RS63362B1

RS63362B1 - Formulacije koje sadrže rekombinantnu kiselu alfa-glukozidazu

Info

Publication number: RS63362B1
Application number: RS20220642A
Authority: RS
Inventors: Hing Char; Sergey Tesler; Wendy Sunderland; Enrique Diloné; Hung Do; Russell Gotschall
Original assignee: Amicus Therapeutics Inc
Priority date: 2016-03-30
Filing date: 2017-03-30
Publication date: 2022-07-29
Also published as: CY1125413T1; TWI813388B; EP3436053A1; TWI820564B; TW201733614A; EP3436053B1; DK3436053T3; CN114712490B; PL3436053T3; TW202402323A; LT3436053T; CN109475607B; TWI774670B; ES2921673T3; HRP20220817T1; PT3436053T; EP4098274A1; SMT202200279T1; HUE059014T2; CN114712490A

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST

[0001] Principi i otelotvorenja ovog pronalaska se generalno odnose na formulacije koje sadrže rekombinantnu kiselu α-glukozidazu, a posebno tečne formulacije.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Pompeova bolest, takođe poznata kao nedostatak kisele maltaze ili bolest skladištenja glikogena tip II, jedan je od nekoliko poremećaja skladištenja lizozoma. Poremećaji skladištenja lizozoma su grupa autozomnih recesivnih genetskih bolesti koje karakteriše akumulacija ćelijskih glikosfingolipida, glikogena ili mukopolisaharida unutar intracelularnih odeljaka koji se nazivaju lizozomi. Osobe sa ovim poremećajima nose gene mutante koji kodiraju enzime koji su defektni u katalizaciji hidrolize jedne ili više ovih supstanci, koje se zatim nakupljaju u lizozomima. Drugi primeri lizozomalnih poremećaja uključuju Gošeovu bolest, GM1-gangliozidozu, fukozidozu, mukopolisaharidoze, Hurler-Scheie bolest, Niman-Pikovu bolest tipa A i B i Fabrijevu bolest. Pompeova bolest se takođe klasifikuje kao neuromišićna bolest ili metabolička miopatija.

[0003] Procenjuje se da se Pompeova bolest javlja kod oko 1 od 40.000 rođenja, a uzrokovana je mutacijom GAA gena, koji kodira enzim lizozomalnu α-glukozidazu (EC:3.2.1.20), takođe poznat kao kisela α-glukozidaza. Kisela α-glukozidaza je uključena u metabolizam glikogena, razgranatog polisaharida koji je glavni oblik skladištenja glukoze kod životinja, tako što katalizuje njenu hidrolizu u glukozu unutar lizozoma. Pošto osobe sa Pompeovom bolešću proizvode mutantnu, defektnu kiselu α-glukozidazu koja je neaktivna ili ima smanjenu aktivnost, razgradnja glikogena se odvija sporo ili je uopšte nema, a glikogen se akumulira u lizozomima različitih tkiva, posebno u poprečno-prugastim mišićima, što dovodi do širokog spektra kliničkih manifestacija, uključujući progresivnu slabost mišića i respiratornu insuficijenciju. Posebno su pogođena tkiva kao što su srce i poprečno-prugasti mišići.

[0004] Pompeova bolest može uveliko varirati u stepenu nedostatka enzima, težini i godina starosti početka, a identifikovano je preko 500 različitih mutacija u GAA genu, od kojih mnoge izazivaju simptome bolesti različite težine. Bolest je klasifikovana u široke tipove: rani početak ili infantilni i kasni početak. Raniji početak bolesti i niža enzimska aktivnost su generalno povezani sa težim kliničkim tokom. Infantilna Pompeova bolest je najteža, nastala kao rezultat potpunog ili skoro potpunog nedostatka kisele α-glukozidaze, i manifestuje se simptomima koji uključuju ozbiljan nedostatak mišićnog tonusa, slabost, uvećanu jetru i srce i kardiomiopatiju. Jezik može postati uvećan i izbočen, a gutanje može postati otežano.

Većina pogođene dece umire od respiratornih ili srčanih komplikacija pre druge godine. Kasni početak Pompeove bolesti može se pojaviti u bilo kom uzrastu starijem od 12 meseci i karakteriše ga to što nije zahvaćeno srce i bolja kratkoročna prognoza. Simptomi su povezani sa progresivnom disfunkcijom poprečno-prugastih mišića i uključuju generalizovanu slabost mišića i atrofiju respiratornih mišića u trupu, proksimalnim donjim udovima i dijafragmi. Neki odrasli pacijenti su lišeni značajnih simptoma ili motoričkih ograničenja. Prognoza generalno zavisi od stepena zahvaćenosti respiratornih mišića. Kod većine subjekata sa Pompeovom bolešću, bolest na kraju napreduje do fizičke iscrpljenosti koja zahteva upotrebu invalidskih kolica i mehaničke ventilacije, sa preranom smrću koja se često javlja zbog respiratorne insuficijencije.

[0005] Nedavne opcije lečenja Pompeove bolesti uključuju terapiju zamene enzima (eng. enzyme replacement therapy - TZE) sa rekombinantnom humanom kiselinom αglukozidazom (rhGAA). Konvencionalni proizvodi rhGAA poznati su pod nazivima alglukozidaza alfa, Miozyme<®>ili Lumizyme<®>kompanije Genzyme, Inc. TZE je hronična terapija koja je potrebna tokom celog životnog veka pacijenta i uključuje davanje zamenskog enzima intravenskom infuzijom. Zamenski enzim se zatim transportuje u cirkulaciju i ulazi u lizozome unutar ćelija, gde deluje na razgradnju akumuliranog glikogena, nadoknađujući manjak aktivnosti endogenog defektnog mutantnog enzima, i na taj način ublažava simptome bolesti.

[0006] Način na koji se zamenski enzimi, kao što je rhGAA, pripremaju, skladište, transportuju i daju pacijentima je težak. Enzimi koji se koriste u TZE su generalno relativno složeni i delikatni, čineći izbor pratećih pufera, ekscipijenata itd. kritičnim. Ako enzim nije pravilno sačuvan, mogu biti potrebne velike količine, što tretman čini skupim i neefikasnim.

[0007] Neki konvencionalni proizvodi rhGAA daju se pacijentima kao liofilizovani (osušeni zamrzavanjem) prah u bočicama za jednokratnu upotrebu bez konzervansa. rhGAA se zatim mora rekonstituisati u bočicama, zatim razblažiti i primeniti intravenozno. Iako liofilizacija pomaže u očuvanju enzima nakon proizvodnje dok ne bude spreman za primenu pacijentu, ovaj proces sam po sebi može oštetiti enzim. Stoga treba posvetiti veliku pažnju odabiru komponenti u formulaciji rhGAA tako da pomažu u očuvanju koncentracije i aktivnosti proteina.

[0008] Štaviše, rekombinantni enzimi se često strukturno razlikuju od enzima divljeg tipa. Čak i ako aminokiseline u rekombinantnom enzimu mogu da budu identične kao kod njegovog dvojnika divljeg tipa, mogu postojati razlike u hemiji ugljenih hidrata. Stoga, kako se otkrivaju novi rekombinantni enzimi, formulacije za enzime moraju biti razvijene specifično za hemiju novootkrivenih enzima.

[0009] Shodno tome, postoji stalna potreba za formulacijama za skladištenje i transport rekombinantnih enzima, kao što je rhGAA, koji čuvaju aktivnost i koncentraciju enzima.

SAŽETAK

[0010] Jedan aspekt pronalaska se odnosi na farmaceutsku formulaciju. U jednom aspektu, formulacija sadrži:

(a) rekombinantna kisela α-glukozidaza, pri čemu je rekombinantna kisela α-glukozidaza eksprimirana u ćelijama jajnika kineskog hrčka (eng: Chinese hamster ovary - CHO) i sadrži najmanje 3 mola ostataka manoza-6-fosfata i najmanje 4 mola ostatka sijalinske kiseline po molu rhGAA

(b) citratni pufer; i

(c) najmanje jedan ekscipijent izabran iz grupe koju čine manitol, polisorbat 80 i njihove kombinacije,

pri čemu formulacija ima pH od oko 5,0 do oko 7,0.

[0011] Drugi aspekt pronalaska odnosi se na liofilizovanu farmaceutsku kompoziciju.

[0012] Drugi aspekt se odnosi na metodu lečenja Pompeove bolesti. Drugi aspekt sadrži razblaživanje farmaceutske formulacije pre davanja pacijentu. Sledeći aspekt se odnosi na postupak lečenja Pompeove bolesti koji sadrži: rekonstituisanje farmaceutske kompozicije i davanje rekonstituisane farmaceutske kompozicije pacijentu kome je to potrebno.

[0013] Drugi aspekt pronalaska se odnosi na postupak za pripremu gore navedenih farmaceutskih formulacija. Shodno tome, jedan aspekt se odnosi na metodu za pripremu farmaceutske formulacije koja obuhvata: dodavanje najmanje jednog pufera, najmanje jednog ekscipijenta i rekombinantne kisele α-glukozidaze u vodu da bi se dobio rastvor; opciono prilagođavanje pH rastvora; i opciono dodavanje dodatne vode u rastvor. Dalji aspekt uključuje modifikaciju postupka koji dalje sadrži filtriranje rastvora, opciono dalje sadrži čuvanje rastvora. Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0014] Dalje karakteristike ovog otkrića će postati očigledne iz pisanog opisa u nastavku i pratećih slika, u kojima:

Slika 1A prikazuje nefosforilisani glikan sa visokim sadržajem manoze, mono-M6P glikan i bis-M6P glikan.

Slika 1B prikazuje hemijsku strukturu M6P grupe.

Slika 2A opisuje produktivno ciljanje rhGAA preko glikana koji nose M6P na ciljna tkiva (npr. mišićno tkivo ispitanika sa Pompeovom bolešću).

Slika 2B opisuje neproduktivni klirens leka za neciljana tkiva (npr. jetra i slezina) ili vezivanje ne-M6P glikana za neciljana tkiva.

Slike 3A i 3B, respektivno, su grafikoni koji pokazuju rezultate CIMPR afinitetne hromatografije za Lumizyme<®>i Miozyme<®>. Isprekidane linije se odnose na gradijent eluiranja M6P. Elucija sa M6P zamenjuje GAA molekule vezane preko glikana koji sadrži M6P za CIMPR. Kao što je prikazano na slici 2A, 78% aktivnosti GAA u Lumizyme<®>eluirano je pre dodavanja M6P. Slika 2B pokazuje da je 73% aktivnosti GAA Miozyme<®>eluirano pre dodavanja M6P. Samo 22% ili 27% rhGAA u Lumizyme<®>ili Miozyme<®>, respektivno, eluirano je sa M6P. Ove brojke pokazuju da većini rhGAA u ova dva konvencionalna rhGAA proizvoda nedostaju glikani koji imaju M6P potreban za ciljanje CIMPR u ciljnim mišićnim tkivima.

Slika 4 prikazuje DNK konstrukt za transformaciju CHO ćelija sa DNK koja kodira rhGAA. CHO ćelije su transformisane sa DNK konstruktom koji kodira rhGAA. Slike 5A i 5B, respektivno, su grafikoni koji prikazuju rezultate CIMPR afinitetne hromatografije za Miozyme<®>i ATB200 rhGAA. Kao što se vidi na slici 5B, oko 70% rhGAA u ATB200 rhGAA sadrži M6P.

Slika 6 je grafikon koji prikazuje rezultate CIMPR afinitetne hromatografije ATB200 rhGAA sa i bez hvatanja na koloni anjonske izmene (AEX).

Slika 7 je grafikon koji prikazuje profile eluiranja Polywax polimera iz Lumizyme<®>i ATB200 rhGAA.

Slika 8 je tabela koja prikazuje rezime N-glikanskih struktura Lumizyme<®>u poređenju sa tri različita preparata ATB200 rhGAA, identifikovanih kao BP-rhGAA, ATB200-1 i ATB200-2.

Slike 9A-9H prikazuju rezultate analize N-glikozilacije ATB200 rhGAA specifične za mesto.

Slika 10A je grafikon koji upoređuje afinitet vezivanja za CIMPR kod ATB200 rhGAA (levi trag) u odnosu na Lumizyme<®>(desni trag).

Slika 10B je tabela u kojoj se poredi sadržaj Bis-M6P u Lumizyme<®>i ATB200 rhGAA.

Slika 11A je grafikon koji upoređuje aktivnost ATB200 rhGAA (levi trag) u odnosu na aktivnost Lumizyme<®>rhGAA (desni trag) unutar normalnih fibroblasta pri različitim koncentracijama GAA.

Slika 11B je tabela koja upoređuje aktivnost ATB200 rhGAA (levi trag) u odnosu na aktivnost Lumizyme<®>rhGAA (desni trag) unutar fibroblasta kod ispitanika koji ima Pompeovu bolest pri različitim koncentracijama GAA.

Slika 11C je tabela u kojoj se poredi Kupijanjefibroblasta kod normalnih ispitanika i ispitanika sa Pompeovom bolešću.

Slika 12A je grafikon koji prikazuje količinu glikogena u odnosu na dozu rekombinantne humane kiselinske α-glukozidaze u srčanom mišiću miša nakon kontakta sa vehikulumom (negativna kontrola), sa 20 mg/ml alglukozidaze alfa (Lumizyme<®>), ili sa 5, 10 ili 20 mg/kg ATB200.

Slika 12B je grafikon koji prikazuje količinu glikogena u odnosu na dozu rekombinantne humane kisele α-glukozidaze u kvadriceps mišiću miša nakon kontakta sa vehikulumom (negativna kontrola), sa 20 mg/ml alglukozidaze alfa (Lumizyme<®>), ili sa 5, 10 ili 20 mg/kg ATB200.

Slika 12C je grafikon koji prikazuje količinu glikogena u odnosu na dozu rekombinantne humane kiselinske α-glukozidaze u triceps mišiću miša nakon kontakta sa vehikulumom (negativna kontrola), sa 20 mg/ml alglukozidaze alfa (Lumizyme<®>), ili sa 5, 10 ili 20 mg/kg ATB200.

Slika 13 je tabela koja pokazuje da kombinacija ATB200 rhGAA i miglustat šaperona obezbeđuje značajno bolji klirens glikogena kod GAA nokaut miševa od lečenja bez miglustat šaperona bilo da je u pitanju Lumizyme<®>ili ATB200 rhGAA.

Slika 14 je serija elektronskih mikrofotografija srca, dijafragme i mišića soleusa divljeg tipa i Gaa-nokaut miševa tretiranih vehikulumom, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata, koje pokazuju nivoe membranskog proteina povezanog sa lizozomom (LAMP-1).

Slika 15 je serija elektronskih mikrofotografija srca i mišića soleusa divljeg tipa i Gaa-nokaut miševa tretiranih vehikulumom, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata, koje pokazuju nivoe membranskog proteina povezanog sa lizozomom (PAS).

Slika 16 je serija elektronskih mikrografija (1000×) mišića kvadricepsa divljih i Gaanokaut miševa tretiranih vehikulumom, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata, obojenog metilen plavim da bi se pokazale vakuole (označene strelicama).

Slika 17 je serija elektronskih mikrofotografija (40x) mišića kvadricepsa divljih i Gaa-nokaut miševa tretiranih vehikulumom, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata, koji pokazuju nivoe markera autofagije mikrotubulama pridruženih proteina 1A/1B-lakog lanca 3 fostatidiletanolamin konjugata (LC3A II) i p62, insulin-zavisnog glukoznog transpsorter GLUT4 i insulnnezavisnog glukoznog transporter GLUT1.

Slike 18A i 18B su grafikoni koji prikazuju podatke o snazi mišića šake i hvata za miševe divljeg tipa i Gaa-nokaut miševe koji su tretirani vehikulumom, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu miglustata.

Slike 19A-19G su grafikoni koji prikazuju nivoe glikogena u kvadricepsima, tricepsima i srčanim ćelijama kod miševa divljeg tipa i Gaa-nokaut miševa tretiranih vehikulumom, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata. Slika 20 je serija mikrofotografija (100× i 200×) mišićnih vlakana vastus lateralis (VL) kod miševa divljeg tipa i Gaa-nokaut miševa tretiranih vehikulumom,

alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata, koji pokazuju signale distrofina.

Slika 21 pokazuje dizajn otvorene studije, fiksne sekvence, rastuće doze, prve kod ljudi, faze 1/2 studije za procenu bezbednosti, podnošljivosti, PK, PD i efikasnosti intravenskih infuzija ATB200 koje se daju u kombinaciji sa oralnim miglustatom kod odraslih sa Pompeovom bolešću.

Slike 22A-22B su grafikoni koji pokazuju profile koncentracije i vremena ukupnog proteina GAA u plazmi kod humanih ispitanika nakon doziranja od 5, 10 ili 20 mg/kg ATB200, 20 mg/kg ATB200 i 130 mg miglustata, ili 20 mg/kg ATB200 i 260 mg miglustata.

Slika 22C je grafikon koji prikazuje AUC ukupnog proteina GAA u plazmi kod ljudi nakon doziranja od 20 mg/kg ATB200, 20 mg/kg ATB200 i 130 mg miglustata, ili 20 mg/kg ATB200 i 260 mg miglustata.

Slika 22D je grafikon koji prikazuje profile koncentracije i vremena ukupnog proteina GAA u plazmi kod dva pojedinačna ljudska ispitanika nakon doziranja od 20 mg/kg ATB200 i 260 mg miglustata.

Slika 23 je grafikon koji prikazuje profile koncentracije i vremena miglustata u plazmi kod ljudi nakon doziranja od 130 mg ili 260 mg miglustata.

Slike 24A-24D su grafikoni koji pokazuju promene u nivoima alanin aminotransferaze (ALT), aspartat aminotransferaze (AST), kreatin fosfokinaze (CPK) i heksoza tetrasaharida (Hex4) kod pacijenata nakon primene rastućih doza ATB200 (5, 10 i 20 mg/kg). /kg) nakon čega sledi istovremena primena ATB200 (20 mg/kg) i miglustata (130 i 260 mg).

DETALJNI OPIS

[0015] Veliko iznenađenje predstavljalo je otkriće da se pažljivim odabirom pufera i ekscipijenata može obezbediti formulacija za rekombinantni GAA protein ATB200 koja pokazuje superiornu stabilnost i može da se podvrgne procesima koji su povezani sa pripremom formulacije, skladištenjem, transportom, rekonstitucijom i primenom uz održavanje aktivnosti enzima. i efikasnost, ali uz minimizaciju precipitacije enzima. Shodno tome, jedan aspekt pronalaska se odnosi na formulaciju koja sadrži rhGAA, pufer i najmanje jedan ekscipijent. U jednom ili više otelotvorenja, rhGAA sadrži ATB200. U nekim realizacijama, formulacija je tečna formulacija. Detalji i različita otelotvorenja u vezi sa različitim sastojcima formulacije slede u nastavku.

Definicije

[0016] Termini korišćeni u ovoj specifikaciji generalno imaju svoja uobičajena značenja u predmetnoj oblasti, u kontekstu ovog pronalaska i u specifičnom kontekstu gde se svaki termin koristi. Određeni termini su razmotreni u nastavku, ili negde drugde u specifikaciji, kako bi se pružile dodatne smernice lekaru u opisivanju sastava i metode pronalaska i kako da ih napravi i koristi.

[0017] U ovoj specifikaciji, osim kada kontekst zahteva drugačije zbog određenog jezika ili neophodne implikacije, reč „sadrži“ ili varijacije kao što su „sadržano je“ ili „koji sadrži“ se koristi u inkluzivnom smislu, odnosno da bi se ukazalo na prisustvo navedenih karakteristika, ali ne da bi se isključilo prisustvo ili dodavanje dodatnih karakteristika u različitim otelotvorenjima pronalaska.

[0018] Kako se ovde koristi, termin "Pompeova bolest", koji se takođe naziva i nedostatak kisele maltaze, bolest skladištenja glikogena tip II (GSDII) i glikogenoza tip II, treba da se odnosi na genetski poremećaj skladištenja lizozoma koji se karakteriše mutacijama u GAA genu, koji kodira enzim humanu kiselu α-glukozidazu. Termin uključuje, ali nije ograničen na, rane i kasne oblike bolesti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, infantilnu, juvenilnu i Pompeovu bolest koja se javlja kod odraslih.

[0019] Kako se ovde koristi, termin "kisela α-glukozidaza" je odnosi se na lizozomalni enzim koji hidrolizuje α-1,4 veze između D-glukoznih jedinica glikogena, maltoze i izomaltoze. Alternativni nazivi uključuju ali nisu ograničeni na lizozomalnu α-glukozidazu (EC:3.2.1.20); glukoamilazu; 1,4-α-D-glukan glukohidrolazu; amiloglukozidazu; gama-amilazu i egzo-1,4-α-glukozidazu. Humana kisela α-glukozidaza je kodirana GAA genom (Nacionalni centar za biotehnološke informacije (NCBI) ID broj gena 2548), koji je mapiran na dugačkom kraku hromozoma 17 (lokacija 17q25.2-q25.3). Potpuna GAA aminokiselinska sekvenca divljeg tipa je navedena u SEQ ID NO: 1, kako je opisano u US patentu br.8,592,362 i ima pristupni broj GenBank AHE24104.1 (GI:568760974).

[0020] Trenutno je identifikovano više od 500 mutacija na humanom GAA genu, od kojih su mnoge povezane sa Pompeovom bolešću. Mutacije koje dovode do neadekvatnog savijanja ili neadekvatne obrade enzima kisele α-glukozidaze uključuju T1064C (Leu355Pro) i C2104T (Arg702Cys). Pored toga, GAA mutacije koje utiču na sazrevanje i obradu enzima uključuju Leu405Pro i Met519Thr. Očuvani heksapeptid WIDMNE na amino kiselinskim ostacima 516-521 je neophodan za aktivnost proteina kisele α-glukozidaze. Kako se ovde koristi, skraćenica „GAA“ se odnosi na enzim kisele α-glukozidaze, dok skraćenica ispisana kurzivom „GAA“ označava humani gen koji kodira enzim humane kisele α-glukozidaze". Dakle, skraćenica „rhGAA“ treba da se odnosi na enzim rekombinantne humane kisele αglukozidaze.

[0021] Kako se ovde koristi, termin „alglukozidaza alfa“ je namenjen da se odnosi na rekombinantnu humanu kiselu α-glukozidazu identifikovanu kao [199-arginin,223-histidin]prepro-α-glukozidaza (humana); Registarski broj CAS 420794-05-0. Alglukozidazu alfa je Genzime odobrio za prodaju u Sjedinjenim Državama, od januara 2016. godine, kao proizvode Lumizyme<®>i Miozyme<®>.

[0022] Kako se ovde koristi, termin „ATB200“ je ukazuje na rekombinantnu humanu kiselu α-glukozidazu opisanu u patentnoj prijavi koja je na čekanju PCT/US2015/053252.

[0023] Kako se ovde koristi, termin „glikan“ ukazuje na polisaharidni lanac kovalentno vezan za aminokiselinski ostatak na proteinu ili polipeptidu. Kako se ovde koristi, termin „N-glikan“ ili „N-vezani glikan“ odnosi se na polisaharidni lanac vezan za aminokiselinski ostatak na proteinu ili polipeptidu preko kovalentnog vezivanja za atom azota aminokiselinskog ostatka. Na primer, N-glikan može biti kovalentno vezan za atom azota bočnog lanca asparginskog ostatka Glikani mogu da sadrže jednu ili više monosaharidnih jedinica, a monosaharidne jedinice mogu biti kovalentno povezane da formiraju ravan ili razgranati lanac. U najmanje jednoj realizaciji, jedinice N-glikana vezane za ATB200 mogu da sadrže jednu ili više monosaharidnih jedinica, od kojih he svaka nezavisno odabrana od N-acetilglukozamina, manoze, galaktoze ili sijalinske kiseline. Jedinice N-glikana na proteinu mogu se odrediti bilo kojom odgovarajućom analitičkom tehnikom, kao što je masena spektrometrija. U nekim otelotvorenjima, jedinice N-glikana se mogu odrediti tečnom hromatografijom-tandem masenom spektrometrijom (LC-MS/MS) koristeći instrument kao što je Thermo Scientific Orbitrap Velos Pro<™>maseni spektrometar, Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribid<™>maseni spektrometar ili Waters Xevo<®>G2-XS QTof maseni spektrometar.

1

[0024] Kako se ovde koristi, termin "N-glikan sa visokim sadržajem manoze" odnosi se na N-glikan koji ima jednu do šest ili više jedinica manoze. U najmanje jednom otelotvorenju, jedinica N-glikana sa visokim sadržajem manoze može da sadrži lanac bis(N-acetilglukozamina) vezan za asparaginski ostatak i dalje vezan za razgranati polimanozni lanac. Kako se ovde koristi naizmenično, termin "M6P" ili "manoza-6-fosfat" odnosi se na manozno jedinicu fosforilisanu na poziciji 6; tj. ima fosfatnu grupu vezanu za hidroksilnu grupu na poziciji 6. U najmanje jednom otelotvorenju, jedna ili više jedinica manoze jedne ili više jedinica N-glikana su fosforilisane na poziciji 6 da bi se formirale manoza-6-fosfatne jedinice.

[0025] Kako se ovde koristi, termin "kompleksni N-glikan" odnosi se na N-glikan koji sadrži jednu ili više jedinica galaktoze i/ili sijalinske kiseline. U najmanje jednoj realizaciji, kompleksni N-glikan može biti N-glikan sa visokim sadržajem manoze u kome su jedna ili manozna jedinica dalje vezane za jednu ili više monosaharidnih jedinica, od kojih je svaka nezavisno odabrana od N-acetilglukozamina, galaktoze i sijalinske kiseline.

[0026] Kako se ovde koristi, "terapeutski efikasna doza" i "efikasna količina" odnose se na količinu kisele α-glukozidaze, koja je dovoljna da izazove terapijski odgovor kod ispitanika. Terapijski odgovor može biti bilo koji odgovor koji će korisnik (na primer, klinički lekar) prepoznati kao efikasan odgovor na terapiju, uključujući sve surogat kliničke markere ili simptome koji su ovde opisani i poznati u predmetnoj oblasti. Prema tome, u najmanje jednom otelotvorenju, terapeutski odgovor može biti poboljšanje ili inhibicija jednog ili više simptoma ili markera Pompeove bolesti kao što su oni poznati u predmetnoj oblasti.

Simptomi ili markeri Pompeove bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na, smanjenu aktivnost kisele α-glukozidaze u tkivima; kardiomiopatiju; kardiomegaliju; progresivnu slabost mišića, posebno u trupu ili donjim udovima; duboku hipotonija; makroglosiju (i u nekim slučajevima, izbočenje jezika); otežano gutanje, sisanje i/ili hranjenje; respiratornu insuficijenciju; hepatomegaliju (umerenu); labavost mišića lica; arefleksiju; intoleranciju fizičke aktivnosti; dispneju pri naporu; ortopneju; apneju u snu; jutarnje glavobolje; somnolenciju; lordozu i/ili skoliozu; smanjene reflekse dubokih tetiva; bol u krstima; i neispunjavanje razvojnih motoričkih prekretnica.

[0027] Kako se ovde koristi, termin "terapija zamene enzima" ili "TZE" ima odnosi se na uvođenje ne-nativnog, prečišćenog enzima kod pojedinca koji ima nedostatak takvog enzima.

Primenjeni protein se može dobiti iz prirodnih izvora ili rekombinantnom ekspresijom.

Termin se takođe odnosi na uvođenje prečišćenog enzima kod pojedinca koji inače ima potrebu ili korist od primene prečišćenog enzima. U najmanje jednom otelotvorenju, takav pojedinac pati od insuficijencije enzima. Uvedeni enzim može biti prečišćeni, rekombinantni enzim proizveden in vitro, ili protein prečišćen iz izolovanog tkiva ili tečnosti, kao što je, na primer, placenta ili životinjsko mleko, ili iz biljaka.

[0028] Kako se ovde koristi, termin "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na molekulske entitete i kompozicije koje su fiziološki podnošljive i tipično ne izazivaju neželjene reakcije kada se daju ljudima. Poželjno, kako se ovde koristi, termin "farmaceutski prihvatljiv" označava odobrenje od strane regulatorne agencije savezne ili državne vlade ili je naveden u Farmakopeji SAD ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu kod životinja, ili preciznije, kod ljudi.

[0029] Kako se ovde koristi, izraz "ekscipijent" se odnosi na supstancu koja nije aktivni sastojak uključenu u formulaciju, i generalno je neaktivni materijal. Ekscipijent može da pomogne u transportu aktivnog leka do mesta gde lek treba da deluje, kontroliše oslobađanje aktivnog leka ili pomaže u rastvaranju, ili može da ima niz drugih funkcija. Primeri ekscipijenata uključuju, ali nisu ograničeni na, supstance za puferovanje, surfaktante, antimikrobike, antioksidante, punioce, stabilizatore, modifikatore toničnosti itd.

[0030] Kako se ovde koristi, termin "pufer" odnosi se na rastvor koji sadrži i slabu kiselinu i njenu konjugovanu slabu bazu, čija se pH vrednost samo neznatno menja dodatkom alkalije ili kiseline. Kao što će dalje biti objašnjeno u nastavku, u nekim otelotvorenjima, pufer koji se koristi u farmaceutskoj formulaciji je citratni i/ili fosfatni pufer.

[0031] Kako se ovde koristi, termini "ispitanik" ili "pacijent" odnosi se na čoveka ili životinju osim čoveka. U najmanje jednom otelotvorenju, ispitanik je sisar. U najmanje jednom otelotvorenju, ispitanik je čovek.

[0032] Kako se ovde koristi, termini "oko" i "približno" odnose se na prihvatljiv stepen greške za izmerenu količinu s obzirom na prirodu ili preciznost merenja. Na primer, stepen greške se može označiti brojem značajnih cifara predviđenih za merenje, kao što je poznato u struci, i uključuje, ali nije ograničeno na varijaciju od ±1 u najpreciznijoj značajnoj cifri prijavljenoj za merenje. Tipični primeri stepena greške su unutar 20 procenata (%), poželjno unutar 10%, a još poželjnije unutar 5% date vrednosti ili opsega vrednosti. Alternativno, a posebno u biološkim sistemima, termini "oko" i "približno" mogu značiti vrednosti koje su unutar reda veličine, poželjno unutar 5 puta i još poželjnije unutar 2 puta od date vrednosti. Ovde date numeričke količine su približne osim ako nije drugačije navedeno, što znači da se termin "oko" ili "približno" može zaključiti kada nije izričito naveden.

ATB200 rhGAA

[0033] Formulacija sadrži ATB200, koji je rekombinantni GAA (rhGAA) protein pogodan za upotrebu u terapiji zamene enzima. Detalji u vezi sa strukturom i proizvodnjom ATB200, kao i varijante, dati su u nastavku.

[0034] U najmanje jednom otelotvorenju, ATB200 je eksprimiran u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) i sadrži povećan sadržaj jedinica N-glikana koje nose jedan ili više ostataka manoza-6-fosfata u poređenju sa sadržajem jedinica N-glikana koje nose jedan ili više ostataka manoza-6-fosfata alglukozidaze alfa. Postoji sedam potencijalnih N-vezanih mesta glikozilacije na rhGAA. Pošto je svako mesto glikozilacije heterogeno po vrsti prisutnih N-vezanih oligosaharida (N-glikana), rhGAA se sastoji od kompleksne mešavine proteina sa N-glikanima koji imaju različite afinitete vezivanja za M6P receptor i druge receptore za ugljene hidrate. rhGAA koji sadrži N-glikane sa visokim sadržajem manoze koji ima jednu M6P grupu (mono-M6P) vezuje se za CIMPR sa niskim (-6.000 nM) afinitetom dok se rhGAA koji sadrži dve M6P grupe na istom N-glikanu (bis-M6P) vezuje sa visokim ( ~2 nM) afinitetom. Reprezentativne strukture za nefosforilisane, mono-M6P i bis-M6P glikane prikazane su na slici 1A. Grupa manoza-6-P prikazana je na slici 1B. Jednom u lizozomu, rhGAA može enzimski razgraditi akumulirani glikogen. Međutim, konvencionalni rhGAA imaju niske ukupne nivoe glikana koji nose M6P- i bis-M6P i, na taj način, slabo ciljaju mišićne ćelije što dovodi do inferiorne isporuke rhGAA u lizozome. Produktivno ciljanje rhGAA lekom prikazano je na slici 2A. Većina rhGAA molekula u ovim konvencionalnim proizvodima nema fosforilisane N-glikane, pa im nedostaje afinitet za CIMPR.

Nefosforilisani glikani sa visokim sadržajem manoze takođe mogu biti očišćeni od strane receptora manoze, što rezultira neproduktivnim klirensom TZE (Slika 2B).

[0035] Drugi tip N-glikana, složeni ugljeni hidrati, koji sadrže galaktozu i sijalinsku kiselinu, takođe su prisutni na rhGAA. Pošto kompleksni N-glikani nisu fosforilisani, nemaju afinitet

1

za CIMPR. Međutim, N-glikani kompleksnog tipa sa izloženim ostacima galaktoze imaju umeren do visok afinitet za asialoglikoproteinski receptor na hepatocitima jetre što dovodi do brzog neproduktivnog klirensa rhGAA (slika 2B).

[0036] U najmanje jednom otelotvorenju, kisela α-glukozidaza je rekombinantna humana kisela α-glukozidaza koja se ovde pominje kao ATB200, kao što je opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi koja je još uvek na čekanju PCT/US2015/053252. Pokazalo se da ATB200 vezuje katjon-nezavisne manoza-6-fosfatne receptore (CIMPR) sa visokim afinitetom (KD~ 2-4 nM) i da ga efikasno internalizuju Pompeovi fibroblasti i mioblasti poprečno-prugastih mišića (Kuptake~ 7-14 nM). ATB200 je okarakterisan in vivo i pokazalo se da ima kraći prividni poluživot u plazmi (t1/2~ 45 min) nego alglukozidaza alfa (t1/2~ 60 min).

[0037] U jednom ili više otelotvorenja, rekombinantna humana kisela α-glukozidaza ima aminokiselinsku sekvencu GAA divljeg tipa kao što je navedeno u SEQ ID NO: 2, koji odgovara amino kiselinskim ostacima 57-952 i identičan je humanom GAA divljeg tipa (WT) nakon prirodne intracelularne proteolitičke obrade koja uklanja početnih 56 ostataka koji sadrže signalni peptid i prekursorski peptid. ATB200 aminokiselinska sekvenca je verifikovana triptičnom digestijom praćenom tečnom hromatografijom/masenom spektroskopijom kao i sekvenciranjem aminokiselina. Nasuprot tome, trenutni standard lečenja terapijom zamene rhGAA enzima (TZE) (komercijalno dostupni proizvodi koji sadrže alglukozidazu alfa su Miozyme<®>u većini zemalja i Lumizyme<®>u SAD, Genzime, kompanija Sanofi) razlikuje se od WT GAA (GAA divljeg tipa) i sadrži 3 supstitucije aminokiselinskih ostataka: histidin je promenjen u arginin na poziciji 199, arginin je promenjen u histidin na 223, a valin promenjen u izoleucin na 780.

[0038] U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna humana kiselinska α-glukozidaza podleže post-translacionim i/ili hemijskim modifikacijama na jednom ili više aminokiselinskih ostataka u proteinu. Na primer, ostaci metionina i triptofana mogu biti podvrgnuti oksidaciji. Kao drugi primer, ostaci asparagina mogu biti podvrgnuti deamidaciji u asparaginsku kiselinu. Kao još jedan primer, asparaginska kiselina može da se podvrgne izomerizaciji u izo-asparaginsku kiselinu. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima enzim je inicijalno eksprimiran kao da ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1, ili SEQ ID NO: 2, a enzim prolazi kroz jednu ili više ovih post-translacionih i/ili hemijskih modifikacija. Takve modifikacije su takođe u okviru ovog otkrića.

[0039] U najmanje jednom otelovorenju, rekombinantna humana kiselinska α-glukozidaza ima aminokiselinsku sekvencu GAA divljeg tipa kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1, kako je opisano u US patentu br.8,592,362 i ima pristupni broj GenBank AHE24104.1 (GI:568760974). U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna humana kisela αglukozidaza je glukozidaza alfa, enzim humane kisele α-glukozidaze kodiran najčešćim od devet uočenih haplotipova GAA gena.

[0040] U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna humana kisela α-glukozidaza je inicijalno eksprimirana kao da ima sekvencu pune dužine od 952 aminokiseline divljeg tipa GAA kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1, a rekombinantna humana kisela α-glukozidaza prolazi kroz intracelularnu obradu koja uklanja deo aminokiselina, npr. prvih 56 amino kiselina. Shodno tome, rekombinantna humana kisela α-glukozidaza koju luči ćelija domaćin može imati kraću aminokiselinsku sekvencu od rekombinantne humane kisele α-glukozidaze koja je inicijalno eksprimirana u ćeliji. U najmanje jednom otelotvorenju, kraći protein može imati aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 2 koja se razlikuje od SEQ ID NO: 1 samo u tome što je uklonjeno prvih 56 aminokiselina koje sadrže signalni peptid i prekursorski peptid, čime se dobija protein koji ima 896 aminokiselina. Moguće su i druge varijacije u broju aminokiselina, kao što je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili više delecija, supstitucija i/ili insercija u odnosu na aminokiselinsku sekvencu opisanu SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. U nekim realizacijama, rhGAA proizvod uključuje mešavinu molekula rekombinantne humane kisele α-glukozidaze koji imaju različite dužine aminokiselina.

[0041] U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna humana kiselinska α-glukozidaza podleže post-translacionim i/ili hemijskim modifikacijama na jednom ili više aminokiselinskih ostataka u proteinu. Na primer, ostaci metionina i triptofana mogu biti podvrgnuti oksidaciji. Kao drugi primer, N-terminalni glutamin može da formira piroglutamat. Kao drugi primer, ostaci asparagina mogu biti podvrgnuti deamidaciji u asparaginsku kiselinu. Kao još jedan primer, ostaci asparaginske kiseline mogu da se podvrgnu izomerizaciji u izo-asparaginsku kiselinu. Kao još jedan primer, neupareni cisteinski ostaci u proteinu mogu da formiraju disulfidne veze sa slobodnim glutationom i/ili cisteinom. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima enzim je inicijalno eksprimiran kao da ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2, a enzim

1

prolazi kroz jednu ili više ovih post-translacionih i/ili hemijskih modifikacija. Takve modifikacije su takođe u okviru ovog otkrića.

[0042] Poželjno je da ne više od 70, 65, 60, 55, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 ili 5% ukupnih molekula rekombinantne humane kisele α-glukozidaze jedinicu N-glikana koja nosi jedan ili više ostataka manoza-6-fosfata ili im nedostaje kapacitet da se vežu za katjon-nezavisni receptor manoza-6-fosfata (CIMPR). Alternativno, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99%, <100% ili više rekombinantnih molekula humane kisele α-glukozidaze sadrži najmanje jednu jedinicu N-glikana koja nosi jedan ili više ostataka manoza-6-fosfata ili ima kapacitet da se veže za CIMPR.

[0043] Molekuli rekombinantne humane kisele α-glukozidaze mogu imati 1, 2, 3 ili 4 manoza-6-fosfatne (M6P) grupe na svojim glikanima. Na primer, samo jedan N-glikan na molekulu rekombinantne humane kisele α-glukozidaze može da nosi M6P (monofosforilisan), jedan N-glikan može da nosi dve M6P grupe (bis-fosforilisane) ili dva različita N-glikana na istom molekulu rekombinantne humane kisele α-glukozidaze mogu da nose pojedinačne M6P grupe. Molekuli rekombinantne humane kisele α-glukozidaze mogu takođe imati N-glikane koji nemaju M6P grupe. U drugom aspektu, N-glikani u proseku sadrže više od 3 mol/mol M6P i više od 4 mol/mol sijalinske kiseline, tako da rekombinantna humana kisela α-glukozidaza sadrži u proseku najmanje 3 mola manoza-6-fosfatnih ostataka po molu rekombinantne humane kisele α-glukozidaze i najmanje 4 mola sijalinske kiseline po molu rekombinantne humane kisele α-glukozidaze. U proseku, najmanje oko 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10% ukupnih glikana na rekombinantnoj humanoj kiseloj α-glukozidazi može biti u obliku mono-M6P glikana, na primer, oko 6,25% ukupnih glikana može da nosi jednu M6P grupu i u proseku, najmanje oko 0,5, 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0% ukupnih glikana na rekombinantnoj humanoj kiseloj α-glukozidazi je u obliku bis-M6P glikana i u proseku manje od 25% ukupne rekombinantne humane kisele α-glukozidaze ne sadrži fosforilisani glikan koji se vezuje za CIMPR.

[0044] Rekombinantna humana kisela α-glukozidaza može imati prosečan sadržaj N-glikana koji nose M6P u rasponu od 0,5 do 7,0 mol/mol rekombinantne humane kisele α-glukozidaze ili bilo koju srednju vrednost podopsega uključujući 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 ili 7,0 mol/mol rekombinantne humane kisele α-glukozidaze.

Rekombinantna humana kisela α-glukozidaza može biti frakcionisana da bi se dobili preparati

1

rekombinantne humane kisele α-glukozidaze sa različitim prosečnim brojem glikana koji sadrže M6P ili bis-M6P, što omogućava dalje prilagođavanje rekombinantne humane kisele α-glukozidaze tako da cilja na lizozome u ciljnim tkivima odabirom određene frakcije ili selektivnim kombinovanjem različitih frakcija.

[0045] U nekim realizacijama, rekombinantna humana kisela α-glukozidaza će nositi, u proseku, 2,0 do 8,0 mola M6P po molu rekombinantne humane kisele α-glukozidaze. Ovaj opseg uključuje sve srednje vrednosti i podopsege uključujući 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 i 8.0 mol M6P/mol rekombinantne humane kisele α-glukozidaze.

[0046] Do 60% N-glikana na rekombinantnoj humanoj kiseloj α-glukozidazi može biti potpuno sijalilizovano, na primer, do 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ili 60% N-glikana može biti potpuno sijalilizovano. U nekim otelotvorenjima od 4 do 20% ukupnih N-glikana je potpuno sijalilizovano. U drugim oteotvorenjima ne više od 5%, 10%, 20% ili 30% N-glikana na rekombinantnoj humanoj kiseloj α-glukozidazi nosi sijalinsku kiselinu i terminalni ostatak galaktoze (Gal). Ovaj opseg uključuje sve srednje vrednosti i podopsege, na primer, 7 do 30% ukupnih N-glikana na rekombinantnoj humanoj kiseloj α-glukozidazi može da nosi sijalinsku kiselinu i terminalnu galaktozu. Dalje u drugim otelotvorenjima, ne više od 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20% N-glikana na rekombinantnoj humanoj kiseloj α-glukozidazi ima samo terminalnu galaktozu i ne sadrži sijalinsku kiselinu. Ovaj opseg obuhvata sve srednje vrednosti i podopsege, na primer, od 8 do 19% ukupnih N-glikana na rekombinantnoj humanoj kiseloj α-glukozidazi u kompoziciji može imati samo terminalnu galaktozu i ne sadrži sijalinsku kiselinu.

[0047] U drugim realizacijama pronalaska, 40, 45, 50, 55 do 60% ukupnih N-glikana na rekombinantnoj humanoj kiseloj α-glukozidazi su N-glikani kompleksnog tipa; ili ne više od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7% ukupnih N-glikana na rekombinantnoj humanoj kiseloj α-glukozidazi su N-glikani hibridnog tipa; ne više od 5, 10 ili 15% N-glikana tipa manoze na rekombinantnoj humanoj kiseloj α-glukozidazi nije fosforilisano; najmanje 5% ili 10% N-glikana tipa manoze na rekombinantnoj humanoj kiseloj α-glukozidazi je mono-M6P fosforilisano; i/ili najmanje 1 ili 2% N-glikana tipa manoze na rekombinantnoj humanoj kiseloj α-glukozidazi je bis-M6P fosforilisano. Ove vrednosti uključuju sve međuvrednosti i podopsege. Rekombinantna humana kisela α-glukozidaza može zadovoljiti jedan ili više opsega sadržaja opisanih gore.

1

[0048] U nekim otelotvorenjima, rekombinantna humana kisela α-glukozidaza će nositi, u proseku, 2,0 do 8,0 mola ostataka sijalinske kiseline po molu rekombinantne humane kisele α-glukozidaze. Ovaj opseg uključuje sve međuvrednosti i podopsege uključujući 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 i 8.0 mol ostatke/mol rekombinantne humane kisele αglukozidaze Bez vezivanja za teoriju, veruje se da prisustvo N-glikanskih jedinica koje nose ostatke sijalinske kiseline može sprečiti neproduktivni klirens rekombinantne humane kisele α-glukozidaze pomoću asijaloglikoproteinskih receptora.

[0049] U jednom ili više izvođenja, rhGAA ima jedinice M6P i/ili sijalinske kiseline na određenim mestima N-glikozilacije rekombinantnog humanog lizozomalnog proteina. Na primer, postoji sedam potencijalnih N-vezanih mesta glikozilacije na rhGAA. Ova potencijalna mesta glikozilacije su na sledećim pozicijama SEQ ID NO: 2: N84, N177, N334, N414, N596, N826 i N869. Slično tome, za punu dužinu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1, ova potencijalna mesta glikozilacije su na sledećim pozicijama: N140, N233, N390, N470, N652, N882 i N925. Druge varijante rhGAA mogu imati slična mesta glikozilacije, u zavisnosti od lokacije ostataka asparagina. Generalno, sekvence ASN-X-SER ili ASN-X-THR u aminokiselinskoj sekvenci proteina ukazuju na potencijalna mesta glikozilacije, sa izuzetkom da X ne može biti HIS ili PRO.

[0050] U različitim otelotvorenjima, rhGAA ima određeni profil N-glikozilacije. U jednom ili više izvođenja, najmanje 20% rhGAA je fosforilisano na prvom mestu N-glikozilacije (npr. N84 za SEQ ID NO: 2 i N140 SEQ ID NO: 1). Na primer, najmanje 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA može biti fosforilisano na prvom mestu N-glikozilacije. Ova fosforilacija može biti rezultat mono-M6P i/ili bis-M6P jedinica. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% , 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi mono-M6P jedinicu na prvom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi bis-M6P jedinicu na prvom mestu N-glikozilacije.

[0051] U jednom ili više otelotvorenja, najmanje 20% rhGAA je fosforilisano na drugom mestu N-glikozilacije (npr. N177 za SEQ ID NO: 2 i N223 SEQ ID NO: 1). Na primer, najmanje 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA može biti fosforilisano na drugom mestu N-glikozilacije. Ova

1

fosforilacija može biti rezultat mono-M6P i/ili bis-M6P jedinica. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% , 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi mono-M6P jedinicu na drugom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi bis-M6P jedinicu na drugom mestu N-glikozilacije. U jednom ili više otelotvorenja, najmanje 5% rhGAA je fosforilisano na trećem mestu N-glikozilacije (npr. N334 za SEQ ID NO: 2 i N390 SEQ ID NO: 1). U drugim otelotvorenjima, manje od 5%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA je fosforilisano na trećem mestu N-glikozilacije. Na primer, treće mesto N-glikozilacije može imati mešavinu nefosforilisanih glikana sa visokim sadržajem manoze, di-, tri- i tetra-antenarnih kompleksnih glikana i hibridnih glikana kao glavne vrste. U nekim otelotvorenjima, najmanje 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ili 50% rhGAA je siajalilizovano na trećem mestu N-glikosizalcije.

[0052] U jednom ili više otelotvorenja, najmanje 20% rhGAA je fosforilisano na četvrtom mestu N-glikozilacije (npr. N414 za SEQ ID NO: 2 i N470 SEQ ID NO: 1). Na primer, najmanje 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA može biti fosforilisano na četvrtom mestu N-glikozilacije. Ova fosforilacija može biti rezultat mono-M6P i/ili bis-M6P jedinica. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% , 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi mono-M6P jedinicu na četvrtom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi bis-M6P jedinicu na četvrtom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA je sijalilizovano na četvrtom mestu N-glikozilacije.

[0053] U jednom ili više otelotvorenja, najmanje 5% rhGAA je fosforilisano na petom mestu N-glikozilacije (npr. N596 za SEQ ID NO: 2 i N692 SEQ ID NO: 1). U drugim otelotvorenjima, manje od 5%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA je fosforilisano na petom mestu N-glikozilacije. Na primer, peto mesto N-glikozilacije može imati fukozilovane diantenarne kompleksne glikane kao glavnu vrstu. U nekim realizacijama, najmanje 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA je sijalilizovano na petom mestu N-glikozilacije.

1

[0054] U jednom ili više otelotvorenja, najmanje 5% rhGAA je fosforilisano na šestom mestu N-glikozilacije (npr. N826 za SEQ ID NO: 2 i N882 SEQ ID NO: 1). U drugim otelotvorenjima, manje od 5%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA je fosforilisano na šestom mestu N-glikozilacije. Na primer, šesto mesto N-glikozilacije može imati mešavinu di-, tri- i tetra-antenarnih kompleksnih glikana kao glavne vrste. U nekim otelotvorenjima, najmanje 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA je sijalilizovano na šestom mestu N-glikozilacije.

[0055] U jednom ili više otelotvorenja, najmanje 5% rhGAA je fosforilisano na sedmom mestu N-glikozilacije (npr. N869 za SEQ ID NO: 2 i N925 SEQ ID NO: 1). U drugim otelotvorenjima, manje od 5%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA je fosforilisano na sedmom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, manje od 40%, 45%, 50%, 55%, 60% ili 65%% rhGAA ima bilo koji glikan na sedmom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 30%, 35% ili 40% rhGAA ima glikan na sedmom mestu N-glikozilacije.

[0056] U različitim otelotvorenjima, rhGAA ima prosečan sadržaj fukoze 0-5 mola po molu rhGAA, sadržaj GlcNAc 10-30 mola po molu rhGAA, sadržaj galaktoze 5-20 mola po molu rhGAA, sadržaj manoze 10- 40 mola po molu rhGAA, sadržaj M6P 2-8 mola po molu rhGAA i sadržaj sijalinske kiseline 2-8 mola po molu rhGAA. U različitim otelotvorenjima, rhGAA ima prosečan sadržaj fukoze 2-3 mola po molu rhGAA, sadržaj GlcNAc 20-25 mola po molu rhGAA, sadržaj galaktoze 8-12 mola po molu rhGAA, sadržaj manoze 22- 27 mola po molu rhGAA, sadržaj M6P 3-5 mola po molu rhGAA i sadržaj sijalinske kiseline 4-7 mola rhGAA.

[0057] Rekombinantnu humanu kiselu α-glukozidazu poželjno proizvode ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), kao što je CHO ćelijska linija GA-ATB200 ili ATB200-001-X5-14, ili subkulturom ili derivatom takve ćelijske kulture CHO. DNK konstrukti, koji eksprimiraju alelične varijante kisele α-glukozidaze ili druge varijante kisele α-glukozidaze aminokiselinskih sekvenci kao što su one koje su najmanje 90%, 95% ili 99% identične SEQ ID NO: 1, mogu biti konstruisani i eksprimirani u CHO ćelijama. Ove varijante kisele αglukozidaze aminokiselinske sekvence mogu sadržati delecije, supstitucije i/ili insercije u odnosu na SEQ ID NO: 1, kao što je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više delecija, supstitucija i/ili insercija u aminokiselinsku sekvencu opisanu SEQ ID NO: 1. Stručnjaci u ovoj oblasti

2

mogu da izaberu alternativne vektore pogodne za transformaciju CHO ćelija za proizvodnju takvih DNK konstrukata.

[0058] Različiti algoritmi i/ili programi za poravnanje mogu se koristiti za izračunavanje identiteta između dve sekvence, uključujući FASTA ili BLAST koji su dostupni kao deo GCG paketa za analizu sekvenci (Univerzitet Viskonsin, Medison, Viskonsin), i mogu se koristiti sa, na primer, podrazumevanim podešavanjem. Na primer, razmatraju se polipeptidi koji imaju najmanje 90%, 95% ili 99% identičnosti sa specifičnim polipeptidima koji su ovde opisani i poželjno pokazuju suštinski iste funkcije, kao i polinukleotid koji kodira takve polipeptide. Osim ako nije drugačije naznačeno, ocena sličnosti će se zasnivati na upotrebi BLOSUM62. Kada se koristi BLASTP, procenat sličnosti se zasniva na BLASTP pozitivnim rezultatima, a procenat identičnosti sekvence zasnovan je na BLASTP rezultatu identičnosti. BLASTP "Identičnost" pokazuje broj i frakciju ukupnih ostataka u parovima sekvenci sa visokim rezultatom koji su identični; a BLASTP "Pozitivne" pokazuje broj i frakciju ostataka za koje rezultati poravnanja imaju pozitivne vrednosti i koji su međusobno slični.

Aminokiselinske sekvence koje imaju ove stepene identičnosti ili sličnosti ili bilo koji srednji stepen identičnosti sa sekvencama aminokiselina koje su ovde otkrivene su razmatrane i obuhvaćene ovim otkrićem. Polinukleotidne sekvence sličnih polipeptida se izvode korišćenjem genetskog koda i mogu se dobiti na konvencionalne načine, posebno reverznim prevođenjem njegove aminokiselinske sekvence korišćenjem genetskog koda.

[0059] U nekim otelotvorenjima, rekombinantna humana kiselinska α-glukozidaza koja ima superiornu sposobnost ciljanja na katjon-nezavisne manoza-6-fosfatne receptore (CIMPR) i ćelijske lizozome, kao i obrasce glikozilacije koji smanjuju njen neproduktivni klirens in vivo, može se proizvesti korišćenjem jajnih ćelija kineskog hrčka (CHO). Ove ćelije se mogu indukovati da eksprimiraju rekombinantnu humanu kiselu α-glukozidazu sa značajno višim nivoima N-glikanskih jedinica koje nose jedan ili više ostataka manoza-6-fosfata nego konvencionalni proizvodi rekombinantne humane kisele α-glukozidaze kao što je alglukozidaza alfa. Rekombinantna humana kisela α-glukozidaza koju proizvode ove ćelije, na primer, kao što je prikazano u ATB200, ima značajno više ostataka N-glikana sa manoza-6-fosfatom (M6P) i bis-manoza-6-fosfatom koji cilja na mišićne ćelije nego konvencionalna kisela α-glukozidaza, kao što je Lumizyme<®>. Bez vezivanja za teoriju, veruje se da ova ekstenzivna glikozilacija omogućava da se enzim ATB200 efikasnije apsorbuje u ciljne ćelije, te da se stoga efikasnije uklanja iz cirkulacije nego druge rekombinantne humane kisele α-glukozidaze, kao što je na primer, alglukozidaza alfa, koja ima mnogo niži sadržaj M6P i bis-M6P. Pokazalo se da se ATB200 efikasno vezuje za CIMPR i da ga efikasno preuzimaju poprečno-prugasti mišići i srčani mišić i da ima obrazac glikozilacije koji obezbeđuje povoljan farmakokinetički profil i smanjuje neproduktivni klirens in vivo.

[0060] Takođe se smatra da ekstenzivna glikozilacija ATB200 može doprineti smanjenju imunogenosti ATB200 u poređenju sa, na primer, alglukozidazom alfa. Kao što će proceniti stručnjaci u ovoj oblasti, glikozilacija proteina sa konzerviranim šećerima sisara generalno poboljšava rastvorljivost proizvoda i smanjuje agregaciju i imunogenost proizvoda.

Glikozilacija indirektno menja imunogenost proteina tako što minimizira agregaciju proteina, kao i štiteći epitope imunogenih proteina od imunog sistema (Smernice za industriju – Procena imunogenosti za terapijske proteinske proizvode, Odeljenje za zdravlje i humane služne SAD, Uprava za hranu i lekove, Centar za procenu i istraživanje lekova, Centar za procenu i istraživanje bioloških preparata, avgust 2014.). Prema tome, u najmanje jednom otelotvorenju, primena rekombinantne humane kisele α-glukozidaze ne indukuje antitela protiv leka. U najmanje jednom otelotvorenju, primena rekombinantne humane kisele αglukozidaze indukuje nižu incidencu antitela protiv leka kod ispitanika od nivoa antitela protiv leka indukovanog davanjem alglukozidaze alfa.

[0061] Kao što je opisano u međunarodnoj prijavi patenta koja je na

čekanju PCT/US2015/053252, ćelije kao što su CHO ćelije mogu se koristiti za proizvodnju rhGAA opisanog u njemu, a taj rhGAA se može koristiti u ovom pronalasku. Primeri takve CHO ćelijske linije su GA-ATB200 ili ATB200-001-X5-14, ili njihova podkultura koja proizvodi rhGAA kompoziciju kako je tamo opisano. Takve CHO ćelijske linije mogu da sadrže više kopija gena, kao što je 5, 10, 15 ili 20 ili više kopija, polinukleotida koji kodira GAA.

[0062] rhGAA sa visokim sadržajem M6P i bis-M6P, kao što je ATB200 rhGAA, mogu se proizvesti transformacijom CHO ćelija sa DNK konstruktom koji kodira GAA. Iako su CHO ćelije ranije korišćene za pravljenje rhGAA, nije uzeto u obzir da se transformisane CHO ćelije mogu kultivisati i odabrati na način koji bi proizveo rhGAA sa visokim sadržajem M6P i bis-M6P glikana koji ciljaju CIMPR.

[0063] Iznenađujuće, otkriveno je da je moguće transformisati CHO ćelijske linije, odabrati transformante koji proizvode rhGAA koji imaju visok sadržaj glikana koji nose M6P ili bis-M6P koji ciljaju CIMPR, i stabilno eksprimirati ovaj rhGAA sa visokim stepenom M6P. Stoga, metode za pravljenje ovih CHO ćelijskih linija su takođe opisane u međunarodnoj patentnoj prijavi koja je na čekanju PCT/US2015/053252. Ovaj metod uključuje transformaciju CHO ćelije sa DNK koja kodira GAA ili GAA varijantu, odabir CHO ćelije koja stabilno integriše DNK koja kodira GAA u svoj(e) hromozom(e) i koja stabilno eksprimira GAA, i odabir CHO ćelije koja eksprimira GAA sa visokim sadržaj glikana koji nose M6P ili bis-M6P, i, opciono, izbor CHO ćelije koja ima N-glikane sa visokim sadržajem sijalinske kiseline i/ili ima N-glikane sa niskim nefosforilisanim visokim sadržajem manoze. Ove CHO ćelijske linije se mogu koristiti za proizvodnju rhGAA i rhGAA kompozicija kultivisanjem ćelijske linije CHO i dobijanjem pomenute kompozicije iz kulture CHO ćelija.

[0064] U jednom ili više otelotvorenja, ATB200 je prisutan u količini u rasponu od oko 5 do oko 50 mg/mL. U daljim otelotvorenjima, ATB200 je prisutan u količini koja se kreće u opsegu od oko 5, 8, 10 ili 12 do oko 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 mg/mL. U nekim otelotvorenjima, ATB200 je prisutan u količini od oko 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 mg/mL. U daljim otelotvorenjima, ATB200 je prisutan u količini od oko 15 mg/mL.

pH i pufer

[0065] pH vrednost formulacije može da se kreće od oko 5,0 do oko 7,0 ili oko 5,0 do oko 6,0. U jednom ili više otelotvorenja, pH vrednost se kreće od oko 5,5 do oko 6,0. U nekim otelotvorenjima, formulacija ima pH vrednost od oko 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 ili 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 ili 6,5. Generalno, navedene količine komponenti će dati pH frednost u opsegu od oko 5,0 do oko 6,0. Međutim, pH se može podesiti na ciljni pH pomoću regulatora pH vrednosti (tj. agensi za alkalizaciju i agensi za zakiseljavanje), kao što su natrijum hidroksid i/ili hlorovodonična kiselina.

[0066] Formulacija takođe sadrži pufer koji je izabran iz grupe koju čine citrat, fosfat i njihove kombinacije. Kako se ovde koristi, "pufer" se odnosi na puferski rastvor koji sadrži slabu kiselinu i njenu konjugovanu bazu koja pomaže u sprečavanju promena pH. Citrat i/ili fosfat mogu biti natrijum citrat ili natrijum fosfat. Ostale soli uključuju kalijumove i amonijumove soli. U jednom ili više otelotvorenja, pufer sadrži citrat. U daljim

2

otelotvorenjima, pufer sadrži natrijum citrat (npr. mešavina natrijum citrat dihidrata i limunske kiseline monohidrata). U jednom ili više otelotvorenja, puferski rastvori koji sadrže citrat mogu da sadrže natrijum citrat i limunsku kiselinu. U nekim realizacijama, prisutni su i citratni i fosfatni pufer.

Ekscipijenti

[0067] Formulacija takođe sadrži najmanje jedan ekscipijent. Neka otelotvorenja pronalaska sadrže ekscipijente koji pomažu u toničnosti, deluju kao sredstvo za povećanje zapremine ili deluju kao stabilizatori. U jednom ili više otelotvorenja, najmanje jedan ekscipijent je izabran iz grupe koju čine manitol, polisorbat i njihove kombinacije.

[0068] U jednom ili više otelotvorenja, ekscipijent sadrži sastojak koji može da deluje kao modifikator toničnosti i/ili punilac, posebno manitol. Sredstva za toničnost su komponente koje pomažu da se obezbedi da formulacija ima osmotski pritisak sličan ili isti kao humana krv. Punioci su sastojci koji dodaju masu formulacijama (npr. liofilizovani) i daju adekvatnu strukturu komadu.

[0069] U jednom ili više oteotvorenja, ukupna količina sredstva za toničnost i/ili punioca kreće se u količini od oko 10 do oko 50 mg/mL. U daljim otelotvorenjima, ukupna količina sredstva za toničnost i/ili punioca kreće se u količini od oko 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 do oko 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 mg /mL. U nekim otelotvorenjima, sredstvo za toničnost i/ili punilac sadrži manitol. U jednom ili više otelotvorenja, manitol je prisutan u količini od oko 10 do oko 50 mg/mL. U daljim otelotvorenjima, manitol je prisutan u količini od oko 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 do oko 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 mg/mL. U daljim otelotvorenjima, manitol je prisutan u količini od oko 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 mg/mL. U nekim otelotvorenjima, manitol je jedino sredstvo za toničnost i/ili punilac. Primeri drugih sredstava za toničnost i/ili punlaca uključuju natrijum hlorid, saharozu i trehalozu.

[0070] U nekim otelotvorenjima, ekscipijent sadrži sastojak koji može da deluje kao stabilizator, kao što je polisorbat 80. Stabilizatori su jedinjenja koja mogu da spreče ili minimiziraju stvaranje agregata na hidrofobnim međufaznim površinama vazduh-voda. U nekim otelotvorenjima, stabilizator je surfaktant. U jednom ili više otelotvorenja, ukupna količina stabilizatora se kreće od oko 0,1 do oko 1,0 mg/mL. U daljim otelotvorenjima, ukupna količina stabilizatora se kreće od oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 ili 0,5 do oko 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 0,9 ili 1,0 mg/mL. U daljim otelotvorenjima, ukupna količina stabilizatora je oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,80,9 ili 1,0 mg/mL. U nekim otelotvorenjima, polisorbat 80 je jedini stabilizator. Prema tome, u jednom ili više otelotvorenja, polisorbat 80 se kreće od oko 0,1 do oko 1,0 mg/mL. U daljim otelotvorenjima, polisorbat 80 se kreće od oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 ili 0,5 do oko 0,5, 0,6, 0,7, 0,80,9 ili 1,0 mg/mL. U daljim otelotvorenjima, polisorbat 80 je oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,80,9 ili 1,0 mg/mL.

[0071] U jednom ili više otelotvorenja, može biti poželjno da se isključe određena jedinjenja iz formulacije. Na primer, u pripremi formulacije za lečenje date bolesti, bilo bi poželjno isključiti određena jedinjenja koja bi pogoršala osnovnu bolest. Kao što je gore pomenuto, osobe sa Pompeovom bolešću imaju smanjenu ili nikakvu sposobnost razlaganja glikogena. Nekoliko često korišćenih ekscipijenata, kao što su saharoza, trehaloza i glicin, mogu se pretvoriti u glukozu u telu, što bi zauzvrat pogoršalo Pompeovu bolest. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, saharoza, trehaloza i/ili glicin su isključeni iz formulacije. Slično tome, određene komponente mogu biti isključene jer nisu najprikladnije za formulaciju u određenim kontekstima. Na primer, u nekim otelotvorenjima, poloksameri mogu biti isključeni.

Primeri otelotvorenja

[0072] U jednom ili više otelotvorenja, formulacija sadrži ili se u suštini sastoji od:

(a) ATB200 (npr. rekombinantna kisela α-glukozidaza, pri čemu je rekombinantna kisela α-glukozidaza eksprimirana u jajnim ćelijama kineskog hrčka (CHO) i ima povećan sadržaj jedinica N-glikana koje nose jedan ili dva ostatka manoza-6-fosfata u poređenju sa sadržajem N-glikanskih jedinica koje nose jedan ili dva ostatka manoza-6-fosfatna alglukozidaze alfa);

(b) najmanje jedan pufer izabran iz grupe koju čine citrat, fosfat i njihove kombinacije; (c) najmanje jedan ekscipijent izabran iz grupe koju čine manitol, polisorbat 80 i njihove kombinacije; i

pri čemu formulacija ima pH od oko 5,0 do oko 6,0 ili 7,0.

[0073] U nekim otelotvorenjima, formulacija sadrži ili se suštinski sastoji od:

(a) ATB200 (npr. rekombinantna kisela α-glukozidaza, pri čemu je rekombinantna kisela α-glukozidaza eksprimirana u jajnim ćelijama kineskog hrčka (CHO) i ima povećan sadržaj jedinica N-glikana koje nose jedan ili dva ostatka manoza-6-fosfata u

2

poređenju sa sadržajem N-glikanskih jedinica koje nose jedan ili dva ostatka manoza-6-fosfatna alglukozidaze alfa);

(b1) natrijum citrata;

(b2) monohidrata limunske kiseline;

(c1) manitola;

(c2) polisorbata 80;

(d) vode;

(e) opciono, sredstva za zakiseljavanje; i

(f) opciono, sredstva za alkalizaciju,

pri čemu formulacija ima pH od oko 5,0 do oko 6,0 ili 7,0. U daljim otelotvorenjima, pH se kreće od oko 5,5 do oko 6,0. U daljim otelotvorenjima, pH je oko 6,0.

[0074] U specifičnom otelotvorenju, formulacija sadrži

(a) ATB200 (npr. rekombinantna kisela α-glukozidaza, pri čemu je rekombinantna kisela α-glukozidaza eksprimirana u jajnim ćelijama kineskog hrčka (CHO) i ima povećan sadržaj jedinica N-glikana koje nose jedan ili dva ostatka manoza-6-fosfata u poređenju sa sadržajem N-glikanskih jedinica koje nose jedan ili dva ostatka manoza-6-fosfatna alglukozidaze alfa), prisutnu u količini i koncentracijo od oko 5-30 mg/mL ili oko 15 mg/mL;

(b) natrijum citratni pufer, prisutan u koncentraciji od oko 10-100 mM ili oko 25 mM; (cl) manitol, prisutan u koncentraciji od oko 10-50 mg/mL, ili oko 20 mg/mL;

(c2) polisorbat 80, prisutan u koncentraciji od oko 0,1-1 mg/mL, ili oko 0,5 mg/mL; i (d) vodu;

(e) opciono, sredstvo za zakiseljavanje; i

(f) opciono, sredstvo za alkalizaciju,

Priprema formulacije

[0075] Drugi aspekt pronalaska se odnosi na postupke za pripremu formulacija koje su ovde opisane. U jednom ili više otelotvorenja, formulacija se može pripremiti iz rastvora enzima. Koncentracija i pufer ovog rastvora mogu se zameniti da bi se dobila željena koncentracija i pufer po potrebi korišćenjem metoda poznatih u predmdetnoj oblasti. Zatim se mogu dodati dodatne komponente (npr. ekscipijenti i pH regulatori). Formulacija se zatim može filtrirati i staviti u kontejner za skladištenje i čuvati.

2

[0076] U jednom ili više otelotvorenja, postupak za pripremu bilo koje od ovde opisanih farmaceutskih formulacija obuhvata: dodavanje najmanje jednog pufera, najmanje jednog ekscipijenta i rekombinantne kisele α-glukozidaze u vodu da bi se dobio rastvor; opciono podešavanje pH rastvora; i opciono dodavanje dodatne vode u rastvor. U daljim otelotvorenjima, postupak dalje obuhvata filtriranje rastvora. U daljim otelotvorenjima, postupak dalje obuhvata čuvanje rastvora.

[0077] Primer, neograničavajući proces za proizvodnju formulacije kako je ovde opisano sledi u nastavku:

1. U odgovarajuću proizvodnu posudu dodajte približno 85-90% zapremine serije vode za injekcije.

2. Dodati i rastvoriti željene ekscipijente i pufere (npr. natrijum citrat dihidrat, limunska kiselina monohidrat, polisorbat 80, manitol) i mešati dok se ne rastvori.

3. Dodajte supstancu leka ATB200 i promešajte.

4. Podesite pH vrednost na ciljani pH (na primer, 6 ± 0.1) po potrebi koristeći regulatore (na primer,) rastvor hlorovodonične kiseline ili natrijum hidroksida.

5. Dodajte dovoljno vode za injekcije do konačne zapremine i promešajte.

6. Filtrirajte rastvor kroz sterilni filter u sterilni prijemnik.

7. Aseptično napunite rastvor leka u bočice i postavite čepove.

8. Zatvorite sve bočice i čuvajte na 2°-8°C.

[0078] U jednom ili više otelotvorenja, formulacija kako je pripremljena biće u tečnom obliku. To jest, formulacija sadrži vodu. Ova tečna formulacija može biti podvrgnuta procesu liofilizacije (sušenje zamrzavanjem) da bi se dobio kolač ili prah. Shodno tome, drugi aspekt pronalaska se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bilo koju od formulacija opisanih iznad nakon liofilizacije. Liofilizovana smeša može da sadrži ATB200, pufer izabran iz grupe koju čine citrat, fosfat i njihove kombinacije, i najmanje jedan ekscipijent izabran iz grupe koju čine trehaloza, manitol, polisorbat 80 i njihove kombinacije. U nekim otelotvorenjima, drugi sastojci (npr. drugi ekscipijenti) se mogu dodati u liofilizovanu smešu. Farmaceutska kompozicija koja sadrži liofilizovanu formulaciju može da bude data u bočici, koja se zatim može čuvati, transportovati, rekonstituisati i/ili davati pacijentu.

Način lečenja i davanje pacijentu

2

[0079] Drugi aspekt se odnosi na metodu lečenja Pompeove bolesti i/ili upotrebu ovde opisanih formulacija za lečenje Pompeove bolesti. Formulacija se može davati kako je pripremljena, ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. Prema tome, u jednom ili više otelotvorenja, postupak obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno bilo koje od farmaceutskih formulacija opisanih gore. U drugim otelotvorenjima, postupak obuhvata rekonstituisanje liofilizovane farmaceutske kompozicije i davanje rekonstituisane farmaceutske kompozicije pacijentu kome je to potrebno. U nekim otelotvorenjima, rekonstituisana farmaceutska kompozicija ima sličan ili isti sastav kao farmaceutska formulacija pre liofilizacije i/ili kako je pripremljena. U oba slučaja, farmaceutska formulacija ili rekonstituisana farmaceutska kompozicija se mogu razblažiti pre davanja pacijentu. U daljim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija ili rekonstituisana farmaceutska kompozicija se primenjuje intravenozno.

[0080] U jednom ili više izvođenja, kompozicija za intravensku primenu je rastvor u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Tamo gde je potrebno, kompozicija može takođe uključiti sredstvo za rastvaranje i lokalni anestetik za ublažavanje bolova na mestu injekcije. Uopšteno, sastojci se isporučuju ili odvojeno ili pomešani zajedno u obliku jedinične doze, na primer, kao suvi liofilizovani prah ili koncentrat bez vode u hermetički zatvorenoj posudi kao što je ampula ili kesica na kojoj je naznačena količina aktivne materije. Tamo gde se smeša primenjuje infuzijom, ona se može izdavati sa bocom za infuziju koja sadrži sterilnu farmaceutsku vodu, fiziološki rastvor ili dekstrozu/vodu. Kada se kompozicija primenjuje injekcijom, može se obezbediti ampula sterilne vode za injekcije ili fiziološkog rastvora tako da se sastojci mogu mešati pre primene.

[0081] U drugim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija ili rekonstituisana farmaceutska kompozicija se primenjuje direktnom administracijom u ciljno tkivo, kao što je srce ili poprečno-prugasti mišić (npr. intramuskularno), ili nervni sistem (npr. direktna injekcija u mozak; intraventrikularno; intratekalno). Po želji, može se koristiti više od jedne rute istovremeno.

[0082] Farmaceutska formulacija ili rekonstituisana kompozicija se daje u terapeutski efikasnoj količini (npr. količina doze koja je, kada se primenjuje u redovnim intervalima, dovoljna za lečenje bolesti, kao što je ublažavanje simptoma povezanih sa bolešću, sprečavanje ili odlaganje početka bolesti i/ili smanjenje težine ili učestalosti simptoma

2

bolesti). Količina koja će biti terapeutski efikasna u lečenju bolesti zavisiće od prirode i obima efekata bolesti i može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama. Dodatno, in vitro ili in vivo testovi mogu opciono da se koriste da bi pomogli u identifikaciji optimalnih opsega doziranja. U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna humana kisela αglukozidaza se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od oko 1 mg/kg do oko 100 mg/kg, kao što je oko 5 mg/kg do oko 30 mg/kg, tipično oko 5 mg/kg do oko 20 mg/kg. U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna humana kisela α-glukozidaza se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od oko 5 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 25 mg/ kg, oko 30 mg/kg, oko 35 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 50 mg/kg, oko 50 mg/kg, oko 60 mg/kg, oko 70 mg/kg, oko 80 mg/kg, oko 90 mg/kg ili oko 100 mg/kg. U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna humana kisela α-glukozidaza se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od oko 20 mg/kg. Efektivna doza za određenog pojedinca može varirati (npr. može se povećavati ili smanjivati) tokom vremena, u zavisnosti od potreba pojedinca. Na primer, u vreme fizičke bolesti ili stresa, ili ako se antitela protiv kisele α-glukozidaze pojave ili se povećaju, ili ako se simptomi bolesti pogoršaju, količina se može povećati.

[0083] Terapeutski efikasna količina rekombinantne humane kisele α-glukozidaze (ili kompozicije ili leka koji sadrži rekombinantnu humanu kiselu α-glukozidazu) primenjuje se u redovnim intervalima, u zavisnosti od prirode i obima efekata bolesti, i kontinuirano. Primena u "redovnom intervalu", kako se ovde koristi, ukazuje na to da se terapeutski efikasna količina primenjuje periodično (za razliku od jednokratne doze). Interval se može odrediti standardnim kliničkim tehnikama. U poželjnim realizacijama, rekombinantna humana kisela α-glukozidaza se primenjuje mesečno, dvaput mesečno; nedeljno; dva puta nedeljno; ili dnevno. Interval primene za jednu osobu ne mora da bude fiksni interval, već može da varira tokom vremena, u zavisnosti od potreba pojedinca. Na primer, u vreme fizičke bolesti ili stresa, ako se anti-tela protiv rekombinantne humane kisele α-glukozidaze pojave ili se povećaju, ili ako se simptomi bolesti pogoršaju, interval između doza se može smanjiti.

[0084] U jednom ili više otelotvorenja, farmaceutska formulacija ili rekonstituisana kompozicija se primenjuje zajedno sa farmakološkim pratiocem, kao što je oralna primena šaperona i intravenozna primena farmaceutske formulacije ili rekonstituisane kompozicije. U različitim realizacijama, farmakološki pratilac je miglustat. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje u oralnoj dozi od oko 200 mg do oko 400 mg, ili u oralnoj dozi od

2

oko 200 mg, oko 250 mg, oko 300 mg, oko 350 mg ili oko 400 mg. U najmanje jednoj realizaciji, miglustat se primenjuje u oralnoj dozi od oko 233 mg do oko 400 mg. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje u oralnoj dozi od oko 250 do oko 270 mg, ili u oralnoj dozi od oko 250 mg, oko 255 mg, oko 260 mg, oko 265 mg ili oko 270 mg. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje kao oralna doza od oko 260 mg.

[0085] U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat i rekombinantna humana kisela αglukozidaza se daju istovremeno. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat i rekombinantna humana kisela α-glukozidaza se primenjuju sekvencijalno. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje pre primene rekombinantne humane kisele αglukozidaze. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje manje od tri sata pre primene rekombinantne humane kisele α-glukozidaze. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje oko dva sata pre primene rekombinantne humane kisele αglukozidaze. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje manje od dva sata pre primene rekombinantne humane kisele α-glukozidaze. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje oko 1,5 sati pre primene rekombinantne humane kisele αglukozidaze. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje oko jedan sat pre primene rekombinantne humane kisele α-glukozidaze. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje od oko 50 minuta do oko 70 minuta pre primene rekombinantne humane kisele α-glukozidaze. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje od oko 55 minuta do oko 65 minuta pre primene rekombinantne humane kisele α-glukozidaze. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje oko 30 minuta pre primene rekombinantne humane kisele α-glukozidaze. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje od oko 25 minuta do oko 35 minuta pre primene rekombinantne humane kisele αglukozidaze. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje od oko 27 minuta do oko 33 minuta pre primene rekombinantne humane kisele α-glukozidaze.

Komplet

[0086] Drugi aspekt se odnosi na komplete koji sadrže ovde opisane farmaceutske formulacije (uključujući i sadržaj posle liofilizacije). U jednom ili više otelotvorenja, komplet sadrži kontejner (na primer, bočica, tubica, torba, itd.) koji sadrži farmaceutske formulacije (bilo pre ili posle liofilizacije) i uputstva za rekonstituciju, razblaživanje i primenu.

PRIMERI

PRIMER ENZIMA 1: OGRANIČENJA POSTOJEĆIH rhGAA PROIZVODA MIOZYME<®>AND LUMIZYME<®>

[0087] Da bi se procenila sposobnost rhGAA u proizvodima Miozyme<®>i Lumizyme<®>, jedinim trenutno odobrenim lečenjima za Pompeovu bolest, ovi preparati rhGAA su ubrizgani u CIMPR kolonu (koja vezuje rhGAA sa M6P grupama) i zatim eluirani slobodnim gradijentom M6. Frakcije su sakupljene u ploču sa 96 bunarčića i aktivnost GAA je analizirana pomoću 4MU-α-glukoznog supstrata. Relativne količine vezanog i nevezanog rhGAA su određene na osnovu aktivnosti GAA i prijavljene kao frakcija ukupnog enzima.

[0088] Slike 3A-B prikazuju probleme povezane sa konvencionalnim terapijama zamene enzima (TZE) (Miozyme<®>i Lumizyme<®>): 73% rhGAA u Miozyme<®>(Slika 3B) i 78% rhGAA u Lumizyme<®>(Slika 3A) se nisu vezali za CIMPR, pogledajte vrhove krajnje levo na svakoj slici. Samo 27% rhGAA u Miozyme<®>i 22% rhGAA u Lumizyme<®>sadrži M6P koji može produktivno ciljati na CIMPR na mišićnim ćelijama.

[0089] Efikasna doza Miozyme<®>i Lumizyme<®>odgovara količini rhGAA koji sadrži M6P koji cilja CIMPR na mišićnim ćelijama. Međutim, većina rhGAA u ova dva konvencionalna proizvoda ne cilja CIMPR receptor na ciljnim mišićnim ćelijama. Primena konvencionalnog rhGAA gde većina rhGAA nije usmerena na mišićne ćelije povećava rizik od alergijske reakcije ili indukcije imuniteta na neusmereni rhGAA.

PRIMER ENZIMA 2: PRIPREMA CHO ĆELIJA KOJE PROIZVODE ATB200 rhGAA KOJE IMAJU VISOKI SADRŽAJ N-GLIKANA SA MONO- ILI BIS-M6P [0090] CHO ćelije su transfektovane sa DNK koja eksprimira rhGAA, nakon čega je usledila selekcija transformanata koji proizvode rhGAA. DNK konstrukt za transformaciju CHO ćelija sa DNK koja kodira rhGAA prikazana je na slici 4. CHO ćelije su transfektovane sa DNK koja eksprimira rhGAA, nakon čega je usledila selekcija transformanata koji proizvode rhGAA.

[0091] Nakon transfekcije, ćelije DG44 CHO (DHFR-) koje sadrže stabilno integrisani GAA gen odabrane su sa medijumom sa nedostatkom hipoksantina/timidina (-HT). Amplifikacija

[0092] Ekspresija GAA u ovim ćelijama je indukovana tretmanom metotreksatom (MTX, 500 nM). Grupe ćelija koje su eksprimovale velike količine GAA identifikovane su testovima

1

aktivnosti GAA enzima i korišćene su za uspostavljanje pojedinačnih klonova koji proizvode rhGAA. Pojedinačni klonovi su generisani na pločama sa polučvrstim medijem, odabranim ClonePix sistemom, i prebačeni u ploče sa 24 duboka bunarčića. Pojedinačni klonovi su analizirani na aktivnost GAA enzima da bi se identifikovali klonovi koji eksprimiraju visok nivo GAA. Kondicionirani medijum za određivanje GAA aktivnosti koristio je supstrat 4-MU-α-glukozidaze. Klonovi koji proizvode više nivoe GAA kao što je mereno GAA enzimskim testovima dalje su procenjeni na održivost, sposobnost rasta, produktivnost GAA, strukturu N-glikana i stabilnu ekspresiju proteina. CHO ćelijske linije, uključujući CHO ćelijsku liniju GA-ATB-200, koje eksprimiraju rhGAA sa pojačanim mono-M6P ili bis-M6P N-glikanima su izolovane korišćenjem ove procedure.

PRIMER ENZIMA 3: HVATANJE I PREČIŠĆAVANJE ATB200 rhGAA

[0093] Proizvedene su višestruke serije rhGAA prema pronalasku u bocama za mućkanje i u perfuzionim bioreaktorima korišćenjem CHO ćelijske linije GA-ATB-200 i mereno je vezivanje CIMPR. Slično vezivanje CIMPR receptora (-70%) kao što je prikazano na Slici 5B i Slici 6 primećeno je za prečišćeni ATB200 rhGAA iz različitih proizvodnih serija što ukazuje da se ATB200 rhGAA može dosledno proizvoditi. Kao što je prikazano na slikama 3A-B i 5A-B, Miozyme<®>i Lumizyme<®>rhGAA su pokazali značajno manje vezivanja za CIMPR od ATB200 rhGAA.

PRIMER ENZIMA 4: ANALITIČKO POREĐENJE ATB200 I LUMIZYME<®>

[0094] Tečna hromatografija sa slabom anjonskom izmenom ("WAX") korišćena je za frakcionisanje ATB200 rhGAA prema terminalnom fosfatu. Profili eluiranja su generisani eluiranjem TZE sa sve povećanom količinom soli. Profili su praćeni UV (A280nm). ATB200 rhGAA je dobijen iz CHO ćelija i prečišćen. Lumizyme<®>je dobijen iz komercijalnog izvora. Lumizyme<®>pokazao visok vrh na levoj strani svog eluacionog profila. ATB200 rhGAA je pokazao četiri istaknuta vrha koji eluiraju desno od Lumizyme<®>(slika 7). Ovo potvrđuje da je ATB200 rhGAA fosforilisan u većoj meri nego Lumizyme<®>pošto je ova evaluacija zasnovana na terminalnom naelektrisanju, a ne na CIMPR afinitetu.

PRIMER ENZIMA 5: KARAKTERIZACIJA OLIGOSACHARIDA ATB200 rhGAA [0095] Glikani prečišćenog ATB200 rhGAA i Lumizyme<®>procenneni su MALDI-TOF masenom spektrometrijom da bi se odredile pojedinačne strukture glikana koje se nalaze na

2

svakom TZE (Slika 8). Utvrđeno je da uzorci ATB200 sadrže manje količine nefosforilisanih N-glikana visoko-manoznog tipa nego Lumizyme<®>. Veći sadržaj M6P glikana u ATB200 nego u Lumizymeu<®>, efikasnije usmerava ATB200 rhGAA na mišićne ćelije. Visok procenat mono-fosforilisanih i bis-fosforilisanih struktura određen MALDI masenom spektrometrijom slaže se sa CIMPR profilima koji ilustruju značajno veće vezivanje ATB200 za CIMPR receptor. Analiza N-glikana putem MALDI-TOF masene spektrometrije potvrdila je da u proseku svaki molekul ATB200 sadrži najmanje jednu prirodnu bis-M6P N-glikansku strukturu. Ovaj veći sadržaj bis-M6P N-glikana u ATB200 rhGAA direktno je korelirao sa visokim afinitetom vezivanja za CIMPR u testovima vezivanja sa M6P receptorskom pločom (KD oko 2-4 nM) Slika 10A.

[0096] ATB200 rhGAA je takođe analiziran za profile N-glikana specifične za mesto korišćenjem dve različite LC-MS/MS analitičke tehnike. U prvoj analizi, protein je denaturisan, redukovan, alkilovan i digestiran pre LC-MS/MS analize. Tokom denaturacije i redukcije proteina, 200 µg uzorka proteina, 5 µL 1 mol/L tris-HCl (konačna koncentracija 50 mM), 75 µL 8 mol/L gvanidina HCl (konačna koncentracija 6 M), 1 µL 0,5 mol/L EDTA ( konačna koncentracija 5 mM), 2 µL 1 mol/L DTT (konačna koncentracija 20 mM) i Milli-Q<®>vode dodato je u epruvetu od 1,5 mL da bi se obezbedila ukupna zapremina od 100 µL. Uzorak je pomešan i inkubiran na 56°C tokom 30 minuta u suvom kupatilu. Tokom alkilacije, denaturisani i redukovani uzorak proteina je pomešan sa 5 µL 1 mol/L jodoacetamida (IAM, konačna koncentracija 50 mM), zatim inkubiran na 10-30°C u mraku 30 minuta. Posle alkilacije, 400 µL prethodno ohlađenog acetona dodato je u uzorak i smeša je zamrznuta na -80°C u frižideru 4 sata. Uzorak je zatim centrifugiran 5 minuta na 13000 o/min na 4°C i supernatant je uklonjen. 400 µL prethodno ohlađenog acetona je dodato u granule, koje su zatim centrifugirane 5 minuta na 13000 o/min na 4°C i supernatant je uklonjen. Uzorak je zatim osušen na vazduhu na ledu u mraku da bi se uklonio ostatak acetona. 40 µL 8M uree i 160 µL 100 mM NH4HCO3su dodati uzorku da bi se protein rastvorio. Tokom digestije tripsinom, 50 µg proteina je zatim dodato sa puferom za digestiju tripsinom do konačne zapremine od 100 µL, i dodato je 5 µL 0,5 mg/mL tripsina (odnos proteina i enzima 20/1 w/w). Rastvor je dobro izmešan i inkubiran preko noći (16 ± 2 sata) na 37°C. Dodato je 2,5 µL 20% TFA (konačna koncentracija 0,5%) da bi se reakcija ugasila. Uzorak je zatim analiziran korišćenjem Thermo Scientific Orbitrap Velos Pro<™>masenog spektrometra

[0097] U drugoj LC-MS/MS analizi, uzorak ATB200 je pripremljen prema sličnoj proceduri denaturacije, redukcije, alkilacije i digestije, osim što je jodosirćetna kiselina (IAA) korišćena kao reagens za alkilaciju umesto IAM, a zatim je izvršena analiza pomoću Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribid<™>masenog spektrometra.

[0098] Rezultati prve i druge analize prikazani su na slikama 9A-9H. Na slikama 9A-9H, rezultati prve analize su predstavljeni levom trakom (tamno siva), a rezultati druge analize su predstavljeni desnom trakom (svetlo siva). Na slikama 9B-9G, nomenklatura simbola za prikaz glikana je u skladu sa Varki, A., Cummings, RD, Esko JD, et al., Essentials of Glycobiology, 2. izdanje (2009.).

[0099] Kao što se može videti na slikama 9A-9G, dve analize su dale slične rezultate, iako je bilo nekih varijacija između rezultata. Ova varijacija može biti posledica brojnih faktora, uključujući korišćeni instrument i kompletnost analize N-glikana. Na primer, ako neke vrste fosforilisanih glikana nisu identifikovane i/ili nisu kvantifikovane, ukupan broj fosforilisanih glikana može biti nedovoljno zastupljen, a procenat rhGAA koji nosi fosforilisane glikane na tom mestu može biti nedovoljno zastupljen. Kao drugi primer, ako neke vrste nefosforilisanih glikana nisu identifikovane i/ili nisu kvantifikovane, ukupan broj nefosforilisanih glikana može biti nedovoljno zastupljen, a procenat rhGAA koji nosi fosforilisane glikane na tom mestu može biti prezastupljen. Slika 9A prikazuje zauzetost mesta N-glikozilacije ATB200. Kao što se može videti na slici 9A, prvo, drugo, treće, četvrto, peto i šesto mesto N-glikozilacije su uglavnom zauzeti, pri čemu obe analize otkrivaju preko 90% i do oko 100% enzima ATB200 koji ima glikan otkriven na svakom potencijalnom mestu. Međutim, sedmo potencijalno mesto N-glikozilacije je glikozilovano oko polovine vremena.

[0100] Slika 9B prikazuje profil N-glikozilacije prvog mesta, N84. Kao što se može videti na slici 9B, glavna vrsta glikana su bis-M6P glikani. I prva i druga analiza su otkrile da je preko 75% ATB200 imalo bis-M6P glikan na prvom mestu.

[0101] Slika 9C prikazuje profil N-glikozilacije drugog mesta, N177. Kao što se može videti na slici 9C, glavne vrste glikana su mono-M6P glikani i nefosforilisani visoko manozni glikani. I prva i druga analiza su otkrile da je preko 40% ATB200 imalo mono-M6P glikan na drugom mestu.

4

[0102] Slika 9D prikazuje profil N-glikozilacije trećeg mesta, N334. Kao što se može videti na slici 9D, glavne vrste glikana su nefosforilisani glikani sa visokim sadržajem manoze, di-, tri- i tetra-antenarni kompleksni glikani i hibridni glikani. I prva i druga analiza su otkrile da je preko 20% ATB200 imalo ostatak sijalinske kiseline na trećem mestu.

[0103] Slika 9E prikazuje profil N-glikozilacije četvrtog mesta, N414. Kao što se može videti na slici 9E, glavne vrste glikana su bis-M6P i mono-MGP glikani. I prva i druga analiza su otkrile da je preko 40% ATB200 imalo bis-M6P glikan na četvrtom mestu. I prva i druga analiza takođe su otkrile da preko 25% ATB200 ima mono-M6P glikan na četvrtom mestu.

[0104] Slika 9F prikazuje profil N-glikozilacije petog mesta, N596. Kao što se može videti na slici 9F, glavne vrste glikana su fukozilovani di-antenarni kompleksni glikani. I prva i druga analiza su otkrile da je preko 70% ATB200 imalo ostatak sijalinske kiseline na petom mestu.

[0105] Slika 9G prikazuje profil N-glikozilacije šestog mesta, N826. Kao što se može videti na slici 9G, glavne vrste glikana su di-, tri- i tetra-antenarni kompleksni glikani. I prva i druga analiza su otkrile da je preko 80% ATB200 imalo ostatak sijalinske kiseline na šestom mestu.

[0106] Analiza glikozilacije na sedmom mestu, N869, pokazala je približno 40% glikozilacije, pri čemu su najčešći glikani A4S3S3GF (12%), A5S3G2F (10%), A4S2G2F (8%) i A6S3G3F (8%).

[0107] Slika 9H prikazuje pregled fosforilacije na svakom od sedam potencijalnih mesta N-glikozilacije. Kao što se može videti na slici 9G, i prva i druga analiza su otkrile visoke nivoe fosforilacije na prvom, drugom i četvrtom mestu. Obe analize su otkrile da je preko 80% ATB200 mono- ili di-fosforilisano na prvom mestu, preko 40% ATB200 je monofosforilisano na drugom mestu, a preko 80% ATB200 je mono- ili di-fosforilisano na četvrtom mestu.

[0108] Druga analiza glikana ATB200 je izvedena prema metodi hidrofilne interakcije tečne hromatografije-fluorescentne detekcije-masene spektrometrije (HILIC-FLD-MS).

[0109] Rezultati HILIC-FLD-MS analize su dati u tabeli A ispod. U tabeli A, prvi broj u trocifrenom broju označava broj grana u glikanu, drugi broj označava broj jedinica fukoze jezgra, a treći broj označava broj terminalnih jedinica sijalinske kiseline. Koristeći ovu nomenklaturu, "303" predstavlja tri-antenarni glikan (prvi broj 3) sa 0 jezgara fukoze (2.0) i 3 terminalne sijalinske kiseline (poslednje 3), "212" predstavlja bi-antenarni glikan sa 1 jezgrom fukoze i 2 terminalne sijalinske kiseline, "404" predstavlja tetraantenarni glikan sa 0 jezgara fukoze i 4 terminalne sijalinske kiseline, itd.

Tabela A

[0110] Na osnovu ove HILIC-FLD-MS analize, očekuje se da će testirani ATB200 imati prosečan sadržaj fukoze 2-3 mola po molu ATB200, sadržaj GlcNAc 20-25 mola po molu ATB200, sadržaj galaktoze 8-12 mola po molu ATB200, sadržaj manoze 22-27 mola po molu ATB200, sadržaj M6P 3-5 mola po molu ATB200 i sadržaj sijalinske kiseline 4-7 mola ATB200.

PRIMER ENZIMA 6: KARAKTERIZACIJA CIMPR AFINITETA ATB200

[0111] Pored toga što ima veći procenat rhGAA koji se može vezati za CIMPR, važno je razumeti kvalitet te interakcije. Vezivanje rhGAA receptora Lumizyme<®>i ATB200 rhGAA određeno je korišćenjem testa vezivanja CIMPR ploče. Ukratko, ploče obložene CIMPR-om korišćene su za hvatanje GAA. Različite koncentracije rhGAA su primenjene na imobilisani receptor i nevezani rhGAA je ispran. Količina preostalog rhGAA određena je aktivnošću GAA. Kao što je prikazano na slici 10A, ATB200 rhGAA se značajno bolje vezuje za CIMPR nego Lumizyme<®>.

[0112] Slika 10B prikazuje relativni sadržaj bis-M6P glikana u Lumizyme<®>, konvencionalnom rhGAA i ATB200 prema pronalasku. Za Lumizyme<®>u proseku samo 10% molekula ima bis-fosforilisani glikan. Uporedite ovo sa ATB200 gde u proseku svaki rhGAA molekul ima najmanje jedan bis-fosforilisani glikan.

PRIMER ENZIMA 7: ATB200 rhGAA JE EFIKASNIJE INTERNALIZOVAN FIBROBLASTOM OD LUMIZYME<®>

[0113] Relativna ćelijska apsorpcija ATB200 i Lumizyme<®>rhGAA su upoređeni korišćenjem normalnih i Pompeovih ćelijskih linija fibroblasta. Poređenja su uključivala 5-100 nM ATB200 rhGAA prema pronalasku sa 10-500 nM konvencionalnog rhGAA Lumizyme<®>. Posle 16-časovne inkubacije, spoljašnji rhGAA je inaktiviran sa TRIS bazom i ćelije su isprane 3 puta sa PBS pre žetve. Internalizovani GAA je meren hidrolizom 4MU-α-glukozida i prikazan je grafikonom u odnosu na ukupni ćelijski protein, a rezultati se pojavljuju na slikama 11A-B.

[0114] Takođe se pokazalo da se ATB200 rhGAA efikasno internalizuje u ćelije (Slika 11A i 11B), respektivno, slike pokazuju da se ATB200 rhGAA internalizuje i u normalne i u ćelije Pompeovog fibroblasta i da se internalizuje u većem stepenu nego konvencionalni Lumizyme<®>rhGAA. ATB200 rhGAA zasićuje ćelijske receptore na oko 20 nM, dok je potrebno oko 250 nM Lumizyme<®>. Konstanta efikasnosti upijanja (Kuptake) ekstrapolirano iz ovih rezultata je 2-3 nm za ATB200 i 56 nM za Lumizyme<®>kao što je prikazano na slici 11C. Ovi rezultati sugerišu da je ATB200 rhGAA dobro ciljano lečenje za Pompeovu bolest.

PRIMER ENZIMA 8: REDUKCIJA GLIKOGENA KOD GAA-NOKAUT MIŠEVA [0115] Slike 12A do 12C pokazuju efekte primene alglukozidaze alfa (Lumizyme<®>) i ATB200 na klirens glikogena kod Gaa nokaut miševa. Životinje su dobile dve IV bolusne administracije (svake druge nedelje); tkiva su sakupljena dve nedelje nakon poslednje doze i analizirana na aktivnost kisele α-glukozidaze i sadržaj glikogena.

[0116] Kao što se vidi na slikama 12A do 12C, otkriveno je da ATB200 prazni glikogen iz tkiva u kiseloj α-glukozidazi (Gaa) nokaut miševa u zavisnosti od doze. Doza od 20 mg/kg ATB200 je dosledno uklanjala veći deo uskladištenog glikogena kod Gaa nokaut miševa u odnos na nivoe doze od 5 i 10 mg/kg. Međutim, kao što se vidi na slikama 12A do 12C, ATB200 primenjen u dozi od 5 mg/kg pokazao je slično smanjenje glikogena u srcu i poprečno-prugastim mišićima miša (kvadriceps i triceps) kao Lumizyme<®>primenjen u dozi od 20 mg/kg, dok je ATB200 doziran od 10 i 20 mg/kg pokazao značajno bolje smanjenje nivoa glikogena u poprečno-prugastim mišićima nego Lumizyme<®>.

4

[0117] Slika 15 prikazuje efekte primene alglukozidaze alfa (Lumizyme<®>) i ATB200 na klirens glikogena kod Gaa nokaut miševa. Dvanaest nedelja stari GAA KO miševi tretirani Lumizymeom<®>ili ATB200, 20 mg/kg IV svake druge nedelje 4 injekcije. Tkiva su sakupljena 14 dana nakon poslednje doze enzima radi merenja glikogena. Slika 13 pokazuje relativno smanjenje glikogena u poprečno prugastim mišićima kvadricepsa i tricepsa, pri čemu je ATB200 obezbedio veće smanjenje glikogena nego Lumizyme<®>.

PRIMER ENZIMA 9: FIZIOLOGIJA I MORFOLOGIJA MIŠIĆA KOD GAA-NOKAUT MIŠEVA

[0118] Gaa nokaut miševima su date dve IV bolusne administracije rekombinantne humane kisele α-glukozidaze (alglukozidaze alfa ili ATB200) u dozi od 20 mg/kg svake druge nedelje. Kontrolni miševi su tretirani samo vehikulumom. Tkivo soleusa, kvadricepsa i dijafragme sakupljeno je dve nedelje nakon poslednje doze rekombinantne humane kisele αglukozidaze. Tkivo soleusa i dijafragme su analizirani na nivoe glikogena, bojenjem periodičnom kiselinom - Šifov reagens (PAS), i na proliferaciju lizozoma, merenjem nivoa markera membranskog proteina povezanog sa lizozomom (LAMP1), koji je pojačan kod Pompeove bolesti. Polutanki delovi mišića kvadricepsa ugrađeni u epoksidnu smolu (Epon) su obojeni metilenskom plavom i posmatrani elektronskim mikroskopom (1000×) da bi se odredio stepen prisustva vakuola. Uzorci mišića kvadricepsa su analizirani imunohistohemijski da bi se odredili nivoi markera autofagije konjugata proteina A/1B-lakog lanca 3 fosfatidiletanolamina (LC3A II) i p62, povezanog sa mikrotubulama, insulin-zavisnog transportera glukoze GLUT4 i insulin-nezavisnog transportera glukoze, GLUT1.

[0119] U sličnoj studiji, Gaa nokaut miševima su date četiri IV bolusne administracije rekombinantne humane kisele α-glukozidaze (alglukozidaze alfa ili ATB200) u dozi od 20 mg/kg svake druge nedelje. Kontrolni miševi su tretirani samo vehikulumom. Srčano mišićno tkivo je sakupljeno dve nedelje nakon poslednje doze rekombinantne humane kisele αglukozidaze i analizirano na nivoe glikogena, bojenjem periodičnom kiselinom - Šifov reagens (PAS), i na proliferaciju lizozoma, merenjem nivoa LAMP1.

[0120] Kao što se vidi na slici 14, primena ATB200 je pokazala smanjenje proliferacije lizozoma u tkivu srca, dijafragme i poprečno-prugastih mišića (soleus) u poređenju sa konvencionalnim lečenjem alglukozidazom alfa. Pored toga, kao što se vidi na slici 15, primena ATB200 je pokazala smanjenje nivoa glikogena punktata u tkivu srca i poprečnoprugastih mišića (soleusa) u poređenju sa konvencionalnim lečenjem alglukozidazom alfa.

[0121] Takođe, kao što se vidi na slici 16, ATB200 je značajno smanjio broj vakuola u mišićnim vlaknima u kvadricepsima Gaa nokaut miševa u poređenju sa nelečenim miševima i miševima lečenim alglukozidazom alfa. Kao što se vidi na slici 17, nivoi i LC3 II i p62 su povećani kod Gaa nokaut miševa u poređenju sa miševima divljeg tipa. Pored toga, nivoi insulin-zavisnog transportera glukoze GLUT4 i insulin-nezavisnog transportera glukoze GLUT1 su povećani kod Gaa nokaut miševa u poređenju sa miševima divljeg tipa. Povišeni nivoi GLUT4 i GLUT1 povezani sa nedostatkom kisele α-glukozidaze mogu doprineti povećanom unosu glukoze u mišićna vlakna i povećanju sinteze glikogena kako bazalno, tako i nakon uzimanja hrane.

PRIMER ENZIMA 10: FUNKCIJA MIŠIĆA KOD GAA-NOKAUT MIŠEVA [0122] U dugoročnim studijama u kojima je svake dve nedelje tokom 12 nedelja davano 20 mg/kg ATB200 plus 10 mg/kg miglustata progresivno se povećavala funkcionalna snaga mišića kod Gaa KO miševa u odnosu na osnovnu mereno i jačinom hvata i testom kačenja na žicu (Slike 18A-18B). Primećeno je da je stanje miševa koji su lečeni alglukozidazom alfa (Lumizyme<®>) koji su primali istu dozu TZE (20 mg/kg) opadalo pod identičnim uslovima tokom većeg dela studije (Slike 18A-18B). Kao i kod kratkoročne studije, ATB200/miglustat je imao znatno bolji klirens glikogena nakon 3 meseca (Slike 19A-19C) i 6 meseci (Slike 19D-19G) lečenja od alglukozidaze alfa. ATB200/miglustat je takođe smanjio autofagiju i intracelularnu akumulaciju LAMP1 i disferlina nakon 3 meseca lečenja (Slika 20) u poređenju sa alglukozidazom alfa. Slika 18A,<∗>ukazuje na statistički značajan u poređenju samo sa Lumizyme<®>(p<0,05, 2-strani t-test). Na slikama 19A-19G,<∗>ukazuje na statistički značaj u poređenju samo sa Lumizyme<®>(p<0,05, višestruko poređenje korišćenjem Danetove metode u jednosmernoj ANOVA analizi).

[0123] Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju na to da je ATB200/miglustat bio efikasno usmeren na mišiće kako bi preokrenuo ćelijsku disfunkciju i poboljšao funkciju mišića. Važno je da očigledna poboljšanja u arhitekturi mišića i smanjena autofagija i intracelularna akumulacija LAMP1 i disferlina mogu biti dobri surogati za poboljšanu fiziologiju mišića koja je u korelaciji sa poboljšanjima funkcionalne mišićne snage. Ovi rezultati sugerišu da praćenje autofagije i ovih ključnih mišićnih proteina može biti racionalan, praktičan metod za procenu efikasnosti terapijskih tretmana za Pompeovu bolest kod Gaa KO miševa što se može pokazati kao korisni biomarkeri iz biopsija mišića u kliničkim studijama.

[0124] Slika 20 pokazuje da je 6 meseci primene ATB200 sa ili bez miglustata smanjilo intracelularnu akumulaciju distrofina kod Gaa KO miševa. Došlo je do većeg smanjenja akumulacije distrofina za ATB200 ± miglustat nego za Lumizyme<®>.

PRIMER FORMULACIJE 1: PH I PUFER

Analitičke metode za primere formulacije

[0125] Analize ovde opisanih primera u pogledu izgleda, pH vrednosti, koncentracije proteina, itd. su sprovedene prema dole navedenim metodama, osim ako nije drugačije naznačeno.

Izgled

[0126] Izgled uzoraka, uključujući jasnoću, boju i vidljive čestice, ispitan je pod crno-belom pozadinom koristeći YB-2 lightbox.

pH

[0127] pH uzorka je izmeren meračem pH vrednosti SevenMulti<™>.

Koncentracija proteina

[0128] Koncentracija proteina je određena očitavanjem UV280 pomoću NanoDrop<™>2000 spektrofotometra. Sva merenja su ponovljena dva puta sa uzorkom od 2,5 µL svaki put i uzet je prosek.

Tečna hromatografija isključivanja po veličini visokih performansi (SEC-HPLC)

[0129] Za primere pH i pufera, zamrzavanja-odmrzavanja i ekscipijensa, odvajanje proteinskih monomera i njegovih vrsta i fragmenata visoke molekulske težine izvedeno je korišćenjem TSKgel<®>G3000 SWXL kolona (Tosoh Bioscience, 7,8 × 300 mm, 5 µm, 25 °C) na Agilent 1260 HPLC sistemu. Mobilna faza se sastojala od 50 mM natrijum fosfata, 100 mM natrijum hlorida i 20 mM natrijum citrata (pH 6,0±0,2). Hromatografski sistem je koristio brzinu protoka od 1,0 ml/min, zapreminu injekcije od 50 µL (obično 1 mg/mL) i vreme rada od 20 minuta sa izokratskim gradijentom. Signali su detektovani UV detektorom na 280 nm (referenca: 360 nm).

4

[0130] U primeru PS80, odvajanje proteinskih monomera i njegovih vrsta i fragmenata visoke molekulske težine izvedeno je korišćenjem BioSep<™>-SEC-s3000 kolona (Phenomenex, 7,8×300 mm, 5µm, 25°C) na Agilent 1260 HPLC sistemu. Mobilna faza se sastojala od 50 mM natrijum fosfata i 100 mM natrijum hlorida (pH 6,2±0,2).

Hromatografski sistem je koristio brzinu protoka od 1,15 ml/min, zapreminu injekcije od 50 µL (obično 1 mg/mL) i vreme rada od 25 minuta sa izokratskim gradijentom. Signali su detektovani UV detektorom na 280 nm.

SDS-PAGE (bez redukcije)

[0131] Vrednosti koje se mogu prijaviti su čistoća i molekulska težina proteina u neredukovanom SDS-PAGE. Uzorci su denaturisani neredukovani u prisustvu prekomernog SDS-a da bi se postiglo jednolično negativno naelektrisanje. U primenjenom električnom polju (165V), ove vrste obložene SDS-om su odvojene na osnovu njihove očigledne molekulske težine kroz poliakrilamidni gel. Razdvojene trake su detektovane bojenjem Coomassie plavom.

4-MUG enzimska aktivnost

[0132] 10 µl uzorka je razblaženo i hidrolizovano (pomoću GAA, 37°C tokom 60 min) da bi se dobio fluorescentni proizvod 4-MU. Dodato je 125 µl 1 M glicina ili 0,1 M NaOH da bi se reakcija zaustavila.

[0133] Serija 4-MU standarda je analizirana sa uzorcima da bi se stvorila standardna kalibraciona kriva na osnovu fluorescentnog signala. Konverzija RFU u 4-MU količinu postignuta je softverski posredovanim poređenjem sa standardnom krivom, koja je regresirana prema modelu logističke regresije sa 4 parametra. Zatim je izračunata aktivnost GAA enzima (nmol 4-MU oslobođena/hr/ml GAA) u uzorku na osnovu standardne krive 4-MU.

4-MUG Enzimska koncentracija

[0134] 10 µl uzorka i GAA referentnog standarda je razblaženo i hidrolizovano (pomoću GAA, 37°C tokom 60 min) da bi se dobio fluorescentni proizvod 4-MU. Dodato je 125 ul 1 M NaOH da bi se reakcija zaustavila.

[0135] Serija GAA referentnih standarda je analizirana sa uzorcima da bi se generisala standardna kalibraciona kriva na osnovu fluorescentnog signala. Konverzija RFU u 4-MU količinu postignuta je softverski posredovanim poređenjem sa standardnom krivom, koja je regresirana prema modelu logističke regresije sa 4 parametra. Zatim je koncentracija GAA enzima (nmol 4-MU oslobođena/hr/ml GAA) u uzorku izračunata na osnovu standardne krive GAA.

Dinamičko rasipanje svetlosti (DLS)

[0136] Mikropipeta je korišćena za prenošenje alikvota od 40 µL nerazređenog uzorka u kivetu za jednokratnu upotrebu od 40 µL. Trostruka merenja su obavljena za svaki uzorak.

čestice: HIAC

[0137] 200 µl svakog uzorka je razblaženo u 2000 µl sa filtriranim referentnim puferom. Uzorak je testiran tri puta i za svaki test je korišćeno 450 µl. Prijavljen je prosečan broj čestica svake veličine, 1 µm, 3 µm, 5 µm, 10 µm i 25 µm po ml.

MicroCal diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC)

[0138] Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija kapilarnih ćelija (DSC) se koristi za merenje termičke stabilnosti proteina otkrivanjem razlike u količini toplote koja je potrebna za povećanje temperature uzorka i referentne vrednosti kao funkcije temperature. Konkretno, koristi se za merenje srednje tačke prenosa toplote (Tm), koja je indikator relativne stabilnosti proteina u rastvoru.

[0139] Uzorci su razblaženi do oko 1 mg/mL sa referentnim puferom. Alikvot od 400 µL referentnog pufera je dodat u svaki neparni bunarčić na ploči sa 96 bunarčića, dok je alikvot od 400 µL svakog uzorka dodat u odgovarajući parni bunarčić. Temperatura skeniranja se kreće od 10°C do 110°C.

Modulirana diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (mDSC)

[0140] Temperatura staklene tranzicije (Tg') i eutektička temperatura (Te) su testirane korišćenjem Netzsch kalorimetra za diferencijalno skeniranje (DSC 204 F1).15 µL uzorka je stavljeno u disk za punjenje radi testiranja. Prvo, temperatura je smanjena sa 20 °C na -60 °C brzinom od 10 °C/min, a Te vrednost je dobijena iz krive hlađenja tokom ovog koraka.

4

Drugo, temperatura je povećana sa -60 °C na 40 °C brzinom od 10 °C/min, a vrednost Tg' je analizirana iz krive zagrevanja.

M6P

[0141] M6P je oslobođen iz uzorka hidrolizom (4 M TFA, 100 °C, 4 h) i osušen pomoću centrifugalnog vakuumskog isparivača. Osušeni M6P i referentni standard su suspendovani u prečišćenoj vodi pre analize. Korišćene su CarboPac PA10 BioLCTM analitička kolona (4 mm × 250 mm, 3,5 µm, 100 Å, 30 °C) i CarboPac PA10 BioLCGuard kolona (4 mm × 50 mm, 3,5 µm, 100 Å, 30 °C). Mobilna faza se sastojala od faze A (100 mM NaOH) i faze B (1 M NaOAc, 100 mM NaOH). Hromatografski sistem je koristio brzinu protoka od 1 ml/min, zapreminu injekcije od 25 µL i vreme rada od 30 minuta sa izokratskim gradijentom. Signali su detektovani pulsnom amperometrijskom detekcijom. Sadržaj M6P u uzorku je izračunat na osnovu standardne krive.

Sijalinska kiselina

[0142] Sijalinske kiseline su oslobođene iz molekula leka hidrolizom (2 M HAc, 80°C, 2h), a zatim obeležavanjem svih uzoraka i pomešanog standardnog rastvora sa DMB (50°C, 17±0,5 h u mraku) pre nego što se odvoje korišćenjem kolona Zorbax Eclipse Plus C18 (Agilent, 4,6 mm×100 mm, 3,5 µm, 45 °C) na Agilent 1260 HPLC sistemu. Mobilna faza se sastojala od faze A (9% ACN, 7% MeOH) i faze B (100% ACN). Hromatografski sistem je koristio brzinu protoka od 0,5 ml/min, zapreminu injekcije od 20 µL i vreme rada od 20 minuta sa izokratskim gradijentom. Signali su detektovani fluorescentnim detektorom (λek=373 nm, λem=448 nm). Sadržaj Neu5Gc i Neu5Ac u uzorku je izračunat na osnovu standardne krive.

[0143] Pripremljeno je deset puferskih formulacija koje imaju pH u rasponu od 4,0 do 8,0, koje sadrže 25 mM natrijum fosfata ili 25 mM natrijum citrata, sa ili bez 50 mM NaCl, kao što je prikazano u tabeli 1. Enzimska koncentracija ATB200 4-MUG bila je 1 mg/mL.

Tabela 1. Kompozicije formulacije:

4

Priprema uzorka

[0144] Materijal korišćen u studiji za procenu pH i pufera naveden je u tabeli 2 ispod.

Tabela 2 Informacije o sirovinama korišćenim u studiji procene pH vrednosti i pufera:

<∗>Pufer ovog rastvora enzima ATB200 je 50 mM natrijum fosfata (pH 6,2), 50

[0145] Bili su pripremljeni 25 mM natrijum fosfatni pufer koji sadrži 50 mM NaCl na pH 4,0 (P40), 5,0 (P50), 6,0 (P60), 7,0 (P70) i 8,0 (P80), 25 mM natrijum fosfatni pufer na pH 6,0 (P6 bez NaCl) i 25 mM natrijum citratni pufer koji sadrži 50 mM NaCl na pH 5,0 (C50), 5,5 (C55), 6,0 (C60) i 6,5 (C65). Za pH 4,0, HCl je korišćen za podešavanje pH u natrijumfosfatnom puferu (pH 4,0).

[0146] Rastvor enzima ATB200 je prvo koncentrovan korišćenjem ultra-filtracionih centrifugalnih uređaja pod uslovima od 15°C i 3500 o/min tokom 40 min. Nakon toga, koncentrovani rastvor enzima je zamenjen pufer sa tri različita pufera opisana iznad, dva kruga ultrafiltracije na 15°C i 3500 o/min tokom 50 min i 55 min. Rastvori enzima sa zamenjenim puferima su zatim analizirani na koncentraciju proteina i koncentraciju enzima od 4 MUG.

4

[0147] Na kraju, dodata je odgovarajuća zapremina svakog pufera da bi se konačna koncentracija ATB200 enzima podesila na 1,0 mg/mL. Konačna koncentracija ATB200 je potvrđena i UV_A280 apsorbancijom i koncentracijom enzima od 4 MUG.

[0148] Rastvori su aseptički filtrirani pomoću 0,22-µm polietersulfonskog (PES) filtera.

[0149] Svaka formulacija je aseptično napunjena u staklene bočice od 2 mL u biološki bezbednom poklopcu sa zapreminom punjenja od 500 µL ~ 1000 µL u skladu sa zahtevom za količinu uzorka iz analitičkih testova. Bočice su začepljene, a zatim zapečaćene odmah nakon punjenja.

Testiranje uzoraka

[0150] Bočice svake formulacije su čuvane na 5°C i 40°C do 8 nedelja i mešane na 25°C pri 100 o/min na orbitalnom šejkeru do 5 dana (videti tabelu 3). Formulacije su uzorkovane inicijalno (T0), na 5 dana (5D), 2 nedelje (2N), 4 nedelje (4N) i 8 nedelja (8N), kako je opisano u tabeli 3, za testove izgleda, pH, UV koncentracije, 4-MUG enzimske koncentracije, SEC, HIAC, DLS, aktivnosti enzima 4-MUG i DSC.

Tabela 3 Parametri studije u studiji procene ATB200 pH i procene pufera:

Rezultati

Rezultati termičke stabilnosti - MicroCal DSC

[0151] Rezultati merenja termičke stabilnosti su prikazani u tabeli 4:

Tabela 4:

4

[0152] Viši Tmonsetukazuje na bolju termičku stabilnost proteina u određenoj formulaciji. Shodno tome, formulacije koje su pokazale najveću termičku stabilnost bile su P50, C55, C50, P60 bez NaCl, P60 i C60. Ovi rezultati pokazuju da enzim ATB200 ima bolju termičku stabilnost u slabo kiselom puferu nego u bazičnom stanju.

Izgled - Agitacija

[0153] Rezultati izgleda studije agitacije prikazani su u tabeli 5:

Tabela 5:

4

[0154] Kao što se može videti iz tabele, nakon 5-dnevne agitacije, P60 bez NaCl, C50, C55, C60 i C65 je ostao bezbojan, bistar i bez vidljivih čestica, ali su vidljive čestice primećene u P40, P50, P60, P70 i P80. Ovi podaci pokazuju da je natrijum-citratni pufer stabilizovao formulaciju bolje od natrijum-fosfatnog pufera nakon agitacije.

pH

[0155] Rezultati merenja pH vrednosti prikazani su u tabeli 6 ispod:

Tabela 6:

[0156] Kao što se vidi iz podataka, i fosfatni i citratni puferi sa 50 mM NaCl u rasponu od pH 5,0 do 6,5 su bili u stanju da održavaju naznačeni pH tokom celog perioda. Tokom zamene pufera, prilagođavanja koncentracije, 8-nedeljnog skladištenja na 5°C i 40°C i agitacije, nije bilo značajne promene u pH vrednosti uzoraka.

[0157] Nasuprot tome, pH se smanjio u P60 bez NaCl nakon 8-nedeljnog skladištenja na 5°C i 40°C, a pH se povećao u P40 nakon zamene pufera i 8-nedeljnog skladištenja na obe temperature. Međutim, agitacija nije dovela do promene pH vrednosti u P40 i P60 bez NaCl.

Koncentracija proteina

[0158] Rezultati merenja koncentracije proteina su prikazani ispod u tabeli 7:

Tabela 7:

1

[0159] Čuvanje od 8 nedelja na 5°C i agitacija tokom 5 dana nisu uticali na koncentraciju proteina. Nisu primećene značajne varijacije među svim formulacijama.

[0160] Nasuprot tome, tokom skladištenja na 40°C, koncentracija proteina je blago povećana u P50, P60, P60 bez NaCl, C60 i C65, blago smanjena u C50 i održavana u P40, P70, P80, C55. Zbog formiranja vidljivih čestica u uzorcima od 40°C, uzorci od 40°C/8 nedelja su ponovo testirani nakon centrifugiranja na 12000 o/min tokom 1 minuta. Rezultati su pokazali pad koncentracije proteina nakon centrifugiranja u uzorcima koji sadrže čestice, što ukazuje da čestice prisutne u uzorcima imaju uticaj na adsorpciju na 280nm.

4-MUG Enzimska koncentracija

[0161] Rezultati merenja enzimske koncentracije od 4 MUG prikazani su u tabeli 8 u nastavku:

Tabela 8:

2

[0162] Posle razmene pufera, enzimska koncentracija P80 od 4 MUG je odmah pala na 0,27 mg/mL. Ovo ukazuje da pH 8,0 značajno utiče na aktivnost enzima. Posle 2-nedeljnog skladištenja na 5°C i 40°C, koncentracija enzima je pala na nulu. Osim za P80, nakon 8-nedeljnog skladištenja na 5°C, enzimske koncentracije većine formulacija su bile stabilne i malo su pale u P40.

[0163] Nasuprot tome, skladištenje na 40°C očigledno je uticalo na koncentraciju enzima. Posle 2 nedelje, koncentracija enzima je nestala u P70, dramatično je opala kod P40 i C65 i očigledno se smanjila u P50. Posle 4 nedelje, koncentracija enzima je nastavila da opada. Konačno, nakon 8 nedelja, koncentracije enzima su bile blizu nule u P40 i C65, pale na 0,33 mg/mL u pH 5,0 puferima (P50 i C50) i na 0,5-0,7 mg/mL u pH 5,5 ~ 6,0 puferima (P60, P60 bez NaCl, C55 i C60). Među njima, P60 bez NaCl je na kraju imao najveću enzimsku koncentraciju (0,73 mg/mL). Rezultati pokazuju da je koncentracija enzima bila najviše očuvana u odnosu na 4-MUG enzimsku koncentraciju u opsegu pH 5,5 ~ 6,0, ali nije bilo značajne razlike između natrijum-fosfatnog pufera i natrijum-citratnog pufera.

[0164] Tokom studije agitacije, osim P80, koncentracija enzima se nije značajno promenila.

4-MUG enzimska aktivnost

[0165] Rezultati merenja aktivnosti enzima 4-MUG prikazani su u tabeli 9 u nastavku:

Tabela 9:

[0166] Trend promene aktivnosti enzima 4-MUG bio je paralelan sa koncentracijom enzima 4-MUG.

[0167] P80 je pokazao najgoru stabilnost u aktivnosti enzima od 4-MUG u uslovima testiranja. Aktivnost enzima P80 se smanjila za oko 70% nakon zamene pufera. Kasnije, aktivnost enzima je skoro potpuno izgubljena nakon 2-nedeljnog skladištenja na 5°C i 40°C. Osnovno stanje je značajno uticalo na aktivnost enzima.

[0168] Nakon 8-nedeljnog skladištenja na 5°C, aktivnost enzima PS80 je skoro potpuno izgubljena; 20% smanjenja je nađeno u P40; u drugim formulacijama nije primećena značajna promena.

4

[0169] Nasuprot tome, skladištenje na 40°C dovelo je do očiglednog smanjenja aktivnosti enzima u svim formulacijama. Posle 2 nedelje, aktivnost enzima je skoro potpuno izgubljena u P70, dramatično se smanjila u P40 i C65 i očigledno opala u P50. Aktivnost enzima je nastavila da opada u različitom stepenu od 2 nedelje do 4 nedelje. Na kraju studije, aktivnost enzima je skoro potpuno izgubljena u C65, pala je na 211,5 U/L u P40 na ~ 1550 U/L u P50 i C50, i na 2500 ~ 3000 U/L u C60, P60 i C55. Među formulacijama, P60 bez NaCl je zadržao najveću aktivnost od 3549,7 U/L.

[0170] Na osnovu rezultata testiranja aktivnosti enzima 4-MUG, enzim je bio najviše stabilizovan sa pH u opsegu od pH 5,5 ~ 6,0, ali nije primećena razlika između natrijumfosfatnog pufera i natrijum-citratnog pufera.

čistoća: SEC-HPLC

[0171] Rezultati SEC merenja su prikazani ispod u tabeli 10:

Tabela 10:

[0172] Nakon razmene pufera, čistoća SEC nekih formulacija je značajno smanjena u poređenju sa početnim materijalom (SEC monomer: 98,9%). U P80, SEC čistoća je pala na 44,9%, a formirano je 54,5% agregata; u P40, došlo je do smanjenja procenta monomera od 4,9% u poređenju sa DS pre razmene, sa više formiranih fragmenata molekula niske molekulske mase (eng. Low Molecular Weigt - LMW) od molekula velike molekulske mase (eng. High Molecular Weight - HMW) (4,7% VS 1,3%); u P70 je utvrđeno blago smanjenje (1,2%) procenta monomera, što odgovara povećanju agregata; u P60 bez NaCl, došlo je do smanjenja procenta monomera za 2,3%.

[0173] Nakon 8-nedeljnog skladištenja na 5°C, čistoća SEC u formulacijama P60, P60 bez NaCl i C65 se dobro održavala, ali se čistoća SEC drugih formulacija značajno smanjila u poređenju sa T0. U P40, čistoća SEC je dramatično pala na 74,3% (T0: 94,0%) i formirano je 23,4% fragmenata LMW; kod P50 i C50 došlo je do blagog smanjenja (5∼7%) u monomeru i povećanja (5~7%) fragmenata LMW. U P80 je utvrđeno smanjenje od 18,2%, koje se uglavnom prenelo na agregaciju (14,8%). Kao i u P70, došlo je do smanjenja monomera za 10,7% i povećanja fragmenata HMW za 9,2%. U C55 je došlo do male promene u procentima monomera, HMW i LMW.

[0174] Čuvanje na 40°C dovelo je do dramatične promene procenta monomera u svim formulacijama. U P70 i P80, SEC monomer je pao na 0~0,5% posle 2 nedelje, a u C65 je ostalo 22,4% i oni su se uglavnom pretvorili u agregate nakon 8 nedelja. Kod P40, P50 i C50 došlo je do značajnog pada (50-90%) monomera, uglavnom zbog formiranja fragmenata LMW. U P60, P60 bez NaCl i C60, posle 8 nedelja, procenat SEC monomera se smanjio na 80,8%, 83,6% i 77,5%, respektivno.

[0175] Rezultati SEC su pokazali da je pH 6,0 bio najbolji za stabilnost ATB200, i nije pronađena značajna razlika između natrijum-fosfatnog pufera i natrijum-citratnog pufera. Štaviše, odsustvo natrijum hlorida u formulacijama nije uticalo na stabilnost ATB200.

[0176] Tokom studije agitacije, čistoća SEC je blago smanjena u P60 i P60 bez NaCl. Kod P40, P50, P70, P80, C50, C60 i C65 došlo je do očiglednog smanjenja procenta monomera.

Polidisperznost: Dinamičko rasipanje svetla (eng. Dinamic Light Scattering - DLS) [0177] Rezultati merenja DLS su prikazani ispod u tabeli 11:

Tabela 11:

Uslovi Uzorak Z-Ave Pdl Pk 1 Pk 2 Pk 3 Pk 1 Peak 3

Uslovi Uzorak Z-Ave Pdl Pk 1 Pk 2 Pk 3 Pk 1 Pk 2 Peak 3

1

Uslovi Uzorak Z-Ave Pdl Pk 1 Pk 2 Pk 3 Pk 1 Pk 2 Peak 3

[0178] DLS podaci odražavaju hidrodinamički radijus proteinskih molekula i polidisperznost čestica. Opalescencija je primećena u nekim uzorcima, pa je DLS korišćen za analizu subvidljivih čestica. DLS rezultat je generalno bio u skladu sa indikacijom iz izgleda.

[0179] Tokom 8-nedeljnog skladištenja na 5°C, i hidrodinamički radijus proteinskih molekula i indeks polidisperznosti (PDI) bili su stabilni i uporedivi u P60, P70, P80, P60 bez NaCl i C60. Hidrodinamički radijus se promenio sa oko 10 nm na nekoliko stotina nm u svih ostalih pet formulacija, posebno u P40 nakon 8 nedelja.

[0180] Tokom 8-nedeljnog skladištenja na 40°C, došlo je do dramatične promene u hidrodinamičkom radijusu i PDI u svim formulacijama. Međutim, zbog složenih profila agregata, teško je uporediti te formulacije na osnovu rezultata.

[0181] U studiji agitacije, hidrodinamički radijus i PDI P80 su imali dramatično povećanje; kod P40, P50 i C50 hidrodinamički radijus i PDI su blago povećani; u P60, P70, P60 bez NaCl, C55, C60 i C65 nije primećena značajna promena.

[0182] Prema svim navedenim DLS podacima, P60, P70, P60 bez NaCl, C55, C60 i C65 su bili bolji od P40, P50, P80 i C50.

Čestice: HIAC

[0183] Rezultati HIAC merenja studije agitacije prikazani su u tabeli 12 ispod:

2

Tabela 12:

[0184] Tokom studije agitacije, P70 je imao značajno povećanje broja čestica nakon agitacije na 25°C tokom 5 dana, a sve ostale formulacije su imale uporedive brojeve čestica.

Sažetak

[0185] Uopšteno, P60 i C60 su se istakli kao najstabilnije formulacije u poređenju sa ostalima. Stoga je zaključeno da je ATB200 najstabilniji u opsegu od 5,0-6,0. Međutim, nije se mogla napraviti razlika između fosfatnog i citratnog pufera. Pored toga, odsustvo natrijum hlorida u formulaciji nije pokazalo značajan uticaj na stabilnost ATB200.

PRIMER FORMULACIJE 2: ZAMRZAVANJE-ODMRZAVANJE

[0186] Tri formulacije su procenjene na stabilnost tokom procesa zamrzavanja-odmrzavanja. Tri formulacije su sažete u nastavku u tabeli 13. Ciljna koncentracija enzima ATB200 bila je 5 mg/mL.

Tabela 13:

Priprema uzorka

[0187] ATB200 DS je pufer zamenjen u 3 pufera za formulaciju korišćenjem kasete za dijalizu (20000 MWCO). Dijalize su izvedene na 5°C uz lagano mešanje, svaka sa tri promene pufera, jednom na 6∼10 sati.

[0188] Posle svake dijalize, dodata je odgovarajuća zapremina pufera za formulaciju da bi se konačna UV koncentracija podesila na 5 mg/mL. Rastvori su zatim aseptički filtrirani sa 0,22-µm PES filterom. Svaka formulacija je zatim aseptično napunjena u staklene bočice od 2 mL u biološki bezbednom poklopcu sa zapreminom punjenja od 500 µL ~ 1000 µL u

4

skladu sa zahtevom za količinu uzorka iz analitičkih testova. Bočice su začepljene, a zatim zapečaćene odmah nakon punjenja.

[0189] Pre zamrzavanja-odmrzavanja bočice su uzete za svaku formulaciju i preostale bočice za uzorke su podvrgnute dizajniranom ciklusu zamrzavanja-odmrzavanja. Bočice sa uzorcima nakon zamrzavanja-odmrzavanja su uzete na unapred definisanim tačkama uzorkovanja.

Testiranje uzoraka

[0190] Testirana su tri procesa zamrzavanja-odmrzavanja, kao što je navedeno u nastavku:

[0191] Proces 1: nekontrolisano zamrzavanje i odmrzavanje. Uzorci su zamrznuti u zamrzivaču na -80°C i odmrznuti u komori na 25°C.

[0192] Proces 2: kontrolisano zamrzavanje i nekontrolisano odmrzavanje. Uzorci su stavljeni u Frosty kontejner i zamrznuti u zamrzivaču na -80°C. Frosty kontejner je koristio izopropanol za postizanje kontrolisane brzine smrzavanja na 1°C/min. Frosty kontejner je stavljen u komoru na 25°C da bi se uzorci odmrzli. Brzina povećanja temperature bila je približno 1 °C/min.

[0193] Proces 3: kontrolisano zamrzavanje i odmrzavanje. Za zamrzavanje i odmrzavanje uzoraka korišćen je liofilizator. Najniža temperatura uzorka postignuta tokom zamrzavanja bila je -47°C. Temperatura uzorka je podignuta na 25°C. Brzina promene temperature i za zamrzavanje i za odmrzavanje je kontrolisana na oko 0,5°C/min. Rezultati su potvrđeni ponavljanjem eksperimenta.

[0194] Pet ili tri ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja su izvedena korišćenjem svakog procesa. Sledeći testovi su obavljeni za uzorke pre i posle zamrzavanja-odmrzavanja: Izgled, koncentracija (UV & Enzimska) i SEC-HPLC. Rezime parametara testiranja dat je u nastavku u tabeli 14:

Tabela 14:

Rezultati

Izgled - 1. krug

[0195] Rezultati prvog kruga merenja izgleda prikazani su ispod u tabelama 15A i 15B:

Tabela 15A:

Tabela 15B:

[0196] Kod T0 (pre zamrzavanja-odmrzavanja), činilo se da su sve formulacije bezbojne, blago opalescentne i bez vidljivih čestica, koristeći odgovarajuće pufere za formulaciju kao referencu.

[0197] Posle 5 ciklusa brzog zamrzavanja-odmrzavanja (proces 1), činilo se da sve formulacije sadrže vidljivije čestice u poređenju sa njihovim T0. CP60 je sadržao najmanje čestica od sva tri uzorka nakon 5 FT.

[0198] Posle 5 ciklusa sporog zamrzavanja-odmrzavanja (proces 2), činilo se da sve formulacije sadrže više vidljivih čestica od T0, ali manje od onih tretiranih postupkom 1. Manje čestica je uočeno u CP60 uzorcima nakon 5 ZO ciklusa nego u uzorcima P60 i C60 nakon 1 ZO ciklusa.

[0199] Posle 3 ciklusa sporog zamrzavanja-odmrzavanja (proces 3), činilo se da sve formulacije imaju vidljivije čestice od T0. Nije bilo razlike između tri formulacije.

Izgled - 2. krug

[0200] Rezultati drugog kruga merenja izgleda prikazani su ispod u tabelama 23:

Tabela 16:

[0201] U 2. drugu studije sporog zamrzavanja-odmrzavanja (proces 3), sprovedeno je više ZO ciklusa nego u prvom krugu. Veliki broj vidljivih čestica pojavio se u P60 nakon 5 ZO u poređenju sa T0, dok je mali broj čestica primećen i u C60 i CP60.

4-MUG Enzimska koncentracija i aktivnost

[0202] Rezultati merenja enzimske koncentracije i aktivnosti 4-MUG prikazani su ispod u tabeli 17 (procesi 1-2 i prvi krug procesa 3) i tabeli 18 (drugi krug procesa 3):

Tabela 17:

Tabela 18:

[0203] Posle 5 ciklusa brzog zamrzavanja-odmrzavanja (proces 1), primećeno je blago smanjenje enzimske koncentracije 4-MUG u P60 u poređenju sa T0 uzorkom, dok nije primećena značajna razlika u C60 i CP60.

[0204] Posle 5 ciklusa sporog zamrzavanja-odmrzavanja korišćenjem Frosty kontejnera (proces 2), nije primećena značajna razlika u poređenju sa T0 uzorcima, ni u jednoj od 3 formulacije.

[0205] Posle 3 ciklusa sporog zamrzavanja-odmrzavanja korišćenjem liofilizatora (proces 3), došlo je do izrazitog smanjenja enzimske koncentracije i P60 i CP60, ali nije bilo značajne promene u C60 u poređenju sa T0. Zamrzavanje-odmrzavanje procesom 3 je ponovljeno u 5 ciklusa i primećen je isti trend. Enzimska koncentracija uzoraka P60 opala je za 18,8% nakon 1. ciklusa Z/O, a pogoršala se nakon 3. ciklusa (smanjenje za 53,1%) i 5. ciklusa (smanjenje za 68,9%). Kod CP60, koncentracija enzima je počela da opada nakon 3. ciklusa, i konačno se smanjila na isti nivo kao P60 nakon 5. ciklusa. Kod C60 nije bilo skoro nikakve promene nakon 5. ciklusa sporog zamrzavanja-odmrzavanja.

[0206] Rezultati enzimske koncentracije od 4 MUG pokazali su da brzina zamrzavanja/zagrevanja, broj Z/O ciklusa i tip pufera mogu uticati na stabilnost ATB200. Sistem citratnog pufera (C60) je obezbedio dobar stabilizujući efekat bez obzira na korišćeni proces zamrzavanja-odmrzavanja.

[0207] Trend promene aktivnosti enzima 4-MUG bio je isti kao i koncentracija enzima 4-MUG.

[0208] Tokom studije brzog zamrzavanja-odmrzavanja (proces 1), došlo je do blagog smanjenja aktivnosti enzima u P60 nakon 5. ciklusa, nije primećena značajna promena kod C60 i CP60.

[0209] Ni u jednom uzorku nije primećena nikakva izrazita promena tokom ispitivanja sporog zamrzavanja-odmrzavanja sa promenom temperature od 1°C/min (proces 2).

[0210] U studiji sporog zamrzavanja-odmrzavanja sa liofilizatorom (proces 3), aktivnost enzima kod P60 je imala očigledan pad, a kod CP60 je imala blagi pad. Međutim, kod C60 skoro da nije bilo promene. Tokom 2. kruga procesa 3 studije sporog zamrzavanjaodmrzavanja, aktivnost enzima P60 se smanjila za 19,1% nakon 1. ciklusa, 54,1% nakon 3. ciklusa) i 71,2% nakon 5. ciklusa. Kod CP60, aktivnost enzima je počela da opada nakon 3. ciklusa, pala je na nivo sličan P60 nakon 5 ciklusa. Bilo je zanemarljive promene u C60 nakon 5 ciklusa.

Čistoća: SEC-HPLC

[0211] Rezultati merenja čistoće su prikazani u tabeli 20 (procesi 1-2 i prvi krug procesa 3) i tabeli 21 (drugi krug procesa 3):

aea :

1

[0212] Ni u jednom uzorku nije otkrivena promena procenta SEC monomera posle do 5. ciklusa brzog Z/O (proces 1) ili sporog Z/O (proces 2).

[0213] U prvoj studiji sporog Z/O (proces 3), uzorci P60 su pokazali očigledan pad procenta monomera SEC (uglavnom zbog formiranja vrsta HMW) nakon 3. ciklusa. I nije se desila nikakva izrazita promena u C60 i CP60. U 2. procesu 3. studije sporog Z/O (0,5°C/min), monomer u uzorcima P60 je počeo da opada nakon 1. ciklusa i konačno opao za 68,1% nakon 5. ciklusa. I kod CP60, procenat monomera je opao nakon 3. ciklusa, ali u mnogo manjoj meri nego kod P60; međutim, dostigao je isti nivo kao kod P60 nakon 5. ciklusa. Nije bilo promene u procentu monomera kod C60 posle do 5. ciklusa.

[0214] Rezultati čistoće SEC bili su u skladu sa performansama enzimske koncentracije i aktivnosti, potvrđujući da brzina smrzavanja/zagrevanja, broj Z/O ciklusa i tip pufera mogu uticati na stabilnost ATB200 tokom procesa zamrzavanja-odmrzavanja. Ni puferi koji sadrže natrijum fosfat nisu zaštitili ATB200 tokom ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja, na osnovu rezultata SEC.

Sažetak

[0215] ATB200 formulisan u citratnom puferu (C60) izdržao je više ciklusa zamrzavanjaodmrzavanja bolje od druga dva pufera (P60 i CP60). Bez obzira na proces zamrzavanjaodmrzavanja, ATB200 je ostao stabilan u citratnom puferu.

PRIMER FORMULACIJE 3: EKSCIPIJENT

[0216] Osam formulacija (E1-8) je pripremljeno sa različitim ekscipijentima. Koncentracija enzima ATB200 u studiji procene ekscipijenata bila je 5 mg/mL. Tri pufera, dva stabilizatora i jedan surfaktant su odabrani da bi se procenila stabilnost proteina u formulacijama opisanim u Tabeli 22 ispod.

2

Tabela 22:

Priprema uzorka

[0217] 25 mM natrijum fosfatnog pufera koji sadrži 50 mM NaCl pri pH 6,0, 25 mM natrijum citratnog pufera koji sadrži 50 mM NaCl pri pH 6,0 i 25 mM kombinovanog pufera natrijum fosfat-citrat koji sadrži 50 mM NaCl pri pH 6,0 su pripremljeni odvojeno. Rastvor enzima ATB200 je zamenjen u tri pufera pomoću kasete za dijalizu. Dijalize su izvedene na 5°C uz lagano mešanje, svaka sa 3 promene pufera, jednom na svakih 6-10 sati.

[0218] Posle dijalize, u dijalizat su dodati trehaloza, manitol ili PS80 da bi se pripremile formulacije kao što je navedeno u tabeli 22. Na kraju, dodata je odgovarajuća zapremina pufera za formulaciju da bi se konačna koncentracija ATB200 podesila na 5 mg/mL. Rastvori su aseptički filtrirani sa 0,22 µm PES filterom.

[0219] Svaka formulacija je aseptično napunjena u staklene bočice od 2 mL u biološki bezbednoj haubi sa oko 1 mL zapremine punjenja. Bočice su zapušene, a zatim uvrnute odmah nakon punjenja.

Testiranje uzoraka

[0220] Formulacije E1-8 su testirane pod 4 različita uslova. Bočice svake formulacije su čuvane na 5°C tokom 12 nedelja (12N) i na 40°C tokom 8 nedelja (8N), zamrznuteodmrznute (0,5°C/min) tokom 5 ciklusa i mešane na 100 o/min tokom 5 dana na 25°C. Plan uzorkovanja i testiranja opisan je u tabeli 23. Uzorci su testirani na početku (T0), nakon 2 nedelje (2N), 4 nedelje (4N), 8 nedelja (8N) i 12 nedelja (12N).

Tabela 23:

Rezultati

Izgled

[0221] Rezultati izgleda za merenja studije smrzavanja-odmrzavanja prikazani su u tabeli 24 (pomoću frižidera) i Tabeli 25 (koristeći liofilizator):

Tabela 24:

4

Tabela 25:

[0222] Tokom studije zamrzavanja-odmrzavanja, vidljive čestice su se neznatno povećavale sa povećanjem ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja u F5 i F6, koji nisu sadržali PS80. U drugim formulacijama nije primećena razlika.

[0223] Formulacije bez PS80 (F5 i F6) nisu bile tako dobre kao formulacije sa PS80 u studiji zamrzavanja-odmrzavanja, o čemu svedoči formiranje vidljivih čestica nakon višestrukih ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja.

PRIMER FORMULACIJE 4: HEMOLIZA U CELOJ HUMANOJ KRVI

[0224] Serija razblaženja krvi (1:2, 1:3, 1:4, 1:5 i 1:10) od humanog davaoca pripremljena je u fiziološkom rastvoru. Kada se pomeša sa dejonizovanom vodom, u testu je korišćeno razblaživanje koje je dalo optičku gustinu (OD) na 540 nm između 0,8 i 1,2 i naziva se krvni supstrat. Ispitivane su četiri vrste uzoraka: ispitivani lek, placebo, pozitivna kontrola i negativna kontrola. Ispitivani lek je predstavljao ATB200 rhGAA u formulaciji sa 25 mM natrijum citrata, 2% manitola i 0,05% polisorbata 80 pri pH vrednosti 6,0. Placebo je bio isti kao u ispitivanom artiklu, osim što nije bilo ATB200 rhGAA. Pozitivna kontrola je bila sterilna voda za injekcije i imala je pH vrednost 5. Negativna kontrola je bila fiziološki rastvor (0,9 NaCl) i imao je pH vrednost 5.

[0225] Ispitivani lek (ATB200) u količini od 300, 600 i 1000 µg/ml sa fiziološkim rastvorom, placebo sa fiziološkim rastvorom, negativna kontrola (fiziološki rastvor) i pozitivna kontrola (voda) pomešani su sa supstratom krvi od humanog donora. Uzorci su inkubirani bez agitacije 1 sat na 37°C. Posle inkubacije, epruvete su centrifugirane 10 minuta na približno 100x g na sobnoj temperaturi. Količina hemoglobina u supernatantu svakog uzorka je analizirana spektrofotometrijski na 540 nm.

[0226] Procenat hemolize za ispitni lek određen je formulom:

% hemolize = Abs. IL/placebo vod/krv – Abs. fiz.rast voda/krv – Abs. IL/placebo

Abs. voda voda/krv – Abs. fiz rast voda/krv

[0227] Procenat hemolize vode i krvi je 100%. Slani rastvor je bio negativna kontrola.

Hemoliza manja ili jednaka 10% smatrana je beznačajnom. Procenat hemolize je izračunat za svaku koncentraciju ispitivanog artikla i za placebo.

[0228] Tabela 26 ispod prikazuje rezultate testiranih uzoraka.

Tabela 26:

[0229] Inkubacija supstrata humane krvi sa tri uzorka placeba, razblaženih u fiziološkom rastvoru u istom odnosu kao i tri doze ispitivanog proizvoda, nije izazvala značajnu hemolizu himane krvi. Procenat hemolize za uzorke razblažene placebom je izračunat na -1,3, -1,3 i 0,9%, respektivno. Inkubacija supstrata humane krvi sa ATB200 u količini 300, 600 i 1000 µg/ml nije izazvala značajnu hemolizu humane krvi. Procenat hemolize za uzorke ispitivanog artikla je izračunat na -0,1, -1,5% i -1,5%, respektivno.

[0230] U zaključku, formulacija ATB200 je bila kompatibilna sa humanom krvlju u svim razblaženjima.

PRIMER FORMULACIJE 5: FLOKULACIJA U HUMANOJ PLAZMI I SERUMU

[0231] Rastvori za doziranje ispitivanog artikla (3 koncentracije) i placebo (3 koncentracije) su pomešani sa jednakim količinama humane plazme i seruma donora. Ispitivani lek je predstavljao ATB200 rhGAA u formulaciji sa 25 mM natrijum citrata, 2% manitola i 0,05% polisorbata 80 pri pH vrednosti 6,0. Placebo je bio isti kao u ispitivanom artiklu, osim što nije bilo ATB200 rhGAA.

[0232] Jedan ml svake doze ispitivanog artikla ili placeba je pomešan sa jednakom zapreminom plazme, seruma i fiziološkog rastvora. Uzorci su inkubirani 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, epruvete su pregledane makroskopski i mikroskopski na precipitaciju ili koagulaciju. Alikvot iz svake epruvete je centrifugiran na 14.000 o/min u mikrocentrifugi 10 minuta. Svaka epruveta je ispitana na prisustvo ili odsustvo granula. Precipitacija/koagulacija i granule su ocenjeni na sledeći način:

0 = negativno

1 = vrlo slaba precipitacija ili granule

2 = minimalna precipitacija ili granule

3 = umerena precipitacija ili granule

4 = značajna precipitacija ili granule

[0233] Tabela 27 ispod prikazuje rezultate testiranih uzoraka.

Tabela 27:

[0234] Nije primećena precipitacija makroskopski ili mikroskopski u humanoj plazmi ili serumu kada je pomešan sa bilo kojom koncentracijom ATB200. U uzorcima placeba nisu zabeležene recipitacije. Kada su svi placebo ili ATB200 uzorci centrifugirani, nisu primećene granule.

[0235] Na osnovu rezultata ove studije, utvrđeno je da je formulacija ATB200 kompatibilna sa humanom plazmom i serumom do i uključujući konačnu koncentraciju od 1000 µg/ml.

PRIMER: FARMAKOKINETIČKI I BEZBEDNOSNI PODACI REKOMBINANTNE

A-GLUKOZIDAZE ATB200 KOJA SE DAJE U KOMBINACIJI SA

MIGLUSTATOM KOD PACIJENATA SA POMPEOVOM BOLEŠĆU KOJI NISU

PRIMILI TZE I PACIJENATA KOJI SU PRIMILI TZE

[0236] Ova studija je osmišljena da prvenstveno proceni bezbednost, podnošljivost i farmakokinetiku (FK) ATB200 istovremeno primenjenog sa miglustatom.

FK/farmakodinamički (FD) translacioni model od Gaa nokaut miša predviđa da bi kombinacija ATB200 20 mg/kg sa visokom dozom (npr.260 mg) miglustata kod ljudi obezbedila optimalno smanjenje glikogena.

[0237] U opisu ispod, "visoka doza" miglustata se odnosi na dozu od oko 260 mg, a "niska doza" miglustata se odnosi na dozu od oko 130 mg.

[0238] Cilj je bio da se procene preliminarni podaci o ukupnom GAA proteinu, ATB200 i PK miglustatu i bezbednosnim markerima 10 pacijenata u ovoj fazi 1/2 studije.

[0239] Ovo je otvorena studija, sa fiksnom sekvencom, rastućom dozom, prva kod ljudi, faze 1/2 za procenu bezbednosti, podnošljivosti, FK, FD i efikasnosti intravenskih infuzija ATB200 koje se daju istovremen o sa oralnim miglustatom kod odraslih sa Pompeovom bolešću (Slika 21). Procenjeni su srednji ukupni rezultati GAA proteina i FK miglustata od prvih 8 pacijenata iz grupe 1 do posete 9 i prva 2 pacijenta iz grupe 3.<a>Podaci o bezbednosti od 2 nadzorna pacijenta iz grupe 1 su pregledani na svakom nivou doze pre doziranja u grupama 2 i 3.<b>Tokom faze 2 i 3, miglustat je primenjen oralno pre početka intravenske infuzije ATB200. Za sve doze, ATB200 je infundiran intravenozno u trajanju od 4 sata.<c>Prva 2 pacijenta u grupama 2 i 3 služila su kao kontrolni pacijenti za svoje grupe.

[0240] Ključni kriterijumi za uključivanje:

• Muškarci i žene starosti 18-65 godina kojima je dijagnostikovana Pompeova bolest na osnovu dokumentovanog nedostatka aktivnosti GAA enzima ili GAA genotipizacije

• Osobe koje su primale TZE sa alglukozidazom alfa 2-6 godina (ili ≥2 godine za grupu 2) pre početka ispitivanja (grupa 1)

• Osoba koja trenutno alglukozidazu alfa učestalost svake druge nedelje i završila je poslednje 2 infuzije bez neželjenog događaja povezanog sa lekom koji je rezultirao prekidom doze (Grupe 1 i 2)

• Mora biti u stanju da hoda između 200 i 500 metara na 6-minutnom testu hodanja (Grupe 1 i 3)

• Uspravno forsirani vitalni kapacitet mora biti 30%-80% predviđene normalne vrednosti (Grupe 1 i 3)

• Mora biti vezan za invalidska kolica i ne može da hoda bez pomoći (Grupa 2)

[0241] FK analiza:

• Sakupljeni su uzorci krvi za ukupni GAA protein u plazmi i koncentraciju aktivnosti • Faza 1: pre početka infuzije ATB200 i 1, 2, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 8, 10, 12 i 24 sata nakon početka infuzije

• Faze 2 i 3: 1, 2, 3, 4, 4.5, 5, 6, 7, 9, 11, 13 i 25 sati nakon oralne primene miglustata • Uzorci krvi za koncentracije miglustata u plazmi uzeti su neposredno pre oralne primene miglustata (vreme 0) i 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 9, 11 i 25 sati nakon oralne primene miglustata. Miglustat u plazmi se određuje validiranim LC-MS/MS testom • Ukupne koncentracije GAA proteina u plazmi za ATB2005, 10 i 20 mg/kg određene su validiranom LC-MS/MS kvantifikacijom rhGAA-specifičnih "potpisnih" peptida

[0242] Preliminarna analiza je završena kod 8 pacijenata u grupi 1 koji su završili faze 1 i 2 i 2 pacijenata u grupi 3 koji su započeli fazu 3

• Pacijenti sa početnim prebacivanjem na TZE su reprezentativni za populaciju Pompeove bolesti, sa prosečne 5,02 godine na TZE (Tabela 28)

Tabela 28: Osnovne karakteristike

Osnovne karakteristike (N=12*)

Vrem

<a>n=10 iz Grupe 1 (ambulantno TZE-promena) kroz privremenu analizu podataka; n=2 iz grupe 3 (bez TZE).

Ukupni GAA protein

[0243] Kada se daje sam, ATB200 se povećava na način koji je nešto veći od doze proporcionalno (tabela 29 i slike 22A-22D). Čini se da se varijabilnost povećava sa dozom miglustata (Slika 22C). Istovremena primena ATB20020 mg/kg sa visokom dozom miglustata (260 mg) povećala je ukupnu izloženost GAA proteinu (AUC) za približno 25% u odnosu na sam ATB200 pri dozi od 20 mg/kg. Poluživot distribucije (a-faza) se povećao za 45%, što sugeriše da visoka doza miglustata stabilizuje ATB200 u plazmi. Povećanje poluživota distribucije praćeno je povećanjem AUC od vremena do maksimalne koncentracije u plazmi do približno 12 sati nakon doze. Povećanje AUC i poluživota se može

1

posmatrati na log skali, tokom faze terminalne eliminacije (Slika 22B). ATB200 je pokazao relativno visok obim distribucije. Dispozicija ukupnog GAA proteina u plazmi izgleda slično između pacijenata koji primili TZE (Grupa 3) i pacijenata koji su primili TZE (Grupa 1) (Slike 22A i 22D).

Tabela 29: Ukupni GAA Protein

FK miglustata

[0244] Miglustat je pokazao kinetiku proporcionalnu dozi (Tabela 30 i Slika 23). Miglustat u plazmi izgleda slično između pojedinačnih i višestrukih doza.

Tabela 30: Pregled FK miglustata

Farmakodinamika

[0245] Do 11. posete kod pacijenata koji su primili TZE iz grupe 1 (Slike 24A i 24B):

2

• Alanin aminotransferaza (ALT) smanjena je kod 5 od 8 pacijenata; 4/4 pacijenata sa povišenim početnim nivoima je normalizovano

• Aspartat aminotransferaza (AST) smanjena je kod 6 od 8 pacijenata; 3/4 pacijenata sa povišenim početnim nivoima se je normalizovano

• Kreatin fosfokinaza (CPK) je smanjena kod 6 od 8 pacijenata; 2/6 pacijenata sa povišenim početnim nivoima je normalizovano

• Nivo tetrasaharida glukoze u urinu (HEX4) smanjen je kod 8 od 8 pacijenata

[0246] Do 4. nedelje, sva 4 nivoa biomarkera su se smanjila kod 2 pacijenta u grupi koja nije dobila lečenje (Grupa 3) (Slike 24C i 24D).

[0247] Na slikama 24A-24D, podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± standardna greška.

Sigurnost

[0248]

• Nisu prijavljeni ozbiljni neželjeni događaji (eng. adverse events - AE) ili reakcije povezane sa infuzijom nakon 155+ ukupnih infuzija kod svih pacijenata

• Neželjeni efekti izazvani lečenjem, prijavljeni kod 11/13 (84%) pacijenata, uglavnom su bili blagi i prolazni.

• Neželjeni efekti povezani sa lečenjem prijavljeni su kod 7/13 (53%) pacijenata:

mučnina (n=1), umor (n=1), glavobolja (n=1), tremor (n=2), akne (n=1), tahikardija (n=1) i hipotenzija (n=1).

Zaključci

[0249]

• ATB200 sam i u kombinaciji sa miglustatom je do danas bezbedan i dobro se podnosi, bez reakcija povezanih sa infuzijom.

• Sam ATB200 pokazao je povećanje ekspozicije veće od proporcionalnog dozi, koje je dodatno pojačano miglustatom, što sugeriše stabilizujući efekat šeporona na ATB200. • Nakon prelaska sa standardne nege na ATB200/miglustat, pacijenti su generalno pokazali poboljšanje u biomarkerima oštećenja mišića, pri čemu su mnogi pacijenti pokazali normalizaciju do 18. nedelje.

• Prva 2 pacijenta koja nisu dobila terapiju lečena ATB200/miglustatom pokazali snažno smanjenje svih biomarkera oštećenja mišića

SEKVENCE [0250]

4

1

2

�

Claims

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska formulacija koja sadrži:

(a) populaciju molekula rekombinantne humane kisele α-glukozidaze (rhGAA), naznačenu time što su rhGAA molekuli eksprimirani u jajnim ćelijama kineskog hrčka (CHO), i gde rhGAA molekuli sadrže najmanje 3 mola ostataka manoza-6-fosfata (M6P) i najmanje 4 mola ostataka sijalinske kiseline, po molu rhGAA;

(b) citratni pufer; i

pri čemu formulacija ima pH vrednost od 5,0 do 7,0.

2. Farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što su 40% -60% N-glikana na rhGAA molekulima N-glikani kompleksnog tipa.

3. Farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 1 ili patentnog zahteva 2, naznačena time što je rhGAA prisutan u koncentraciji od 5 mg/mL do 50 mg/mL, opciono 15 mg/mL.

4. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačena time što formulacija ima pH vrednost od 5,5 do 7,0, opciono 6,0.

5. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačena time što citratni pufer sadrži kalijumovu, natrijumovu ili amonijumovu so.

6. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačena time što je manitol prisutan u koncentraciji od 10 mg/mL do 50 mg/mL i/ili je polisorbat 80 prisutan u koncentraciji od 0,2 mg/mL do 0,5 mg /mL; i gde je, poželjno, manitol prisutan u koncentraciji od 20 mg/mL, a polisorbat 80 je prisutan u koncentraciji od 0,5 mg/mL.

7. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, koja dalje sadrži alkalizujuće sredstvo i/ili

agens za zakiseljavanje,

naznačena time što su agens za alkalizaciju i agens za zakiseljavanje prisutni u količinama dovoljnim da održe farmaceutsku formulaciju na pH od 5,0 do 6,0.

8. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačena time što rhGAA molekuli sadrže prvo, drugo, treće, četvrto, peto, šesto i sedmo potencijalno mesto N-glikozilacije na amino kiselinama koje odgovaraju N84, N177, N334, N414, N596, N826 i N869 SEQ ID NO: 2, respektivno, i gde:

(a) najmanje 50% rhGAA molekula sadrži N-glikansku jedinicu koja nosi bis-M6P na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije;

(b) najmanje 30% rhGAA molekula sadrži N-glikansku jedinicu koja nosi mono-M6P na drugom potencijalnom mestu N-glikozilacije; ili

(c) najmanje 30% rhGAA molekula sadrži N-glikansku jedinicu koja nosi bis-M6P na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije; ili

(d) najmanje 20% rhGAA molekula sadrži N-glikansku jedinicu koja nosi mono-M6P na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije.

9. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, naznačena time što se farmaceutska formulacija suštinski sastoji od:

(a) populacije rhGAA molekula;

(b) natrijum citrata;

(c) monohidrata limunske kiseline;

(d) manitola;

(e) polisorbata 80;

(f) vode;

(g) opciono, agensa za zakiseljavanje; i

(h) opciono, sredstva za alkalizaciju,

pri čemu formulacija ima pH od 5,0 do 6,0, i pri čemu, opciono: populacija rhGAA molekula je prisutna u koncentraciji od 15 mg/mL, natrijum citratni pufer je prisutan u koncentraciji od 25 mM, manitol je prisutan u koncentraciji od 20 mg/mL, a polisorbat 80 je prisutan u koncentraciji od 0,5 mg/mL.

10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži farmaceutsku formulaciju prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, naznačena time što je farmaceutska formulacija liofilizovana.

11. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 za upotrebu u lečenju Pompeove bolesti kod pacijenta kome je to potrebno, naznačena time što se farmaceutska formulacija opciono razblaži pre davanja pacijentu.

12. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10 za upotrebu u lečenju Pompeove bolesti kod pacijenta kome je to potrebno, naznačena time što se farmaceutska kompozicija rekonstituiše pre davanja pacijentu.

13. Postupak za pripremu farmaceutske formulacije prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, gde postupak sadrži:

(a) pripremu rastvora koji sadrži citratni pufer, najmanje jedan ekscipijent i populaciju rhGAA molekula;

(b) opciono podešavanje pH rastvora;

(c) opciono dodavanje dodatne vode u rastvor;

(d) opciono filtriranje rastvora; i

(e) opciono čuvanje rastvora.

14. Postupak za pripremu farmaceutske kompozicije prema zahtevu 10, pri čemu postupak sadrži liofilizaciju farmaceutske formulacije prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9.