleinsku kiselinu ili peptid.

[0120] Prema tome, u postupcima detektovanja ćelija metastatskog kancera jajnika ili ćelija metastatskog kancera pluća, tumorske nukleinske kiseline identifikovane u skladu sa učenjem i/ili tumorski antigeni identifikovani u skladu sa učenjem ili tumorski antigenski peptidi izvedeni iz njih, koriste se kao ciljni molekuli za identifikovanje tumorskih ćelija koje se karakterišu prisustvom navedenih ciljnih molekula. Verovatno je da ove ćelije predstavljaju metastatske ćelije kancera jajnika ili metastatske ćelije kancera pluća. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina ili peptid detektuju se ili im se određuje količina in situ u ćeliji, poželjno tumorskoj ćeliji.

[0121] U jednom primeru izvođenja, peptid se detektuje ili se određuje njegova količina in situ na površini ćelije, gde je ili inkorporisan u ćelijsku membranu ili u kompleksu sa MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I. Načini za obavljanje navedene detekcije i/ili određivanje količine takvih ciljnih molekula opisani su u ovom tekstu i biće očigledni stručnjaku.

2

[0122] U skladu sa učenjem, nukleinska kiselina i/ili peptid se suštinski ne eksprimiraju ako je nivo ekspresije niži u odnosu na ekspresiju u ćelijama placente ili tkivu placente i/ili je niži u poređenju sa ekspresijom u ćelijama tumora jajnika i/ili ćelijama tumora pluća. Poželjno, nivo ekspresije je niži od 10%, poželjno niži od 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% ili 0.05% ili još niži u poređenju sa gornjim ćelijama ili tkivima. Poželjno, nukleinska kiselina i/ili peptid se suštinski ne eksprimiraju ako je nivo ekspresije ispod granice detekcije.

[0123] Poželjno, tkivo je tkivo koje nije tkivo placente i poželjno je tkivo različito od tkiva jajnika ili tkiva pluća. Poželjno, navedeno tkivo je tkivo dojke, dvanaestopalačnog creva, kože, kolona, jetre, limfnih čvorova, želuca, slezine, bubrega, jednjaka, pankreasa, endometrijuma, mozga, žučne kese, mokraćne bešike, ileuma, nadbubrežne žlezde, rektuma i skeletnih mišića. Poželjno, takvo tkivo je tkivo za koje se zna da je podložno metastatskom kanceru jajnika i/ili metastatskom kanceru pluća. Takva tkiva su opisana u ovom tekstu.

[0124] Poželjno, tkivo ili organ su već dijagnostikovani kao pogođeni tumorskim oboljenjem, vizuelnim pregledom ili testiranjem ćelija, tkiva ili organa u kulturi.

[0125] U jednom aspektu postupka, prisustvo navedene nukleinske kiseline prema (i) i/ili navedenog peptida prema (ii) u navedenom biološkom uzorku, ili količina navedene nukleinske kiseline i/ili peptida u navedenom biološkom uzorku, koja je povišena u poređenju sa referentnim nivoom, ukazuje na prisustvo ili rizik za metastatske ćelije kancera jajnika ili metastatske ćelije kancera pluća u navedenom tkivu ili organu. Prisustvo metastatskih ćelija kancera jajnika ili metastatskih ćelija kancera pluća u navedenom tkivu ili organu može ukazati i na prisustvo ili rizik za kancer jajnika ili kancer pluća kod navedenog pacijenta.

[0126] Pozitivna dijagnoza metastatskih ćelija kancera jajnika ili metastatskih ćelija kancera pluća može ukazati na to da je tumor tkiva ili organa iz kojeg je biološki uzorak izolovan podložan postupcima lečenja opisanim u ovom tekstu.

[0127] Specifikacija opisuje još i dijagnostičke testne kitove korisne u postupcima za dijagnozu, detekciju ili praćenje i u postupcima za detekciju cirkulišućih tumorskih ćelija i/ili u postupcima detekcije metastatskih ćelija kancera jajnika ili metastatskih ćelija kancera pluća učenja. Ovi kitovi u jednom primeru izvođenja sadrže ligand koji se specifično vezuje za ciljni molekul kako je gore definisano i, opciono, detektabilni obeleživač, npr. indikatorske enzime, radioobeleživače, fluorofore ili paramagnetne čestice. U posebnom primeru izvođenja, ligand sadrži nukleinskokiselinske prajmere ili probe specifične za ciljne nukleinske kiseline kako je gore opisano, ili antitelo ili njegov derivat, specifično za ciljni peptid kako je gore opisano. U jednom primeru izvođenja, navedeno antitelo je specifično za peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste

2

sekvenci ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. Kitovi mogu sadržati informativne brošure, na primer, brošure koje daju informacije o tome kako u praksi koristiti reagense za izvođenje ovde objavljenog postupka.

[0128] U još jednom aspektu, učenje se odnosi na rekombinantni molekul nukleinske kiseline, posebno DNK ili RNK molekul, koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena ili tumorskog antigenakog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena.

[0129] Učenje se odnosi i na ćelije-domaćine koje uključuju rekombinantni molekul nukleinske kiseline učenja. Poželjno, takve ćelije-domaćini eksprimiraju kodirani peptid.

[0130]Ćelija-domaćin može biti rekombinantna ćelija i može sekretovati kodirani peptid, može ga eksprimirati na površini i poželjno može dodatno eksprimirati MHC molekul koji se vezuje sa navedenim peptidom ili proizvodom njegove obrade. U jednom primeru izvođenja, ćelijadomaćin eksprimira MHC molekul endogeno. U još jednom primeru izvođenja, ćelija-domaćin eksprimira MHC molekul i/ili peptid ili proizvod njegove obrade na rekombinantan način. Ćelija-domaćin je poželjno neproliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija-domaćin je ćelija koja prezentuje antigen, posebno dendritska ćelija, monocit ili makrofag.

[0131] U još jednom aspektu, učenje se odnosi na peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena, ili derivat navedenog peptida. U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta.

[0132] U još jednom aspektu, učenje se odnosi na sredstvo koje se vezuje za peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena, ili derivat navedenog peptida. U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. U poželjnom primeru izvođenja, sredstvo je protein ili peptid, posebno antitelo, T-ćelijski receptor ili MHC molekul. U dodatnim primerima izvođenja, antitelo je monoklonsko, himerno, humano ili humanizovano antitelo, antitelo proizvedeno tehnikama kombinacije, fragment antitela, ili sintetsko antitelo.

[0133] Učenje se odnosi i na konjugat sredstva učenja koje se vezuje sa peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem ili

2

tumorskog antigenskog peptida izvedenog iz navedenog tumorskog antigena, ili derivat navedenog peptida i terapijsku efektorsku komponentu ili detektabilni obeleživač.

Detaljan opis

[0134] Neki aspekti predmetnog učenja predviđaju imunoterapiju tumorskih oboljenja, posebno kancerskih oboljenja, korišćenjem tumorskih nukleinskih kiselina i tumorskih antigena identifikovanih prema učenju, aktivnim ili pasivnim imunoterapijskim pristupima koji se mogu sumirati na sledeći način:

Imunoterapija

[0135]

I. Aktivna imunoterapija ("kancerske vakcine")

Imunizacija sa:

i) antigenom ili peptidom (nativnim ili modifikovanim)

ii) nukleinskom kiselinom koja kodira antigen ili peptid

iii) rekombinantnim ćelijama koje kodiraju antigen ili peptid

iv) rekombinantnim virusima koji kodiraju antigen ili peptid

v) antigen-prezentujućim ćelijama koje su pobuđene antigenom ili peptidom (nativnim ili modifikovanim) ili transfektovane nukleinskim kiselinama koje kodiraju antigen ili peptid

II. Pasivna imunoterapija ("adoptivna imunoterapija")

vi) Transfer antitela ili T-ćelijskih receptora koji prepoznaju antigen vii) Transfer ćelija senzitizovanih in vitro na antigen (velike ili klonirane populacije)

viii) Transfer efektorskih ćelija (ili matičnih ćelija) transdukovanih nukleinskim kiselinama koje kodiraju T-ćelijske receptore koji prepoznaju antigen i poželjno odgovaraju na tumor-specifične peptide koji se prezentuju sa klasom I MHC

[0136] Poslednjih nekoliko godina mnogo pažnje pridaje se ulozi CD8+ T ćelija u tumorskoj imunosti. Za tumor-specifične CD8+ CTL pokazano je da mogu direktno lizirati tumorske ćelije i iskoreniti tumorske mase in vivo u životinjskim modelima.

[0137] Međutim, smatra se da i CD4+ T ćelije igraju ključnu ulogu i moguće je da optimalne vakcine protiv kancera zahtevaju učešće i CD4+ i CD8+ T ćelija.

[0138] Imunizacija intaktnim ili suštinski intaktnim tumorskim antigenom ima potencijalnu prednost istovremene imunizacije protiv epitopa klase I i klase II, ali zahteva opsežne i dugotrajne napore pri prečišćavanju velikih količina tumorskog antigena. Identifikacija MHC klase I i klase II peptida unutar tumorskog antigena omogućava imunizaciju visokim nivoima čistog sintetskog peptida. Peptidni pristup takođe ima prednost što se izborom epitopa koji će se koristiti može birati između odgovora tipa MHC klase I i klase II (ili mešavine). Imunizacija peptidom znači i to da se mogu odabrati subdominantni i/ili kriptični epitopi (jer se potreba za obradom antigena može zaobići ili smanjiti na ulogu "podrezivanja") kako bi se stimulisao različiti podskup T ćelija. Peptid se takođe može modifikovati (na primer na mestima ukotvljavanja HLA klase I ili II) kako bi se povećala njegova imunogenost.

[0139] Učenje se odnosi na tumor-specifične peptide koji se prezentuju sa klasom I MHC i postupke korišćenja istih, kao i na citotoksične T limfocite (CTL) koji odgovaraju na tumorspecifične peptide koji se prezentuju sa klasom I MHC i postupke upotrebe istih.

[0140] U jednom aspektu, specifikacija opisuje antitumorske vakcine sposobne da stimulišu ćelijski odgovor protiv tumora koji se karakteriše prezentacijom tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, sa klasom I MHC. Antitumorske vakcine poželjno sadrže tumorski antigenski peptid ili nukleinsku kiselinu tumorskog antigenskog peptida.

[0141] Učenje takođe obuhvata upotrebu nukleinskih kiselina koje kodiraju jedan ili više tumorskih antigena identifikovanih prema učenju ili jedan ili više tumorskih antigenskih peptida izvedenih iz njih. Pretpostavlja se da su tako kodirani antigeni ili peptidi efikasni kao terapijske ili profilaktičke antitumorske vakcine. Na primer, posebna razmatrana primena ovih nukleinskih kiselina uključuje indukciju ćelijskog odgovora kao što je CTL odgovor i/ili humoralnog imunskog odgovora protiv takvih antigena.

[0142] Imunizacija plazmidnom DNK može pobuditi antigen-specifične imunske odgovore koji se sastoje od CD8+ T ćelija, CD4+ T ćelija i antitela. DNK se može primeniti postupkom imunizacije genskim pištoljem. Kod imunizacije genskim pištoljem, plazmidna DNK može se naneti na čestice zlata, posle čega sledi dostava čestica obloženih DNK u kožu genskim pištoljem pod visokim pritiskom, koji se pokreće helijumom.

[0143] Napredak u molekularnoj biologiji omogućio je konstruisanje rekombinantnih virusa koji kodiraju tumorske antigene ili tumorske antigenske peptide kako je ovde opisano. Do sada je korišćeno nekoliko rekombinantnih virusnih vakcina.

1

[0144] Nekoliko virusnih vektora pokazalo je obećavajuće rezultate u pogledu potencijala za poboljšanje imunoterapije malignih oboljenja. Mogu se koristiti virusi kompetentni za replikaciju i virusi nekompetentni za replikaciju, pri čemu se prednost daje drugoj grupi. Herpes virus, adenovirus, vakcinija, reovirus i virusi New Castle bolesti primeri su poželjnih virusa korisnih prema predmetnom učenju.

[0145] Antigen-prezentujuće ćelije (APC) kao što su dendritske ćelije (DC) mogu se napuniti peptidima koji se prezentuju sa MHC klase I ili tumorskim lizatom, ili transdukovati nukleinskom kiselinom, na primer transdukcija korišćenjem adenovirusa koji kodira tumorski antigen.

[0146] U poželjnom primeru izvođenja, antitumorska vakcina učenja uključuje APC napunjene antigenskim peptidom tumora. U tom smislu, protokoli se mogu oslanjati na in vitro kulturu/diferencijaciju DC manipulisanih tako da veštački prezentuju tumorski antigenski peptid. Proizvodnja genetički modifikovanih DC može uključivati uvođenje nukleinskih kiselina koje kodiraju tumorske antigene ili tumorske antigenske peptide u DC. Transfekcija DC pomoću mRNK je obećavajuća tehnika punjenja antigenom za stimulisanje snažnog antitumorskog imuniteta.

[0147] Dendritske ćelije (DC) su populacija leukocita koji T ćelijama prezentuju antigene zarobljene u perifernim tkivima, putevima prezentacije antigena preko MHC klase II i I. Dobro je poznato da su DC moćni induktori imunskih odgovora i aktivacija ovih ćelija je kritičan korak za indukciju antitumorskog imuniteta. Sazrevanje DC označava se kao status aktivacije DC, pri čemu takve antigen-prezentujuće DC dovode do prajminga T ćelija, dok prezentacija nezrelim DC rezultuje tolerancijom. Sazrevanje DC uglavnom je uzrokovano biomolekulima sa mikrobnim karakteristikama koje detektuju urođeni receptori (bakterijska DNK, virusna RNK, endotoksin itd.), proupalnim citokinima (TNF, IL-1, IFN), vezivanjem CD40 na površini DC sa CD40L, i supstancama koje se oslobađaju iz ćelija koje podležu stresnoj ćelijskoj smrti. DC se mogu dobiti kultivisanjem ćelija kostne srži in vitro, sa citokinima kao što je faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (granulocyte-macrophage colonystimulating factor, GM-CSF) i faktor nekroze tumora alfa.

[0148] Specifikacija opisuje još i pripremanje antitela, poželjno monoklonskih antitela protiv ciljnog antigena kako je definisano gore. Takva monoklonska antitela mogu se proizvesti konvencionalnim postupcima i uključuju njihove fragmente ili derivate, uključujući, bez ograničavanja, humana monoklonska antitela, humanizovana monoklonska antitela, himerna monoklonska antitela, jednolančana antitela, npr., scFv i antigen-vezujuće fragmente antitela kao što su Fab i Fab’ fragmenti. Postupci za pripremanje monoklonskih antitela poznati su u

2

struci. Uopšteno, pripremanje monoklonskih antitela uključuje imunizaciju odgovarajućeg domaćina antigenima o kojima je reč, izolovanje imunskih ćelija iz njih, upotrebu tih imunskih ćelija za izolovanje monoklonskih antitela i skrining na monoklonska antitela koja se specifično vezuju za jedan od tih antigena. Fragmenti antitela mogu se pripremiti poznatim postupcima, npr., enzimskim sečenjem monoklonskih antitela.

[0149] Ova monoklonska antitela i fragmenti korisni su za pasivnu antitumorsku imunoterapiju ili se mogu pričvrstiti za terapijske efektorske kompnente, npr., radioobeleživače, citotoksine, terapijske enzime, sredstva koja indukuju apoptozu i slično, kako bi se osigurala ciljana citotoksičnost, tj., ubijanje tumorskih ćelija. U jednom primeru izvođenja predmetnog učenja, takva antitela ili fragmenti primenjuju se u obeleženoj ili neobeleženoj formi, sami ili u kombinaciji sa drugim terapeuticima, npr. hemioterapeuticima kao što su cisplatin, metotreksat, adriamicin i slično, pogodnim za lečenje kancera.

[0150] Ako se koriste kao pasivna antitumorksa imunoterapija, antitela se mogu, ali ne moraju povezati sa terapijskim efektorskim komponentama. Poželjno, antitela opisana u ovom tekstu posreduju u ubijanju ćelija indukovanjem lize posredovane citotoksičnošću zavisnom od komplementa (complement dependent cytotoxicity, CDC), lize posredovane ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC), apoptoze, homotipske adhezije, i/ili fagocitoze, poželjno indukovanjem CDC-posredovane lize i/ili ADCC-posredovane lize. Antitela opisana u ovom tekstu poželjno interaguju sa komponentama imunskog sistema, poželjno preko ADCC ili CDC. Međutim, antitela učenja mogu ispoljiti efekat i jednostavno vezivanjem za tumorske antigene na površini ćelije, tako, npr. blokirajući proliferaciju ćelija.

[0151] ADCC opisuje sposobnost efektorskih ćelija, posebno limfocita, da ubijaju druge ćelije kako je opisano u ovom tekstu, što poželjno zahteva da ciljne ćelije budu obeležene antitelom.

[0152] ADCC se poželjno dešava kada se antitela vežu za antigene na tumorskim ćelijama i Fc domeni antitela angažuju Fc receptore (FcR) na površini imunskih efektorskih ćelija. Identifikovano je nekoliko familija Fc receptora, i specifične ćelijske populacije karakteristično eksprimiraju definisane Fc receptore. ADCC se može posmatrati kao mehanizam direktnog indukovanja različitog stepena neposredne destrukcije tumora, koji dovodi i do prezentacije antigena i indukcije odgovora T ćelija usmerenih ka tumoru. Poželjno, in vivo indukovanje ADCC dovešće do odgovora T ćelija usmerenih ka tumoru i odgovora antitelima poreklom iz domaćina.

[0153] CDC je još jedan postupak ubijanja ćelija, koji se može usmeravati antitelima. IgM je najefikasniji izotip za aktivaciju komplementa. IgG1 i IgG3 su takođe vrlo efikasni u usmeravanju CDC preko klasičnog puta aktivacije komplementa. Poželjno, u ovoj kaskadi, formiranje kompleksa antigen-antitelo rezultuje otključavanjem višestrukih C1q vezujućih mesta u neposrednoj blizini na CH2 domenima učesničkih molekula antitela, kao što su molekuli IgG (C1q je jedna od tri podkomponente komplementa C1). Poželjno ova otključana mesta vezivanja C1q konvertuju prethodno niskoafinitetnu interakciju C1q-IgG u onu visokog aviditeta, što pokreće kaskadu događaja koji uključuju niz drugih proteina komplementa i dovodi do proteolitičkog oslobađanja hemotaktičkih/aktivirajućih agenasa efektorskih ćelija, C3a i C5a. Poželjno, kaskada komplementa završava se formiranjem kompleksa za napad na membranu, koji stvara pore u ćelijskoj membrani, koje olakšavaju slobodan prolaz vode i rastvora u i iz ćelije i mogu dovesti do apoptoze.

[0154] Pasivna imunoterapija imunskim ćelijama (opciono genetički modifikovanim) sposobnim za prepoznavanje tumorskih antigena efikasna je u posredovanju regresije kancera kod odabranih pacijenata. Ove tehnike mogu se bazirati na ex vivo reaktivaciji i ekspanziji kloniranih ili poliklonskih kultura tumor-reaktivnih T ćelija. Posle kultivisanja, T ćelije se mogu reinfundovati u pacijenta zajedno sa IL-2. Razvijene su in vitro tehnike u kojima su humani limfociti senzibilisani in vitro na tumorske antigenske peptide prezentovane na ćelijama koje prezentuju antigen. Ponavljajućom in vitro stimulacijom mogu se dobiti ćelije sa velikom sposobnošću prepoznavanja humanih tumorskih antigena. Adoptivni transfer ovih ćelija može biti efikasniji u posredovanju regresije tumora in vivo od konvencionalno gajenih ćelija.

[0155] U jednom primeru izvođenja, autologni citotoksični limfociti ili limfociti koji infiltriraju tumor mogu se dobiti od pacijenta sa kancerom. Limfociti se mogu gajati u kulturi i CTL koji odgovaraju na tumorski antigen mogu se ekspandirati kultivisanjem u prisustvu tumorskog antigenskog peptida prezentovanog sa MHC klase I, sami ili u kombinaciji sa najmanje jednim imunomodulatornim sredstvom, poželjno dodatno sa citokinima. CTL koji odgovaraju na tumorski antigen se zatim infuzijom vraćaju pacijentu u količini koja je efikasna za smanjenje ili uklanjanje tumora kod pacijenta.

[0156] Pacijenti mogu prethodno biti stimulisani vakcinom protiv tumorskog peptida, pre sakupljanja limfocita, ako je postojeći odgovor bio neadekvatan. Očekuje se da će CTL preneti adoptivnim transferom najbolje preživeti uz infuziju IL-2 u dozama od niskih do srednjih.

[0157] Pod "CTL koji odgovara na tumorski antigen" misli se na CD8+ T ćeliju koja odgovara na tumorski antigenski peptid izveden iz pomenutog tumorskog antigena, koji se prezentuje sa klasom I MHC, npr. na površini tumorskih ćelija.

[0158] U skladu sa učenjem, odgovor CTL može uključivati kontinuirani protok kalcijuma, deobu ćelija, proizvodnju citokina kao što su IFN-gama i TNF-alfa, pozitivnu regulaciju

4

markera aktivacije kao što su CD44 i CD69 i specifično citolitičko ubijanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju tumorski antigen. Odgovor CTL može se odrediti i korišćenjem veštačkog reportera koji tačno ukazuje na odgovor CTL.

[0159] Pod "tumorski antigenski peptid" ili "tumorski antigenski peptid izveden iz tumorskog antigena" misli se na oligopeptid ili polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja suštinski odgovara aminokiselinskoj sekvenci fragmenta ili peptida tumorskog antigena identifikovanog prema predmetnom učenju. Poželjno, tumorski antigenski peptid je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv tumora koji se karakteriše prezentovanjem tumorskog antigena identifikovanog u ovom tekstu sa klasom I MHC i poželjno CTL koji odgovaraju na tumorski antigen i/ili da pobudi antitela koja se specifično vezuju za tumorski antigen identifikovan u skladu sa predmetnim učenjem, kada se koristi sam ili vezan za imunogeni nosač. Tumorski antigenski peptid u skladu sa učenjem je poželjno peptid koji sadrži sekvencu koja suštinski odgovara sekvenci fragmenta aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 2 iz liste sekvenci ili je derivat navedenog peptida. U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. Tumorski antigenski peptid može biti bilo koje dužine.

[0160] Ako tumorski antigenski peptid treba da se prezentuje direktno, tj. bez obrade, posebno bez sečenja, on ima dužinu koja je pogodna za vezivanje sa MHC molekulom, posebno MHC molekulom klase I, a poželjno dužina iznosi 7-20 amino-kiselina, poželjnije dužina iznosi 7-12 amino-kiselina, poželjnije dužina iznosi 8-11 amino-kiselina, posebno dužina iznosi 9 ili 10 amino-kiselina. Poželjno je da se sekvenca tumorskog antigenskog peptida koji treba da se direktno prezentuje izvodi iz aminokiselinske sekvence tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, tj. njegova sekvenca suštinski odgovara i poželjno je potpuno identična sa fragmentom tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem. Ako tumorski antigenski peptid treba da se prezentuje posle obrade, posebno posle sečenja, peptid proizveden obradom ima dužinu koja je pogodna za vezivanje sa MHC molekulom, posebno MHC molekulom klase I, a poželjno dužina iznosi 7-20 amino-kiselina, poželjnije dužina iznosi 7-12 amino-kiselina, poželjnije dužina iznosi 8-11 amino-kiselina, posebno dužina iznosi 9 ili 10 amino-kiselina. Poželjno je da sekvenca peptida koji će se prezentovati posle obrade bude izvedena iz aminokisleinske sekvence tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, tj. da njegova sekvenca suštinski odgovara i poželjno bude potpuno identična sa fragmentom tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem. Prema tome, tumorski antigenski peptid u skladu sa učenjem u jednom primeru izvođenja sadrži sekvencu dužine 7-20 aminokiselina, poželjnije dužine 7-12 amino-kiselina, poželjnije dužine 8-11 amino-kiselina, posebno dužine 9 ili 10 amino-kiselina, koja suštinski odgovara i poželjno je potpuno identična fragmentu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem i posle obrade tumorskog antigenskog peptida čini prezentovani peptid. Međutim, tumorski antigenski peptid može takođe sadržati sekvencu koja suštinski odgovara i poželjno je potpuno identična sa fragmentom tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem koji je čak i duži od gore navedene sekvence. U jednom primeru izvođenja, tumorski antigenski peptid može sadržati celu sekvencu tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem.

[0161] Poželjno, tumorski antigenski peptid može da se prezentuje, direktno ili posle obrade, sa molekulima klase I MHC, i kada se tako prezentuje, sposoban je da stimuliše CTL koji odgovaraju na tumorski antigen. Peptidi koji imaju aminokiselinske sekvence koje suštinski odgovaraju sekvenci peptida koji se prezentuje sa MHC klase I mogu se razlikovati po jednoj ili više rezidua koje nisu esencijalne za prepoznavanje peptida prezentovanog sa MHC klase I preko TCR, ili za vezivanje peptida za MHC. Takvi suštinski odgovarajući peptidi sposobni su i da stimulišu CTL koji odgovaraju na tumorski antigen. Peptidi koji imaju aminokiselinske sekvence koje se razlikuju od prezentovanog peptida na reziduama koje ne utiču na prepoznavanje preko TCR, ali poboljšavaju stabilnost vezivanja sa MHC, mogu poboljšati imunogenost tumorskog antigenskog peptida, i u ovom tekstu se mogu označiti kao "optimizovani peptidi". Koristeći postojeće znanje o tome koja će od ovih rezidua verovatnije uticati na vezivanje sa MHC ili sa TCR, može se primeniti racionalan pristup dizajniranju suštinski odgovarajućih peptida. Rezultujući peptidi koji su funkcionalni razmatraju se kao tumorski antigenski peptidi.

[0162] Pod "imunoreaktivna ćelija" misli se na ćeliju koja može sazreti u imunsku ćeliju (na primer B ćelija, T pomažuća ćelija, ili CTL) posle odgovarajuće stimulacije. Prema tome imunoreaktivne ćelije uključuju CD34+ hematopoetske matične ćelije, nezrele T ćelije i nezrele B ćelije. Kada je poželjno proizvesti CTL koji prepoznaju tumorski antigen, imunska ćelija kontaktira sa ćelijom koja prezentuje tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid izveden iz navedenog tumorskog antigena pod uslovima koji favorizuju proizvodnju, diferencijaciju i/ili selekciju CTL.

[0163] Pod "ćelija koja se karakteriše prezentovanjem tumorskog antigena sa klasom I MHC" ili "ćelija koja prezentuje tumorski antigen sa klasom I MHC" ili sličnim izrazima misli se na ćeliju kao što je tumorska ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija koja prezentuje tumorski antigen koji eksprimira, ili fragment izveden iz navedenog tumorskog antigena, npr. obrađivanjem tumorskog antigena, u kontekstu molekula MHC klase I. Slično tome, izraz "tumor koji se karakteriše prezentacijom tumorskog antigena sa klasom I MHC" označava tumor koji sadrži ćelije koje se karakterišu prezentovanjem tumorskog antigena sa klasom I MHC.

[0164] Pod "fragment tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem, koji se prezentuje" ili sličnim izrazima misli se da fragment može da se prezentuje sa MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I, npr. kada se doda direktno antigen-prezentujućim ćelijama. U jednom primeru izvođenja, fragment je fragment koji prirodno prezentuju ćelije koje eksprimiraju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem, npr. tumorske ćelije.

[0165] Pod "ćelija koja prepoznaje tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid izveden iz navedenog tumorskog antigena" ili "imunoreaktivna ćelija koja prepoznaje tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid izveden iz navedenog tumorskog antigena" ili sličnim izrazima misli se na ćeliju koja je sposobna da prepozna navedeni tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid izveden iz navedenog tumorskog antigena, sa nekim stepenom specifičnosti, posebno ako se prezentuje u kontekstu MHC molekula, na primer na površini antigen-prezentujućih ćelija ili tumorskih ćelija. Poželjno, navedeno prepoznavanje omogućava odgovor ćelije koja prepoznaje tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid izveden iz navedenog tumorskog antigena. Ako je ćelija T pomažuća ćelija (CD4+ T ćelija) koja nosi receptore koji prepoznaju tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid izveden iz navedenog tumorskog antigena u kontekstu MHC molekula klase II, takav odgovor može uključivati oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8+ limfocita (CTL) i/ili B ćelija. Ako je ćelija CTL, takav odgovor može uključivati eliminaciju ćelija prezentovanih u kontekstu MHC molekula klase I, tj. ćelija koje se karakterišu prezentovanjem tumorskog antigena sa klasom I MHC, na primer apoptozom ili lizom ćelije posredovanom perforinom. Takvi CTL koji prepoznaju tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid izveden iz navedenog tumorskog antigena i koji odgovaraju, označeni su u ovom tekstu i kao "CTL koji odgovaraju na tumorski antigen". Ako je ćelija B ćelija, takav imunski odgovor može uključivati oslobađanje imunoglobulina.

[0166] Pod "T-ćelijski receptor koji prepoznaje tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid izveden iz navedenog tumorskog antigena" misli se na T-ćelijski receptor koji je sposoban da prepozna navedeni tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid izveden iz navedenog tumorskog antigena, sa nekim stepenom specifičnosti, posebno ako se prezentuje u kontekstu MHC molekula. Poželjno, navedeno prepoznavanje omogućava ćeliji koja nosi T-ćelijski receptor koji prepoznaje tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid izveden iz navedenog tumorskog antigena, da odgovori kako je gore navedeno.

[0167] "Ćelijski odgovor protiv tumorskog antigena" uključuje ćelijski odgovor usmeren prema ćelijama koje se karakterišu prezentovanjem tumorskog antigena sa klasom I ili klasom II MHC. Ćelijski odgovor odnosi se na ćelije koje se nazivaju T ćelije ili T limfociti, koje deluju ili kao 'pomagači' ili kao 'ubice'. T ćelije pomagači (takođe nazvane CD4+ T ćelije) igraju centralnu ulogu u regulisanju imunskog odgovora, a ćelije ubice (nazvane i citotoksične T ćelije, citolitičke T ćelije, CD8+ T ćelije ili CTL) ubijaju tumorske ćelije, sprečavajući proizvodnju još većeg broja tumorskih ćelija. Iako se smatra da su obe grane imunskog odgovora neophodne, CTL odgovor može biti važniji za kontrolu kancera.

[0168] U skladu sa učenjem, "referenca", na primer referentan uzorak ili referentan organizam može se koristiti za korelisanje i upoređivanje rezultata dobijenih u postupcima učenja iz testnog uzorka ili testnog organizma, tj. pacijenta. Obično je referentni organizam zdrav organizam, posebno organizam koji ne boluje od tumorskog oboljenja.

[0169] "Referentna vrednost" ili "referentni nivo" može se odrediti na osnovu reference empirijski, merenjem dovoljno velikog broja referenci. Poželjno je da se referentna vrednost određuje merenjem najmanje 2, poželjno najmanje 3, poželjno najmanje 5, poželjno najmanje 8, poželjno najmanje 12, poželjno najmanje 20, poželjno najmanje 30, poželjno najmanje 50, ili poželjno najmanje 100 referenci.

[0170] U skladu sa učenjem, pojam "vezivanje" poželjno se odnosi na specifično vezivanje. "Specifično vezivanje" znači da se sredstvo kao što je antitelo jače vezuje za cilj kao što je epitop za koji je specifično u poređenju sa vezivanjem za drugi cilj. Sredstvo se jače vezuje za prvi cilj u poređenju sa drugim ciljem ako se za prvi cilj vezuje sa konstantom disocijacije (KD) koja je niža od konstante disocijacije za drugi cilj. Poželjno je da je konstanta disocijacije (KD) za cilj za koji se sredstvo specifično vezuje više od 10<2>puta, 10<3>puta, 10<4>puta, 10<5>puta, 10<6>puta, 10<7>puta, 10<8>puta, 10<9>puta ili 10<10>puta niža od konstante disocijacije (KD) za cilj za koji se seredstvo ne vezuje specifično.

[0171] U skladu sa učenjem, nukleinska kiselina je poželjno dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK). Nukleinske kiseline prema učenju obuhvataju genomsku DNK, cDNK, mRNK, rekombinantno proizvedene i hemijski sintetisane molekule. Prema učenju, nukleinska kiselina može biti prisutna u vidu jednolančanog ili dvolančanog i linearnog ili kovalentno kružno zatvorenog molekula.

[0172] Izrazi "tumorska nukleinska kiselina identifikovana prema učenju" i "nukleinska kiselina koja kodira tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem" imaju slično značenje.

[0173] Kako se ovde koristi, izraz "RNK" označava molekul koji sadrži najmanje jednu ribonukleotidnu reziduu. Pod "ribonukleotid" misli se na nukleotid sa hidroksilnom grupom na 2'-poziciji beta-D-ribo-furanozne komponente. Pojam uključuje dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK kao što je delimično prečišćena RNK, suštinski čistu RNK, sintetsku RNK, rekombinantno proizvedenu RNK, kao i izmenjenu RNK koja se od prirodne RNK razlikuje po adiciji, deleciji, supstituciji i/ ili alteraciji jednog ili više nukleotida. Takve promene mogu uključivati dodavanje nenukleotidnog materijala, na primer na kraj(eve) RNK ili u unutrašnjosti, na primer na jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u molekulima RNK takođe mogu sadržati nestandardne nukleotide, kao što su nukleotidi koji se ne pojavljuju u prirodi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili dezoksinukleotidi. Ove promenjene RNK mogu se nazvati analozima ili analozima prirodne RNK.

[0174] Ako se u ovom tekstu pominje detekcija ili određivanje količine nukleinske kiseline, nukleinska kiselina koja zapravo treba da se detektuje ili čija količina zapravo treba da se odredi je poželjno mRNK. Međutim, treba razumeti da to takođe može uključivati primere izvođenja u kojima se mRNK detektuje ili se količina mRNK određuje indirektno. Na primer, mRNK može da se transformiše u cDNK i da se detektuje cDNK ili da se određuje njena količina. Ovde je mRNK data kao ekvivalent cDNK. Stručnjak će razumeti da je sekvenca cDNK ekvivalentna sekvenci mRNK, i da se ovde može koristiti za istu svrhu, npr., za stvaranje proba koje se hibridizuju sa nukleinskom kiselinom koju treba detektovati. Prema tome, ako se u ovom tekstu poziva na sekvence prikazane u listi sekvenci, to uključuje i RNK ekvivalente navedenih sekvenci.

[0175] Nukleinske kiseline opisane u skladu sa učenjem poželjno su izolovane. Izraz "izolovana nukleinska kiselina" znači prema učenju da je nukleinska kiselina (i) amplifikovana in vitro, na primer pomoću lančane reakcije polimeraze (polymerase chain reaction, PCR), (ii) rekombinantno proizvedena kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer sečenjem i frakcionisanjem elektroforezom na gelu, ili (iv) sintetisana, na primer hemijskom sintezom. Izolovana nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja je dostupna za manipulaciju tehnikama rekombinantne DNK.

[0176] Izraz "varijanta" u odnosu, na primer, na sekvence nukleinskih kiselina i amino-kiselina, prema učenju uključuje sve varijante, posebno mutante, splajsovane varijante, konformacije, izoforme, alelne varijante, vrsne varijante i vrsne homologe, posebno one koje su prirodno prisutne. Alelna varijanta odnosi se na promenu u normalnoj sekvenci gena, čiji je značaj često nejasan. Potpuno sekvenciranje gena često identifikuje brojne alelne varijante određenog gena. Vrsni homolog je sekvenca nukleinske kiseline ili amino-kiselina poreklom od različite vrste u odnosu na datu sekvencu nukleinske kiseline ili amino-kiselina.

[0178] Pored toga, "varijanta" specifične sekvence nukleinske kiseline u skladu sa učenjem uključuje sekvence nukleinske kiseline koje sadrže jednu ili više, na primer najmanje 2, najmanje 4 ili najmanje 6, a poželjno do 3, do 4, do 5, do 6, do 10, do 15 ili do 20 nukleotidnih supstitucija, delecija i/ili adicija.

[0179] Poželjno, stepen identičnosti između date sekvence nukleinske kiseline i sekvence nukleinske kiseline koja je varijanta navedene date sekvence nukleinske kiseline iznosiće najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90% ili najpoželjnije najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Stepen identičnosti je poželjno dat za područje od najmanje oko 30, najmanje oko 50, najmanje oko 70, najmanje oko 90, najmanje oko 100, najmanje oko 150, najmanje oko 200, najmanje oko 250, najmanje oko 300, ili najmanje oko 400 nukleotida. U poželjnim primerima izvođenja, stepen identičnosti dat je za celu dužinu referentne sekvence nukleinske kiseline.

[0180] "Sličnost sekvence" označava procenat amino-kiselina koje su ili identične ili predstavljaju konzervativne aminokiselinske supstitucije. "Identičnost sekvenci" dva polipeptida ili sekvenci nukleinske kiseline označava procenat amino-kiselina ili nukleotida identičnih za sekvence.

[0181] Izraz "procenat identičnosti" namenjen je označavanju procenta nukleotida ili aminokiselinskih rezidua koji su identični za dve sekvence koje se upoređuju, dobijenom posle najboljeg poravnavanja, pri čemu je taj procenat čisto statistički, i razlike između dve sekvence distribuirane su nasumično i celom njihovom dužinom. Upoređivanja dveju nukleotidnih ili aminokiselinskih sekvenci konvencionalno se izvode upoređivanjem ovih sekvenci posle optimalnog poravnavanja, navedeno upoređivanje izvodi se po segmentu ili po "prozoru poređenja" kako bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sekvencione sličnosti. Optimalno poravnavanje sekvenci za upoređivanje može se proizvesti, pored ručnog postupka, pomoću algoritma lokalne homologije Smith-a i Waterman-a, 1981, Ads App. Math. 2, 482, pomoću algoritma lokalne homologije Neddleman-a i Wunsch-a 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, pomoću postupka traženja sličnosti Pearson-a i Lipman.a, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili pomoću kompjuterskih programa koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics softverskom paketu, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[0182] Procenat identičnosti izračunava se određivanjem broja identičnih pozicija u obe sekvence koje se upoređuju, deljenjem tog broja sa brojem upoređenih pozicija i množenjem dobijenog rezultata sa 100 kako bi se dobio procenat identičnosti između ove dve sekvence.

[0183] Nukleinska kiselina je "sposobna za hibridizaciju" ili "hibridizuje se" sa drugom nukleinskom kiselinom ako su dve sekvence komplementarne jedna sa drugom. Nukleinska kiselina je "komplementarna" sa drugom nukleinskom kiselinom ako su dve sekvence sposobne

4

da jedna sa drugom formiraju stabilan dvostruki lanac. U skladu sa učenjem, hibridizacija se poželjno obavlja pod uslovima koji dopuštaju specifičnu hibridizaciju između polinukleotida (stringentni uslovi). Stringentni uslovi opisani su, na primer, u Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., editori, 2. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ili Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., editori, John Wiley & Sons, Inc., New York, i odnose se, na primer, na hibridizaciju na 65°C u puferu za hibridizaciju (3.5 × SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% polivinilpirolidon, 0.02% goveđi serum albumin, 2.5 mM NaH2PO4(pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA). SSC je 0.15 M natrijum hlorid / 0.15 M natrijum citrat, pH 7. Posle hibridizacije, membrana na koju je DNK prebačena se ispere, na primer, u 2 × SSC na sobnoj temperaturi i zatim u 0.1-0.5 × SSC/0.1 × SDS na temperaturama do 68°C.

[0184] Procenat komplementarnosti ukazuje na procenat kontinuiranih rezidua u molekulu nukleinske kiseline koje mogu formirati vodonične veze (npr., Watson-Crick-ovo sparivanje baza) sa sekvencom druge nukleinske kiseline (npr., 5, 6, 7, 8, 9, 10 od 10 je komplementarnost od 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, i 100%). "Perfektna komplementarnost" ili "potpuna komplementarnost" znači da će sve kontinuirane rezidue sekvence nukleinske kiseline formirati vodonične veze sa istim brojem kontinuiranih rezidua u drugoj sekvenci nukleinske kiseline. Poželjno, stepen komplementarnosti u skladu sa učenjem iznosi najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90% ili najpoželjnije najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Najpoželjnije, stepen komplementarnosti u skladu sa učenjem iznosi 100%.

[0185] Pojam "derivat" uključuje bilo koji hemijsku derivatizaciju nukleinske kiseline na nukleotidnoj bazi, na šećeru ili na fosfatu. Pojam "derivat" uključuje i nukleinske kiseline koje sadrže nukleotide i nukleotidne analoge koji se ne pojavljuju prirodno. Poželjno, derivatizacija nukleinske kiseline povećava njenu stabilnost.

[0186] Nukleinske kiseline koje kodiraju tumorske antigene ili tumorske antigenske peptide mogu, prema učenju, biti prisutne same ili u kombinaciji sa drugim nukleinskim kiselinama, posebno heterolognim nukleinskim kiselinama. Poželjno, nukleinska kiselina koja kodira tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid eksprimira navedeni tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid. U poželjnim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je funkcionalno povezana sa sekvencama za kontrolu ekspresije ili regulatornim sekvencama koje mogu biti homologne ili heterologne u odnosu na navedenu nukleinsku kiselinu. Kodirajuća sekvenca i regulatorna sekvenca su "funkcionalno" povezane jedna sa drugom ako su kovalentno povezane jedna sa drugom na takav način da je ekspresija ili transkripcija navedene kodirajuće sekvence pod kontrolom ili pod uticajem navedene regulatorne sekvence. Ako kodirajuća sekvenca treba da se translatuje u funkcionalni protein, onda, sa regulatornom sekvencom funkcionalno povezanom sa navedenom kodirajućom sekvencom, indukcija navedene regulatorne sekvence rezultuje transkripcijom navedene kodirajuće sekvence, bez dovođenja do pomaka okvira u kodirajućoj sekvenci ili navedena kodirajuća sekvenca nije sposobna da se translatuje u željeni protein ili peptid.

[0187] Izraz "kontrolna sekvenca ekspresije" ili "regulatorna sekvenca" uključuje, u skladu sa učenjem, promotore, enhensere i druge kontrolne elemente koji regulišu ekspresiju gena. U posebnim primerima izvođenja učenja, kontrolne sekvence ekspresije mogu biti regulisane. Tačna struktura regulatornih sekvenci može varirati u funkciji vrste ili tipa ćelije, ali uopšteno uključuje 5’netranskribujuće i 5’netranslatujuće sekvence koje su uključene u inicijaciju transkripcije, odnosno translacije, na primer TATA boks, "kapa" sekvenca, CAAT sekvenca, i slično. Tačnije, 5’netranskribujuće regulatorne sekvence sadrže promotorski region koji uključuje promotorsku sekvencu za transkripcionu kontrolu funkcionalno povezanog gena. Regulatorne sekvence mogu sadržati i enhenserske sekvence ili uzvodne aktivatorske sekvence.

[0188] U skladu sa učenjem, nukleinska kiselina može biti prisutna i u kombinaciji sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira peptid koji kontroliše sekreciju proteina ili peptida kodiranog navedenom nukleinskom kiselinom iz ćelije-domaćina. U skladu sa učenjem, nukleinska kiselina može biti prisutna i u kombinaciji sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira peptid koji dovodi do ukotvljavanja kodiranog proteina ili peptida u ćelijsku membranu ćelije-domaćina ili kompratmentalizovanja u određeneim organelama navedene ćelije. Slično tome, moguća je kombinacija sa nukleinskom kiselinom koja predstavlja reporterski gen ili bilo koju "oznaku".

[0189] U poželjnom primeru izvođenja, rekombinantni molekul nukleinske kiseline je, prema učenju, vektor, prema potrebi sa promotorom, koji kontroliše ekspresiju nukleinske kiseline, na primer nukleinske kiseline koja kodira tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem. Izraz "vektor" ovde se koristi u svom najopštijem značenju i uključuje bilo koji intermedijarni prenosnik nukleinske kiseline, koji omogućava navedenoj nukleinskoj kiselini, na primer, da bude uvedena u prokariotske i/ili eukariotske ćelije i, gde je pogodno, da se integriše u genom. Vektori ove vrste poželjno se repliciraju i/ili eksprimiraju u ćelijama. Intermedijarni prenosnik može se prilagoditi, na primer, za upotrebu u elektroporaciji, u bombardovanju mikroprojektilima, u primeni lipozomima, u prenosu pomoću agrobakterija ili u inserciji putem DNK ili RNK virusa. Vektori uključuju plazmide, fagemide, bakteriofage ili virusne genome.

[0190] Nukleinske kiseline koje kodiraju tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem mogu se koristiti za transfekciju ćelija-domaćina. Nukleinske kiseline ovde označavaju i rekombinantnu DNK i RNK. Rekombinantna RNK može se pripremiti in vitro transkripcijom uzorka DNK. Pored toga, može se pre primene modifikovati stabilizacijom sekvenci, stavljanjem "kape" i poliadenilacijom.

[0191] U skladu sa učenjem, izraz "ćelija-domaćin" odnosi se na bilo koju ćeliju koja se može transformisati ili transfektovati egzogenom nukleinskom kiselinom. Izraz "ćelije-domaćini" uključuje, prema učenju, prokariotske (npr. E. coli) ili eukariotske ćelije (npr. dendritske ćelije, B ćelije, CHO ćelije, COS ćelije, K562 ćelije, ćelije kvasca i ćelije insekata). Posebna prednost se daje ćelijama sisara kao što su ćelije ljudi, miševa, hrčaka, svinja, koza, primata. Ćelije mogu biti poreklom iz velikog broja tipova tkiva i uključivati primarne ćelije i ćelijske linije. Specifični primeri uključuju keratinocite, leukocite periferne krvi, matične ćelije kostne srži i embrionalne matične ćelije. U dodatnim primerima izvođenja, ćelija-domaćin je antigenprezentujuća ćelija, posebno dendritska ćelija, monocit ili makrofag. Nukleinska kiselina može biti prisutna u ćeliji-domaćinu u vidu jedne kopije ili u dve ili više kopija i, u jednom primeru izvođenja, eksprimira se u ćeliji-domaćinu.

[0192] Prema učenju, izraz "ekspresija" se koristi u svom najopštijem značenju i uključuje proizvodnju RNK ili RNK i proteina. Uključuje i delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Pored toga, ekspresija se može izvoditi prolazno ili stabilno. Poželjni ekspresioni sistemi u ćelijama sisara uključuju pcDNK3.1, pcDNK3.3 i pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), koji sadrže selektabilni marker kao što je gen koji daje otpornost na G418 (i tako omogućava selektovanje stabilno transfektovanih ćelijskih linija) i enhenserske-promotorske sekvence citomegalovirusa (cytomegalovirus, CMV).

[0193] U onim slučajevima učenja u kojima MHC molekul prezentuje tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid, ekspresioni vektor može sadržati i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira navedeni MHC molekul. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira molekul MHC može biti prisutna na istom ekspresionom vektoru kao i nukleinska kiselina koja kodira tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid, ili nukleinske kiseline mogu biti prisutne na različitim ekspresionim vektorima. U ovom drugom slučaju, dva ekspresiona vektora mogu se kotransfektovati u ćeliju. Ako ćelija-domaćin ne eksprimira ni tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid ni MHC molekul, obe nukleinske kiseline koje ih kodiraju mogu se transfektovati u ćeliju, na istom ekspresionom vektoru ili na različitim ekspresionim vektorima. Ako ćelija već eksprimira molekul MHC, u ćeliju se može transfektovati samo sekvenca nukleinske kiseline koja kodira tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid.

4

[0194] "Antisense molekuli" ili "antisense nukleinske kiseline" mogu se koristiti za regulaciju, posebno sniženje, ekspresije nukleinske kiseline. Izraz "antisense molekul" ili "antisense nukleinska kiselina" odnosi se, prema učenju, na oligonukleotid koji je oligoribonukleotid, oligodezoksiribonukleotid, modifikovani oligoribonukleotid ili modifikovani oligodezoksiribonukleotid i koji se hibridizuje pod fiziološkim uslovima sa DNK koja sadrži određeni gen ili sa mRNK navedenog gena, čime se inhibira transkripcija navedenog gena i/ili translacija navedene mRNK. Prema učenju, "antisense molekul" uključuje i konstrukt koji sadrži nukleinsku kiselinu ili njen deo u obrnutoj orijentaciji u odnosu na njen prirodni promotor. Antisense transkript nukleinske kiseline ili njenog dela može formirati dvostruki lanac sa prirodnom mRNK i tako sprečiti akumulaciju ili translaciju mRNK. Druga mogućnost je upotreba ribozima za inaktiviranje nukleinske kiseline.

[0195] U poželjnim primerima izvođenja, antisense oligonukleotid se hibridizuje sa N-terminalnim ili 5' uzvodnim mestom kao što je mesto inicijacije translacije, mesto inicijacije transkripcije ili mesto promotora. U dodatnim primerima izvođenja, antisense oligonukleotid se hibridizuje sa 3’netranslatujućim regionom ili mestom splajsovanja mRNK.

[0196] U jednom primeru izvođenja, oligonukleotid učenja sastoji se od ribonukleotida, dezoksiribonukleotida ili njihove kombinacije, pri čemu su 5' kraj jednog nukleotida i 3' kraj drugog nukleotida međusobno povezani fosfodiesterskom vezom. Ovi oligonukleotidi mogu se sintetisati na konvencionalan način ili proizvesti rekombinantno.

[0197] U poželjnim primerima izvođenja, oligonukleotid učenja je "modifikovan" oligonukleotid. Ovde se oligonukleotid može modifikovati na vrlo različite načine, bez narušavanja njegove sposobnosti da se veže sa svojim ciljem, kako bi se povećala, na primer, njegova stabilnost ili terapijska efikasnost. Prema učenju, pojam "modifikovani oligonukleotid" označava oligonukleotid u kojem (i) najmanje dva njegova nukleotida međusobno su povezana sintetskom internukleozidnom vezom (tj. internukleozidnom vezom koja nije fosfodiesterska veza) i/ili (ii) hemijska grupa koja se obično ne nalazi u nukleinskim kiselinama kovalentno je povezana sa oligonukleotidom. Poželjne sintetske internukleozidne veze su fosforotioati, alkil fosfonati, fosforoditioati, fosfatni estri, alkil fosfonotioati, fosforamidati, karbamati, karbonati, fosfatni triestri, acetamidati, karboksimetil estri i peptidi.

[0198] Izraz "modifikovani oligonukleotid" uključuje i oligonukleotide koji imaju kovalentno modifikovanu bazu i/ili šećer. "Modifikovani oligonukleotidi" uključuju, na primer, oligonukleotide sa šećernim reziduama koje su kovalentno vezane za organske grupe niske molekulske težine, različite od hidroksilne grupe na poziciji 3’ i fosfatne grupe na poziciji 5’.

Modifikovani oligonukleotidi mogu sadržati, na primer, 2'-O-alkilisanu riboznu reziduu ili drugi šećer umesto riboze, na primer arabinozu.

[0199] Podrazumeva se da se svi gore opisani primeri izvođenja u vezi sa oligonukleotidima mogu primeniti i na polinukleotide.

[0200] Pod "mala interferirajuća RNK" ili "siRNK" (small interfering RNA), kako se ovde koristi, misli se na izolovani RNK molekul, poželjno duži od 10 nukleotida, poželjnije duži od 15 nukleotida, i najpoželjnije dug 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 nukleotida, koji se koristi za identifikaciju ciljnog gena ili mRNK koje treba razgraditi. Najpoželjnija dužina siRNK je u rasponu od 19 do 25 nukleotida.

[0201] siRNK u skladu sa učenjem može sadržati delimično prečišćenu RNK, suštinski čistu RNK, sintetsku RNK, ili rekombinantno proizvedenu RNK, kao i izmenjenu RNK koja se razlikuje od prirodne RNK po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili alteraciji jednog ili više nukleotida. Takve alteracije mogu uključivati dodavanje nenukleotidnog materijala, na primer na kraj(-eve) siRNK ili na jedan ili više unutrašnjih nukleotida siRNK; modifikacije koje čine siRNK rezistentnom na digestiju nukleazom (npr., upotreba 2’-supstituisanih ribonukleotida ili modifikacije na osovini šećer-fosfat); ili supstituciju jednog ili više nukleotida u siRNK dezoksiribonukleotidima. Pored toga, siRNK može da se modifikuje da bi se povećala njena stabilnost kako je opisano gore za modifikovane oligonukleotide, posebno uvođenjem jedne ili više fosforotioatnih veza.

[0202] Jedan ili oba lanca siRNK mogu sadržati i 3'-prepust. Kako se ovde koristi, "3'-prepust" se odnosi na najmanje jedan nespareni nukleotid koji se proteže od 3'-kraja RNK lanca. Prema tome, u jednom primeru izvođenja, siRNK sadrži najmanje jedan 3'-prepust dužine od 1 do oko 6 nukleotida (što uključuje ribonukleotide ili dezoksinukleotide), poželjno dužine od 1 do oko 5 nukleotida, poželjnije dužine od 1 do oko 4 nukleotida, i posebno poželjno dužine od oko 2 do oko 4 nukleotida. U primeru izvođenja u kojem oba lanca molekula siRNK sadrže 3'-prepust, dužina prepusta može biti ista ili različita za svaki lanac. U najpoželjnijem primeru izvođenja, 3'-prepust je prisutan na oba lanca siRNK, a dužina je 2 nukleotida. Na primer, svaki lanac siRNK iz učenja može sadržati 3’-prepust dideoksitimidilne kiseline ("TT") ili diuridilne kiseline ("uu").

[0203] Da bi se povećala stabilnost siRNK, 3'-prepusti se takođe mogu stabilisati protiv degradacije. U jednom primeru izvođenja, prepusti se stabilišu uključivanjem purinskih nukleotida, kao što su adenozinski ili guanozinski nukleotidi. Alternativno, supstitucija pirimidinskih nukleotida modifikovanim analozima, npr. supstitucija uridinskih nukleotida u 3’-prepustima 2’-deoksitimidinom, toleriše se i ne utiče na efikasnost razgradnje RNKi.

4

Posebno, odsustvo 2’-hidroksila u 2’-deoksitimidinu značajno povećava otpornost 3’-prepusta prema nukleazi, u medijumu za kulturu tkiva.

[0204] Sense i antisense lanci siRNK mogu sadržati dva komplementarna, jednolančana molekula RNK ili mogu sadržati jedan molekul u kojem su dve komplementarne porcije sparene bazama i kovalentno su povezan jednolančanim područjem "ukosnice". To jest, sense region i antisense region mogu biti kovalentno povezani linkerskim molekulom. Linkerski molekul može biti polinukleotidni ili nenukleotidni linker. Bez želje za ograničavanjem nekom teorijom, veruje se da se područje ukosnice ovog drugog tipa molekula siRNK unutar ćelije seče "Dicer" proteinom (ili njegovim ekvivalentom) kako bi se formirala siRNK od dva pojedinačna molekula RNK sparenih bazama.

[0205] Kako se koristi u ovom tekstu, "ciljna mRNK" odnosi se na RNK molekul koji je cilj za negativnu regulaciju.

[0206] siRNA može se eksprimirati iz pol III ekspresionih vektora bez promene u ciljajućem mestu, jer se veruje da je ekspresija RNK iz pol III promotora efikasna jedino kada je prvi transkribovani nukleotid purin.

[0207] siRNK u skladu sa učenjem može biti usmerena prema bilo kojem nizu od približno 19-25 kontinuiranih nukleotida u bilo kojoj od ciljnih mRNK sekvenci ("ciljna sekvenca"). Tehnike selektovanja ciljnih sekvenci za siRNK date su, na primer, u Tuschl T. et al., "The siRNA User Guide", revidirano 11. oktobra 2002. "The siRNA User Guide" je raspoloživ na world wide web, na veb-stranici koju održava Dr. Thomas Tuschl, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, New York, USA, i može se naći pristupanjem veb-stranici Rockefeller University i pretraživanjem za ključnu reč "siRNK". Prema tome, sense lanac predmetne siRNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja je suštinski identična sa bilo kojim kontinuiranim nizom od oko 19 do oko 25 nukleotida u ciljnoj mRNK.

[0208] Uopšteno, ciljna sekvenca na ciljnoj mRNK može se odabrati iz date cDNK sekvence koja odgovara ciljnoj mRNK, poželjno počevši 50 do 100 nt nizvodno (tj. u 3’-smeru) od početnog kodona. Ciljna sekvenca, međutim, može biti locirana u 5’- ili 3’-netranslatujućim regionima ili u regionu u blizini početnog kodona.

[0209] siRNK može se dobiti korišćenjem brojnih tehnika poznatih stručnjacima u oblasti. Na primer, siRNK može se hemijski sintetisati ili rekombinantno proizvesti korišćenjem postupaka poznatih u struci, kao što je Drosophila in vitro sistem opisan u U.S. objavljenoj patentnoj prijavi 2002/0086356, Tuschl et al.

[0210] Poželjno, siRNK se hemijski sintetiše korišćenjem pogodno zaštićenih ribonukleozidnih fosforamidita i konvencionalnog DNK/RNK sintetizera. siRNA se može sintetisati u vidu dva

4

odvojena, komplementarna RNK molekula ili u vidu jednog RNK molekula sa dva komplementarna regiona.

[0211] Alternativno, siRNK se može eksprimirati i iz rekombinantnih kružnih ili linearnih DNK plazmida korišćenjem bilo kojeg pogodnog promotora. Takvi primeri izvođenja su uključeni prema predmetnom učenju, kada se ovde upućuje na primenu siRNK ili inkorporaciju siRNK u farmaceutske kompozicije. Pogodni promotori za ekspresiju siRNK učenja iz plazmida uključuju, na primer, U6 ili H1 RNK pol III promotorske sekvence i promotor citomegalovirusa.

[0212] Odabir drugih pogodnih promotora je u okviruma struke. Rekombinantni plazmidi iz učenja mogu sadržati i inducibilne ili regulisane promotore za ekspresiju siRNK u određenom tkivu ili u određenom unutarćelijskom okruženju.

[0213] siRNK eksprimirana iz rekombinantnih plazmida može se izolovati iz kultivisanih ćelijskih ekspresionih sistema standardnim tehnikama ili se može eksprimirati unutar ćelije. Korišćenje rekombinantnih plazmida za dostavu siRNK ćelijama in vivo detaljnije se razmatra u nastavku ovog teksta. siRNK se može eksprimirati iz rekombinantnog plazmida ili u vidu dva odvojena, komplementarna RNK molekula, ili u vidu jednog RNK molekula sa dva komplementarna regiona.

[0214] Odabir plazmida pogodnih za ekspresiju siRNK, postupci za insertovanje sekvenci nukleinske kiseline za ekspresiju siRNK u plazmid, i postupci dostave rekombinantnog plazmida u ćelije od interesa su u okviru struke.

[0215] siRNK može se eksprimirati iz rekombinantnih virusnih vektora unutar ćelije in vivo. Rekombinantni virusni vektori sadrže sekvence koje kodiraju siRNK i bilo koji pogodan promotor za ekspresiju sekvenci siRNK. Rekombinantni virusni vektori mogu takođe sadržati inducibilne ili regulisane promotore za ekspresiju siRNK u određenom tkivu ili u određenoj unutarćelijskoj sredini. siRNK se može eksprimirati iz rekombinantnog virusnog vektora ili u vidu dva odvojena, komplementarna RNK molekula, ili u vidu jednog RNK molekula sa dva komplementarna regiona.

[0216] Izraz "peptid" uključuje oligo- i polipeptide i odnosi se na supstance koje sadrže dva ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 ili više, poželjno 21 ili više i poželjno do 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, posebno 100 amino-kiselina kovalentno povezanih peptidnim vezama. Izraz "protein" odnosi se na velike peptide, poželjno na peptide sa više od 100 aminokiselinskih ostataka, ali uopšteno pojmovi "peptidi" i "proteini" su sinonimi i ovde se koriste naizmenično.

4

[0217] Poželjno, proteini i peptidi opisani prema učenju su izolovani. Izrazi "izolovani protein" ili "izolovani peptid" znače da je protein ili peptid odvojen od svog prirodnog okruženja. Izolovani protein ili peptid može biti u suštinski prečišćenom stanju. Izraz "u suštini prečišćen" znači da protein ili peptid u suštini ne sadrži druge supstance sa kojima je povezan prirodno ili in vivo.

[0218] Takvi proteini i peptidi mogu se koristiti, na primer, u proizvodnji antitela i u imunološkom ili dijagnostičkom testu ili kao terapeutici. Proteini i peptidi opisani u skladu sa učenjem mogu se izolovati iz bioloških uzoraka kao što su tkivni ili ćelijski homogenati i takođe mogu se eksprimirati rekombinantno u velikom broju pro- ili eukariotskih ekspresionih sistema.

[0219] U svrhu ovog učenja, "varijante" proteina ili peptida ili aminokiselinske sekvence uključuju aminokiselinske insercione varijante, aminokiselinske delecione varijante i/ili aminokiselinske supstitucione varijante.

[0220] Aminokiselinske insercione varijante uključuju amino i/ili karboksi-terminalne fuzije i takođe insercije jedne ili dve ili više amino-kiselina u određenu aminokiselinsku sekvencu. U slučaju varijanti aminokiselinskih sekvenci koje imaju inserciju, jedna ili više aminokiselinskih rezidua insertuje se na određeno mesto u aminokiselinskoj sekvenci, iako je moguća i nasumična insercija sa odgovarajućim skriningom rezultujućeg proizvoda.

[0221] Aminokiselinske delecione varijante karakterišu se uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence.

[0222] Aminokiselinske supstitucione varijante karakterišu se uklanjanjem najmanje jedne rezidue u sekvenci i insertovanjem druge rezidue na njeno mesto. Prednost se daje modifikacijama na pozicijama u aminokiselinskoj sekvenci koje nisu konzervirane između homolognih proteina ili peptida i/ili zameni amino-kiselina drugima koje imaju slična svojstva.

[0223] Poželjno, aminokiselinske promene u proteinskim varijantama su konzervativne aminokiselinske promene, tj. supstitucije slično naelektrisanih ili nenaelektrisanih aminokiselina. Konzervativna aminokiselinska promena uključuje supstituciju amino-kiselinom iz familije amino-kiselina srodnih po svojim bočnim lancima. Prirodne amino-kiseline obično se dele u četiri grupe: kisele (aspartat, glutamat), bazne (lizin, arginin, histidin), nepolarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan) i nenaelektrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistin, serin, treonin, tirozin) amino-kiseline. Fenilalanin, triptofan i tirozin ponekad se zajedno klasifikuju kao aromatične amino-kiseline.

[0224] Poželjno stupanj sličnosti, poželjno identičnosti između date aminokiselinske sekvence i aminokiselinske sekvence koja je varijanta navedene date aminokiselinske sekvence biće najmanje 70%, poželjno najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90%

4

ili najpoželjnije najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Stupanj sličnosti ili identičnosti dat je poželjno za region od najmanje oko 20, najmanje oko 40, najmanje oko 60, najmanje oko 80, najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 200 ili 250 amino-kiselina. U poželjnim primerima izvođenja, stupanj sličnosti ili identičnosti dat je za celu dužinu referentne aminokiselinske sekvence.

[0225] Peptidi i amino-kiselinske varijante opisane u ovom tekstu mogu se lako pripremiti poznatim tehnikama sinteze peptida kao što su, na primer, sinteza na čvrstoj fazi (Merrifield, 1964) i slični postupci, ili rekombinantnom manipulacijom DNK. Manipulacija DNK sekvenci za pripremanje proteina i peptida koji imaju supstitucije, insercije ili delecije, opisana je detaljno u Sambrook et al. (1989), na primer.

[0226] U skladu sa učenjem, "derivati" proteina i peptida su modifikovane forme proteina i peptida. Takve modifikacije uključuju svaku hemijsku modifikaciju i uključuju jednu ili više supstitucija, delecija i/ili adicija bilo kojeg od molekula udruženih sa proteinom ili peptidom, na primer ugljenog hidrata, lipida i/ili proteina ili peptida. Izraz "derivat" proteže se i na sve funkcionalne hemijske ekvivalente navedenih proteina i peptida. Poželjno, modifikovani peptid ima povišenu stabilnost i/ili povišenu imunogenost.

[0227] U skladu sa učenjem, varijanta nukleinskokiselinske ili aminokiselinske sekvence, suštinski odgovarajuće aminokiselinske sekvence ili fragmenta ili derivata peptida poželjno ima funkcionalno svojstvo nukleinskokiselinske ili aminokiselinske sekvence, aminokiselinske sekvence, ili peptida, respektivno, iz kojeg je izvedena. Takva funkcionalna svojstva uključuju interakciju sa antitelima, interakciju sa drugim peptidima ili proteinima, selektivno vezivanje sa nukleinskim kiselinams i enzimsku aktivnost. U jednom primeru izvođenja, varijanta nukleinskokiselinske ili aminokiselinske sekvence, suštinski odgovarajuće aminokiselinske sekvence ili fragmenta ili derivata peptida imunološki je ekvivalentna nukleinskokiselinskoj ili aminokiselinskoj sekvenci, aminokiselinskoj sekvenci ili peptidu, respektivno, iz kojeg je izvedena. U jednom primeru izvođenja, funkcionalno svojstvo je imunološko svojstvo. Posebno, svojstvo je sposobnost stvaranja kompleksa sa MHC molekulima i, gde je pogodno, generisanja imunskog odgovora, poželjno stimulisanjem citotoksičnih ili T pomažućih ćelija. Fragment tumorskog antigena poželjno sadrži sekvencu od najmanje 6, posebno najmanje 8, najmanje 10, najmanje 12, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30 ili najmanje 50, uzastopnih amino-kiselina tumorskog antigena. Fragment tumorskog antigena poželjno sadrži sekvencu od do 8, posebno do 10, do 12, do 15, do 20, do 30 ili do 55, uzastopnih amino-kiselina tumorskog antigena. Fragment tumorskog antigena je poželjno deo tumorskog antigena koji se može

4

prezentovati sa MHC molekulima i kada je tako prezentovan sposoban je da stimuliše ćelijski odgovor.

[0228] Poželjni fragmenti tumorskog antigena pogodni su za stimulaciju citotoksičnih T limfocita in vivo, ali i za proizvodnju ekspandiranih i stimulisanih T limfocita za terapijski adoptivni transfer ex vivo.

[0229] Antiserumi koji sadrže specifična antitela koja se specifično vezuju za ciljni protein mogu se pripremiti različitim standardnim procesima; vidi, na primer, "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual", Ed Harlow, David Lane, ISBN: 0879693142 i "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO", Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447. Na taj način moguće je generisati i afinitetna i specifična antitela koja prepoznaju kompleks membranskih proteina u njihovoj nativnoj formi (Azorsa et al., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., J. Immunol.143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116,2000). Ovo je posebno relevantno za pripremanje antitela koja se koriste terapijski, ali i u mnogim dijagnostičkim aplikacijama. U tom smislu, moguće je izvršiti imunizaciju celim proteinom, vanćelijskim delimičnim sekvencama kao i ćelijama koje eksprimiraju ciljni molekul u fiziološki savijenoj formi.

[0230] Monoklonska antitela se tradicionalno pripremaju korišćenjem tehnologije hibridoma. (za tehničke detalje vidi: "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach", Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual", Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO", Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).

[0231] Poznato je da je samo mali deo molekula antitela, paratop, uključen u vezivanje antitela za epitop (up. Clark, W.R. (1986.), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991.), Essential Immunology, 7. izdanje, Blackwell Scientific Publications, Oxford). pFc’ i Fc regioni su, na primer, efektori kaskade komplementa, ali nisu uključeni u vezivanje antigena. Antitelo iz kojeg je pFc’ region enzimski uklonjen ili koje je proizvedeno bez pFc’ regiona, koje se naziva F(ab’)2fragment, nosi oba antigenvezujuća mesta kompletnog antitela. Slično tome, antitelo iz kojeg je Fc region enzimski uklonjen ili koje je proizvedeno bez navedenog Fc regiona, koje se naziva Fab fragment, nosi jedno antigen-vezujuće mesto intaktnog molekula antitela. Pored toga, Fab fragmenti se sastoje od kovalentno vezanog lakog lanca antitela i dela teškog lanca navedenog antitela, označenog kao Fd. Fd fragmenti su glavne determinante specifičnosti antitela (jedan Fd fragment može biti povezan sa do deset različitih lakih lanaca, bez promene specifičnosti antitela) i Fd fragmenti, kada se izoluju, zadržavaju sposobnost vezivanja za epitop.

[0232] Unutar antigen-vezujućeg dela antitela nalaze se regioni koji određuju komplementarnost (complementary-determining regions, CDR) koji direktno komuniciraju sa epitopom antigena i regionima okvira (framework regions, FR) koji održavaju tercijarnu strukturu paratopa. I Fd fragment teškog lanca i laki lanac imunoglobulina IgG sadrže četiri regiona okvira (FR1 do FR4) koji su u svakom slučaju odvojeni sa tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3). CDR i, posebno, CDR3 regioni i, posebnije, CDR3 region teškog lanca, odgovorni su u velikoj meri za specifičnost antitela.

[0233] Poznato je da ne-CDR regioni sisarskog antitela mogu da se zamene sličnim regionima antitela iste ili različite specifičnosti, uz zadržavanje specifičnosti za epitop originalnog antitela. Ovo omogućava razvijanje "humanizovanih" antitela u kojima se nehumani CDR kovalentno povezuju sa humanim FR i/ili Fc/pFc’ regionima da bi se porizvelo funkcionalno antitelo.

[0234] Kao još jedan primer, u WO 92/04381 opisana je proizvodnja i upotreba humanizovanih mišjih RSV antitela u kojima je najmanje deo mišjih FR regiona zamenjen FR regionima humanog porekla. Antitela ove vrste, uključujući fragmente intaktnih antitela sa sposobnošću vezivanja za antigen, često se označavaju kao "himerna" antitela.

[0235] U skladu sa učenjem, izraz "antitelo" uključuje i F(ab’)2, Fab, Fv, i Fd fragmente antitela, himerna antitela, u kojima su Fc i/ili FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili lakolančani CDR3 regioni zamenjeni homolognim humanim ili nehumanim sekvencama, himerna F(ab’)2-fragmentna antitela u kojima su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili lakolančani CDR3 regioni zamenjeni homolognim humanim ili nehumanim sekvencama, himerna Fab-fragmentna antitela u kojima su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili lakolančani CDR3 regioni zamenjeni homolognim humanim ili nehumanim sekvencama i himerna Fd-fragmentna antitela u kojima su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 regioni zamenjeni homolognim humanim ili nehumanim sekvencama. Izraz "antitelo" uključuje i "jednolančana" antitela.

[0236] Proteini i peptidi koji nisu antitela, koji se specifično vezuju za tumorske antigene, mogu zameniti antitela kada se koriste u skladu sa učenjem. Vezujuće supstance ove vrste mogu se obezbediti, na primer, bibliotekama degenerisanih peptida koje se mogu pripremiti jednostavno u rastvoru u imobilisanoj formi ili kao biblioteke prikazivanja fagima. Moguće je isto tako pripremiti kombinatorne biblioteke peptida sa jednom ili više amino-kiselina. Mogu se pripremiti i biblioteke peptoida i nepeptidnih sintetskih rezidua.

1

[0237] Antitela se takođe mogu povezati sa terapijskim obeleživačem za prikazivanje ćelija i tkiva koji eksprimiraju tumorske antigene. Mogu se povezati i sa terapijskim efektorskim komponentama.

[0238] U jednom primeru izvođenja, antitela opisana u ovom tekstu specifično se vezuju za deo tumorskih antigena identifikovanih prema učenju, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci, ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. U jednom primeru izvođenja, antitela opisana u ovom tekstu specifično se vezuju za tumorski antigenski peptid opisan ovde, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci, ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. Takva antitela mogu se dobiti korišćenjem peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 iz liste sekvenci, ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta za imunizaciju.

[0239] Detektabilni obeleživači uključuju bilo koji obeleživač koji funkcioniše da: (i) obezbedi detektabilni signal; (ii) interaguje sa drugim obeleživačem da bi modifikovao detektabilni signal obezbeđen prvim ili drugim obeleživačem, npr. FRET (fluorescence resonance energy transfer, fluorescentni rezonantni energetski transfer); (iii) utiče na mobilnost, npr. elektroforetsku mobilnost, naelektrisanjem, hidrofobnošću, oblikom, ili drugim fizičkim parametrima, ili (iv) obezbeđuje komponentu za zadržavanje, npr., afinitet, antitelo/antigen, ili jonsko kompleksovanje. Kao obeleživači pogodne su strukture kao što su fluorescentni obeleživači, luminiscentni obeleživači, hromoforni obeleživači, radioizotopski obeleživači, izotopski obeleživači, poželjno stabilni izotopski obeleživači, izobarski obeleživači, enzimski obeleživači, čestični obeleživači, posebno metalni čestični obeleživači, magnetni čestični obeleživači, polimerni čestični obeleživači, mali organski molekuli kao što je biotin, ligandi receptora ili vezujući molekuli kao što su proteini ćelijske adhezije ili lektini, obeleživačke sekvence koje sadrže nukleinske kiseline i/ili aminokiselinske rezidue koje se mogu detektovati upotrebom vezujućih sredstava, itd. Obeleživači koji se mogu detektovati uključuju, bez ograničavanja, barijum sulfat, jocetaminsku kiselinu, jopansku kiselinu, kalcijum ipodat, natrijum diatrizoat, meglumin diatrizoat, metrizamid, natrijum tiropanoat i radiodijagnostička sredstva, uključujući pozitronske emitere kao što su fluor-18 i ugljenik-11, gama emitere kao što je jod-123, tehnicijum-99m, jod-131 i indijum-111, nuklide za nuklearnu magnetnu rezonancu, kao što su fluor i gadolinijum.

[0240] Prema učenju, pojam "terapijski efektorski molekul" označava bilo koji molekul koji može pokazati terapijski efekat. Prema učenju, terapijski efektorski molekul se poželjno

2

selektivno vodi do ćelije koja eksprimira jedan ili više tumorskih antigena, i uključuje antikancerska sredstva, jedinjenja obeležena radioaktivnim jodom, toksine, citostatičke ili citolitičke lekove, itd. Antikancerska sredstva uključuju, na primer, aminoglutetimid, azatioprin, bleomicin sulfat, busulfan, karmustin, hlorambucil, cisplatin, ciklofosfamid, ciklosporin, citarabidin, dakarbazin, daktinomicin, daunorubin, doksorubicin, taksol, etopozid, fluorouracil, interferon-α, lomustin, merkaptopurin, metotreksat, mitotan, prokarbazin HCl, tioguanin, vinblastin sulfat i vinkristin sulfat. Druga antikancerska sredstva opisana su, na primer, u Goodman and Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8. izdanje, 1990., McGraw-Hill, Inc., posebno Poglavlje 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner) Toksini mogu biti proteini kao što su antivirusni protein vinobojke, toksin kolere, toksin velikog kašlja, ricin, gelonin, abrin, egzotoksin difterije ili egzotoksin Pseudomonas. Rezidue toksina takođe mogu biti radionuklidi koji emituju veliku energiju kao što je kobalt-60.

[0241] Izraz "glavni kompleks histokompatibilnosti" ili "MHC" uključuje MHC klase I i klase II i odnosi se na kompleks gena prisutan u svim vertebratima. MHC proteini ili molekuli uključeni su u signalizaciju između limfocita i antigen-prezentujućih ćelija u normalnim imunskim reakcijama vezivanjem peptida i njihovim prezentovanjem na prepoznavanje T ćelijskim receptorima (TCR). MHC molekuli vezuju peptide u unutarćelijskom kompartmentu za obradu i prikazuju ove peptide na površini antigen-prezentujućih ćelija, za prepoznavanje T ćelijama. Humani MHC region označen i kao HLA nalazi se na hromozomu 6 i uključuje region klase I i klase II. U jednom poželjnom primeru izvođenja svih aspekata učenja, MHC molekul je HLA molekul.

[0242] "Sniziti" ili "inhibirati", kako se ovde koristi, znači sposobnost izazivanja ukupnog sniženja, poželjno od 20% ili više, poželjnije od 50% ili više, a najpoželjnije od 75% ili više, nivoa, npr. nivoa proteina ili mRNK u poređenju sa referentnim uzorkom (npr. uzorak koji nije tretiran siRNK). Ovo sniženje ili inhibicija ekspresije RNK ili proteina može se dogoditi ciljanim sečenjem ili razgradnjom mRNK. Testovi za ekspresiju proteina ili ekspresiju nukleinske kiseline poznati su u struci i uključuju, na primer, ELISA, western blot analizu za ekspresiju proteina i Northern blotting, ili testove zaštite od RNaze za RNK.

[0243] Pojam "pacijent" prema učenju označava ljudsko biće, nehumanog primata ili drugu životinju, posebno sisara kao što je krava, konj, svinja, ovca, koza, pas, mačka ili glodar kao što je miš i pacov. U posebno poželjnom primeru izvođenja, pacijent je ljudsko biće.

[0244] Prema učenju, pojam "povećan" ili "povećana količina" poželjno se odnosi na povećanje za najmanje 10%, posebno za najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100%. Količina supstance povećana je u testnom uzorku kao što je biološki uzorak u poređenju sa referentnim uzorkom i ako je detektabilna u testnom uzorku, ali je nema ili nije detektabilna u referentnom uzorku.

[0245] Prema učenju, pojam "tumor" ili "tumorsko oboljenje" odnosi se na otok ili leziju formiranu abnormalnim rastom ćelija (nazvanih neoplastične ćelije ili tumorske ćelije). Pod "tumorskom ćelijom" misli se na abnormalnu ćeliju koja raste brzom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja rast posle prestanka stimulusa koji su pokrenuli novi rast. Tumori pokazuju delimični ili potpuni nedostatak strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom i obično čine posebnu masu tkiva, koja može biti benigna, premaligna ili maligna.

[0246] Poželjno, tumorsko oboljenje prema učenju je kancersko oboljenje, tj. maligno oboljenje i tumorska ćelija je kancerska ćelija. Poželjno, tumorsko oboljenje karakteriše se ćelijama u kojima se tumorska nukleinska kiselina i/ili tumorski antigen identifikovan u skladu sa učenjem eksprimiraju ili abnormalno eksprimiraju, a tumorska ćelija ili cirkulišuća ili metastatska tumorska ćelija karakteriše se ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom tumorske nukleinske kiseline i/ili tumorskog antigena identifikovanog u skladu sa učenjem. Poželjno, tumorsko oboljenje, tumorska ćelija ili cirkulišuća ili metastatska tumorska ćelija karakteriše se ekspresijom tumorskog antigena identifikovanog prema učenju, sa klasom I MHC.

[0247] "Abnormalna ekspresija" znači, u skladu sa učenjem, da je ekspresija izmenjena, poželjno povišena, u poređenju sa stanjem kod zdrave individue. Povišenje ekspresije odnosi se na povišenje od najmanje 10%, posebno najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak i više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se sreće samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu pod represijom.

[0248] Prema učenju, ćelije tkiva ili organa suštinski ne eksprimiraju tumorski antigen identifikovan prema učenju i/ili tumorsku nukleinsku kiselinu identifikovanu prema učenju ako je nivo ekspresije niži u odnosu na ekspresiju u ćelijama placente ili tkivu placente i/ili je niži u odnosu na ekspresiju u ćelijama tumora jajnika i/ili ćelijama tumora pluća ili tkivu tumora jajnika i/ili tkivu tumora pluća. Poželjno, nivo ekspresije je niži od 10%, poželjno niži od 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% ili 0,05% ili čak niži u poređenju sa gornjim ćelijama ili tkivima. Poželjno, tumorski antigen i/ili nukleinska kiselina suštinski se ne eksprimiraju ako je nivo ekspresije ispod granice detekcije. Poželjno, tkivo koje suštinski ne eksprimira tumorski antigen identifikovan prema učenju i/ili tumorsku nukleinsku kiselinu identifikovanu prema učenju kada tkivo ne sadrži tumor, tj. nema tumorsko oboljenje, je tkivo jajnika, pluća, dojke,

4

dvanaestopalačnog creva, kože, kolona, jetre, limfnih čvorova, želuca, slezine, bubrega, jednjaka, pankreasa, endometrijuma, mozga, žučne kese, mokraćne bešike, ileuma, nadbubrežne žlezde, rektuma i skeletnog mišića, poželjno tkivo jajnika ili tkivo pluća. Poželjno je da takvo tkivo nije tkivo placente

[0249] Poželjno, tumorsko tkivo prema učenju je kancer, pri čemu izraz "kancer" u skladu sa učenjem uključuje leukemije, seminome, melanome, teratome, limfome, neuroblastome, gliome, kancer rektuma, kancer endometrijuma, kancer bubrega, kancer nadbubrega, kancer tiroidne žlezde, kancer krvi, kancer kože, kancer mozga, kancer cerviksa, kancer creva, kancer jetre, kancer kolona, kancer želuca, kancer creva, kancer glave i vrata, gastrointestinalni kancer, kancer limfnog čvora, kancer jednjaka, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer uva, grla i nosa (ear, nose and throat, ENT), kancer dojke, kancer prostate, kancer uterusa, kancer jajnika i kancer pluća i njihove metastaze. Njihovi primeri su karcinomi pluća, karcinomi dojke, karcinomi prostate, karcinomi kolona, karcinomi bubrežnih ćelija, karcinomi cerviksa, ili metastaze tipova kancera ili tumora opisanih gore. Izraz kancer prema učenju obuhvata i kancerske metastaze.

[0250] Poželjna tumorska oboljenja ili kanceri prema učenju biraju se iz grupe koja se sastoji od kancera jajnika, posebno adenokarcinoma jajnika i teratokarcinoma janika, kancera pluća, uključujući sitnoćelijski kancer pluća (SCLC) i nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), posebno karcinom pluća pločastih ćelija i adenokarcinom, kancer želuca, kancer dojke, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, posebno karcinom bazalnih ćelija i karcinom pločastih ćelija, maligni melanom, kancer glave i vrata, posebno maligni pleomorfni adenom, sarkom, posebno sinovijalni sarkom i karcinosarkom, kancer žučnih kanala, kancer mokraćne bešike, posebno karcinom prelaznih ćelija i papilarni karcinom, kancer bubrega, posebno karcinom bubrežnih ćelija uključujući karcinom svetlih ćelija bubrega i papilarni karcinom bubrežnih ćelija, kancer kolona, kancer tankog creva uključujući kancer ileuma, posebno adenokarcinom tankog creva i adenokarcinom ileuma, ambrionalni karcinom testisa, placentalni horiokarcinom, kancer cerviksa kancer testisa, posebno seminom testisa, teratom testisa i embrionalni kancer testisa, i kancer uterusa, i njihove metastatske forme.

[0251] Posebno poželjna tumorska oboljenja ili kanceri prema učenju odabrani su iz grupe koja se sastoji od kancera jajnika, kancera pluća, metastatskog kancera jajnika i metastatskog kancera pluća. Poželjno, kancer jajnika je karcinom jajnika ili adenokarcinom jajnika. Poželjno, kancer pluća je karcinom ili adenokarcinom, a poželjno je bronhiolarni kancer kao što je bronhiolarni karcinom ili bronhiolarni adenokarcinom. U jednom primeru izvođenja, tumorska ćelija je ćelija tog kancera. Metastatski kanceri jajnika uključuju metastatske karcinome jajnika i metastatske adenokarcinome jajnika, a metastatski kanceri pluća uključuju metastatske karcinome pluća, metastatske adenokarcinome pluća, metastatske bronhiolarne karcinome i metastatske bronhiolarne adenokarcinome.

[0252] Glavni tipovi kancera pluća su sitnoćelijski karcinom pluća (SCLC) i nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC). Postoje tri glavna podtipa nesitnoćelijskih karcinoma pluća: karcinom pločastih ćelija pluća, adenokarcinom, i krupnoćelijski karcinom pluća. Adenokarcinomi učestvuju sa 10% u kancerima pluća. Ovaj kancer se obično sreće periferno u plućima, nasuprot sitnoćelijskom kanceru i kanceru pločastih ćelija pluća, koji imaju tendenciju da budu više centralno locirani.

[0253] Kancer kože je maligni izraštaj na koži. Najčešći kanceri kože su kancer bazalnih ćelija, kancer pločastih ćelija i melanom. Maligni melanom je ozbiljan tip kancera kože. Nastaje usled nekontrolisanog rasta pigmentnih ćelija zvanih melanociti.

[0254] U skladu sa učenjem, "karcinom" je kancer koji počinje u sloju koji oblaže organe (epitelne ćelije).

[0255] "Bronhiolarni karcinom" je karcinom pluća, veruje se poreklom od epitela terminalnih bronhiola, u kojem se neoplastično tkivo proteže duž zidova alveola i raste u malim masama unutar alveola. Mucin se može demonstrirati u nekim od ćelija i u materijalu u alveolama, koji uključuje i denudirane ćelije.

[0256] "Adenokarcinom" je kancer koji nastaje u žlezdanom tkivu. Ovo tkivo je i deo veće kategorije tkiva poznatog kao epitelno tkivo. Epitelno tkivo uključuje kožu, žlezde i razna druga tkiva koja oblažu šupljine i organe u telu. Epitel vodi embrionalno poreklo od ektoderma, endoderma i mezoderma. Da bi se klasifikovale kao adenokarcinom, ćelije ne moraju nužno biti deo žlezde, sve dok imaju sekretorna svojstva. Ovaj oblik karcinoma može se pojaviti kod nekih viših sisara, uključujući ljude. Dobro diferencirani adenokarcinomi liče na žlzdano tkivo iz kojeg potiču, dok slabo diferencirani ne moraju ličiti. Bojenjem ćelija dobijenih biopsijom patolog će utvrditi da li je tumor adenokarcinom ili neka druga vrsta kancera. Adenokarcinomi mogu nastati u mnogim tkivima tela zbog sveprisutnosti žlezda u telu. Iako svaka žlezda možda ne sekretuje istu supstancu, sve dok ćelija ima egzokrinu funkciju, ona se smatra žlezdanom i njen maligni oblik se stoga naziva adenokarcinom. Maligni adenokarcinomi prodiru u druga tkiva i često metastaziraju ako imaju dovoljno vremena da to učine. Adenokarcinom jajnika najčešći je tip karcinoma jajnika. Uključuje serozne i mucinozne adenokarcinome, adenokarcinome svetlih ćelija i endometrioidni adenokarcinom.

[0257] "Cistadenokarcinom" je maligna forma epitelno-stromalnog tumora površinskog epitela, tipa kancera jajnika.

[0258] Epitelno-stromalni tumori površinskog epitela su klasa neoplazme jajnika za koju se misli da je poreklom od površinskog epitela jajnika (modifikovani peritoneum) ili od ektopičnog tkiva endometrijuma ili jajovoda (tubusnog tkiva). Ova grupa tumora odgovorna je za većinu svih tumora jajnika.

[0259] Teratokarcinom označava tumor germinativne ćelije, mešavina je teratoma sa embrionalnim karcinomom, ili sa horiokarcinomom ili oba. Horiokarcinom je maligni, trofoblastni i agresivni kancer, obično placente. On se karakteriše ranim hematogenim širenjem u pluća.

[0260] Sarkom je kancer vezivnog tkiva (kosti, hrskavice, masnog tkiva) koji rezultuje proliferacijom mezoderma. Ovo se razlikuje od karcinoma koji su epitelnog porekla. Sinovijalni sarkom je redak oblik kancera koji se obično javlja u blizini zglobova ruku ili nogu. To je jedan od sarkoma mekih tkiva.

[0261] Karcinom bubrežnih ćelija poznat i kao kancer bubrežnih ćelija ili adenokarcinom bubrežnih ćelija je kancer bubrega koji nastaje u sloju koji oblaže proksimalne izuvijane tubule, veoma male cevčice u bubregu, koje filtriraju krv i uklanjaju otpadne proizvode. Karcinom bubrežnih ćelija daleko je najčešći tip kancera bubrega kod odraslih i najsmrtonosniji je od svih genitorurinarnih tumora. Različiti podtipovi karcinoma bubrežnih ćelija su karcinom svetlih bubrežnih ćelija i papilarni karcinom bubrežnih ćelija. Karcinom svetlih bubrežnih ćelija je najčešći oblik karcinoma bubrežnih ćelija. Kada se posmatraju pod mikroskopom, ćelije koje čine karcinom svetlih bubrežnih ćelija izgledaju vrlo bledo ili prozirno. Papilarni karcinom bubrežnih ćelija drugi je najčešći podtip. Ovi karcinomi formiraju male prstolike izbočine (koje se nazivaju papile) u nekim, ako ne i većini, tumora.

[0262] Pod "metastazom" se misli na širenje kancerskih ćelija od originalnog mesta do drugog dela tela. Stvaranje metastaza vrlo je složen proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije vanćelijskog matriksa, prodiranja kroz bazalnu membranu endotela u telesnu šupljinu i krvne sudove, a zatim, posle prenošenja krvlju, infiltracije ciljnih organa. Konačno, rast novog tumora, tj. sekundarnog tumora ili metastatskog tumora, na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Tumorske metastaze se često sreću čak i posle uklanjanja primarnog tumora jer tumorske ćelije ili komponente mogu ostati i razviti metastatski potencijal. U jednom primeru izvođenja, izraz "metastaza" prema učenju odnosi se na "udaljenu metastazu" koja se odnosi na metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i sistema regionalnih limfnih čvorova.

[0263] Ćelije sekundarnog ili metastatskog tumora su kao one u originalnom tumoru. To znači, na primer, da, ako kancer jajnika metastazira u jetru, sekundarni tumor se sastoji od abnormalnih ćelija jajnika, a ne od abnormalnih ćelija jetre. Tumor u jetri se tada naziva metastatski kancer jajnika, a ne kancer jetre.

[0264] Kod kancera jajnika, metastaze se mogu pojaviti na sledeće načine: direktnim kontaktom ili proširenjem, mogu zahvatiti obližnje tkivo ili organe koji se nalaze blizu ili oko jajnika, kao što su jajovodi, materica, mokraćna bešika, rektum itd; rasejavanjem ili odvajanjem u trbušnu šupljinu, što je najčešći način širenja kancera jajnika. Ćelije kancera odvajaju se sa površine mase na jajniku i "padaju" na druge strukture u abdomenu kao što su jetra, želudac, kolon ili dijafragma; odvajanjem od mase na jajniku, invazijom limfnih sudova i zatim putovanjem u druga područja tela ili udaljene organe kao što su pluća ili jetra; odvajanjem od mase na jajniku, invazijom krvnog sistema i putovanjem do drugih područja tela ili udaljenih organa.

[0265] U skladu sa učenjem, metastatski kancer jajnika uključuje kancer u jajovodu, kancer u organima abdomena kao što je kancer u debelom crevu, kancer u materici, kancer u mokraćnoj bešici, kancer u rektumu, kancer u jetri, kancer u želucu, kancer u kolonu, kancer u dijafragmi, kancer u plućima, kancer u sloju koji oblaže abdomen ili pelvis (peritoneum), i kancer u mozgu. Slično tome, metastatski kancer pluća odnosi se na kancer koji se proširio od pluća do udaljenih mesta i/ili nekoliko mesta u telu i uključuje kancer u jetri, kancer u nadbubrežnim žlezdama, kancer u kostima, i kancer u mozgu.

[0266] Do relapsa ili recidiva dolazi kada je osoba ponovo pogođena stanjem koje je uticalo na nju u prošlosti. Na primer, ako je pacijent bolovao od tumorskog oboljenja, primio uspešno lečenje navedene bolesti i ponovo razvio navedenu bolest, navedena novorazvijena bolest može se smatrati relapsom ili recidivom. Međutim, prema učenju, relaps ili recidiv tumorskog oboljenja može se, ali ne mora nužno dogoditi na mestu prvobitne tumorskog oboljenja. Tako, na primer, ako je pacijent bolovao od tumora jajnika i primio uspešno lečenje, relaps ili recidiv može biti pojava tumora jajnika ili pojava tumora na mestu različitom od jajnika. Relaps ili recidiv tumora takođe uključuje situacije u kojima se tumor javlja na mestu različitom od mesta izvornog tumora, kao i na mestu izvornog tumora. Poželjno, izvorni tumor za koji je pacijent primio lečenje je primarni tumor, a tumor na mestu različitom od mesta izvornog tumora je sekundarni ili metastatski tumor.

[0267] Prema učenju, biološki uzorak može biti uzorak tkiva, uključujući telesne tečnosti, i/ili ćelijski uzorak i može se dobiti na konvencionalan način kao što je biopsija tkiva, uključujući biopsiju kleštima, i uzimanjem krvi, bronhijalnog aspirata, sputuma, urina, fecesa ili druge telesne tečnosti. Prema učenju, izraz "biološki uzorak" uključuje i obrađene biološke uzorke kao što su frakcije ili izolati bioloških uzoraka, npr. izolati nukleinske kiseline i peptida/proteina.

[0268] Prema učenju, termin "imunoreaktivna ćelija" označava ćeliju koja može sazreti u imunsku ćeliju (kao što je B ćelija, T pomažuća ćelija ili citolitička T ćelija) uz odgovarajuću stimulaciju. Imunoreaktivne ćelije uključuju CD34<+>hematopoetske matične ćelije, nezrele i zrele T ćelije i nezrele i zrele B ćelije. Ako se želi proizvodnja citolitičkih ili T pomažućih ćelija koje prepoznaju tumorski antigen, imunoreaktivna ćelija se dovodi u kontakt sa ćelijom koja eksprimira tumorski antigen pod uslovima koji favorizuju proizvodnju, diferencijaciju i/ili selekciju citolitičkih T ćelija i T pomažućih ćelija. Diferencijacija prekursora T ćelija u citolitičku T ćeliju, kada se izloži antigenu, slična je klonskoj selekciji imunskog sistema.

[0269] Izrazi "T ćelija" i "T limfocit" koriste se naizmenično u ovom tekstu i uključuju T pomažuće ćelije (CD4+ T ćelije) i citotoksične T ćelije (CTL, CD8+ T ćelije) koje uključuju citolitičke T ćelije.

[0270] Neki terapijski postupci zasnivaju se na reakciji imunskog sistema pacijenta, koja rezultuje lizom ćelija zahvaćenih bolešću, kao što su kancerske ćelije koje prezentuju tumorski antigen sa klasom I MHC. U tom kontekstu, na primer, autologni citotoksični T limfociti specifični za kompleks tumorskog antigenskog peptida i molekula MHC mogu se primeniti kod pacijenta koji ima tumorsko oboljenje. Poznata je proizvodnja takvih citotoksičnih T limfocita in vitro. Primer postupka diferencijacije T ćelija može se naći u WO-A-9633265. Uopšteno, uzorak koji sadrži ćelije kao što su krvne ćelije, uzima se od pacijenta i ćelije se dovode u kontakt sa ćelijom koja prezentuje kompleks i koja može izazvati propagaciju citotoksičnih T limfocita (npr. dendritske ćelije). Ciljna ćelija može da biti transfektovana ćelija kao što je COS ćelija. Ove transfektovane ćelije prezentuju željeni kompleks na svojoj površini i, kada dođu u kontakt sa citotoksičnim T limfocitima, stimulišu propagaciju ovih drugih. Klonski ekspandirani autologni citotoksični T limfociti se zatim primenjuju kod pacijenta.

[0271] U drugom postupku selektovanja citotoksičnih T limfocita, fluorogeni tetrameri kompleksa MHC molekula klase I/peptid koriste se za dobijanje specifičnih klonova citotoksičnih T limfocita (Altman et al., Science 274:94-96, 1996; Dunbar et al., Curr. Biol.

8:413-416, 1998).

[0272] Pored toga, čelije koje prezentuju željeni kompleks (npr. dendritske ćelije) mogu se kombinovati sa citotoksičnim T limfocitima zdravih osoba ili druge vrste (npr. miš) što može rezultovati propagacijom specifičnih citotoksičnih T limfocita sa visokim afinitetom. Visokoafinitetni T-ćelijski receptor ovih propagiranih specifičnih T limfocita može se klonirati i opciono humanizovati do različite mere, a tako dobijeni T-ćelijski receptori zatim se transdukuju genskim transferom, na primer upotrebom retrovirusnih vektora, u T ćelije pacijenata. Adoptivni transfer se tada može izvesti pomoću ovih genetički promenjenih T limfocita (Stanislawski et al., Nat Immunol. 2:962-70, 2001; Kessels et al., Nat Immunol.

2:957-61, 2001).

[0273] Citotoksični T limfociti se mogu generisati i in vivo na način koji je poznat po sebi. U jednom postupku koriste se neproliferativne ćelije koje eksprimiraju kompleks MHC klase I/peptid. Ćelije koje se ovde koriste su one koje obično eksprimiraju kompleks, kao što su ozračene tumorske ćelije ili ćelije trasfektovane sa jednim ili oba gena neophodna za prezentovanje kompleksa (tj. antigenski peptid i prezentujući MHC molekul). Druga poželjna forma je uvođenje tumorskog antigena u obliku rekombinantne RNK koja se može introdukovati u ćelije lipozomskim transferom ili elektroporacijom, na primer. Rezultujuće ćelije prezentuju kompleks od interesa i prepoznaju ih autologni citotoksični T limfociti koji se zatim propagiraju.

[0274] Sličan efekat može se postići kombinovanjem tumorskog antigena ili tumorskog antigenskog peptida sa adjuvansom kako bi se omogućilo in vivo inkorporisanje u ćelije koje prezentuju antigen. Tumorski antigen ili tumorski antigenski peptid može se predstaviti kao protein, kao DNK (npr. u vektoru) ili kao RNK. Tumorski antigen može se obraditi da se proizvede peptidni partner za MHC molekul, dok se njegov fragment može prezentovati bez potrebe za dodatnom obradom. Ovo drugo je posebno slučaj ako je moguće vezivanje za MHC molekule. Prednost se daje formama za primenu u kojima dendritska ćelija in vivo obrađuje kompletan antigen, jer se time mogu proizvesti i odgovori T pomažućih ćelija koje su potrebne za efikasan imunski odgovor (Ossendorp et al., Immunol Lett.74:75- 9, 2000; Ossendorp et al., J. Exp. Med.187:693-702, 1998). Uopšteno, moguće je primeniti efikasnu količinu tumorskog antigena kod pacijenta, na primer, intradermalnom injekcijom. Međutim, injekcija se može izvesti i intranodalno u limfni čvor (Maloy et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303, 2001).

[0275] Farmaceutske kompozicije i postupci lečenja opisani u skladu sa učenjem mogu se koristiti i za imunizaciju ili vakcinisanje za terapijsko lečenje ili prevenciju ovde opisanog oboljenja. Prema učenju, termini "imunizacija" ili "vakcinisanje" se poželjno odnose na povećanje ili aktivaciju imunskog odgovora na antigen. Za testiranje efekta imunizacije na kancer mogu se koristiti životinjski modeli. Na primer, humane kancerske ćelije mogu se uvesti u miša kako bi se stvorio tumor. Efekat na kancerske ćelije (na primer smanjenje veličine tumora) može se odrediti kao mera efikasnosti imunizacije sredstvom koje se primenjuje kod životinje.

[0276] Kao deo kompozicije za imunizaciju ili vakcinaciju, poželjno jedno ili više sredstava opisanih u ovom tekstu primenjuju se zajedno sa jednim ili više adjuvanasa za indukovanje imunskog odgovora ili za povišenje imunskog odgovora. Adjuvans je supstanca koja pojačava imunski odgovor. Adjuvansi mogu pojačati imunski odgovor obezbeđivanjem rezervoara antigena (van ćelije ili u makrofagima), aktiviranjem makrofaga i/ili stimulisanjem određenih limfocita. Adjuvansi su poznati i sadrže, bez ograničavanja, monofosforil lipid A (monophosphoryl lipid A, MPL, SmithKline Beecham), saponine kao QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 i QS-L1 (So et al., Mol. Cells 7:178-186, 1997), nekompletni Freund-ov adjuvans, kompletni Freund-ov adjuvans, vitamin E, montanid, stipsu, CpG oligonukleotide (up. Kreig et al., Nature 374:546-9, 1995) i različite emulzije tipa voda u ulju, pripremljene od biološki degradabilnih ulja kao što su skvalen i/ili tokoferol. Poželjno, prema učenju, peptidi se primenjuju u mešavini sa DQS21/MPL. Odnos DQS21 prema MPL tipično je oko 1:10 do 10:1, poželjno oko 1:5 do 5:1 i posebno oko 1:1. Za primenu kod ljudi, formulacija vakcine tipično sadrži DQS21 i MPL u rasponu od oko 1 µg do oko 100 µg.

[0277] Mogu se davati i druge supstance koje stimulišu imunski odgovor pacijenta. Mogu se, na primer, koristiti citokini u vakcinaciji, zahvaljujući njihovim regulatornim svojstvima prema limfocitima. Takvi citokini uključuju, na primer, interleukin-12 (IL-12) za koji se pokazalo da povećava zaštitno dejstvo vakcina (up. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF i IL-18.

[0278] Postoje brojna jedinjenja koja pojačavaju imunski odgovor i koja se prema tome mogu koristiti u vakcinaciji. Navedena jedinjenja uključuju kostimulišuće molekule obezbeđene u formi proteina ili nukleinskih kiselina kao što su B7-1 i B7-2 (CD80, odnosno CD86).

[0279] Peptidi se mogu primeniti na način poznat po sebi. U jednom primeru izvođenja, nukleinske kiseline se primenjuju ex vivo postupcima, tj. uklanjanjem ćelija iz pacijenta, genetičkom modifikacijom navedenih ćelija kako bi se inkorporisala nukleinska kiselina i ponovnim uvođenjem promenjenih ćelija u pacijenta. Ovo obično uključuje uvođenje funkcionalne kopije gena u pacijentove ćelije in vitro i ponovno uvođenje genetički promenjenih ćelija u pacijenta. Funkcionalna kopija gena je pod funkcionalnom kontrolom regulatornih elemenata koji omogućavuju ekspresiju gena u genetički promenjenim ćelijama. Postupci transfekcije i transdukcije poznati su stručnjacima.

[0280] Učenje obezbeđuje i primenu nukleinskih kiselina in vivo, korišćenjem, na primer, vektora kao što su virusi i lipozomi koji kontrolišu cilj.

[0281] U poželjnom primeru izvođenja, virus ili virusni vektor za primenu nukleinske kiseline odabran je iz grupe koja se sastoji od adenovirusa, adeno-udruženih virusa, virusa boginja, uključujući virus vakcinije i oslabljene viruse boginja, Semliki Forest virus, retroviruse, Sindbis

1

virus i čestice slične virusu Ty. Posebna prednost se daje adenovirusima i retrovirusima. Retrovirusi su obično replikaciono deficijentni (tj. nisu sposobni za stvaranje infektivnih čestica).

[0282] Postupci uvođenja nukleinskih kiselina u ćelije in vitro ili in vivo uključuju transfekciju kalcijum-fosfatnih precipitata nukleinskih kiselina, transfekciju nukleinskih kiselina povezanih sa DEAE, transfekciju ili infekciju gore navedenim virusima koji nose nukleinske kiseline od interesa, transfekciju posredovanu lipozomima i slično. U određenim primerima izvođenja, prednost se daje usmeravanju nukleinske kiseline prema određenim ćelijama. U takvim primerima izvođenja, nosač koji se koristi za predavanje nukleinske kiseline ćeliji (npr. retrovirus ili lipozom) može imati vezani molekul koji kontroliše cilj. Na primer, molekul kao što je antitelo specifično za protein na površini membrane ciljne ćelije ili ligand receptora na ciljnoj ćeliji može se inkorporisati ili pričvrstiti za nosač nukleinske kiseline. Poželjna antitela uključuju antitela koja se selektivno vezuju za tumorski antigen. Ako je poželjna primena nukleinske kiseline lipozomima, proteini koji se vezuju za površinski membranski protein povezan sa endocitozom mogu se ugraditi u formulaciju lipozoma kako bi se omogućila kontrola cilja i/ili unosa. Takvi proteini uključuju proteine kapsida ili njihove fragmente koji su specifični za određeni tip ćelije, antitela na proteine koji se internalizuju, proteine usmerene na određeno mesto unutar ćelije i slično.

[0283] Terapijski aktivna jedinjenja učenja mogu se primeniti bilo kojim uobičajenim putem, uključujući injekciju ili infuziju. Primena se može izvesti, na primer, oralno, intravenski, intraperitonealno, intramuskularno, supkutano ili transdermalno. Poželjno je da se antitela terapijski primenjuju putem plućnog aerosola. Antisens nukleinske kiseline poželjno se daju sporom intravenskom primenom.

[0284] Kompozicije učenja se primenjuju u efikasnim količinama. "Efikasna količina" odnosi se na količinu kojom se postiže željena reakcija ili željeni efekat, samu ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju lečenja određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija se poželjno odnosi na inhibiciju toka bolesti. To uključuje usporavanje napredovanja bolesti i, posebno, prekid ili reverziju napredovanja bolesti. Željena reakcija u lečenju bolesti ili stanja može biti i odlaganje početka ili prevencija početka navedene bolesti ili navedenog stanja. Prema učenju, dijagnoza ili lečenje kancera može uključivati i dijagnozu ili lečenje kancerskih metastaza koje su se već formirale ili će se formirati. Prema učenju, pojam "lečenje" obuhvata terapijsko i profilaktičko lečenje, tj. prevenciju.

[0285] Efikasna količina kompozicije učenja zavisiće od stanja koje se leči, ozbiljnosti bolesti, individualnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu,

2

trajanje lečenja, tip prateće terapije (ako postoji), specifičan način primene i slične faktore. Prema tome, primenjene doze kompozicija učenja mogu zavisiti od takvih različitih parametara. U slučaju da reakcija kod pacijenta bude nedovoljna sa početnom dozom, mogu se koristiti više doze (ili efektivno više doze koje se postižu drugačijim, lokalizovanijim putem primene).

[0286] Farmaceutske kompozicije prema učenju su poželjno sterilne i sadrže efikasnu količinu terapijski aktivne supstance za stvaranje željene reakcije ili željenog efekta.

[0287] Uopšteno, formulišu se i primenjuju doze peptida od 1 ng do 1 mg, poželjno od 10 ng do 100 µg. Ako se želi primena nukleinskih kiselina (DNK i RNK), mogu se formulisati i primeniti doze od 1 ng do 0,1 mg.

[0288] Farmaceutske kompozicije učenja uopšteno se primenjuju u farmaceutski kompatibilnim količinama i u farmaceutski kompatibilnom preparatu. Pojam "farmaceutski kompatibilan" odnosi se na netoksičan materijal koji ne interaguje sa dejstvom aktivne komponente farmaceutske kompozicije. Preparati ove vrste obično mogu sadržati soli, puferske supstance, konzervanse, nosače, dopunske supstance za jačanje imuniteta kao što su adjuvansi, npr. CpG oligonukleotidi, citokini, hemokini, saponin, GM-CSF i/ili RNK i, kada je pogodno, druga terapijski aktivna jedinjenja. Kada se koriste u medicini, soli treba da budu farmaceutski kompatibilne. Međutim, soli koje nisu farmaceutski kompatibilne mogu se koristiti za pripremu farmaceutski kompatibilnih soli i uključene su u učenje. Farmakološki i farmaceutski kompatibilne soli ove vrste obuhvataju, bez ograničavanja, one koje su pripremljene od sledećih kiselina: hlorovodična, bromovodična, sumporna, azotna, fosforna, maleinska, sirćetna, salicilna, limunska, mravlja, malonska, ćilibarna kiselina i slično. Farmaceutski kompatibilne soli se mogu pripremiti i kao soli alkalnih metala ili soli zemno-alkalnih metala, kao što su natrijumove soli, kalijumove soli ili kalcijumove soli.

[0289] Farmaceutska kompozicija kako je opisano u specifikaciji može sadržati farmaceutski kompatibilan nosač. Izraz "nosač" odnosi se na organsku ili neorgansku komponentu, prirodne ili sintetske prirode, u kojoj se aktivna komponenta kombinuje da bi se olakšala primena. Prema učenju, izraz "farmaceutski kompatibilan nosač" uključuje jednu ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih potpornih supstanci, razblaživača ili supstanci za inkapsuliranje, pogodnih za primenu kod pacijenta. Komponente farmaceutske kompozicije učenja su obično takve da ne dolazi do interakcije koja suštinski ometa željenu farmaceutsku efikasnost.

[0290] Farmaceutske kompozicije učenja mogu sadržati odgovarajuće puferske supstance kao što su sirćetna kiselina u soli, limunska kiselina u soli, borna kiselina u soli i fosforna kiselina u soli.

[0291] Farmaceutske kompozicije mogu, kada je pogodno, sadržati i pogodne prezervanse kao što su benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.

[0292] Farmaceutske kompozicije su obično obezbeđene u uniformnoj doznoj formi i mogu se pripremiti na način koji je poznat po sebi. Farmaceutske kompozicije učenja mogu biti u formi kapsula, tableta, lozengi, rastvora, suspenzija, sirupa, eliksira ili, na primer, u formi emulzije.

[0293] Kompozicije pogodne za parenteralnu primenu obično sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je poželjno izotoničan u odnosu na krv primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringer-ov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, obično se koriste sterilna, fiksirana ulja kao rastvor ili suspenzioni medijum [0294] Treba naglasiti da se izraz "sadrži/uključuje", kada se koristi u ovoj specifikaciji, koristi za određivanje prisustva navedenih osobina, celih brojeva, koraka ili komponenti, ali ne isključuje prisustvo ili dodavanje jedne ili više drugih osobina, celih brojeva, koraka, komponenti ili njihovih grupa. Sama činjenica da su određene mere navedene u međusobno različitim zavisnim patentnim zahtevima ili opisane u različitim primerima izvođenja ne ukazuje na to da se kombinacija ovih mera ne može koristiti kao prednost. Međutim, izraz "sadrži/uključuje" uključuje i primere izvođenja koji se sastoje od navedenih osobina, celih brojeva, koraka ili komponenti.

[0295] Predmetno učenje detaljno je opisano slikama i primerima u nastavku, koji se koriste samo u svrhu ilustrovanja i ne treba ih shvatiti kao ograničavajuće. Zahvaljujući opisu i primerima, dodatni primeri izvođenja koji su takođe uključeni u učenje dostupni su stručnjaku.

Slike:

[0296]

Slika 1. Kvantifikacija ekspresije CLDN6 u normalnim i kancerskim tkivima pomoću RT-PCR u realnom vremenu. Sa izuzetkom placente, u normalnim tkivima transkripti CLDN6 mogu se detektovati samo u tragovima. Visoka ekspresija CLDN6 nađena je u uzorcima kancera jajnika (adenokarcinomi) i kancera pluća (adenokarcinomi).

Slika 2: Kvantifikacija ekspresije CLDN6 u normalnim tkivima korišćenjem RT-PCR u realnom vremenu. Testirani su normalni tipovi svakog od tkiva, poreklom iz tri osobe. U normalnim tkivima, posle 40 ciklusa RT-PCR, transkripti CLDN6 mogli su se detektovati samo u tragovima. Jedino normalno tkivo kod kojeg je blago prevaziđena

4

granična ekspresija (isprekidana linija, prosečna ekspresija u svim normalnim tkivima 3 STD (99% persentila)) bila je placenta. Oznake za grešku, STD.

Slika 3a-h: Kvantifikacija ekspresije CLDN6 u kancerskim tkivima i ćelijskim linijama korišćenjem RT-PCR u realnom vremenu. Nasuprot normalnim tkivima, našli smo visoku ekspresiju CLDN6 u uzorcima kancera jajnika (adenokarcinomi), kancera pluća (NSCLC, sa najvišom frekvencijom i nivoima ekspresije u adenokarcinomima), kancera želuca, kancera dojke, kancera jetre, kancera pankreasa, kancera kože (karcinom bazalnih ćelija i karcinom pločastih ćelija), malignog melanoma, kancera glave i vrata (maligni pleomorfni adenom), sarkoma (sinovijalni sarkom i karcinosarkom), kancera žučnih kanala, kacera bubrežnih ćelija (karcinom svetlih ćelija i papilarni karcinom), kancera materice, kancera mokraćne bešike (papilarni karcinom) i kancerskim ćelijskim linijama A2780 (kancer jajnika), NIH-OVCAR3 (kancer jajnika), HCT-116 (kancer kolona), EFO-27 (kancer jajnika), CPC-N (SCLC), NCI-H552 (NSCLC), SNU-1 (kancer želuca), KATOIII (kancer želuca), YAPC (kancer pankreasa), AGS (kancer želuca), FU97 (kancer želuca), MKN7 (kancer želuca). Kako se ne bi precenila frekvencija ekspresije CLDN6 u kancerskim tkivima i ćelijskim linijama, samo nivoi transkripata koji su bili najmanje 10 puta iznad granične vrednosti ekspresije za normalno tkivo klasifikovani su kao pozitivni (isprekidana linija).

Slika 4: Western blot analiza ekspresije CLDN6 u normalnim tkivima. Testirani su lizati svakog od normalnih tipova tkiva, poreklom od najviše pet osoba. Ekspresija proteina CLDN6 nije detektovana ni u jednom normalnom analiziranom tkivu. NIH-OVCAR3, pozitivna kontrola.

Slika 5: Western blot analiza ekspresije CLDN6 u kancerskim tkivima. Nasuprot normalnim tkivima, visoka ekspresija proteina CLDN6 detektovana je u uzorcima kancera jajnika i kancera pluća. NIH-OVCAR3, pozitivna kontrola.

Slika 6: Western blot analiza ekspresije CLDN6 u kancerskim ćelijskim linijama.

Ekspresija CLDN6 detektovana je u HEK293 ćelijama transfektovanim CLDN6 ekspresionim plazmidom (pozitivna kontrola), NIH-OVCAR3 (kancer jajnika), MKN7 (kancer želuca), AGS (kancer želuca), CPC-N (SCLC), HCT-116 (kancer kolona), FU97 (kancer želuca), NEC8 (embrionalni karcinom testisa), JAR (horiokarcinom placente), JEG3 (horiokarcinom placente), BEWO (horiokarcinom placente), i PA-1 (teratokarcinom jajnika).

Slika 7: Imunohistohemijska (IHC) analiza ekspresije CLDN6 u normalnim tkivima. Ni u jednom od analiziranih tkiva nije bilo detektabilne ekspresije proteina CLDN6. Tamne oznake vidljive u pankreasu, dvanaestopalačnom crevu i bubregu predstavljaju precipitate boje, koji nisu udruženi sa ćelijskim strukturama.

Slika 8a-h: Imunohistohemijska (IHC) analiza ekspresije CLDN6 u kancerskim tkivima. Nasuprot normalnim tkivima, jako ili bar značajno bojenje zapaženo je na presecima tkiva iz (a) kancera jajnika, (b) kancera pluća, (c) kancera kože, (d) kancera pankreasa, kancera želuca, (e) kancera dojke, kancera mokraćne bešike (karcinom prelaznih ćelija), (f) kancera cerviksa, kancera testisa (seminom), (g) kancera materice, kancera tankog creva i (h) kancera testisa (embrionalni i teratom). Bojenje je jasno naglašeno na ćelijskoj membrani populacija malignih epitelnih ćelija, dok su susedne stromalne i nemaligne epitelne ćelije negativne. Ovi rezultati ukazuju na to da je protein CLDN6 lokalizovan u nivou ćelijske membrane malignih ćelija.

Slika 9: Protočno-citometrijska analiza ekspresije CLDN6 u kancerskim ćelijama.

Nativne ćelije se boje korišćenjem komercijalnog monoklonskog antitela koje cilja vanćelijski domen CLDN6 (αCLDN6). Kao kontrola korišćene su HEK293 ćelije transfektovane CLDN6 ekspresionim plazmidom i netransfektovane HEK293 ćelije. Nije zapaženo obeležavanje netransfektovanih kontrolnih ćelija, međutim, jako obeležavanje je zapaženo u CLDN6 transfektovanim kontrolnim ćelijama i endogeno CLDN6 eksprimirajućim AGS (kancer želuca), NIH-OVCAR3 (kancer jajnika), HCT-116 (kancer kolona), i CPC-N (SCLC) kamcerskim ćelijama. Ovi rezultati jasno pokazuju da je CLDN6 lokalizovan u nivou ćelijske membrane kancerskih ćelija i da se može ciljati monoklonskim antitelima usmerenim protiv vanćelijskog domena proteina.

Primeri:

[0297] Ovde upotrebljene tehnike i postupci opisani su u ovom tekstu ili izvedeni na način poznat po sebi i kako je opisano, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izdanje (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Svi postupci, uključujući upotrebu kitova i reagenasa, izvedeni su u skladu sa uputstvima proizvođača, osim ako je specifično naznačeno drugačije.

Primer 1: CLDN6 je marker koji je specifičan za tumore jajnika i tumore pluća

[0298] Ekspresija CLDN6 (sekvenca nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 1, aminokiselinska sekvenca prema SEQ ID NO: 2) kvantifikovana je u normalnim tkivima i uzorcima kancera jajnika i kancera pluća (adenokarcinomi) korišćenjem RT-PCR u realnom vremenu.

[0299] Za ekstrakciju RNK, sinteza prvog lanca cDNK i reverzna transkripcija-PCR u realnom vremenu (RT-PCR) izvode se kako je ranije opisano (Koslowski et al, 2006; Koslowski et al, 2007). Kvantitativna analiza ekspresije u realnom vremenu izvodi se u triplikatima, u 40 ciklusa RT-PCR. Posle normalizovanja prema HPRT (sense 5’- TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA-3’; antisense 5’- GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT-3’, 62°C sparivanje) ekspresija CLDN6 (sense 5’-CTT ATC TCC TTC GCA GTG CAG-3’; antisense 5’-AAG GAG GGC GAT GAC ACA GAG-3’, 60°C sparivanje) kvantifikuje se korišćenjem ΔΔCT izračunavanja. Tastirani su normalni tipovi svakog od tkiva, poreklom iz najviše tri individue.

[0300] Sa izuzetkom placente, u normalnim tkivima transkripti CLDN6 mogli su se detektovati samo u tragovima. Nasuprot tome, našli smo visoku ekspresiju CLDN6 u uzorcima kancera jajnika (adenokarcinomi) i kancera pluća (adenokarcinomi); vidi Sl.1.

Primer 2: Kvantifikacija ekspresije CLDN6 u normalnim tkivima, kancerskim tkivima i ćelijskim linijama uz korišćenje RT-PCR u realnom vremenu

[0301] Ukupna ćelijska RNK je ekstrahovana iz zamrznutih uzoraka tkiva i kancerskih ćelijskih linija uz korišćenje RNeasy Mini Kit (Qiagen), prajmovana dTi oligonukleotidom i reverzno transkribovana korišćenjem Superscript II (GIBCO/Lifetech) prema uputstvu proizvođača. Integritet dobijene cDNK testiran je amplifikacijom p53 transkripata u 30 ciklusa PCR (sense, 5’-CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG-3’; antisense, 5’-CCTAACCAGCTGCCCAACT GTAG-3’; temperatura sparivanja 67°C). Posle normalizacije prema HPRT (sense 5’-TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA-3’; antisense 5’-GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT-3’, 62°C sparivanje) ekspresija CLDN6 (sense 5’-CTT ATC TCC TTC GCA GTG CAG-3’; antisense 5’-AAG GAG GGC GAT GAC ACA GAG-3’, 60°C sparivanje) kvantifikuje se korišćenjem ΔΔCT izračunavanja.

[0302] Testiran je svaki normalan tip tkiva iz tri individue. Transkripti CLDN6 mogli su se detektovati samo u tragovima u normalnim tkivima, posle 40 ciklusa RT-PCR; vidi Sl.2. Jedino normalno tkivo u kojem je blago prevaziđena granična vrednost ekspresije (isprekidana linija, prosečna ekspresija za sva normalna tkiva 3 STD (99% persentila)) bila je placenta. Oznake za grešku, STD.

[0303] Nasuprot normalnim tkivima, našli smo visoku ekspresiju CLDN6 u uzorcima kancera jajnika (adenokarcinomi), kancera pluća (NSCLC, sa najvišom frekvencijom i nivoima ekspresije u adenokarcinomima), kancera želuca, kancera dojke, kancera jetre, kancera pankreasa, kancera kože (karcinom bazalnih ćelija i karcinom pločastih ćelija), malignog melanoma, kancera glave i vrata (maligni pleomorfni adenom), sarkoma (sinovijalni sarkom i karcinosarkom), kancera žučnih kanala, kacera bubrežnih ćelija (karcinom svetlih ćelija i papilarni karcinom), kancera materice, kancera mokraćne bešike (papilarni karcinom) i kancerskim ćelijskim linijama A2780 (kancer jajnika), NIH-OVCAR3 (kancer jajnika), HCT-116 (kancer kolona), EFO-27 (kancer jajnika), CPC-N (SCLC), NCI-H552 (NSCLC), SNU-1 (kancer želuca), KATOIII (kancer želuca), YAPC (kancer pankreasa), AGS (kancer želuca), FU97 (kancer želuca), MKN7 (kancer želuca); vidi Sl.3a-g. Kako se ne bi precenila frekvencija ekspresije CLDN6 u kancerskim tkivima i ćelijskim linijama, samo nivoi transkripata koji su bili najmanje 10 puta iznad granične vrednosti ekspresije za normalno tkivo klasifikovani su kao pozitivni (isprekidana linija).

Primer 3: Kvantifikacija ekspresije CLDN6 u normalnim tkivima, kancerskim tkivima i ćelijskim linijama korišćenjem Western blot analize

[0304] Za Western blot analizu korišćeno je 20 µg ukupnog proteina ekstrahovanog iz ćelija liziranih Laemmli-lysis puferom. Ekstrakti su razblaženi u redukujućem uzoračkom puferu (Roth), podvrgnuti SDS-PAGE i zatim elektrotransferu na PVDF membranu (Pall). Imunobojenje je izvedeno poliklonskim antitelima reaktivnim na CLDN6 (ARP) i beta-aktin (Abcam) što je praćeno detekcijom primarnih antitela kozjim antimišjim i kozjim antizečjim sekundarnim antitelima konjugovanim sa peroksidazom rena (Dako).

[0305] Testirani su lizati svakog normalnog tipa tkiva iz najviše pet individua. Nije detektovana ekspresija proteina CLDN6 ni u jednom analiziranom normalnom tkivu; vidi Sl. 4. NIH-OVCAR3, pozitivna kontrola.

[0306] Nauprot normalnim tkivima, visoka ekspresija proteina CLDN6 detektovana je u uzorcima kancera jajnika i kancera pluća; vidi Sl.5. NIH-OVCAR3, pozitivna kontrola.

[0307] Ekspresija CLDN6 detektovana je u HEK293 ćelijama transfektovanim CLDN6 ekspresionim plazmidom (pozitivna kontrola), NIH-OVCAR3 (kancer jajnika), MKN7 (kancer želuca), AGS (kancer želuca), CPC-N (SCLC), HCT-116 (kancer kolona), FU97 (kancer želuca), NEC8 (embrionalni karcinom testisa), JAR (horiokarcinom placente), JEG3 (horiokarcinom placente), BEWO (horiokarcinom placente), i PA-1 (teratokarcinom jajnika); vidi Sl.6.

Primer 4: Imunohistohemijska (IHC) analiza ekspresije CLDN6 u normalnim tkivima i kancerskim tkivima

[0308] Preseci tkiva ukalupljenog u parafinu (4 µm) inkubirani su 1 sat na 58°C na grejnoj ploči (HI 1220, Leica). Parafin se uklanja sa preseka inkubiranjem pločica u Roticlear (Roth) 2 × 10 min na RT. Posle toga preseci se rehidratišu u alkoholima opadajuće koncentracije (99%, 2 × 96%, 80% i 70%, 5 min svaki). Otrivanje antigena izvodi se kuvanjem pločica na 120°C (15 psi) 15 min u 10 mM citratnom puferu (pH 6.0) 0,05% Tween-20. Odmah posle kuvanja, pločice se inkbiraju u PBS 5 min. Endogena peroksidazna aktivnost blokira se 0,3% vodonik peroksidom u MeOH, 15 min na RT. Da bi se izbeglo nespecifično vezivanje, pločice se blokiraju 10% kozjim serumom u PBS, 30 min na RT. Posle toga, pločice se inkubiraju sa CLDN6-specifičnim poliklonskim antitelom 1 µg/ml) (ARP) preko noći na 4°C. Sledećeg dana pločice se isperu korišćenjem PBS na RT (3 × 5 min) i inkubiraju sa 100 µl sekundarnih antitela (PowerVision poli-HRP-anti-zečji IgG spreman za upotrebu (ImmunoLogic)) jedan sat na RT. Posle toga, pločice se isperu korišćenjem PBS na RT (3 × 5 min). Finalno bojenje se vrši korišćenjem VECTOR NovaRED Substrate kita SK-4800, Vector Laboratories (Burlingame). Preseci se kontraboje hematoksilinom, 90 sec na RT. Posle dehidratacije alkoholima rastuće koncentracije (70%, 80%, 2x 96% i 99%, 5 min svaki) i inkubacije u ksilolu 10 min pločice se montiraju pomoću Xtra Kit (Medite Histotechnic).

[0309] Nije bilo detektabilne ekspresije proteina CLDN6 ni u jednom analiziranom tkivu; vidi Sl. 7. Tamne oznake vidljive u pankreasu, dvanaestopalačnom crevu i bubregu predstavljaju precipitate boje, koji nisu udruženi sa ćelijskim strukturama.

[0310] Nasuprot normalnim tkivima, jako ili bar značajno bojenje zapaženo je na presecima tkiva iz (a) kancera jajnika, (b) kancera pluća, (c) kancera kože, (d) kancera pankreasa, kancera želuca, (e) kancera dojke, kancera mokraćne bešike (karcinom prelaznih ćelija), (f) kancera cerviksa, kancera testisa (seminom), (g) kancera materice, kancera tankog creva i (h) kancera testisa (embrionalni i teratom); vidi Sl.8a-h. Bojenje je jasno naglašeno na ćelijskoj membrani populacija malignih epitelnih ćelija, dok su susedne stromalne i nemaligne epitelne ćelije negativne. Ovi rezultati ukazuju na to da je protein CLDN6 lokalizovan u nivou ćelijske membrane malignih ćelija.

Primer 5: Protočno-citometrijska analiza ekspresije CLDN6 u kancerskim ćelijama

[0311] Ćelije se sakupe sa 5 mM EDTA/PBS i resuspenduju u PBS / 2% FCS / 0.1% NaAcid.

2 × 10<5>ćelija inkubira se sa mišjim monoklonskim antitelom koje cilja vanćelijski domen CLDN6 (R&D) na 4°C, 30 min. Posle ispiranja ćelije se inkubiraju sa APC-obeleženim zečjim antimišjim sekundarnim antitelom (Jackson ImmunoResearch Laboratories) na 4°C, 30 min. Posle ispiranja ćelije se boje propidijum jodidom (propidium iodide, PI). Analiza se obavlja posle ograđivanja živih (PI-negativnih ćelija) uz korišćenje BD FACSArray Bioanalyzer sistema.

[0312] Nativne ćelije se boje korišćenjem komercijalnog monoklonskog antitela koje cilja vanćelijski domen CLDN6 (αCLDN6). Kao kontrola korišćene su HEK293 ćelije transfektovane CLDN6 ekspresionim plazmidom i netransfektovane HEK293 ćelije. Nije zapaženo obeležavanje netransfektovanih kontrolnih ćelija, međutim, jako obeležavanje je zapaženo u CLDN6 transfektovanim kontrolnim ćelijama i endogeno CLDN6 eksprimirajućim AGS (kancer želuca), NIH-OVCAR3 (kancer jajnika), HCT-116 (kancer kolona), i CPC-N (SCLC) kamcerskim ćelijama; vidi Sl.9. Ovi rezultati jasno pokazuju da je CLDN6 lokalizovan u nivou ćelijske membrane kancerskih ćelija i može se ciljati monoklonskim antitelima usmerenim protiv vanćelijskog domena proteina.

Claims (7)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Postupak za dijagnozu, detekciju ili praćenje tumorskog oboljenja naznačen povišenom ekspresijom tumorskog antigena klaudina-6 (CLDN6), navedeni postupak uključuje detekciju i/ili određivanje količine jednog ili više parametara odabranih iz grupe koja se sastoji od:

(i) nukleinske kiseline koja kodira peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena, i

(ii) peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena,

u biološkom uzorku izolovanom iz pacijenta,

pri čemu navedeni tumorski antigen sadrži aminokiselinsku sekvencu kodiranu nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 1 iz liste sekvenci,

pri čemu je navedeno tumorsko oboljenje bolest odabrana iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jetre, kancera pankreasa, kancera glave/vrata, kancera žučnih kanala, i kancera mokraćne bešike.

2. Postupak iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što je biološki uzorak iz tkiva ili organa gde ćelije, kada tkivo ili organ ne sadrže tumore, ne eksprimiraju navedeni tumorski antigen i/ili nukleinsku kiselinu koja kodira navedeni tumorski antigen.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što detekcija i/ili određivanje količine uključuje:

(i) dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa sredstvom koje se specifično vezuje za nukleinsku kiselinu ili peptid koji treba detektovati i/ili čiju količinu treba odrediti, i

(ii) detektovanje formiranja i/ili određivanje količine kompleksa između sredstva i nukleinske kiseline ili peptida koji treba da se detektuje ili čija količina treba da se odredi.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, naznačen time, što (i) sredstvo koje se specifično vezuje za nukleinsku kiselinu sadrži oligonukleotid koji se specifično hibridizuje sa navedenom nukleinskom kiselinom, i (ii) sredstvo koje se specifično vezuje za peptid sadrži antitelo koje se specifično vezuje za navedeni peptid.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 4, naznačen time, što sredstvo sadrži još i detektabilni obeleživač.

6. Upotreba dijagnostičkog testnog kita u postupku iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 do 5,

pri čemu kit sadrži sredstvo koje se specifično vezuje za

(i) nukleinsku kiselinu koja kodira peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena, i/ili

(ii) peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu tumorskog antigena,

pri čemu navedeni tumorski antigen sadrži aminokiselinsku sekvencu kodiranu nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 1 iz liste sekvenci, pri čemu sredstvo poželjno sadrži još i detektabilni obeleživač, pri čemu je navedeno tumorsko oboljenje bolest odabrana iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jetre, kancera pankreasa, kancera glave/vrata, kancera žučnih kanala, i kancera mokraćne bešike.

7. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 5, ili upotreba prema patentnom zahtevu 6, pri čemu tumorski antigen sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 2 iz liste sekvenci.