RS64651B1

RS64651B1 - Solubilizat ksantohumola

Info

Publication number: RS64651B1
Application number: RS20230896A
Authority: RS
Inventors: Dariush Behnam
Original assignee: Aquanova Ag
Priority date: 2018-07-11
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2023-10-31
Also published as: US11786484B2; HRP20231146T1; PT3820527T; PL3820527T3; ES2960685T3; DK3820527T3; US20220125740A1; FI3820527T3

Description

Opis

Pronalazak se odnosi na bezvodni solubilizat sa ksantohumolom prema patentnom zahtevu 1. Pronalazak se dalje odnosi na fluid koji sadrži takav solubilizat i kapsulu napunjenu takvim solubilizatom ili fluidom.

Ksantohumol je flavonoid koji se prirodno nalazi u hmelju. Ovo je prenilovani biljni polifenol koji je klasifikovan kao halkoni i do sada je otkriven samo u hmelju. Gorke sorte hmelja imaju znatno veći sadržaj ksantohumola od aromatičnih sorti.

Evropska patentna prijava EP 1431 385 A1 opisuje piće koje sadrži ksantohumol i proces za njegovu proizvodnju. Na primer, formulacija ksantohumola sa Tween 60 može se pripremiti zagrevanjem Tween 60 i mešanjem u ksantohumolu na temperaturi od 95°C.

U testovima se pokazalo da je ksantohumol efikasan protiv stvaranja i razvoja ćelija raka. Laboratorijski testovi su takođe pokazali da ksantohumol može zaštititi nervne ćelije mozga i stoga potencijalno pomoći u usporavanju napredovanja bolesti kao što su Alchajmerova ili Parkinsonova bolest.

Na primer, istraživanje prijavljeno na http://www.besserlaengerleben.at/gesund-und-fit/hopfen-hilft-gegen-cholesterinund-blutzucker.html ukazuje da ksantohumol smanjuje nivo PCSK9 u plazmi, proteina koji igra važnu ulogu u nivou holesterola. Smanjenje nivoa PCSK9 moglo bi poboljšati uklanjanje LDL holesterola iz krvi. Naučnici sa Državnog univerziteta Oregon su pokazali da uzimanje velikih količina ksantohumola kod laboratorijskih životinja može dovesti do poboljšanja kada je reč o metaboličkom sindromu i smanjenog povećanja telesne težine. Ovo istraživanje bi moglo dovesti do novih tretmana za gojaznost, visok holesterol i povišeni šećer u krvi. Kombinacija ovih zdravstvenih problema, poznata kao metabolički sindrom, danas je jedan od vodećih uzroka smrti u razvijenim zemljama, zajedno sa kardiovaskularnim oboljenjima i dijabetesom tipa 2.

Ksantohumol se prirodno nalazi u hmelju, a samim tim i u pivu. Najveće količine korišćene u studiji odgovarale bi dozi od 350 miligrama dnevno za jednu osobu. Međutim, ova vrednost znatno premašuje onu koja se može postići normalnim unosom hrane. Međutim, uzimanje putem dijetetskog suplementa bi teoretski bilo moguće bez problema.

Ekstrakti hmelja su trenutno komercijalno dostupni kao dijetetski suplementi. Međutim, pokazalo se da je bioraspoloživost ksantohumola niska samo kada se ekstrakti hmelja uzimaju oralno.

Stoga je cilj pronalaska da obezbedi formulaciju za ksantohumol koja pokazuje poboljšanu bioraspoloživost u poređenju sa prirodnim ksantohumolom iz ekstrakata hmelja.

Dalji cilj pronalaska je da obezbedi formulaciju za ksantohumol koja postiže poboljšani antiinflamatorni efekat u poređenju sa prirodnim ksantohumolom bez hemijske promene aktivnog sastojka ksantohumola.

Ovi ciljevi se postižu uz pomoć pronalaska na iznenađujuće jednostavan način sa solubilizatom prema patentnom zahtevu 1.

Pronalazak obezbeđuje bezvodni solubilizat koji se sastoji od ksantohumola sa udelom manjim ili jednakim 35% masenog udela, poželjno manjim ili jednakim 15% masenog udela, posebno poželjno od 2% masenog udela do 12% masenog udela i najmanje jednog emulgatora HLB vrednost u opsegu između 13 i 18, koja se posebno bira iz grupe koja uključuje polisorbat 80, polisorbat 20, estre šećera iz masnih kiselina (E 473) i fosfolipide, posebno lecitin, i mešavine najmanje dva od pomenuti emulgatori, i do 35% masenog udela, poželjno do 20% masenog udela, posebno poželjno do 15% masenog udela etanola i po izboru do 25% masenog udela, poželjno do 10% masenog udela glicerina. Kao što će biti detaljnije objašnjeno u nastavku, solubilizat prema pronalasku ima poboljšanu bioraspoloživost u poređenju sa prirodnim ksantohumolom iz ekstrakata hmelja i poboljšan antiinflamatorni efekat u poređenju sa prirodnim ksantohumolom.

Solubilizat prema pronalasku je koloidno formulisana smesa kao punjenje kapsula, koja sadrži ksantohumol kao bioaktivni aktivni sastojak. Sa pronalaskom, solubilizat sa micelama koji su stabilni čak i pod fiziološkim uslovima može se stvoriti samo od emulgatora i ksantohumola. Međutim, solubilizat može biti i smesa koja se, pored ksantohumola, uglavnom sastoji od tehničkih pomoćnih sredstava, nosača, punila i stabilizatora. Solubilizat prema pronalasku je bezvodni ili anhidrovani.

Dizajniran je da se koristi kao punjenje kapsula. Konkretno, iako je tečnost, nije piće.

Preduslov za apsorpciju mikronutrijenata rastvorljivih u mastima u ljudskom ili životinjskom telu je formiranje takozvanih „fizioloških mešanih micela” uz pomoć žučnih kiselina, žučnih soli i enzima iz digestivnog trakta. Solubilizat prema pronalasku stoga ima stabilnu micelarnu strukturu, analognu ovom prirodnom principu i u kontekstu optimizacije bioraspoloživosti ksantohumola.

Poboljšanje bioraspoloživosti se može postići na ovaj način ako se pokaže da je micela stabilna u fiziološkim uslovima - tj. na temperaturi od 37°C i pH 1,1 - i dospe u tanko crevo neoštećena.

Zbog visokog udela ksantohumola, pronalazak obezbeđuje u povoljnoj realizaciji da solubilizat sadrži etanolni ekstrakt tvrdih smola iz hmelja kao izvor za ksantohumol, naznačen time što se ksantohumol u ovom ekstraktu nalazi u koncentraciji u opsegu između 60% masenog udela. i 95% masenog udela, poželjno u koncentraciji u opsegu od 65% masenog udela do 85% masenog udela. Konkretno, proizvodi „Ksanto-Flav pur“ i „Ksanto-Flav“ koji su detaljnije objašnjeni u nastavku mogu se koristiti kao izvor ksantohumola u okviru pronalaska.

U poželjnoj varijanti, solubilizat prema pronalasku sadrži polisorbat 80 ili polisorbat 20 ili smešu polisorbata 20 i polisorbata 80 kao emulgator. Pronalazak povoljno stvara mogućnost izbora emulgatora ili sastava emulgatora za proizvodnju stabilnih micela ksantohumola čak i pod fiziološkim uslovima (pH 1,1 i 37°C). Najmanje jedan estar šećera masne kiseline ili mešavina nekoliko estra šećera masnih kiselina takođe se može koristiti kao emulgator. Dalje, pronalazač je otkrio da se mešavina polisorbata 80 ili polisorbata 20 ili mešavina polisorbata 80 i polisorbata 20 sa najmanje jednim estrom šećera masne kiseline takođe može koristiti kao emulgator u okviru pronalaska. Pored toga, mešavina najmanje jednog fosfolipida, na primer lecitina, sa najmanje jednim estrom šećera masne kiseline može se koristiti kao emulgator u okviru pronalaska.

Pronalazak stoga nudi prednost u mogućnosti prilagođavanja sastava u zavisnosti od toga koje druge komponente treba da budu sadržane u solubilizatu i u kojim kvantitativnim odnosima, njegovim osobinama u pogledu bioraspoloživosti, stabilnosti skladištenja i interakcijama sa materijalom kapsula u kojima se solubilizat koristi za oralnu upotrebu,

Utvrđeno je da u zavisnosti od toga koliko ksantohumola treba rastvoriti, a posebno u zavisnosti od pitanja da li treba micelizirati i druge aktivne sastojke pored ksantohumola, maseni odnos emulgatora, posebno polisorbata 80, prema ksantohumolu je u opsegu između 30:1 i 3:1, poželjno u opsegu između 25:1 i 5:1, poželjno u opsegu između 9,8:1 do 6,6:1.

Prema pronalasku, sadržaj emulgatora, posebno sadržaj polisorbata, je najmanje 45% masenog udela, poželjno u opsegu između 60% masenog udela i 95% masenog udela, posebno poželjno u opsegu između 73% masenog udela i 90% masenog udela. U zavisnosti od toga koliko emulgatora može da se koristi za određenu namenu solubilizata, pronalazak nudi mogućnost da solubilizat sadrži do 35% masenog udela, poželjno do 20% masenog udela, posebno poželjno do 15% masenog udela etanola. Dodavanjem etanola može se smanjiti udeo polisorbata, što je prednost u pogledu ADI vrednosti za polisorbat.

Za formiranje stabilnih micela, u zavisnosti od toga koji aktivni sastojci treba da se rastvore i u kojoj količini, može biti od pomoći da solubilizat sadrži do 25% masenog udela, poželjno do 10% masenog udela glicerola. Udeo polisorbata se takođe može smanjiti dodavanjem glicerina.

Solubilizati prema pronalasku imaju usku distribuciju veličine čestica sa malim prosečnim veličinama čestica čak i pod fiziološkim uslovima želudačnog prolaza; raspodela prečnika micela u razblaženju solubilizata sa destilovanom vodom u omjeru 1:500 pri pH 1,1 i 37°C je poželjno dovoljno oko dio=7O=6 nm do oko d9o=16O nm. Ove vrednosti su određene korišćenjem distribucije intenziteta. Detalji analize veličine čestica micela solubilizata su objašnjeni u nastavku.

Pronalazak povoljno obezbeđuje solubilizate sa veoma dobrim antiinflamatornim svojstvima. Antiinflamatorna aktivnost ksantohumol solubilizata, merena kao koncentracija C-reaktivnog proteina (CRP) u krvnom serumu pacova sa artritisom nakon jednokratne primene solubilizata u dozi od 5 mg/kg telesne težine, je u opsegu od oko 2.500 pg/ml do oko 2.700 pg/ml i samim tim značajno niža od koncentracije C-reaktivnog proteina (CRP) u krvnom serumu pacova sa artritisom nakon jednokratne primene prirodnog ksantohumola u dozi od 5 mg/kg telesne težine, koja je u opsegu od oko 3.300 pg/ml do oko 3.700 pg/ml. Poziva se na priloženu sliku 1c i na opis ispod.

Poređenja radi, antiinflamatorna aktivnost solubilizata sa ksantohumolom i kurkuminom, merena kao koncentracija C-reaktivnog proteina (CRP) u krvnom serumu pacova sa artritisom, nakon jednokratne primene solubilizata u dozi ksantohumola i kurkumina, od 5 mg/kg telesne težine svakog, je u opsegu od približno 2.000 pg/ml do oko 2.400 pg/ml i samim tim značajno niži od koncentracije C-reaktivnog proteina (CRP) u krvnom serumu pacova sa artritisom nakon jedne primene prirodnog ksantohumola i prirodnog kurkumina u dozi od 5 mg/kg telesne težine svakog, koji je u opsegu od oko 3.200 pg/ml do oko 3.600 pg/ml. U ovom kontekstu, upućuje se na priloženu sliku 1b i odgovarajući opis ispod.

Antiinflamatorni efekat ksantohumol solubilizata prema pronalasku, meren kao koncentracija mijeloperoksidaze (MPO) u krvnom serumu pacova sa artritisom, je u opsegu od oko 800 mU/ml do oko 900 mU/ml nakon jedne primene solubilizata u dozi od 5 mg/kg telesne težine, dakle značajno niža od koncentracije mijeloperoksidaze (MPO) u krvnom serumu pacova sa artritisom nakon jednokratne primene prirodnog ksantohumola u dozi od 5 mg/kg telesne težine, koji je u opsegu od oko 1.100 mU/ml do oko 1.200 mU/ml. U ovom kontekstu, upućuje se na priloženu sliku 4 i odgovarajući opis ispod.

Enzimska jedinica (U) je jedinica koja ukazuje na aktivnost enzima i sada je zamenjena katalom. Pošto se numeričke vrednosti menjaju kada se koristi katal, enzimska jedinica (U) nastavlja da se koristi u medicini i kliničkoj hemiji. Jedna enzimska jedinica U odgovara jednom mikromolu obrtanja supstrata u minuti.

Antiinflamatorni efekat solubilizata sa ksantohumolom i kurkuminom, mereno kao koncentracija mijeloperoksidaze (MPO) u krvnom serumu pacova sa artritisom nakon jednokratne primene solubilizata u dozi ksantohumola i kurkumina od 5 mg/kg telesne težine svakog, je u opsegu od oko 550 mu/ml do oko

600 mU/ml i stoga značajno niži od koncentracije mijeloperoksidaze (MPO) u krvnom serumu pacova sa artritisom nakon jednokratne primene prirodnog ksantohumola i prirodnog kurkumina u dozi od 5 mg/kg telesne težine svakog, koji je u opsegu od oko 1.100 mU/ml do oko 1.300 mU/ml. U ovom kontekstu, upućuje se na priloženu sliku 3 i odgovarajući opis ispod.

Indikacija poboljšane bioraspoloživosti u poređenju sa prirodnim ksantohumolom ili nemicelizovanim sastavima ksantohumola sa kurkuminom i/ili glavonoidom prema pronalasku daje se merenjem zamućenosti solubilizata, kojem je mnogo lakše pristupiti. Kao rezultat formulacije prema pronalasku, zamućenost solubilizata je poželjno manja od 100 FNU, poželjno manja od 50 FNU i meri se merenjem raspršene svetlosti infracrvenom svetlošću u skladu sa propisima standarda ISO 7027 za razblaživanje solubilizata u omjeru 1:50 u vodi na pH 1, 1 i 37°C.

Korelacija između opterećenja micele ksantohumolom i njegove stabilnosti je obrnuto proporcionalna. Povećanje opterećenja dovodi do veće nestabilnosti micele. Samo netaknute micele dovode do povećanja bioraspoloživosti. Kao što pokazuju uske distribucije veličine čestica i takođe izuzetno niska zamućenost solubilizata prema pronalasku, pronalazak stvara veliku prednost obezbeđivanja visoko opterećenih stabilnih micela koje su takođe stabilne u fiziološkim uslovima i stoga postižu visoku bioraspoloživost ksantohumola.

Da bi se omogućila oralna primena solubilizata prema pronalasku na jednostavan i prijatan način za potrošača ili pacijenta, pronalazak takođe obezbeđuje kapsulu napunjenu nevodenim solubilizatom opisanim iznad, naznačeno time što je kapsula meka želatinska kapsula ili tvrda kapsula, želatinska kapsula ili meka kapsula bez želatina ili je dizajnirana kao tvrda kapsula bez želatina, posebno kao kapsula od celuloze.

Solubilizat prema pronalasku se takođe može uključiti u druge fluide, posebno fluide, u okviru pronalaska. Zadržavaju se male micele ispunjene aktivnim sastojcima. Dakle, pronalazak takođe obezbeđuje jedan fluid koji sadrži solubilizat opisan gore, naznačeno time što je fluid izabran iz grupe koja sadrži hranu, dodatke ishrani, napitke, kozmetiku i farmaceutske proizvode. Konkretno, fluid može da sadrži vodeno razblaživanje solubilizata.

Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju solubilizata sa ksantohumolom kao što je gore opisano, sa sledećim koracima:

1. a) sadržavanje najmanje jednog emulgatora sa HLB vrednošću u opsegu između 13 i 18, koji se posebno bira iz grupe koju čine polisorbat 80, polisorbat 20, estri šećera iz masnih kiselina (E 473) kao i fosfolipidi, posebno lecitin, a mešavine najmanje dva od pomenutih uključuju emulgatore,

2. b) dodavanje etanola,

3. c) zagrevanje na temperaturu do 85°C, poželjno do 80°C, uz mešanje, na primer miksanjem,

4. d) dodavanje etanolnog ekstrakta tvrdih smola iz hmelja, posebno Ksanto-Flav čistog praha i/ili Ksanto-Flav praha, uz mešanje, na primer miksanjem,

naznačeno time što u koraku d) sledi zagrevanje do temperature u opsegu od 81°C do 90°C, posebno poželjno do temperature u opsegu od 83°C i 87°C.

Ako solubilizat prema prvoj varijanti postupka takođe treba da sadrži etanol, pronalazak obezbeđuje jedan pre koraka b).

bl) izvesti rastvaranje etanolnog ekstrakta tvrdih smola iz hmelja, posebno Ksanto-Flav pur praha, u etanolu uz zagrevanje do temperature u opsegu od 40°C do 62°C, poželjno do temperature u opsegu od 45°C do 57°C,

posebno poželjno do temperature u opsegu od

48°C i 52°C.

U svakom slučaju, u koraku c) ako je potrebno, da podrži proces mešanja ili rastvaranja, sledi zagrevanje na nižu temperaturu u opsegu od 40°C do 62°C, poželjno do temperature u opsegu od 45°C do 57°C, posebno poželjno na temperaturi u opsegu od 48°C i 52°C.

Dalje, u okviru pronalaska, u zavisnosti od toga koji je sastav emulgatora izabrana za datu primenu, fosfolipid, posebno dodatak lecitina, može se dodati u koraku b) zajedno sa etanolom. U koraku b) takođe je moguće dodati glicerin i/ili vodu zajedno sa etanolom.

Pronalazak je detaljnije objašnjen u nastavku korišćenjem primernih realizacija. Korišćene su sledeće komponente.

Ksanthohumol

Kao izvor ksantohumola korišćeni su proizvodi „Ksanto-Flav pur” ili „Ksanto-Flav 75% (65 - 85%)” marke „Hopsteiner” Simon H. Steiner, Hopfen, GmbH, Mainburg, Nemačka. Oba su prirodni proizvodi napravljeni od hmelja.

Aktivni sastojak je hmelj polifenol ksantohumol. To je prah žute boje sa sadržajem ksantohumola i najmanje 85% u „Ksanto-Flav pur“ prema proizvođaču. Sadržaj ksantohumola u „Ksanto-Flav 75% (65 - 85%)“ bio je najmanje 70% u primerima izvođenja predstavljenim u nastavku. Koncentracije ksantohumola i izoksantohumola u „Ksantho-Flav pur“ kvantificira proizvođač nakon UV spektrofotometrijske analize ili prema HPLC EBC 7.8 korišćenjem eksternog kalibracionog standarda čistog KSN (370 nm) ili IKS (290 nm). „Ksantho-Flav pur“ sadrži prenilovani flavonoid ksantohumol u veoma visokim koncentracijama. „Ksantho-Flav pur“ serija broj 9432 je korišćena za primerne realizacije u kontekstu ove prijave.

Polisorbat 80

Kao izvor polisorbata 80 korišćen je materijal „TEGO SMO 80 V FOOD” sa šifrom specifikacije „K04 EU-FOOD” kompanije Evonik Nutrition & Care GmbH, Esen, Nemačka. Proizvod je usaglašen sa zahtevima EU za aditiv za hranu E 433. U primernim realizacijama opisanim u nastavku, kao alternativu pomenutom TEGO SMO 80 V iz Evonik, TEGO SMO 80 V iz InCoPA Gmbh, Illertissen, Nemačka ili Crillet 4/Tween 80-LQ-(SG) iz CRODA GmbH, Nettetal takođe može se koristiti kao polisorbat 80, Nemačka ili Lamesorb SMO 20, kao i Kotilen-O/1 VL iz Univar ili Kolb Distributions AG, Hedingen, Švajcarska.

Estri šećera masnih kiselina (E473)

Pojedinačni estri šećera masnih kiselina (E 473) ili mešavine najmanje dva estra šećera masnih kiselina mogu se koristiti kao šećerni estri masnih kiselina (E 473). Pogodni estri šećera masnih kiselina su, posebno, saharoza mono-laurat, saharoza di-laurat, saharoza mono-palmitat, saharoza di-palmitat, saharoza mono-stearat i saharoza di-stearat. Proizvodi „Rioto L-1695“, „Rioto P-1670“ i „Rioto M-1695“ proizvođača Mitsubishi-Kagaku Foods Corporation korišćeni su za primerne realizacije opisanih u nastavku. Nadalje, kao estar šećera masnih kiselina (estar saharoze, E 473) korišćen je proizvod „DUB SE 16

P“ proizvođača Stearinerie Dubois. Proizvod „DUB SE 16 S“ se takođe može koristiti za proizvodnju solubilizata ksantohumola prema pronalasku.

Kao fosfolipid korišćen je lecitin u obliku proizvoda „Epikuron<®>135 F” ili „Epikuron<®>135 F IP (bez GMO) (35% ili 32% fosfatidilholina u sojinom ulju)” kompanije Cargill Inc.

Glicerin

Proizvod „Glicamed 99,7%“ iz Glaconchemie GmbH, Merseburg, Nemačka, korišćen je kao glicerin u kontekstu ove prijave. Prema proizvođaču, sadržaj glicerina u ovom proizvodu je najmanje 99,5%.

Etanol

Etanol je kupljen od Berkel Pfalzische Spritfabrik GmbH & Co. KG kao deo ove prijave. Prema specifikaciji za „neutralni alkohol nedenaturisani“ 1411U obloženi“, sadržaj etanola u ovom proizvodu je približno 94 /- 1%.

Kao voda je korišćena destilovana voda.

Analize veličine čestica micela u vodenim razblaženjima solubilizata prema pronalasku merene su primenom principa dinamičkog rasejavanja svetlosti laserskom svetlošću talasne dužine 780 nm. Merenje veličine čestica obavljeno je pomoću ParticleMetrik NANOFLEKS analizatora čestica povratnog rasejanja. Princip merenja je zasnovan na dinamičkom rasejanju svetlosti (DLS) u heterodinskom rasporedu povratnog rasejanja od 180°. Sa ovom geometrijom, deo laserskog zraka se meša sa rasejanom svetlošću (heterodina tehnologija). Zbog male putanje svetlosti od 200 mikrometara do 300 mikrometara u uzorku, povratno rasejanje je korisno za upijajuće i visoko koncentrisane uzorke. Heterodina tehnologija ima sve veći efekat na odnos signal/šum i osetljivost ispod 100 nm opsega.

Lasersko svetlo je spojeno u Y-viljušku optičkog vlakna. U isto vlakno se vraća laserska svetlost koja se delimično odbija od safirnog prozora komore za uzorke i svetlost koja se raspršuje iz uzorka. Detektor u drugoj grani Y-viljuške beleži ometajuće signale. Procena brze Furijeove transformacije razlaže fluktuirajuće komponente rasute svetlosti u frekvencijski zavisan takozvani „spektar snage“. Svaka komponenta frekvencije predstavlja Braunovsku konstantu difuzije i stoga se može pripisati veličini čestice. Stokes-Einstein formula se koristi za pretvaranje u distribuciju veličine čestica:

Ova jednačina uključuje difuzionu konstantu D, Bolcmanovu konstantu k, temperaturu T, dinamički viskozitet η medijuma i prečnik dP čestica. Senzor temperature je ugrađen u merni uređaj blizu uzorka u blizini safirnog prozora.

Da bi se eksperimentalno odredila zamućenost solubilizata prema pronalasku, uređaji za merenje zamućenosti su kalibrisani sa standardnom suspenzijom. Prikaz stoga nije u obliku izmerenog intenziteta svetlosti, već kao koncentracije suspenzije za kalibraciju. Prilikom merenja bilo koje suspenzije, prikaz znači da dotična tečnost izaziva isto rasejanje svetlosti kao standardna suspenzija prikazane koncentracije. Međunarodno utvrđeni standard zamućenja je formazin. Jedna od najčešćih jedinica je naziv „FNU“, što znači „formazinske nefelometrijske jedinice“. Ovo je jedinica koja se koristi, na primer, u tretmanu vode za merenje na 90° u skladu sa propisima standarda ISO 7072.

Uporedni primer 1

10 postotni solubilizat Ksanto Flav pur-a

Koristi se

100 g Ksanto Flav pur-a i

900 g polisorbata 80

(= 71,2 g kurkumina)

Da bi se to uradilo, Ksanto Flav pur prah se mešanjem ugrađuje u polisorbat 80. Prašak se dodaje takvom brzinom da se ravnomerno apsorbuje u emulgator. Homogenizacija se nastavlja zagrevanjem na 83 do 87°C. Nakon što se postigne homogeni solubilizat, smeša se ohladi na temperaturu ispod 60°. Ksanto Flav solubilizat se zatim flašira i čuva na tamnom i hladnom mestu, odnosno ispod 25°C.

Primerna realizacija 2

10 postotni solubilizat Ksanto Flav pur-a s etanolom

Za ovu varijantu ksantohumol solubilizata se prema pronalasku koristi

100 g Ksanto Flav pur-a,

150 g etanola (96 postotni) neutralni alkohol 1411U i

750 g polisorbata 80

(= 71,2 g kurkumina)

Prvo, Ksanto Flav pur prah se rastvori u etanolu i zagreva do temperature između 48 i 52°C. Stvara se homogeni rastvor. Polisorbat 80 se zatim dodaje u rastvor Ksanto Flav pur u etanolu uz zagrevanje na 83 do 87°C.

Dodavanje se odvija takvom brzinom da se dva fluida dobro homogenizuju mešanjem. Dobijeni solubilizat se ohladi na ispod 60°C i flašira i čuva na tamnom i hladnom mestu, odnosno na temperaturi ispod 25°C.

Primerna realizacija 2A

10 postotni solubilizat Ksanto Flav pur-a sa etanolom se takođe može napraviti sa manje etanola i više polisorbata 80.

Za ovu varijantu ksantohumol solubilizata se prema pronalasku koristi

100 g Ksanto Flav pur-a,

100 g etanola (96 postotni) neutralni alkohol 1411U i

800 g polisorbata 80

(= 71,2 g kurkumina)

Prvo, Ksanto Flav pur prah se rastvori u etanolu i zagreva do temperature između 56 i 60°C. Stvara se homogeni rastvor. Dalja proizvodnja odgovara primernoj realizaciji 2.

Primerna realizacija 3

12 postotni solubilizat Ksanto Flav pur-a s etanolom

Za proizvodnju koristi se

120 g Ksanto Flav pur-a,

150 g etanola (96 postotni) neutralni alkohol 1411U i

730 g polisorbata 80

(= 71,2 g kurkumina)

12 postotni solubilizat Ksanto Flav pur proizvodi se na isti način kao u primernoj realizaciji 2.

Proizvedeni solubilizati su tamno braon boje i dobro teku uprkos blagoj viskoznosti. Rastvoren u vodi na oko 40 do 50°C u omjeru od 1:50, formira se blago zamućen rastvor tamno žute do oker boje. Koristeći HPLC merenja, potvrđen je sadržaj 10 postotnog solubilizata Ksanto Flav-a uključenog u micele za 10% solubilizata Ksanto Flav-a sa etanolom. Gustina ovog solubilizata je određena na 1 do 1,1 g/cm<3>korišćenjem merenja hidrometrom na 20°C. pH vrednost solubilizata bila je između 5 i 7 za rastvor pripremljen sa vodom u omjeru od 1:50. Ukupan broj bakterija bio je manji ili najviše jednak 1.000/g. Kvasci i plesni su bili maksimalno 100/g i nije bilo E. coli ili koliformnih klica u 1 g solubilizata prema Ph.Eur. metodi verzije koja je važila u oktobru 2014. godine.

Za ksantohumol solubilizat sa etanolom prema realizaciji 2, merenja zamućenosti su sprovedena u razblaženju u omjeru od 1:50 u vodi pri pH od 1,1 i temperaturi od 37°C, odnosno u fiziološkim uslovima. Prosečna vrednost za tri uzorka je 40,9 FNU, koja je izračunata iz pojedinačnih vrednosti od 26,0 FNU, 6,4 FNU i 90,2 FNU.

Da bi se izmerila veličina čestica ksantohumol solubilizata sa etanolom u skladu sa primerom izvođenja 2, on je prvo razblažen destilovanom vodom u odnosu 1:500 i doveden na 37°C uz stalno mešanje magnetnom mešalicom i uz pomoć rešoa.

pH je zatim podešen na 1,1 sa 32% hlorovodoničnom kiselinom.

Uzorci su zatim odmah izmereni. Rezultati raspodele intenziteta sumirani su u sledećoj tabeli.

Primerna realizacija 4

Ksantohumol solubilizat prema pronalasku se takođe može proizvesti dodavanjem glicerina.

3,8 postotni Ksanto Flav pur solubilizat sa glicerinom

Koristi se za proizvodnju 875 g solubilizata

33,3 g Ksanto-Flav pur praha

33,3 g glicerina 99,5%

808,4 g polisorbata 80

(= 71,2 g kurkumina)

Polisorbat 80 i glicerin se mešaju uz miksanje zagrevaju do temperature u opsegu od 48 do 52°C da bi se smesa dobro homogenizovala. Etanol se ubacuje u smesu polisorbat-glicerin uz tako snažno mešanje da se formira homogeni rastvor. Temperatura se održava konstantnom. Zatim se ksantohumol uključuje u rastvor polisorbata, glicerina i etanola. Temperatura se dalje povećava na vrednost u opsegu između 63°C i 67°C. Mešavina se meša tako snažno da se ksantohumol homogeno kombinuje sa predstavljenim rastvorom.

Druga mogućnost proizvodnje solubilizata prema pronalasku je upotreba estara šećera masnih kiselina kao emulgatora.

Primerna realizacija 5

10 postotni solubilizat Ksanto Flav

Koristi se

100 g Ksanto Flav praha,

598,5 g Estri šećera iz masnih kiselina (E 473) „Rioto L-1695“ i,

301,5 g etanola 96 postotni neutralni alkohol 1411U

(= 71,2 g kurkumina)

Estar šećera se meša sa etanolom uz mešanje na sobnoj temperaturi u temperaturnom opsegu od 20°C do 25°C tako da se formira homogena smesa. Smesa se zagreva do maksimalne temperature od 80°C uz mešanje. Mešanje se nastavlja sve dok se ne postigne homogen, providan rastvor. Zatim se dodaje Ksanto-Flav prah i dalje zagreva uz mešanje do temperature u opsegu od 83°C do 97°C. Mešavina se meša tako snažno da se ksantohumol homogeno kombinuje sa predstavljenim rastvorom. Nakon hlađenja do sobne temperature, solubilizat je tamno braon i providan. U ovom stanju se flašira i zatim skladišti.

Primerna realizacija 6

5 postotni solubilizat Ksanto Flav

Koristi se

50 g Ksanto Flav praha,

627 g estera šećera iz masnih kiselina (E 473) i

323 g etanola 96 postotni neutralni alkohol 1411U

(= 71,2 g kurkumina)

Estar šećera koji se koristi od masnih kiselina je mešavina

41% masenog udela saharoza mono-laurat,

32% masenog udela saharoze monopalmitata,

9% masenog udela saharoze di-laurata,

8,5% masenog udela saharoze di-palmitata.

7% masenog udela saharoze mono-stearata i

2,5% masenog udela saharoza di-stearata.

Ovaj estar šećera se meša sa etanolom uz mešanje na sobnoj temperaturi u temperaturnom opsegu od 20°C do 25°C tako da se formira homogena smesa. Ovo može uključivati blago zagrevanje do temperature u opsegu od 48°C do 52°C. Mešanje se nastavlja sve dok se ne postigne homogena mešavina ili rastvor. Zatim se dodaje Ksanto-Flav prah i dalje zagreva uz mešanje do temperature u opsegu od 83°C do 97°C. Mešavina se meša tako snažno da se ksantohumol homogeno kombinuje sa predstavljenim rastvorom. Nakon hlađenja do sobne temperature, solubilizat je tamno braon i providan. U ovom stanju se flašira i zatim skladišti.

Primerna realizacija 7

5 postotni solubilizat Ksanto Flav

Koristi se

50 g Ksanto Flav praha,

313,5 g estera šećera iz masnih kiselina (E 473) „Ryoto L-1695“,

313,5 g Estri šećera iz masnih kiselina (E 473) „Ryoto P-1670“ i

323 g etanola (96 postotni) neutralni alkohol Sorte1411U i

(= 71,2 g kurkumina)

Dva estra šećera u prahu se dodaju zajedno. Za ovaj korak nije potrebno mešanje. Estri šećera se onda mešaju sa etanolom uz mešanje na sobnoj temperaturi u temperaturnom opsegu od 20°C do 25°C tako da se formira homogena smesa. Smesa se zagreva do maksimalne temperature od 80°C uz mešanje. Mešanje se nastavlja sve dok se ne postigne homogen, providan rastvor. Zatim se dodaje Ksanto-Flav prah i dalje zagreva uz mešanje do temperature u opsegu od 83°C do 97°C. Mešavina se meša tako snažno da se ksantohumol homogeno kombinuje sa predstavljenim rastvorom. Nakon hlađenja do sobne temperature, solubilizat je tamno braon i providan. U ovom stanju se flašira i zatim skladišti.

Primerna realizacija 8

5 postotni solubilizat Ksanto Flav

Koristi se

50 g Ksanto Flav praha,

613,75 g estera šećera iz masnih kiselina (E 473) „Ryoto L-1695“,

318,25 g etanola 96 postotni neutralni alkohol 1411U

(= 71,2 g kurkumina)

Proizvodnja solubilizata odgovara postupku opisanom u primernoj realizaciji 7 samo sa jednim estrom šećera umesto dva korišćena.

Primerna realizacija 9

5 postotni solubilizat Ksanto Flav

Koristi se

50 g Ksanto Flav praha,

142,5 g estera šećera iz masnih kiselina (E 473) „Ryoto L-1695“,

332,5 g estera šećera iz masnih kiselina (E 473) „DUB SE 16 P“,

304 g etanola 96 postotni neutralni alkohol 1411U i

171 g Glicerin

(= 71,2 g kurkumina)

Dva estra šećera u prahu se dodaju zajedno. Za ovaj korak nije potrebno mešanje.

Estri šećera se zatim mešaju sa etanolom i glicerinom uz tako snažno mešanje na sobnoj temperaturi u temperaturnom opsegu od 20°C do 25°C uključujući i da se formira homogena smesa. Smesa se zagreva do maksimalne temperature od 80°C uz mešanje. Mešanje se nastavlja sve dok se ne postigne homogen, providan rastvor. Zatim se dodaje Ksanto-Flav prah i dalje zagreva uz mešanje do temperature u opsegu od 83°C do 97°C. Mešavina se meša tako snažno da se ksantohumol homogeno kombinuje sa predstavljenim rastvorom. Nakon hlađenja do sobne temperature, solubilizat je tamno braon i providan. U ovom stanju se flašira i zatim skladišti.

Primerna realizacija 10

5 postotni solubilizat Ksanto Flav

Koristi se

50 g Ksanto Flav praha,

71,25 g estera šećera iz masnih kiselina (E 473) „Ryoto L-1695“,

166,25 g estera šećera iz masnih kiselina (E 473) „DUB SE 16 P“,

475 g polisorbata 80,

152 g etanola 96 postotni neutralni alkohol 1411U i

82,5 g Glicerin

(= 71,2 g kurkumina)

Estri šećera se mešaju sa polisorbatom 80, etanolom i glicerinom uz mešanje na sobnoj temperaturi u temperaturnom opsegu od 20°C do 25°C tako da se formira homogena smesa. Ovo može uključivati blago zagrevanje do temperature u opsegu od 48°C do 52°C. Mešanje se nastavlja sve dok se ne postigne homogena mešavina ili rastvor. Zatim se dodaje Ksanto-Flav prah i dalje zagreva uz mešanje do temperature u opsegu od 83°C do 97°C. Mešavina se meša tako snažno da se ksantohumol homogeno kombinuje sa predstavljenim rastvorom. Nakon hlađenja do sobne temperature, solubilizat je tamno braon i providan.

Primerna realizacija 11

5 postotni solubilizat Ksanto Flav

Koristi se

50 g Ksanto Flav praha,

313,5 g estera šećera iz masnih kiselina (E 473) „Ryoto M-1695“,

313,5 g estera šećera iz masnih kiselina (E 473) „Ryoto P-1670“,

9,5 g lecitina kao fosfolipid i

313,5 g etanola 96 postotni neutralni alkohol 1411U

(= 71,2 g kurkumina)

Dva estra šećera u prahu se dodaju zajedno. Za ovaj korak nije potrebno mešanje. Lecitin je pomešan sa etanolom. Ovo može uključivati blago zagrevanje do temperature u opsegu od 40°C do 50°C. Mešavina estra šećera se zatim meša sa mešavinom etanola i lecitina uz tako snažno mešanje na sobnoj temperaturi u temperaturnom opsegu od 20°C do 25°C tako da se formira homogena smesa. Ako je potrebno, može se izvršiti lagano zagrevanje do temperature u opsegu od 40°C do 50°C. Ovo se takođe može uraditi dodavanjem prethodno zagrejane mešavine etanol-lecitina. Smesa se zagreva uz mešanje do maksimalne temperature od 80°C uz mešanje. Mešanje se nastavlja sve dok se ne postigne homogen, providan rastvor. Zatim se dodaje Ksanto-Flav prah i dalje zagreva uz mešanje do temperature u opsegu od 83°C do 97°C. Mešavina se meša tako snažno da se ksanto-flav prah ili ksantohumol homogeno kombinuju sa predstavljenim rastvorom. Nakon hlađenja do sobne temperature, solubilizat je tamno braon i providan. U ovom stanju se flašira i zatim skladišti.

Primerna realizacija 12

5 postotni solubilizat Ksanto Flav

Koristi se

50 g Ksanto Flav praha,

332,5 g estera šećera iz masnih kiselina (E 473) „Ryoto L-1695“,

142,5 g estera šećera iz masnih kiselina (E 473) „DUB SE 16 P“,

152 g etanola 96 postotni neutralni alkohol 1411U,

85,5 g glicerina i

237,5 g vode

(= 71,2 g kurkumina)

Dva estra šećera u prahu se dodaju zajedno. Za ovaj korak nije potrebno mešanje. Estri šećera se zatim mešaju sa etanolom, vodom i glicerinom uz tako snažno mešanje na sobnoj temperaturi u temperaturnom opsegu od 20°C do 25°C tako da se formira homogena smesa. Smesa se zagreva do maksimalne temperature od 80°C uz mešanje. Mešanje se nastavlja sve dok se ne postigne homogen, providan rastvor. Zatim se dodaje Ksanto-Flav prah i dalje zagreva uz mešanje do temperature u opsegu od 83°C do 97°C. Mešavina se meša tako snažno da se ksantohumol homogeno kombinuje sa predstavljenim rastvorom. Nakon hlađenja do sobne temperature, solubilizat je tamno braon i providan. U ovom stanju se flašira i zatim skladišti.

Primerna realizacija 13

10 postotni solubilizat Ksanto Flav

Koristi se

100 g Ksanto Flav praha,

315 g estera šećera iz masnih kiselina (E 473) „Ryoto L-1695“,

135 g estera šećera iz masnih kiselina (E 473) „DUB SE 16 P“,

144 g etanola 96 postotni neutralni alkohol 1411U,

81 g glicerina i

225 g vode

(= 71,2 g kurkumina)

Proizvodnja solubilizata odgovara postupku opisanom u primernoj realizaciji 12.

Da li je završena dovoljno potpuna homogenizacija komponenti za formiranje solubilizata prema pronalasku, proverava se tokom proizvodnje merenjem bistrine proizvoda korišćenjem laserskog zraka. Takvo merenje laserskog zraka može se izvesti, na primer, osvetljavanjem uzorka korišćenjem komercijalno dostupnog laserskog pokazivača, posebno sa talasnom dužinom u opsegu između 650 nm i 1.700 nm (crvena spektralna boja), a zatim vizuelnim pregledom osvetljenog ili transiluminiranog solubilizata. Kontrola se ne vrši uzorkovanjem i samim tim izvan reakcionog kotla, već u reakcionom kotlu.

Laserski zrak je usmeren okomito na reakcioni kotao kroz staklo za gledanje koje se nalazi na prednjoj strani reakcionog kotla. Ako se na zadnjoj unutrašnjoj strani reakcionog kotla pojavi samo jedna tačka svetlosti, potpuno bez rasejanja, nastale strukture čestica u reakcionom kotlu su manje od talasne dužine vidljive svetlosti i samim tim pružaju optičku potvrdu da je proces micelizacije završen.

Izmerene male veličine čestica povoljno rezultiraju formiranjem tečnosti koja je posebno bistra za ljudsko oko.

Bistrina solubilizata se takođe može pokazati njegovom niskom zamućenošću. Primenjena je sledeća radna hipoteza: Što je jasnije vodeno razblaživanje solubilizata ili druge formulacije ksantohumola, posebno u fiziološkim uslovima gastričnog prolaza, odnosno pri pH od 1,1 i temperaturi od 37°C, to je bolja njegova solubilizacija. Što je bolja solubilizacija, to je bolja bioraspoloživost aktivnog sastojka ili proizvoda koji ga sadrži.

To se već može videti iz posebno niske zamućenosti solubilizata, što se može shvatiti kao neka vrsta parametra za bioraspoloživost. Zamućenost solubilizata prema pronalasku je određena merenjem rasejane svetlosti infracrvenom svetlošću u skladu sa propisima standarda ISO 7027.

Transparentna i potpuno stabilna formulacija rastvorljiva u vodi prema pronalasku ima, bez ekscipijenata kao u mekim i tvrdim želatinskim kapsulama, u kapsulama bez želatina (tvrdim i/ili mekim) i u tečnim krajnjim proizvodima na bazi vode, nezavisnu stabilnu transparentnost od pH. Relevantna industrija hitno traži proizvode sa takvom transparentnošću i rastvorljivošću u vodi za inovativne proizvode kao punjenje kapsula. Prema saznanjima pronalazača, formulacija ksantohumola koja ispunjava ove zahteve još ne postoji.

Kao rezultat formulacije prema pronalasku u solubilizatu sa vrlo malim, stabilnim i enteričko-rezistentnim micelama, pronalazak stvara solubilizat ksantohumola za upotrebu kao dodatak ishrani i/ili lek, posebno za upotrebu kao dodatak ishrani i/ili lek za lečenje gojaznosti.

U okviru pronalaska, sadržaj ksantohumola u pojedinačnim solubilizatima se takođe može podesiti znatno više nego u prikazanom primeru, u zavisnosti od primene.

Ako su veće količine aktivnog sastojka postavljene, ovo je ograničeno činjenicom da ako se prekorači sadržaj pojedinačnog aktivnog sastojka za odgovarajući sastav, ne nastaje solubilizat već emulzija. Ako se sadržaj aktivnog sastojka poveća, odgovarajuće proporcije ostalih komponenti (u težinskim procentima) se nužno smanjuju. Iznad određene granice, dobija se disperzni sistem koji, međutim, nije nepovratno rastvorljiv u vodi kao solubilizati pronalaska i ima veoma nisku zamućenost izmerenu za ove solubilizate u fiziološkim uslovima gastričnog prolaza, tj. na pH 1,1 i 37°C. Takve disperzije mogu biti (nano)emulzije, ali nisu solubilizati u kojima su aktivni sastojak ili aktivni sastojci prisutni zatvoreni u veoma malim micelama. Međutim, prema iskustvu pronalazača, samo solubilizati omogućavaju značajno povećanu bioraspoloživost aktivnog sastojka ili aktivnih sastojaka prema pronalasku, čak i ako emulzija dozvoljava veće punjenje aktivnog sastojka.

Studije o uticaju ksantohumola na telesnu težinu sprovedene su na medicinskom fakultetu Fridrih-Aleksandar univerziteta Erlangen Nirnberg (FAU). Primenjena je dnevna doza od 2,5 mg/kg telesne ksantohumola. U tu svrhu je korišćen solubilizat od podnosioca predstavke. Ovo je proizvedeno od 100 g „Ksanto-Flav Pur“, 150 g 96 postotnog etanola i 750 g polisorbata 80. Da bi se podesila koncentracija na 0,375 mg/ml, solubilizat je razblažen dvostruko destilovanom vodom („ddH2O“). Na pratećim slikama, odgovarajući podaci su označeni sa „s-XN“.

Za poređenje, odgovarajući eksperimenti su sprovedeni sa istom dozom prirodnog ksantohumola. Vodeni rastvor metil hidroksipropil celuloze (MHPC, 0,2%, Methocel E4M Prmium CR, Hipromellose 2910 USP, Fragron Inc., Minnesota, SAD) je korišćen za rastvaranje prirodnog ksantohumola.

Odgovarajući podaci su označeni sa „n-XN“.

Rastvori su pripremani sveže nedeljno i čuvani na hladnom mestu, zaštićeno od svetlosti.

Mužjaci soja C57BL/6 u dobi od 8 nedelja ili su dobijali uobičajenu hranu ili su hranjeni „prehranom zapadnog tipa“ koja se sastojala od 15% masti, 15% goveđeg loja, 4% palmitinske kiseline, 4% stearinske kiseline, 0,2% holesterola i 30% saharoze. U kontrolnoj grupi (CTRL), koja je dobijala uobičajenu hranu, kao terapiju („prenosnik“ VH) davan je vodeni rastvor metil hidroksipropil celuloze (MHPC, 0,2%, methocel<™>E4M prem), kao što je to bio slučaj u „prehrani zapadnog tipa“ - Grupa („WTD“).

Druge grupe su primile aplikantov ksantohumol solubilizat („s-XN“) ili nativni ksantohumol („n-XN“) pored WTD-a. Terapija je sprovedena tokom 8 nedelja.

Posle sedam nedelja upotrebe solubilizata ili prirodnog ksantohumola, urađen je intraperitonealni test tolerancije glukoze (ipGTT). Nakon 12 sati gladovanja, miševima je intraperitonealno ubrizgan rastvor glukoze u koncentraciji glukoze od 50% (masa glukoze po zapremini) u dozi od 3 mg glukoze po g telesne težine.

Koncentracija glukoze u krvi je merena u uzorcima uzetim iz repne vene pre („glukoza natašte”) i posle 30, 60, 80 i 120 minuta nakon primene glukoze. Merenje je obavljeno pomoću glukometra „accutrend“ (Roche, Mannheim, Nemačka).

Da bi se kvantifikovali lipidi jetre, oni su ekstrahovani i količina triglicerida („nivo hepatičnih triglicerida“) je određena korišćenjem „GPO-trigliceridnog kompleta“ (Sigma, Deisenhofen, Nemačka) kao u „Vobser et al.: „Lipid accumulation in hepatocytes induces fibrogenic activation of hepatic stellate cells“, Cell Res 2009; 19: 996 - 1005“ opisano.

Izolacija RNK iz tkiva jetre, reverzna transkripcija i kvantitativna analiza lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu sprovedeni su korišćenjem LightCycler tehnologije (Roche) i specifičnih testova za prajmere kao u „Hellebrand et al.: „Promoter- hypermethylation is causing functional relevant downregulation of methylthioadenosine phosphorylase (MTAP) expression in hepatocellular carcinoma“, Carcinogenesis 2006; 27: 64 - 72“ opisano.

Za histološku analizu, uzorci tkiva jetre miševa su fiksirani u 4 postotnu formalinu na sobnoj temperaturi tokom 24 sata, sušeni u uzlaznoj seriji etanola i uključeni u parafin. Sekcije ovih blokova tkiva fiksiranih formalinom, debljine 5 mikrometara, su deparafinizovane ksilenom i obojene hematoksilinom i eozinom kao u „Dorn et al.: „Increased expression of c-Jun in nonalcoholic fatty liver disease“, Lab Invest. 2014; 94: 394 - 408“ opisano.

Rezultati eksperimenata koji su gore objašnjeni su grafički prikazani na priloženim slikama. Pokazuju:

Slike 1A do D Efekti na povećanje telesne težine i akumulaciju (visceralne) masti kada se daje ksantohumol solubilizat (s-XN) ili nativni ksantohumol (n-XN) tokom WTD dijete;

Slika IE i F Efekti na glukozu natašte i toleranciju na glukozu kada se daje ksantohumol solubilizat (s-XN) ili nativni ksantohumol (n-XN) tokom WTD dijete;

Slike 2 Efekti na steatozu, težinu jetre i količinu triglicerida u jetri kada je ksantohumol solubilizat (s-XN) ili prirodni ksantohumol (n-XN) primenjen tokom WTD dijete;

Slike 3 Efekti na oslobađanje gena koji izazivaju fibrozu u jetri („hepatična ekspresija profibrogenetskih gena“ kada se daje ksantohumol solubilizat (s-XN) ili nativni ksantohumol (n-XN) tokom WTD dijete; i

Slike 4 Efekti na oslobađanje proteina koji izazivaju cirozu jetre kada se daje ksantohumol solubilizat (s-XN) ili nativni ksantohumol (n-XN) tokom WTD dijete;

Oznaka „*“ na slikama znači p < 0,05 u poređenju sa podacima za „terapiju“ sa prenosnikom (VH). Oznaka „#“ na slikama znači p < 0,05 u poređenju sa podacima za kontrolnu grupu (CTR).

Na Univerzitetu u Kairu na Farmaceutskom fakultetu Instituta za farmakologiju prof.dr. MT Khaiial je sproveo dalje studije o antiinflamatornom dejstvu ksantohumola, takođe u kombinaciji sa kurkuminom, svaki u prirodnom obliku ili u rastvorenom obliku prema pronalasku. Rezultati ovih testova su grafički prikazani na sledećim slikama. Pokazuju:

Slika 5 Uticaj ksantohumola u prirodnom i rastvorenom obliku na sadržaj CRP u serumu (pg/l), i

Slika 6 Uticaj ksantohumola u prirodnom i rastvorenom obliku na sadržaj MPO u serumu (mU/ml).

WTD je izazvala ne samo povećanje telesne težine (Slika 1A), već i značajno povećanje mase visceralnog i potkožnog masnog tkiva. Na osnovu fotografskih slika testiranih životinja prema slikama 1C i ID, pokazano je da je primena ksantohumol solubilizata dovela do smanjenja mase visceralne masti.

Hranjenje WTD je dalje rezultiralo višom glukozom natašte i smanjenom tolerancijom glukoze u poređenju sa miševima hranjenim kontrolnom hranom, što ukazuje na insulinsku rezistenciju (uporediti slike IE i 1F). Primena ksantohumol solubilizata prema pronalasku je dovela do značajnog poboljšanja povišenih vrednosti glukoze natašte i tolerancije glukoze, dok nativni ksantohumol nije doneo ovaj efekat.

Kao rezultat, primena solubilizovanog ksantohumola prema pronalasku je poboljšala gojaznost izazvanu WTD i insulinsku rezistenciju.

Štaviše, WTD je izazvala povećanje veličine jetre eksperimentalnih životinja, što se može videti kako na fotografijama organa koji su uklonjeni sa životinja na kraju serije testova (slika 2A) tako i u povećanju težina jetre (slika 2B). Svetla boja jetre takođe ukazuje na akumulaciju masti u jetri (steatoza) (slika 2A za primenu prenosnika i prirodnog ksantohumola). Primena solubilizata prema pronalasku pored WTD-a je rezultirala skoro potpuno ukidanjem povećanja težine jetre, tj. vraćanjem na početnu vrednost (slika 2B).

WTD je takođe dovela do povećanja nivoa triglicerida u jetri. Histologija jetre je takođe potvrdila nalaz masne jetre (steatoza jetre). Primena ksantohumol solubilizata prema pronalasku zajedno sa WTD dovela je do značajnog smanjenja količine triglicerida u jetri (slika 2C), što je pokazano i u histološkim pregledima u kojima je primećena samo minimalna steatoza u poređenju sa kontrolom. grupa.

Markeri zapaljenja jetre (ekspresija proinflamatornog hemokina MCP-1 i citokina CKSCL1) su značajno povećani od strane WTD u poređenju sa kontrolom (videti slike 3A i 3B). Primena ksantohumol solubilizata prema pronalasku zajedno sa WTD dovela je do značajnog smanjenja povećanja ova dva parametra (videti sliku 3A).

Kvantitativna kPCR analiza jetre miševa hranjenih WTD pokazala je povećanu ekspresiju aktina alfasmooth mišića (a-SMA), proteina glatkih mišića (videti sliku 4A). Protein a-SMA je utvrđeni marker aktiviranih zvezdastih ćelija jetre (HSC), koje izazivaju cirozu jetre. Imunohistohemijska analiza proteina α-SMA potvrdila je da WTD izaziva značajnu aktivaciju HSC (slika 4B). Ovo je praćeno značajno povećanom ekspresijom kolagena tipa 1 (COL1A1) u jetri miševa hranjenih WTD u poređenju sa kontrolnom grupom (slika 4C). Kolagen tip 1 (COL1A1) je kvantitativno i kvalitativno najvažniji protein ekstracelularnog matriksa u fibrozi jetre.

Važno je napomenuti da tretman sa solubilizovanim ksantohumolom prema pronalasku značajno ometa ekspresiju α-SMA i kolagena tipa 1 indukovanu WTD, dok nativni ksantohumol ne pokazuje gotovo nikakve efekte (slike 4A, 4B i 4C).

Solubilizat prema pronalasku je stoga pogodan za smanjenje zapaljenja jetre, steatoze i fibroze koja se već razvila.

Ovi nalazi su posebno iznenađujući jer je ksantohumol davan sa solubilizatom prema pronalasku organizmima koji su već bili oštećeni prethodnom ishranom posle WTD. U biološkim sistemima ili u vezi sa ispitivanjem aktivnih supstanci za bolesti, mnogo je lakše pokazati efekat ako se aktivna supstanca primenjuje od početka zajedno sa agensom ili mehanizmom koji izaziva bolest, ovde WTD. U kontekstu gore opisanih studija, solubilizat prema pronalasku je davan samo kada je gojaznost već bila manifestovana ili kada je oštećenje organa već uznapredovalo, odnosno u fazi terapije eksperimenta.

Doze za ljude koje odgovaraju dozama utvrđenim u daljim eksperimentima na životinjama na pacovima su izračunate kao što je opisano u nastavku. Preračunavanje doze za pacove u dozu za ljude, u mg po kg telesne težine i dan, vrši se prema jednačini

Primer primene 5 mg ksantohumola je objašnjen u nastavku:

≙ 5 mg ksantohumola/kg telesne težine pacova

≙ 0,81 mg ksantohumola/kg telesne težine čoveka.

Na osnovu telesne težine od 70 kg, dnevna doza za ljude je:

÷Ksantohumol:

((5 ÷ 37) x 6) x 70 = 56,76 mg ksantohumola/čovek/dan

Ovo rezultira sledećom količinom solubilizata za dnevnu dozu za čoveka. Sledeći proračun je izveden za 10 postotni solubilizat ksantohumola.

Ksantohumol: 56,76 mg x 10 = 567,60 mg solubilizata

Ovo rezultira polisorbatom:

567,60 mg solubilizata x 0,75 = 425,70 mg polisorbata u ukupnoj količini solubilizata.

Uz pretpostavku telesne težine od 70 kg i preporuku SZO o dnevnom unosu od 25 mg polisorbata (= 1.750 mg polisorbata/dan), svi gore opisani rastvori su u okviru preporučene dnevne količine SZO.

Na Univerzitetu u Kairu na Farmaceutskom fakultetu Instituta za farmakologiju prof.dr. MT Khayyal sproveo je studije o antiinflamatornom dejstvu kurkumina i kombinaciji kurkumina sa ksantohumolom u prirodnom obliku ili u rastvorenom obliku prema pronalasku.

Određeni su antiinflamatorni markeri i antioksidativni kapacitet. Ženke Vistar pacova sa telesnom težinom između 150 i 200 g bile su podvrgnute „adjuvantno indukovanom artritisu” prema „Pearson et al. (1956)”. Životinjama je dato 0,1 ml Freundovog adjuvansa (FCA) subplantarnom injekcijom u desnu zadnju šapu 0. dana. Životinje su nasumično podeljene u 12 grupa od po 8 životinja. U okviru istraživanja ksantohumol solubilizata prema pronalasku, od interesa su sledeće grupe:

Grupa 1 je formirala kontrolnu grupu.

Grupa 2 je primala diklofenak kao referentni lek u dozi od

3 mg/kg telesne težine.

Grupa 7 je primala nativni ksantohumol u dozi od 5 m/kg telesne težine i

Grupa 8 je primala ksantohumol u istoj dozi.

Grupa 12 je primila mešavinu solubilizovanog kurkumina i solubilizovanog ksantohumola, svaki u istoj dozi.

Svi ekstrakti ili solubilizati su davani oralno jednom dnevno od dana 0 do dana 21 nakon vakcinacije sa adjuvansom. Posle 21. dana, životinje su ubijene i uzorci seruma su pripremljeni i čuvani na -80°C. Merene su mijeloperoksidaza (MPO), C-reaktivni protein (CRP), ukupni antioksidativni kapacitet (TAC) i reaktivne supstance tiobarbituratne kiseline (TBARS).

Rezultati istraživanja su objašnjeni u nastavku koristeći

priložene slike 5 i 6.

Prvo su ispitani efekti na C-reaktivni protein (CRP). C-reaktivni protein je specifičan marker za antiinflamatornu aktivnost. Sam ksantohumol ima uporediv efekat sa diklofenakom i pokazao je bolju antiinflamatornu aktivnost u rastvorenom obliku u poređenju sa nativnim oblikom (slika 5).

Mijeloperoksidaza (MPO) u plazmi igra centralnu ulogu kao proinflamatorni medijator kod reumatoidnog artritisa i indikator je migracije neutrofila u zahvaćeno tkivo. Njegova koncentracija je povećana kod pacijenata sa reumatoidnim artritisom i izaziva oksidativni stres. Sam nativni oblik ksantohumola imao je mali uticaj na koncentraciju MPO u serumu, dok je solubilizovani oblik ksantohumola skoro jednako efikasan kao diklofenak (slika 6).

Oksidativni stres je jedan od glavnih faktora koji doprinose destrukciji zglobova kod reumatoidnog artritisa (RA). Povećanje proizvodnje takozvanih „reaktivnih vrsta kiseonika (ROS)“ dovodi do smanjenog snabdevanja endogenim antioksidansima i na kraju dovodi do uništenja ćelija. Neutrofilni granulociti koji se oslobađaju u reumatoidnom zglobu proizvode slobodne radikale kiseonika, koji dovode do povećanog stvaranja lipidnih peroksida, što se ogleda u povećanju TBARS u serumu. Stoga se povećanje antioksidativnog statusa, predstavljeno povećanjem TAC-a, može koristiti kao indikacija zaštite od razvoja degenerativnih inflamatornih procesa. Postoji inverzna veza između nivoa TAC i TBARS, visok nivo antioksidativnog kapaciteta TAC odgovara niskoj koncentraciji TBARS.

Sledeća tabela sadrži podatke o dejstvu kurkumina kao poređenje i ksantohumola u odnosu na pronalazak u prirodnom i solubilizovanom obliku, bilo dato samostalno ili u kombinaciji sa diklofenakom u dozi od 3 mg/kg telesne težine jednom dnevno za 15 dana do 21 dan na antioksidans Kapacitet TAC i supstance koje reaguju na tiobarbiturnu kiselinu TBARS u serumu artritičnih pacova (n=8). Date su srednje vrednosti ± standardne greške SEM.

Sam ksantohumol rastvoren prema pronalasku bio je skoro jednako efikasan kao diklofenak u smanjenju TBARS i povećanju TAC u serumu pacova sa artritisom, kao što pokazuju podaci u tabeli.

Bistrina solubilizata se takođe može pokazati njegovom niskom zamućenošću. Primenjena je sledeća radna hipoteza: Što je jasnije vodeno razblaživanje solubilizata ili druge formulacije ksanhohumola, posebno u fiziološkim uslovima gastričnog prolaza, odnosno pri pH od 1,1 i temperaturi od 37°C, to je bolja njegova solubilizacija. Što je bolja solubilizacija, to je bolja bioraspoloživost aktivnih sastojaka ili proizvoda koji ih sadrži.

Ova bioraspoloživost se već može videti u posebno niskoj zamućenosti solubilizata, što se može shvatiti kao neka vrsta parametra za bioraspoloživost.

Kao rezultat formulacije prema pronalasku u solubilizatu sa vrlo malim, stabilnim i enteričko-rezistentnim micelama, pronalazak stvara solubilizat ksantohumola za upotrebu kao dodatak ishrani i/ili lek, posebno za upotrebu kao dodatak ishrani i/ili kao lek sa antiinflamatornom aktivnošću.

Stručnjacima će biti očigledno da pronalazak nije ograničen na primere opisane iznad, već može da varira na mnogo načina. Posebno, karakteristike pojedinačno predstavljenih primera se takođe mogu kombinovati jedna sa drugom ili razmenjivati jedna za drugu.

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Bezvodni solubilizat koji se sastoji od,

Ksantohumola sa udelom manjim ili jednakim 35% masenog udela, poželjno manjim ili jednakim 15% masenog udela, posebno poželjno 2% masenog udela do 12% masenog udela i

najmanje jednog emulgatora sa HLB vrednošću u opsegu između 13 i 18, koji se posebno bira iz grupe koju čine polisorbat 80, polisorbat 20, estri šećera iz masnih kiselina (E 473) kao i fosfolipidi, posebno lecitin, a mešavine najmanje dva od pomenutih uključuju emulgatore,

i do 35% masenog udela, poželjno do 20% masenog udela, posebno poželjno do 15% masenog udela etanola

i po izboru do 25% masenog udela, poželjno do 10%

masenog udela, glicerina.

2. Solubilizat prema patentnom zahtevu 1,karakterisan time što solubilizat sadrži, kao izvor ksantohumola, etanolni ekstrakt tvrdih smola iz hmelja, naznačen time što se ksantohumol u ovom ekstraktu nalazi u koncentraciji u opsegu između 60% masenog udela i 95% masenog udela, poželjno u jednoj koncentraciji u opsegu od 65% masenog udela do 85% masenog udela.

3. Solubilizat prema patentnom zahtevu 1 ili 2,karakterisan time što

emulgator je polisorbat 80 ili polisorbat 20 ili mešavina polisorbata

20 i polisorbata 80,

ili da je emulgator estra šećera masne kiseline ili mešavina najmanje dva estra šećera masnih kiselina,

ili da je emulgator mešavina polisorbata 80 ili polisorbata 20 ili mešavina polisorbata 80 i polisorbata 20 sa najmanje jednim estrom šećera masne kiseline,

ili da je emulgator mešavina najmanje jednog fosfolipida, posebno lecitina, sa najmanje jednim estrom šećera masne kiseline.

4. Solubilizat prema jednom od prethodnih patentnih zahteva,

karakterisan time što je odnos emulgatora, posebno polisorbata 80, prema ksantohumolu u opsegu između 30:1 i 3:1, poželjno u opsegu između 25:1 i 5:1, poželjno u opsegu između 9,8:1 do 6,6:1.

5. Solubilizat prema jednom od prethodnih patentnih zahteva,

karakterisano time što sadržaj emulgatora, posebno sadržaj polisorbata, je najmanje 45% masenog udela, poželjno u opsegu 60% i 95% masenog udela, posebno poželjno u opsegu između 73% i 90% masenog udela.

6. Solubilizat prema jednom od prethodnih patentnih zahteva,

karakterisano time što je raspodela prečnika micela u razblaženju rastvora destilovanom vodom u odnosu od 1:500 na pH 1,1 i 37°C od približno d10=70 nm do dovoljno je približno d90=160 nm.

7. Solubilizat prema jednom od prethodnih patentnih zahteva,

karakterisano time što

je zamućenost solubilizata manja od 100 FNU, poželjno manja od 50 FNU, merena je merenjem raspršene svetlosti infracrvenim svetlom u skladu sa propisima standarda ISO 7027 sa razblaženjem. solubilizata u odnosu 1:50 u vodi na pH 1,1 i 37°C.

8. Kapsula punjena bezvodnim solubilizatom prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, karakterisano time što

kapsula je dizajnirana kao meka želatinska kapsula ili tvrda želatinska kapsula ili kao meka kapsula bez želatina ili kao tvrda kapsula bez želatina, npr. celulozna kapsula.

9. Tečnost koja sadrži solubilizat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7,

karakterisano time što tečnost se bira iz grupe koju čine hrana, kozmetika i farmaceutski proizvodi.

10. Postupak za proizvodnju solubilizata prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7,

koji se sastoji od sledećih koraka

a) sadržavanje najmanje jednog emulgatora sa HLB vrednošću u opsegu između 13 i 18, koji se posebno bira iz grupe koju čine polisorbat 80, polisorbat 20, estri šećera iz masnih kiselina (E 473) kao i fosfolipidi, posebno lecitin, a mešavine najmanje dva od pomenutih uključuju emulgatore,

b) dodavanje etanola,

c) zagrevanje na temperaturu do 85°C, poželjno do 80°C, uz mešanje, na primer miksanjem,

d) dodavanje etanolnog ekstrakta tvrdih smola iz hmelja pri mešanju, na primer miksanjem,

11. Postupak prema patentnom zahtevu 10

naznačen time što se pre koraka a) sprovodi korak

b1) rastvaranje etanolnog ekstrakta tvrdih smola iz hmelja u etanolu uz zagrevanje do temperature u opsegu od 40°C do 62°C, poželjno do temperature u opsegu od 45°C do 57°C, posebno poželjno do temperatura u opsegu od

48°C do 52°C,

12. Postupak prema patentnom zahtevu 11,

naznačen time što u koraku c) sledi zagrevanje na nižu temperaturu u opsegu od 40°C do 62°C, poželjno do temperature u opsegu od 45°C do 57°C, posebno poželjno do temperature u opsegu 48°C i 52°C.

13. Postupak prema patentnom zahtevu 12,

naznačen time što se u koraku b) sledi dodavanje fosfolipida, posebno dodavanje lecitina, zajedno sa etanolom.

14. Postupak prema jednom od patentnih zahteva 11 do 13,

naznačen time što u koraku b) sledi dodavanje glicerin zajedno sa etanolom.