RS64907B1 - Peptid za upotrebu u imunoterapiji protiv nesitnoćelijskog kancera pluća i sitnoćelijskog kancera pluća - Google Patents

Description

Opis

[0001] Generalno, ovaj opis se odnosi na peptide, proteine, nukleinske kiseline i ćelije za upotrebu u imunoterapijskim postupcima. Posebno, ovaj opis se odnosi na imunoterapiju kancera. Ovaj opis se dalje odnosi na peptidne epitope T-ćelija povezanih sa tumorom, same ili u kombinaciji sa drugim peptidima povezanim sa tumorom koji mogu, na primer, da služe kao aktivni farmaceutski sastojci kompozicija vakcine koji stimulišu antitumorski imuni odgovor, ili da stimulišu T-ćelije ex vivo i prenos u pacijente. Peptidi vezani za molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC), ili peptidi kao takvi, takođe mogu biti ciljna mesta antitela, rastvorljivih receptora T-ćelija i drugih vezujućih molekula.

[0002] Ovaj opis se dalje odnosi na upotrebu gornjih peptida za stvaranje specifičnih receptora T-ćelija (TCR) koji se vezuju za antigene povezane sa tumorom (TAA) za ciljno delovanje na ćelija kancera, stvaranje T-ćelija koje eksprimiraju iste i postupke za lečenje kancera upotrebom istih. Ovde otkrivene peptidne sekvence i njihove varijante izvedene iz HLA klase I molekula humanih tumorskih ćelija mogu se koristiti u kompozicijama vakcine za izazivanje antitumorskih imunih odgovora, ili kao ciljna mesta za razvoj farmaceutski/imunološki aktivnih jedinjenja i ćelija. Ovaj pronalazak se odnosi na ovaj pronalazak i odnosi se na peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu KVLEHVVRV (SEQ ID NO: 1).

STANJE TEHNIKE

[0003] Nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC) je nazvan prema veličini ćelija kancera kada se posmatra pod mikroskopom i mora se razlikovati od sitnoćelijskog kancera pluća (SCLC). NSCLC čini oko 85% do 90% svih kancera pluća (American Cancer Society, 2015).

[0004] Oba kancera pluća (SCLC i NSCLC) su drugi najčešći kancer i kod muškaraca i kod žena. Kancer pluća je vodeći uzrok smrti od kancera, koji čini oko 25%. Dakle, svake godine više ljudi umire od kancera pluća nego od kancera debelog creva, dojke i prostate zajedno. Pored toga, oba kancera pluća čine oko 13% (više od 1.8 miliona) svih novih kancera. Kancer pluća se uglavnom javlja kod starijih ljudi. Prosečna starost u trenutku postavljanja dijagnoze je oko 70 godina. Manje od 2% svih slučajeva dijagnostikuje se kod ljudi mlađih od 45 godina.

[0005] Postoje četiri glavna tipa NSCLC, a to su adenokarcinom, karcinom skvamoznih ćelija, bronhoalveolarni karcinom i krupnoćelijski karcinom. Adenokarcinom i karcinom skvamoznih ćelija su najčešći tipovi NSCLC zasnovani na ćelijskoj morfologiji (Travis et al., Lung Cancer Principles and Practice, Lippincott-Raven, New York, 361-395, 1996). Adenokarcinome karakteriše perifernija lokacija u plućima i često imaju mutaciju u onkogenu K-ras (Gazdar et al., Anticancer Res., 14, 261-267, 1994). Karcinomi skvamoznih ćelija su obično centralnije locirani i često nose mutacije gena p53 (Niklinska et al., Folia Histochem. Cytobiol., 39, 147-148, 2001).

[0006] Objavljene su mnoge genetske promene povezane sa razvojem i napredovanjem kancera pluća, ali precizni molekularni mehanizmi ostaju nejasni (Sozzi, G. Eur. J. Cancer 37: 63-73 (2001)). Većinu NSCLC karakteriše prisustvo ras mutacije, što pacijenta čini relativno neosetljivim na lečenje poznatim inhibitorima kinaze. Kao rezultat toga, trenutni tretmani kancera pluća su generalno ograničeni na citotoksične lekove, hirurgiju i terapiju zračenjem. Tokom poslednje decenije, pojavila su se novorazvijena citotoksična sredstva uključujući paklitaksel, docetaksel, gemcitabin i vinorelbin koji nude višestruke terapijske izbore za pacijente sa uznapredovalim NSCLC; međutim, svaki od novih režima može pružiti samo skromne koristi za preživljavanje u poređenju sa terapijama zasnovanim na cisplatinu (Schiller, J. H. et al., N. Engl. J. Med.346: 92-98 (2002); Kelly, K. et al., J. Clin. Oncol.19: 3210-3218 (2001)). Stoga kliničari željno očekuju nove terapijske strategije, kao što je razvoj molekularnociljanih sredstava.

[0007] Imunoterapija kancera predstavlja opciju specifičnog ciljanja ćelija kancera uz minimiziranje neželjenih efekata. Imunoterapija kancera koristi postojanje antigena povezanih sa tumorom.

[0008] Trenutna klasifikacija antigena povezanih sa tumorom (TAA) može se kategorisati u sledeće grupe:

a) Antigeni kancera testisa: Prvi ikada identifikovani TAA koje mogu prepoznati T-ćelije pripadaju ovoj klasi, koja je prvobitno nazvana antigeni kancera testisa (CT) zbog ekspresije njegovih članova u histološki različitim humanim tumorima i, među normalnim tkivima, samo u spermatocitima/spermatogonijama testisa i, povremeno, u placenti. Pošto ćelije testisa ne eksprimiraju molekule HLA klase I i II, T-ćelije ne mogu prepoznati ove antigene u normalnim tkivima i stoga se mogu smatrati imunološki specifičnim za tumor. Dobro poznati primeri za CT antigene su članovi porodice MAGE i NY-ESO-1.

b) Antigeni diferencijacije: Ovi TAA se dele između tumora i normalnog tkiva iz kojeg je tumor nastao. Većina poznatih antigena diferencijacije nalazi se u melanomima i normalnim melanocitima. Mnogi od ovih proteina povezanih sa melanocitnom linijom uključeni su u biosintezu melanina i stoga nisu specifični za tumor, ali se ipak široko koriste za imunoterapiju kancera. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, tirozinazu i Melan-A/MART-1 za melanom ili PSA za kancer prostate.

c) Prekomerno eksprimirani TAA: Geni koji kodiraju široko eksprimirane TAA su otkriveni u histološki različitim tipovima tumora, kao i u mnogim normalnim tkivima, generalno sa nižim nivoima ekspresije. Moguće je da su mnogi epitopi obrađeni i potencijalno predstavljeni u normalnim tkivima ispod nivoa praga za prepoznavanje T-ćelija, dok njihova prekomerna ekspresija u tumorskim ćelijama može da izazove antikancerogenu reakciju kršenjem prethodno uspostavljene tolerancije. Istaknuti primeri za ovu klasu TAA su Her-2/neu, survivin, telomeraza ili WT1.

d) Antigeni specifični za tumor: Ovi jedinstveni TAA nastaju mutacijama normalnih gena (kao što su β-katenin, CDK4, itd.). Neke od ovih molekularnih promena su povezane sa neoplastičnom transformacijom i/ili progresijom. Antigeni specifični za tumor su generalno u stanju da indukuju jake imune odgovore bez rizika od autoimunih reakcija protiv normalnih tkiva. S druge strane, ovi TAA su u većini slučajeva relevantni samo za tačan tumor na kome su identifikovani i obično se ne dele među mnogim pojedinačnim tumorima. Tumorska specifičnost (ili -vezivanje) peptida takođe može nastati ako peptid potiče od tumor- (-vezanog) egzona u slučaju proteina sa tumorspecifičnim (-vezanim) izoformama.

e) TAA koji proizilaze iz abnormalnih post-translacionih modifikacija: Takvi TAA mogu nastati od proteina koji nisu ni specifični ni prekomerno eksprimirani u tumorima, ali ipak postaju vezani za tumor post-translacionim procesima primarno aktivnim u tumorima. Primeri za ovu klasu proizilaze iz izmenjenih obrazaca glikozilacije koji dovode do novih epitopa u tumorima kao što je MUC1 ili događaja kao što je splajsing proteina tokom razgradnje koji mogu, ali ne moraju biti specifični za tumor.

f) Onkovirusni proteini: Ovi TAA su virusni proteini koji mogu igrati kritičnu ulogu u onkogenom procesu i, pošto su strani (nisu humanog porekla), mogu izazvati odgovor T-ćelija. Primeri takvih proteina su proteini virusa humanog papiloma tipa 16, E6 i E7, koji se eksprimiraju u karcinomu grlića materice.

[0009] Imunoterapija zasnovana na T-ćelijama ciljno deluje na peptidne epitope izvedene iz tumora povezanih ili tumor-specifičnih proteina, koji su predstavljeni molekulima glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC). Antigeni koje prepoznaju tumorski specifični T limfociti, odnosno njihovi epitopi, mogu biti molekuli izvedeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji su eksprimirani i, u poređenju sa nepromenjenim ćelijama istog porekla, obično ushodno regulisani u ćelijama odgovarajućeg tumora.

[0010] Postoje dve klase MHC-molekula, MHC klasa I i MHC klasa II. Molekuli MHC klase I su sastavljeni od alfa teškog lanca i beta-2-mikroglobulina, MHC klase II molekula od alfa i beta lanca. Njihova trodimenzionalna konformacija rezultira žlebom za vezivanje, koji se koristi za nekovalentnu interakciju sa peptidima. Molekuli MHC klase I mogu se naći na većini ćelija sa jedrom. Oni predstavljaju peptide koji su rezultat proteolitičkog cepanja pretežno endogenih proteina, defektnih ribozomalnih proizvoda (DRIP) i većih peptida. Međutim, peptidi izvedeni iz endozomalnih odeljaka ili egzogenih izvora takođe se često nalaze na molekulima MHC klase I. Ovaj neklasičan način prikaza klase I u literaturi se naziva unakrsni prikaz (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). Molekuli MHC klase II mogu se naći pretežno na profesionalnim ćelijama koje prikazuju antigen (APC), i prvenstveno predstavljaju peptide egzogenih ili transmembranskih proteina koje preuzimaju APC, na primer, tokom endocitoze, a zatim se obrađuju.

[0011] Komplekse peptida i MHC klase I prepoznaju CD8-pozitivne T-ćelije koje nose odgovarajući T-ćelijski receptor (TCR), dok komplekse peptida i MHC molekula klase II prepoznaju CD4-pozitivne-pomoćne T-ćelije koje nose odgovarajući TCR. Dobro je poznato da su TCR, peptid i MHC stoga prisutni u stehiometrijskoj količini od 1:1:1.

[0012] CD4-pozitivne pomoćne T-ćelije igraju važnu ulogu u izazivanju i održavanju efikasnih odgovora CD8-pozitivnih citotoksičnih T-ćelija. Identifikacija CD4-pozitivnih epitopa T-ćelija izvedenih iz antigena povezanih sa tumorom (TAA) je od velikog značaja za razvoj farmaceutskih proizvoda za pokretanje antitumorskih imunih odgovora (Gnjatic et al., 2003). Na mestu tumora, T pomoćne ćelije podržavaju citotoksični milje citokina pogodan za T-ćelije-(CTL-) (Mortara et al., 2006) i privlače efektorske ćelije, npr., CTL, prirodne ćelije ubice (NK), makrofage i granulocite (Hwang et al., 2007).

[0013] U odsustvu inflamacije, ekspresija molekula MHC klase II uglavnom je ograničena na ćelije imunog sistema, posebno na profesionalne ćelije koje predstavljaju antigen (APC), npr., monocite, ćelije izvedene iz monocita, makrofage, dendritske ćelije. Kod pacijenata sa kancerom, otkriveno je da ćelije tumora eksprimiraju molekule MHC klase II (Dengjel et al., 2006). Izduženi (duži) peptidi iz opisa mogu funkcionisati kao aktivni epitopi MHC klase II.

[0014] T-pomoćne ćelije, aktivirane epitopima MHC klase II, igraju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL u antitumorskom imunitetu. Epitopi T-pomoćnih ćelija koji pokreću odgovor T-pomoćnih ćelija tipa TH1 podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivnih T-ćelija ubica, koje uključuju citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju peptidne/MHC komplekse povezane sa tumorom na svojim ćelijskim površinama. Na ovaj način epitopi peptida T-pomoćnih ćelija povezani sa tumorom, sami ili u kombinaciji sa drugim peptidima povezanim sa tumorom, mogu poslužiti kao aktivni farmaceutski sastojci kompozicija vakcine koji stimulišu antitumorski imuni odgovor.

[0015] Prikazano je na životinjskim modelima sisara, npr., miševa, da su čak i u odsustvu CD8-pozitivnih T limfocita, CD4-pozitivne T-ćelije dovoljne za inhibiciju manifestacije tumora putem inhibicije angiogeneze lučenjem interferona-gama (IFNγ) (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Postoje dokazi za CD4 T-ćelije kao direktne antitumorske efektore (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

[0016] Pošto je konstitutivna ekspresija molekula HLA klase II obično ograničena na imune ćelije, mogućnost izolovanja peptida klase II direktno iz primarnih tumora ranije se nije smatrala mogućom. Međutim, Dengjel et al. bili uspešni u identifikaciji određenog broja epitopa MHC klase II direktno iz tumora (WO 2007/028574, EP 1760 088 B1).

[0017] Pošto oba tipa odgovora, zavisna od CD8 i CD4, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija antigena povezanih sa tumorom koje prepoznaju bilo CD8+ T-ćelije (ligand: MHC klase I molekul peptidni epitop) ili CD4-pozitivne T-pomoćne ćelije (ligand: molekul MHC klase II peptidni epitop) je važna u razvoju tumorskih vakcina.

[0018] Da bi peptid MHC klase I pokrenuo (izazvao) ćelijski imuni odgovor, on se takođe mora vezati za MHC-molekul. Ovaj proces zavisi od alela MHC-molekula i specifičnih polimorfizama aminokiselinske sekvence peptida. MHC-klasa-I-vezujući peptidi su obično dužine 8-12 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže dva očuvana ostatka („sidra“) u svojoj sekvenci koja stupaju u interakciju sa odgovarajućim žlebom za vezivanje MHC-molekula. Na ovaj način svaki alel MHC ima "motiv vezivanja" koji određuje koji peptidi se mogu vezati specifično za žleb za vezivanje.

[0019] U imunološkoj reakciji zavisnoj od MHC klase I, peptidi ne samo da moraju biti u stanju da se vežu za određene molekule MHC klase I koje eksprimiraju tumorske ćelije, već ih naknadno moraju prepoznati i T-ćelije koje nose specifične T-ćelijske receptore (TCR).

[0020] Da bi proteini bili prepoznati od strane T-limfocita kao tumor-specifični ili povezani antigeni, i da bi se koristili u terapiji, moraju biti ispunjeni određeni preduslovi. Antigen treba da bude eksprimiran uglavnom u tumorskim ćelijama, a ne u normalnim zdravim tkivima ili u uporedivo malim količinama. U poželjnom primeru izvođenja, peptid bi trebalo da bude prekomerno zastupljen u ćelijama tumora u poređenju sa normalnim zdravim tkivima. Pored toga, poželjno je da odgovarajući antigen nije prisutan samo u tipu tumora, već i u visokim koncentracijama (tj., brojevi kopija odgovarajućeg peptida po ćeliji). Tumorski specifični i tumorski povezani antigeni često potiču od proteina koji su direktno uključeni u transformaciju normalne ćelije u tumorsku zbog svoje funkcije, npr., u kontroli ćelijskog ciklusa ili supresiji apoptoze. Pored toga, nishodna ciljna mesta proteina koji su direktno uzročnici transformacije mogu biti ushodno regulisani i tako mogu biti indirektno povezani sa tumorom. Takvi indirektni antigeni povezani sa tumorom takođe mogu biti ciljna mesta pristupa vakcinaciji (Singh-Jasuja et al., 2004). Neophodno je da epitopi budu prisutni u aminokiselinskoj sekvenci antigena, kako bi se osiguralo da takav peptid („imunogeni peptid“), potiče od antigena povezanog sa tumorom, i da vodi do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.

[0021] Prema tome, TAA su polazna tačka za razvoj terapije zasnovane na T-ćelijama, uključujući, ali ne ograničavajući se na vakcine protiv tumora. Postupci za identifikaciju i karakterizaciju TAA obično se zasnivaju na upotrebi T-ćelija koje se mogu izolovati od pacijenata ili zdravih subjekata, ili se zasnivaju na generisanju diferencijalnih transkripcionih profila ili diferencijalnih obrazaca ekspresije peptida između tumora i normalnih tkiva. Međutim, identifikacija gena koji su prekomerno eksprimirani u tumorskim tkivima ili ćelijskim linijama humanog tumora, ili selektivno eksprimirani u takvim tkivima ili ćelijskim linijama, ne daje precizne informacije o upotrebi antigena koji se transkribuju iz ovih gena u imunoterapiji. To je zato što je samo pojedinačna subpopulacija epitopa ovih antigena pogodna za takvu primenu pošto T-ćelija sa odgovarajućim TCR mora biti prisutna i imunološka tolerancija za ovaj konkretan epitop mora biti odsutna ili minimalna. Stoga je važno izabrati samo one peptide koji su previše ili selektivno prikazani u odnosu na koje se može naći funkcionalna i/ili proliferirajuća T-ćelija. Takva funkcionalna T-ćelija je definisana kao T-ćelija, koja nakon stimulacije specifičnim antigenom može biti klonalno proširena i sposobna je da izvrši efektorske funkcije („efektorska T-ćelija“).

[0022] U slučaju ciljnog delovanja na peptid-MHC pomoću specifičnih TCR (npr., rastvorljivi TCR) i antitela ili drugih vezujućih molekula (osnova) prema opisu, imunogenost osnovnih peptida je sekundarna. U ovim slučajevima, prikaz je odlučujući faktor.

[0023] Uprkos značajnom napretku u osnovnim i kliničkim istraživanjima u vezi sa TAA (Rosenbeg et al., Nature Med. 4: 321-7 (1998); Mukherji et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8078-82 (1995); Hu et al., Cancer Res.56: 2479-83 (1996)), dostupan je samo ograničen broj kandidata za TAA za lečenje kancera. TAA koji se obilno eksprimiraju u ćelijama kancera, a u isto vreme čija je ekspresija ograničena na ćelije kancera, bili bi obećavajući kandidati kao imunoterapeutska ciljna mesta. Nadalje, očekuje se da će identifikacija novih TAA koji indukuju moćne i specifične antitumorske imune odgovore podstaći kliničku upotrebu strategije vakcinacije peptidima kod različitih vrsta kancera (Boon and can der Bruggen, J. Exp. Med.

183: 725-9 (1996); van der Bruggen et al., Science 254: 1643-7 (1991); Brichard et al., J. Exp. Med. 178: 489-95 (1993); Kawakami et al., J. Exp. Med.180: 347-52 (1994); Shichijo et al., J. Exp. Med. 187: 277-88 (1998); Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1914-8 (1997); Harris, J. Natl. Cancer Inst. 88: 1442-5 (1996); Butterfield et al., Cancer Res. 59: 3134-42 (1999); Vissers et al., Cancer Res.59: 5554-9 (1999); van der Burg et al., J Immunol 156: 3308-14 (1996); Tanaka et al., Cancer Res.57: 4465-8 (1997); Fujie et al., Int. J. Cancer 80: 169-72 (1999); Kikuchi et al., Int. J. Cancer 81: 459-66 (1999); Oiso et al., Int. J. Cancer 81: 387-94 (1999)).

[0024] Pored toga, iako je postignut napredak u razvoju lekova koji ciljno deluju na molekule za terapiju kancera, opseg tipova tumora koji reaguju kao i efikasnost tretmana su i dalje veoma ograničeni. Stoga je hitno potrebno razviti nova sredstva protiv kancera koji ciljno deluju na molekule visoko specifične za maligne ćelije i verovatno će izazvati minimalne ili nikakve neželjene reakcije. Takođe postoji potreba da se identifikuju faktori koji predstavljaju biomarkere za kancer uopšte i NSCLC posebno, što bi dovelo do bolje dijagnoze kancera, procene prognoze i predviđanja uspeha lečenja.

SUŠTINA PRONALASKA

[0025] Obim pronalaska je definisan patentnim zahtevima.

[0026] Konkretno, ovaj pronalazak se odnosi na peptid koji se sastoji od aminosekvence SEQ ID No. 1 (KVLEHVVRV), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu je pomenuti kancer izabran od nesitnoćelijskog kancera pluća i sitnoćelijski kancer pluća.

[0027] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na T-ćelijski receptor, poželjno rekombinantni, rastvorljiv ili za membranu vezan T-ćelijski receptor koji je reaktivan sa HLA ligandom, pri čemu se navedeni ligand sastoji od peptida iz ovog pronalaska, za upotrebu u lečenju nesitnoćelijskog kancera pluća ili sitnoćelijski kancer pluća.

[0028] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na antitelo, posebno rastvorljivo ili za membranu vezano antitelo, koje specifično prepoznaje peptid iz ovog pronalaska kada je vezan za MHC molekul za upotrebu u lečenju nesitnoćelijski kancer pluća ili sitnoćelijski kancer pluća.

[0029] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje jedan aktivni sastojak izabran iz grupe koja se sastoji od peptida ovog pronalaska, ili antitela ovog pronalaska, ili T-ćelijskog receptora ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljivog nosača, i izborno dodatnih farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa i/ili stabilizatora za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu je pomenuti kancer izabran od nesitnoćelijskog kancera pluća i sitnoćelijskog kancera pluća.

[0030] Ovaj opis otkriva peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:2 do SEQ ID NO:24 ili njenu varijantnu sekvencu koja je najmanje 65%, poželjno najmanje 77%, a poželjnije na najmanje 85% homologna (poželjno najmanje 75% ili najmanje 85% identična) sa SEQ ID NO:2 do SEQ ID NO:24, pri čemu se navedena varijanta vezuje za MHC i/ili indukuje unakrsnu reakciju T-ćelija sa navedenim peptidom, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, i pri čemu pomenuti peptid nije osnovni polipeptid pune dužine.

[0031] Ovde je takođe otkriven peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:2 do SEQ ID NO:24 ili njene varijante, koja je najmanje 65%, poželjno najmanje 75% i više poželjno najmanje 85% homologna (poželjno najmanje 75% ili najmanje 85% identična) sa SEQ ID NO:2 do SEQ ID NO:24, pri čemu navedeni peptid ili njegova varijanta ima ukupnu dužinu između 8 i 100, poželjno između 8 i 30, a najpoželjnije između 8 i 14 aminokiselina, pri čemu se pomenuti peptid ili varijanta vezuje za MHC i/ili indukuje unakrsnu reakciju T-ćelija sa navedenim peptidom, ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju.

[0032] Sledeće tabele prikazuju peptide prema predmetnom opisu i njihove odgovarajuće SEQ ID NO. Ovaj pronalazak se odnosi na peptid SEQ ID NO: 1. Peptidi SEQ ID NO:

Tabela 1: Peptidi prema predmetnom opisu. Ovaj pronalazak se odnosi na peptid SEQ ID NO: 1. Peptidi SEQ ID NO: 2 do 24 su ovde otkriveni samo za referencu.

[0033] Ovaj opis otkriva varijante MAG-003 peptida (SEQ ID NO:1), koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema sledećoj opštoj formuli I:

X1X2LEHVVRX3

Formula I

pri čemu X1je izabran od aminokiselina K i Y, X2je izabran od aminokiselina V, L i A i X3je izabran od V, L, A i I, pri čemu se navedeni peptid vezuje za molekul HLA klase I ili klase II i/ili indukuje unakrsnu reakciju T-ćelija sa navedenim peptidom kao što je ovde otkriven, ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju. Kao što je ovde otkriveno, navedeni peptid nije osnovni polipeptid pune dužine.

[0034] Peptid SEQ ID NO: 1 ovog pronalaska je za upotrebu u lečenju nesitnoćelijskog kancera pluća ili sitnoćelijskog kancera pluća.

[0035] Ovaj opis dalje otkriva varijante peptida SEK ID NO: 1 za upotrebu u lečenju proliferativnih bolesti, kao što su nesitnoćelijski kancer pluća, sitnoćelijski kancer pluća, kancer bubrežnih ćelija, kancer mozga, kancer želuca, kolorektalni kancer, hepatocelularni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, leukemija, kancer dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, kancer jajnika, kancer mokraćne bešike, kancer materice, kancer žučne kese i žučnih kanala i kancer jednjaka.

[0036] Peptidi - sami ili u kombinaciji - prema ovom opisu su izabrani iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:2 do SEQ ID NO:24. Ovde su otkriveni peptidi - sami ili u kombinaciji - izabrani iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:2 do SEQ ID NO:24 (videti Tabelu 1), i njihova upotreba u imunoterapiji nesitnoćelijskog kancera pluća, sitnoćelijskog kancera pluća, kancera bubrežnih ćelija, kancera mozga, kancera želuca, kolorektalnog kancera, hepatocelularnog kancera, kancera pankreasa, kancera prostate, leukemije, kancera dojke, karcinoma Merkelovih ćelija, melanoma, kancera jajnika, kancera mokraćne bešike, kancera materice, kancera žučne kese i žučnih kanala i kancera jednjaka, i poželjno glioblastoma, kancera želuca, kancera pluća, hepatocelularnog karcinoma, kolorektalnog kancera, kancera pankreasa, kancera jednjaka, kancera jajnika i nesitnoćelijskog kancera pluća.

[0037] Ovde su otkrivene varijante peptida SEQ ID NO: 1, koji imaju sposobnost da se vežu za molekul humanog kompleksa glavne histokompatibilnosti (MHC) klase-I ili - u izduženom obliku, kao što je varijanta dužine - MHC klase-II.

[0038] Ovde su otkrivene varijante peptida SEQ ID NO: 1, pri čemu navedeni peptidi (svaki) sadrže, sastoje se od, ili se u suštini sastoje od aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 2 do SEQ ID NO: 24.

[0039] Ovde su otkriveni peptidi, gde je pomenuti peptid modifikovan i/ili uključuje nepeptidne veze.

[0040] Ovde su otkriveni peptidi, pri čemu je pomenuti peptid deo fuzionog proteina, posebno fuzionisan sa N-terminalnim aminokiselinama nepromenljivog lanca (li) povezanog sa HLA-DR antigenom ili fuzionisan sa (ili u sekvencu) antitelo, kao što je, na primer, antitelo koje je specifično za dendritske ćelije.

[0041] Ovaj opis otkriva nukleinsku kiselinu, koja kodira peptide koji su ovde otkriveni. Ovaj opis dalje otkriva nukleinsku kiselinu koja je DNK, cDNK, PNA, RNK ili njihove kombinacije.

[0042] Ovaj opis dalje otkriva ekspresioni vektor sposoban da eksprimira i/ili eksprimira nukleinsku kiselinu koja je ovde otkrivena.

[0043] Ovaj opis dalje otkriva peptid, nukleinsku kiselinu ili ekspresioni vektor za upotrebu u lečenju bolesti i u medicini, posebno u lečenju kancera,

[0044] Ovaj opis dalje otkriva antitela koja su specifična protiv peptida iz ovog otkrića ili kompleksa navedenih peptida u skladu sa predmetnim opisom sa MHC, i postupke za njihovo dobijanje.

[0045] Ovaj opis dalje otkriva ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu ili ekspresioni vektor kao što su prethodno opisani.

[0046] Predmetni opis dalje otkriva pomenutu ćeliju domaćina koja je ćelija koja predstavlja antigen, a poželjno je da je dendritska ćelija.

[0047] Ovaj opis dalje otkriva postupak za proizvodnju peptida koji je ovde opisan, pri čemu pomenuti postupak sadrži kultivisanje ćelije domaćina koja je ovde otkrivena i izolovanje peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kulturu.

[0048] Ovaj opis dalje otkriva pomenuti postupak, gde se antigen stavlja na molekule MHC klase I ili II eksprimirane na površini odgovarajuće ćelije koja prikazuju antigen ili veštačke ćelije koja predstavlja antigen tako što se dovodi u kontakt dovoljna količina antigena sa ćelijom koja prikazuje antigen.

[0049] Ovaj opis dalje otkriva postupak u kome ćelija koja predstavlja antigen sadrži ekspresioni vektor sposoban da eksprimira i/ili eksprimira navedeni peptid koji sadrži SEQ ID NO: 1 do SEQ ID No.: 24, poželjno sadrži SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO:24, ili varijantnu aminokiselinsku sekvencu.

[0050] Ovaj opis dalje otkriva aktivirane T-ćelije, proizvedene postupkom koji je ovde otkriven, pri čemu navedena T-ćelija selektivno prepoznaje ćeliju opisanu ovde koja eksprimira polipeptid koji sadrži ovde opisanu aminokiselinsku sekvencu.

[0051] Ovaj opis dalje otkriva postupak ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu koja je ovde otkrivena, a postupak sadrži primenu na pacijenta, kako je ovde opisan, efikasnog broja proizvedenih T ćelija kako je ovde opisano.

[0052] Ovde je takođe otkrivena upotreba bilo kog peptida, nukleinske kiseline, vektora ekspresije, ćelije, aktiviranog T limfocita, receptora T ćelije ili antitela ili drugih molekula koji vezuju peptide i/ili peptide MHC kao što je ovde opisano kao lek ili u proizvodnji leka. Navedeni lek može biti aktivan protiv kancera.

[0053] Navedeni lek može biti ćelijska terapija, vakcina ili protein zasnovan na rastvorljivom TCR ili antitelu.

[0054] Ovaj opis dalje otkriva upotrebu kako je ovde opisana, pri čemu su navedene ćelije kancera nesitnoćelijskog kancera pluća, sitnoćelijskog kancera pluća, kancera bubrežnih ćelija, kancera mozga, kancera želuca, kolorektalnog kancera, hepatocelularnog kancera, kancera pankreasa, kancera prostate, leukemije, kancera dojke, karcinoma Merkelovih ćelija, melanoma, kancera jajnika, kancera mokraćne bešike, kancera materice, kancera žučne kese i žučnih kanala i kancera jednjaka, i poželjno nesitnoćelijskog kancera pluća.

[0055] Ovde su otkriveni i biomarkeri zasnovani na peptidima koji su ovde opisani koji se takođe nazivaju "ciljna mesta", koji se mogu koristiti u dijagnozi kancera, poželjno nesitnoćelijskog kancera pluća. Marker može biti prekomerni prikaz samog peptida (jednog ili više) ili prekomerna ekspresija odgovarajućeg(ih) gena (jednog ili više). Markeri se takođe mogu koristiti za predviđanje verovatnoće uspeha lečenja, poželjno imunoterapije, a najpoželjnije imunoterapije koja ciljno deluje na isto ciljno mesto koje identifikuje biomarker. Na primer, antitelo ili rastvorljivi TCR se mogu koristiti za bojenje delova tumora da bi se otkrilo prisustvo peptida od interesa u kompleksu sa MHC. Izborno, antitelo nosi dalju efektorsku funkciju kao što je imunostimulišući domen ili toksin.

[0056] Ovde je otkrivena i upotreba ovih novih ciljnih mesta za identifikaciju TCR koji prepoznaju najmanje jedno od navedenih ciljnih mesta, a poželjno je identifikacija navedenih TCR koji aktiviraju T-ćelije.

[0057] Ovaj opis takođe otkriva upotrebu ovih novih ciljnih mesta u kontekstu lečenja kancera.

[0058] Ovaj opis dalje otkriva upotrebu peptida koji su ovde opisani za proizvodnju TCR, pojedinačnih TCR podjedinica (samih ili u kombinaciji) i njihovih pod-domena, posebno rastvorljivih TCR (sTCR) i kloniranih TCR, navedenih TCR konstruisanih u autologne ili alogene T-ćelije i postupke njihove pripreme, kao i druge ćelije koje nose pomenuti TCR ili unakrsno reaguju sa navedenim TCR.

[0059] Ovaj pronalazak se odnosi na TCR protein, pojedinačne TCR podjedinice (same ili u kombinaciji) i njihove pod-domene, posebno rastvorljive TCR (sTCR) i klonirane TCR koji se vezuju za KVLEHVVRV (SEQ ID NO:1)-HLA-A* 02 kompleks koji sadrži varijabilni domen TCR alfa lanca i varijabilni domen TCR beta lanca za upotrebu u lečenju nesitnoćelijskog kancera pluća ili sitnoćelijskog kancera pluća.

[0060] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira TCR ovog pronalaska. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac, beta lanac TCR ili oba, kao što je proizvedeno prema ovom opisu.

[0061] Ovaj opis je takođe otkrio izolovanu ćeliju domaćina koja sadrži rekombinantni ekspresioni vektor koji eksprimira nukleinsku kiselinu koja kodira TCR alfa lanac, beta lanac ili oba.

[0062] Ovde je otkrivena i izolovana ćelija domaćina koja sadrži rekombinantni ekspresioni vektor ovog pronalaska, poželjno pri čemu ćelija je limfocit periferne krvi (PBL).

[0063] Ovde je otkriven i izolovani PBL koji sadrži rekombinantni ekspresioni vektor ovog pronalaska, pri čemu PBL je CD8+ T-ćelija ili CD4+ T-ćelija.

[0064] Ovde je takođe otkrivena populacija ćelija koja sadrži najmanje jednu ćeliju domaćina prema ovom opisu.

[0065] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na TCR proteine ovog pronalaska za upotrebu u lečenju nesitnoćelijskog kancera pluća i sitnoćelijskog kancera pluća. Ovde su otkriveni i TCR proteini za upotrebu u lečenju kancera bubrežnih ćelija, kancera mozga, kancera želuca, kolorektalnog kancera, hepatocelularnog kancera, kancera pankreasa, kancera prostate, leukemije, kancera dojke, karcinoma Merkelovih ćelija, melanoma, kancera jajnika, kancera mokraćne bešike, kancera materice, kancera žučne kese i žučnih kanala i kancera jednjaka.

[0066] Stimulacija imunog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imuni sistem domaćina prepoznaje kao strani. Otkriće postojanja antigena povezanih sa tumorom povećalo je mogućnost korišćenja imunog sistema domaćina da interveniše u rastu tumora. Za imunoterapiju kancera trenutno se istražuju različiti mehanizmi iskorišćavanja humoralnih i ćelijskih grana imunog sistema.

[0067] Specifični elementi ćelijskog imunog odgovora su sposobni da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija T-ćelija iz populacija ćelija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi sugeriše da takve ćelije igraju važnu ulogu u prirodnoj imunološkoj odbrani od kancera. Naročito CD8-pozitivne T-ćelije, koje prepoznaju molekule klase I peptida koji nose glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) koji obično sadrže 8 do 10 aminokiselinskih ostataka koji potiču iz proteina ili defektnih ribozomalnih proizvoda (DRIPS) koji se nalaze u citosolu, igraju ulogu važnu ulogu u ovom odgovoru. MHC-molekuli ljudi su takođe označeni kao humani leukocitni antigeni (HLA).

[0068] Termin "T-ćelijski odgovor" označava specifičnu proliferaciju i aktivaciju efektorskih funkcija indukovanih peptidom in vitro ili in vivo. Za ograničene citotoksične T-ćelije MHC klase I, efektorske funkcije mogu biti liza peptid-pulsiranih, pulsiranih peptidnih prekursora ili ciljnih ćelija koje prirodno prikazuju peptide, sekrecija citokina, poželjno interferon-gama, TNF-alfa ili IL-2 indukovana peptidom, sekrecija efektorskih molekula, poželjno granzima ili perforina indukovanih peptidom, ili degranulacijom.

[0069] Termin "peptid" se ovde koristi za označavanje niza aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično peptidnim vezama između alfa-amino i karbonil grupa susednih aminokiselina. Po mogućstvu, peptidi imaju dužinu od 9 aminokiselina, ali mogu biti dužine do 8 aminokiselina i 10, 11 ili 12 ili duže, a u slučaju peptida MHC klase II (izdužene varijante peptida opis) mogu biti dugačke i do 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 ili više aminokiselina.

[0070] Dalje, termin "peptid" će uključivati soli niza aminokiselinskih ostataka, povezanih jedni sa drugima tipično peptidnim vezama između alfa-amino i karbonil grupa susednih aminokiselina. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida, kao što su, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetatne) soli. Treba napomenuti da se soli peptida prema ovom opisu značajno razlikuju od peptida u njihovom stanju(ima) in vivo, pošto peptidi nisu soli in vivo.

[0071] Termin "peptid" takođe uključuje "oligopeptid". Termin "oligopeptid" se ovde koristi za označavanje niza aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično peptidnim vezama između alfa-amino i karbonil grupa susednih aminokiselina. Dužina oligopeptida nije kritična za opis, sve dok se u njemu održava tačan epitop ili epitopi. Oligopeptidi su tipično duži od oko 30 aminokiselinskih ostataka i duži od oko 15 aminokiselina.

[0072] Termin "polipeptid" označava niz aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim, tipično peptidnim vezama između alfa-amino i karbonil grupa susednih aminokiselina. Dužina polipeptida nije kritična za opis sve dok se održavaju ispravni epitopi. Za razliku od termina peptid ili oligopeptid, termin polipeptid treba da se odnosi na molekule koji sadrže više od oko 30 aminokiselinskih ostataka.

[0073] Peptid, oligopeptid, protein ili polinukleotid koji kodira takav molekul je "imunogen" (i stoga je "imunogen" u okviru ovog opisa), ako je sposoban da izazove imuni odgovor. U slučaju ovog opisa, imunogenost je preciznije definisana kao sposobnost da se indukuje odgovor T-ćelija. Prema tome, "imunogen" bi bio molekul koji je sposoban da izazove imuni odgovor, a u slučaju ovog opisa, molekul sposoban da indukuje odgovor T-ćelija. U sledećem aspektu, imunogen može biti peptid, kompleks peptida sa MHC, oligopeptid i/ili protein koji se koristi za dobijanje specifičnih antitela ili TCR protiv njega.

[0074] "Epitop" T-ćelija klase I zahteva kratak peptid koji je vezan za MHC receptor klase I, formirajući ternarni kompleks (MHC klase I alfa lanac, beta-2-mikroglobulin i peptid) koji se može prepoznati pomoću T -ćelija koja nosi odgovarajući T-ćelijski receptor koji se vezuje za MHC/peptidni kompleks sa odgovarajućim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za molekule MHC klase I su tipično dužine 8-14 aminokiselina, a najčešće 9 aminokiselina.

[0075] Kod ljudi postoje tri različita genetska lokusa koji kodiraju molekule MHC klase I (MHC-molekuli ljudi su takođe označeni kao humani leukocitni antigeni (HLA)): HLA-A, HLA-B i HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 i HLA-B*07 su primeri različitih alela MHC klase I koji se mogu eksprimirati iz ovih lokusa.

Tabela 2: Učestalosti ekspresije F HLA-A*02 i HLA-A*24 i najčešćih HLA-DR serotipova. Učestalost su izvedene iz učestalosti haplotipa Gf unutar američke populacije prilagođene iz Mori et al. (Mori et al., 1997) koristeći Hardy-Weinberg formulu F = 1 - (1-Gf)<2>.

Kombinacije A*02 ili A*24 sa određenim HLA-DR alelima mogu biti obogaćene ili ređe nego što se očekivalo od njihovih pojedinačnih učestalosti zbog neravnoteže veze. Za detalje pogledajte Chanock et al. (Chanock et al., 2004).

[0076] Gen MAGEA4 je član porodice gena MAGEA. Članovi ove porodice kodiraju proteine sa 50 do 80% međusobne identičnosti sekvence. Promotori i prvi egzoni gena MAGEA pokazuju značajnu varijabilnost, što sugeriše da postojanje ove porodice gena omogućava da se ista funkcija eksprimira pod različitim transkripcionim kontrolama. Geni MAGEA su grupisani na hromozomskoj lokaciji Xq28. Oni su umešani u neke nasledne poremećaje, kao što je diskeratoza congenita. Za ovaj gen su pronađene najmanje četiri varijante koje kodiraju isti protein. [obezbedio RefSeq, jul 2008.]

[0077] Lokalizacija MAGEA4 je opisana kao citoplazmatska (Kim et al., 2015). Međutim, MAGEA4 bojenje je takođe otkriveno u jedrima, sa diferencijalnom distribucijom između jedra i citoplazme kod dobro diferenciranih naspram manje diferenciranih kancera (Sarcevic et al., 2003).

[0078] MAGEA4 se koristi kao marker muških germinativnih ćelija. Ne eksprimira se u gonocitima, već u pre-spermatogonijama i zrelim germinativnim ćelijama (Mitchell et al., 2014).

[0079] MAGEA4 je onkofetalni protein ili antigen kancera testisa. Nema jasnih dokaza za direktan efekat MAGEA4 na stimulaciju tumora. Jedna studija sugeriše da prekomerna ekspresija MAGEA4 stimuliše rast spontano transformisanih normalnih oralnih keratinocita inhibiranjem zaustavljanja ćelijskog ciklusa i apoptoze (Bhan et al., 2012). Međutim, drugi izveštaji sugerišu efekat MAGEA4 na suzbijanje tumora in vitro, pošto je prekomerna ekspresija povećala apoptozu i aktivnost kaspaze-3, dok je utišavanje MAGEA4 dovelo do smanjene aktivnosti kaspaze-3 (Peikert et al., 2006). Drugi su objavili da C-terminalni fragment MAGEA4 ima pro-apoptotičku aktivnost in vitro (Sakurai et al., 2004) i da inhibira rast nezavisan od sidra kroz interakciju sa onkoproteinom gankirinom (Nagao et al., 2003).

[0080] Postoje sporadični dokazi o povezanosti sa metastazama tumora: ekspresija MAGEA4 je povezana sa metastazama u limfnim čvorovima u karcinomu skvamoznih ćelija jednjaka (Forghanifard et al., 2011), sa progresijom do mišićno-invazivnog kancera kod kancera mokraćne bešike (Bergeron et al., 2009), i sa metastazama u limfnim čvorovima kod kancera vulve (Bellati et al., 2007).

[0081] Nema jasnih dokaza o povezanosti MAGEA4 sa matičnim ćelijama kancera. Međutim, ekspresija MAGEA4 je otkrivena u bočnim populacijskim ćelijama iz različitih ćelijskih linija kancera, uključujući pluća, debelo crevo i dojke (Yamada et al., 2013), kao i u uzorcima tumora Hodgkin-ovog limfoma (Shafer et al., 2010). Pored toga, MAGEA4 je opisan u nediferenciranim humanim embrionalnim matičnim ćelijama, kao i njihovim diferenciranim derivatima, ćelijama teratokarcinoma (Lifantseva et al., 2011).

[0082] Prekomerna ekspresija MAGEA4 kod kancera - ekspresija MAGEA4 je opisana u mnoštvu različitih tipova kancera. Za detalje o određenim entitetima kancera, videti pododeljke u nastavku. Ovde su navedene samo neke dodatne informacije o vrstama kancera koje nisu obuhvaćene određenim odeljkom u nastavku.

[0083] Kod primarnog melanoma, imunohistohemijski je otkrivena ekspresija MAGEA4 u 10-30% tumora i do 44% u udaljenim metastazama (Barrow et al., 2006; Luftl et al., 2004). Primarni melanomi sluzokože glave i vrata pokazali su do 60% pozitivnosti na MAGEA4 bojenje (Prasad et al., 2004).

[0084] Kod kancera mokraćne bešike, MAGEA4 je primećen u 38% neinvazivnih tumora na mišiće, 48% mišićno-invazivnih tumora, 65% karcinoma in situ i u 73% metastaza u limfnim čvorovima (Bergeron et al., 2009). Druga studija je opisala ekspresiju MAGEA4 kod kancera mokraćne bešike sa nešto nižim učestalostima, sa najvišim učestalostima u skvamoznom (25/55, 46%) u poređenju sa karcinomima adeno (4/15, 27%), sarkomatoidnim (4/14, 29%), sitnoćelijskim (5/20, 25%) ili prelaznih ćelija (281/1,522, 19%) (Kocher et al., 2002). Kod urotelnog karcinoma, ekspresija MAGEA4 je otkrivena imunohistohemijom u 64% i RT-PCR u 58% slučajeva (Sharma et al., 2006). MAGEA4 je detektovan pomoću RT-PCR u 40 - 60% uzoraka karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata (Cuffel et al., 2011; Soga et al., 2013). Ekspresija MAGEA4 je otkrivena u 57% uzoraka oralnog skvamoznog karcinoma (Montoro et al., 2012; Ries et al., 2005). Ekspresija MAGEA4 nije otkrivena imunohistohemijom ni u jednom od 70 analiziranih uzoraka benignih i malignih tumora štitaste žlezde (Melo et al., 2011). Ekspresija MAGEA4 pronađena je samo kod klasičnog seminoma, ali ne i kod neseminomatoznih tumora germinativnih ćelija testisa (Aubry et al., 2001; Bode et al., 2014). Ekspresija MAGEA4 je otkrivena u 14% (5/35) gastrointestinalnih stromalnih tumora (Perez et al., 2008).

[0085] Kod meduloblastoma u detinjstvu, MAGEA4 iRNK je otkrivena u 28% (7/25), ali je imunoreaktivnost primećena samo u 4% (1/25) uzoraka (Oba-Shinjo et al., 2008). Sledeća studija je otkrila slabu iRNK MAGEA4 u 18% (2/11) meduloblastoma (Jacobs et al., 2008).

[0086] Jedna studija je otkrila da se MAGEA4 eksprimira u 60% uzoraka leukemije/limfoma T-ćelija odraslih (Nishikawa et al., 2012). Drugi izveštaj opisuje mnogo niže učestalosti ekspresije u 5% (2/38) uzoraka ne-Hodgkinovog limfoma i 20-30% uzoraka Hodgkinove bolesti. Kod Hodgkinovog limfoma, Reed-Sternbergove ćelije su bile najjače obojene ćelije, dok okolne ćelije nisu bile (Chambost et al., 2000). Ekspresija MAGEA4 nije otkrivena u 39 uzoraka multiplog mijeloma (Andrade et al., 2008).

[0087] Imunoreaktivnost MAGEA4 detektovana je u 33% karcinoma skvamoznih ćelija grlića materice (20/60) (Sarcevic et al., 2003).

[0088] Imunohistohemijski je utvrđeno da je ekspresija MAGEA4 prisutna u 12% endometrioidnih adenokarcinoma, 63% papilarnih seroznih karcinoma materice i 91% karcinosarkoma materice. U populaciji tumora, stepen ekspresije MAGEA4 bio je najveći kod karcinosarkoma (Resnick et al., 2002).

[0089] Bojenje MAGEA4 detektovano imunohistohemijom je heterogeno, a samo deo pozitivnih tumora eksprimira MAGEA4 u više od 50% ćelija tumora (Resnick et al., 2002; Sarcevic et al., 2003).

[0090] Za razliku od velikog broja studija koje objavljuju o ekspresiji MAGEA4 kod različitih tipova kancera, dokazi o povezanosti MAGEA4 sa ishodom i prognozom su ograničeniji. Međutim, neki izveštaji otkrivaju korelaciju ekspresije MAGEA4 sa kliničkim parametrima. U karcinomu skvamoznih ćelija glave i vrata, ekspresija MAGEA4 je u korelaciji sa lošim ukupnim preživljavanjem i bila je nezavisni prognostički indikator lošeg ishoda (Cuffel et al., 2011). Kod kancera mokraćne bešike, ekspresija MAGEA4 je bila u korelaciji sa recidivom i progresijom do mišićno-invazivnog kancera (Bergeron et al., 2009), a snažno bojenje MAGEA4 povezano je sa smanjenim preživljavanjem (Kocher et al., 2002). Kod gastrointestinalnih stromalnih tumora, ekspresija MAGEA4 zajedno sa drugim antigenima kancera testisa bila je u korelaciji sa recidivom (Perez et al., 2008), kao i kod kancera vulve, MAGEA4 je češće otkrivan kod rekurentnih tumora (Bellati et al., 2007).

[0091] Dokaze za povezanost ekspresije MAGEA4 sa uznapredovalim stadijumima tumora pružaju neki izveštaji koji pokrivaju različite tipove kancera: Kod malignog melanoma, ekspresija MAGEA4 se povećava sa napredovanjem bolesti sa 9% kod primarnih tumora na 44% u udaljenim metastazama (Barrow et al., 2006). Takođe kod kancera vulve, ekspresija MAGEA4 je bila češća kod tumora sa metastazama u limfnim čvorovima (Bellati et al., 2007). Pored toga, ekspresija MAGEA4 je bila povezana sa tumorima visokog stepena ili uznapredovalim stadijumom karcinoma endometrijuma (Chitale et al., 2005), karcinomima skvamoznih ćelija grlića materice (Sarcevic et al., 2003), i kancerom mokraćne bešike (Bergeron et al., 2009; Kocher et al., 2002).

[0092] Čini se da je MAGEA4 eksprimiran u ćelijama tumora, nema dokaza o ekspresiji u stromalnim, vaskularnim, imunim ili drugim ćelijama povezanim sa tumorom. Pored toga, ekspresija MAGEA4 je takođe otkrivena u kultivisanim ćelijskim linijama tumora, kao što su ćelijske linije kancera želuca (Li et al., 1997), ćelijske linije karcinoma jednjaka (Tanaka et al., 1997), ćelijske linije karcinoma pankreasa (Kubuschok et al., 2004) i ćelijske linije karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata (Hartmann et al., 2015).

Tabela 3: MAGEA4 kao opšte ciljno mesto kancera

[0093] MAGEA4 kao terapeutsko ciljno mesto - Imunoterapija ciljnog mesta (vakcine, ađuvansi, CAR) Dvadeset pacijenata sa uznapredovalim kancerom jednjaka, želuca ili pluća primalo je MAGEA4 vakcinu koja sadrži 300 µg proteina subkutano jednom svake 2 nedelje u šest doza. Od 15 pacijenata koji su završili jedan ciklus vakcinacije, četiri pacijenta su pokazala humoralni odgovor specifičan za MAGEA4, a ovi pacijenti su pokazali duže ukupno preživljavanje od pacijenata bez odgovora na antitela. Odgovori CD4 i CD8T ćelija primećeni su kod tri odnosno šest pacijenata, a pacijenti sa indukcijom CD8T ćelija koje proizvode MAGEA4 specifične IFNγ, ali ne i CD4T ćelija, živeli su duže od onih bez indukcije (Saito et al., 2014).

[0094] Postoji izveštaj o slučaju pacijenta sa kancerom debelog creva sa metastazama u plućima koji je lečen fuzionim peptidom MAGE-A4-H/K-HELP (koji se sastoji od MAGE-A4(278-299) pomoćnog epitopa fuzionisanog sa MAGE-A4(143-154) epitopom ubice pomoću glicinskog linkera) zajedno sa OK432 i Montanidom. Tretman je indukovao MAGEA4-specifične Th1 i CTL imune odgovore i MAGEA4-specifične IgG. Rast tumora i tumorski marker karcinoembrionalnog antigena su smanjeni u konačnoj dijagnozi (Takahashi et al., 2012).

[0095] Kliničko ispitivanje faze I istraživalo je adaptivni transfer autolognih CTL konstruisanih TCR-om koji su reaktivni prema MAGEA4 (143-151) vezanim za HLA-A*24:02 kod pacijenata sa kancerom jednjaka. Pacijentima su jednom davani limfociti transdukovani TCR-om, bez prethodnog tretmana, nakon čega je usledila potkožna imunizacija sa MAGEA4 peptidom nakon 2 i 4 nedelje. Nije primećena objektivna regresija tumora, verovatno zbog nedostatka režima limfodepletiranja i primene IL2 (Kageyama et al., 2015). Pretkliničke studije na miševima su pokazale da prenete T-ćelije inhibiraju rast ćelijskih linija tumora koje eksprimiraju MAGEA4 inokulisane kod miševa, i da dodatna vakcinacija peptidima pojačava ovu antitumorsku aktivnost (Shirakura et al., 2012).

[0096] Ciljno delovanje na MAGEA4 sa adaptivnim CTL transferom je predloženo kao opcija lečenja EBV-negativnog Hodgkinovog i ne-Hodgkinovog limfoma. Infuzirani CTL koji ciljno deluju na peptide izvedene iz EBV su opisani da indukuju potpune remisije kod pacijenata sa EBV(+) limfomom. Stoga se ciljno delovanje drugih antigena eksprimiranih limfomom, uključujući MAGEA4, istražuje kao moguća opcija lečenja (Cruz et al., 2011; Gerdemann et al., 2011).

[0097] Nekoliko studija je pokazalo stvaranje MAGEA4 specifičnih CD4(+) T-ćelija od zdravih donora i pacijenata sa kancerom nakon inkubacije sa autolognim ćelijama koje predstavljaju antigen pulsirane sa preklapajućim skupovima peptida (Cesson et al., 2011; Gerdemann et al., 2011; Ohkuri et al., 2009).

[0098] MAG-003, tj. KVLEHVVRV (SEQ ID NO:1), je HLA-A∗0201-ograničeni citotoksični T limfocit (CTL) epitop MAGEA4 (aminokiseline 286-294). (Jia et al. 2010; Wu et al. 2011) U jednom aspektu, MAG-003 izaziva CTL specifične za peptide in vitro od HLA-A∗0201-pozitivnih PBMC i u LA-A∗0201/Kb transgenim miševima. U sledećem aspektu, indukovani CTL liziraju ciljne ćelije na HLA-A∗0201-ograničen način, pokazujući da je MAG-003 HLA-A∗0201-ograničeni CTL epitop i služi kao ciljno mesto za terapijsku antitumoralnu vakcinaciju (Jia et al.2010).

[0099] Pored toga, rutina SYFPEITHI (Rammensee et al., 1997; Rammensee et al., 1999) predviđa vezivanje MAG-003 za A*02:01 sa apsolutnim rezultatom od 25 i relativnim rezultatom od 0.69. Pronalazači predmetnog pronalaska su potvrdili da je 100% identifikacija od vezivanja MAG-003 za A*02-pozitivne uzorake.

Tabela 4: Prikaz MAG-003 u normalnim tkivima i kancerima.

[0100] Prekomerni ili specifičan prikaz TAA na tumorskim ćelijama u poređenju sa normalnim ćelijama dovoljan je za njihovu korist u imunoterapiji, a neki peptidi su specifični za tumor uprkos tome što se njihov izvorni protein nalazi i u normalnim tkivima. Ipak, profilisanje ekspresije iRNK dodaje dodatni nivo bezbednosti u izboru peptidnih ciljnih mesta za imunoterapije. Posebno za terapijske opcije sa visokim bezbednosnim rizicima, kao što su TCR sa afinitetom, idealni ciljni peptid će biti izveden iz proteina koji je jedinstven za tumor i koji se ne nalazi na normalnim tkivima.

[0101] Hirurški uklonjeni uzorci tkiva dati su kao što je gore navedeno nakon što je dobijen pismeni informisani pristanak od svakog pacijenta. Uzorci tumorskog tkiva su brzo zamrznuti odmah nakon operacije i kasnije homogenizovani avanom i tučkom pod tečnim azotom. Ukupna RNK je pripremljena iz ovih uzoraka korišćenjem TRI reagensa (Ambion, Darmstadt, Nemačka) nakon čega je usledilo čišćenje sa RNeasy (QIAGEN, Hilden, Nemačka); oba postupka su obavljena prema protokolu proizvođača.

[0102] Analiza genske ekspresije uzoraka RNK tumora i normalnog tkiva obavljena je sekvenciranjem sledeće generacije (RNAseq) od strane CeGaT (Tübingen, Nemačka). Ukratko, biblioteke za sekvenciranje se pripremaju korišćenjem kompleta reagensa Illumina HiSeq v4 prema protokolu dobavljača (Illumina Inc., San Diego, CA, SAD), koji uključuje fragmentaciju RNK, konverziju cDNK i dodavanje adaptera za sekvenciranje. Biblioteke izvedene iz više uzoraka se mešaju ekvimolarno i sekvenciraju na Illumina HiSeq 2500 sekvenceru u skladu sa uputstvima proizvođača, generišući 50 bp single end čitanja. Obrađena očitavanja se mapiraju u ljudski genom (GRCh38) pomoću softvera STAR. Podaci o ekspresiji daju se na nivou transkripta kao RPKM (čitanja po kilobazi na milion mapiranih čitanja, generisana od softvera Cufflinks) i na nivou egzona (ukupna očitavanja, generisana softverom Bedtools), na osnovu napomena baze podataka ensembl sekvenci (Ensembl77). Čitanja egzona su normalizovana za dužinu egzona i veličinu poravnanja da bi se dobile RPKM vrednosti.

[0103] Tabele 5 do 7 prikazuju RNASeq podatke (rezultate ekspresije) ekspresije MAG-003 kod različitih kancera

Tabela 5: RNASeq ocena 1

Tabela 6: RNASeq ocena 3

Tabela 7: Ekspresija tumora

[0104] Za razliku od velikog broja studija koje izveštavaju o ekspresiji MAGEA4 kod različitih tipova kancera, dokazi o povezanosti MAGEA4 sa ishodom i prognozom su ograničeniji. Međutim, neki izveštaji otkrivaju korelaciju ekspresije MAGEA4 sa kliničkim parametrima. Kod skvamoznog karcinoma glave i vrata, ekspresija MAGEA4 je u korelaciji sa lošim ukupnim preživljavanjem i bila je nezavisni prognostički pokazatelj lošeg ishoda (Cuffel et al., 2011). Pronađena je obrnuta korelacija između ekspresije MAGE-A4 i preživljavanja pacijenata u uznapredovalom stadijumu NSCLC kancera (Yoshida et al., 2006; Shigematsu et al., 2010) i kancera jajnika (Yakirevich et al., 2003). Kod kancera mokraćne bešike, ekspresija MAGEA4 je bila u korelaciji sa recidivom i progresijom do mišićno-invazivnog karcinoma (Bergeron et al., 2009) i snažno bojenje MAGEA4 povezano je sa smanjenim preživljavanjem (Kocher et al., 2002). Kod gastrointestinalnih stomalnih tumora, ekspresija MAGEA4 zajedno sa drugim antigenima kancera testisa je bila u korelaciji sa recidivom (Perez et al., 2008), a takođe i kod kancera vulve, MAGEA4 je češće detektovan kod rekurentnih tumora (Bellati et al., 2007).

[0105] U studiji Cancer Genome Atlas (TCGA) seroznih kancera jajnika visokog stepena, ekspresija MAGEA8 ispod srednje vrednosti bila je povezana sa povećanjem PFS za 11.4 meseca, što je bio najjači efekat koji se može proveriti. Visoka ekspresija MAGE A8 bila je povezana sa lošijim PFS kod pacijenata sa visokim CD3 tumorima, što potencijalno ukazuje na imunosupresivnu ulogu MAGEA8, kao što je preko aktivacije imunosupresivnih Tregs (Eng et al., 2015).

[0106] Grupa visokog rizika i grupa sa niskim rizikom obolelih od kancera debelog creva su se razlikovali po osam biomarkera (ZBTB32, OR51B4, CCL8, TMEFF2, SALL3, GPSM1, MAGEA8 i SALL1) koji su dali referencu za individualni tretman (Zhang et al., 2015).

[0107] U eksperimentima sa ćelijskom linijom karcinoma skvamoznih ćelija kod ljudi MAGE-A5 i -A8 su prijavljeni kao negativni prediktori anti-EGFR terapije primenom panitumumaba (Hartmann et al., 2014).

[0108] Dokaze za povezanost ekspresije MAGEA4 sa uznapredovalim stadijumima tumora pružaju neki izveštaji koji pokrivaju različite tipove kancera: Kod malignog melanoma, ekspresija MAGEA4 se povećava sa napredovanjem bolesti sa 9% kod primarnih tumora na 44% u udaljenim metastazama (Barrow et al., 2006). Takođe kod kancera vulve, ekspresija MAGEA4 je bila češća kod tumora sa metastazama u limfnim čvorovima (Bellati et al., 2007). Štaviše, ekspresija MAGEA4 je bila povezana sa tumorima visokog stepena ili uznapredovalim stadijumom karcinoma endometrijuma (Chitale et al., 2005), karcinoma skvamoznih ćelija grlića materice (Sarcevic et al., 2003) i kancera mokraćne bešike (Bergeron et al., 2009; Kocher et al., 2002).

[0109] Kako se ovde koristi termin "nukleotidna sekvenca" odnosi se na heteropolimer deoksiribonukleotida.

[0110] Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodna ili može biti sintetički konstruisana. Generalno, segmenti DNK koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine se sastavljaju od cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih linkera, ili iz serije oligonukleotida, da bi se obezbedio sintetički gen koji je sposoban da se eksprimira u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatorne elemente izvedene iz mikrobnog ili virusnog operona.

[0111] Kako se ovde koristi termin "nukleotid koji kodira (ili kodira) peptid" odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid, uključujući veštačke (kodove koje je napravio čovek) start i stop kodone kompatibilne za biološki sistem kojim sekvenca treba da bude eksprimirana, na primer, dendritska ćelija ili drugi ćelijski sistem koristan za proizvodnju TCR.

[0112] Kako se ovde koristi termin "nukleotid koji kodira (ili kodira) TCR protein" odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja kodira za TCR protein uključujući veštačke (koje je napravio čovek) start i stop kodone kompatibilne za biološki sistem, sekvenca treba da bude eksprimirana pomoću, na primer, T-ćelije ili drugog ćelijskog sistema korisnog za proizvodnju TCR.

[0113] Kako se ovde koristi, referenca na sekvencu nukleinske kiseline uključuje i jednolančanu i dvolančanu nukleinsku kiselinu. Tako, na primer za DNK, specifična sekvenca, osim ako kontekst ne ukazuje drugačije, odnosi se na jednolančanu DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa njenim komplementom (dvolančana DNK) i komplement takve sekvence.

[0114] Termin "kodirajući region" odnosi se na onaj deo gena koji prirodno ili normalno kodira proizvod ekspresije tog gena u njegovom prirodnom genomskom okruženju, tj., kodiranje regiona in vivo za nativni ekspresioni proizvod gena.

[0115] Kodirajući region može biti izveden iz ne-mutiranog („normalnog“), mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak može biti izveden iz DNK sekvence ili gena, koji je u potpunosti sintetisan u laboratoriji korišćenjem postupaka koji su dobro poznati stručnjacima u oblasti tehnike sinteze DNK.

[0116] Termin "proizvod ekspresije" označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod translacije gena i bilo koje sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju ekvivalente koji su rezultat degeneracije genetskog koda i na taj način kodiraju istu aminokiselinu(e).

[0117] Termin "fragment", kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo DNK koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji ekspresioni proizvod zadržava suštinski istu biološku funkciju ili aktivnost kao ekspresioni proizvod kompletnog kodirajućeg regiona.

[0118] Termin "DNK segment" se odnosi na DNK polimer, u obliku zasebnog fragmenta ili kao komponentu većeg DNK konstrukta, koji je izveden iz DNK izolovane najmanje jednom u suštinski čistom obliku, tj., bez kontaminirajućih endogenih materijala i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i izolaciju segmenta i njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci standardnim biohemijskim postupcima, na primer, korišćenjem vektora za kloniranje. Takvi segmenti su obezbeđeni u obliku otvorenog okvira čitanja neprekinutog unutrašnjim netranslatiranim sekvencama, ili intronima, koji su tipično prisutni u eukariotskim genima.

[0119] Sekvence netranslatirane DNK mogu biti prisutne nishodno od otvorenog okvira čitanja, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.

[0120] Termin "prajmer" označava kratku sekvencu nukleinske kiseline koja se može upariti sa jednim lancem DNK i obezbeđuje slobodan 3'-OH kraj na kome DNK polimeraza započinje sintezu dezoksiribonukleotidnog lanca.

[0121] Termin "promotor" označava region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze da bi se inicirala transkripcija.

[0122] Termin "izolovan" znači da je materijal uklonjen iz svog originalnog okruženja (npr., prirodno okruženje, ako je prirodno). Na primer, polinukleotid ili polipeptid koji se nalazi u prirodi prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali je isti polinukleotid ili polipeptid, odvojen od nekih ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, izolovan. U jednom aspektu, takvi polinukleotidi su deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi su deo kompozicije, i još uvek su izolovani u tome što takav vektor ili kompozicija nije deo njegovog prirodnog okruženja.

[0123] Polinukleotidi i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, opisani ovde, takođe mogu biti u "prečišćenom" obliku. Termin "prečišćen" ne zahteva apsolutnu čistoću; umesto toga, zamišljen je kao relativna definicija i može uključiti preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, kako te termine razumeju stručnjaci u relevantnoj oblasti tehnike. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz biblioteke cDNK su konvencionalno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Ovde je otkriveno prečišćavanje početnog materijala ili prirodnog materijala do najmanje jednog reda veličine, ili dva ili tri reda, ili čak četiri ili pet redova veličine. Dalje, polipeptid koji ima čistoću poželjno 99.999%, ili najmanje 99.99% ili 99.9%; pa čak i poželjno 99% težinskih ili više je izričito obuhvaćen.

[0124] Nukleinske kiseline i polipeptidni ekspresioni proizvodi otkriveni u skladu sa ovim opisom, kao i ekspresioni vektori koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u "obogaćenom obliku". Kako se ovde koristi, termin "obogaćen" znači da je koncentracija materijala najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od prirodne koncentracije (na primer), povoljno 0.01%, po težini, poželjno najmanje oko 0.1% po težini. Takođe se razmatraju obogaćeni preparati od oko 0.5%, 1%, 5%, 10% i 20% po težini. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji sadrže ovaj opis mogu povoljno biti u obogaćenom ili izolovanom obliku. Termin "aktivni fragment" označava fragment, obično sekvence peptida, polipeptida ili nukleinske kiseline, koji generiše imuni odgovor (tj., ima imunogenu aktivnost) kada se primenjuje, sam ili izborno sa odgovarajućim ađuvansom ili u vektoru, životinji, kao što je sisar, na primer, zec ili miš, a takođe uključuje i čoveka, takav imuni odgovor uzima oblik stimulisanja odgovora T-ćelija unutar životinje primaoca, kao što je čovek. Alternativno, "aktivni fragment" se takođe može koristiti za izazivanje odgovora T-ćelija in vitro.

[0125] Kako se ovde koristi, termini "deo", "segment" i "fragment", kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca formira podskup veće sekvence. Na primer, ako je polipeptid podvrgnut tretmanu sa bilo kojom od uobičajenih endopeptidaza, kao što je tripsin ili himotripsin, oligopeptidi koji nastaju takvim tretmanom bi predstavljali delove, segmente ili fragmente početnog polipeptida. Kada se koriste u odnosu na polinukleotide, ovi termini se odnose na proizvode proizvedene tretmanom navedenih polinukleotida sa bilo kojom od endonukleaza.

[0126] Kako se ovde koristi, termin "procenat identičnosti" ili "procenata identičan", kada se odnosi na sekvencu, znači da se sekvenca upoređuje sa sekvencom za koju se traži zaštita ili koja je opisana nakon poravnanja sekvence koja treba da se poredi ("Upoređena sekvenca") sa opisanom sekvencom ili sekvencom za koju se traži zaštita („Referentna sekvenca“). Procenat identičnosti se zatim određuje prema sledećoj formuli: procenat identičnosti = 100 [1 -(C/R)]

pri čemu je C broj razlika između referentne sekvence i upoređene sekvence duž dužine poravnanja između referentne sekvence i upoređene sekvence, pri čemu

(i) svaka baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili aminokiselinu u upoređenoj sekvenci i

(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci i

(iii) svaka poravnata baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od usklađene baze ili aminokiseline u upoređenoj sekvenci, predstavlja razliku i

(iv) poravnanje mora da počne na poziciji 1 poravnatih sekvenci;

i R je broj baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci duž dužine poravnanja sa upoređenom sekvencom pri čemu se bilo koja praznina koja je stvorena u referentnoj sekvenci takođe računa kao baza ili aminokiselina.

[0127] Ako postoji poravnanje između upoređene sekvence i referentne sekvence za koju je procenat identičnosti kao što je gore izračunat približno jednak ili veći od navedenog minimalnog procenta identičnosti, onda upoređena sekvenca ima navedeni minimalni procenat identičnosti referentne sekvence iako poravnanja mogu postoje u kojima je gore izračunati procenat identičnosti manji od navedenog procenta identičnosti.

[0128] Kao što je gore pomenuto, predmetni opis stoga obezbeđuje peptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1 za upotrebu u postupku lečenja nesitnoćelijskog kancera pluća i sitnoćelijskog kancera pluća. Peptidi pronalaska imaju sposobnost da se vežu za molekul humanog kompleksa glavne histokompatibilnosti (MHC) klase-I ili izdužene verzije navedenih peptida za klasu II.

[0129] Kako se ovde koristi, termin "homologan" se odnosi na stepen identičnosti (videti procenat identičnosti iznad) između sekvenci dve aminokiselinske sekvence, tj. peptidne ili polipeptidne sekvence. Gore pomenuta "homologija" je određena upoređivanjem dve sekvence poređane pod optimalnim uslovima u odnosu na sekvence koje se porede. Takva homologija sekvence se može izračunati kreiranjem poravnanja koristeći, na primer, ClustalW algoritam. Uobičajeno dostupan softver za analizu sekvenci, tačnije, Vector NTI, GENETYX ili drugi alati su obezbeđeni iz javnih baza podataka.

[0130] Stručnjak u ovoj oblasti će moći da proceni da li će T-ćelije izazvane varijantom specifičnog peptida moći unakrsnu da reaguju sa samim peptidom (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).

[0131] Pod „varijantom“ date aminokiselinske sekvence podrazumeva se da su bočni lanci, na primer, jednog ili dva aminokiselinska ostatka izmenjeni (na primer tako što se zamenjuju bočnim lancem drugog prirodnog aminokiselinskog ostatka ili nekim drugim bočnim lancem) tako da je peptid i dalje u stanju da se veže za HLA molekul na suštinski isti način kao peptid koji se sastoji od date aminokiselinske sekvence koja se sastoji od SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO:24. Na primer, peptid se može modifikovati tako da barem održava, ako ne i poboljšava, sposobnost interakcije i vezivanja za žleb za vezivanje odgovarajućeg MHC molekula, kao što je HLA-A*02 ili -DR, i to način na koji barem održava, ako ne i poboljšava, sposobnost vezivanja za TCR aktiviranih T-ćelija. Slično, TCR protein može biti modifikovan tako da barem održava, ako ne i poboljšava, sposobnost interakcije i vezivanja za odgovarajući kompleks MHC molekula/ KVLEHVVRV (SEQ ID NO:1), kao što je HLA-A*02 ili -DR, i na taj način barem održava, ako ne i poboljšava, sposobnost aktiviranja T-ćelija.

[0132] Ove T-ćelije mogu naknadno da unakrsno reaguju sa ćelijama i ubijaju ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida, kao što je KVLEHVVRV (SEQ ID NO:1), kao što je definisano u aspektima opisa. Kao što se može izvesti iz naučne literature i baza podataka (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997), određene pozicije HLA vezujućih peptida su tipično sidreni ostaci koji formiraju sekvencu jezgra koja odgovara motivu vezivanja HLA receptora, koji je definisan polarnim, elektrofizičkim, hidrofobnim i prostornim osobinama polipeptidnih lanaca koji čine žleb za vezivanje. Prema tome, stručnjak u ovoj oblasti bi mogao da modifikuje aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO 24, održavanjem poznatih sidrenih ostataka, i bio bi u stanju da utvrdi da li takve varijante zadržavaju sposobnost da vezuju ovde otkrivene molekule MHC klase I ili II / KVLEHVVRV (SEQ ID NO:1). Varijante koje su ovde otkrivene zadržavaju sposobnost vezivanja molekula MHC klase I ili II /KVLEHVVRV (SEQ ID NO:1) kompleksa. T-ćelije koje eksprimiraju varijante mogu naknadno da ubiju ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida, kao što je KVLEHVVRV (SEQ ID NO:1).

[0133] Originalni (nemodifikovani) peptidi ili TCR proteini kako su ovde otkriveni mogu biti modifikovani supstitucijom jednog ili više ostataka na različitim, moguće selektivnim, mestima unutar peptidnog lanca, ako nije drugačije navedeno. Poželjno je da se te supstitucije nalaze na kraju aminokiselinskog lanca navedenog peptida. Za TCR proteine, poželjno je da se te supstitucije nalaze na varijabilnim domenima TCR alfa lanca i TCR beta lanca. Takve supstitucije mogu biti konzervativne prirode, na primer, gde je jedna aminokiselina zamenjena aminokiselinom slične strukture i karakteristika, kao što je kada je hidrofobna aminokiselina zamenjena drugom hidrofobnom aminokiselinom. Još konzervativnija bi bila zamena aminokiselina iste ili slične veličine i hemijske prirode, kao što je slučaj kada je leucin zamenjen izoleucinom. U studijama varijacija sekvenci u porodicama homolognih proteina koji se javljaju u prirodi, određene supstitucije aminokiselina se češće tolerišu od drugih, a one često pokazuju korelaciju sa sličnostima u veličini, naelektrisanju, polarnosti i hidrofobnosti između originalne aminokiseline i njene zamene, i takva je osnova za definisanje „konzervativnih supstitucija“.

[0134] Konzervativne supstitucije su ovde definisane kao razmene unutar jedne od sledećih pet grupa: Grupa 1-mali alifatični, nepolarni ili blago polarni ostaci (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupa 2-polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi (Asp, Asn, Glu, Gin); Grupa 3-polarni, pozitivno naelektrisani ostaci (His, Arg, Lys); Grupa 4-veliki, alifatični, nepolarni ostaci (Met, Leu, Ile, Val, Cys); i Grupa 5 - veliki, aromatični ostaci (Phe, Tyr, Trp).

[0135] Manje konzervativne supstitucije mogu uključiti zamenu jedne aminokiseline drugom koja ima slične karakteristike, ali je nešto drugačija po veličini, kao što je zamena alanina ostatkom izoleucina. Veoma nekonzervativne zamene mogu uključivati zamenu kisele aminokiseline za onu koja je polarna, ili čak za onu koja je bazna. Takve "radikalne" zamene se, međutim, ne mogu odbaciti kao potencijalno neefikasne jer hemijski efekti nisu potpuno predvidljivi i radikalne supstitucije mogu dovesti do slučajnih efekata koji inače nisu predvidljivi iz jednostavnih hemijskih principa.

[0136] Naravno, takve supstitucije mogu uključivati strukture koje nisu uobičajene L-aminokiseline. Dakle, D-aminokiseline mogu biti zamenjene L-aminokiselinama koje se obično nalaze u antigenskim peptidima iz opisa, a ipak budu obuhvaćene ovim otkrićem.

[0137] Pored toga, nestandardne aminokiseline (tj., osim uobičajenih proteinogenih aminokiselina koje se javljaju u prirodi) takođe mogu da se koriste u svrhe supstitucije za proizvodnju imunogena i imunogenih polipeptida u skladu sa ovim opisom.

[0138] Ako se utvrdi da supstitucije na više od jedne pozicije dovode do peptida sa suštinski ekvivalentnom ili većom antigenom aktivnošću kao što je definisano u nastavku, onda će se testirati kombinacije tih supstitucija da bi se utvrdilo da li kombinovane supstitucije rezultiraju aditivnim ili sinergističkim efektima na antigenost peptida. Najviše, ne više od 4 pozicije unutar peptida ne bi bile istovremeno zamenjene.

[0139] Peptid koji se u suštini sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je ovde naznačeno može imati jednu ili dve nesidrene aminokiseline (pogledajte dole u vezi sa motivom sidra) koji se razmenjuju bez te sposobnosti da se veže za molekul klase humanog glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase-I ili -II su značajno promenjeni ili su negativno pogođeni u poređenju sa nemodifikovanim peptidom. U drugom slučaju, u peptidu koji se u suštini sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je ovde naznačeno, jedna ili dve aminokiseline mogu da se razmene sa svojim konzervativnim partnerima u razmeni (videti ovde dole) bez te sposobnosti da se vežu za molekul humanog glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase-I ili -II je značajno promenjen, ili je negativno pogođen, u poređenju sa nemodifikovanim peptidom.

[0140] Ostaci aminokiselina koji ne doprinose suštinski interakcijama sa TCR mogu se modifikovati zamenom sa drugim aminokiselinama čija ugradnja ne utiče suštinski na reaktivnost T-ćelija i ne eliminiše vezivanje za relevantni MHC. Prema tome, osim datih uslova, peptid koji je ovde otkriven može biti bilo koji peptid (pod kojim terminom pronalazači uključuju oligopeptid ili polipeptid), koji uključuje aminokiselinske sekvence ili njihov deo ili varijantu kako je dato.

Tabela 9: Varijante peptida pronalaska

[0141] Duži (izduženi) peptidi takođe mogu biti pogodni. Moguće je da epitopi MHC klase I, iako obično stvarni epitop su ostaci koji ne utiču suštinski na proteolitičko cepanje neophodno da bi se izložio stvarni epitop tokom obrade.

[0142] Peptidi iz opisa mogu biti produženi za do četiri aminokiseline, odnosno 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline se mogu dodati na oba kraja u bilo kojoj kombinaciji dužine između 8 i 11 aminokiselina, generišu se obradom peptida iz dužeg peptide ili proteine koji uključuju stvarni epitop. Na primer, ostaci mogu biti bočni između 4:0 i 0:4. Kombinacije elongacija prema opisu mogu se naći u tabeli 10.

Tabela 10: Kombinacije elongacija peptida iz opisa

[0143] Aminokiseline za elongaciju/produženje mogu biti peptidi originalne sekvence proteina ili bilo koje druge aminokiseline. Elongacija se može koristiti za poboljšanje stabilnosti ili rastvorljivosti peptida.

[0144] Dakle, epitopi ovog pronalaska su identični epitopima koji se javljaju u prirodi povezanim sa tumorom ili tumor-specifičnim epitopima. Dalje opisani ovde se takođe razlikuju za ne više od četiri ostatka od referentnog peptida, sve dok imaju suštinski identičnu antigenu aktivnost.

[0145] Alternativno, peptid je produžen sa jedne ili obe strane za ili više od 4 aminokiseline, ili do ukupne dužine do 30 aminokiselina. Ovo može dovesti do vezivanja peptida MHC klase II. Vezivanje za MHC klase II može se testirati postupcima poznatim u tehnici.

[0146] Shodno tome, ovde su otkriveni peptidi i varijante epitopa MHC klase I, pri čemu peptid ili varijanta ima ukupnu dužinu između 8 i 100, poželjno između 8 i 30, a najpoželjnije između 8 i 14, odnosno 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 aminokiselina, u slučaju izduženih vezujućih peptida klase II dužina može biti i 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ili 22 aminokiseline.

[0147] Naravno, peptid prema ovom pronalasku će imati sposobnost da se veže za molekul humanog kompleksa glavne histokompatibilnosti (MHC) klase I. Vezivanje peptida ili varijante za MHC kompleks može se testirati postupcima poznatim u stanju tehnike.

[0148] Kada se T-ćelije specifične za peptid koji je ovde otkrivene testiraju u odnosu na supstituisane peptide, koncentracija peptida pri kojoj supstituisani peptidi postižu polovinu maksimalnog povećanja lize u odnosu na pozadinu nije veća od oko 1 mM, ili ne više od oko 1 µM, ili ne više od oko 1 nM, ili ne više od oko 100 pM, ili ne više od oko 10 pM. U drugom slučaju T-ćelije prepoznaju supstituisani peptid iz više od jedne osobe, najmanje dve, ili čak tri osobe.

[0149] Povećanje afiniteta TCR specifičnih za tumor i njegova eksploatacija se oslanja na postojanje prozora za optimalne TCR afinitete. Postojanje takvog prozora zasnovano je na zapažanjima da TCR specifični za HLA-A2-ograničene patogene imaju KD vrednosti koje su generalno oko 10 puta niže u poređenju sa TCR specifičnim za HLA-A2-ograničene autoantigene povezane sa tumorom (Aleksic et al.2012; Kunert et al.2013). Sada je poznato, iako tumorski antigeni imaju potencijal da budu imunogeni, jer tumori nastaju iz sopstvenih ćelija individue, samo će mutirani proteini ili proteini sa izmenjenom translacionom obradom biti prepoznati kao strani od strane imunološkog sistema. Antigeni koji su pojačano ili prekomerno eksprimirani (tzv. autoantigeni) neće nužno izazvati funkcionalni imuni odgovor protiv tumora: T-ćelije koje eksprimiraju TCR koji su visoko reaktivni na ove antigene biće negativno selekcionisani unutar timusa u procesu poznatom kao centralna tolerancija (Xing et al. 2012; Ruella et al.2014; Sharpe et al.2015), što znači da ostaju samo T-ćelije sa TCR niskog afiniteta za antigene. Prema tome, afinitet TCR ovog pronalaska prema MAG-003 je poboljšan postupcima dobro poznatim u tehnici kao što je opisano u nastavku.

[0150] "Farmaceutska kompozicija" je kompozicija pogodna za primenu na ljudsko biće u medicinskom okruženju. Poželjno, farmaceutska kompozicija je sterilna i proizvedena u skladu sa GMP smernicama.

[0151] Farmaceutske kompozicije sadrže peptide ili TCR proteine ili u slobodnom obliku ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli (videti takođe gore). Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na derivat otkrivenih peptida gde je peptid modifikovan stvaranjem kiselih ili baznih soli agensa. Na primer, kisele soli se pripremaju iz slobodne baze (tipično gde neutralni oblik leka ima neutralnu -NH2 grupu) uključujući reakciju sa odgovarajućom kiselinom. Pogodne kiseline za pripremu kiselih soli uključuju kako organske kiseline, npr., sirćetnu kiselinu, propionsku kiselinu, glikolnu kiselinu, pirogrožđanu kiselinu, oksalnu kiselinu, jabučnu kiselinu, malonsku kiselinu, ćilibarnu kiselinu, maleinsku kiselinu, fumarnu kiselinu, vinsku kiselinu, limunsku kiselinu, benzojevu kiselinu, cimetnu kiselinu, bademovu kiselinu, metan sulfonsku kiselinu, etan sulfonsku kiselinu, p-toluensulfonsku kiselinu, salicilnu kiselinu i slično, tako i neorganske kiseline, npr., hlorovodoničnu kiselinu, bromovodoničnu kiselinu, sumpornu kiselinu, azotnu kiselinu, fosfornu kiselinu i slično. Suprotno tome, priprema baznih soli kiselih grupa koje mogu biti prisutne na peptidu se priprema korišćenjem farmaceutski prihvatljive baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalcijum hidroksid, trimetilamin ili slično.

[0152] Ovaj pronalazak se odnosi na peptid koji se ne pojavljuje u prirodi pri čemu se navedeni peptid sastoji od aminokiselinske sekvence prema SEQ ID No: 1 i sintetički je proizveden (npr. sintetisan) kao farmaceutski prihvatljiva so. Postupci za sintetičku proizvodnju peptida su dobro poznati u tehnici. Soli peptida prema ovom pronalasku se značajno razlikuju od peptida u njihovom stanju(ima) in vivo, kao stvoreni peptidi in vivo nemaju soli. Neprirodni oblik soli peptida posreduje u rastvorljivosti peptida, posebno u kontekstu farmaceutskih kompozicija koje sadrže peptide, npr. peptidne vakcine kako su ovde otkrivene. Potrebna je dovoljna i barem značajna rastvorljivost peptida (jednog ili više) da bi se efikasno obezbedili peptidi subjektu koji se leči. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida. Ove soli prema pronalasku obuhvataju alkalne i zemnoalkalne soli kao što su soli Hofmeister serije koje sadrže kao anjone PO4<3->, SO4<2->, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3-, ClO4-, I-, SCN<->i kao katjone NH4<+>, Rb<+>, K<+>, Na<+>, Cs<+>, Li<+>, Zn<2+>, Mg<2+>, Ca<2+>, Mn<2+>, Cu<2+>i Ba<2+>. Posebno se soli biraju od (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)H2PO4, (NH4)2SO4, NH4CH3COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4ClO4, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO4, RbH2PO4, Rb2SO4, Rb4CH3COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4ClO4, Rb4I, Rb4SCN, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, KCH3COO, KCl, KBr, KNO3, KClO4, KI, KSCN, Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, NaClO4, NaI, NaSCN, ZnCl2Cs3PO4, Cs2HPO4, CsH2PO4, Cs2SO4, CsCH3COO, CsCl, CsBr, CsNO3, CsClO4, Csl, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, LiH2PO4, Li2SO4, LiCH3COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO4, Lil, LiSCN, Cu2SO4, Mg3(PO4)2, Mg2HPO4, Mg(H2PO4)2, Mg2SO4, Mg(CH3COO)2, MgCl2, MgBr2, Mg(NO3)2, Mg(ClO4)2, MgI2, Mg(SCN)2, MnCl2, Ca3(PO4), Ca2HPO4, Ca(H2PO4)2, CaSO4, Ca(CH3COO)2, CaCl2, CaBr2, Ca(NO3)2, Ca(ClO4)2, CaI2, Ca(SCN)2, Ba3(PO4)2, Ba2HPO4, Ba(H2PO4)2, BaSO4, Ba(CH3COO)2, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)2, Ba(ClO4)2, BaI2i Ba(SCN)2. Posebno su poželjni NH acetat, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl i CaCl2, kao što su, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetatne) soli.

[0153] U posebno poželjnom primeru izvođenja, farmaceutske kompozicije sadrže peptide ili TCR proteine kao soli sirćetne kiseline (acetati), trifluoroacetati ili hlorovodonične kiseline (hloridi).

[0154] Dodatni aspekt opisa obezbeđuje nukleinsku kiselinu (na primer polinukleotid) koja kodira peptid i TCR protein i TCR varijante opisa. Polinukleotid može biti, na primer, DNK, cDNK, PNA, RNK ili njihove kombinacije, jednolančani i/ili dvolančani, ili prirodni ili stabilizovani oblici polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatnom osnovom i može ili ne mora da sadrži introne sve dok kodira peptid. Naravno, polinukleotid može kodirati samo peptide koji sadrže prirodne aminokiselinske ostatke spojene prirodnim peptidnim vezama. Dodatni aspekt opisa obezbeđuje ekspresioni vektor sposoban da eksprimira polipeptid prema opisu.

[0155] Razvijeni su različiti postupci za vezivanje polinukleotida, posebno DNK, sa vektorima, na primer preko komplementarnih kohezivnih završetaka. Na primer, komplementarni homopolimerni trakti se mogu dodati segmentu DNK koji će biti inseriran u DNK vektora.

Vektor i DNK segment se zatim spajaju vodoničnom vezom između komplementarnih homopolimernih repova da bi se formirali rekombinantni DNK molekuli.

[0156] Sintetički linkeri koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju alternativni postupak pridruživanja segmenta DNK vektorima. Sintetički linkeri koji sadrže različita mesta restrikcione endonukleaze su komercijalno dostupni iz brojnih izvora uključujući International Biotechnologies Inc. New Haven, CN, USA.

[0157] Poželjan postupak modifikacije DNK koja kodira polipeptid iz opisa koristi lančanu reakciju polimeraze kako je otkrio Saiki RK, et al. (Saiki et al., 1988). Ovaj postupak se može koristiti za uvođenje DNK u pogodan vektor, na primer inženjeringom na odgovarajućim restrikcionim mestima, ili se može koristiti za modifikovanje DNK na druge korisne načine koji su poznati u tehnici. Ako se koriste virusni vektori, poželjni su vektori boginja ili adenovirusa.

[0158] DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) se zatim može eksprimirati u odgovarajućem domaćinu da bi se proizveo polipeptid koji sadrži peptid ili varijantu iz opisa. Prema tome, DNK koja kodira peptid ili varijantu opisa može da se koristi u skladu sa poznatim tehnikama, na odgovarajući način modifikovanim s obzirom na učenja koja su ovde sadržana, da se konstruiše ekspresioni vektor, koji se zatim koristi za transformaciju odgovarajuće ćelije domaćina za ekspresiju i proizvodnju polipeptida iz opisa. Takve tehnike uključuju one koje su otkrivene, na primer, u US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075, i 4,810,648.

[0159] DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptid koji čini jedinjenje iz opisa može se spojiti sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Prateća DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina i da li se želi epizomalno održavanje ili integracija.

[0160] Generalno, DNK se inserira u ekspresioni vektor, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i ispravnom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je potrebno, DNK može biti povezana sa odgovarajućim transkripcionim i translacionim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u ekspresionom vektoru. Vektor se zatim uvodi u domaćina standardnim tehnikama. Generalno, neće svi domaćini biti transformisani vektorom. Zbog toga će biti neophodno izabrati transformisane ćelije domaćina. Jedna tehnika selekcije uključuje ugrađivanje u ekspresioni vektor sekvence DNK, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira selektabilnu osobinu u transformisanoj ćeliji, kao što je rezistencija na antibiotike.

[0161] Alternativno, gen za takvu selektivnu osobinu može biti na drugom vektoru, koji se koristi za ko-transformaciju željene ćelije domaćina.

[0162] Ćelije domaćini koje su transformisane rekombinantnom DNK iz opisa se zatim kultivišu dovoljno vremena i pod odgovarajućim uslovima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti s obzirom na učenja koja su ovde otkrivena da bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji se zatim može izolovati.

[0163] Poznati su mnogi ekspresioni sistemi, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasac (npr. Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljive (npr. Aspergillus spec.), biljne T-ćelije, životinjske ćelije i T-ćelije insekata. Poželjno, sistem mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC Cell Biology Collection.

[0164] Tipični vektorski plazmid ćelije sisara za konstitutivnu ekspresiju sadrži promotor CMV ili SV40 sa odgovarajućim poli A repom i markerom rezistencije, kao što je neomicin. Jedan primer je pSVL dostupan od Pharmacia, Piscataway, NJ, SAD. Primer inducibilnog vektora ekspresije sisara je pMSG, takođe dostupan iz Pharmacia. Korisni plazmidni vektori kvasca su pRS403-406 i pRS413-416 i generalno su dostupni od Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Plazmidi pRS403, pRS404, pRS405 i pRS406 su plazmidi koji integrišu kvasac (Ylps) i ugrađuju kvaščeve selektabilne markere HIS3, TRP1, LEU2 i URA3. Plazmidi pRS413-416 su plazmidi centromere kvasca (Ycps). Vektori zasnovani na CMV promotoru (na primer od Sigma-Aldrich) obezbeđuju prolaznu ili stabilnu ekspresiju, citoplazmatsku ekspresiju ili sekreciju, i N-terminalno ili C-terminalno obeležavanje u različitim kombinacijama FLAG, 3xFLAG, c-myc ili MAT. Ovi fuzioni proteini omogućavaju detekciju, prečišćavanje i analizu rekombinantnog proteina. Dvostruko-obeležene fuzije pružaju fleksibilnost u detekciji.

[0165] Regulatorni region promotora snažnog humanog citomegalovirusa (CMV) pokreće nivoe ekspresije konstitutivnih proteina čak do 1 mg/L u COS ćelijama. Za manje potentne ćelijske linije, nivoi proteina su tipično -0.1 mg/L. Prisustvo oridžina replikacije SV40 će rezultirati visokim nivoima replikacije DNK u COS ćelijama koje dozvoljavaju replikaciju SV40. CMV vektori, na primer, mogu da sadrže pMB1 (derivat pBR322) oridžin replikacije u bakterijskim ćelijama, gen b-laktamaze za selekciju otpornosti na ampicilin kod bakterija, hGH poliA i f1 oridžin. Vektori koji sadrže pre-pro-tripsin lidersku (PPT) sekvencu mogu usmeriti sekreciju FLAG fuzionih proteina u medijum kulture za prečišćavanje korišćenjem ANTI-FLAG antitela, smola i ploča. Drugi vektori i ekspresioni sistemi su dobro poznati u tehnici za upotrebu sa različitim ćelijama domaćinima.

[0166] Ovde su otkrivena dva ili više peptida ili peptidnih varijanti opisa koji su kodirani i na taj način eksprimirani uzastopnim redosledom (slično konstruktima "perle na nizu"). Pri tome, peptidi ili varijante peptida mogu biti povezani ili spojeni zajedno pomoću nizova aminokiselina linkera, kao što je na primer LLLLLL, ili mogu biti vezani bez ikakvih dodatnih peptida između njih. Ovi konstrukti se takođe mogu koristiti za terapiju kancera i mogu izazvati imuni odgovor koji uključuje i MHC I i MHC II.

[0167] Ovde je takođe otkrivena ćelija domaćina transformisana polinukleotidnom vektorskom konstrukcijom ovog opisa. Ćelija domaćin može biti ili prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti poželjne prokariotske ćelije domaćina u nekim okolnostima i tipično su soj E. coli kao što je, na primer, E. coli sojevi DH5 dostupni iz Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SAD, i RR1 koji je dostupan iz American Type Culture Collection (ATCC) iz Rockville, MD, SAD (br. ATCC 31343). Poželjne ćelije domaćina eukariota obuhvataju ćelije kvasca, insekata i sisara, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su one iz fibroblastičnih i ćelijskih linija miša, pacova, majmuna ili čoveka. Ćelije domaćini kvasca uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koji su generalno dostupni od Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Poželjne ćelije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) dostupne od ATCC kao CCL61, NIH švajcarske ćelije embriona miša NIH/3T3 dostupne od ATCC kao CRL 1658, ćelije COS-1 izvedene iz bubrega majmuna dostupne od ATCC5 kao CRL16 i 293 ćelije koje su ćelije bubrega humanog embriona. Poželjne ćelije insekata su ćelije Sf9 koje se mogu transfektovati vektorima ekspresije bakulovirusa. Pregled u vezi sa izborom odgovarajućih ćelija domaćina za ekspresiju može se naći u, na primer, udžbeniku Paulina Balbas and Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols," Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9 i drugoj literaturi poznatoj stručnjaku iz date oblasti tehnike.

[0168] Transformacija odgovarajućih ćelija domaćina sa DNK konstruktom ovog opisa se postiže dobro poznatim postupcima koji tipično zavise od tipa korišćenog vektora. Što se tiče transformacije prokariotskih ćelija domaćina, videti, na primer, Cohen et al. (Cohen et al., 1972) i (Green and Sambrook, 2012). Transformacija ćelija kvasca je opisana u Sherman et al. (Sherman et al., 1986). Koristan je i Beggs-ov postupak (Beggs, 1978). Što se tiče ćelija kičmenjaka, reagensi korisni u transfekciji takvih ćelija, na primer formulacije kalcijum fosfata i DEAE-dekstrana ili lipozoma, dostupni su od Stratagene Cloning Systems, ili Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, SAD. Elektroporacija je takođe korisna za transformaciju i/ili transfekciju ćelija i dobro je poznata u tehnici za transformaciju kvaščevih T-ćelija, bakterijskih ćelija, T-ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.

[0169] Uspešno transformisane ćelije, tj. ćelije koje sadrže DNK konstrukt ovog opisa, mogu se identifikovati dobro poznatim tehnikama kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu se može detektovati korišćenjem antitela.

[0170] Biće jasno da su određene ćelije domaćini iz opisa korisne u pripremi peptida iz opisa, na primer bakterijske ćelije, ćelije kvasca i T-ćelije insekata. Međutim, druge ćelije domaćini mogu biti korisne u određenim terapijskim postupcima. Na primer, ćelije koje predstavljaju antigen, kao što su dendritske ćelije, mogu se korisno upotrebljavati za ekspresiju peptida iz opisa tako da se mogu puniti u odgovarajuće MHC molekule. Prema tome, trenutni opis obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu ili ekspresioni vektor prema opisu.

[0171] U nekim slučajevima ćelija domaćina je ćelija koja prikazuje antigen, posebno dendritska ćelija ili ćelija koja prikazuje antigen. APC napunjene rekombinantnim fuzionim proteinom koji sadrži fosfatazu prostate (PAP) odobrila je Američka uprava za hranu i lekove (FDA) 29. aprila 2010. za lečenje asimptomatskih ili minimalno simptomatskih metastatskih HRPC (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

[0172] Ovde je takođe otkriven postupak proizvodnje peptida ili njegove varijante, postupak koji sadrži kultivisanje ćelije domaćina i izolovanje peptida iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kulturu.

[0173] U sledećem primeru izvođenja TCR proteini, nukleinska kiselina ili ekspresioni vektor iz opisa se koriste u medicini. Na primer, peptid se može pripremiti za intravensku (i.v.) injekciju, subkutanu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Primeri postupaka injektiranja peptida uključuju s.c., i.d., i.p., i.m., i i.v. Primeri postupaka injektiranja DNK uključuju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Mogu se dati doze od npr., između 50 µg i 1.5 mg, poželjno 125 µg do 500 µg, peptida ili DNK i zavisiće od odgovarajućeg peptida ili DNK. Doze ovog opsega su uspešno korišćene u prethodnim ispitivanjima (Walter et al., 2012).

[0174] Polinukleotid koji se koristi za aktivnu vakcinaciju može biti suštinski čist ili sadržan u odgovarajućem vektoru ili sistemu za isporuku. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, PNA, RNK ili njihova kombinacija. Postupci za projektovanje i uvođenje takve nukleinske kiseline su dobro poznati u tehnici. Prikaz je obezbeđen npr., Teufel et al. (Teufel et al., 2005). Polinukleotidne vakcine se lako pripremaju, ali način delovanja ovih vektora u izazivanju imunološkog odgovora nije u potpunosti shvaćen. Pogodni vektori i sistemi za isporuku obuhvataju virusnu DNK i/ili RNK, kao što su sistemi zasnovani na adenovirusu, virusu vakcinije, retrovirusima, virusu herpesa, adeno-povezanom virusu ili hibridima koji sadrže elemente više od jednog virusa. Nevirusni sistemi isporuke uključuju katjonske lipide i katjonske polimere i dobro su poznati u struci isporuke DNK. Može se koristiti i fizička isporuka, kao što je preko "genskog pištolja". Peptid ili peptidi kodirani nukleinskom kiselinom mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T-ćelije za odgovarajući suprotni CDR kao što je gore navedeno.

[0175] Lek iz opisa takođe može uključivati jedan ili više pomoćnih sredstava. Ađuvansi su supstance koje nespecifično pojačavaju ili potenciraju imuni odgovor (npr., imuni odgovori posredovani CD8-pozitivnim T-ćelijama i pomoćnim-T (TH) ćelijama na antigen, i stoga bi se smatrali korisnim u leku ovog opisa. Pogodni ađuvansi uključuju, ali nisu ograničeni na, 1018 ISS, soli aluminijuma, AMPLIVAX<®>, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelin ili TLR5 ligande izvedene iz flagelina, FLT3 ligand, GM-CSF, IC30, IC31, imikvimod (ALDARA<®>), resikvimod, ImuFact IMP321, interleukine kao IL-2, IL-13, IL-21, interferonalfa ili -beta, ili njihove pegilovane derivate, IS flaster, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune<®>, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipid A, Montanid IMS 1312, Montanid ISA 206, Montanid ISA 50V, Montanid ISA-51, emulzije voda u ulju i ulje u vodi, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel<®>vektorski sistem, mikročestice na bazi poli(laktidnog ko-glikolida) [PLG] i dekstrana, talaktoferin SRL172, virozome i druge čestice slične virusima, YF-17D, VEGF zamka, R848, beta-glukan, Pam3Cys, Aquila-ov QS21 stimulon, koji je poreklom od saponina, mikobakterijskih ekstrakata i sintetičkih imitacija ćelijskog zida bakterija, i drugih zaštićenih ađuvanasa kao što su Ribi-ev Detox, Quil ili Superfos. Poželjni su ađuvansi kao što su Freund-ov ili GM-CSF. Nekoliko imunoloških pomoćnih sredstava (npr., MF59) specifičnih za dendritske ćelije i njihova priprema su prethodno opisani (Allison and Krummel, 1995). Takođe se mogu koristiti citokini. Nekoliko citokina je direktno povezano sa uticajem na migraciju dendritskih ćelija u limfoidna tkiva (npr., TNF-), ubrzavajući sazrevanje dendritskih ćelija u efikasne ćelije koje predstavljaju antigen za T-limfocite (npr., GM-CSF, IL-1 i IL-4) (U.S. Pat. br: 5,849,589) i deluju kao imunoađuvansi (npr., IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa. IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996).

[0176] Takođe je prijavljeno da CpG imunostimulatorni oligonukleotidi pojačavaju efekte ađuvansa u postavci vakcine. Bez veze sa teorijom, CpG oligonukleotidi deluju tako što aktiviraju urođeni (neadaptivni) imuni sistem preko Toll-sličnog receptora (TLR), uglavnom TLR9. CpG aktivirana TLR9 aktivacija poboljšava humoralne i ćelijske odgovore specifične za antigen na širok spektar antigena, uključujući peptidne ili proteinske antigene, žive ili ubijene viruse, vakcine dendritskih ćelija, autologne ćelijske vakcine i polisaharidne konjugate u profilaktičkim i terapijskim lekovima. Što je još važnije, poboljšava sazrevanje i diferencijaciju dendritskih ćelija, što rezultira pojačanom aktivacijom TH1 ćelija i snažnim generisanjem citotoksičnih T-limfocita (CTL), čak i u odsustvu pomoći CD4 T-ćelija. TH1 pristrasnost izazvana TLR9 stimulacijom se održava čak i u prisustvu ađuvansa vakcine kao što je stipsa ili nekompletan Freund-ov ađuvans (IFA) koji normalno stimuliše TH2 pristrasnost. CpG oligonukleotidi pokazuju još veću ađuvantnu aktivnost kada su formulisani ili zajedno sa drugim ađuvansima ili u formulacijama kao što su mikročestice, nanočestice, lipidne emulzije ili slične formulacije, koje su posebno neophodne za izazivanje snažnog odgovora kada je antigen relativno slab. Oni takođe ubrzavaju imuni odgovor i omogućavaju da se doze antigena smanje za približno dva reda veličine, sa uporedivim odgovorima antitela na vakcinu pune doze bez CpG u nekim eksperimentima (Krieg, 2006). US 6,406,705 B1 opisuje kombinovanu upotrebu CpG oligonukleotida, ađuvansa ne-nukleinske kiseline i antigena da bi se indukovao antigen-specifičan imuni odgovor. Antagonist CpG TLR9 je dSL1M (imunomodulator dvostruke petlje) od Mologen (Berlin, Nemačka) koji je poželjna komponenta farmaceutske kompozicije ovog opisa. Mogu se koristiti i drugi TLR vezujući molekuli kao što su TLR 7, TLR 8 i/ili TLR 9.

[0177] Drugi primeri korisnih ađuvanasa uključuju, ali nisu ograničeni na hemijski modifikovane CpG (npr., CpR, Idera), analoge dsRNA kao što je Poli(I:C) i njihove derivate (npr., AmpliGen<®>, Hiltonol<®>, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), ne-CpG bakterijska DNK ili RNK, kao i imunoaktivni mali molekuli i antitela kao što su ciklofosfamid, sunitinib, Bevacizumab<®>, celebreks, NCX-4016, sildenafil, tadalafil, vardenafil, sorafenib, temozolomid, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, drugi anti-CTLA sistem ciljnog delovanja, strukturu protiv imunog sistema, npr., anti-CD40, anti-TGFbeta, anti-TNFalfa receptor) i SC58175, koji mogu delovati terapeutski i/ili kao pomoćno sredstvo. Količine i koncentracije pomoćnih sredstava i aditiva korisnih u kontekstu predmetnog opisa može lako odrediti stručnjak bez nepotrebnog eksperimentisanja.

[0178] Poželjni ađuvansi su anti-CD40, imikvimod, resikvimod, GM-CSF, ciklofosfamid, sunitinib, bevacizumab, interferon-alfa, CpG oligonukleotidi i derivati, poli-(I:C) i derivati, RNK, sildenafil i PLG ili formulacije virozoma.

[0179] U poželjnom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije prema opisu, pomoćno sredstvo je izabrano iz grupe koja se sastoji od faktora koji stimulišu koloniju, kao što su faktor stimulacije kolonije granulocitnih makrofaga (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamid, imikvimod, resikvimod i interferon-alfa.

[0180] U poželjnom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije prema opisu, ađuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije kolonije makrofaga granulocita (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamid, imikvimod i resikvimod. U poželjnom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije prema opisu, pomoćno sredstvo je ciklofosfamid, imikvimod ili resikvimod. Još poželjniji ađuvansi su Montanid IMS 1312, Montanid ISA 206, Montanid ISA 50V, Montanid ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol<®>) i anti-CD40 mAB, ili njihove kombinacije.

[0181] Ova kompozicija se koristi za parenteralnu primenu, kao što je subkutana, intradermalna, intramuskularna ili oralna primena. Za ovo, peptidi i izborno drugi molekuli su rastvoreni ili suspendovani u farmaceutski prihvatljivom, poželjno vodenom nosaču. Pored toga, kompozicija može da sadrži ekscipijense, kao što su puferi, vezujuća sredstva, sredstva za peskarenje, razblaživači, arome, lubrikanti, itd. Peptidi se takođe mogu primenjivati zajedno sa supstancama koje stimulišu imunitet, kao što su citokini. Opsežan spisak ekscipijenasa koji se mogu koristiti u takvoj kompoziciji može se, na primer, uzeti iz A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). Kompozicija se može koristiti za prevenciju, profilaksu i/ili terapiju adenomatoznih ili kanceroznih bolesti. Primeri formulacija mogu se naći u na pruimer, EP2112253.

[0182] Važno je shvatiti da imuni odgovor izazvan vakcinom prema opisu napada kancer u različitim ćelijskim fazama i različitim fazama razvoja. Pored toga, napadnuti su različiti signalni putevi povezani sa kancerom. Ovo je prednost u odnosu na vakcine koje pogađaju samo jedno ili nekoliko ciljnih mesta, što može dovesti do toga da se tumor lako prilagodi napadu (izbegavanje tumora). Pored toga, ne eksprimiraju svi pojedinačni tumori isti obrazac antigena. Prema tome, kombinacija nekoliko peptida povezanih sa tumorom osigurava da svaki pojedinačni tumor nosi bar neke od ciljnih mesta. Kompozicija je dizajnirana na takav način da se od svakog tumora očekuje da eksprimira nekoliko antigena i pokriva nekoliko nezavisnih puteva neophodnih za rast i održavanje tumora. Dakle, vakcina se lako može koristiti "gotova" za veću populaciju pacijenata. To znači da se pred-selekcija pacijenata koji će biti lečeni vakcinom može biti ograničena na HLA tipizaciju, ne zahteva nikakve dodatne procene biomarkera za ekspresiju antigena, ali je i dalje osigurano da nekoliko ciljnih mesta bude istovremeno napadnuto izazvanim imunološkim odgovorom, što je važno za efikasnost (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

[0183] Kako se ovde koristi, termin "osnova" se odnosi na molekul koji se specifično vezuje za (npr., antigenu) determinantu. U jednom primeru izvođenja, osnova je u stanju da usmerava entitet za koji je pričvršćena (npr., (druga) grupa koja se vezuje za antigen) na ciljno mesto, na primer na specifičan tip tumorske ćelije ili tumorsku stromu koja nosi antigenu determinantu (npr., kompleks peptida sa MHC, prema primeni). U sledećem primeru izvođenja, osnova je u stanju da aktivira signalizaciju preko svog ciljnog antigena, na primer antigena kompleksa receptora T-ćelija. Osnove uključuju, ali nisu ograničene na antitela i njihove fragmente, domene antitela koji se vezuju za antigen, koji sadrže varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca antitela, vezujuće proteine koji sadrže najmanje jedan motiv ponavljanja ankirina i molekule (SDAB) koji vezuju antigen sa jednim domenom, aptamere, (rastvorljive) TCR i (modifikovane) ćelije kao što su alogene ili autologne T-ćelije. Da bi se procenilo da li je molekul osnova vezivanja za ciljno mesto, mogu se izvršiti testovi vezivanja.

[0184] „Specifično“ vezivanje znači da osnova vezuje peptid-MHC-kompleks od interesa bolje od drugih prirodnih peptidnih-MHC-kompleksa, do te mere da osnova naoružana aktivnim molekulom koji je u stanju da ubije ćeliju koja nosi specifično ciljno mesto nije u stanju da ubije drugu ćeliju bez specifičnog ciljnog mesta, ali predstavlja drugi peptid-MHC kompleks(e). Vezivanje za druge komplekse peptid-MHC je irelevantno ako se peptid unakrsno reaktivnog peptida-MHC ne pojavljuje u prirodi, tj. nije izveden iz humanog HLA-peptidoma. Testovi za procenu ubijanja ciljnih ćelija su dobro poznati u tehnici. Trebalo bi da se izvode korišćenjem ciljnih ćelija (primarne ćelije ili ćelijske linije) sa nepromenjenim prikazom peptida-MHC, ili ćelijama napunjenim peptidima tako da se dostignu nivoi peptida-MHC koji se javljaju u prirodi.

[0185] Svaka osnova može sadržati obeležavanje koje obezbeđuje da se vezana osnova može detektovati određivanjem prisustva ili odsustva signala obezbeđenog obeleživačem. Na primer, osnova može biti obeležena fluorescentnom bojom ili bilo kojim drugim primenljivim ćelijskim molekulom markera. Takvi molekuli markera su dobro poznati u tehnici. Na primer, fluorescentno obeležavanje, na primer obezbeđeno fluorescentnom bojom, može da obezbedi vizuelizaciju vezanog aptamera pomoću fluorescentne ili laserske skenirajuće mikroskopije ili protočne citometrije.

[0186] Svaka skela može biti konjugovana sa drugim aktivnim molekulom kao što je na primer IL-21, anti-CD3 i anti-CD28.

[0187] Za dalje informacije o polipeptidnim osnovama videti na primer odeljak o osnovi WO 2014/071978A1 i reference koje su tamo citirane.

[0188] Ovde su otkriveni i aptameri. Aptameri (videti na primer WO 2014/191359 i literatura kako je tamo citirana) su kratki jednolančani molekuli nukleinske kiseline, koji se mogu savijati u definisane trodimenzionalne strukture i prepoznati specifične ciljne strukture. Činilo se da su pogodne alternative za razvoj ciljanih terapija. Pokazalo se da se aptameri selektivno vezuju za različita kompleksna ciljna mesta sa visokim afinitetom i specifičnošću.

[0189] Aptameri koji prepoznaju molekule locirane na površini ćelije identifikovani su u protekloj deceniji i obezbeđuju sredstva za razvoj dijagnostičkih i terapijskih pristupa. Pošto se pokazalo da aptameri nemaju skoro nikakvu toksičnost i imunogenost, oni su obećavajući kandidati za biomedicinsku primenu. Zaista, aptameri, na primer aptameri koji prepoznaju membranski antigen za prostatu, uspešno su korišćeni za ciljane terapije i pokazali su se funkcionalnim u in vivo modelima ksenotransplantata. Pored toga, identifikovani su aptameri koji prepoznaju specifične tumorske ćelijske linije.

[0190] DNK aptameri mogu biti izabrani da otkriju svojstva širokog spektra prepoznavanja za različite ćelije kancera, a posebno one izvedene iz solidnih tumora, dok se ne-tumorogene i primarno zdrave ćelije ne prepoznaju. Ako identifikovani aptameri prepoznaju ne samo specifičan podtip tumora, već radije komuniciraju sa nizom tumora, to čini aptamere primenljivim kao takozvana dijagnostika i terapeutika širokog spektra.

[0191] Pored toga, ispitivanje ponašanja vezivanja ćelija pomoću protočne citometrije pokazalo je da su aptameri otkrili veoma dobre očigledne afinitete koji su unutar nanomolarnog opsega.

[0192] Aptameri su korisni u dijagnostičke i terapeutske svrhe. U jednom aspektu, najmanje jedan ili više aptamera preuzimaju tumorske ćelije i na taj način mogu funkcionisati kao molekularni nosači za ciljanu isporuku sredstava protiv kancera kao što je siRNA u tumorske ćelije.

[0193] Aptameri se mogu birati protiv kompleksnih ciljnih mesta kao što su ćelije i tkiva i kompleksi peptida u skladu sa opisom sa MHC molekulom, koristeći tehniku ćelija-SELEX (Sistematska evolucija liganada eksponencijalnim obogaćivanjem).

[0194] Peptidi ovog opisa mogu se koristiti za generisanje i razvoj specifičnih antitela protiv MHC/peptidnih kompleksa. Oni se mogu koristiti za terapiju, ciljno delujući na toksine ili radioaktivne supstance na obolelo tkivo. Druga upotreba ovih antitela može biti ciljno delovanje radionuklida na obolelo tkivo u svrhe snimanja kao što je PET. Ova upotreba može pomoći da se otkriju male metastaze ili da se odredi veličina i precizna lokalizacija obolelih tkiva.

[0195] Prema tome, ovde je takođe otkriven postupak za proizvodnju rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) klase I ili II koji se stvara u kompleksu sa HLA-restrikcionim antigenom, a postupak sadrži: imunizaciju genetski modifikovanog sisara koji nije čovek koji sadrži ćelije koje eksprimiraju pomenuti humani glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) klase I ili II sa rastvorljivim oblikom molekula MHC klase I ili II koji se stvara u kompleksu sa navedenim HLA-restrikcionim antigenom; izolovanje iRNK molekula iz ćelija koje proizvode antitela pomenutog sisara koji nije čovek; proizvodnju biblioteke fagnog prikaza koja prikazuje proteinske molekule kodirane navedenim molekulima iRNK; i izolovanje najmanje jednog faga iz pomenute biblioteke za prikaz faga, pri čemu je navedeni najmanje jedan fag koji pokazuje da se pomenuto antitelo specifično vezuje za pomenuti humani glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) klase I ili II u kompleksu sa navedenim HLA-restrikcionim antigenom.

[0196] Dodatni aspekt pronalaska je da obezbedi antitelo koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) klase I koje je u kompleksu sa HLA-restrikcionim antigenom, SEQ ID NO:1, gde je antitelo poželjno poliklonsko antitelo, monoklonsko antitelo, bi-specifično antitelo i/ili himerno antitelo.

[0197] Odgovarajući postupci za proizvodnju takvih antitela i jednolančanih glavnih kompleksa histokompatibilnosti klase I, kao i drugi alati za proizvodnju ovih antitela su otkriveni u WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, i u publikacijama (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003).

[0198] Poželjno, antitelo se vezuje sa afinitetom vezivanja ispod 20 nanomola, poželjno ispod 10 nanomola, za kompleks, što se takođe smatra "specifičnim" u kontekstu ovog opisa.

[0199] Ovaj pronalazak se odnosi na TCR protein ili njegovu varijantu ili funkcionalni fragment koji se specifično vezuje za MAG-003.

[0200] Ovaj opis se dalje odnosi na TCR protein prema opisu, pri čemu je TCR protein (hemijski) modifikovan i/ili uključuje nepeptidne veze.

[0201] Ovaj opis se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu, koja kodira TCR proteine prema opisu, pod uslovom da TCR protein nije kompletan (pun) humani protein.

[0202] Ovaj opis se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu prema opisu koja je DNK, cDNK, PNA, RNK ili njihove kombinacije.

[0203] Ovaj opis se dalje odnosi na ekspresioni vektor sposoban da eksprimira nukleinsku kiselinu prema predmetnom opisu.

[0204] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na TCR protein prema predmetnom pronalasku, nukleinsku kiselinu prema predmetnom opisu ili ekspresioni vektor prema predmetnom opisu za upotrebu u lečenju nesitnoćelijskog kancera pluća.

[0205] Ovde je otkrivena ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu prema opisu ili ekspresioni vektor prema opisu.

[0206] Pored toga, ovde je otkrivena ćelija domaćin prema ovom opisu koja je T-ćelija, a poželjno je CD8-pozitivna T-ćelija ili CD4-pozitivna T-ćelija.

[0207] Predmetni opis se dalje odnosi na postupak proizvodnje TCR proteina u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu pomenuti postupak sadrži inkubaciju PBMCs od HLA-A*02-negativnih zdravih donora sa A2/MAG-003 monomerima, inkubiranje PBMC sa tetramerfikoeritrinom ( PE) i izolovanje T-ćelija visoke avidnosti fluorescentno aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS)-Calibur analizom.

[0208] Ovde je takođe otkriven postupak za proizvodnju TCR proteina, pri čemu pomenuti postupak sadrži inkubaciju PBMC iz HLA-A*02-negativnih zdravih donora sa A2/p286-1Y2L monomerima, inkubaciju PBMC sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolovanje T-ćelija visoke avidnosti sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS)-Calibur analize.

[0209] Ovde je takođe otkriven postupak proizvodnje TCR proteina, pri čemu pomenuti postupak sadrži inkubaciju PBMC iz HLA-A*02-negativnih zdravih donora sa A2/p286-1Y2L9L monomerima, inkubaciju PBMC sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolovanje T-čelija visoke avidnosti sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS)-Calibur analizom.

[0210] Predmetni opis se dalje odnosi na postupak proizvodnje TCR proteina u skladu sa ovim opisom, pri čemu navedeni postupak sadrži dobijanje transgenog miša sa celim lokusima humanog TCRαβ gena (1.1 i 0.7 Mb), čije T-ćelije eksprimiraju raznolik humani TCR repertoar koji kompenzuje deficijenciju mišjeg TCR, imunizaciju miša sa MAG-003, inkubiranje PBMC dobijenih od transgenih miševa sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolovanje T-ćelija visoke avidnosti fluorescentno aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS)-Calibur analizom.

[0211] Ovde je takođe otkriven postupak proizvodnje TCR proteina, pri čemu pomenuti postupak sadrži dobijanje transgenog miša sa celim humanim lokusima TCRαβ gena (1.1 i 0.7 Mb), čije T-ćelije eksprimiraju raznolik humani TCR repertoar koji kompenzuje nedostatak TCR kod miša, imunizaciju miša sa p286-1Y2L, inkubaciju PBMC dobijenih od transgenih miševa sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolovanje T-ćelija visoke avidnosti fluorescentno aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS)-Calibur analizom.

[0212] Ovde je takođe otkriven postupak proizvodnje TCR proteina, pri čemu pomenuti postupak sadrži dobijanje transgenog miša sa celim humanim lokusima TCRαβ gena (1.1 i 0.7 Mb), čije T-ćelije eksprimiraju raznolik humani TCR repertoar koji kompenzuje nedostatak TCR kod miša, imunizaciju miša sa p286-1Y2L9L, inkubaciju PBMC dobijenih od transgenih miševa sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolovanje T-ćelija visoke avidnosti fluorescentno aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS)-Calibur analizom.

[0213] Ovde je takođe otkriven postupak ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju MAG-003, pri čemu postupak sadrži primenu na pacijenta efikasnog broja T-ćelija.

[0214] Ovde je takođe otkrivena upotreba bilo kog opisanog TCR proteina, nukleinske kiseline prema ovom opisu, ekspresionog vektora prema predmetnom opisu, ćelije prema predmetnom opisu, ili aktiviranog citotoksičnog T limfocita prema predmetnom opisu kao leka ili u proizvodnji leka. Otkrivena je takođe upotreba prema predmetnom opisu, pri čemu je lek aktivan protiv kancera. Ovaj pronalazak se odnosi na peptid, TCR, antitelo ili farmaceutsku kompoziciju prema ovom pronalasku, za upotrebu u lečenju NSCLC ili SCLC.

[0215] Ovde je otkrivena i upotreba u skladu sa opisom, pri čemu navedene ćelije kancera su ćelije solidnog ili hematološkog tumora kao što je kancer bubrežnih ćelija, kancer mozga, kancer želuca, kolorektalni kancer, hepatocelularni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, leukemija, kancer dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, kancer jajnika, kancer mokraćne bešike, kancer materice, kancer žučne kese i žučnih kanala i kancer jednjaka.

[0216] Predmetni opis se dalje odnosi na određene markere proteine i biomarkere zasnovane na peptidima prema predmetnom opisu, koji se ovde nazivaju "ciljna mesta" koji se mogu koristiti u dijagnozi i/ili prognozi nesitnoćelijskog kancer pluća. Ovaj opis se takođe odnosi na upotrebu ovih novih ciljnih mesta za lečenje kancera.

[0217] Termin "antitelo" ili "antitela" se ovde koristi u širem smislu i uključuje i poliklonska i monoklonska antitela. Pored intaktnih ili "punih" molekula imunoglobulina, u termin "antitela" su takođe uključeni fragmenti (npr., CDR, Fv, Fab i Fc fragmenti) ili polimeri tih molekula imunoglobulina i humanizovane verzije molekula imunoglobulina, sve dok pokazuju bilo koje od željenih svojstava (npr., specifično vezivanje (poli)peptida markera nesitnoćelijskog kancera pluća, isporuka toksina u ćeliju nesitnoćelijskog kancera pluća koja eksprimira gen markera kancera na povećanom nivou, i/ili inhibira aktivnost polipeptida markera nesitnoćelijskog kancera pluća) prema opisu.

[0218] Kad god je moguće, antitela iz opisa mogu se kupiti iz komercijalnih izvora. Antitela iz opisa se takođe mogu generisati korišćenjem dobro poznatih postupaka. Stručnjak će razumeti da se za generisanje antitela iz opisa mogu koristiti ili polipeptidi markeri nesitnoćelijskog kancera pluća pune dužine ili njihovi fragmenti. Polipeptid koji će se koristiti za generisanje antitela iz opisa može biti delimično ili potpuno prečišćen iz prirodnog izvora, ili može biti proizveden upotrebom tehnika rekombinantne DNK.

[0219] Stručnjak u ovoj oblasti će shvatiti da generisanje dva ili više različitih setova monoklonskih ili poliklonalnih antitela maksimizira verovatnoću dobijanja antitela sa specifičnošću i afinitetom potrebnim za njegovu nameravanu upotrebu (npr., ELISA, imunohistohemija, in vivo snimanje, terapija imunotoksinom). Antitela se testiraju na njihovu željenu aktivnost poznatim postupcima, u skladu sa svrhom za koju će se antitela koristiti (npr., ELISA, imunohistohemija, imunoterapija, itd.; za dalje smernice o generisanju i testiranju antitela, videti, npr. Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). Na primer, antitela se mogu testirati ELISA testovima ili Western blotovima, imunohistohemijskim bojenjem kancera fiksiranih sa formalinom ili zamrznutih delova tkiva. Nakon njihove početne in vitro karakterizacije, antitela namenjena terapijskoj ili in vivo dijagnostičkoj upotrebi se testiraju prema poznatim postupcima kliničkog ispitivanja.

[0220] Termin "monoklonsko antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, tj.; pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim mogućih prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela ovde posebno uključuju "himerna" antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču od određene vrste ili pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca(lanaca) identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču od druge vrste ili pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela, sve dok pokazuju željenu antagonističku aktivnost (US 4,816,567).

[0221] Monoklonska antitela iz opisa mogu se pripremiti korišćenjem postupaka hibridoma. U postupku hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin se tipično imunizuje sredstvom za imunizaciju da bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su sposobni da proizvode antitela koja će se specifično vezati za sredstvo za imunizaciju. Alternativno, limfociti mogu biti imunizovani in vitro.

[0222] Monoklonska antitela se takođe mogu napraviti postupcima rekombinantne DNK, kao što su one opisane u US 4,816,567. DNK koja kodira monoklonska antitela iz opisa može se lako izolovati i sekvencirati korišćenjem konvencionalnih postupaka (npr., korišćenjem oligonukleotidnih poba koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela).

[0223] In vitro postupci su takođe pogodni za dobijanje monovalentnih antitela. Digestija antitela da bi se proizveli njihovi fragmenti, posebno Fab fragmenti, može se postići korišćenjem rutinskih tehnika poznatih u tehnici. Na primer, digestija se može obaviti pomoću papaina. Primeri digestije papaina su opisani u WO 94/29348 i US 4,342,566. Digestija antitela papainom tipično proizvodi dva identična fragmenta koji se vezuju za antigen, koji se nazivaju Fab fragmenti, svaki sa jednim mestom za vezivanje antigena i rezidualnim Fc fragmentom. Tretman pepsinom daje F(ab')2 fragment i pFc' fragment.

[0224] Fragmenti antitela, bez obzira da li su vezani za druge sekvence ili ne, takođe mogu uključivati insercije, delecije, supstitucije ili druge odabrane modifikacije određenih regiona ili ostataka specifičnih aminokiselina, pod uslovom da aktivnost fragmenta nije značajno izmenjena ili oslabljena u poređenju sa nemodifikovanim antitelom ili fragmentom antitela. Ove modifikacije mogu da obezbede neka dodatna svojstva, kao što je uklanjanje/dodavanje aminokiselina sposobnih za disulfidno vezivanje, da se poveća njegov biološki vek, da se promene njegove sekretorne karakteristike, itd. U svakom slučaju, fragment antitela mora da poseduje bioaktivno svojstvo, kao što je aktivnost vezivanja, regulacija vezivanja na vezujućem domenu, itd. Funkcionalni ili aktivni regioni antitela mogu se identifikovati mutagenezom specifičnog regiona proteina, nakon čega sledi ekspresija i testiranje eksprimiranog polipeptida. Takvi postupci su očigledni kvalifikovanom stručnjaku u ovoj oblasti i mogu uključiti mutagenezu nukleinske kiseline koja kodira fragment antitela specifičnu za mesto.

[0225] Antitela iz opisa mogu dalje da sadrže humanizovana antitela ili humana antitela. Humanizovani oblici nehumanog (npr., mišjeg) antitela su himerni imunoglobulini, lanci imunoglobulina ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab' ili druge podsekvence antitela koje se vezuju za antigen) koji sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina. Humanizovana antitela obuhvataju humane imunoglobuline (antitelo primaoca) u kojima su ostaci iz komplementarnog određujućeg regiona (CDR) primaoca zamenjeni ostacima iz CDR nehumane vrste (donorsko antitelo) kao što su miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci Fv okvira (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ne-humanim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze ni u antitelu primaoca, niti u uvezenim CDR ili okvirnim sekvencama. Uopšteno govoreći, humanizovano antitelo će sadržati suštinski sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onim ne-humanog imunoglobulina i sve ili suštinski sve FR regione su one konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Optimalno humanizovano antitelo će takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj humanog imunoglobulina.

[0226] Postupci za humanizaciju nehumanih antitela su dobro poznati u tehnici. Generalno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka unetih u njega iz izvora koji nije human. Ovi ostaci aminokiselina koji nisu humani se često nazivaju "uvoznim" ostacima, koji se obično uzimaju iz "uvoznog" varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvesti zamenom CDR regiona ili CDR sekvenci glodara za odgovarajuće sekvence humanog antitela. Shodno tome, takva "humanizovana" antitela su himerna antitela (US 4,816,567), pri čemu je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena zamenjeno odgovarajućom sekvencom iz ne-humane vrste. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci i možda neki FR ostaci supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.

[0227] Kao što je ovde otkriveno, transgene životinje (npr., miševi) koji su sposobni, nakon imunizacije, da proizvode pun repertoar humanih antitela u odsustvu proizvodnje endogenog imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena regiona koji povezuje teški lanac antitela kod himernih i mutantnih miševa klicine linije dovodi do potpune inhibicije proizvodnje endogenog antitela. Transfer gena humane klicine linije imunoglobulina kod takvih mutantnih miševa klicine linije će rezultirati proizvodnjom humanih antitela nakon izazivanja antigena. Humana antitela se takođe mogu proizvesti u bibliotekama za prikaz faga.

[0228] Antitela pronalaska se poželjno primenjuju na subjekta u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Tipično, odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli se koristi u formulaciji da bi se formulacija napravila izotoničnom. Primeri farmaceutski prihvatljivog nosača uključuju fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora je poželjno od oko 5 do oko 8, a poželjnije od oko 7 do oko 7.5. Dodatni nosači uključuju preparate sa produženim oslobađanjem, kao što su polupropusni matriksi čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, koji su u obliku oblikovanih artikala, npr. filmova, lipozoma ili mikročestica. Stručnjacima će biti očigledno da određeni nosači mogu biti poželjniji u zavisnosti od, na primer, načina primene i koncentracije antitela koji se primenjuju.

[0229] Antitela se mogu primenjivati na subjekta, pacijenta ili ćeliju putem injekcije (npr., intravenska, intraperitonealna, subkutana, intramuskularna) ili drugim postupcima kao što je infuzija koje obezbeđuju njihovu isporuku u krvotok u efikasnom obliku. Antitela se takođe mogu primenjivati intratumoralnim ili peritumoralnim putevima, da bi ispoljila lokalne, kao i sistemske terapijske efekte. Poželjna je lokalna ili intravenska injekcija.

[0230] Efikasne doze i rasporedi za primenu antitela mogu se odrediti empirijski, i takvo određivanje je u okviru veštine stručnjaka u ovoj oblasti. Stručnjaci će razumeti da će doza antitela koja se mora primeniti varirati u zavisnosti od, na primer, subjekta koji će primiti antitelo, načina primene, određenog tipa korišćenog antitela i drugih lekova koji se primenjuju. Tipična dnevna doza antitela korišćenog samog može da bude u opsegu od oko 1 (µg/kg do 100 mg/kg telesne težine ili više dnevno, u zavisnosti od faktora navedenih iznad. Nakon primene antitela, poželjno za lečenje nesitnoćelijskog kancera pluća, efikasnost terapeutskog antitela može se proceniti na različite načine koji su dobro poznati kvalifikovanom stručnjaku. Na primer, veličina, broj i/ili distribucija kancera kod subjekta koji se leči može se pratiti korišćenjem standardnih tehnika snimanja tumora. Terapijski primenjeno antitelo koje zaustavlja rast tumora, rezultira smanjenjem tumora i/ili sprečava razvoj novih tumora, u poređenju sa tokom bolesti koji bi se javio u odsustvu primene antitela, je efikasno antitelo za lečenje kancera.

[0231] Ovde je dalje otkriven postupak za proizvodnju rastvorljivog T-ćelijskog receptora (sTCR) koji prepoznaje specifični peptid-MHC kompleks. Takvi rastvorljivi T-ćelijski receptori mogu se generisati iz specifičnih klonova T-ćelija, a njihov afinitet se može povećati mutagenezom koja ciljno deluje na regione koji određuju komplementarnost. U svrhu selekcije receptora T-ćelija, može se koristiti fagni prikaz (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). U cilju stabilizacije T-ćelijskih receptora tokom prikaza faga i u slučaju praktične upotrebe kao leka, mogu se povezati alfa i beta lanac npr., ne-prirodnim disulfidnim vezama, drugim kovalentnim vezama (jednolančani receptor T-ćelija) ili domenima dimerizacije (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T-ćelijski receptor se može vezati sa toksinima, lekovima, citokinima (videti, npr. US 2013/0115191), i domenima koji regrutuju efektorske ćelije kao što je anti-CD3 domen, itd., kako bi izvršili određene funkcije na ciljnim ćelijama. U sledećem aspektu, eksprimiran je u T-ćelijama koje se koriste za adaptivni transfer. Videti, na primer, WO 2004/033685A1, WO 2004/074322A1, i WO 2013/057586A1.

[0232] Pored toga, peptidi i/ili TCR ili antitela ili drugi vezujući molekuli predmetnog opisa mogu se koristiti za verifikaciju dijagnoze kancera patologa na osnovu uzorka biopsije.

[0233] Antitela ili TCR se takođe mogu koristiti za in vivo dijagnostičke testove. Generalno, antitelo je obeleženo radionukleotidom (npr.<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<3>H,<32>P ili<35>S) tako da se tumor može lokalizovati pomoću imunoscintiografije. Antitela ili njihovi fragmenti mogu da se vežu za ekstracelularne domene dva ili više ciljnih mesta proteina izabranih iz grupe koja se sastoji od gore pomenutih proteina, i vrednost afiniteta (Kd) je manja od 1 × 10 µM.

[0234] Antitela za dijagnostičku upotrebu mogu biti obeležena probama pogodnim za detekciju različitim postupcima snimanja. Postupci za detekciju proba uključuju, ali nisu ograničeni na, fluorescentnu, svetlosnu, konfokalnu i elektronsku mikroskopiju; magnetnu rezonancu i spektroskopiju; fluoroskopiju, kompjutersku tomografiju i pozitronsku emisionu tomografiju. Pogodne probe uključuju, ali nisu ograničene na, fluorescein, rodamin, eozin i druge fluorofore, radioizotope, zlato, gadolinijum i druge lantanide, paramagnetno gvožđe, fluor-18 i druge radionuklide koji emituju pozitron. Pored toga, sonde mogu biti dvo- ili multifunkcionalne i mogu se otkriti pomoću više od jednog od navedenih postupaka. Ova antitela mogu biti direktno ili indirektno obeležena navedenim probama. Vezivanje proba na antitela uključuje kovalentno vezivanje probe, ugradnju probe u antitelo i kovalentno vezivanje helatirajućeg jedinjenja za vezivanje probe, što je između ostalog dobro prepoznato u tehnici. Za imunohistohemiju, uzorak obolelog tkiva može biti svež ili zamrznut ili može biti ukalupljen u parafin i fiksiran konzervansom kao što je formalin. Fiksirani ili ukalupljeni isečak koji sadrži uzorak je u kontaktu sa obeleženim primarnim antitelom i sekundarnim antitelom, pri čemu se antitelo koristi za detekciju ekspresije proteina in situ.

[0235] Ovaj pronalazak će biti dalje opisan u sledećim primerima, bez obzira na to, bez ograničavanja na njih.

[0236] Slika 1 prikazuje ekspresiju egzona MAG-003 u MAGEA4 (tumor naspram zdravih, RNASeq podaci). Ekspresija egzona MAGE-003 u MAGEA4 na zdravim tkivima upoređena je sa ekspresijom na različitim solidnim tumorima (crvene trake). Podtipovi zdravog tkiva su grupisani kao tkiva visokog (tamnozelene trake), srednjeg (svetlozelene trake) i niskog rizika (sive trake). Svaka traka predstavlja jedan uzorak. Visoka ekspresija na normalnim tkivima nađena je samo u placenti i testisu (nizak rizik). (RPKM = očitavanja po kilobazi na milion mapiranih očitavanja)

[0237] Slika 2 prikazuje ekspresiju egzona MAG-003 na MAGEA8 (tumor naspram zdravih, RNASeq podaci). Ekspresija egzona MAGEA8 na zdravim tkivima upoređena je sa ekspresijom na različitim solidnim tumorima (crvene trake). Podtipovi zdravog tkiva su grupisani kao tkiva visokog (tamnozelene trake), srednjeg (svetlozelene trake) i niskog rizika (sive trake). Svaka traka predstavlja jedan uzorak. Visoka ekspresija na normalnim tkivima nađena je samo u placenti (nizak rizik). (RPKM = očitavanja po kilobazi na milion mapiranih očitavanja).

[0238] Slike 3-5 prikazuju oslobađanje IFNγ iz CD8+ T-ćelija elektroporiranih sa alfa i beta lancem RNK TCR specifičnih za MAG-003 nakon ko-inkubacije sa ciljnim ćelijama napunjenim MAG-003 peptidom (SEQ ID NO:1) ili različitim MAG-003 varijantama supstitucije alanina na pozicijama 1-9 SEQ ID NO:1 kako je ovde otkriveno.

[0239] Slika 6 prikazuje ekspresiju MAGEA4 prema primeru 7. MAGEA4 iRNK se može detektovati u prikazanim uzorcima kancera. Nivo ekspresije pokriva opseg od značajne ekspresije u uzorcima kancera glave i vrata i nesitnoćelijskog kancera pluća (HNSCC062T1, HNSCC064T1 i NSCLC004T1) do prilično niske ekspresije u uzorcima nesitnoćelijskog kancera pluća i kancera jajnika (NSCLC006T1 i OC036T1).

Primeri

[0240] Alo-reaktivna postavka se može koristiti da se zaobiđu auto-tolerancija i proizvedu T-ćelije sa većom avidnošću u poređenju sa T-ćelijama izvedenim iz autologne postavke, tj. pacijenata. Primeri takvih postavki uključuju in vitro stvaranje alo-HLA reaktivnih T-ćelija specifičnih za peptide (Sadovnikova et al. 1998; Savage et al. 2004; Wilde et al. 2012), i imunizaciju miševa transgenih za humani MHC ili humani TCR (Stanislawski et al.2001; Li et al.2010).

Primer 1

In vitro generisanje alo-HLA reaktivnih T-ćelija specifičnih za peptide (Savage et al.2004)

[0241] PBMC od HLA-A*02-negativnih zdravih donora su korišćeni nakon dobijanja informisanog pristanka. Rekombinantni biotinilovani HLA-A2 monomeri klase I i A2 fluorescentni tetrameri koji sadrže MAG-003 dobijeni su od MBLI (Woburn, MA). PBMC su inkubirani sa anti-CD20SA razblaženim u fiziološkom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS) 1 sat na sobnoj temperaturi, isprani i inkubirani sa biotinilovanim A2/MAG-003 monomerima 30 minuta na sobnoj temperaturi, isprani i postavljeni na 3×10<6>ćelija/bunariću u pločama sa 24 bunarčića u RPMI sa 10% humanog AB seruma. Interleukin 7 (IL-7; R&D Systems, Minneapolis, MN) je dodat na dan 1 u količini od 10 ng/mL i IL-2 (Chiron, Harefield, Ujedinjeno Kraljevstvo) je dodat 10 U/mL na dan 4. Tokom perioda od 5 nedelja ćelije su ponovo stimulisane jednom nedeljno sa svežim PBMC, pomešane sa ćelijama koje daju odgovor u odnosu 1:1 i postavljene na 3×10<6>/bunarčiću u ploče sa 24 bunarčića.

[0242] Da bi se dobile T-ćelije visoke avidnosti, inkubirati približno 10<6>PBMC sa HLA-A2/MAG-003 tetramerom-fikoeritrinom (PE) (dobijenim od MBLI) tokom 30 minuta na 37°C, nakon čega sledi anti-CD8-fluorescein izotiocijanat (FITC)/alofikocijanin (APC) 20 minuta na 4°C, nakon čega sledi sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS)-Calibur analiza. Sortiranje je obavljeno pomoću FACS-Vantage (Becton Dickinson, Cowley, Oxford, Ujedinjeno Kraljevstvo). Sortirane tetramer-pozitivne ćelije su proširene u ploče sa 24 bunarića upotrebom, po bunarčiću, 2×10<5>sortiranih ćelija, 2×10<6>ozračenih A2-negativnih PBMC kao punjenja, 2×10<4>CD3/CD28 kuglica/mL (Dynal, Oslo Norveška) i IL-2 (1000 U/mL). Tako dobijene T-ćelije visoke avidnosti su zatim korišćene da identifikuju i izoluju TCR za određivanje aminokiselinskih/DNK sekvenci i kloniranje u ekspresione vektore korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u tehnici.

Primer 2

Imunizacija miševa transgenih za humani MHC ili humani TCR

[0243] MAG-003 je korišćen za imunizaciju transgenih miševa sa celim lokusima humanog TCRαβ gena (1.1 i 0.7 Mb), čije T-ćelije eksprimiraju raznovrstan humani TCR repertoar koji kompenzuje nedostatak TCR kod miša. (Li et al. 2010). Da bi se dobile T-ćelije visoke avidnosti, inkubirati PBMC dobijene od transgenih miševa sa tetramerom-fikoeritrinom (PE) nakon čega sledi sortiranje ćelija kao što je gore opisano. Tako dobijene T-ćelije visoke avidnosti su zatim korišćene da identifikuju i izoluju TCR za određivanje aminokiselinskih/DNK sekvenci i kloniranje u ekspresione vektore korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u tehnici.

[0244] U jednom aspektu, MAG-003 i njegove varijante, tj. p286-1Y2L (sa 2 aminokiselinske supstitucije, SEQ ID NO:2) i p286-1Y2L9L (sa 3 aminokiselinske supstitucije, SEQ ID NO:3) pokazuju snažan afinitet vezivanja i stabilnost prema HLA-A*0201 molekulu. Konkretno, p286-1Y2L9L je pokazao sposobnost da indukuje specifične CTL koji, u jednom aspektu, liziraju ciljne ćelije kancera iz oba, PBMC zdravih donora i HLA-A2.1 /Kb transgenih miševa. Videti, na primer, (Wu et al.2011).

[0245] Da bi se dobili TCR visoke avidnosti za komplekse MHC I ili II/p286-1Y2L ili p286-1Y2L9L, ovi peptidi se mogu koristiti u postupcima opisanim u Primerima 1 i 2. Tako dobijene T-ćelije visoke avidnosti su zatim korišćene za identifikaciju i izolaciju TCR za određivanje aminokiselinskih/DNK sekvenci i kloniranje u ekspresione vektore korišćenjem postupaka dobro poznatih u tehnici.

[0246] TCR varijante visoke avidnosti takođe se mogu izabrati iz biblioteke CDR mutanata pomoću prikaza kvasca, faga ili T-ćelija (holler et al.2003; Li et al.2005; Chervin et al.2008). Kandidati TCR varijanti, na taj način, obezbeđuju vodič za dizajn mutacija TCR-ovih CDR regiona da bi se dobile TCR varijante visoke avidnosti (Robbins et al.2008; Zoete et al.2007).

Primer 3: Kloniranje TCR

[0247] Postupci za kloniranje TCRs su poznati u tehnici, na primer, kao što je opisano u U.S.

8,519,100. Specifični oligonukleotid A1 sekvence alfa lanca varijabilnog regiona koji kodira restrikciono mesto Ndel, uvedeni metionin za efikasnu inicijaciju ekspresije bakterija i specifičan oligonukleotid A2 sekvence alfa lanca konstantnog regiona koji kodira restrikciono mesto Sall su korišćeni za amplifikaciju alfa lanca varijabilnog regiona. U slučaju beta lanca, specifičan oligonukleotid sekvence beta lanca varijabilnog regiona koji kodira restrikciono mesto npr. Ndel, uvedeni metionin za efikasnu inicijaciju ekspresije u bakterijama i specifičan oligonukleotid B2 sekvence beta lanca konstantnog regiona koji kodira restrikciono mesto npr. Agel su korišćeni za amplifikaciju beta lanca varijabilnog regiona.

[0248] Alfa i beta varijabilni regioni su klonirani u ekspresione plazmide na bazi pGMT7 koji sadrže Cα ili Cβ pomoću standardnih postupaka opisanih u (Molecular Cloning a Laboratory Manual Third edition by Sambrook and Russell). Plazmidi su sekvencionirani upotrebom Applied Biosystems 3730×1 DNK analizatora.

[0249] DNk sekvence koje kodiraju TCR alfa lanac isečen sa Ndel i Sall su ligatirani u pGMT7+Cα vektor, koji je isečen sa Ndel i Xhol. DNK sekvence koje kodiraju TCR beta lanac isečen sa Ndel i Agel le ligatiran u poseban pGMT7+Cβ vektor, koji je takođe isečen sa Ndel i Agel. Ligatirani plazmidi su transformisani u kompetentne XL1-plave ćelije Escherichia coli soja i postavljene na LB/agar ploče koje sadrže 100 µg/ml ampicilina. Posle prekonoćne inkubacije na 37°C, pojedinačne kolonije su sakupljene i gajene u 10 ml LB koji sadrži 100 µg/ml ampicilina preko noći na 37°C uz mućkanje. Klonirani plazmidi su prečišćeni upotrebom Miniprep kompleta (Qiagen) i insert je sekvencioniran upotrebom automatskog DNK sekvensera (Lark Technologies).

Primer 4: Autologni T-ćelijski inženjering

[0250] T-ćelije mogu biti konstruisane da eksprimiraju TCR visokog aviditeta (takozvane TCR terapije) ili himerni antigen-receptori poreklom od proteinske-fuzije (CAR) koji imaju pojačanu antigenu specifičnost za MHC I/MAG-003 kompleks ili MHC II/MAG-003 kompleks. U aspektu, ovaj pristup prevazilazi neka od ograničenja povezana sa centralnom i perifernom tolerancijom i generiše T-ćelije koje će biti efikasnije u ciljnom delovanje na tumore bez zahteva za de novo T-ćelijsku aktivaciju u pacijentu.

[0251] Da bi se dobile T-ćelije koje eksprimiraju TCR predmetnog opisa, nukleinske kiseline koje kodiraju tumor specifične TCR-alfa i/ili TCR-beta lance identifikovane i izolovane, kao što je opisano u Primerima 1-3, su klonirane u ekspresione vektore, kao što je gama-retrovirus ili lentivirus. Rekombinantni virusi su generisani i zatim testirani za funkcionalnost, kao što je antigena specifičnost i funkcionalni aviditet. Alikvota finalnog proizvoda je zatim korišćena za transdukciju ciljne T-ćelijske populacije (generalno prečišćena iz PBMC pacijenta), koja je proširena pre infuzije u pacijenta.

[0252] TCR lanci uvedeni u perifernu T-ćeliju mogu da budu u kompeticiji sa endogenim TCR lancima za vezivanje sa CD3 kompleksom, što je neophodno za TCR površinsku ekspresiju. Zbog toga što je veliki nivo TCR površinske ekspresije esencijalan za obezbeđivanje odgovarajuće osetljivosti za pokretanje od strane ćelija koje eksprimiraju ciljni tumorski antigen (Cooper et al., 2000; Labrecque et al., 2001), strategije koje pojačavaju nivoe ekspresije gena TCR-alfa i TCR-beta su važne za razmatranje u TCR genskoj terapiji.

[0253] Da bi se povećala ekspresija TCR predmetnog opisa, u predmetnom opisu se mogu koristiti snažni promotori, kao što su retrovirusni dugački terminalni ponovci (LTR), citomegalovirus (CMV), virus mišjih matičnih ćelija (MSCV) U3, fosfoglicerat kinaza (PGK), β-aktin, ubikvitin i simian virus 40 (SV40)/CD43 složeni promotor (Cooper et al., 2004; Jones et al., 2009), elongacioni faktor (EF)-1a (Tsuji et al., 2005) i promotor virusa koji formira fokus slezine (SFFV) (Joseph et al., 2008).

[0254] Pored snažnih promotora, mnoge TCR ekspresione kasete sadrže dodatne elemente koji mogu da pojačavaju ekspresiju transgena, uključujući centralni polipurin trakt (cPPT), koji stimuliše jedarnu translokaciju lentivirusnoh konstrukata (Follenzi et al., 2000) i posttranskripcioni regulatorni element virusa hepatititsa detlića (wPRE), koji povećava nivo transgene ekspresije povećanjem stabilnosti RNK (Zufferey et al., 1999).

[0255] Postizanje TCR površinske ekspresije visokog nivoa zahteva da se kako TCR-alfa tako i TCR-beta lanci uvedenog TCR transkribuju u visokim nivoima. Da bi se to izvelo, TCR-alfa i TCR-beta lanci predmetnog opisa mogu biti klonirani u bi-cistronske konstrukte u jednom vektoru, za koje je pokazano da su sposobni da prevaziđe ovu prepreku. Upotreba virusnog mesta intraribozomalnog ulaska (IRES) između TCR-alfa i TCR-beta lanaca rezultuje u koordinisanoj ekspresiji oba lanca, zbog toga što se TCR-alfa i TCR-beta lanci generišu iz jednog transkripta koji je razložen u dva proteina u toku translacije, osiguravajući da je proizveden isti molarni odnos TCR-alfa i TCR-beta lanaca (Schmitt et al.2009).

[0256] Sledeća modifikacija za koju je dokazano da je korisna za povećanje ekspresije TCR transgena je optimizacija kodona. Suvišnost u genetičkom kodu omogućava da neke aminokiseline budu kodirane od strane više od jednog kodona, ali određeni kodoni su manje "optimalni" od drugih zbog relativne biodostupnosti poklapajućih tRNK kao i drugih faktora (Gustafsson et al., 2004). Pokazano je da modifikacija TCR-alfa i TCR-beta genskih sekvenci tako da je svaka aminokiselina kodirana optimalnim kodonom za ekspresiju sisarskog gena, kao i eliminaciju iRNK motiva nestabilnosti ili kriptičkih splajs varijanti značajno pojačava ekspresiju TCR-alfa i TCR-beta gena (Scholten et al., 2006).

[0257] Pored toga, pogrešno sparivanje između uvedenih i endogenih TCR lanaca može da rezultira u sticanju specifičnosti koje predstavljaju značajan rizik za autoimunitet. Na primer, formiranje mešanih TCR dimera može da redukuje broj CD3 molekula dostupan da formira ispravno sparene TCR komplekse i prema tome može značajno da smanji funkcionalni aviditet ćelija koje eksprimiraju uvedeni TCR (Kuball et al., 2007).

[0258] Da bi se smanjilo pogrešno sparivanje, domen C-terminusa uvedenih TCR lanaca predmetnog opisa može biti modifikovan u cilju stimulacije međulančanog afiniteta, dok smanjenje sposobnosti uvedenih lanaca da se sparuju sa endogenim TCR. Ove strategije mogu da obuhvataju zamenu domena C-terminusa humanih TCR-alfa i TCR-beta sa njihovim mišjim parnjacima (mišjenizirani domen C-terminusa); generisanje drugu međulančanu disulfidnu vezu u domenu C-terminusa uvođenjem drugog cisteinskog ostatka u oba, TCR-alfa i TCR-beta lanac uvedenog TCR (cisteinska modifikacija); zamenu interagujućih ostataka u domenima C-terminusa TCR-alfa i TCR-beta lanca ("ključ-u-bravi"); i fuziju varijabilnih domena TCR-alfa i TCR-beta lanaca direktno sa CD3ζ (CD3ζ fuzija) (Schmitt et al.2009).

[0259] Predmetni opis obezbeđuje TCR proteine koji su korisni u lečenju kancera/tumora, poželjno nesitnoćelijskog kancera pluća koji prekomerno ili isključivo prikazuje MAG-003.

Primer 5: Alogenski T-ćelijski inženjering

[0260] Gama delta (γδ) T ćelije, koje su ne-konvencionalni T limfocitni efektori uključeni u prvu liniju odbrane protiv patogena, mogu da interaguju sa i izbrišu tumorske ćelije na način nezavisan od MHC preko aktivirajućih receptora, pored ostalih, TCR-gama i TCR-delta lanaca. Ove γδ T ćelijske ispoljavaju preaktivirani fenotip koji omogućava brzu proizvodnju citokina (IFN-γ, TNF-α) i snažan citotoksičan odgovor posle aktivacije. Ove T-ćelije imaju antitumorsku aktivnost protiv mnogih kancera i sugerišu da je γδ T ćelijski-posredovana imunoterapija izvodljiva i može da indukuje objektivne tumorske odgovore (Braza et al.2013).

[0261] Skorašnji napredak upotrebom imobilizovaniha antigena, agonističkih monoklonskih antitela (mAbs), veštačkih ćelija koje prikazuju antigen poreklom od tumora (aAPC), ili kombinacije aktivirajućih mAbs i aAPC je bio uspešan u proširivanju gama delta T-ćelija sa oligoklonskim ili poliklonskim TCR repertoarima. Na primer, imobilizovani lanac A srodan sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase-I je bio stimulus za γδ T-ćelije koje eksprimiraju TCRδ1 izotipove i aktivirajuća antitela vezana za ploču su proširila Vδ1 i Vδ2 ćelije ex vivo. Klinički dovoljne količine TCRδ1, TCRδ2 i TCRδ1<neg>TCRδ2<neg>su proizvedene praćenjem ko-kulture na aAPC, i ove podgrupe su ispoljile razlike u memorijskom fenotipu i reaktivnosti na tumore in vitro i in vivo (Deniger et al.2014).

[0262] Pored toga, γδ T-ćelije su podložne genetičkoj modifikaciji kao što je dokazano uvođenjem TCR-alfa i TCR-beta lanaca (Hiasa et al.2009). Sledeći aspekt predmetnog opisa se odnosi na proizvodnju γδ T-ćelija koje eksprimiraju TCR-alfa i TCR-beta koji se vezuju za MAG-003. Da bi se to iuvelo, γδ T-ćelije su proširene pomoću postupaka opisanih od strane Deniger et al.2014, što je praćeno transdukcijom rekombinantnih virusa koji eksprimiraju TCR koji se vezuju za MAG-003 (kao što je opisano u Primeru 3) u proširene γδ T-ćelije. Virusomtransducirane γδ T-ćelije su zatim infuzirane u pacijenta.

Primer 6: Imunogenost i funkcionalni T-ćelijski podaci

[0263] Imunogenost MAG-003 je testirana upotrebom protokola koji imitiraju proizvodni postupak za farmaceutski proizvod. Prajming MAG-003-specifičnih T-ćelija je zabeležen za zdrave donore. Generisane T ćelije su bile sposobne da ubiju ciljne ćelije napunjene peptidom što pokazuje njihovu funkcionalnost. Podaci pokazuju da 1) MAG-003 je imunogeno ciljno mesto i 2) da su generisane T ćelije protiv MAG-003 funkcionalne.

[0264] Dodatni ppodaci kao što su generisani obezbedili su dokaz da je MAG-003 peptid sa veoma dobrim vezivanjem za HLA-A*02:01.

Primer 7: Ekspresija iRNK MAGEA4 u tkivima

[0265] In situ hibridizacija (ISH) se koristi za detekciju ekspresije iRNK direktno u formalinom fiksiranim ili zamrznutim delovima tkiva. Zbog svoje visoke osetljivosti i svoje prostorne rezolucije, to je pogodan postupak za određivanje ciljne ekspresije specifične za ćelijski tip i distribucije ili učestalosti ekspresije ciljnog mesta u isečcima tkiva kancera.

[0266] ISH je izvršen da bi se detektovala iRNK MAGEA4 pomoću BaseScope<™>tehnologije koju je razvila Advanced Cell Diagnostics (ACD). BaseScope<™>tehnologija se zasniva na hibridizaciji na četiri para oligonukleotidnih proba u obliku slova Z sa ciljnom sekvencom. Pojačavanje signala se postiže razgranatom DNK amplifikacijom, koja se zasniva na višestrukim koracima hibridizacije oligonukleotida, čime se na kraju gradi razgranato DNK (bDNK) stablo. Konačno, veliki broj proba za obeležavanje hibridizuje se sa granama bDNK stabla i pojačani signal se može detektovati. Chromogenic BaseScope<™>komplet za detekciju (RED) uključuje probe za obeležavanje koje su povezane sa enzimom (alkalna fosfataza). Detekcija signala zavisi od enzimske konverzije hromogenog supstrata FastRed, što dodatno pojačava originalni signal. BaseScope<™>je veoma osetljiva tehnologija, koja je zbog efikasnog procesa pojačavanja signala, uparena sa visokom osetljivošću i robusnim vezivanjem parova Z probe za ciljnu iRNK, čak i ako je delimično unakrsno vezana ili razložena. Prema ACD, vezivanje jednog para probe za svaki pojedinačni molekul iRNK je dovoljno da generiše ISH signal koji se može detektovati.

[0267] Svaki ISH eksperiment je podeljen na dva metodološka postupka: 1) Predodni tretman tkiva za pronalaženje ciljnog mesta i 2) Hibridizacija ciljnog mesta, pojačanje signala i detekcija. Optimalni uslovi pre tretmana su kritični za uspešnu detekciju ciljnog mesta u isečcima FFPE tkiva. Postupak fiksacije indukuje unakrsno vezivanje proteina, DNK i RNK u ćelijama i tkivima i na taj način maskira mesta hibridizacije. Stoga, da bi se osigurala dostupnost ciljne iRNK i pravilno vezivanje seta probe, ove poprečne veze moraju biti uklonjene pre ciljane hibridizacije. Predhodni tretman tkiva obuhvata tri odvojena koraka: 1) Blokiranje endogene alkalne fosfataze tretmanom vodonik peroksidom, 2) dobijanje ciljnog mesta ključanjem u ciljnom reagensu za dobijanje i 3) dobijanje ciljnog mesta digestijom proteazom. Kako obim fiksacije i unakrsno vezivanje može da varira između različitih FFPE blokova, optimalni uslovi traženja ciljnog mesta moraju se eksperimentalno odrediti za svaki pojedinačni FFPE blok. Zbog toga su isečci tkiva izloženi različitim vremenima ključanja i digestije proteazom, nakon čega je usledila hibridizacija sa pozitivnim i negativnim kontrolnim setom probe. Optimalni uslovi su određeni mikroskopskom procenom specifičnog intenziteta signala u pozitivnoj kontroli, nespecifične pozadine u negativnoj kontroli i morfologije tkiva. Predhodni tretman tkiva je obavljen prema protokolima proizvođača. Reagensi za prethodnu obradu su uključeni u BaseScope<™>komplete reagensa. Nakon završetka različitih koraka prethodnog tretmana, ciljna ekspresija je procenjena hibridizacijom specifičnih setova probe sa iRNK od interesa sa naknadnim pojačavanjem razgranatog DNK signala i detekcijom hromogenog ili fluorescentnog signala. Svi testovi su obavljeni prema protokolima proizvođača.

Tabela 10: Analiza ekspresije

Spisak referenci

Adair SJ, Hogan KT (2009). Treatment of ovarian cancer cell lines with 5-aza-2'-deoxycytidine upregulates the expression of cancer-testis antigens and class I major histocompatibility complex-encoded molecules. Cancer Immunol. Immunother. 58, 589-601.

Alves PM, Levy N, Bouzourene H, Viatte S, Bricard G, Ayyoub M, Vuilleumier H, Givel JC, Halkic N, Speiser DE, Romero P, Levy F (2007). Molecular and immunological evaluation of the expression of cancer/testis gene products in human colorectal cancer. Cancer Immunol. Immunother. 56, 839-847.

Andrade VC, Vettore AL, Felix RS, Almeida MS, Carvalho F, Oliveira JS, Chauffaille ML, Andriolo A, Caballero OL, Zago MA, Colleoni GW (2008). Prognostic impact of cancer/testis antigen expression in advanced stage multiple myeloma patients. Cancer Immun. 8, 2.

Aubry F, Satie AP, Rioux-Leclercq N, Rajpert-De ME, Spagnoli GC, Chomez P, De BO, Jegou B, Samson M (2001). MAGE-A4, a germ cell specific marker, is expressed differentially in testicular tumors. Cancer 92, 2778-2785.

Bar-Haim E, Paz A, Machlenkin A, Hazzan D, Tirosh B, Carmon L, Brenner B, Vadai E, Mor O, Stein A, Lemonnier FA, Tzehoval E, Eisenbach L (2004). MAGE-A8 overexpression in transitional cell carcinoma of the bladder: identification of two tumour-associated antigen peptides. Br. J Cancer 91, 398-407.

Barrow C, Browning J, MacGregor D, Davis ID, Sturrock S, Jungbluth AA, Cebon J (2006). Tumor antigen expression in melanoma varies according to antigen and stage. Clin Cancer Res 12, 764-771.

Bellati F, Napoletano C, Tarquini E, Palaia I, Landi R, Manci N, Spagnoli G, Rughetti A, Panici PB, Nuti M (2007). Cancer testis antigen expression in primary and recurrent vulvar cancer: association with prognostic factors. Eur. J Cancer 43, 2621-2627.

Bergeron A, Picard V, LaRue H, Harel F, Hovington H, Lacombe L, Fradet Y (2009). High frequency of MAGE-A4 and MAGE-A9 expression in high-risk bladder cancer. Int. J Cancer 125, 1365-1371.

Bhan S, Chuang A, Negi SS, Glazer CA, Califano JA (2012). MAGEA4 induces growth in normal oral keratinocytes by inhibiting growth arrest and apoptosis. Oncol Rep.28, 1498-1502. Bode PK, Thielken A, Brandt S, Barghorn A, Lohe B, Knuth A, Moch H (2014). Cancer testis antigen expression in testicular germ cell tumorigenesis. Mod. Pathol.27, 899-905.

Cabezon T, Gromova I, Gromov P, Serizawa R, Timmermans W, V, Kroman N, Celis JE, Moreira JM (2013). Proteomic profiling of triple-negative breast carcinomas in combination with a three-tier orthogonal technology approach identifies Mage-A4 as potential therapeutic target in estrogen receptor negative breast cancer. Mol. Cell Proteomics.12, 381-394.

Cesson V, Rivals JP, Escher A, Piotet E, Thielemans K, Posevitz V, Dojcinovic D, Monnier P, Speiser D, Bron L, Romero P (2011). MAGE-A3 and MAGE-A4 specific CD4(+) T-cells in head and neck cancer patients: detection of naturally acquired responses and identification of new epitopes. Cancer Immunol. Immunother. 60, 23-35.

Chambost H, Van BN, Brasseur F, Godelaine D, Xerri L, Landi SJ, Theate I, Plumas J, Spagnoli GC, Michel G, Coulie PG, Olive D (2000). Expression of gene MAGE-A4 in Reed-Sternberg cells. Blood 95, 3530-3533.

Chen CH, Huang GT, Lee HS, Yang PM, Yan MD, Chen DS, Sheu JC (1999). High frequency of expression of MAGE genes in human hepatocellular carcinoma. 1999. Liver 19, 110-114.

Chitale DA, Jungbluth AA, Marshall DS, Leitao MM, Hedvat CV, Kolb D, Spagnoli GC, Iversen K, Soslow RA (2005). Expression of cancer-testis antigens in endometrial carcinomas using a tissue microarray. Mod. Pathol. 18, 119-126.

Coral S, Parisi G, Nicolay HJ, Colizzi F, Danielli R, Fratta E, Covre A, Taverna P, Sigalotti L, Maio M (2013). Immunomodulatory activity of SGI-110, a 5-aza-2'-deoxycytidine-containing demethylating dinucleotide. Cancer Immunol. Immunother. 62, 605-614.

Cruz CR, Gerdemann U, Leen AM, Shafer JA, Ku S, Tzou B, Horton TM, Sheehan A, Copeland A, Younes A, Rooney CM, Heslop HE, Bollard CM (2011). Improving T-cell therapy for relapsed EBV-negative Hodgkin lymphoma by targeting upregulated MAGE-A4. Clin Cancer Res 17, 7058-7066.

Cuffel C, Rivals JP, Zaugg Y, Salvi S, Seelentag W, Speiser DE, Lienard D, Monnier P, Romero P, Bron L, Rimoldi D (2011). Pattern and clinical significance of cancer-testis gene expression in head and neck squamous cell carcinoma. Int. J Cancer 128, 2625-2634.

Daudi S, Eng KH, Mhawech-Fauceglia P, Morrison C, Miliotto A, Beck A, Matsuzaki J, Tsuji T, Groman A, Gnjatic S, Spagnoli G, Lele S, Odunsi K (2014). Expression and immune responses to MAGE antigens predict survival in epithelial ovarian cancer. PLoS. ONE. 9, e104099.

Duffour MT, Chaux P, Lurquin C, Cornelis G, Boon T, van der Bruggen P (1999). A MAGE-A4 peptide presented by HLA-A2 is recognized by cytolytic T lymphocytes. Eur. J Immunol.

29, 3329-3337.

De PE, Arden K, Traversari C, Gaforio JJ, Szikora JP, De SC, Brasseur F, van der Bruggen P, Lethe B, Lurquin C, . (1994). Structure, chromosomal localization, and expression of 12 genes of the MAGE family. Immunogenetics 40, 360-369.

Doyle JM, Gao J, Wang J, Yang M, Potts PR (2010). MAGE-RING protein complexes comprise a family of E3 ubiquitin ligases. Mol Cell 39, 963-974.

Eng KH, Weir I, Tsuji T, Odunsi K (2015). Immunostimulatory/regulatory gene expression patterns in advanced ovarian cancer. Genes and Cancer.

Forghanifard MM, Gholamin M, Farshchian M, Moaven O, Memar B, Forghani MN, Dadkhah E, Naseh H, Moghbeli M, Raeisossadati R, Abbaszadegan MR (2011). Cancer-testis gene expression profiling in esophageal squamous cell carcinoma: identification of specific tumor marker and potential targets for immunotherapy. Cancer Biol Ther.12, 191-197.

Gerdemann U, Katari U, Christin AS, Cruz CR, Tripic T, Rousseau A, Gottschalk SM, Savoldo B, Vera JF, Heslop HE, Brenner MK, Bollard CM, Rooney CM, Leen AM (2011). Cytotoxic T lymphocytes simultaneously targeting multiple tumor-associated antigens to treat EBV negative lymphoma. Mol. Ther.19, 2258-2268.

Gunda V, Cogdill AP, Bernasconi MJ, Wargo JA, Parangi S (2013). Potential role of 5-aza-2'-deoxycytidine induced MAGE-A4 expression in immunotherapy for anaplastic thyroid cancer. Surgery 154, 1456-1462.

Gure AO, Chua R, Williamson B, Gonen M, Ferrera CA, Gnjatic S, Ritter G, Simpson AJ, Chen YT, Old LJ, Altorki NK (2005). Cancer-testis genes are coordinately expressed and are markers of poor outcome in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 11, 8055-8062.

Hartmann S, Meyer TJ, Brands RC, Haubitz IR, Linz C, Seher A, Kubler AC, Muller-Richter UD (2015). MAGE-A expression clusters and antineoplastic treatment in head and neck cancer. Int. J Mol. Med.35, 1675-1682.

Hasegawa H, Mori M, Haraguchi M, Ueo H, Sugimachi K, Akiyoshi T (1998). Expression spectrum of melanoma antigen-encoding gene family members in colorectal carcinoma. Arch. Pathol. Lab Med.122, 551-554.

Hussein YM, Morad FE, Gameel MA, Emam WA, El Sawy WH, El Tarhouny SA, Bayomy ES, Raafat N (2012). MAGE-4 gene m-RNA and TGF in blood as potential biochemical markers for HCC in HCV-infected patients. Med. Oncol 29, 3055-3062.

Jacobs JF, Grauer OM, Brasseur F, Hoogerbrugge PM, Wesseling P, Gidding CE, van de Rakt MW, Figdor CG, Coulie PG, de Vries IJ, Adema GJ (2008). Selective cancer-germline gene expression in pediatric brain tumors. J Neurooncol.88, 273-280.

Jia ZC, Ni B, Huang ZM, Tian Y, Tang J, Wang JX, Fu XL, Wu YZ (2010). Identification of two novel HLA-A*0201-restricted CTL epitopes derived from MAGE-A4. Clin Dev. Immunol.

2010, 567594.

Kageyama S, Ikeda H, Miyahara Y, Imai N, Ishihara M, Saito K, Sugino S, Ueda S, Ishikawa T, Kokura S, Naota H, Ohishi K, Shiraishi T, Inoue N, Tanabe M, Kidokoro T, Yoshioka H, Tomura D, Nukaya I, Mineno J, Takesako K, Katayama N, Shiku H (2015). Adoptive Transfer of MAGE-A4 T-cell Receptor Gene-Transduced Lymphocytes in Patients with Recurrent Esophageal Cancer. Clin. Cancer Res.

Kang J, Lee HJ, Kim J, Lee JJ, Maeng LS (2015). Dysregulation of X chromosome inactivation in high grade ovarian serous adenocarcinoma. PLoS. ONE.10, e0118927.

Kawagoe H, Yamada A, Matsumoto H, Ito M, Ushijima K, Nishida T, Yakushiji M, Itoh K (2000). Serum MAGE-4 protein in ovarian cancer patients. Gynecol. Oncol 76, 336-339. Kim K, Cho YM, Park BH, Lee JL, Ro JY, Go H, Shim JW (2015). Histological and immunohistochemical markers for progression prediction in transurethrally resected high-grade non-muscle invasive bladder cancer. Int. J Clin Exp. Pathol.8, 743-750.

Kobayashi T, Lonchay C, Colau D, Demotte N, Boon T, van der Bruggen P (2003). New MAGE-4 antigenic peptide recognized by cytolytic T lymphocytes on HLA-A1 tumor cells. Tissue Antigens 62, 426-432.

Kocher T, Zheng M, Bolli M, Simon R, Forster T, Schultz-Thater E, Remmel E, Noppen C, Schmid U, Ackermann D, Mihatsch MJ, Gasser T, Heberer M, Sauter G, Spagnoli GC (2002). Prognostic relevance of MAGE-A4 tumor antigen expression in transitional cell carcinoma of the urinary bladder: a tissue microarray study. Int. J Cancer 100, 702-705.

Kubuschok B, Xie X, Jesnowski R, Preuss KD, Romeike BF, Neumann F, Regitz E, Pistorius G, Schilling M, Scheunemann P, Izbicki JR, Lohr JM, Pfreundschuh M (2004). Expression of cancer testis antigens in pancreatic carcinoma cell lines, pancreatic adenocarcinoma and chronic pancreatitis. Int. J Cancer 109, 568-575.

Li J, Yang Y, Fujie T, Tanaka F, Mimori K, Haraguchi M, Ueo H, Mori M, Akiyoshi T (1997). Expression of the MAGE gene family in human gastric carcinoma. Anticancer Res 17, 3559-3563.

Li M, Yuan YH, Han Y, Liu YX, Yan L, Wang Y, Gu J (2005). Expression profile of cancertestis genes in 121 human colorectal cancer tissue and adjacent normal tissue. Clin Cancer Res 11, 1809-1814.

Lifantseva N, Koltsova A, Krylova T, Yakovleva T, Poljanskaya G, Gordeeva O (2011). Expression patterns of cancer-testis antigens in human embryonic stem cells and their cell derivatives indicate lineage tracks. Stem Cells Int.2011, 795239.

Luftl M, Schuler G, Jungbluth AA (2004). Melanoma or not? Cancer testis antigens may help. Br. J Dermatol.151, 1213-1218.

Lin J, Lin L, Thomas DG, Greenson JK, Giordano TJ, Robinson GS, Barve RA, Weishaar FA, Taylor JM, Orringer MB, Beer DG (2004). Melanoma-associated antigens in esophageal adenocarcinoma: identification of novel MAGE-A10 splice variants. Clin Cancer Res 10, 5708-5716.

Liu W, Cheng S, Asa SL, Ezzat S (2008). The melanoma-associated antigen A3 mediates fibronectin-controlled cancer progression and metastasis. Cancer Res 68, 8104-8112.

Marcar L, Ihrig B, Hourihan J, Bray SE, Quinlan PR, Jordan LB, Thompson AM, Hupp TR, Meek DW (2015). MAGE-A Cancer/Testis Antigens Inhibit MDM2 Ubiquitylation Function and Promote Increased Levels of MDM4. PLoS. ONE.10, e0127713.

Marcar L, Maclaine NJ, Hupp TR, Meek DW (2010a). Mage-A cancer/testis antigens inhibit p53 function by blocking its interaction with chromatin. Cancer Res 70, 10362-10370.

Marcar L, Maclaine NJ, Hupp TR, Meek DW (2010b). Mage-A cancer/testis antigens inhibit p53 function by blocking its interaction with chromatin. Cancer Res 70, 10362-10370.

Melo DH, Mamede RC, Neder L, Saggioro FP, Figueiredo DL, da Silva WAJ, Jungbluth AA, Zago MA (2011). Expression of MAGE-A4 and MAGE-C1 tumor-associated antigen in benign and malignant thyroid diseases. Head Neck 33, 1426-1432.

Mischo A, Kubuschok B, Ertan K, Preuss KD, Romeike B, Regitz E, Schormann C, de BD, Wadle A, Neumann F, Schmidt W, Renner C, Pfreundschuh M (2006). Prospective study on the expression of cancer testis genes and antibody responses in 100 consecutive patients with primary breast cancer. Int. J Cancer 118, 696-703.

Mitchell RT, Camacho-Moll E, MacDonald J, Anderson RA, Kelnar CJ, O'Donnell M, Sharpe RM, Smith LB, Grigor KM, Wallace WH, Stoop H, Wolffenbuttel KP, Donat R, Saunders PT, Looijenga LH (2014). Intratubular germ cell neoplasia of the human testis: heterogeneous protein expression and relation to invasive potential. Mod. Pathol.27, 1255-1266.

Miyahara Y, Naota H, Wang L, Hiasa A, Goto M, Watanabe M, Kitano S, Okumura S, Takemitsu T, Yuta A, Majima Y, Lemonnier FA, Boon T, Shiku H (2005). Determination of cellularly processed HLA-A2402-restricted novel CTL epitopes derived from two cancer germ line genes, MAGE-A4 and SAGE. Clin Cancer Res 11, 5581-5589.

Montoro JR, Mamede RC, Neder SL, Saggioro FP, Figueiredo DL, Silva WA, Jr., Jungbluth AA, Spagnoli GC, Zago MA (2012). Expression of cancer-testis antigens MAGE-A4 and MAGE-C1 in oral squamous cell carcinoma. Head Neck 34, 1123-1128.

Monte M, Simonatto M, Peche LY, Bublik DR, Gobessi S, Pierotti MA, Rodolfo M, Schneider C (2006). MAGE-A tumor antigens target p53 transactivation function through histone deacetylase recruitment and confer resistance to chemotherapeutic agents. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103, 11160-11165.

Nagao T, Higashitsuji H, Nonoguchi K, Sakurai T, Dawson S, Mayer RJ, Itoh K, Fujita J (2003). MAGE-A4 interacts with the liver oncoprotein gankyrin and suppresses its tumorigenic activity. J Biol Chem 278, 10668-10674.

Naota H, Miyahara Y, Okumura S, Kuzushima K, Akatsuka Y, Hiasa A, Kitano S, Takahashi T, Yuta A, Majima Y, Shiku H (2006). Generation of peptide-specific CD8+ T-cells by phytohemagglutinin-stimulated antigen-mRNA-transduced CD4+ T-cells. J Immunol. Methods 314, 54-66.

Nishikawa H, Maeda Y, Ishida T, Gnjatic S, Sato E, Mori F, Sugiyama D, Ito A, Fukumori Y, Utsunomiya A, Inagaki H, Old LJ, Ueda R, Sakaguchi S (2012). Cancer/testis antigens are novel targets of immunotherapy for adult T-cell leukemia/lymphoma. Blood 119, 3097-3104. Nishimura S, Fujita M, Terata N, Tani T, Kodama M, Itoh K (1997). Expression of MAGE genes in colorectal carcinomas. Nihon Rinsho Meneki. Gakkai Kaishi 20, 95-101.

Oba-Shinjo SM, Caballero OL, Jungbluth AA, Rosemberg S, Old LJ, Simpson AJ, Marie SK (2008). Cancer-testis (CT) antigen expression in medulloblastoma. Cancer Immun.8, 7.

Ohkuri T, Wakita D, Chamoto K, Togashi Y, Kitamura H, Nishimura T (2009). Identification of novel helper epitopes of MAGE-A4 tumor antigen: useful tool for the propagation of Th1 cells. Br. J Cancer 100, 1135-1143.

Ottaviani S, Colau D, van der Bruggen P, van der Bruggen P (2006). A new MAGE-4 antigenic peptide recognized by cytolytic T lymphocytes on HLA-A24 carcinoma cells. Cancer Immunol. Immunother. 55, 867-872.

Otte M, Zafrakas M, Riethdorf L, Pichlmeier U, Loning T, Janicke F, Pantel K (2001). MAGE-A gene expression pattern in primary breast cancer. Cancer Res 61, 6682-6687.

Peikert T, Specks U, Farver C, Erzurum SC, Comhair SA (2006). Melanoma antigen A4 is expressed in non-small cell lung cancers and promotes apoptosis. Cancer Res 66, 4693-4700. Peng JR, Chen HS, Mou DC, Cao J, Cong X, Qin LL, Wei L, Leng XS, Wang Y, Chen WF (2005). Expression of cancer/testis (CT) antigens in Chinese hepatocellular carcinoma and its correlation with clinical parameters. Cancer Lett.219, 223-232.

Perez D, Herrmann T, Jungbluth AA, Samartzis P, Spagnoli G, Demartines N, Clavien PA, Marino S, Seifert B, Jaeger D (2008). Cancer testis antigen expression in gastrointestinal stromal tumors: new markers for early recurrence. Int. J Cancer 123, 1551-1555.

Prasad ML, Jungbluth AA, Patel SG, Iversen K, Hoshaw-Woodard S, Busam KJ (2004). Expression and significance of cancer testis antigens in primary mucosal melanoma of the head and neck. Head Neck 26, 1053-1057.

Quillien V, Raoul JL, Heresbach D, Collet B, Toujas L, Brasseur F (1997). Expression of MAGE genes in esophageal squamous-cell carcinoma. Anticancer Res.17, 387-391.

Rammensee HG, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S (1999). SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics 50, 213-219.

Rammensee HG, Bachmann J, Stevanovic S (1997). MHC Ligands and Peptide Motifs. (Heidelberg, Germany: Springer-Verlag).

Resnick MB, Sabo E, Kondratev S, Kerner H, Spagnoli GC, Yakirevich E (2002). Cancer-testis antigen expression in uterine malignancies with an emphasis on carcinosarcomas and papillary serous carcinomas. Int. J Cancer 101, 190-195.

Ries J, Schultze-Mosgau S, Neukam F, Diebel E, Wiltfang J (2005). Investigation of the expression of melanoma antigen-encoding genes (MAGE-A1 to -A6) in oral squamous cell carcinomas to determine potential targets for gene-based cancer immunotherapy. Int. J Oncol.

26, 817-824.

Roch N, Kutup A, Vashist Y, Yekebas E, Kalinin V, Izbicki JR (2010). Coexpression of MAGE-A peptides and HLA class I molecules in hepatocellular carcinoma. Anticancer Res 30,1617-1623.

Saito T, Wada H, Yamasaki M, Miyata H, Nishikawa H, Sato E, Kageyama S, Shiku H, Mori M, Doki Y (2014). High expression of MAGE-A4 and MHC class I antigens in tumor cells and induction of MAGE-A4 immune responses are prognostic markers of CHP-MAGE-A4 cancer vaccine. Vaccine 32, 5901-5907.

Sakurai T, Itoh K, Higashitsuji H, Nagao T, Nonoguchi K, Chiba T, Fujita J (2004). A cleaved form of MAGE-A4 binds to Miz-1 and induces apoptosis in human cells. J Biol Chem 279, 15505-15514.

Sarcevic B, Spagnoli GC, Terracciano L, Schultz-Thater E, Heberer M, Gamulin M, Krajina Z, Oresic T, Separovic R, Juretic A (2003). Expression of cancer/testis tumor associated antigens in cervical squamous cell carcinoma. Oncology 64, 443-449.

Schirmer U, Fiegl H, Pfeifer M, Zeimet AG, Muller-Holzner E, Bode PK, Tischler V, Altevogt P (2013). Epigenetic regulation of L1CAM in endometrial carcinoma: comparison to cancertestis (CT-X) antigens. BMC. Cancer 13, 156.

Shafer JA, Cruz CR, Leen AM, Ku S, Lu A, Rousseau A, Heslop HE, Rooney CM, Bollard CM, Foster AE (2010). Antigen-specific cytotoxic T lymphocytes can target chemoresistant side-population tumor cells in Hodgkin lymphoma. Leuk. Lymphoma 51, 870-880.

Sharma P, Shen Y, Wen S, Bajorin DF, Reuter VE, Old LJ, Jungbluth AA (2006). Cancer-testis antigens: expression and correlation with survival in human urothelial carcinoma. Clin Cancer Res 12, 5442-5447.

Shichijo S, Hoshino T, Koufuji K, Hayashi A, Kawamoto M, Kikuchi M, Higuchi T, Ichiki M, Oizumi K, Itoh K (1997). Detection of MAGE-4 protein in sera of lung cancer patients. Jpn. J Cancer Res 88, 414-419.

Shigematsu Y, Hanagiri T, Shiota H, Kuroda K, Baba T, Mizukami M, So T, Ichiki Y, Yasuda M, So T, Takenoyama M, Yasumoto K (2010). Clinical significance of cancer/testis antigens expression in patients with non-small cell lung cancer. Lung Cancer 68, 105-110.

Shirakura Y, Mizuno Y, Wang L, Imai N, Amaike C, Sato E, Ito M, Nukaya I, Mineno J, Takesako K, Ikeda H, Shiku H (2012). T-cell receptor gene therapy targeting melanomaassociated antigen-A4 inhibits human tumor growth in non-obese diabetic/SCID/gammacnull mice. Cancer Sci.103, 17-25.

Simpson AJ, Caballero OL, Jungbluth A, Chen YT, Old LJ (2005). Cancer/testis antigens, gametogenesis and cancer. Nat Rev. Cancer 5, 615-625.

Soga N, Hori Y, Yamakado K, Ikeda H, Imai N, Kageyama S, Nakase K, Yuta A, Hayashi N, Shiku H, Sugimura Y (2013). Limited expression of cancer-testis antigens in renal cell carcinoma patients. Mol. Clin Oncol 1, 326-330.

Su C, Xu Y, Li X, Ren S, Zhao C, Hou L, Ye Z, Zhou C (2015). Predictive and prognostic effect of CD133 and cancer-testis antigens in stage Ib-IIIA non-small cell lung cancer. Int. J Clin Exp. Pathol.8, 5509-5518.

Takahashi N, Ohkuri T, Homma S, Ohtake J, Wakita D, Togashi Y, Kitamura H, Todo S, Nishimura T (2012). First clinical trial of cancer vaccine therapy with artificially synthesized helper/ killer-hybrid epitope long peptide of MAGE-A4 cancer antigen. Cancer Sci.103, 150-153.

Tahara K, Mori M, Sadanaga N, Sakamoto Y, Kitano S, Makuuchi M (1999b). Expression of the MAGE gene family in human hepatocellular carcinoma 1999. Cancer 85, 1234-1240.

Tanaka F, Mori M, Li J, Fujie T, Mimori K, Haraguchi M, Tanaka Y, Mafune K, Akiyoshi T (1997). High frequency of the expression of the MAGE gene family in human esophageal carcinoma. Int. J Oncol 10, 1113-1117.

Tsuzurahara S, Sata M, Iwamoto O, Shichijo S, Kojiro M, Tanikawa K, Itoh K (1997). Detection of MAGE-4 protein in the sera of patients with hepatitis-C virus-associated hepatocellular carcinoma and liver cirrhosis. Jpn. J Cancer Res 88, 915-918.

Wang M, Li J, Wang L, Chen X, Zhang Z, Yue D, Ping Y, Shi X, Huang L, Zhang T, Yang L, Zhao Y, Ma X, Li D, Fan Z, Zhao L, Tang Z, Zhai W, Zhang B, Zhang Y (2015). Combined cancer testis antigens enhanced prediction accuracy for prognosis of patients with hepatocellular carcinoma. Int. J Clin Exp. Pathol.8, 3513-3528.

Wilson EM (2010). Androgen receptor molecular biology and potential targets in prostate cancer. Ther. Adv. Urol.2, 105-117.

Wolff AC, Hammond ME, Hicks DG, Dowsett M, McShane LM, Allison KH, Allred DC, Bartlett JM, Bilous M, Fitzgibbons P, Hanna W, Jenkins RB, Mangu PB, Paik S, Perez EA, Press MF, Spears PA, Vance GH, Viale G, Hayes DF (2013). Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol 31, 3997-4013.

Wong PP, Yeoh CC, Ahmad AS, Chelala C, Gillett C, Speirs V, Jones JL, Hurst HC (2014). Identification of MAGEA antigens as causal players in the development of tamoxifen-resistant breast cancer. Oncogene 33, 4579-4588.

Wu ZY, Gao YF, Wu YH, Liu W, Sun M, Zhai MX, Qi YM, Ye Y (2011). Identification of a novel CD8+ T-cell epitope derived from cancer-testis antigen MAGE-4 in oesophageal carcinoma. Scand. J Immunol.74, 561-567.

Yakirevich E, Sabo E, Lavie O, Mazareb S, Spagnoli GC, Resnick MB (2003). Expression of the MAGE-A4 and NY-ESO-1 cancer-testis antigens in serous ovarian neoplasms. Clin Cancer Res 9, 6453-6460.

Yang B, O'Herrin SM, Wu J, Reagan-Shaw S, Ma Y, Bhat KM, Gravekamp C, Setaluri V, Peters N, Hoffmann FM, Peng H, Ivanov AV, Simpson AJ, Longley BJ (2007). MAGE-A, mMage-b, and MAGE-C proteins form complexes with KAP1 and suppress p53-dependent apoptosis in MAGE-positive cell lines. Cancer Res 67, 9954-9962.

Yamada R, Takahashi A, Torigoe T, Morita R, Tamura Y, Tsukahara T, Kanaseki T, Kubo T, Watarai K, Kondo T, Hirohashi Y, Sato N (2013). Preferential expression of cancer/testis genes in cancer stem-like cells: proposal of a novel sub-category, cancer/testis/stem gene. Tissue Antigens 81, 428-434.

Yoshida N, Abe H, Ohkuri T, Wakita D, Sato M, Noguchi D, Miyamoto M, Morikawa T, Kondo S, Ikeda H, Nishimura T (2006). Expression of the MAGE-A4 and NY-ESO-1 cancertestis antigens and T-cell infiltration in non-small cell lung carcinoma and their prognostic significance. Int. J Oncol 28, 1089-1098.

Zhang Y, Stroobant V, Russo V, Boon T, van der Bruggen P (2002). A MAGE-A4 peptide presented by HLA-B37 is recognized on human tumors by cytolytic T lymphocytes. Tissue Antigens 60, 365-371.

Zimmermann AK, Imig J, Klar A, Renner C, Korol D, Fink D, Stadlmann S, Singer G, Knuth A, Moch H, Caduff R (2013). Expression of MAGE-C1/CT7 and selected cancer/testis antigens in ovarian borderline tumours and primary and recurrent ovarian carcinomas. Virchows Arch.

462, 565-574.

Claims (4)

Patentni zahtevi

1. Peptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID No. 1 (KVLEHVVRV), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu je pomenuti kancer izabran od nesitnoćelijskog kancera pluća i sitnoćelijskog kancera pluća.

2. T-ćelijski receptor, poželjno rekombinantni, rastvorljiv ili T-ćelijski receptor vezan za membranu koji je reaktivan sa HLA ligandom, pri čemu se navedeni ligand sastoji od peptida prema patentnom zahtevu 1, za upotrebu u lečenju nesitnoćelijskog kancera pluća ili sitnoćelijskog kancera pluća.

3. Antitelo, posebno rastvorljivo ili antitelo vezano za membranu, koje specifično prepoznaje peptid prema patentnom zahtevu 1 kada je vezan za MHC molekul za upotrebu u lečenju nesitnoćelijskog kancera pluća ili sitnoćelijskog kancera pluća.

4. Farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedan aktivni sastojak izabran iz grupe koja se sastoji od peptida prema patentnom zahtevu 1, ili antitela prema patentnom zahtevu 3 ili T-ćelijskog receptora prema patentnom zahtevu 2, i farmaceutski prihvatljivog nosača, i izborno dodatnih farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa i/ili stabilizatora za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu je pomenuti kancer izabran od nesitnoćelijskog kancera pluća i sitnoćelijskog kancera pluća.